Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика R-плазмиды рМЗ (Inc P-9 группы) метилотрофных

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика R-плазмиды рМЗ (Inc P-9 группы) метилотрофных"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛОРУССКОЙ ССР ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

• На правах рукописи ТИТОН Марина Алексеевна

УДК 579.8i841.11:252.5

ХАРАКТЕРИСТИКА R-ПЛЯЗМИДЫ, рМЗ

(INС Р-9 ГРУППЫ) МЕТИЛОТРОФНЫХ

-PSEUDOMONAS Специальность 03.00.15 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск — 1990

Работа выполнена на кафедре микробиологии и в Проблемной НИЛ экспериментальной биологии Белорусского государственного университета имени В. И. Ленина.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Фомнчев Ю. К.

кандидат биологических наук,, старший научный сотрудник Максимова Н. П.

Официальные оппоненты —

доктор медицинских наук Б. Н. Ильяшенко кандидат биологических наук Е. Н. Воронина

Ведущее учреждение —

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции, промышленных микроорганизмов.

Защит диссертации состоится 18 декабря 1990 года в /9 часов на заседании специализированного совета К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Институте генетики и цитологии АН БССР по адресу: 220734, г. Минск, ул. Ф. Ско-рины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Я. Коласа.

Автореферат разослан « ^ » ноября 1990 года.

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук

Е. В. ЛОБАНОК

Актуальность проблемы. Среди плазмид грамотрицательных бактерий особую группу составляют плазмиды широкого круга хозяев, которые нашли широкое применение как инструменты для генетических исследований различных микроорганизмов, в частности, при клонировании и картировании генов, транспозонном мутагенезе и т.п. Поэтому поиск и характеристика плазмид этого типа приобретают особую актуальность в связи с вовлечением в 5фуг генетических объектов новых малоизученных грамотрицательных бактерий. В этом плане определенный интерес представляют метилотрофные бактерии рода Раеи-дотопаз, достаточно широко распространенные в природе и представляющие большой интерес для микробной"биотехнологии. Кроме того, изучение распространения плазмид среди естественных обитателей различных экологических ниш позволяет создать общую картину циркуляции внехромосомных генетических элементов в бактериальных популяциях, а также дает возможность выявить плазмиды с новыми практически полезными свойствами.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение плазындного состава факультативных метилотрофиых бактерий, выделенных из различных природных источников, а также характеристика наиболее типичной из обнаруженных плазмид. В соответствии с этим в работе ставились следующие конкретные задачи:

- провести методом электрофореза в агарозном геле скрининг факультативных метилотрофяых бактерий с целью обнаружения внехромосомных факторов наследственности;

- определить стенотипическое проявление обнаруженных плазмид (контроль лекарственной устойчивости, способность катаболизировать различные органические соединения и т.д.);

- классицдщировать обнаруткенше нлазшды по их молекулярным массам;

- охарактеризовать один из наиболее типичных и-факторов ме-ТПЛОТрофНЫХ бактерий Гаеиботопаэ - ШШЗМИДу рШ.

Научная новизна и практическая значимость результатов. Определен плазмидный состав бактерии 335 штаг.ллов факультативных мети-лотрофов рода Раеиаол.опиэ. Установлено, что клетки 20 % выделенных бактериальшх штампов содержат плазмида различной молекулярной масон (2,1) ыа до 1Ш.л), причем половина из хшх совместно наследуют три и более илазпцчи.Исе изученные илазивдсодеряадио бактерии ха-

рактеризуются широким спектром устойчивости к антибактериальным препаратам, в то время как способность утилизировать такие органические соединения как камцора, толуол, нафталин, октан, ксилол и др. не свойственна указанным микроорганизмам.

Показано, что у плазмидсодержащих факультативных Pseudomonas наиболее часто встречаются плазмиды с молекулярной массой 50 ш, имеющие сходные свойства, одна из таких плазмид (обозначенная рШ] охарактеризована более подробно.

Установлено, что плазмида рЮ, детерминирующая резистентносго к тетрациклину и стрептомицину, принадлежит к группе несовместимое ти Р-9 и является новым R- фактором широкого круга хозяев. Описанная плазмида рМЗ обладает уникальным свойством температурной нестабильности В бактериях семейства Enterobacteriaceae цри 37°С. Продемонстрирована возможность использования плазмиды рШ в качестве инструмента в генетическом анализе некоторых грамотрицатель-ных бактерий, в частности, для транспозонного мутагенеза и мобилизации конъюгационного переноса хромосомы.

В клетках е.coli клонирован мини-репликон плазмиды рШ, обладающий основными свойствами, присущими исходной плазмиде, который может быть использован при создании новых векторных систем для молекулярного клонирования генов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 5-ом съезде Белорусского отделения ВОГиС (Горки, I9B6); Всесоюзных совещаниях "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990);"Фитонциды.Бактериальные болезни растений" (Львов, 1990).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, раздела "Материалы и методы", Результатов исследования и их обсуждения, Заключения и Выводов. Работа содержит страниц машинописного текста, 5 рисунков, 27 таблиц. Библиография включает 198 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий. В работе использованы 335 штаммов факультативных метилотрофных бактерий, выделенных из различных природных ИСТОЧНИКОВ. РЯД штаммов бактерий Pseudomonas ., Enterobacteriaceae, Azotobacter, Methylobacterium, Methylobaoillus, а также содержащих реперные плазмиды известных групп несовместимости получены из коллекций различных лабораторий.

- 4 -

Культивирование бактерий. Бактерии выращивали в бульона lb и минимальной среде M9(J.Miller, 1976). Агаризованные среда содержали 1,5 % агара.

йизиолого-биохимические свойства бактерий определяли общепринятыми методами, изложенными в "Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования" (I9&2), а также описанными R.stanier (IS66). Спектры и уровни лекарственной устойчивости исследуемых бактерий определяли методом серийных разведений препаратов в агаризованной среде.

Стабильность наследования плазмид определяли путем высева плазмидсодержащих бактерий в стационарной фазе роста на полноценную агаризованную среду с последующим реплицированием сформнровав-шихся клонов на среды с антибиотиками.

Наличие плазмаднон ДНК выявляли путем электрофореза в агароз-НОМ геле(T.Eckchardt, 1978).

Выделение плазмидной ДНК осуществляли методом "кипячения" (D.Holmes & M.Quigley, 1981) И щелочным методом (H.Birnboim & J.Doli, 1979).

Обработку ДНК рестриктазами, дотирование фрагментов ДНК, гель-электрофорез, проверку клеток на наличие ллазшд, извлечение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы, а также плазмидную трансформацию клеток проводили стандартными методами (T.ManiatiB et ai., 1984). В работе применяли рестрицирущие эндонуклеазы и ДНК-лига-зу, изготовляемые НПО "Фермент" (Вильнюс).

Скрещивание бактерий проводили на мембранных фильтрах, помещаемых на поверхность агаризованной среды.

Мутагенез. Ауксотрофныз мутанты облигатных метилотрофных бактерий Methylobaciilus М75 получали путем обработки бактерий нитрозогуанидином (С.М.Казакова и соавт., 1986). Транспозонный мутагенез осуществляли с помощью разработанного метода (положительное решение Г? 4445104/30-13 ( 0УЫ46).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЪСЩЩИЕ

Выделение и характеристика факультативных метилотрофных бактерий. Источником выделения метилотрофных бактерий служили образцы почвы и сточных вод, отобранных в местах предполагаемого наличия Oj-соединешш. Из 400 с лишним проб, взятых в различных районах СССР било изо'шров'шо итш..ов чакулътативних метилотроф-

- 5 -

них бактерий, способных помимо метанола утилизировать в качестве источников углерода ряд других органических соединений, а также характеризующихся способностью расти на полноценных питательных средах типа LB.

Выделенные метилотрофы по совокупности физиолого-биохимичес-ких свойств были отнесены к бактериям рода Pseudomonas, причем часть из них определена до вида: Р.aeruginosa (21 штамм),Р.putida (35 штаммов), P.fluorescens (5 штаммов); остальные отнесены К Pseudomonas species.

Методом электрофореза в агарозном геле в клетках 68 изолированных штаммов была обнаружена плазмидная ДНК, причем бактерии 31 штамма обладали тремя и более плазмидами, молекулярная масса которых варьировала от 2,3 Md до Ш5ш, клетки 37 штаммов содержали по одной плазмвде с молекулярными массами 6,4 - 90 Md.

Выявление стенотипических признаков бактерий рода Pseudomonas, контролируемых внехромосомными генетическими элементами позволило . установить, что все они характеризуются множественной лекарственной устойчивостью ( ApR, SuR, SmR, TcR), что позволило предположительно отнести обнаруженные плазмиды к плазмидам R - типа. Проверка на способность утилизации изучавшимися плазмидсодериащими бактериями таких соединений как камфора, толуол, нафталин, октан и ксилол, дала отрицательные результаты, что свидетельствовало об отсутствии среди выявленных плазмид плазмид биодеградации.

Определенный интерес вызвал тот факт, что клетки 16 изолированных из разнообразных цриродных источников плазмидсодержащих штаммов обладают одиночными плазмидами одинаковой молекулярной массы (50 Md),детерминирующими устойчивость к тетрациклину и стрептомицину. Все бактерии,наследующие такие плазмиды отнесены к виду Р,putida.

Таким образом, можно констатировать, что среди метанолутили-зирующих бактерий, выделенных из различных природных источников, наиболее часто встречаются бактерии р.putida, содержащие одиночные плазмиды (50 Md), обладающие идентичными, характеристиками. В дальнейшей работе использовалась одна из таких плазмид, обозначенная рМЗ. Однако некоторые свойства определялись и у остальных 15 плазмид, причем необходимо отметить, что различий выявлено не было.

Характеристика плазмиды рМЗ. В результате конъюгационннх скрещивании было установлено, что плазмида рМЗ с частотой Ю-^ -

- 6 -

а

10 передается в клвтки различных грамотрицательных бактерий, сообщая юл устойчивость к тетрациклину и стрептомицину (табл.1).

Таблица I

Наследование плазшды рШ клетками ' различных грамотрицательных бактерий

Бактерии-хозяева | | в^^^ДГк

! у 'Тс ! ¡Зт

Р.веги^поад РАТ 1, •10" -7 1500 3000

P.mendocina ВКМВ1299 3, .3' •10" -5 300 500

Р.а1;^2ег1 ВКМВ148 1, ,1" ' 10" -б 500 3000

Р.зуг1г^ая 345 б, ■10" -7 1000 3000

Р.(Ит1гнгЬа ВК1.1В968 2, ,5' •10' -7 1000 2500

Р.ри1;1с1а рРН1 5, ,8' •10' -7 1000 2000

Р.Пиогезсепв В172 3, .8' •10" -7 1000 1000

Р.те^уИса 2 1, ,8' •10" -8 1500 3000

М.сараи1а^т 1, ,1' 10" -8 1500 зооо

А.с11Гоососсшп 7/831 1, ,9' •10' •7 20 10

Е.со11 С600 1, ,8' •10" -6 50 100

Еп?.с11гузап1;Ьет1 Е11А49 4, ,6' •ю-ь 10 100

Егуг.ЬегЫсо1а ЕН103 3, ,1' ■10-7 25 100

Егет.арес1ев Юб-7 4, ,5' •10" ■ Ь 50 200

Э. typhimuri.ini 487 1, ,6' •10' -7 100 200

К.аегс^епеа 62-1 1, ,7' •10" -4 200 200

С.ГгеипсЩ 467 8, ,5" >10' •8 100 100

З.твгаевсеаа В140 5, ,6- •10" •7 500 500

Ме№у1оЪас111иа М75 1, ,о< 10" ■9 10 300

В следующей серии экспериментов было установлено, что плаз-мида р'ЛЗ относится к группе несовместимости Р-Э, поскольку передача ее в бактерии, наследующие плазмиду Н2 (1по Р-9 группы) вызывала элрминацию последней и наоборот, введение плазмиды В2 в клет-киP.putida приводит к утрате находившейся в них плазмиды рМЗ. Кроме того, в подобных скрещиваниях частота передачи плазмиды иг или рМЗ была на три порядка ниже, чем при передаче их в беоилазмид-пые 1 елетки, что молвт свидетельствовать о поверхноотном исключении совмещаемых плазмид одной группы несовместимости. Сравнение

- 7 -

основных свойств R-плазмид inc Р-9 группы несовместимости позволяет считать, что плазмида piß является новой, ранее не описанной плазмидой принадлежащей к этой группе.

Отличительной особенностью плазмида рМЗ является ее структурная нестабильность, в результате чего возникают делоционные, теряющие маркер тетрациклинрезистентнос ти, варианты. При этом, электрофореткчески регистрируется уменьшение молекулярной массы плазмида. Делеционные варианты, имеющие фенотип TcsSmR, сохраняют основные свойства плазмида, т.е.,способны передаваться и наследоваться клетками различных грамотрицательных бактерий. Делеционные производные плазмида рШ формируются цри длительном культивировании клеток-хозяев в неселективных условиях (с частотой 0,5$), а также образуются в трансконъюгантах, возникающих при передаче плазмида рМЗ в гетерологичных системах скрещивания .(с частотой до 6%). В дальнейшэм было установлено, что образование'таких вариантов не зависит от состояния рекомбинационной системы скрещиваемых . бактерий (табл.2).

Таблица 2

Зависимость образования дТс-вариантов плазмида рЮ от состояния reoА - системы скрещиваемых бактерий

Донор

! ! Частота ! Частота обра-

I Реципиент I передачи! зования л Тс

! ! плазмида! вариантов($)

P.putida ы Р.putida Ы Erw.Chrysanthemi VTO528 (recA+) Erw.Chrysantherai VY0525 (recA")

E.coli C600 (recA+) E.coli DH1 (recA")

1,8 »10 8,3'10"6

6,5'Ю"4

E.coli C600 (recA+) E.coli C600 (recA+) 1,9-10

3,0 1,0

0,5

0,5 „

Поскольку структурная нестабильность плазмида рМЗ не зависит от полноценности гес-системы клетки хозяина, то можно предполагать, что она содержит транспозоноподобные элементы подобно другим плазмидам 1пс Р-9 группы. Однако экспериментальных доказательств наличия транспозонов в плазмиде рШ не было получено.

Другой особенностью плазмида рМЗ является ее неспособность поддерживаться в клетках бактерий семейства ЕгПегоЪа^ег1асеае при температуре 36°С и выше, тогда как в клетках Рвеийотопаа в

- В -

аналогичных условиях она наследуется стабильно (табл.3). Ранее такого типа ts-плазмид описано не было.

Таблица 3

Наследование плазмиды рШ различными грамотрицателышми бактериями

Бактерии-хозяева \ Сохранность плазмиды (в JLSHi _ 1_28 С ! 37°С_

Р.aeruginosa PAT 100 100

P.mendocina ВКМВ1299 100 100

P.stutzeri ВЮЛВ148 100 100

P.syringae 345 100 100

P.dirninuta BKMB968 100 100

E.coli C600 ■ 68 0

Erw.chryaanthemi EIIA49 99 0

Erw.herbicola EH 103 89 0

Erwinia ap. 106-7 90 0

Salmonella typhimurium 407 25 0

K.aerogenes 62-1 99 0

C.freundii 4^7 47 0

S.marcescens B140 99 0

Температурная нестабильность плазмиды рМЗ в гетерологичных хозяевах представляет определенный интерес в плане изучения особенностей ее репликации, а также возможностей использования в качестве инструмента в некоторых генетических манипуляциях.

Клонирование гер-области плазмиды рМЗ. В целях изучения особенностей репликации плазмиды рМЗ была клонирована в клетках е.coli ее гер-область. Для этого фрагменты плазмидной ДНК, ответственные за репликацию, полученные при частичном гидролизе рестрик-тазойРа-н лигировали с Pst 1-фрагментами (1,4 т.п.н.) вектора рис4К, несущими KmR- ген и продуктами датирования трансформировали клеткиЕ.соИ TQ-1. Отобранйые таким образом щэансформанты наследовали плазглиду размером 8,6 т.п.н., обозначенную рМТ2, которая помимо Psti- фрагмента о KmR- геном, содержала шесть Psti фрагментов, общей протяженностью 7,2 т.п.н. На рис.1 цредставлена рестрикционная карта полученной плазмиды рМТ2, построенная с использованием шести рестриктаз.

- 9 -

иЬ&44

Ве111

Рис.1. Рестрикционнад карта плазмида р«ГГ2.

Изучение плазмиды р!ЛТ2 показало, что следствием уменьшения размеров исходной плазмиды явилась потеря конъюгационнзй трансмис-оибельности и утрата генов, детерминирующих антибиотшсорезистент-ность. Вместе с тем, клонированная структура содержала 1пс-гены, обеспечивающие ее несовместимость с исходной плазмидой и сохраняла способность к переносу в различные грамотрицатеяьные бактерии путем мобилизации конъюгативной плазмидой ер 4 кш? Кроме того, плазмида рМГ2, аналогично исходной плазмида рМЗ, характеризовалась температурной нестабильностью в бактериях семейства ЕгПегоЬас^е-г1асеае (табл.4).

Таблица 4

Наследование плазмиды рМТ2 различными бактериями .

Бактерии-хозяева

1 Частота ! Стабильность наследования

I восприятия! плазмиды (в %) при_

! плазмиды Г

28 иС

3?°С

Епя.сЬгуаап^ет! ЕЫАД9 К.вего£епев 62-1 С.£геип(111 467 ЗЛурМтиг1ит 487 З.тагсевсепа В140 Р.рииаа II Р.ри1;1с1а рР01 Р.а1;1^гог1 ВК11В148 Р.ауг1пвае 345 Р.тепдос1па ВКЬ!В1299

-6 -3 -8 -6

4,1'Ю 2,3-10 5,7-10 2,1-10' 3,2-Ю"6 4,4-Ю"5 2,1 -10"5 4,6-Ю"4 5,2-Ю"4 7,9-Ю"8 - 10 -

80 86 20 50 90 100 36 71 54 99

О О О

О

о

73 40 97

Сравнительное исследование tв-функции плазмид рМГ2 и Ша1 (1пс т- группы), показало, что в отличие от та1, ta-фeнoтид рМГ2 в составе вектора рВЛ322 не выражается и, следовательно, имеет иную природу.

Таким образом, в результате указанных экспериментов получен мини-репликон плазмиды рМЗ,-что может свидетельствовать о локализации гер-области в относительно небольшом фрагменте ДНК данной плазмиды.

Использование плазмиды рМЗ для транспозонцого мутагенеза бактерий семейства ЕггЬегоЬа(^ег1асеав. Нестабильность наследования Плазшды рМЗ в бактериях семейства Е^егоЪвсЬег1асеае при 37°С явилась основанием для создания на ее основе вектора для транспозонного мутагенеза этих микроорганизмов, что было изучено на бактериях Бп». сНгуаап^ега1 Е!1А49. Используя делеционный вариант плазшды рШ (обозначен рМЗ-5) в конъюгационных экспериментах получены производные векторные плазмиды, содержащие различные транспозоны: Тп9 (плазмида рМТР9 ), ТгИО (плазмида рмтрю) или одновременно два!транспозона Тп5 и Тп9 (плазмвда рЮТ59 ).

Пригодность полученных вариантов плазмиды рШ для введения транспозонов в клетки Ег^.сЬгувап-ььет! УУ1449 оценивалась на основании частоты транслокации указанных выше транопозонов в хромосому хозяина, а тглже по возникновению ауксотрофных мутаций. В результате было установлено, что с наибольшей частотой транслоци-руется транспозон Тп5(2,9 10"^), вызывая при этом появление различных ауксотрофных мутаций с частотой 2,4$. Частота транслокации транспозонов Тп9 и тпЮ «казалась на порядок ниже, причем транслокация транспозона ОВД, в отличие от Тп5 и ТпЮ, не вызывала образования ауксотрофных мутаций (табл.5).

Таблица 5

Транслокация транспозонов Тп5, Тп9 и ТпЮ из плазмид в хромосому Егиг.1п1а сЬгуаапШет! ТПС1449

рМТРЭ Тп9 (СтК) 2,3-Ю"4 рМТРЮ Тп10(ТсН) 4,6*10"4 рГГР59 Тп5 (КшК) 2,9-Ю-3

1,5

2,4

О

Тг9 (Сгай) 1,2-10~4

... п _

О

Таким образом, транспозонсодэрхащие варианты плазмиды рШ могут быть использованы в качестве векторов для транспозонного мутагенеза бактерий Епк.сЬгузап^ет! ЕНА49.

Температурная нестабильность плазмиды рМЗ у бактерий семейства Е1^егоЪас^ег1асеае обосновывает использование транспозонсодер-жащих вариантов (в частности, плазмиды рМТР59) для транспозошюго мутагенеза этих микроорганизмов (табл.6).

Таблица 6

Транслокация транспозонов Тп5 и Тп9 из плазмиды рЮТ59 В хромосому бактерий Enteгobaoteriaoeae

Штамм » Транспозон ! ! Частота J транслокации ! Частота по! явления аук-! сотрофных му! таций (в %)

Erw.herbicola ЕН103 Tn5 (Кшк) 9,9 10-4 5,5

Tn9 (CmR) 1.4 Ю-6 0

Erwinia ер. 106-7 Tn5 (Кшг) 5,1 ю-3 1.5 '

Тп9 (СшН) 3,5 10-5 0

E.ooli С600 Тп5 (KmR) 8,8 ю-3 1.1

Тп9 (CmR) 1,1 ю-4 0

K.aerogenes 62-1 Тп5 (KraR) ■6.7 ю-з 0.4

Тп9 (CmR) 1.7 lo"4 0

C.freundii 476 Тп5 (КшК) 1.2 ю-2 0,5

Тп9 (CmR) 3,0 10-4 1,5

S.typhiraurium 487 Тп5 (KmR) 3,1 lo"4 2,0

Тп9 (CmR) 4,2 10-5 3,2 .

S.marcescens B14Ö 1п5 (KmR) 2,0 ю-з 0,4

Тп9 (CmR) _

Частота транслокации транспозона Тп5 достаточно высока и достигает 1,2'Ю-2 (для c.freundii ); ауксотрофные мутанты появляются при этом с частотой 0,4-5,5 %, а достаточно широкий спектр мутаций зависимости от аминокислот (met, his, arg, cys, trp, orn, thr, lya, pro, aro и др.) свидетельствуют о неспецифичности встраивания данного транспозона в хромосому.

В то ке время транслокация транспозона Тп9 осуществляется с

более низкой частотой, а в случае бактерий s.marceacena его транслокация вообще не установлена. Появление ауксотрофных мутантов при транслокации Тп9 регистрировали только у двух штаммов S.typhi-muriuin и с.freund!i с частотой 3,2 - 1,5$ соответственно.

Таким образом, приведенные результаты подтверждают возможность использования транспозонсодержащих вариантов плазмиды рМЗ в качестве векторов для транспозонного мутагенеза бактерий семейства Enterobrcteriaceae.

Хромосоммобилизующая активность плазмиды рШ. Плазмида рМЗ является трансмиссибельной и способна передаваться различным грамотрицательным бактерия;,!, обосновывая ее использование в качестве хр и :о с о ммо d илиз ующе г о фактора при конъюгационном анализе определенных грамотрицательных бактерий, не имеющих собственных систем генетического обмена/ например, облигатных кетилотрофовМе^у-lobacillua 1.175 и фитопатогенных Erwinia), что достигается путем ее интеграции в хромосому клетки-хозяина.

Включение плазмиды рШ в хромосому указанных микроорганизмов, по-видимому, цроисходит вследствие рекомбинации по участкам гомологии, возникающим за счет мигрирующих элементов, предположительно имеющихся в хромосоме клеток-хозяев (в случае Methylobacillus М75),-ЛИбо ВО вводимой плазмиде ( В случае Erw.Chrysanthemi ЕНА49).

Действительно, было установлено, что клетки облигатных мети-лотрофных бактерий Methylobacillus М75 с очень низкой частотой '*-(1,0*10"®) способны восцринимать плазмиду рМЗ и стабильно наследовать детерминируемые ее генами маркеры лекарственной устойчивости. Однако, с помощью электрофореза бактериальной ДНК трансконъюган-тов, плазмидная ДНК в них не выявлялась. Это позволило предположить, что в клетках Methylobacillua М75 плазмида рМЗ наследуется только в интегрированном в хромосому состоянии. При использовании таких вариантов в качестве доноров в скрещиваниях с пзогенными бактериями Methylobacillus М75 met-trp- было зарегистрировано образование прототройных трансконъюгантов.

Таким образом, конъюгационные эксперименты подтверждают, что бактерии Methylobacillus М75, наследующие плазщду рМЗ, являются донорами хромосомных генов, причем передачу они осуществляют по типу Hfr - доноров E.coli, т.е. с определенной точки oriT и одно-направленно.

Из бактерий Erw.chryeanthemi ENA49 не удалось получить стабильных Hfr- доноров при выращивании клеток, содержащих плазмиду

- 13 -

рМЗ в непермиссивных для ее репликации условиях (37°С). В этом случае имела место 100^-ая элиминация плазмиды. Доноры Hfг-типа Erw.chrysanthemi бы ли получены лишь с использованием транспозон-содержащей плазмиды рМТР59 вследствие интеграции плазмиды по участкам гомологии, возникающим за счет транслокации транспозонов в бактериальную хромосому. Использование таких бактерий в качестве доноров в скрещиваниях с изогенными реципиентами обеспечивало относительно высокую частоту передачи хромосомных маркеров (табл.7)

Таблица 7

Передача генетических маркеров в изогенных скрещиваниях бактерий Erwinia chrysanthemi ЕЫА49

Скрещивание ! Частота передачи селектируемых маркеров ___! trp"1" ! arg* ! leu"1"' .' KmR

Erw.chrysanthemi ENA49-4 -> с с p

Erw.chrysanthemi VY3736 3,2-10"J А.О-Ю"5 2,5-10"b 3,2-10^

Erw.chrysanthemi ENA49-3

Erw.chrysanthemi TL3736 1,0*10~6 1,5'Ю"-3 1,5• 10~5 1.0-10"2

Плазмица pMTF59 как вектор для транспозонного мутагенеза бактерий Methylobacillus М75. Неспособность к автономной репликации В клетках облигатных метилотрофов Methylobacillus М75 обеспечила возможность применения ее транспозонсодеркащих вариантов в качестве векторов для транспозонного мутагенеза этих генетически малоизученных шкрооргализмов.

При передаче плазмиды рМТР59 бактериям Methylobacillus Ы75 транскокъюганты, селектируеше по маркеру транспозона тп5 (KmR) возникали с частотой в 100 раз превышающей образование трансконъ-югантов, селектируемых по маркерам, детерминируемым исходной пла-змидой рШ. Это может свидетельствовать е пользу того, что в первом случае отбираются бесплазмидные клетки, у которых произошла транслокация транспозона Тп5 в хромосому. Результаты электрофоре-тичиского анализа (отсутствие экстрахромосомалъной ДНК на электрофоре граммах) и конъюгационные эксперименты (отсутствие передачи КшЕ-маркера, а также пере транс локация Km? маркёра в плазмидуич Kms ) подтверждают хромосомную локализацию транспозона Тп5 в клетках Methylobacillus М75, а, следовательно, и возможность исполь-

- 14 -

зования плазмида pMTF59 в качестве вектора для транспозонного мутагенеза этих микроорганизмов.

Анализ полученных результатов и их сопоставление с данными литературы, позволяет сделать следующие выводы:

1. Выделенные из различных природных источников 335 штаммов факультативных метилотрофных бактерий отнесены к роду Pseudomonas, часть из них идентифицирована до вида: Р.aeruginosa (21 штамм), Р.putida (35 штаммов) и P.fluorescena (5 штаммов), остальные штаммы отнесены к группе Pseudomonas species.

2. Путем электрофоретического анализа было установлено, что в 20$ клетки выделенных штаммов обладают плазмидами, молекулярная масса которых варьирует от 2,3!.!а до l05Md, причем у половины из них обнаруживается по три и более плазмид. Выявленные шгазмиды,

по всей вероятности, являются плазмидами R-типа, так как бактерии, обладающие шли, характеризуются множественной лекарственной устойчивостью.

3. Наиболее часто среди плазмидсодержащих факультативных метилотрофных бактерий встречаются штаммы, клетки которых содержат единичные плазмиды с молекулярной массой 50Md, характеризующиеся сходными свойствами. Одна из них (рМЗ) является трансмиссибелышгл R-фактором широкого iqpyra хозяев,'относится к группе несовместимости Р-9 и способна наследоваться бактериями различных таксономических групп.

4. Плазмида р,',13 отличается структурной нестабильностью и при конъюгационной передаче в гетерологичные бактерии или при длительном культивировании в неселективных условиях образует делеци-онные варианты с меньшей молекулярной массой, утратившие лскус тезрациклинрезистентности. Образование делеционных вариантов плазмвды pf.Q является процессом, независимым от полноценности гесА- системы клетки-хозяина.

5. Находясь в клетках гетерологичных хозяев, таких как бактерии семейства Enterobacteriaceae, плазмида рЮ проявляет выраженную зависимую от температуры нестабильность, а в клетках облигат-ного метилотрофа Uethylobaoilius М75 вообще не способна автономно реплицироваться. Учитывая эти особенности, на основе плазмиды piß, созданы транспозонсодержащие варианты (рКТРЭ, pMTFlo, PMTF59), которые могут использоваться в качестве векторов для транспозон-

- 15 -

ного мутагенеза бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также отдельных цредставитвлей облигатных метилотрофных Methyiobaciiius.

6. В клеткахЕ.coli клонирована rep-область плазмиды paß, размером 7,2 т.п.н., содержащая oriv итоЬ- сайт, гер- гены,, обеспечивающие репликацию в широком круге хозяев, а также область, детерминирующую несовместимость с другими плазмидами. Полученный мини-решшкон, подобно исходной шгазмиде, характеризуется температурной нестабильностью в бактериях Enterobacteriaceae. Механизм, обеспечивающий температурную нестабильность мини-репликона (а также исходной плазмиды piß), отличается от такового наиболее изученной в этом отношении плазмиды Rtsi.

7. На основе плазмиды рМЗ создан донорский штамм (Hfr-типа) Methyiobaciiius М75, клетки которого способны при конъюгации передавать хромосомные гены с фиксированной точки oriT и в определенной последовательности. Транспозонсодержащие варианты плазмиды рМЗ могут быть использованы для создания конъюгационных систем дож генетического анализа некоторых бактерий семейства Enterobac

terlaceae. ■'

Работы, опубликованные по материалам диссертации:

1. Титок М.А., Желдакова P.A., Могилевская М.И. Характеристика R-плазмид, детерминирующих тетрациклинрезистентность у факультативных метилотро^ных бактерий Pseudomonas //в сб. Физиология, генетика и биохимия метилотрофных микроорганизмов. - Киев: Навукова думка. - 1986. - С.88-93.

2. Титок М.А., Желдакова P.A. Плазмида рШ метилотрофныхPseudomonas вр.м // Тез.докл. 5-го съезда БелОГиС. - Горки. - 1986.4.2. - С.79-80.

3. Титок М.А., Лысак В.В., Кульба A.;.l. R- плазмиды факультативных метилотрофных Pseudomonas: характеристика плазмиды р.,13 // Вастн.Белорусского ун-та.Сер.2. - 1989. - Я2. - С.42-46.

4. Титок М.А., 'Прокулевич В.А., Максимова H.H., <юмичев Ю.К. Использование плазмиды рШ Pseudomonas up.H ДЛЯ траНСПОЗОННОГО мутагенеза бактерий Erwinia// Молекул.генетика. - 1989. - HI. -С.45-48.

5. Титок М.А., Максимова H.H., Прокулевич В. А., 4о;/,ичев Ю.К. Плазглпдная ДНК рНТР59, предложенная для для трансиозонного мутагенеза бактерий семейства Knterobacterinceae // Положительное решение К- 44451U4/30-13 (095146) от IU.U3.I9U9.

6. Титок М.А., Евтушенков А.Н. Клонирование rep-области плазмида рМЗ Р-9 группы несовмеотимости // Тез.докл. Всас.симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". М. - 1990.- С.89

7. Титок М.А. Система для транспозонного мутагенеза бактерий Erwinia с использованием плазмиды рМТР59 // В сб. Фитонциды. Бактериальные болезни растений. - Киев-Львов. - 1990. - 4.2. -С.5-6.

8. Titok М.А., Maksimova Н.Р. Plasmid рМТР59 (Inc Р-9) sas а vector for transposon mutagenesis in Enterobacteriaceae // 6th Int.Symp. on the Genetics of Industrial Microorganisms. Strasbourg, 12-18 August, - 1990. — P.I37.

Подписано к печати 12.11.90 г. Формат 60x84 1/16 Объем печ.п. 1,0 Тираж 130 экз. Заказ Э<3? Бесплатно. Отпечатано на ротапринте БГУ имени В.И.Ленина