Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярный анализ генов в клетках цианобактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярный анализ генов в клетках цианобактерий"

п г* п

л ?, РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 11 ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ имени Н. И. ВАВИЛОВА

АПР Ж

На правах рукоаки Ш 582.232.7:579.25:577.2

Еланская Ирина Владимировна

КЛОНИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ЦИАНОБДКТЕРИЙ

Автореферат

диссертации, на соискание ученой степени доктора биологически! наук

Специальность 03.00.15 - Генетика

Москва 1994 г.

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции биологического факультета Московского государственного университета мм. Ы.В. Ломоносова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корре споядент РАН - доктор биологических наук, профессор Б. В. ГРОМОВ

доктор биологических наук, профессор Э. С. ПИРУЗЯН

• доктор биологических наук, профессор А. А. ПРОЗОРОВ

ВЕДУЩЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский институт генетики и селекции продавленных микроорганизмов

Защита состоится "¿У&"А^л/^пУ 19Э4 г. в_часов

на заседании специализированного Ученого совэта Д 002.49.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова' РАН (117809 ГСП-1, Моссва, В-333, ул. Губкина , д. 3).

С катеркалами диссертации можно ознакомиться .' ь библиотека Шстатуте общей генетики им. Н.М. Вавилове РАД.

Автореферат разослан "Л-У" ¿¿64М? п 1324

Учеыгй секретарь специализированного созэта

кандидат биологических наук Г.. Н. Полунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. ЦианоСэктерни являются перспективными модельными объектами для изучения различных биологических процессов. По структуре клеточной оболочки и организации генома цяанобактерии относятся к грамотрицательшм бактериям, тогда как строение фотосинтетического аппарата и способность к оксигенному фотосинтезу приближают их к высшим растениям. Шанобактерик являются, в перспективе, наиболее выгодными для биотехнологии продуцентами белка и ценных биологически активных соединений, поскольку не требуют органических источников питания и синтезируют все необходимые для жизнедеятельности вещества за счет фотосинтеза. Цианобактерии широко используются в исследованиях механизмов и генетического контроля азотфихсации, клеточной дафференцировки, радиоустойчивости, а также проблем, связанных с регуляцией действия генов, однако особый интерес к цианобактериям связан с изучением фотосинтеза. У растений и эукариотических водорослей генетическое изучение фотосинтеза затруднено из-за отсутствия эффективных систем генетического переноса, а также из-за сложных взаимодействий между хлоропластным и ядерным геномом в процессе формирования фэгосингетического аппарата. Разработка простой модельной системы, позволяющей изучать фотосинтез и ряд связанных с ним процессов (например, развитие устойчивости к гербицидам - ингибиторам фотосинтеза) на прокариотических объектах, могла бы значительно повысить эффективность генетических исследований в этой области.

Возможности использования цианобактерий для расшифровки механизмов фундаментальных биологических процессов и создания штаммов-продуцентов могут быть значительно расширены за счет методов генетической инженерии. К началу наших исследований (1980 г.) были разработаны методы генетической трансформации некоторых штаммов одноклеточных цианобактерий (SbestaKov, . Khuyen, 1970; Grigorieva, Shestakov, 1976,1982) и обнаружены критические плазмиды цианобактерий (Van den Hendel et al., 1979; Lau, Doolittle 1979; Friedberg. Seitffers, 1979). Эти работа открывали возможности для создания систем клонирования генов в-клетках цианобактерий и позволили нам приступить к разработке векторных систем для деух видов одноклеточных

цианобактерий: облигатно фотоавтотрофной цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 (Anacystls nldulans R2) и фотогетеротрофной цианобактерии Synechocystls sp. РСС 6803.

Цель х задачи исследования. Целыэ работы было создание систем клонирования генов для цианобактернй А. nldulans R2 и Synechocystls эр. 6803 и использование этих систем для изучения генэтического контроля фотосинтеза, устойчивости к гербицидам и экспрессии гетерологичных генов в клетках цианобактерий. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Конструирование различных типов векторных плазмид для- А. nldulans R2 и Synechocystls sp. 6803 и анализ возможностей их использования для клонирования генов в клетках цианобактерий.

2. Клонирование гетерологичных генов (включая гены грампологи-тельных бактерий я растений) в клетках цианобактерий и изучение их экспрессии.

3. Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирующих фотосинтез, с помощью коллекции дефектных по фотосинтезу мутантов цианобактерий;. идентификация мутаций, нарушающих способность клеток цианобактерий к фотосинтезу.

4. Клонирование и молекулярный анализ генов, определяющих устойчивость к яитрофенольннм гербицидам и ингибитору фотосинтеза метронвдазолу; выяснение механизмов развития устойчивости к указанным ингибиторам.

5. Построение физической карты генома Synechocystls sp. 6803 и локализация на ней генов, контролирующих фотосинтез. ,

Научная новизна. Разработано новое направление генетики одноклеточных цианобактерий, связанное с использованием методологии генетической инженерии. Созданные в работе системы клонирования и анализа генов позволяют использовать цианобактерий как модельный объект для генетического изучения фотосинтеза, механизмов развития устойчивости к гербицидам и других фундаментальных биологических процессов, свойственных высшим растениям.

Впервые в клетках цианобактерий . клонированы гена а-амилазн из Bacillus amylollqueraclens, эндоглвканазы из целлюлолитаческого комплекса Clostridium tluermocellum и В1 -гордеина из ячменя (Hordeum vulgare L.). и показана их экспрессия

Показано, что белки СР47, СР43 и цитохром Ь55Э, кодируемые генами рзЬВ, рзЬС и рзЪЕ/Г кгравт важную роль в определении структуры и функции фотосистемы II. Установлена молекулярная природа ряда мутаций в генах рзЬВ, рзЬС, рзЬЕ/Т, нарушающих функций фотосистемы II. Выявлен неизвестный ранее ген рзХ, кодирующий белок с молекулярной массой 46,7 кДа и необходимый для функционирования фотосистемы II. Показано, что ген рзХ имеет гомологию с ядерной ДНК растений.

Клонирован неизвестный ранее ген бх^А, ковтролкрунщй множественную устойчивость клеток БупесЬосузИз $р. 6803 к метронкдазолу и нитрофенольным гербицидам. Устойчивость клеток цианобактерии к указанным ингибиторам связана с инактивацией продукта гена йг^ - белка с молекулярной кассой 23,7 кДа. Ген имеет гомологию с ядерной ДНК растений. Впервые построена физическая карта и установлен размер хромосомы БупесйосузИз Бр. 6803. На физической карте локализовано несколько генов, кодирующих белки фотосистемы II и фотосистемы I.

Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе новые данные о генетическом контроле фотосинтеза и устойчивости к ингибиторам способствуют более глубокому пониманию механизмов фотосинтеза и структурно-функциональной организации фэтосинтетического аппарата, вносят существенный вклад в изучение проблемы развития устойчивости к гербицидам. Сконструированные в работе векторные плззмиды для А. п1йо1апз В2 и Зупес1юсуз1;1з зр. 6803, коллекции дефектных по фотосинтезу и устойчивых к ингибиторам мутантов переданы в ряд отечественных и зарубе киях лабораторий, где они используются в научно-исследовательских работах.

Полученные в настоящей работе рекомОивантные штаммы цианобактерий, несущие гетерологичные гены а-амилазы, эндоглюканазы и В1 -гордеина могут служить хорошей основой для создания экономически выгодных штаммзв-продуцентов запасных белков и биологически актирных соединений.

АпроОацщ работа. Материалы диссертагаи были доложены и обсуддены на V и VI Всесоюзном симпозиуме Молекулярные механизма генетических процессов (Москва, 1983, 1387 гг.), Всесоюзной конференции "Гене'.ипз и (физиология микроорганизмов

-перспективных объектов биотехнологии (Пущино, 1984), IX и X Всесоюзном совещании по программе "Плазмида" (Москва, 1984, 1985 гг.), VII Съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985 г.), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984, 1986), XIV Международном микробиологическом конгрессе (Манчестер, Англия, 1986), Всесоюзной конференции "Физико-химическая биология и биотехнология фото-трофных микроорганизмов (Москва, 1987), V Съезде ВОП/Ю им. Н. И. Вавилова (Москва, 1987), Ломоносовских чтениях МГУ (1989 г.), Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991 г.), V, VI и VII Международном симпозиуме по фэтотрофвым прокариотам (Гриндельвальд, Швейцария, 1985 г.; Нэрдвикерхаут, Нидерланды, 1988 г.; Амерст, COA, 1991 г.), Российско-германском рабочем совещании по молекулярной биологии и биотехнологии растений (Москва, 1992 г.), II Российском симпозиуме "Ноше метода биотехнологии растений" (Пущино, 1<?9з г.), Международном симпозиуме "Использование цианобактерий в исследованиях фундаментальных биологических процессов" (Асиломар, США, 1993 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, раздела "Материалы и методы", пяти глав экспериментальной части, заключения, основных выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 237 стр. машинописного текста, включают 58 рисунков и 29 таблиц. В списке литературы приведены ссылки на 285 работ.

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова в лаборатории, руководимой чл.-корр. РАН C.B. Швстаковым. В диссертации использованы результаты,- полученные лично автором, а также в соавторстве с сотрудниками и аспирантами кафедр генетики, биофизики, клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ, Института почвоведения и фотосинтеза РАН, Института общей генетики РАН, Института Молекулярной генетики РАН, Института физиологии растений РАН, кафедра генетики Берлинского университета (Германия). Соискателю принадлежат: разработка программы исследования и схемы основных опытов, теоретическое обобщение полученной информации, вывода из работы. Автор приносит глубокую благодарность всем коллегам.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТО

I. Векторные плазмида для АпасувИв п1аи1апв К? я БупесЬосув^в вр. 6803.

Сконструированы две - группы векторных плазмид для клонирования генов в клетках А. гШШапз И2 и Бупес1юсузиз гр. 6803. Первгя группа включает автономно реплицирующиеся векторы, полученные на-основе резидентных криптических плазмид циэнобакторий. Вторая - интегративные векторные плазмида, обеспечивающие встраивание клонируемых генов в • хромосому цианобактерий. Характеристики векторных плазмид приведены в табл. 1.

1.1. Автономно реплицирующиеся векторы для БупесЬосувИв вр. 6803.

С помощью модифицированного нами метода из клеток БупесЬосузиз зр. 6803 было выделено 4 типа резидентных плазмид с размерили: 2,3; 4,8; 53 и 89 тпн. На основе резидентной плазмида БупесЬосузИэ вр. 6803 р5Б2 (2,3 тпн) и векторной плазмида Е. со11 рАСУС 184 (4,0 тая, Стн Тсй) получены бирошшконвые векторы рЭЕ7 (6,0 тпн, СтК), рБЕГб (8,3 тпн, Стй) и р5Е17б (9,8 тпн, СтН КтН). Плазмида рБЕТб образовалась в результате рекомбинации р5Е7 с резидентной плазмидой рББг в клетках циансбактерии. Плазмида р5Е176 сконструирована путем встраивания гена Ктк из плазмида рис-4К в рЗК76 (рис. 1). Рекомбинантные плазмида рБЕТб и рБЕ176 трансформируют клетки БупесЬосуз'Ыз зр. 6803 с частотой Ю-5-Ю-6, однако характеризуются некоторой нестабильностью в клетках Зупес1юсуз1;1з зр. 6803, по-видимому, в результате рекомбинации с резидентной плазмидой рЭБг. Попытки получения штамма, излеченного от ра32, не привели к успеху ни в нашей, ни в зарубезшнх лабораториях.

1.2. Автоношю рзплиццрущиеся вектора дня Л. п1сЬх!апв кг.

Клетки А. п1йи1зпз И2 содержат две критические плазмида:

EcoRl

H

M

pSS2

трансформация E. coli (CmR Tcs)

EcoRi'

трансформация Synechocystis sp. 6803

рекомбинаци резидентной плазмидой

Soil

дотирование, трансформаци E. coli (CmR К

Рис. 1. Схема конструирования Сирепликонных векторных плазмид для Synechocystis sp. 6803 и E. coll. H - Hlndlïl; S - Sau3A

pANS (8,0 тпн) и pANL (48,5 тпн) (Van den Hondel et al.,1980). На основе pAi'S и pAHL сконструированы гибридные плазмшш, содержащие Д(Ж векторной плазмиды грэмположительннх бактерий pUBHO (4,0 тпн, KnR). Плазмида pBS20 (12,5 тпн, Кл1*Ь включает последовательности pANS и рГО110, с высокой частотой трансформирует клетки A. nidulans и протопласты В. subtilis, однако нестабильна в клетках бацилл. Плазмиды pBL12 и рВ123 содержат ДНК рШ110 и практически полную последовательность pANL, трансформрфуют клетки-A. nidulans Н2 по маркеру KmR с частотой ' около ICF3 на клетку, но из трансформируют В. subtilis. Сконструированные гибридные плазмиды могут служить основой для создания новых типов векторных плазмид для цианобактерий, а также применимы в экспериментах по изучению межвидового переноса плазмид и таксономического анализа у цианобактерий.

1.3. Интегративные векторы для A. nidulans R2 и SynecbocystiB вр. 6803.

Для введения генов в хромосому цианобактерий сконструированы интегративные векторы, состоящие из полной последовательности ДНК векторной плазмида Е. coll pACYCl84 (СпР) и клонированных в ней по сайтам ВапЯ1 или Hindlll фрагментов хромосомной ДНК A. nidulans R2 или Synechocystia зр. 6803 (твбл. 1). Такие гибридане шизмиды автономно реплицируются в клетках Е. coll, а при трансформации цианобактерий встраиваются в хромосому по механизму гомологичной рекомбинации. Интегративные векторы I типа содержат один селективный маркер (ген • Сш11), расположенный в участке вектора, принадлежащем pACYC184, и экспрессия этого гена возможна только при встраивании полной последовательности интегратпшого вектора в хромосому цианобактерий. Векторы II типа (pIAH4-Km, pSIB39r-Km, pS3B39A-Km) содержат дополнительный сслективннй маркер (ген внутри фрагмента цианобактериаль-ной ДНК в интегративном векторе. Экспрессия гена Е¡aR возможна как прл встрагзгнга в хромосому полной последовательности вектора,-так и при згмещении гчестка хромосомы гомологичной послодоватзльностьч цзанобактериальног ДНК с геном кгвамшин-резистентеост?, клонированными б составе вектора (рис. 3).

Рис. 2. предполагаемая схема встраивания интегративных векторов в хромосому цианобактерий. Е-ЕсоШ . Н-Н1пс1111, Б-ЭаИ ; Сшн, Кш®-гены устойчивости к хлорам^ениколу и канамицину.

в

í. I • уиширюи IMWWIiilt^H I

Плазмвда Составляющие Размер (тпн) Реципиент Селективинй маркер Частота трансформации клеток цааноОактеркй

OSE76 oSS2. OACYC184 8.4 s. 6303 E. coli CmR 2 x 10"fe

dSË176 dSS2. DACYC184. OUC-4K 9,9 S. 6003 E. cali Cm". KmR 5 x iO"6

dSIS, dSIB OACYC1B4. Хр.ДНК S.6803 4,5-13.0 S. 6907 E. coli Cm* 0.2-3 x Ю-7

□ IAH, dIAB DACVC194. Хр.ДНК A.nid.R2 A.4-9.2 A. nid.r2 E. coli CmR 0.3-1 x 10~S

oSIB3?-Km oACYC184.pUC-4K Хр.ДНК S.6B03 16.3 S. 6303 E. coli CmR Km R Ь x 10"S 5 M 10~6

oSIB3?ü-Km oBR323.. Tn5. xp .ДНК 4s. 6B03 7.5 S. 6003 E. coli ap* KmR. SmR 2 x 10_S 6 x 10_â

oIAHl-Km oACYCia4.üUC-4K хр.дак A.nidiRZ 10.7 A. nid.R2 E. coli CmR KmR 2 x 10~S S x 10""

pBS20 □ANS. oUEUlO 12.5 A. nid.R2 B. subtilis K« П P x 10 "3

□ E3L12 PBL23 DANU. OUBUO 53 50,5 A. nid.R2 l. R Km I x 10"3

Б.ЬВОЗ - Svnechocvetis 6ВОЗ1 A.nid.R2 -

Anacvstis nlc'uUns R2: Хр.ДНК - ХрОМОСОМНаЯ ДНК

Приведзнкые в табл. I данные о частота}: трансфзрмащш клеток циавобактерий векторными плазмидами показывала-, что для клонирования генов в клетках А. nidulans Н2 южно использовать как автономно решшцирушиеся, так и интегратившо векторные штазмидн. Дня клонирования генов в клетках Synechocystls зр. 68(33 наиболее эффективными являются- интеграгизше векторы, обеспечивавдяе встраивание в хромосому клонирк&мого гена по мэхаькзму двойного кроссанговера. Почила высокой частоты трансформации, такой способ введения гена обеспечивает . его максимальную стабильность в хромосоме циаяоогктерий (Williams,' Szalay, 1983).

Глава II. Клонирование гетерологнчвих генов в клетках А. nlchilans К2 я Synechocystis вр. 6803

Циакобактерии, использующие для своей кизнедеятельности энергию солнечного света, являются, в перспективе, наиболее выгодными для микробиологической промышленности продуцентами различных веществ. Возможности использования цианобактерий для клонирования и экспрессии промытленно важных генов других организмов практически не изучены. К числу таких генов относятся гены, кодирующие а-амилазу из Bacillus amylollque-iaclens, эядоглгкаяазу - из целлвлолитяческого комплекса Clostridium thermocellum и В1 гордеин - из ячменя (Hordeum vulgare L.). В настоящей работе осуществлено клонирование и изучена экспрессия указанных генов в клетках цианобактерий.

II.I. Кговироваяне гена а-аиилазы В. amyloliqueiaclens и гена эндоглпкавазы с. thennocellum в клетках А. nidulans R2

Интегратявные векторные плазмида, полностью встраивающиеся в хромосому цианобистерии, перспективны для анализа экспрессии генов в клетках К. nidulans F2, поскольку клонируемый ген может быть встроен но удобному сайту практически в любую часть вектора. Ген а-амилазы В. amylollquelaclens, выделенный из ДНК фага M13mtfB2344amy (Сорокин, 1985), клонировали в уникальном BamHl сайте, расположенном в рАСТС184-участке интегративного

р!лН4аиу5 pRW2

Рис. 3. Схемя встраивания генов а-амилазы и эндоглюканазы

в иятегративвкй вектор р1АН4.

а- amy - ген а-амилззн В. amyloliquefaciens, Pro-промотор, IS1 - 1S1-элемент; се 12 - детерминант се 12 C.thermocelluni; жирной линией обозначена хромосомная ДНК A. nldulans R2:

Е - EcoRl: в - ВгтН1; Во - Bglll; К - Hind III: Р - Pstl: S - SalGl: X - Xhol

вектора pIAE4 (рис. 3). Полученные в результате трансформации лигированной смесью CmR клоны Е. coll обнаруживали а-амилазную активность (Ашу+) на среде с амилопектиназурон.

Ген эвдоглшаназы клонировали в векторе р1АН4Д, полученном в результате делеции Sali-участка вектора р1АН4. Участок ДНК С. thermooellun с детерминантом се12, определяющим эндоглюканазную активность (Пирузян и др., 1985) и маркером SmR из рекембинантной плазмидо рС1 (Бабиклн и др., 1983) клонировал:! в векторе р!АН4Д по сайту Sali, расположенному на

Ii

границе последовательностей цианобактериальной ДНК и pACYC184 (рис. 3, 4). Отобранные после трансформации лигированной смесью Sm'HSeP клоны Е. coll обнаруживали эвдоглюканазную активность (Се1+) на среде с карбоксимв тилцеллвлозой.

Для введения генов а-амилазы и эндоглюканазы в хромосому цианобактерии рекомбинантными плазмидами из Any* и Се1+ клонов Е. coll трансформировали клетки A. nldulans R2 по маркеру CmR. Все Стя-клсш A. nldulans R2, отобранные после трансформации рекомбинаняии плазмидами из Amy* клонов Е. coll, проявляли а-амилазную активность на среде с амилопектиназуром. CmR клоны A. nldulans R2, полученные после трансформации плазмидами из Се1+ клеток 2. coll, обладали устойчивостью ж стрептомицину. В лизатах всех исследованных CmRSmR клонов A. nldulans R2, полученных после обработки саркозилатом натрия, обнаружена эндоглюканазная активность, что свидетельствовало об экспрессии зндоглюкаиазного гена С. therroocellum в клетках цианобактерии.

Сравнительное определение активностей эндоглюканазы и а-амилззы в периплазлатической и цитоплазматичасной фракциях и в культуральнсв жидкости Ашу+ и Се1+ трансформантов A. nldulans R2 (табл. 2) показало, что а-аыилэза активно сехреткрувтся в периплазму 1ау+ клеток цианобактерии, тогда как практически вся эндоглисаназная активность обнаруживается только в цитоплазматаческой фракции Се1+ клеток. Таким образом, система секреции A.nldulans R2 распознает сигналы, закодированные в структуре а-амилазы B.amylollquelaclens, но не способна узнавать подобные сигналы в эндоглюкаказе из С. thermocellum, синтезируемой в клетках цианобактерии. Сходным образом ген эндоглюканазы из С. theraocellum экспрессируется в клетках дрожжей Saccbaromyces cerevlslae (Sacco et al., 1984), однако y ряда других бактерий эвдоглпсаназа является активно секретируемым продуктом (Головченко и др., 1985; Soutschek-Bauer, Staudenbauer, 1987; Бабыкин и др., 1988). Возможно, что подстройка структурного гена из С. thermocellum под регуляторше элементы, функционирующие в клетках А. nldulans К2, позволит получить секре тируемую клетками цианобактерии эндоглюканазу.

р!АН4 (7,7 ТПН)

Н 5

ль

хрДНК

р1АН4ату1

I 1тптп(г

■А-

хрДНК

1_5+Л-ату 151 Рго

рШМатуб

11_

Р Е

IIIIIII

хрДНК,

р1АН4Д (6,6 ТПН) Е Н

Рго 1Э1 ЦБ+а-ату

хрДНК

рС1 (17,9 ТПН)

рЛИ2

се1 2

5т

зрДНК

се I 2

5т

Рис. 4. Рестрикционные карты интегративного вектора р1АН4 и рекомбинантных плазмид, несущих гены а-аюшазы * В. ату1о11^ие1ас1епз , и эвдоглюканазы С. 1Легэосе11ит.

рго-промотор, 1Б1 - 1Б1-элемент, 1Б-лидэрная последовательность, а-аюу - структурный ген а-аыилазы. Остальные обозначения как на рис. 3.

ДНК рАСУС184;

днк рвизгг;

ДВК РЯ2209

н

з

Е

Таблица 2. Относительное количество а-амилазк и эпдоглгданазн (в %) в различных фракциях Ату+ и Се1+ клеток A. nidal ans Н2

Шта;з.1 Время Активность а-акашазы или зндогликаназы

A.nldulans роста, % от суммашоК

Е2 час. цитоплазма торгах лзз.«ш культуральная

жидкость

72 66 32 2

96 50 46 4

Amy'*' 120 29 65 6

144 23 70 7

168 16 75 9

48 95 5 0

96 93 7 0

Cel+ 144 93 7 0

168 91 8 I

182 89 8 3

И .2. Клонирование гена В1 гордеина ячменя (Hordeum vulgare L. сорт Донецкий 4) в клетках Synechocyatis sp. 6803*.

Некоторые виды цианобактерий служат источником кормового и питательного белка. В связи с этим, создание штаммов цианобактернй, продуцирующих запасные белки растений, является важной биотехнологической задачей. Особый интерес для клонирования представляют гены гордеинов - запасных белков ячменя, которые составляют более 50% белка эндосперма, но имеют несбалансированный аминокислотные состав. Разработка систем гетерологичпой экспрессии генов гордеина в прокариотах позволит проводить направленную модаЗикацив этих генов с целью обогащения гордеинов незаменимыми аминокислотами и быстрый функциональный анализ модифицированных генов. Задачей данного раздела работы было клонирование и изучение экспрессии гена В1- гордеина в клетках Synechocyatis sp. 6803.

^Раздел работы выполнен совместно с H.H. Чемересте.

Smal/PvuII Smal/PvuII

Рис. 5. Рекомбинантная плаздаа р31НогВ1, сконструированная для изучения экспрессии гена В1 гордеина ячменя в клетках Synechocyatls sp. 6803. Ног В1 - ген В1 гордеина; lac-промотор Е. coll; KmR,

BleoR, SmR - маркеры устойчивости к канамицину, блеомицкну и стрептомицину из Тп5. Тонкой линией обозначена ДНК рВВ325; жирной линией - хромосомная ДНК Synechocyatls ар. 6803.

Ген В1 гордеина Hordeum TUlgare (Чернышев и др., 1389) клонировали в векторной плазмиде Е. coll pBSM13(-) под контролем 1ас-промотора (плазмида pBS1). Для введения гена В1 гордеина в клетки Synechocyatls ар. 6803 был сконструирован иктегративный вектор рБ1В39Д-Кга, несущий ЕсоН1/ВалЯ1

участок плазмада pSIB39 размером 3,1 тпн со встроенными по сайту Hindin маркерами устойчивости к каяамицену, блесмицину и стрептомацану из Тп5 (табл. 1). Ген В1 гордеинэ под контролем lac-промоторз из плазмяда pESI клонировали по сайту Saal в геке устойчивости к блвомицину плазмкда р31В39 Д-Km, и полученной ракокбинантнсй плззмидой р31Еог31 трансфэрмирозаля клетки Synechocystis sp. 6803 по маркеру XmR.

При Слот-гибридизация ВаиН1-фрагментов хромосомной, ДНК одного из Khr трансформантов Synechocystis ар. 6803 с 32Р-мзченным Prüll участком плазмида pBS1, несущим ген В1 гордеша, обнаружен фрагмент размером 1,4 тпн, даадяй положительный гибридизационный сигаал, что свидетельствовало о встраивании гена гордвипа в хромосому цианобактерии. При анализе тотального препарата белков ' из меток этого трансфэрманта Synechocystis sp. 6803 была обнаружена фракция, которая окрашивалась антителами против гордеиновой фракции ячменя .{рис. 6)

Таким образом, впервые показана экспрессия гана запасного белка ячменя в клетках Synechocystis ар. 6803 под контролем 1ас-промотара, что позволяет использовать клетки циенобактерий для направленной модификации генов гордеина, а также для создания штаммов - продуцентов кормового белка.

Рис. 6. Вестерн-блот анализ белков из клеток Е. coll (1) и Synechocystis sp. 6803 (3), содержащих ген В1 гордеша, с помощью антител к гордаинам ячменя. (2)-гордвиновая фракция белков ячменя сорта Донецкий 4.

III. Клонирование и анализ генов фотосистемы II.

Сксигенкый фотосинтез, свойственный высшим растениям, водорослям и циаяоСактериям, осуществляется с участием двух фотосистем и сопровождается выделением кислорода, который образуется в процессе фотолиза воды, являющейся первичным донором электронов для фотосистемы II (ФС II). Встроенный в мембрану комплекс ©С II вклпчает около 20 белковых субъединиц, кодируемых генами рзЬА-рЕК. Реакционный центр ФС II связан с двумя белками, кодируемыми генами ргЬА и рзЬВ (белки В1 и 1)2). В ядро ФС II зходят также два хлорофилл-связнвапцих белка (СР47 и СР43), кодируемые генами рзЬВ и рэЬС, и две субъединицы цптохромэ Ь559, кодируеше кластером генов рзЬЕ/Р. Эти гены имеют высокую степень гомологии у всех организмов, осуществляющих оксигьнвый фотосинтез.

3 расшифровке структурно-функциональной роли отдельных белковых субъединиц в ФС II реигпцзб значение принадлежит исследованию 1.<утантов с нарупаниями генов, кодирующих белки ФС II. Изучение фотосштетическах свойств таких ¡мутантов в сочетании с анализом природы мутационных повреждений мокет дать важную информации о структурной организации и фуЕК!5:ониро2ашш аппарата окспгенного фотосинтеза.

ФотосяЕтетичоские мутанты (РБ-мутантк), нзсгособные к фотоавтотрофному росту вследствие нарушения активности ФС II, моуно получить у фотогетеротрофных шанобактврий, в частности, у БупесЬосузг1з зр. 6803, выращивая клетки на среде,-содержащей глюкозу. Задачей настоящего раздела работы было получение мутантов Зупес1юсуз1:1з зр.6803, неспособных к фотоавтотрофному росту, и выявление природы мутаций.

III.I. Спонтанные и ицдуцирозанные нитрозогуанидинои мутанты БупесЬосувИа вр. 6803, неспособные к фотоавтотрофному росту.

В серии независимых опытов отобрано около 30 спонтанных и НГ-индуцированных стабильных РБ-мутантов Бупес1юсун1;1з зр. 6803, неспособных к фотоавтотрофному росту, но растущих на среде с глюкозой. Для обогащения популяции фэтссинтетическими мутантами в качестве селектива^х агентов использовали ингибиторы фотосинтеза: нитрофурангоин, хлорпромазин,

Таблица 3. РЗ-мутанты БупесПосузиз ар. 6803

РЗ-мутангы Частота трансформации хромосомной ДНК из клеток мутантов Фрагмент ДНК, трансформирующий к фотоавтотрофности

группа название способ получен селек. агент гр ГШШ:

I II III IV

I г РК7 РК12 РМВ1 6КА 8К19 6К20 ЫР1 N£3 N^16 МР17 N61 N07 N00 N010 СРЭ СЫà спонт. спонт. НГ спонт. спонт. спонт. НГ иг НГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ НГ ГШШ ПХМБ гамз ш> № НФ НФ НФ ХП ХП 0 10~5-10~4 1-6x1О"5 1-9x1О-5 р31 (рзЬВ)

II 5X7 ВК9 8К11 5К13 NFЗ спонт. спонт. спонт. спонт. НГ НГ НФ НФ 1(Г5-1(Г4 0 2-8x10-5 1-8x1О"5 р193 (рзЬЕ/Г)

III ею БК15 СР13 спонт. спонт. спонт. ХП 10'5-10_4 2-8x10-5 0 4-7x1 (Г^ р235 (рзЬС1/С)

IV 5К10 спонт. - «Г°-1(Г4 3-7x10"'й 1-7х10~Ь 0 р203 (рэХ)

Обозначения: НГ - Н-метал-Ы-нитро-К-нитрозогуанидин; НФ - китрофурантоин; ХП - хлорпромазин; ПХЫБ - парахлормеркурибекзоат

парахлорчеркурибензоа?. PS-мутанты с высокой частотой трансформировались к фстоавтотрофности донорной ДНК из клеток дикого тета Synechocystis зр. 6803, что позволило выделить из геномного банка штамма дикого типа рекомбкнаятгае шгазмиды, восстенавливаицие способность к фотоавтотрофяому росту у PS-мутантов. Предварительный генетический анализ мутантов методом перекрестной генетической трансформации хромосомной ДНК по признаку фотоавготрофности показал, что мутации затрагивает по крайней мэре 4 независимых гена или кластера генов (табл. 3).

III.2. Клонирование и идентификация фрагментов ДНК из штаиэ дикого типа Synechocystis вр. G803, тргпсфзркарулцих PS-ыутанты к фотоавтотрофности.

Сконструированы клонотеки (по 1800 клонов) Вглй; ц ЗаиЗА фрагментов ДНК дакого типа Synechocystis sp. 6SCG в векторной плазмиде Е. coll pA0YCl8i. Кз клонотех выделены рекомбинакюте плззмидц, каждая из которых при генетической трансформации восстанавливала способность к фотоавтотрофяому росту у определенной грутгпы мутантов (табл. 3). Делециокный анализ фрагментов цианобектераальной ДНК в составе рекомбинаптяых шизмид выявил нзйолъше участки этих фрагментов, ответственные за трансформации мутантов к фотоввтотро^иостя (рис. 7).

По результатам блот-гибркдизации клонированных фрагментов ДНК с мзвэстнчми генами фотосинтеза из клеток цианобактеркй и растений были идентифицированы три гена (кластера генов), нарушенные у мутантов: ген psbB и кластеры геноз psbE/?/L/J и psbD1 /С. Фрагмент цианобактериальной ДНК в плазмвде р203, восстанавливающей способность к фотосинтезу у единственного мутанта IV группы SKI8, не гибридизовался ни с одним из использованных генов фотосинтеза, и по-видимому, содержал неизвестный ранее ген, обозначенный наш psX (рис. 7)

Таким образом, в результате генетического анализа коллекции PS-мутантов удалось выявить спвктр гонов, нарушение которых приводит к потере способности к фэтеавтотрофному росту. Это ген рзЬВ, кодирухиий хлорофалл-сзязыващиЕ белок СР47 ФС II, кластер генов psbE/P/L/J, кодирупцай две

I. Р31 (5.6 тан)

ВРК Бт Н В

III I , I , I

I

рбЬВ

1

2,8 топ

И.Р193 О.? тан)

ЗаЗа Ш Н Е1 НН1 раЬЕРЫ

А N 0,7 тон

-.!.,

Н Ба

I !

Ш.р235 (Ю.5

в

К X н хъ

I ) 1

СТ.р203 (6,6 так)

За КН ХЬ

1 II I

Е ХЪ Н М £т Ба

^_I

рвьс

1,8 ТПН,

рзЫЗГ

ХЬ На Ра Н ¿»■Ь-шн^м-а! 1.6 тпн

541 нп

649 пн

Ы ЫХЬ

I I 1

1,4 тда

рзХ

Рис. 7. Рестрикционныв карта фрагментов цианобактериавьной ДНК дикого типа, трансформирующих РЗ-мутанты к фотоавтотрофности.

А—Асс!. В-ВмН1. Е-Есо321. Н-ШшШ!. Ма-Каг1. МП-МЬе!. Р-РчиИ. Я1-£соЯ1. 5-5а 11. Бя-Sm.il . Х-ХЬо1. ХЬ-ХЬа!

субъенпйш шгтохрома t>559 и два небольших бежа ÍC II, и кластер генов psbDl/psbC. Поскольку ген psbD имеет в геноме цианобактерии вторую экспрессирувдуюся копию, мутации, скорее всего, затрагивают ген рзЬС, кодирующий хлорофыл-свазывапций белок СР43. По той же причине среди PS- мутантов не найдено мутантов по гену psbA, кодирующему белок D1 РЦ ЗС II и имеющему 3 копии в геноме Synechocystis sp. 6803. Помимо известии ранее генов, кодирующих структурные белки ядра ФС II, выявлен новый ген, psX, не имепций-гомологии с известными генами фотосинтеза. Мутация в гене рзХ у мутанта SKI8 приводит к потере способности к фотоавтотрофному росту.

В Р К SSaDSaK И

Р 31.2 ■-■■■ | ■ t-b—T--'Ti ■ ni ¡ ■ Чту f

256 550 759 1339 2215 ПН

DSbB

302

1522 ПН 580 Ш 695 ПН

502

7В0

1332 ПН

NF1 NF2 NF17 СР16

РМВ1 {

РК7 | i— ,J

РК12

SKI 9 SK4 NF5

SK20 N51 CP9

- 60 Ш -300 ПН -370 ПН -470 ПЯ

CP5 NG7

В7Ь ПН

- 60 -220

NF16

NGB

N610

Рис.8. Локализация мутационных повреждений у раЬВ-мутантов Synechocystis sp. 6803

В—BamHI. k-KDnl. S-Smal. Sa-Sau3A. P-Pvul. D-Dral. H-MindIIt

III.3. Локализация и анализ молекулярной природа мутационных повреждений.

III.3Л Мутации в гене рэЪВ.

В целях локализации мутационных повреждений внутри гена рзЬВ отдельные участки цианобактериальной ДНК из плазмиды р31 субклонировади в векторных шшзмидах Е. coli рАСУС184 или pUClB, и рекомбянантными плазмидами трансформировали ' клетки рзЬВ-мутантов. По результатам трансформации выявлено не менее 5 районов гена рзЬВ, в которых были локализованы мутации (рис.8).

Для выяснения природы мутаций из хромосомной ДНК некоторых рзЬВ-мутантов были клонированы несущие мутации участки гена и установлены их нуклеотвдные последовательности. У четырех мутантов выявлены замены нуклвотидов, приводящие к образованию stop-кодояов и ранней терминации синтеза белка СР47. У двух независимо полученных мутантов РМВ1 и РК12 обнаружена делеция 12 пн в участке, содержащем короткие прямые повторы. В результате, в мутантном белке СР47 отсутствуют 4 аминокислота в районе 208-211 кодонов. У мутантов NF2 и №17 замена одного основания привела к замещению триптофана в положении 167 аргинином в белке СР47 (рис. 9).

г—-«-1-1-1-s-1—|

О 25В 560 760 1000 ПН 1340 1522

BaaHI PvuII KonI Smal Sau3A

Рис. 9. Природа мутационных изменений у рзЬВ-мутантов Sjnechocystls sp. 6803.

III.3.2. Мутации в кластере генов раЬЕ/?/1/.1.

Анализ нуклеотидных последовательностей кластера генов рзЬЕ/Р/Ь/^ у мутантов II группы выявил две мутации в гене рэЬЕ, кодирующем а-субьединицу цитохрома Ьзэ9, и две мутации в гене рэЬР, ответственном за синтез {3-суОьединицы цитохрома №59 (рис. 10). В гене рзЬЕ идентифицированы делвция трех нуклеотидов (ТТЛ, приводящая к потере фенилаланяна в 36 положении а-суОъедштцы цитохрома Ь559 (мутант БК9) и замена в—»Т, вследствие которой пролин-63 замещен на лейцин (мутант №3).

В гене рэЬР обнаружена замена С—»Г, вызывающая замещение валива на фенилаланин в положении 29 р-суОьединицы цитохрома Ьэ59 (мутант ИР8), а также делеция одного вуклеотвдэ в 9-м кодонэ (мутант БКТ), вызывающая сдвиг рамки считывания и нарушение структуры (З-суОъединкцы цитохрома Ь559 (рис. 10).

Бш1 Асс1 №1е1 Есой1

...... | |ц 1 1 2.1 тпн

рзЬЕ с^ЬР огЫ. osЬJ

Асс1

рвЬЕ

-X-2-

рвЬР

-X-2—

рвЫ.

НЪе1 0,7 тпн

Рис. 10..Природа мутационных изменений у рзЬЕ/Р-мутантов Зупес1юсузг1э зр. 6803.

III.3.3. Анализ нутаций в гене рвЪС

Результаты трансформации клеток трех мутантов III группы (СР13, SK15, SN5) рекомбинантными шшзмидами, несущими различные участки кластера генов psbD1/C из клеток дикого типа Synechocystls sp. 6803, подтвердили, что все мутации затрагивают ген psbC. Анализ нуклеотидных последовательностей гомологичных фрагментов из клеток мутантов (рис. 11) виявил делецию трех нуклеотидных пар (GTT), приводящую к 'потере одного из трех фенилаланиновых остатков в 422-424 положении белка СР43 (мутант СР13), а также две мутации, вызывающие крупные нарушения структуры белка СР43: сдвиг рамки считывания в 40-м кодонз гена psbC (мутант SK15) и образование stop-кодона в положении VI (мутант. SN5).

Для получения большего числа различных мутаций в гене psbC клонированный в плазмиде pDICK кластер генов psbD1/C с прилегающими к нему участками цианобактеркальной ДНК и маркером Кша (Vennaas et al., 1990), подвергали мутагенезу в

EcoRV

Iba! Jähel Есо721

Н RI S

i i i

Вга1

Sau3A

619 1058

psbPI

541

NC8, MC11

stop23

SKI 5

делеция С в 40-м кодоне

SN5

г

1809 2268 2425 2755

»459

649

stopri

т

1054

687

деления рр-о . Phe Ст13

вставка А в 221-и кодоне

ЫС9

Рис. 11. Локализация мутаций в кластере генов psbD1/C,

и природа мутационных изменений у рзЬС-мутантов Synechocystls sp. 6803.

Н - Hindlll. S - Smat. RI - EcoRl

Рис. 12. Схема получения мутаций в кластере генов рэЬВ1/С.

клетках Е. coll (вводили в клетки мутаторного штамма Е. coll, несущего ген-мутатор mutTI, либо обрабатывали яитрозогуани-дином в клетках Е. coll). Мутагенизированной плазмидой pDICK трансформировали клетки штамма Synechocystls sp. 6803, в котором делетированы обе копии гене psbD и ген psbC (Verroaas et al., 1990), и отбирали KmR клоны на среде с глшозой. Среди полученных KmR трансформантов выявляли клоны с нарушением способности к фотоавтотрофному росту. Такой подход позволял получать мутанты по гену psbC и psbD1 (рис. 12).

В результате было отобрано 3 мутанта цианобактерии (NC8, NC11, МС9), полностью неспособных к фотоавтотрофному росту и 4 мутанта, характеризующихся замедленным ростом в фэтоавтотрофных условиях по сравнению с клетками дикого типа. По данным трансформации клеток мутантов делеционными производными плазмид р235 и pDICK все мутации были локализованы в пределах гена psbC. Анализ нуклеотидных последовательностей гена psbC из клеток четырех мутантов выявил мутации приводящие к сдвигу рамки считывания в 221 кодоне (МС9), образованию stop-кодона в положении 23 (NC8, NC11). У мутанта NC20, характеризующегося замедленным ростом в фэтоав-тотрофных условиях обнаружена мутация, приводящая к замене лизина в положении 141 СР43 на глутвминовую кислоту (рис. 11).

III.3.4. Анализ гена, нарушенного у мутанта SK18.

EcoR1 -фрагмент ДНК размером 1,4 тпн, трансформирующий к фэтоавтотрофности мутант SK18, не гибридизовался с известными генами фотосинтеза. Трансформация клеток мутанта делеционными производными EcoR1 -фрагмента позволила локализовать район мутации (рис. 13). Установлена нуклеотидная последовательность EcoRl фрагмента из клеток дикого типа и мутанта SKI 8.

Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности выявил открытую рамку считывания 0HF427, способную кодировать белок с молекулярной массой 46,688 кДа. Мутация в штамме SK18 приводит к образованию stop-кодона в положении 28, приводящего к ранней терминами синтеза белка, кодируемого ORF427. 5'- концевая нуклеотидная последовательность 0SP427, включая район мутации, приведена на рис. 14.

EcoRI Apal BspUII Apal EcoRI

EcoRI BspHII 1411 п.н.

I 310 п.н.

Apal Apal

1 ** I 1 460 п.н.

Рис. 13. Локализация района мутации (хх) и стратегия секванировгния фрагменте ДНК, трансформирующего мутант SK18.

1 5■gaattcaa6acctagacaaatagcttaaaatgagftagctaactgagaaattaactaagtt

ORF427

mskrtrrfw ы ttgtaaattttggtttgcgggggcgagcgtcacgatgggtaaacggacaaggcg6ttttg

alafsllmgal iylgntpsa

i2i ggctttagctttttctttgctgatgggggccctgatttatctgggcaatacaccgtCggc

A-SK18

lafteeoklllqswrlvnqs 101 cttggctttcaccgaggaacaaaagctactgttgcaatcctggcgtttggtcaaccaatc

YLD ETFNHONWWLLREKYVK 241 ctatctcgatgaaacctttaaccatcaaaattggtggctgttgcgggagaagtacgttaa

rplrnreetytaieertlatl 301 acgtcccctccggaaccgggaagaaacctacacggcgatcgaagaaatgctcgctaccct

depftrllrpeqygnlovt г 361 ggatgaaccctttacccgcttactgcgtccggaacagtacggcaatctccaggtgaccac

tgelsgvglq i ninpetnql 421 cactggtgagctatcgggggtaggtctgcaaatcaacatcaaccctgaaaccaaccagtt

e i maplagspaeea glqphd 481 agaaattatggcccccctggccggttcccctgcggaggaggccgggctgcaaccccatga

01laidgvdt0tlsldeaaa 541 ccaaattttggcgatcgacggtgtagatacccaaaccctgagcttagacgaagcagcggc

rmrgpkntkvsleil.sa gte 601 cagaatgcggggcccaaaaaacaccaaagtttccctggaaattctgtcagcgggcaccga

vpoeftltrql islspvaao 661 agtaccccaagaatttaccctgactcggcagttaatttccctcagtccggtggc6gccca

Рис.14, ^-концевая нуклеотидная последовательность

EcoRI фрагмента ДНК, трансформирующего мутант SKI8.

В нуклеотидной последовательности 0НР427 не выявлено участков гомологии с хлоропластной ДНК и известными генами, однако слот гибридизация СзгР]-меченного фрагмента ДНК, несущего ген рзХ, с ДНК растений показала, что гомологичная последовательность присутствует в ядерном геноме. Таким образом, ждалось выделить неизвестный ранее ген, контролирующий способность к фотоавтотрофному росту. Дальнейший анализ гена рэХ, проведенный в лаборатории X. Пакраси (Вашингтонский Университет, Сент-Луис, США) показал, что продуктом гена рэХ является С-концевая протеаза, которая участвует в процессинге белка 01 в комплексе ФС II. Таким образом, использованный в работе метод генетического анализа фотосинтетического аппарата с помощью РБ- мутантов БупесЬэсуБиз эр. 6803, позволяет выявлять новые гены и Селки, контролируйте фотосинтез.

III.5. Анализ фотосинтзтических свойств мутантов*.

Измерения фотосинтетического выделения кислорода, фото-индуцированних изменений переменной флуоресценции, спектров ЭПР и низкотемпературной флуоресценции (табл. 4) показывают, что у большинства РЗ-мутантов отсутствует функция ФС II, тогда как активность ФС I сохраняется на уровне клеток дикого типа. Активность ФС II обнаруживается только у рзЪВ-мутанта НР2 и рзЬС- мутанта N020, причем в клетках штамма 10*2 она заметно снижена по сравнению с выращенными в тех же условиях клетками дикого типа.. По данным измерений выделения 02 на вспышку содержание функционально активных центров ФС II у мутанта И?2 составляет около 25-30 % от дикого типа. Измерения фотоингиби-рования темнового дыхания на вспышку показывают, что у большинства мутантов подавление кислородвыделямцей активности сопровождается увеличением в 1,5-2 раза соотношения ФС1/ФСП, что может указывать, на отсутствие собранных комплексов ФС II. Возможно, в клетках этих мутантов происходит перераспределение хлорофилла на добавочно синтезируемые комплексы ФС I.

*Данный раздел работы выполнен совместно с С.И. Аллахвердиевым, В.А. Бойченко, В.В. Климовым (ИПФ РАН) и В.Ы. Голицыным, Б.А. Гуляевым, В .Л. Тетенькиным и К.Н. Тимофеевым- (каф.. биофизики МГУ)

Таблица 4. Фотосинтатическая активность клеток PS-мутантов Synechocygti3 ар. .6803

к> ■о

Мутантный V ммоль 02 Y ммоль 02 ДУ Сигнал ЭПР Тбрмолкг,nine сценция Флуоресценция при 77К

ген Штамм моль ХЛ-С

F щ i II ТЛ~Б5 ТЛ-15

ФВК ФВД ФВК ФИД ЬВ5 им ьчь нм 725 НМ

дикий тип 11,2 0,9 0,17 0,5 0,73 + + + + + + +

SK4 0 .....2,0..... - ...0,8...... 0 + - - - + - 4-

psbB РМВ1 0 4,0 - ...0,8...... 0 + _ - _ + _ +

№2 Т,6 3,0 0,05 0,5 0,3 + + + + + - +

SK15 0 5,8 _ ,_i.i.2______ 0 + _ + _ +

SN5 0 5,3 _ 0,8 0 + _ - - + _ +

psbO СР13 0 4,1 - ....Q.,.4._____ 0 + _ - - + _ +

МС9 0 ..J„,2_____ _ 0,6 0 h _ н/о н/о + — +

NC20 38,7 4,0 - 0,6 0,5 + + н/о н/о ++ + +

рэЬЕ SK9 0 3,5 - 0Г7 0 + _ _ - + — +

NF3 0 2,1 - 0,9 0 + - - + - +

pabP SK7 0 5,5 - ...9,8....... 0 + — - - + _ +

NP8 0 4,6 - 0,6 0 + - - - + - +

Обозначения:У-скорость обмена 02 при насыщающей интенсивности света \=Б80-700 нм; У-гвзообмен 02 на насыщающую вспышку длительностью 1,8 мкс; ФВК-фотосинтетическоэ выделение кислорода; ФВД-фотоингибирование темнового дыхания (в присутствии 10 мкМ диурона); н/о - не определяли; (-) - нет активности; (+) - есть активность.

Таким осразом, нарушение способности к фэтоавтотрофному рост/ у большинства PS-мутантсп Synechocystls ар. 6803 вызвано отсутствием функции ФС II вследствие мутационных изменений белков СР47, СР43 и цитохрома №59. В белках СР43, СР4? и в а-и р-субъединицах цтаохрома Ь559 выявлен ряд аминокислотных остатков нарушение которых приводит к подавлению фупкции ФС II у Synechocystis sp. 6803. К таким учагткам относятся: район 208-211 аминокислотных остатков белка СР4? (мутант Г MB* ), фенклалакиновые остатки в положении 422-424 оелка GP43 (мутант СР13), а также фенилаланиновый остаток в 36 у. пролиновый е 53 полозсэпЕях а- субъединицы (мутгеты SK9 к KF3) и ваягоошй - в 29 шлошыш р-субьединицц цитохрома Ь559 (мутант NF8). Пока неясно, играют ли указанные районы функциональную роль, или их нарушение препятствует правильной сборне комплекса ФС II.

В клетках psbB- мутанта NF2 сохраняется фоаосинтеткческая активность, хотя она значительно ниже, чем в клетках дикого типа. Тем не менее, клетки мутанта KF2 не способны к росту в фотоавтгтрофннх условиях. По-видимому, встраивании мутантного белка GP47, несущего замену ?rp.¡ —► trg, дестабилизирует комплекс ФС II, что приводит к погашенному уровню фэтоингибированкя я нарушению способности к фотоавтотрофгюму росту у мутанта NF2. Замена Lys141 на Glu в белке СР43 у psbC-мутанта NC20 вызывает лишь не::оторое снижение скорости роста клеток в фотоавтотрофвых условиях, не нарушая активности ФС II. Таким образом, указанная мутация es нарушает функцию ФС II и не приводит к повышению уровня фотолвгибирования в клетках Synechocystis эр. 6803.

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли белков СР43, СР47 и цитохрома Ь559 в функционировании ФС II. Эти белки, не являясь в прямом смысле компонентами электронно-трзнспортной цепи, необходимы для формирования правильного окружения и нормального функционирования реакционного центра ФО II. В белках СР47, СР43 п цитохрома Ь559 выявлены отдельные аминокислотные остатки, мутационные изменения которых приводят к нарушению активности ФС II. Эти аминокислотные остатки локализованы, как правило, в тех районах белков, которые высоко консервативны у циаюбактерий .и растений, и могут, по-видимому, нести функциональную нагрузку i"

IV. Клонирование и анализ гена, хонтралирувдего

устойчивость к иатронидазолу я иитрофенольшн гербицидам.

Изучение генов, контролирующих устойчивость к различным ингибиторам, дает важную информацию о молекулярных механизмах а клеточннх мишенях действия этих ингибиторов. Показано, что устойчивость к гербицидам класса триазинов (атразин я др.) и мочевин (диуронидр.) у■ цианобактерий и у высших растений определяется уменьшением сродства белка D1 ФС II к указанным ингибиторам еслэдствиэ мутаций в генз psbA. (Golden, Haselhorn, 1985; ЛоЫкзоп et al., 1987). К числу широко используемых ингибиторов энергетического метаболизма у растений относятся нитрофзнольный гербицад динссеб (б-(сэк-бутил)-2,4-динитрофенол), ингибирутщий активность ФСП и фотофосфорилирование (Гольдфельд, Кврапетян, 1989), и метронидазол (I- (2-гидроксиэтил)- 2-метил- 5-нитроимидазол), действующий на различные ферредоксин-зависимые путл транспорта электронов (Quon et al., 1992; Schmidt et al., 1977). 0 молекулярных механизмах развития резистентности к этим агентам в клетках фотосинтезирухщих организмов известно очень мало, и существенный вклад в изучение этой проблемы может внести клонирование и анализ цианобактериальных генов, ответственных за устойчивость к этим ингибиторам.

Устойчивые к даносебу.(Din") мутанта Synechocystls эр. 6803 характеризуются повышенной резистентностью и к другим нитрофенольным ингибиторам, таким как динитрофенол и ДНОК (4,6-динитро-о-крезол), а также к ингибитору фотосинтетического транспорта электронов метронидазолу. По чувствительности к диурону (3-(3,4-дахлорфенил)-1,1-диметилмочевш8) и феноль-ному гербициду иоксинилу (3,5-дийодо-4-гидрокси-бензонитрилу), действупдим на белок D1 ФС II, клетки мутантов не отличаются от дикого типа (табл. 5). Это позволило предположить, что устойчивость связана не с изменением гена psbA, а определяется другим механизмом.

Отобранный в независимых экспериментах при селекции на устойчивость к метронидазолу (MdR) спонтанный мутант Ш31, также как и Dln^ мутанты обладал перекрестной устойчивостью к нитрофенольным гербицидам и чувствительность к диурону и

Таблица 5. Устойчивость мутантов Зупес1юсуз1;1з 6803 к ингибиторам фотосинтеза.

Штамм Ингибирукщая концентрация агента (мкМ) *

Диносеб ДНОК динитро-фенол (гетро-нидазол йокси- ЕИЛ Диурон

Дикий тип 7 80 г? 2 400 5

Ю1п7 100 250 80 20 400 5

В1п9 100 250 80 2П 400 5

Б1вЕ4 100 250 80 20 400 5

Ш31 100 250 80 20 ^ 400 5

""Минимальная концентрация ингибитора, подавляющая рост клеток на вгаризовашой селективной среде.

иоксинилу (табл. 5). Эти данные свидетельствовали о том, что в клетках цианобактерии имеется общая для реализации действия диносеба и метронидазола система, не связанная непосредственно с функцией фотосистемы II. Признак перекрестной устойчивости к этим агентам передавался с высокой частотой при трансформации клеток штамма дикого типа ЗупейшсуэИз 6803 донорной ДНК, выделенной из Б1п^и Мб.к мутантов, что создавало возможности для клонирования гена, опредэлящего устойчивость.

Из банков генов мутантов Б1п7, 1)1п9 и К<331 были выделены рекомбинантные плазмиды, содержащие НШйШ фрагменты цианобактериальной ДНК размером 4,7 тпн и трансформирующие клетки штамма дикого типа БупесйосузМз ■ 6803 по признаку устойчивости к даносебу или метронидазолу (рис. 15). РестрикциоЕные карты этих фрагментов идентичны, для всех трех мутантов. По результатам трансформации клеток дикого типа делециоявнми производными плазмид все три мутации были локализованы в различных районах Н1пй111/В81И фрагмента размером 1,2 тш (плазмида рБНБ). Плазмиду рВНЗ использовали в качестве зояда для выделения гомологичного Н1пс1111/Б^11 фрагмента пз банка генов штамма дикого типа цианобактерии (плазмида рВТбЗОЗ).

pDln7

ВГ

HUI

BSL

SI SI Bgll SI SI PBl BI EIII

« ÜJ

1.0 2.0 3.0 4.0 4.7

Bgll

pEHS (DinY)

0.5

1.0 1.2

mil or si DlnTfcT

pBH(Din7, Dln9), 470 ПН

SI p R SI . Dln^Jd .

Lmmamma—í pSS(Md31), 310 ПН

р

Рис. 15. Рестрикционные карта фрагментов ДНК из клеток Din и MiR мутантов Synechocystls sp. 6803, передающих, признак устойчивости клеткам дикого типа при генетической трансформация.

Клонированный Hindlll/Bglll фрагмент (1,2 тын) ДНК штамма дикого типа сбквенировали в составе фагового вектора ¡413. в саквенированной последовательности нуклеотидов обнаружена одна открытая рамка считывания 0RF210 длиной 630 пн. Перед кодирупцей последовательностью 0RF2T0 имеется участок, соответствующий промотору. Ген, кодируемый 0BF210, назван нами drgA (dlnoseb resistance gene). Полная последовательность гена drgA приведена на рис. 16.

123 бабттстсттстсстаатсаттттсстабстатсаттбстаааасастатббасассттт 102

и о т р 4

1вз БАСБСТАТТТАССААСББСбАТСББТТААБСАТТТТБАСССТБАССАТСБТТТААСББСС 242 боагуоррэукнрсрсннита 24

243 БААБААБАААБАААБТТБСАСеААБСББССАТССААБСТСССАСТАСТТТТААСАТССАА 302 25-ЕЕЕРК1-НЕ АА 10АРТБРИ1 0 44

303 СТТТББСБАТЧСТТБАТСАТТСБББАЧССССААСТБСЕССАААССАТССЕББАААААТАТ 362 45 1.МЯГ|.11П0РО1.ЯОТ^ХКЕКУ 64

ЗЬЗ ББСААТСАББСССАААТБАССБАСБСТТСССТБТТААТТТТБОТАБСВБСББАТБТТАГ.С 422 65БЫ0А 0МТ0А51-1.1 V А А О V N В4

423 БСТТБББАТДААБАССССБСССБТТАСТББСБСААТБССССССБББААБТеБССААТТАТ 482 B5AWDKDPARYWRNAPRE^/ANY 104

ДВЗ СТТБТТББББСБАТСБССТСТТТСТАТББТББСАААССАСАБТТБСААСББЗЛТБААБСС 542 105 |_УБА1АЗРУББКР01_ОРОЕА 124

543 СААСББТССАТТББСАТББССАТБСААААТТТБАТБТТББСББССААББССАТБББСТАТ 602 125 О Я 5 I БМАМ0(Ч1-М1.ААКАМБУ 144

603 БАТАБСТБТСССАТБАТСББСТТТБАССТССААААББТАБССБАБТТБЗТСДААТТАССС 662 145 0БСРМ1БР01.аКУАЕ!-УКиР 164

663 БСТБАСТАТБССАТТББССССАТББТББСБАТСББТАААСБСАССБААБАТБССССБББС 722 165 а0уа1брмуа1бкктейарб 1в4

723 ААААББСББТСАААСТССССТББААБААТТССТСТБББААААСТССТТТБССТААСТААБ 782 185КРР5МБРБР1Р1_БК1.1. С1-ТК 204

783 БТТТББТБТТТАБСААТТТАБТБТТБАБТББСТААТТБСТБААСССБСТССБАСТСССАТ В42 205 V И С I- А I

Консенсус - промотор 5 ТТБТАА ТАТСАТ М12 3 АТБ Промотор ORF210 5 ТТСТСС N ТАТСАТ N 3 АТБ

Рис. 16. Нуклеотидяая и аминокислотная последовательности гена Подчеркнута предполагаемая промоторная область.

Компьютерный анализ луклеотидвой последовательности гена йг&А показал, что 0НР2Ю не имеет существенной гомологи! с известными генами и хлородластной ДНК расгзний. Гибридизация но Саузерну [32Р1-меченного фрагмента ДНК, несущего ган бг

с ДНК растений обнаружила положительные сигналя с ядерной ДНК. Ггкга образом, ген clrgA лвляьтся не клонированным ранее гзнсм, способны?.) кодировать белок с молекулярной массой 23,703 кДа. Изучение экспрессии гена drgA в миниклетках Е. coli в ссставе вектора экопрэссии рИК223 подтвердило, что транслируемый продует гона drgA соответствует молекулярной мзссе, предсказанной по данным секвенирования нуклаотпдной последовательности (рис. 17).

Рис. 17. Трансляция продукта гена drgA. в миниклетках Е. coll.

А - белки, синтезированные с 4,7 тш фрагмента pïïT6803, клонированного в рКК223-3. Б - белки, синтезированные с рКК233-3.

1 - р-лактамаза (29 кДа);

2 - продукт гена drgA (23 кДа).

А Б

Сравнение нуклеотидаых последовательностей гена dгgA из клеток штамма дикого типа и субклонированных фрагментов ДНК из мутантных штаммов (П1п7, П1п9 и МЙ31) показало, что все три мутации находятся в пределах 0КР210 и обусловлены заменой единичных нуклеотидов в различных участках гена (табл. 6).

Таблица 6. Молекулярная природа мутаций, обусловливающих резистентность к диносебу и метронидазолу.

Мутантный штамм Положение кодона в 0KP21Q Замена нуклеотида Замена аминокислоты

Dln7 45 Т —► А лейцин на гистидин

Dln9 7 А — G изолейцин на валин

Ш1 170 G —► А глицин на аспарагиновую кислоту

В целях изучения функции гена был проведен инсерци-онный и делеционный анализ цианобактериального фрагмента в составе рй(Т6803. Инсерционные и делеционные варианты плазмиды получали путем встраивания в различные участки Н1гк1111Л^111 фрагмента (1,2 тпн) гена устойчивости к канамицину (Кшй) из плазмида рШ-4К (рис. 18). Сконструированными плазкидами трансформировали клетки штамма дикого типа Зупес1юсуз1;1з яр. 6803 по признаку устойчивости к канамицину. Кшк-трансформанты (как к клетки мутантов Б1п7, В1д9 и Мй31) нормально растут в фотоавтотрофшх условиях. Это указывает на то, что инсерции и делеции не затрагивают гены, ответственные за фотосинтез и жизненно необходимые функции в клетках цианобактерш.

KmRI)lnS Ins 1 HlncII

кА>1лК

Ins 2

HlncII Smal

Banfll

Smal

i Km11 DinR i i Km11 DlnR i

KnPDinS

Ins 3

pBHS(ИТ6803) 1,2 тпн

Bglll

Del 1

Del 2

Рис. 18. Делеционные и инсерционные производные плазмиды

pBHS(WT6803) и фенотипы клеток дикого типа, трансформированных

этими производными.

ti я s

Km - устойчивость к канамицину; Din - устойчивость. Din -

чувствительность к диносебу; Ins1-Ins3 - инсерции гена KmR;

Dell, Del2 - замены делетированного участка циашбактериальной

ДНК геном КлР. Светлой полосой выделен -ген árgA (0RF210).

Проверка устойчивости Кт^-трансформаятов к диносебу или метронидазолу показала, что делеции и инсерции, расположенные внутри гена drgA, приводят к развитию устойчивости к указанным ингибиторам. KmR- трансфэрманты с инсерциями Insl и 1пзЗ (вне 0RF21O) не обладают устойчивостью к метронидазолу или диносебу (рис. 18). Эти данные свидетельствуют о том, что признак . устойчивости к диносебу и метронидазолу обусловлен t инактивацией гена drgA к утратой функции продукта гена drgA. По-видимому, устойчивость к этим агентам не связана с изменением способности белка-мишени взаимодействовать с ингибитором, как в случае атразина, действующего на белок D1 фотосистемы II, а определяется отсутствием функционально активного продукта генв drgA.. Возможно, этот белок участвует в транспорте метронвдазола и нитрофенолов в клетки цианобактерий, либо . обеспечивает метаболическую активацию ингибиторов с образованием токсичных для клеток цианобактерии продуктов.

Известно, что устойчивость к метронидазолу мутантов Trichomonas vaginalis обусловлена снижением содержания фэрредоксина, игращего ключевую роль в образовании активной формы метронвдазола вследствие переноса электрона на его нитрогруппу (Quon et al., 1992). Образупциеся при восстановлении метронидазола радикалы и перекись водорода могут индуцировать деструкцию фотосинтетических мембран. Поскольку устойчивость к диносебу и метронидазолу определяется в клетках мутантов Synechocystls sp. 6803 одним и тем же геном drgA, можно предположить, что токсическое действие диносеба, ДНОК и динитрофенола, имепцих нитрогруппы, также связано с активацией этих агентов в клетках цианобактерий при участии продукта гена drgi. В таком случае развитие резистентности к диносебу может быть обусловлено блокированием этого пути биотрансформации. Не исключено однако, что множественная резистентность к диносебу и метронидазолу связана с утратой какого-то общего белка-мишени, участвующего в ферредоксин-зависимом пути транспорта электронов. Полученные данные по-новому освещают проблему механизмов возникновения устойчивости фотосинтезирующих клеток к нитрсфенольным гербицидам,--используемым в ингибиторном анализе функций аппарата фотосинтеза.

V. Физическое картирование генома ЗупесЛосуеие ер. 6803*

Изучение структурно-функциональной организации генома БупесЬосузиз ар. 6803 в значительной степени ограничено из-за отсутствия систем трансдукции и конъюгационного переноса, что затрудняет, генетическое картирование у этого объекта. Использование метода пульс-электрофореза дай разделения крупных фрагментов ДНК позволяет строить физические карты хромосом-различных объектов и локализовать на них различные гены с помощью гибридизации (Янковский, 1389).

Для получения высокомолекулярных т1репар®тоь ДИК БупесИосуз-Мз зр. 6803 была отработана процедура лизиса клеток непосредственно ь агарозном геле. Средний размер фрагментов хромосомной ДНК ЗупесКосузИз зр. 6803 в образцах составлял оолЬе 800 тпн. Хромосомную ДНК Зупеслосузиз эр. 6803 подвергали рестрикции. непосредственно в блоке легкоплавкой агарозы. Большинство проверенных рестрикционных эндонуклеаз оказались непригодными для картирования гэпома, т.к. они расщепляли хромосомную ДНК БупесЬосуз1;1з эр. 6803 более чем на 50 фрагментов. Для физического картирования генома БупесЬосузШ зр. 6803 были выбраны рестрикт83Ы Но1И, расщепляющая хромосому пзанобактерни на 31 фрагмент, К1и1 - на 18 фрагментов е Есо.72.1 - за'39 фрагментов (табл. 7). Размер генома БупесЬосузНБ зр. 6803, определенный по сумкз размеров рестрикционных фрагментов, составляет 3300 ± 90 тле.

Для построения физической карта генома БупесЬосузиз зр. 6803 использовали перекрестную блот-гибридизацшо №Л1-, Н1и1-и Есо72.1- рестрикционных фрагментов, а также блот-гибридизацию с №э1;1-линкерными клонами. На основании полученных данных с учетом результатов неполной рестрикции построена физическая карта хромосомы БупесЬосузиХв зр. 6803. С использованием в качестве гибрвдяз8ЦИовных зондов клонированных генов цианобактерий на физической карте установлено положение некоторых генов, кодирующих белки фотосистемы II и фотосистемы I (рис. 19).

*Этот раздел работы выполнен совместно с И.Н. Шалаком и М.Ю. Фонштейном

Таблица 7. Размеры рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК Synechocystls sp. 6803

Рэстрпкционная эядонуклэгза

Но ti Eco.72 1 M1U1

Рестрикционнае фрагменты

название длина название длпьа название длина

(тпн) (тпн) (тпн)

А 458 A 418 A 870

в 325 в 327 B 495

С * 300 с 214 С 330

D 217 D 20S D 310

Е 207 E 204 E 204

■ F 191 F 159 F 189

G 178 G 147 G 140

H 164 G 141 H 133

I 157 G 132 I 116

J I33a H 102 К 109

К IOS I 93 L 92а

L 99 J 80 a M 77

M 91 К 69 N 71

N 86 L 64 0 57

0 82 M 58 P 50

P 69 N 51 a 44

0 57a 0 486 R 23

R 48 P 43в s 15

S 44 Q 39r

T 42 R 22a

и 38a S 156

V 35 T 12

M 25 и 10

X 21 V 5

Y 20 w 2

Z 17

AA II -

AB 9a

Примечание : средняя статистическая ошибка - 5 тпн а-дуплет , б-тришгот , в-четыре фрагмента, г-шесть фрагментов

Рис. 19. Физическая карта хромосомы Зупес1юсузг1Б ар. 6803 и локализация на вей генов, кодирующих белки фотосистемы II и фотосистема I.

На внешнем кольце показаны фрагменты, образуемые рзстриктазой КоИ : на среднем - М1и1; на внутраннем - Есо72.1. * - порядок расположения фрагуьЕтов в данном месте был установлен по слабым сигналам гибридизации; ? - фрагмент (ы) не определен (ы)

Заключение

Разработанные в настоящей работе системы клонирования ' генов позволяют вводить любые гены в геном цианобактерий А. п14о1апз В2 и БупесЬосуз^з зр. 6803. Эти системы могут быть использованы для клонирования, модификации и . изучения экспрессии в клетках цианобактерий гетерологичных генов, а также для анализа и-направленной модификации цианобактеривль-ных генов. Полученные в работе данные об экспрессии в клетках А. пШИапз В2 генов а-амилазы и эндоглюканазы из грамположительных бактерий и гена В1 гордеина ячменя свидетельствуют о возможности использования цианобактерий для клонирования генов, имеющих биотехнологическое значение, и создания штаммов-продуцентов для микробиологической промышленности.

Клетки цианобактерий представляют особый интерес как реципиенты для клонирования растительных генов, которые после необходимой модификации могут быть снова введены в геном растений с целью получения ценных сортов. Полученные в настоящей работе данные об экспрессии гена В1 гордеина ячменя в клетках Зупес1юсуз1;1з зр. 6803 показывают, что клетки цианобактерий являются • подходящим объектом для клонирования генов запасных белков растений под контролем цианобактериальных (или бактериальных) промоторов. Направленная модификация клонированных растительных генов в клетках цианобактерий позволит получить ценные источники пищевого и кормового белка, а также использовать модифицированные гены для введения их ■ в клетки растений и создания новых сортов.

Использование матодов генетической инженерии значительно расширило возможности изучения генов, контролирующих фотосинтез и устойчивость к гербицидам. В отличие от проводимых в ряде зарубежных лабораторий работ по направленному изменению отдельных аминокислотнкх остатков в белках ФС II, использованный нами подход позволяет не только выявить функционально значимые участки, белков ФС II, но и найти новые гены, контролирующие фотосинтез. С помощью

коллекции случайных мутантов в настоящей работе удалось выделить неизвестный ранее ген рзХ, участвующий в генетическом контроле-фотосинтеза. Молекулярный анализ генов рэЪВ, рзЬС и рзЬЕ/Р, кодирующих структурные белки ФС II, позволил выявить отдельные участки зтвх белков, необходимые для структурно-функциональной целостности ФС II. Высокая гомология аминокислотных последовательностей белков СР43, СР47 и цитохрома Ь559 у различных фотооштезирупцих организмов в районах локализованных нами у ЗупесЬосуаг1з вр. 6803 мутаций свидетельствует о том, что данные о функционально значимых участках этих белков приложимы и к другим объектам, осуществляющим оксигенный фотосинтез.

Полученные в диссертации данные имеют принципиальное значение для понимания механизмов развития устойчивости к ряду гербицидов. Впервые выделен ген йгзА, ответственный за устойчивость клеток цианобактерки к метронидазолу и нитрофенольным гербицидам. Показано, что устойчивость к этим агентам определяется отсутствием в клетках полноценного продукта гена бге&. Таким образом, развитие устойчивости не связано с мутационными изменениями белка В1 ®С II, а определяется нарушением белка, участвующего в транспорте или модификации ингибиторов, разработанная методика выделения генов, ответственных за.резистентность, может, применяться душ клонирования различных цканобактериальных генов, определяющих устойчивость к ингибиторам, гербицидам и стрессовым факторам. Высокая гомология многих цигнобавтериальных и растительных генов и, в частности, наличие в геноме растений последовательностей, гомологичных генам йг£А и рзХ, свидетельствует о том, что данные .. о новых генах, контролирующих фотосинтез и устойчивость к гербицидам, могут Сыть применимы и к растениям. Клонированные гены цианобактерпй могут быть использованы в качестве гибридязациозных зондов для выделения из растительных клоьотзк гомологичных генов, которое после их направленной »одкфжации могут быть введены в клетка растений с целью создания новых форм, цышнх для сельского хозяйства.

Основные выводы

1. Сконструированы автономно реплицирующиеся и интегративные векторные плазмиды для одноклеточных цианобактерий Anacystis nidulara R2 и Synechocystls sp. 6803. Клетки A. nldulans R2 с высокой частотой трансформируются автономно реплицирующимися и интегративннми векторными плазмидами. Наиболее высокая эффективность введения генов в клетки Synechocystls sp. 6803 достигается при использовании интегративных векторных штазмид, обеспечивающих замещение участка хромосомы цианобактерии гомологичным фрагментом ДНК, клонированным в векторе.

2. В клетках A. nldulans Е2 клонирован ген а-амилазы Bacillus amylollquefaclens, содержащий собственный промотор и лидерную последовательность. Показана экспрессия гена а-амилазы и секреция продукта в периплазму клеток цианобактерии.

3. В клетках А. nldulans В2 клонирован гея эндоглюканазы из целлплолитического комплекса Clostridium thermocellm. Эндоглюканазная активность обнаруживается в цитоплазме клеток цианобактерии. В отличие от других гетерологичных систем, в клетках A. nldulans В2 не происходит секреции эндоглюканазы.

4. В клетках Synechocystls sp. 6803 клонирован ген В1 гордеина ячменя Hordeum vulgare L. под контролем 1ас-промотора Е. coll. Продемонстрирована экспрессия гена запасного белка растений в клетках цианобактерий.

5. Создана коллекция дефектных по фотосинтезу мутантов фотогетеротрофной цианобактерии Synechocystls sp. 6803. Из геномного банка дикого типа Synechocystls sp. 6803 выделены фрагменты ДНК, восстанавливающие способность к фотосинтезу у мутантов при генетической трансформации. Показано, что у большинства мутантов нарушены гены psbB, psbC и psbE/F, кодирующие, соответственно, хлорофилл-связывавдие белки СР47, СР43 и цитохром Ь559, входящие в комплекс фотосистемы II.

6. Клонирован и секвеиировая новый ген psX, контролирующий фотосинтез и кодирующий белок с молекулярной массой 45,7 кДа. Установлено, что нарушение способности к фотоавтотрофному росту у мутанта SKI 8 связано с мутацией, вызывающей раннюю терминацшо синтеза белка, кодируемого геном рэХ.

«з

7. Установлена природа мутаций в генах рзЬВ, рзЬС и _ рзЬЕ/Р, приводящих к нарушению функции фотосистемы II. В большинстве случаев это мутации, приводящие к крупным нарушениям структуры белков СР47, СР43 и цитохрома Ь559 вследствие образования з1ор-кодонов и сдвига рамки считывания в кодирующих их генах. Выявлено несколько отдельных аминокислотных остатков в белках СР43, СР47 и субъединицах цитохрома Ь559, необходимых для функции фотосистемы II.

В. Установлено, что мутации в генах ргЬВ (мутант N12) и рэЪС (мутант N020), приводящие к замене Тгр16? -»Агв в белке СР47 и Ьуз141—>С1и в белке 0Р43, не приводят к полному подавлению функции фотосистемы II. Нарушение способности к фотоавтотрофному росту у мутанта КР2. может быть следствием повышенного фотоингибирования.

9. Клонирован и секвенирован новый ген ответственный за перекрестную устойчивость клеток Зупесйосув^з ар. 6803 к метронидазолу и нитрофенольным гербицидам (динитрофенолу, ДНОК, диносебу) и кодирующий белок с молекулярной массой 23,7 кДа, Установлена природа мутационных повреждений у резистентных мутантов. Показано, что устойчивость клеток БутсЬосуБЪЗ-Б эр. 6803 к метронидазолу и нитрофенольным гербицидам связана с отсутствием активного белка - продукта гена бг^. Предложен новый механизм действия нитрофенольных гербицидов в клетках БупесЬосузиБ Бр. 6803, согласно которому продукт гена участвует в транспорте либо модификации ингибиторов и превращении их в токсичные для клетки продукты.

10. Неизвестные ранее гены рз2 и бг£А обнаруживают гомологию с ядерной ДНК растений. Таким образом, геном цианобактерий являются перспективной модельной системой для поиска новых генов и использования их в качестве гибридизационннх зондов для клонирования гомологичных генов из генома растений.

11. Построена физическая карта хромосомы БупесЪосуаШ эр. 6803 и установлен размер хромосомы БупесЬосузиз ар. 6803, составляющий 3300 тпн. На физической карте локализованы гены ргЬА, рзЬВ, рэЬВ1 /С, рБЪЕ/Т, рзЪй, рэЪН, рзЬК, рзЬО, рзаА/В, рэаС, рзаВ, рзХ, кодирующие белки фотосистемы II и фотосистемы I.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Еланская И.В., Постнова Т.А., Богданова С.Л., Шестаков C.B. Нестабильность двурепликонного вектора для цианобактерии Anacystls nldulans R2 и Escherichia coll, полученного на основе плазмиды pBR322 // Тезисы V Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов. Москва, 1983. С. 143-144.

2. Еланская И.В., Моргунова И.Б., Шестаков C.B. Векторы интеграции для цианобактерии Anacystls nldulans Н2 //Тезисы Всесоюзной конференции ""Новые направления биотехнологии". Пущино, 1984. С. Э.

3. Еланская И.В., Богданова С.Л., Бибикова М.В., Кокшарова Т.А., Агамалова С.Р., Никитина Е.И., Шестаков C.B. Плазмиды цианобактерии Synechocystls sp. 68Ю. В сб. "Гибридные плазмиды и экспрессия плазмидных генов"//Тезисы IX Всесоюзного совещания по программе "Плазмида". Москва, 1984. С. 27.

4. Шестаков C.B., Еланская И.В., Бибикова М.В. Векторы интеграции для цианобактерии Synechocystls эр. 6803 //Доклады АН СССР, 1985. Т. 282, N I. С. 176-179.

5. Еланская И.В., Моргунова И.Б., Шестаков C.B. Рекомбинантные плазмиды, способные к интеграции в хромосому цианобактерии Anacystls nldulans В2 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1985. Н 11. С. 20-24.

6. Еланская И.В., Бибикова М.В., Шестаков C.B. Векторные плазмиды для цианобактерии Synechocystls sp. 6803 //В сб. "Достижения микробиологии - практике". Тезисы YII съезда ВМО. Алма-Ата, 1985. Т. 3. С. 25.

7. Еланская И.В., Бибикова М.В., Богданова С.Л., Кокшарова Т.А., Агамалова С.Р., Никитина Е.И., Шестаков C.B. Плазмиды цианобвктерии Synechocystls sp. 6803 // Молекулярная генетипа, микробиология и вирусология. 1985. N 8. С. 19-21.

8. Елэнская И.В., Моргунова И.Б., Шестаков C.B. Экспрессия генов грам-положитэльных бактерий в клетках Anacystls nldulans R2 // В сб."Проблемы переноса генетической информации". Тезисы X Всесоюзного совещания по программе "Плазмида". Пущино, 1985. С.27.

9. ShestakûT S., Elacskaya I., Biblïova H. Vectors Тот gene clonlng In Synechocystls 6803 // Abstr. V Int.Symp. on îhotosynthetlc Prokaryotes. Grindelwald, Switzerland, 1985. P. 109.

10. Elanskaya I., Morzunova I., Shestakov S. Expression oí gram- positise bacteria genes In cyanobacterlum Anacystls nldulans R2- //Abstr. V Int.Symp. on Photbsynthetic Prokaryotes. Grindelwald, Switzerland* 1985. P. 372.

11. Еланская И.В., Бибикова М.В., Кокшарова Т.А,, Кокшарова O.A., Смирнова Т.Н., Станбекова Г.Э., шестаков C.B. Системы вектор-хозяин для цианобактерии Synechocystis 6803 //Тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии". Пущино, 1966. С. 131.

12. ShestakoY S., Koksharova 0., Elanskaya I. Mutants oí cyanobacteriun Synechocystis 6803 unable to grow photoautotro-phically // Abstr. Ш Int. Congr. oí Mlcroblollogy. Manchester, 1986. P.110.

13. Шестаков C.B., Еланская И.В., Кокшарова O.A. Цианобактерии как модельные объекты-для клонирования генов, отвзтствен-ных за фотосинтез // Тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии". Пущино, 1986. С. 139.

14. Шестаков C.B., Кокшарова O.A., Еланская И.В., Станбекова Г.Э. Дефектные по рекомбинации мутанты, цианобактерии Synechocystis 6803 // Тезисы VI Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москве, 1987. с. 191.

15. Еланская И.В., Бибикова М.В., Богданове С.Л., Бабыкин Ы.М., Шестаков C.B. Бирепликонные векторные плазмиды для цианобактерии Synechocystis 6803 и Escherichia coli // Доклады АН СССР. 1W. Т. 293, N3. С. 716-719.

16. Еланская И.В., Хиленкова М.А., Вильчинскас Р.Л., Шестаков C.B. Гибридные векторы для цианобактерии Anacystls nidulans Н2, содержащие плазмиду püB110 из Staphylococcus aureus // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1988. N1. С. 9—13 •

17. Шестаков C.B., Кокшарова O.A., Грошев В.В., Еланская И.В. Дефектные по фотосинтезу мутанты цианобактерии Synechocystis 6803 // Биологические науки. 1988. N1. С. 75-80.

18. Sheatakov S., Elanakaya I., Ermakova S., Koksharova О., Smimova T. Isolation of genes controlling the photosynthesis in Synechocystis sp. 6803 // Abstr. VI Int. Symp. on Photo-trophic Prokaryotes, Netherlands, 1988. P. 77.

19. Еланская И.Б. Цианобактерии как объект генетической инженерии и В сб. "Молекулярная генетика .микроорганизмов". м., Наука, 1988. С. 119-128.

20. Еланская И.В. Клонирование генов в клетках циапобактерий //В сб. "Фототрофнне микроорганизмы". Пущино, 1988. С. 19-28.

21. Барский Е.Л., Губанова O.K., Еланская И.В., Самуилов В.Д., Станбекова Г.Э., Шестаков C.B. Мутанты цаанооактерии Synechocystis 6803 с нарушениями на донорной стороне фотосистемы II // Биологические наука, 1S89. Н7. С. 29-33.

22. Еланпкая И.В., Моргунова И.Б. Клонирование гена альфэ-аыилазы Bacillus a^lollqueíacieiis в. клетках цианобактерии Anacystls nidulans R2 // Молекулярная генетика, микробиология и виоусология. 1989. N9. С. 7-11.

23. Шестаков C.B., Еланская K.B., Ермакова С.Ю., Андрианов

B.М., Ульмасов Т.Н., Кокшарова O.A. Клонирование фрагментов ДНК, трансформирующих к фотоавтотрофности дефектные по фотосинтезу мутанты цианобактерии Synechocystls 6803 // Доклады АН СССР, 1989. Т.308. N1. С. 211-214.

24. Loss O.A., Lebedeva N.V., Elanskaya I.V., Shestakov S.V., Semenenko V.E. Cloning and functioning oí the chloroplasts

?romoters In E. coll and Synechocystls // In: Current Research n Photosynthesis, M. Baltsheíísky ed., т. III. Kluwer Acad. Publ. 1990. P. 645-649.

25. Elanskaya I., Chesnavlchene E., Shestakov S. Cloning of the gene involved in resistance to herbicide dlnoseb In the cyanobacterlum Synechocystls 6803 // Abstr. VII Int. Syrap. on Photosynthetlc Prokaiyotea. Amiierat, USA, 1991. P. 19A.

26. Shestakov S., Elanskaya I., Eraakova S., Stanbekova G., Blblkova Ш., Broun H. Molecular analysis or genes for photosynthesis In the cyanobacterlum Synechocystls 6803 // Abstr. VII Int. Syinp. on Photosynthetlc Prokaryotes. Amherst, USA, 1991. P. 33B.

27. Лысенко E.C., Танеева Т.А., Ермакова С.Ю., Еланская И.В., Огашова O.A., Тарасов В.А. Гомология клонированных фрагментов ДНК* цианобактерии Synechocystls 6803 с хлороплаетной и ядерной ДНК растений // Генетика. 1991. Т. 27, N 4. С. 581-588.

28. Еланская И.В., Ермакова С.Ю., Станбекова Г.Э., Гадкиев А.Г., Броун М.Н., Карбышева S.A., Шахяабатян Л.Г., Чеснавичене Э.А., Шестаков C.B. Молекулярно-генетическсй анализ генов, контролирующих синтез компонентов фотосистемы II у цианобактерии Synechocystls 6803 //Тезисы Международной конференции "Фотосинтез и фэтобиотехнологпя". Пущятю, 1991. С. 81.

29. Станбекова Г.Э., Ермакова С.Ю., Карбышева Е.А., Шахнабатян Л.Г., Еланская И.В., Шестаков C.B. молекулярно-генетический анализ дефэктннх по фотосинтезу мутантов цианобактерии Synechocystls 6803 // Биологические науки. 1992. H 4. С.

30. Шалак H.H., Еланская И.8., Фонштейн И.О. Физическая карта генома цианобактерии Synechocystls 6803 //Генетика. 1992. Т. 28, N 4. С. 46-52.

31. Вильчинскас Р.Л., Еланская И.В. Клонирование и экспрессия гена эндонлюканазы Clostridium thermocellum в клетках цианобактерии Anscystls nldulans Е2. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1Э92. N 11/12. С. 8-10.

32. Еланская И., Броун М., Гадашев А., Шестаков С. Молекулярный анализ генов фотосистемы II // Тезисы II Российского симпозиума "Новые метода биотехнологии растений". Пущино, 1993

C. 64.

33. Чемересюк H.H., Еланская И.В., Ананьев Е.В. Экспрессия гена В1 гордеина ячменя в гетерологичных.системах //Тезисы II Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений". Лупцшо, 1993. С. 9S.

34. Shestatov S., Chesnavichene Е., Bartcevlch V., Elanskaya I. Molecular characterization or genes controlling resistance to herbicides In the cyanobacterium Synechocystls 6803 // Abstr. Workshop "The use of Cyanobacteria to explore basic biological processes". Asilomar, USA, 1993. p. 86.

35. Ermakova.S, Yu., Elanskaya I.V., Rallies K.-U., Weihe A., Börner Т., Shestatov S.V. Cloning and sequencing of mutant psbB genes ol the cyanobacterium Synechocystls PCC 6803 // Photosynthesis research. 1993. V.37. P. 139-146.

36. Еланская И.В., Броун M.H., Гадаиев А.Г., Шестаков C.B. Мутационный анализ генов фотосистемы II у цианобактерии Synechocystls sp. 6803 // Генетика. 1993. Т. 29, К 10. С.1620-1629.

/