Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и изучение экспрессии гена met3 S. cervisiae

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и изучение экспрессии гена met3 S. cervisiae"



ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

НГУЕН НПЖ ТХАО

УЖ 575.113:577.1

КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА теЬЗ 5.сегеШБ1ае

(специальность 03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени .кандидата биологических наук

Киев - 1988

Работа выполнена в отделе биосинтеза нуклеиновых кислот Института молекулярной биологин и генетики АН УССР, в отделе генетики Института экспериментальной биологии Национального центра научных исследовании СРВ, Хошимин, и в лаборатории энзимологии Национального центра научных исследований Франции, Жиф-сгар-Иветт

Научные руководители: кандидат биологических наук

НГО КЭ сыонг,

доктор биологических наук,

В.А.КАВСАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.А.КОРДЮМ

доктор биологических наук

в.с.повторении

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Минмедбиопроиз. СССР

Защита, состоится " У I 1988 г. в часов на заседании Специализированного совета К.016.11.01 при' Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу: 252627, Киев-143, ул.Забопотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР

Автореферат разослан "О " 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Лукаш Л.Л.

. • ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуапьность исследования. Метионин представляет собой одну из незаменимых аминокислот у дрожжей, участвующих в биосинтезе клеточного белка и переносе метилового радикала в клетках через промежуточный продукт - 5-аденозил-иетионин (SAM).

Сведения, полученные ранее при изучении ферментных систем, входящих в цикл биосинтеза метионина (рис.1) в различных условиях культивирования диких и мутантных штаммов дрожжей, показали, что:

- процесс биосинтеза метионина регулируется путем изменения уровня синтеза нескольких ферментов (Antoniewski.Robichon-SzulmaJster, 1973);

- в этом процессе принимают участие по меньшей мере 5 ферментов, имеющих одинаковую систему регуляции:сульфат-пермеаза.АТФ-сульфу-рилаза, аденозил-фосфосульфаткиназа, супьфитредуктаза и гомоци-стеинсинтетаза. Структурные гены этих ферментов генетически не связаны и автономно функционируют в клетках; регуляторными сигналами этих генов являются 5-зденозпл-иет)юнин (SAM) и DL-метионин (Cherest et al.,1969,1973; Breton,Surdin-Kerdan,1977);

- в регуляции биосинтеза метионина могут принимать участие некоторые ассоциированные формы метионин-аденозилтрансфераз (Cherest, Surdin-Kerdan, 1981), катализирующих превращение метионина в S Ali.

Известно,что у дрожжей, наряду с "общин" путем регуляции биосинтеза аминокислот, существуют специфические механизмы регуляции, характерные для каждой из аминокислот (DeIforge et al., 1975; Uolfner et al.,1975; 11 ieJerberger et al.,1981; Carsiotis et al.,1965; Stephens et al.,1975). Ранее для некоторых аминокислот (гистидпна (Struhl,1982; Donahue et al.,1983) и триптофана (Zaikin, Vanofsky,1982)) было показано, что "общий" путь регуляции реализуется на транскрипционном уровне, в то время как специфическая регуляция, например, биосинтеза аргинина (Mesenguy, Dubois, 1983) является посттранскрипционной. Для метионина этот вопрос не был изучен. Настоящая работа привела к пониманию регуляции синтеза АТФ-сульфурилазы, кодируемой геном met3 и катализирующей один из этапов синтеза метионина.

Пел}? работы. Целью настоящей диссертационной работы было клонирование структурного гена met3, кодирующего АТФ-супьфурилазу, и изучение его экспрессии в клетках дрожжей в различных условиях культивирования.

- г -

Для достижения данной цепи последовательно решалось несколько задач:

1) получение банка генов S.cerevisiae, штаым D2B;

2) выделение фрагмента ДНК дрожжей, содержащего ген met3, путем отжига его с химерным плазмидным вектором pFLl (Chevallier et al., 1979), сконструированной из бактериальной плазмиды pBR322, дрожжевой плазмиды 2|а и гена игаЗ дрожжей; получение характеристик и рестрикционной карты этого гена;

3) исследование экспрессии гена met3 в клетках дрожжей в различных условиях культивирования и выяснение механизма регуляции биосинтеза АТФ-сульфурилазы.

лспдрт^Т

HTÏ'-Cy/lb'î'yFM/l/l-^

roMocERiH йфг:

^н'ЬС-f'MH AJ

• ®АФС

С1-ЛЦЕТИ/1-

-L-rOMOCFPHH " i

1ГОМОЦИСТЕИН- ' [«^«ТРЕШИАМ СИНТЕТЛЗЛ

■ Г"

ГОНОЦИСТЕИН

I

МЕТИОНИН

I

S--OXJEHOÏ ИЛ-МЕТИОНИН

Рис.1. Цикл биосинтеза метионина (упрощенная схема - по Breton et al., 1977): АФС - аденозин 5'-фосфосульфат, ФАФС - 3'-фосфоаденозин-5*-фосфосульфат.

Новизна исследования. С помощью химерного плазмидного вектора pFLl впервые изучена экспрессия гена met3 в клетках дрожжей и показано, что специфическая регуляция этого гена, кодирующего АТФ-сульфурилазу, осуществляется на уровне транскрипции. Впервые установлен размер структурного гена met3, равный 1,7 т.п.н., и построена его физическая карта.

Практическое значение. Получен банк нуклеотидных последовательностей дрожжей, применяемый для выделения различных структурных генов дрожжей. Сконструированная в работе серия плазмид на базе химерного плазмидного вектора pFLi успешно применена в ген-ноинженерных исследованиях дрожжей. Выделенный в работе структурный ген met3, кодирующий АТФ-сульфурилазу, может служить в качестве маркера при изучении процессов транскрипции и трансляции у дрожжей.

Апробация. Результаты исследований докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории энзимологии Национального центра научных исследовании Франции и на семинарах и ежегодных научных конференциях Института экспериментальной биологии Национального центра научных исследовании СРВ (Хошимин).

Публикации. По результатам выполненных исследований имеется 8 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав и выводов, содержит А2 0 страницы машинописного текста, г/ рисунков и 7 таблиц. Список использованной литературы включает Z2S наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы штаммы E.coli и S.cereoisiae, полученные от различных исследователей (табл.1).

Культуральная среда для бактерий соответствует Patte et al. (1966). Дрожжевые клетки выращивались на минимальной среде на основе 'Difco Veast Hitrogen Base (0,7%) с добавлением '¿У. глюкозы (среда VHB). Для ауксотрофных штаммов добавлялись урацил (10 мкг/мп), L-гистмдин (200 мкг/мл), DL-лейцин (50 мкг/мл) и DL-we^ тионин (0,2 мМ). При изучении регуляции синтеза АТФ-сульфурилазы и гомоцистеин-синтетазы DL-метионин добавлялся в концентрации 2 мМ. Перед трансформацией клетки дрожжей выращивали на полной среде VPGA (дрожжевой экстракт 0,5Х, пептон 0,5Х, глюкоза ЗУ. и аденин 20 мкг/ил).

В работе использован химерный плазмидный вектор pFLl, построе-

нный из плазмиды pBR322 и плазмиды 2yU дрожжей (Cheuallier-et al., 1979); pFLl может самостоятельно функцнони1Х>вать как в бактериальных, так и в дрожжевых клетках. Кроме этого, плазмидэ. pFLl содержит дрожжевой ген игаЗ, кодирующий ОМФ-декарбоксилазу и комплементирующий мутацию игаЗ в клетках дрожжей или мутацию purF в клетках E.coli.

Таблица 1

Характеристики бактериальных и дрожжевых штаммов

1 Организм I i I Штамм I i Генотип I I i От кого получен I 1 i

1 Escherichia 1 DB6658 pyrF: Hu trp,lacZl D.Bach I

1 coli I hsdR 1 I

1 I C600 I thr, met, recBC, i r~m~ I A.Campbell 1 I

1 Saccharomyces 1 FL100 a ' 1 F.Lacroute 1

I cerevisiae 1 1CC359-0L I. I a, ura3-251, 1 ura3-373, his3, I leu2 I H.Cherest I I I

ICC371-4B I o< , ura.3-251, t ura3-373, met3, I H.Cherest 1 I

I I his3, leu2 Í

J 1 GRF-18 o< , his3, le<j2 I G.Fink I

I I D2B cX , le*j2, his3, I H. Cherest 1

I I sa.m 1 I

Банк генов дрожжей получали по методу Loison et al.(1981), при этом для неполного гидролиза тотальной ДНК дрожжей применяли рестриктазу Sau3A.

Препарат тотальной дрожжевой ДНК получали, как описано Cherest et al.(1973). Препаративное выделение плазмидной ДНК из E.coli проводили по методу Cleuell, Helinski (1972). Аналитические количества плазмидной ДНК из E.coli выделяли по методу Birnboim, Dolw (1979): Перенос плазмиды pFLl из S.cereuisiae в клетки E.coli проводили по методу Crabeel et al.(1981).

Прямая трансформация дрожжей плазмидой pFLl осуществлялась по Hinnen et al. (1978). Трансформацию клеток E.coli проводили по методу Cohen et al.(1972).

Неточный экстракт из дрожжей получали по методу Cherest et al.(1973).

Активность ферментов определяли по выходу продукта соответствующей реакции (в нМ в мин на 1 иг исходного белка); для АТФ-су-льфурилазы таким продуктом был фосфат (реакция по Uito, Dreyfuss (1964)3;для гомоцистеинсннтетазы - гомоцистеин (UieLers, Garner (1967)); для ОНФ-декарбоксилаэы - УМФ-рибоза (BecVuibh et al., 1962)). Определение количества гомоцнстеина проводили по методу Kredich, Tomkins(1966); концентрацию белка в пробе определяли по методу Cornall et al.(1949) с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

Электрофорез ДНК проводили в агарозном геле по методу Helling et al.(1974).

Для генетического анализа трансформантов применяли тетрадный анализ спор дрожжей OlcClaru, 1959).

Получение дрожжевой РНК и нозерн-блотов производили,как описано нами (Cherest et al.(1985).

Скорость синтеза РНК'in vivo определялась путем внесения метки (3Н-аденин) в клетки дрожжей в условиях Chevallier et al.(1980)) и гибридизации экстрагированной РНК с иммобилизованным ДНК-зондом.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение банка генов S.cereuisiae. Очищенную центрифугированием в градиенте плотности CsCl-EtBr тотальную ДНК S.cerevisiae, штамм D2B, подвергали неполному гидролизу рестриктазой Sau3A. Полученные таким образом различного размера фрагменты дрожжевой ДНК отжигали по BamHl-сайту в плазмидном векторе pFLl, после чего такими плазии-дани трансформировали клетки E.coli, штамм СБ00. Скрининг рекоиби-нантных клонов проводили по маркерам Amp"- , Tet . Частота трансформации составляла 10t5 трансформантов на 1 мкг ДНК, применявшейся для трансформации.

Получение дрожжевых трансформантов, несущих фрагмент ДНК с геном

met3.Полученный банк последовательностей ДНК S.cerevisiae штамма D2B использовали для трансформации клеток мутанта СС371-4В met" , . uraT Рекоибинантные плазшщы содержали гены met.3 и игаЗ, поэтому они комплементировали одновременно две мутации met" и ига- . В результате трансформации двойного мутанта СС371-4В met" ига" этими плазнидами на селективной среде без метионина и урацила получили 3 трансформанта с новыми свойствами met4', ura+ . Из них были выделены 3 плазмиды: рМ1, рМ2 и рМЗ. Методом электрофореза в агарозном геле было показано, что ппазмиды рМ1 и рМЗ имели такую же мол.массу, как pFLl (7,6 т.п.п.), но не содержали BamHl-сайта. Плазмида рМ2 имела большую, чем pFLi, иол. массу (11,4 т.и.н.), а также содержала новый сайт EcoRl, отсутствующий в исходном векторе. Была получена карта рестрикции рМ2; на клонированном фрагменте дрожжевой ДНК были найдены сайты для следующих рестрнктаз: Bg1(1, Xhol, EcoRI, SphI, Hindi II, Sail. Был определен размер клонированного фрагмента ДНК, несущего ген met3 (3,8 т.п.н.). Эта плазмида была названа рМЗ-1 (рис.2).

Доказательство наличия гена' met3 в ппазмиде рМЗ-1. Первое доказательство наличия гена met3 в рМЗ-1 было получено иетодои прямой трансформации мутанта СС371-4В ига" .. met" , в результате которой было получено большое количество трансформантов ura+ , met+ , причем количества трансформантов ura+ и met* почти совпадали. Это свидетельствует о том, что гены ura и met сцеплены и передавались вместе (таб.2).

Таблица 2

Результаты трансформации штамма СС371-4В плазмидой рНЗ-1 (число колоний на 0,1 икг внесенной ДНК)

I VHB his, I I leu, ига I

1-:-1

I 0 I

1 0 1 I 125 I

1 VPGA 1 VHB his, leu I VHB his, [ leu, met

I CC371-4B I 100

t CC371-4B ♦ pFLl 1 -1 CC371-4B ♦ pM3-l I -

1 met, ига

I 120 I -1 -

i 0 I 100 I 119

1-

Частота трансформации: 1200 трансформантов/1 мкг ДНК

Трансрормйц ut turn MHCiCCfli'bBmtl" ига ~

приняты обозначения:

E - EcoRI, X - Xhol, H - Hindi 11, A - Aual, G - Bglll, L - Sail, S - Sphl,. S - Sau3A; К - Bstl, T - Taql, В - BamHI, P - Pstl.

Далее провопили анализ генераций трансформантов ura"1" , met4" в процессе митозного деления.Трансфорианты культивировали на полной среде VPGA, а после 10 генерации проверяли признаки у новых клонов. При этом 55Х клонов стали met" , ига- , а после 25 генераций 9&-95Х клонов потеряли признаки ura"1" , met+ . Аналогичные результаты получили, анализируя признак ura+ в клонах, несущих вектор pFLl. В то же время на минимальной селективной среде VHB все клоны сохраняли признаки met4" , ura+ при митозном делении. Все это говорило о том, что признаки met4" , ura+ трансформантов сцеплены между собой и не связаны с хромосомапьной ДНК клетки. Эти признаки перенесены генами met3 и игаЗ плазмиды рМЗ-1 (рис.3).

to

SO to го

to во ho го

10

го

зо

- у/т

-IPSA

*0

vní

У Г, к

ю го in i" Число генераций

Рис.3. Количество клеток с фенотипом ига4" (—°—) и met"1" С—' —) при различных условиях культивирования: а - штамм CC371-4B[pFLl], Ь - штамм CC37i-4B[pM3-l]

Трансформант игаь , met+ (штамм СС371-4В ura.3, his3, leu2, met3 с плазмидой рНЗ-1) скрещивали с исходным штаммом FLIOOa и проводили анализ некоторых тетрад. Оказалось, что признаки his, leu подчиняли законам Менделя: половина спор имела признаки от трансформанта (his leu ), а половина спор - признаки от FL100a. В то же время получили 85% спор с признаками met+ , ига4" , причем число спор с признаками met* и ига*" равны между собой. Все это говорит о том, что плазмида рМЗ-1 действительно содержит гены шеЬЗ и игаЗ, передаваемые поколен ями в процессе мейоза (таб.3).

Клонирование набора различных фрагментов, несущих ген гоеЬЗ. Методами генной манипуляции и прямой трансформации мутанта met", ига" получены следующие плазмиды:

рМЗ-2 - получена из плазмиды рМЗ-1, но без фрагмента Bglll-Bglll; рМЗ-З - получена слиянием фрагмента Bglii-Bglll в сайте BamHI плазмиды pFLl;

рМЗ-4 - получена из рМЗ-1, но без фрагмента между сайтом Sail на

дрожжевой ДНК и сайтом Sail на плазмиде pBR322; рМЗ-12 - получена из рМЗ-4, но без фрагмента BamHI-BglH; pM3-13 - несет фрагмент Sall-Sall, в который входит ген met3; рМЗ-5 - построена из плазмиды pBR322.c фрагментом BamHl-Sall из рНЗ-4.

Карты рестрикции этих плазмид показаны на рис.4.

г_и Sit А

^г'-^пш I

f

_J

р

pMS-2 ptil-3 pM3-h pM3-U pMi-a ftli-S о

wmj

J I t

BGX £SS»L V

I It HI

+ + +

I L f -i-UvJ

10 H

Т.П.Н.

Рис.4. Схема получения и рестрикционные карты основных плазмид; знаком (+) отмечены плазмиды, несущие ген шеЬЗ, комплементирующие мутацию met" (обозначения см.рис.2).

Результаты прямой трансформации показали, что только плазмиды рМЗ-1, рМЗ-4, рМЗ-12 и pM3-13 могли комплементировать мутации met- , ига- . Это свидетельствует о том, что в структурном гене теЬЗ имеются сайты рестриктаз Xhol, EcoRI, SphI и Bglll. Размер фрагмента ДНК, несущего ген met3 в плазмиде рМЗ-12, составлял 2,3 т.п.н.

Определение направления транскрипции гена гоеЬЗ. Для определения направления транскрипции гена met3 был использован фрагмент ДНК Sal I—Sal I размером 4,4 т.п.н. в pM3-13; этот фрагмент был отожжен по Sail-сайту в плазмиду pFLl. В результате было получено 2 новых плазмиды рМ13-2 и рМ13-5. Электрофоретическш! анализ рестриктов.

- 1В -

показал, что рМ13-2 и рМ13-5 содержат ген иеЬЗ, но в двух противоположных ориентациях (рис.5).

Таблица 3

Генетический анализ признаков трансформанта СС371-4В плазмидой рМЗ-1

Признак Тетрады I Число спор I

I 2+:2" 3*: Г 4+: 0 } + 1 ... ... .]

Ыб I 20 0 0 1 40 40 I

1еи 1 20 0 0 1 40 40 I

шеЬ I 6 0 14 1 68 12 1

ига 1 6 0 14 I 68 12 I

* ' __I

I—£ -г-н-,1|нвда*# | {

/» Ми-5 Г ~П11Г1ГГ11_1__1

мРНК

Рис.5. Схема конструирования и рестрикционные карты ппазмид рН13-2 и рМ13-5, содержащих ген теЬЗ в различной ориентации (обозначения рис.2).

Обе эти плазмиды давали одинаковую активность гена теЬЗ в клетках дрожжей; это свидетельствовало о том, что ориентация гена в плазииде рШ..не влияла на его транскрипцию. В таб.4 показаны ре-

зультаты трансформации мутанта СС371-4В плаэмидами рМ13-2 и рМ13-5. В связи с этим можно предположить, что ген шеЬЗ, вставленный в плазмиду pFLl, имеет собственный промотор и автономно экспрессиру-ется в клетках дрожжей.

Субклонирование фрагмента, включающего ген теЬЗ размером 1,7 т. п.н. Все полученные фрагменты ДНК, несущие ген met3, имели большие размеры. Величина такого фрагмента в плазмиде рМЗ-4 составляла 2,8 т.п.н. Было проведено его субклонирование в плазмидах pFLl и рМЗ-5, результатом чего явилась новая плазмида рМЗ-19, рестрикционный анализ которой показал, что в ген шеЬЗ не входят сайты ВашН!, Hindi И, причем ген met3 целиком содержался в фрагменте Xhol-Sall размером 2,0 т.п.н. Этот фрагмент был выделен из плазмиды рМЗ-19 и отожжен по Xhol-SalI-cafrraM с плазмидой pFLl. В результате была получена новая плазмида рМЗ-21, содержащая фрагмент с геном met3 величиной 1,7 т.п.н., на котором обнаружены только сайты Bstl, EcoRI, SphI и Bglll (рис.6). После удаления из этой плазмиды участка, содержащего фрагмент 2уа- и игаЗ, была получена плазмида рМЗ-22, использованная нами в качестве зонда при изучении регуляции экспресии гена met3.

Таблица 4

Результаты траснформации штамма СС371-4В плаэмидами рМ13-2, рИ13-5 (число колоний на 0,1 мкг внесенной ДНК)

VHB his, leu , ига

0 86 110

130

1 СС371-4В I СС371-4В * рМЗ-4 1 СС371-4В + рН13-2 I СС371-4В + рН13-5

VPGA 1 VHB his, 1 leu, met, 1 ига I VHB his. I leu, met I ]

33 I 139 I 0 '

- I 1 130 '

- I I 93

- 1 , - I 135 1

Ресгрикци» Sali

Ptcrpm

Рктрикция

*Ao l-itil AHiHPotauui

l

i

Рис.6.Схема получения и рестрикционные карты плазмид рМЗ-21 и рМЗ-22, содержащих фрагмент с геном шеЬЗ размером 1,7 т.п.н. (обозначения рис.2).

Экспрессия гена шеЬЗ в клетках дрожжей и ее регуляция.Удельная активность АТФ-сульфурилазы, кодируемой геном теЬЗ, измерялась для исходных штаммов Г1Л00а и (ЖШ, а также для штамма СС371-4В, трансформировашюго плазмидами рМЗ-1 и рМЗ-4, несущими ген шеЬЗ. Результаты для одного из трансформантов (таб.5) показывают, что он не только синтезировал АТФ-сульфурилазу, но активность этого фермента была в 5-10 раз больше, чем у исходных штаммов. Во лее того, биосинтез АТФ-сульфурилазы в обоих случаях был подвержен репрессирующей регуляции со стороны метионнна и 5-аденозил-метио-нина. Это свидетельствовало о том, что фрагменты дрожжевой ДНК в этих плазмидах, несущие ген теЬЗ, содержали необходимые регуля-торные последовательности. В то же время плазмида рМЗ-21, несущая фрагмент с геном шеЬЗ минимального размера (1,7 т.п.н.), трансформировала штамм СС371-4В в фенотип теЬ + , ига+, но мегиониновая регуляция не имела места - по-видимому, в этом фрагменте необходимые регуляторные последовательности отсутствуют. Рестрикционная карта ркЗ-21(рис.6) позволяет предположить, что регуляторные последовательности находятся в районе сайта ХЬо[.

Таблица 5

Удельная активность АТФ^-сульфурилазы трансформанта и некоторых исходных штаммов (нМ/мг белка в мин)

I ^^\Шгамм I FL100 I CRF-18 I CC371-4B I CC371-4B + I

I 1 Среда I I I 1 +pM3-l 1 I

1 VHB h is Леи I 207 1 104 I 1 1045 !

1 VHB his, leu +1 12 I 10 I 12 1 27 I

I + 2 mM DL-metI 1 1 I I

I VHB his, leu +I - I 11 1 12 I 188 1

I ♦ 0,15 mM SAM I I I I

Для того, чтобы доказать, что имела место именно регуляция, а не уменьшение числа копий плазмиды под действием повышенных концентраций метионина или SAM, в тех же условиях измерялась активность ОМФ-декарбоксилазы - фермента, кодируемого геном игаЗ, который, как было показано, переносится вместе с геном шеЬЗ. Оказалось, что удельная активность ОМФ-декарбоксилазы оД1шакова как при наличии метионина или SAM в концентрации 2 мМ, так и без них, что свидетельствует о стабильном поддержании плазмид в трансформированных клетках (таб.6).

Следует отметить, что удельная активность ОМФ-декарбоксилазы у трансформэнтов в 2® раз превышала активность этого фермента у диких штаммов, что соответствует, например, данным Chevallier et al.(I960) для того же фермента при трансформации плазмидой pFLl, а также данным для орнитин-карбамойлтрансферазы при клонировании гена агдЗ дрожжей (Crabeel et al. (1981)) или гена, ural (Loison, Jund (1981)).

Дополнительные доказательства в пользу того, что работала именно иетпониновая регуляция синтеза АТФ-сульфурнлазы, были получены при измерении активности гомоцистеинсинтетазы - фермента, участвующего в биосинтезе метионина (рис.1), кодируемого геном met25 и имеющего сходную систему регуляции. Из таб.6 видно, что уровень регуляции при этом для всех трансформированных штаммов был сравним с уровнем для диких штаммов в тех же условиях культивирования.

Таблица 6

Удельные активности АТФ-супьфурилазы (АТФС), гомоцистеин-синтетазы (ГНС) и ОНФ-декарбоксилазы (ОМФД) исходных и трансформированных штаммов (нМ/мг белка в мин)

Штамм

Культуральная среда

ПЛ00 1 Ш Ыб, 1еи 116 1 204 I 1,8

1 Ш Ыб, 1еи + 12 I 19 1 1,8

I + 2 тМ ВЬ-теЬ I I

СС359-©Ь I Ш Ыв, 1еи 114 I 210 I -

I Ш Ь1б, 1еи + 20 1 52 1 -

I + 2 тМ БЬ-теЬ 1 1

СС371-4В 1 УМВ Ыб, 1еи + ига - [ 200 1 -

I УНВ )пб. 1еи + ига + - I 60 1 -

I + 2 мМ ВЬ-теЬ I 1

СС371-4В ¥НВ Ыб, 1еи 490 1 260 I 36

+ рМЗ-1 1 I I

СС371-4В ♦ 1 УНВ Ыб, 1еи * 49 I 50 1 36

♦ рМЗ-1 I + 2 тМ БЬ-шеЬ I 1

СС371-4В +1 УНВ Ыб, 1еи 410 I 290 I 38

»- рМЗ-4 1 I 1

СС371-4В + 1 МВ Ыб, 1еи + 52 1 40 1 36

♦ рЮ-4 I ♦ 2 шМ БЬ-теЬ I 1

Удельная активность

АТФС I ГЦС

--_1---

I ОМФД

_1---

Доказательства регуляции на уровне транскрипции. В этих исследованиях плазмида рИЗ-22 использовалась в качестве зонда; ее фрагмент Тац!—Вд111 гибридизовали с меченой РНК из дикого штамма П100 после выращивания на минимальной среде и минимальной среде с добавлением 2 мМ БЬ-метионина. Оказалось, что количества теЬЗ-специфи-ческой мРНК, приведенное в колонке 8 таб.7, возрастало со временем в такой же степени, как количество тотальной РНК, приведенное в колонке 5 таб.7; после выращивания в присутствии ыетионина наблюдалось падение синтеза теЬЗ-мРНК на 80-90Я, что сравнимо с падением на 857, активности АТФ-сульфурипазы в том же эксперименте.

Эти результаты можно объяснить или падением скорости транскрип-

ции, или падением стабильности «РНК в присутствии 2 мН БЬ-метионм-на. При измерении скорости распада теЬЗ-специфической мРНК, выделенной из клеток дикого штамма, выращенных в отсутствие и в присутствии метионина (при этом также применялась специфическая гибридизация с указанным выше зондом), эта скорость оказалась одинаковой в обоих случаях (время полураспада 5 11 мин).

Увеличение синтеза шеЬЗ-специфической мРНК трансформированного штамма (в 6 раз выше, чем у дикого штамма - колонка 8 таб.?) коррелировало с ростом почти в 4 раза удельной активности АТФ-сульйу-рилазы (колонка 9 таб.7).

Таблица 7

Транскрипция гена теЬЗ

I Штамм 1 Среда! Время 1Добав I Уд.акт 1 Гибридизация 1Акт.I

I I 1экспоз. 1РНК I РНК I -1АТФС1

I I I метки I(мкг) Кимп/минНГибридиз. 1Уд. 1 1

I 1 И мин) 1 1 /мкг) 1имп/мин 1гибр. 1 I

1 1 I I 1х10К 4)1 1x10м! I

I I 1 I I I Общая! На I I I

I I ! I I I I мкг I I 1

I 1 I 1 I 1 I 1 1 т 1 1 1 | доб. I I I 1 I

1 1 1 I 1 2 1 3 1 I 4 т I 5* 1 I 6 1 1 | 7 18** 1 I 9 I 1 |

1П1Ш I Ш I 5 I 18 1 1,6 1 135 I 7,5! 4,7 1183 I

1 1 I 10 I 21 I 2,9 I 365 I 17,41 6,0 1 1

1П,100 I УКВ ♦ 1 I I I I I I I

и ►2 тИ I I I 1 1 I I 1

1 ШЬ-теЬI 5 1 18 1 2,0 1 28 I ■1.61 0,8 I 27 1

1 1 I 10 I 21 I 2,7 I 29 I 1,41 0,5 I I

1СС371-4В1 т I 10 I 2,61 6,9 I 590 1226 132,0 1662 1

1+РМЗ-13 ! I I ! I I 1 1 I

*) Удельную активность РНК измеряли в материале, осажденном три-

хлоруксусной кислотой. ,

**) Отношение колонок 7 и 5.

В экспериментах с иозерн-блотами была измерена, величина гаеЬЗ-

мРНК, оказавшаяся равной 1,7 т.п.н. (в качестве стандарта мол. масс использовались Hindi I i-фрагменты плазмиды рМЗ-1). Поскольку эта величина в пределах точности измерении совпадает с размером минимального фрагмента, содержащего ген met3, то можно утверждать, что размер гена шеЬЗ также равен 1,7 т.п.н.

ВЫВОДЫ

1. Получен банк генов S.cerevisiae, штамм D2B, для выделения различных структурных генов дрожжей.

2. Сконструирована серия плазмид рМЗ на базе химерного плазмид-ного вектора pFLl,содержащих ген теЬЗ и использованных для изучения экспрессии этого гена в клетках дрожжей.

3. Получен трансформант CC371-4B[pM3-ll, содержащий гибридную плазмиду с геном mefc3. Показано, что его фенотип met'1", ига^опре-деляется генами met3, игаЗ, лежащими на плазмиде рМЗ-1 и кодирующими соответственно АТФ-сульфурилазу и Ок№-декарбоксилазу.

4. Клонирован и субклонирован структурный ген теЬЗ на плазмиде рМЗ-21, а также определен его минимальный размер, равный 1,7 т.п. н., и построена физическая карта.

5. Показано, что специфическая система регуляции активности гена теЬЗ функционирует на уровне транскрипции.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Nguyen Hgo с Thao, llguuen Uan Uyen, ligo Ke Suong. Генетическая трансформация клеток эукариот//Тезисы конференции по селекции культурных растений.-Dalat.-1976.-С.120-135.(На вьетнамском языке).

2. Nguyen Ilgoc Thao, Hguyen Thanh Phuong, Hgo Ke Suong, Jlguyen Uan Uyen. Получение очищенной ДНК из проростков риса// Итоги научных исследований филиала Национального центра научных исследований Г.Хошимина.-1978.-112.-С.11-14. (На вьетнамском языке).

3. Hguyen Hgo с Hiao, Bui Uan Le, ligo Ke Suong, Jlguyen Uan Uyen. Получение и очистка тотальной ДНК из дрожжей и проростков риса иетодом хроматографии на колонке с сефарозой 4В// Тан же.-1980.-Н2. -С.140-149. (На вьетнамском языке).

4. Hguyen Ngoc Thao. Генетическая трансформация дрожжей// Извес-

тия Института экспериментальной биологии Национального центра научных исследований (г.Хошимин).-1985.-Н1.-С.15-25. (На вьетнамском языке).

5. Cherest H., Hguyen Hgoc T.,. Surdin-KerJan V. Transcriptional regulation of the Met3 gene of Saccharomyces cerevisiae// Gene.-1985.-v.34.-H2-3.-P.269-281.

6. Hguyen Ilgoc Thao, !lgo He Suong, Hguyen Uan Uyen. Получение и культивирование дрожжевых мутантов P1S4 и D2B, устойчивых к этионину// Известия Института экспериментальной биологии Национального центра научных исследований (г.Хошимин) .-1987.-114.-С.41-47. (Ha. вьетнамском языке).

7. Hguyen Hgoc Thao, Hguyen Lan Dung, ligo Ke Suong, Hguyen Uan Uyen. Получение банков генов дрожжей штаммов P1S4 и D2B// Биологический журнал.-1988.-114.-С.21-31. (На вьетнамском языке).

8. Nguyen Ngoc Thao, Hguyen Lan Dung, ligo Ke Súong, Hguyen Uan Uyen. Клонирование гена met-3 Saccharomyces cerevisiae.-Tau же.-C.32-42.(На вьетнамском языке).

! ) >

Подп. к печ.'/ it 'Л Формат!.. '^'Д Бумага' ■печ. офс. Усл. печ. л. . 1 [}:• Уч.-изд. л. ('• «.•(• Тираж /¡У-Зак. i '/( Бесплатно

Киевская книжная типография научной книги. Киев, Репина, 4.