Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и изучение гена, контролирующего устойчивость к фенольным гербицидам у цианобактерий Synechocystis Sp. 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и изучение гена, контролирующего устойчивость к фенольным гербицидам у цианобактерий Synechocystis Sp. 6803"

i.M-2 9 2

россишия леслдвкя наук

институт онжй шшш им.пл1.влвшюва

lía npannx pyiramica удк: 5q2.232.7: 577.113 : 579,254: 632.954

чес11шгчеш эгле л1шш0вна.

гаоПНГОШЕПВ И ЮТЧНГНВ ГСПД, топпюлиротего устойчивость к еташаи ттагда- 7 1*!'ноб»к1ег;ш sïîechocïsïis sp. бшз.

03.00.15 - Генетика

л\вторс'г'1орчт диссортвщш на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва - 1092

Работа выполнена па кафедре генетики и селекции Биологическо факультета Московского государственного университета нмэ Ы.В.Ломоносова,

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН ПЕШКОВ С.В.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук А.А.Црозоров кандидат биологических наук В.Ы.Андриапов ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Инженерный центр "Еиошшенерия" РАН

Д3_ ^и-с^о- __ со

Защита состоится "-"-&- 1992 г. в - час

на заседании специализированного Ученого совета Д002.49.01 I Институте общей генетики ил. Н.И.Вавилова РАН (117809, ГСП-Ыосква, В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института обе генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан —'" —1дд2 г>

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук • Г.Н.Полухин;

Актуальность проблемы. В настоящее время при создана« новых гербицидных препаратов, применяемых в сельском хозяйстве, большое внимание уделяется вопросам токсикологической и экологической безопасности. В связи с эта;,!, особое значение приобретают исследования, направленные па выяснение природа мипенеП действия гербицидов в растительной клетке, на расшифровку молекулярных и генетических механизмов устойчивости к горбицидам, на "конструирование" гербицидов с заданным типом биологического действия. С другой стороны, гербициды, которые действуют в растительной клетке па определенную молекулярную мишень - ваяний инструмент при изучении механизма обмена веществ и гормональной регуляции метаболизма в растении. Поэтому, понимание молекулярного механизма действия гербицидов может быть чрезвычайно полезным при прогнозировании их биологической активности, а также при направленном ' создании резистентных к гербицидам сельскохозяйственных растений методами генной инженерии. Существенный вклад в разработку этих проблем вносит использование подходов л методов молекулярной генотшси, с помощью которых можно выделять и спалпсировать гены, ответственные за рези^ептность к разлпчши гербицидам, в том числе действующим и на аппарат фотосинтеза. Одпако, клонирование тагагс генов из растений яв-чется трудной задачей, требующей длительных и сложных экспериментов. Удобными в генетическом отношении объектами для решения таких задач могут служить цианобактерци, обладающие, как и растения, оксигеннш фотосинтезом. Более того, большинство" гербицидов, зшгибирупцих процессы и пути, свойственные только растениям '(фотосинтез, биосинтез хлорофилла, биосинтез незаменимых аминокислот), являются летальными соединрниями и для циапобактерий.

В работах, проведенных с цианобактериями, была изучена природа резистентности к диурону - гербициду класса зш. -щенных фешш.гачевин, ингибирующему активность фотосистемы II. Было установлено, что резистентность к диурону определяется мутациями в гене рзЪА, приводящими к утрате способности белка D1 фотосистема II связывать гербицид (Holden, Haselkorn, 1985; ИоЫпвоп et al., 1987; Gleiter et al., 1990).

К числу гербицидов - "неклассических" ингибиторов фотосинтеза относятся диносеб (6- (сек-бутил) -2, 4-дикит£офенол) и ДНОК (4,6-динитро-орто- крьзол), нитрофенолы соедипеш.блокирующие-

транспорт электронов и фотофосфорилирование. Сведения о природа мишеней действия фонольных гербицидов противоречивы, а механизмы развития резистентности растений к этим агентам не изучены.

У цианобактерии SyneohooyotiB 6803 были получены мутанты, устойчивые к даносебу и показана возможность передачи этого признака путем генетической трансформации (Кокварова, Шестаков, 1990). 3tq открывает возмоаности для клонирования гена, определяющего устойчивость цаанобактерий к данному классу гербицидов. Изучение этого гена и его продукта позволит получить ванную информацию о механизмах фитотоксического действия диносеба и расширит перспективы генно-инженерннх работ по созданию трансгенных сельскохозяйственных растений, устойчивых к гербицидам.

Цель работы. Работа посвящеп клонировании и изучению гена, определяющего устойчивость цианобактерии Syneohooystis 6803 к фенолышм гербицидам - даносебу и ДНОК. В задачу исследования входило:

1. Выделение гена, контролирующего устойчивость к фенолышм гербицида),1 из геномного банка резистентных мутантов цианобактерии.

2. Определение нуклеотидной последовательности этого гена.

3. Молекулярно-генетический анализ гена; локализация и идентификация мутаций, приводящих к развитию устойчивости к даносебу и ДНОК.

. 4. Изучение генетических и биохимических механизмов, обуславливающих устойчивость к фенолышм гербицидам у цишюбактерий. >

Научная новизна и практическая ценность работа. Выделен новый, ранее неизвестный гот drg, контролирующий. устойчивость цианобактерии SyneohooyBtie 6803 к даносебу и ДНОК -. гербицидам класса нитрофенолов. Определена нуклеотидная последовательность гена и его мутантшх копий; установлено, что ген ärg кодирует белок с молекулярной массой 23.7 кДа. Устойчивость мутантов , цианобактерии к даносебу и ДНОК обусловлена отсутствием активности этого белка. Таким образом, развитие резистентности к этим гербицидам отличается по своему молекулярному механизму от резистентности к гербицидам типа диурона, которые взаимодействуют с d1 балком фотосистемы II. Цолученные результаты по-новому освещают проблему действия на фотосинтезируюцие организмы гербицидов - ингибиторов фотосинтеза.

г

Клонированный ген может быть использован как зо,,д для выявления гомологичных генов у растений, в качества генетического маркера в векторах для цианобактерий и растений, а также для создания генно-инженерных конструкций с целью получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, применяемым в сельском хозяйстве.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярным мехшшзмам действия гербицидов, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и"списка цитируемой литературы. Работа изложена на'108 стр. машинописного текста и содержит 18 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 211 наименований.

Содержание работы

Материалы и метода t Штатам. В работе использовали бактериологически чиступ культуру Syneohooy3tio вр. рос 6803 из коллекции Пастеровского института (Франция). НГ-индуцированные устойчивые к днносебу мутанты Syneohooy3tis 6803 din2, Din7, Din9 получены на кафеле генетики и селекции МГУ 0.1 . Кокшаровой (Кокшарова, Шестаков, 1990); спонтанный мутант DinE4 отобран в данной работе. М„ганты обладали повышенной устойчивостью к фенольному гербициду дгагосебу (6-(сек-бутил)- 2,4-динитрофенолу) - до 0,1 мМ в плотной среде, до 0,07 мМ в жидкой среде, в то время как порог устойчивости к диносебу для штамма дикого типа - 0,007 мШ

В работе использованы штаммы Е. ooli NH522 и Р678-54 из коллезсции кафедры генетики и селекции МГУ. Плазмиды, использованные в работе, представлены в таблице

Культуру Syneohooystio 6803 выращивали в модифицированной среде "С" (Столетов и др., 1965) в ллминостате при 30°С и 2000 л . Для выращивания DlnR мутантов в среду добавляли селективные» агенты в концентрациях: диносеб - 0,06 мМ; ДНОК - 0,1 Ш; метронидазол -0,02 мМ. Инсерциошше и делеционные мутанты Syneohooystis 6803., содержащие ген устойчивости к канамивдну, выращивали в присутствии 30 мкг/мл канамицина.

Клетки E.ooii выращивали в среде LB (Миллер, 1576). Антибиотики добавляли в концентрациях: ампициллин - 50 мкг/мл, канамицин - 50 тг/ш хлорамфеникол - РП мкг/ил.

Таблица I. Плазмидо, использованные в работе

Плазмиды Описание Ссылка

РКК22Э-3 PÜ0I9 рИС4К M13tg130 M13tg131 pDin2*,pDin7Í pDin9*,pDinE4* PWT6803* ApR, toa, 4,585 т.п.н. ApR , 2,686 Т.П.П. ApR, KinR 4,1 т.п.н. 7,265 т.п.н. 7,265 Т.П.Н. ApR, производные pU0l9, содержат 4,7 т.п.н. Hindlll фрагмент хромосомной ДНК соответствующих мутантов ApR, производная рИ019, содержит 4,7 т.п. . Hindlll фрагмент хромосомной ДНК штамма дикого типа Brosius, 1984 Vieira, Messing, 1982 Vieira, Hessing, 1982 Kieng et al., 1983 Kieng et al., 1983 Настоящая работа Настоящая работа

» - производные данных илазмид описаны в тексте.

Трансформацию цианобактерий проводили по стандартной методике (Grigorieva, Shestakov, 1982). При трансформации на устойчивость к гербицидам стерильные нитроцеллюлозные фильтры ("Millipore" НА, 0,45 мкм) раскладывали на чашку, содержащую агаризованную среду "С". На каждый фильтр наносили по 50 мкл культуры компетентных клеток, плотностью 4x10s клеток/мл, и донорную ДНК в концентрации 1-3 мкг на фильтр. Чашку инкубировали 18-20 часов на свету, затем фильтры переносили на чашку с агаризованной средой "С", содержащей гербициды в селектив: х концентрациях. Чашки, помещали в лшиностат, колонии'трансформантов появлялись через 7 суток.

Хромосомную ДНК Syneohooystie 6803 выделяли по описанной методике с модификациями (Van den Hondel, 1980).

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli, трансформацию клеток E.ooli, а также электрофорез ДНК в горизонтальном » агарозном геле проводили по стандартным методикам (Ыаниатвс и др., 1984). ДНК из агарозных гелей елюировали по описанной методике .(Zhu et al.,1985; Дрейпер и др., 1991).

Перенос ДШ с вгврозных гелей на нейлоновые Зильтры ("Sigma", oharge modified) осуществляли по«Саузерну (Маниатис и др., 1984). ДНК-зонд метили методом статистической гексануклеотидной затравки

при помощи больного фрагмента ДНК голимеразы I (фрагмента Кракова) (Weinberg, Vogelstein, 1984). ДНК-ДНК гибридизацию и гибридизацию in situ бактериальных колоний на нитроцеллюлозных фильтрах ("Millipore" НА,. 0,45 мкм) проводили по стандартной методике (Мшшатис п др., 1984). В качестве гибридизационных зондов для идентификации гонов фотосинтеза па фрагментах ДНК Syneohooystis 6803 использовали клонированные гоны цианобактерий, водорослей и растений, контролирующие скптоз котгопентов ФС1 и ФСП (табл. 2) пз коллекции кафедры генетики и селекции МГУ.

Таблица 2. Клонированные гены CCI и ФОН.

Ген Источник Фрагмент

Фотосистема II

pab AI Syneohooystis вр.РСО 6714 2,0 т.п.н. HindlII-EooRI

psö 3 Syneohooystis sp.PCC 6803 2,6 т.п.н. HindIII-ВалЯП

рзЪ CD Syncchooystia вр.РСО 6803 1,6 T.U.U. HindlII-Xbal

рзЪ ЕР Synechooyotic вр.РСО 6803 2,2 т.п.п. HindIII- ¿ooRI

рзЪ G Syneohooystis зр.РСО 6803 1,8 т.п.н. HindIII-Smal

рзЪ H Syneohooystis ер.PCO o803 0,18 т.п.н Xhol-Sall

pab.I рожь (SecalQ sp. ) 0,6 т.п.н. BamHI

рзЬ К Syneohooystis вр.РСО 6803 2,6 т.п.н. HindlII-EooRI

рзЪ 0 Syneohooystis sp.PCO 6803 0,94 т.п.п Dral-Xbal

Фотосистема I : а

рза А Chlamydomonan reinhardii 6,5 т.п.н. EooRI

рза В +

гЬо Ъ Chlamydomonas reinhardii 5,8 т.п.п. EooRI

рза С Chlcaydomonas reinhardii 1,0 т.п.н. EooRI

Для определения первичной нуклеотидной последовательности необходимый фрагмент ДНК клонировали в составе фаговых векторов MI3 серии tg. Реакции секввнирования проводили методом терминирования синтеза цепи на одноцепочечной ДНК - матрице в присутствии дидезоксину.леотидов (Sanger et al., 1977, Tabor et al., 1987).

Получение мини-клеток штамма E.coli Р678-54 и трансляцию продуктов, кодируемых лазмидой, проводили по стандартной методике (Хеймс, Хиггинс, 1987). Электрофорез ^ ПААГ-ДСН проводили по

методике, описанной ранее (Harnes, 1981).

Активность фиксации С02 измеряли по включению радиоактивной метки из NaH14C03 клетк&чи, выращенными на свету в присутствии или в отсутствии гербицидов. Измерение .светозависимого выделения и поглощения кислорода проводили при помощи электрода Кларка на полярографе LP-7 при тешературе 25°С. Фотоиндуцировашше изменения быстрой флуоресценции хлорофилла а (переменную флуоресценцию) измеряли при помощи доухлучевого флуоримотра то методу Лядского и др. (1987).

Для хроматографического анализа 3-4 суточпую культуру зслеток дикого пша и мутанта Din2/Ins2, содержащего пнсорцию в гене drg, сгущали до плотности 5хЮ9 клеток/мл и шшубировали в присутствии дшюсеба или ДНОК (концентрация'гербицидов -100 ыкМ) в течение 48 часов в люминостате. Клетки осаждали центрифугированием, а культуральную жидкость упаривали п;л помощи вакуумного испарителя. Осадок ресуспендировали в 20 шел метанола и наносили на пластинки для тонкослойной хроматографии ("Silufol", Чехословакия). В качестве подвижной фазы использовали смесь бутанол:вода:метанол (4:2:2). Хроматограмму высушивали и фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Результаты и обсуждение

I. Клонирование и цолекулярно-генетический анализ гена, контррлирупцего устойчивость к диносебу у ' цианобактерин SynechocyBtlB 6803.

I.I. Клонирование фрагмента хромосошюй ДНК DlnR мутанта Synechocyotio 6803, опре/ ишцего устойчивость к диносебу. При клонировании фрагмента ДНК, определяющего устойчивость к диносебу, была применена стратегия "обогащенной полосы". Хромосомную ДНК мутантов din2, Din7, Din9, DinE4 обрабатывали эцдонуклеазами рестрикции Hindin, E00RI и Xbai до полного гидролиза. Продукты рестрикции фракционировали в 0.6& геле легкоплавкой агарозы, вырезали полосы геля, содержащие фрагменты ДНК размером 9-20 т.п.н, 6-9 т.п.н., 4-6 т.п.н. и 2-4 т.п.н., плавили их при 70°С и использовали в опытах по трансформации клеток штамма дикого типа SyneohooyatiB 6803. Максимальной эффективностью трансформации клеток штамма дикого типа по признаку устойчивости к диносебу (2-6 X Ю-6 на клетку) обладали HlncLIII фрагменты размером 4-6 т.п.н.,

б

и EooRI и Xbal фрагменты размером 9-20 т.п.п., незави^лмо от штамма-донора ДНК.

HindIII фрагменты хромосомной ДНК мутанта Ып7 величиной 4-G т.п.н. использовали для конструирования мини-банка ДНК на основе плазмиды püci9 и клонирования гена, определящего устой-лвость к диносебу. Было отобрало 600 клонов Е. ooli, содержащих рекомбинантныэ плазмиды с хромосомной ДНК мутанта Din7. В опытах по трансформащш цианобактерии па устойчивость к диносебу из банка ДНК была выявлена плазмида pDin7, содержащая 4,7 т.п.н. Hindin фрагмент хромосомной ДНК мутанта Din7 и трансформирующая штамм дикого типа Syneohooystio 6803 на устойчивость к дгаюсобу. Рестрикцнопная карта nindlll фрагмента приведена на рис. I.

Для более точной локализации мутации, определяющей устойчивость к диносебу, был получен ряд производных плазмиды pDln7 (рис. I) п изучена их способность трансформировать клетки штамма дикого Tima Synechooystis 6803 по признаку устойчивости. На основании полученпых • результатов мутация, определяющая устойчивость к диносебу в штамма Dln7, была локализована на 1,2 т.п.н. Hindlll-BglU фрагменте плазмиды pBHS(Din7) (Рк . I).

1.2.Клонирование фрагментов ДНК, гоиолопгшых плазшде pDü./, из xpouocouu птамш дикого .кпа и Din11 мутсптов Synechocyotio 6803. Хромосомную ДНК мутантов Din2, Din9, DinE4 и штамма дикого типа Synechooystis 6803 обрабатывали рестриктазой Hindin до голпого гидролиза. Рестрикциошше фрагменты ДЕПС разделяли элоктрофоретически в агарозном геле и элюироввли зоны, примерно соответствуем по размеру 4,7 т.п.н. Для Каждого штамма - донора ДНК были сконструированы мини-банки (200-300 клонов) элюпрованпой ДНК на основе векторной плазмиды puci9. HindllX-BglIX фрагмент (1,2 т.п.н.) из плазмиды pDin7 использовали в качестве зонда для скрининга полученных мини-банков методом гибридизации колоний In situ. Из колоний, дающих положительный гибридизационннй -игнал, были изолированы плазмиды, гомологичные pDin7. Рекомбинантные плазмиды, содержащие гомологичные pDin7 фрагменты хромосомной ДНК DinR мутантов и хромосошюй ДНК штамма дикого типа, полностью совпадали по рестрикционной карте с плазмидой pDin7. Плазмида pDin2, pDin9, pDinE4, содержащие фрагменты ДНК соответствующих мутантов, трансформировали клетки штамма дикого типа SynechooyBtis 6803 на устойчивость к диносебу. Плазмида ,pWT6803, содержащая гомологичный фрагмент хромосомы штамма /""<ого 'типа не обладала

!

i

pDln7

Din

BI

Hill

1=

SI SI Bgll SI

II I I

SI Pel BI

J__L

1.0

2.0

3.0

Hill

4.0 4.7

Din"

Din

Din0

pBHS(Dln7)

Hill Bgll . I_

pSma(Dln7) SI SI

Bgll

pBHL(DlnT)

HIII

HIII

Din"

Bgll

1.2 т.П.н.

Рис. I. Рестрикционная карга фрагмента ДНК мутанта Din7. клонированного в составе плазмида pDin7 и локализация мутации, определяющей устойчивость к диносеОу.

Сокращения: BI. - Вь-Ш, Bgll - Bglll, HIII - HlndlII, Рв1 -Petl, SI - Smal. DlnR - устойчивость к диносебу, Dlns -чувствительность к диносебу.

способностью трансформировать клетки штамма дикого типа на устойчивость к атому гербициду.

1.3. Картирование мутаций, приводящих к устойчивости к диносебу на плазиидах р£Н8(01п7), рВНЗ(Лп9), р£Н8(01п2). В целях более точного картирования мутации, приводящей к устойчивости к диносебу; из ь..азмиды рВШСМпу) был получен ряд делеционных производных, которые проверяли на способность трансформировать клетки штамма дикого типа по признаку устойчивости к диносебу.

pBHS(Dln7)

Din

HII

Hill

HII BI I SI

SI

Bgll

I

Din"

Din"

0.5

m pHlnc 011

L

ПШ pBH(DlnT) SI

1.0 1.2

Din

BI

pBB(Dln7)

Bgll

Din0

Din

SI

pSS1

SI

A

Bgll

mn

Din

SI

470 П.П.

Рис. 2. Локализация мутации устойчивости к диносебу на 470 н.н. фрагмента нлазмида pBH(Din7).

Сокращения: BI - Валй1, Bgll - Bglll, Hill - HindIII, НИ -HlncII, SI - Smal. DlnR -устойчивость к диносебу, Din" -чувствительность к диносебу.

Производные плазмиды и результаты трансформации приведены на рис. 2, из которого видно, что мутация локализована в Н1п(1111-5та1 фрагменте плазмиды рВН(Б1п7), величиной 470 щр нуклеотидов.

Аналогичные деле; .онные производныр %ли получ( ы для плазмид рМп2 и р01п9. В случае плазмиды рБ1п9, мутация, ' определящая

■ . I

I

устойчивость мутанта Diñ9 к диносебу, била картирована на HindlII-Smal фрагменте плазмида pBH(Din9) длиной 470 п.н., а в случае плазмида pDin2, мутация была локализована на BamHi-BglII фрагменте плазмида pBB(Din2) длиной 870 п.н.

1.4. Гибридизация фрагмента ДНК. определяющего устойчивость к диносебу, с клонированными генами фотосинтеза. В целях идентификации генов на клонированных из клеток DinR мутантов фрагментах ДНК, были проведены эксперименты по блот - гибридизации этих фрагментов с известными генами, контролируицими синтез белков фотосистем I и II. Список клонированных • генов SCI и ФСИ,

- использованных в опытах по блот - гибридизации, приведен в таблице 2. В качестве гибридизационного зонда р опытах использовали 1,2 т.п.н. Hindlil-Bglll фрагмент хромосомы мутанта Din7 из плазмида pBHS(Din7). Было показано, что Hindlil-Bglll фрагмент плазмида pBHS(Dln7) не гибридизуется ни с одним из проверенных генов фотосинтеза.

1.5. Делеционный анализ Oparueirra ДНК, определяющего устойчивость к диносебу. С целью выявления функции продукта гена, определяющего устойчивость к гербициду, а так же для определения границ гена, был проведен делеционный и инсерционный анализ плазмид pWTÉ803 и рМл7. Путем встраивания кассеты устойчивости к канамицину (KmR) из плазмида pUC4K в различные участки цианобактериальной ДНК в составе плазмид pBHS(WT6803) и pBHS(Din7), было получено по несколько делеционных и инсерциошшх производных этих плазмид (рис. 3). Делеционшми и инсерционными вариантами плазмид pBHS(WT6803) и pBHS(Din7), несущими маркер kmR, трансформировали клетки штамма дикого типа Syneohooystie 6803 по признаку устойчивости к анамицину. Даже при длительных пассажах Кшн-трансформантов на все более увеличивающиеся концентрации канамицина (до 60 мкг/мл) они сохраняли способность к росту на минимальной среде в фотоввтотрофных условиях, т.е. инсерции и делеции не затрагивают reim, ответственные за фотосинтез и другие функции, жизненно важные для цианобактерий.

Делеции Hinoll фрагмента размером 342 п.н. (Dell) и Smal фрагмента размером 250 п.н. (Deia), а также инсерция KmR- кассеты в сайт BamHI (Ins 2), независимо от того, были ли они получены на плазмидах, содержащих хромосомную ДНК дикого типа или DinR мут0нта, приводили к образованию устойчивых к диносебу трансформантов (рис. 3). Это позволяет предполагать, что признак

А.

W1

Ins 1 raí

sj39a

mu;

i * Bi!

i

Km"

Km

SI

Del 1

Del 2

Ins 3

T

Egll

0.5 т.п.н.

1.0 1.2

Б.

Производные плаз ?.шд pBIIS (WT6803) И pBIIS (pDin7) Фенотип трансформантов

Ins 1 Ins 2 Ins 3 Del 1 Del 2 KmR , Dlns Km11 , DlnR KmR , DlnS Km? , DlnR Em1* , DinR

Рис. 3. Делеционные и инсерционные производила ллазшд . pBHS(Dln7) и pBHS(WT6803) (А) и фенотипы трансформактсв ßyneohocystis 6803 (Б).

Сокращения: BI - BamHI, Bgll - BglII, HUI - HindlII, НИ -HincII, SI - Smal.Ins 1, Ins 2 - инсерции, Del 1, Del 2 - делеции.

р

Din обусловлен инактивацией исследуемого гена и, следовательно, все анализируемые нами мутации, обуславливающие устойчивость к диносебу, приводят к образованию функционально неактивного белка -продукта данного гена. По результатам делеционного анализа

определены условные границы Din11 гена, который находится в 1,2 т.п.н. Hindiii-Bgili участке ДНК хромосомы Synoohooyatio 6803 в составе плазмида рта(6803). ! '

1.6. Секвенирование цутантшх копий гена,, определяющего устойчивость цианобактерии Synechocyotis 6803 к даносебу. Определена последовательность'нуклеотидов Hindlll-Bgill фрагмента длиной 1,2 т.п.н.' из плазмиды pBHS(WT6803), содержащей Dínn локус хромосомной ДНК штамма дикого типа, а также последовательность нуклеотидов Hindlll-Smal фрагментов, размером 470 п.н., из влазмид рвн(Din7), pBH(Din9), содергющих мутантныэ участки хромосомной ДНК соответствующих Din-мутантов.

В установленной последовательности обнаружена одна открытая рамка считывания 0rp210, длиной 630 п.н., кодирующая полипептид размером 210 аминокислотных остатков. Границы 0HF210 согласуются с данными делеционного анализа. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов из клеток DinR мутантов и штамма дикого типа показал, что все мутации находятся в пределах 0RP210 и являются мутациями типа замены нуклеотида. У мутанта Din7 обнаружена трансверсия Т -» А в 45 кодоне, приводящая к ваменв лойцина-45,в штамме дикого типа на гистидин-45 в мутанте, а у мутанта Din9 обнаружена транзиция А -» Г в 7 кодоне, приводящая к замене изолейцина-7 на валин-7 (Рис. 4 ).

Перед кодирующей частью 0RF210 обнаружены последовательности, хорошо соответствующие консенсус - последовательностям промоторов, характерных для цианобактерий (см. таблицу 3} (Bryant, честное сообщение).

Таблица 3. Сравнение промоторой области 0rp210 с консенсус -последовательностями промоторов, характерных для цианобактерий.

Консенсус - промотор 5'таОТАА N16 ТАТСАТ N12 9 3 ATO

Промотор 0KF210 5 ТТСТСС N16 ТАТСАТ N12 9 3 ATO

i ■ или

5 ТСОТАА N12 TATCAT-N13 3 ATG

Ген 0R7210, мутации в котором определяют резистентность к д>шособу\ бил обозначен drg (dinoseb resiatanoe gene).

pBHS(WT6803)

HII . HII

HIII| BI I SI SI

SI

Bgll

Dln9 Dln7

та ОАО GOT ATT TAO CAA 5 Aap Ala Ile Туг Gin 9

та ato caá ста tgg cga 43 Ile Gin Leu íYp Arg 47

dtn9 оао got GTT tac caa din7 атс caa cat tgg cga

5 Лар illa Val Tyr Gin 9 43 Ile Gin His Trp Arg 47

Рис. 4. Нутации, определяющие устойчивость к дгаюсебу у мутантов Din7 и Din9.

Сокращения: BI - ВалЩ, Bgll - BglII, HIH - HindIIIr HII -HlncII, SI - Smal. Dln7, Din9 - DinR мутанты, ОТ! - штамм дикого типа Synechooystis 6803.

1.7. Коипыггерный анализ нуклеотпдкой последовательности гена drg. Нуклеотидную последовательность 0KF210 сравнивали' с Санками данных GenBank R 62.0 И SiBL 21.0 Nucleotide Sequence Data Bank (март 1991 года). Анализ проводили при помощи пакета' программ dnasis, версия 6.0. В ходе этого сравнения существенной гомологии между известными последовательностями и последовательностью 0RF21O обнаружено не было. По-видимому, ген drg является новым, ранее не клонированным геном. Нуклеотидная последовательность гена ärg и предсказанная по ней аминокислотная последовательность продукта этого гена приведет на рис. 5. По данным компьютерного анализа, ген ärg может кодировать белок с молекулярной массой 23,703 кДа.'

1.8. Трансляция продукта гена ürg в шшихлетках E.coli. Для исследования экспрессии гена fir g в E.coli, H in dl 11 фрагмент величиной 4,7 т.п.и. из плазмида ритб803,- клонировали в составе

. 123 GAGTTCTCTTCTCCTAATCATTTTCCTAGCTATCATTOCTAAXiCACTATGQACACCTTT 182

Ii D T F 4

183 GACGCTATTTACCAACGGCGATGCGTTAAGCATTTTGACCCTGACCATCGTTTAACGGCO 242 5DAIYQRRSVKHFDPDHRLTA 24

243 GAAGAAGAAAGAAAGTTGCACGAAGCGGCCATOCAAGOTCCOACÎACTTTTAACATOCAA 302 25EEERKLHEAAIQAPT SFNIQ 44

303 CTTTGCCGATTCTTGATCATTCGGGATCCCCAACTGCGGCAAACCATCCGGOAAAAATAT 362 45 LWR.P L X I RDP QbRQT I R E К Y 64

363 GGCAATCAGGCCCAAATGACCGACGCTTCCCTGTTAATTTTGGTAGCOGCGGATGTTAAO 422 65GNQAQMTDASLI.ILYAADVW 84

423 GCXTGGGATAAAGACOCCGCCCGTTACTGGCGCAATGCCCCCCGGGAAGTGGCOAATTAT 482 85AWDKDPARYWRNA P REYANY 104

483 CTTGTTCCGGCGATCGCCTCTTTCTATGGTGGCAAACCACAGTTGCAACGGGATGAAGCC 542 105 LVGAIASFYGGKPQIiQRDEA 124

543 CAACGGTCCATTGGCATGGCCATGCAAAATTTGATGTTGGCGGCOAAGGCCATGCGOTAT 602 125 Q R S I G MA M QNLULAAKAIÎO Y 144

603 GATAGCTGTCCCATGATCGGCTTTGACCTCCAAAAGGTAGCOOAGTTGGTCAAATTACCC 662 145 D S С P It I GP DLQKVAELYKLP 164

663 CCTCACTATCCCATÏGGCCCCATGGTGCCCATCGGTAAACGCACCCAAOATGCCCCCGGC 722 165ADYAIGPMVAIGKRTEDA PG184

723 AAAAGGCGGTCAAACTCCCCTGGAAGAAMCCTOTCGGAAAACTCOTMGCCTAACTAAO 782 185 К R R S К S P G R I P L G К L L С L T К 204

783 GTTTGGTGTTTAGCAATTTAGTGTTGAGTGGCTAATTGCTGAACCCGCTCCGACTCCCAT 842 205 V У/ С L A I

Рис. 5. Нуклеотидь^л и аминокислотная последовательности гена ûrg. Предполагаемая промоторная область подчеркнута.

вс-ктора экспрессии рКК223-3 таким образом, чтобы транскрипция ORF210 (clrg) происходила с tac-промотора вектора, и исследовали продукты, кодируемые данным фрагментом ДНК, в системе мини-клеток е.coli. При трансляции клонированного фрагмента ДНК, образуется Солок с молоку. .ярной массой около 23 кДа, что соответствует молекулярной массе белка, кодируемого геном arg, предсказанной по нукхоотаднсЯ последовательности этого гена.

1.9. Гибридиз'*ия гена drg с ДНК высших растений. Koi/J отэршй анализ последовательности гена drg не выявил гомологии с хлоропластной ДНК и известными генами растений. С

И

целью поиска в' геноме высших растений гена, гомологичного úrg, Онла проведена блот-гибридизация Hindill-Egill фрагмента плазмиды pBIIS (Dln7) С ДНК уссурийской груши (?yrum sp.) и томата (Lycopersicun sp.). Тотальные препараты ДНК Рутил sp. :: Ьуоорегз1оип зр. расщепляли рестриктазами Hindlll, Ба.тЛ1 или SooRl и фракционировали в агарозном геле. В качестве гибрпдизанионного зонда использовали Hindlll-Bglll фрагмент плазмиды pBKS(Din7) размером 1,2 т.п.п. В гибридизационных экспериментах исследуемый Фрагмент давал положительные сигналы с тотальной ДИК уссур;Жской груши и тсмата. Тагам образом, фрагмент ДНК Syncchooystis бзсз, несущий гон úrg, имеет гомологи» с ДШС растений. Так как компьютерный анализ не' выявил гомологии гена, drg с хлоропласткым геномом, пдлная пуклеотидная последовательность которого ужо известна, можно предположить, что ген úrg имеет гомологии с последовательностями ядерной ДШС высших растения.

2. Исследование роли продукта гена drg в метаболизме цпапобактерил Synechocyntic 6803.

2.1. Перекрестная устойчивость Din1* мутантов к друтни гербицида» н нпгнбитораы. Eco DinR мутанты ке же ли перекрестной устойчивости к ингибитору фотосистем! II, гербициду класса замещенных фенилмочевпп, дкурсну (3-(3,4-дихлорофенил)-1,1-диметилмочевш1в). Помимо устойчивости к диносебу, eco Dinp" мутанты обладали устойчивостью к другому гербициду класса нитрофенолов, ДНОК (4,6 - дннитро-орто-крозолу) - до 0,25 ).-:,! в плотной среде, до 0,15 г,i! в жидкой среде, и к клеточному ингибитору класса кмздазолов, мзтрсплдазолу (2-метпл- 5-нитро-1-пмэдазолэтанолу) - до 0,2 м.'.Г в плотной среде, до 0,1 мМ в жидкой среде. Порога устойчивости птамма дикого типа для ДКОК - 0,01 мМ к 0,001 мМ - для метронидазола-.- В' опытах по трансформации было показано, что плазмиды pDinT,. pBHS'(Din7), pBH(Din7), передающие признак устойчивости к дштосебу,. трансформируют клетки штамма дикого типа на- устойчивость к ДНОК к мзтрозмдазолу. Все делеции и инсерции в гене^ tírg также приводили- к множественной перекрестной устойчивости к- диносебу,. ДНОК я? метронидазолу. Более того, В.Барцевичем- (каф.,генетики (.ТУ) было-показано,- что устойчивость к метронидазолу пезависшо полученных MdR мутантов цпаноС2ктор:м ЗупесЬоеузМз. 6803 тоже* определяется* мутациями в гене árg. Следовательно-,, резистентность- к всем трем" агентам у циансбактерии Synechooystís 6803 определяется' одним и тем же геном.

ТЦ

2.2. Исследование влияния диносеба, ДНОК н иетронвдязола па клетки ir/тантов' и дикого типа Synechocystis 6803. С целью выявления возможного участия продукта гена ürg в процессах фотосинтеза, измеряли фотоиндуццрованное выделение кислорода в реакции Хиллз, характеризующее активность <3X311, и' снижали спектры переменной флуоресценции хлорофилла а клеток птамма дшеого типа, мутантов Din2, Din7 и мутанта Dín2/lns2, содержащего инактивированный • инсерцей ген tírg. Показано, что спектральные характеристики мутантов и мнеерциовного мутанта незначительно отличаются от дикого типа, и что все мутанты-обладают активностью фотосистемы II.

Дойствие гербицидов, мишенью которых являются . белки, определяющие фотосинтез, можно выявить при высева йлеток штамма дикого типа на среды, содержащие глюкозу и гербицид. Гербицида, ипгибирувдие фон, не оказывают' токсического воздействия ва метки штамма дикого типа в условиях фотогетеротрофаого роста в. присутствии глюкозы (Ashton et al., 1987). Мутанты Din2, Din7, Din9, штамм дикого типа Syneohooystib 6803, а также мутант SK4, дефектный по фотосистема II (отсутствует белок СР47, продукт гена рзЬВ (Erraakova ot al, 1992)), Еысевали на среды, содержащие диносеб, ДНОК или метронидазол и глюкозу, а так ка на среды, содержало доносвб, ДНОК или метронидазол и ряд соединений, являющихся потенциальными источниками углерода в условиях фотосинтеза. Результаты представлены в таблице Б, из которой видно, что клетки дикого типа и мутанта SK4 не способны расти на глюкоз« в присутствии гербицидов, то есть, мишенью для диносеба, ДНОК и метрснидазо;1:.. в пределах исследуемых концентраций этих соединений, является не только фотосистема II. Однако, штамм дикого типа растет в присутствии диносеба или ДНОК на средах, содержащих ацетат, малат, оксало-ацетат, глиоксилат или фумарат. Снятие токсического действия диносеба добавлением ряда соединений, участвующих в цикла трикарбоновых кислот, позволяет полагать, что диносеб может влиять на метаболизм углерода в клетке.

Исследовано влияние диносеба на ассимиляцию 14С02 клетками штамма ди::ого типа и мутанта Din2. Для предотвращения гибели ;u".6tok штамма дикого типа, в одной серии опытов в среду добавляли малат. Било показано, что диносеб в течение нескольких минут почти полностью подавл. т ассимиляцию 14С02 клетками дикого типа, как в присутствии, так и в отсутствии малата, и незначительно подавляет

ТА

Таблица 5. Рост клеток мутантов и штамма »кого типа БупесЪ.ооуз'Ыв 6803 в присутствии гербицидов и разных источников углерода (+ : рост, - : отсутствие роста, +- : слабый рост).

Источник - гербицид + доносеб + метронидазол

углерода дикий Din2 SK4 дикий Din2 SK4 дикий Din2 SK4

тип тип тип

Без источника + + - - + - - + -

углерода

Глюкоза + + + + - - + -

Пируват + + - - + - - + -

Ацетат + + - + + - - + -

Оксало- + + - + + - - + -

ацетат

Малат + + - + + - - + -

Глиоксилат + + - +- + - - + -

Фумарат + + - +- + - - + -

Сукщшат + + - - + - - + -

ассимиляция углекислоты в клетках мутанта Din2 (см. рис. 7). Следовательно, диносеб и ДНОК могут влиять на какие - то этапы ассимиляции С02 в клетках Synechooystis 6803.

2.3. Бозиохшй иеханизи развития множественной устойчивости циапобактернл Synechocystio 6803 к диносебу, ДНОК и иетрокидазолу. В ряде работ приводятся данные о том, что нельзя получить трансформантов Synechooystis 6803 по рецессивным признакам в первом поколении, так как в клетке всегда присутствует несколько доминантных копий генов дикого типа. Это подтверждают опыты по конструированию илсерционных мутантов, дефектных по гонам фотосистемы II, гену, кодирующему большую суъединицу RuBisCo, и гесА гену (Williams, 1988; Murphy et al., 1990; Pierce et al.', 1989). Во всех случаях после трансформации получение клоны с кп? инсерцией обладали фенотипом дикого типа. Только длительные пассажи в условиях, не требующих активности белков - продуктов инактивируемых генов, приводили к проявлению рецессивного фенотипа в случае, если потеря копии гена дикого типа не была детальна для клеток. Поскольку по нашим данным признак t>inR проявляется при -

г, гшп

Рис. 7. Фиксация 14С02 клетками штамма дикого типа и мутанта Мп2. Л: бе: добавления малата; Б: в присутствли малата. ▼ -клетки штамма дикого типа, I - клетки мутанта Б1п2. Черные фигуры - без добавления диносеба, белые фигуры - в присутствии диносеба.

ТЧ

инактивации гена с&*£, и ген <2гд представлен в генома БупесЬооуз^£з бзоз единственной копией, можно предположить,, что трансформация клеток дикого типа на устойчивость к диносеоу может происходить по рецессивному признаку. Для того, чтобы проявилась устойчивость к диноссбу, продукт гена вг& должен отсутствовать или быть неактивным, то ость, в клетка по должны присутствовать немутантнко копия гена с!г%. Возникает вопрос, каким. образом происходит трансформация клеток итамла дикого типа по этому признаку.

Опыта по гибридизации фрагмента ДНК, содержащего ген. с хромосомной ДНК птамиа дикого типа и с хромосомной ДНК Кпй трансформаций, ■ содержатся ннсэрцию в Валнх сайте гена ¿"я, показали, что в хромосомой ДНК инсерционных мутантов имеется только инсерцией инактивированный Эти данные, допускают

возможность трансформации клеток ЗупеоЬооуз-Ыз 6803 по рецессивному признаку и получение устойчивых к диносебу трансформантов.

Ввиду того, что множественная устойчивость к дкносеСу, ДЫОК и метронидазолу определяется отсутствие!,! активного продукта гена clrgt возможно , что эти соединения являются субстратами, для белка, кодируемого геном бrg, и метаболизируются при помощи этого бежа до соединений, токсичных для клетки. В пользу этой гипотезы есть несколько доводов. Во - первых, нет сведений о возможной природе мишени для метролидазола, видимо кетронидазол ингибирует в> клетке другие процессы, чем диносеб и ДНОК. Во - вторых, диносэб и ДНОК, по всей видимости, ингибпруют пути ассимиляции углекислоты, ферменты которых необходимы для обеспечения жизнедеятельности клетки. Поэтому, маловероятно, что устойчивость к гербициду могла бы определяться отсутствием фермента - мишени, не приводя при зтем к возникновению ауксотрофпости или летали. В - третьих,- такая гипотеза хорошо бы объяснила противоречия в биохЕДгческих дешшх о молекулярном механизме действия феполькых гербицидов.-

Чтобы выяснить, модифицируются ли деносеб и ДКСК клетками штамма дикого типа БупесЬооузИз 6803, была проведена- тонкослойна^, хроматография культуральных жидкостей клеток штамма спсого типа-и мутанта Мпг/Ьгег,-инкубированных в присутствий дашосеба пли ДНОК-. Было показано, что в культуральной жидкости клеток втаммз дикого типа появляется дополнительное соединение, з то время как хроматограммы гербицида, инкубированного в среда баз- клеток- и культуральная жидкость клеток янсбрцконного мутанта с'

гнактизированным геном órg но отличаются друг от друга'.

Следовательно, в штамме дикого типа диносеб и ДНОК подвергаются

модификации .под воздействием продукта гена úrg, образующиеся метаболиты могут быть токсичными для клетки.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован фрагмент хромосомной ДНК цианобактерии SyncchocyQtis*6303, трансформирующий клетки ттачпла дикого, типа к устойчивости к двум гербицидам класса нитрофзнолов. .

2. в составе фрагмента идентифицирован новый,1. ранее неизвестный гак drg, определяющий множественную устойчивость DinR мутантов цианобактерии SynaohooystiB 6303 к нитрофонольныы гербицидам диносебу, ДНОК и ингибитору мэтронидазолу.

3. Определена нуклэотидная последовательность йrg гона из хромосомы штамма дикого ттта.

4. Катодом молекулярно-гепетичзшсого анализа локализованы мутации, .определяющие устойчивость К гербицидам. Клонированы и соквонированы фрагменты drg некоторых DinR мутантов, определена молекулярная природа генетических повроадэний.

5. Резистентность Synechocystis 6803 к ДШЮСебу и ДНОК обусловлена отсутствием активного белка - продукта гена úrg.

6. Ген úrg имеет гомологию с ДНК высших растений и представлен в геноме Synoohocystis 6803 единственной копией.

7. ;,!ишенью для дикособа является ие только фотосистема II. Показано, что дкносеб подавляет ассимиляцию [14С023 в мотках итак,и дикого типа r„-nechocystis 6803 и незначительно влияет на поглощение [14со2] в клетках dínr мутантов.

3. Предложен возможный механизм развития устойчивости к диносебу, ДНОК и матронидазолу. В клетках штамма дикого типа диносеб и ДНОК подвергаются модификации под воздействием продукта гена drg; по- видимому, образующиеся метаболиты токсичны для клетки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Чеснавичене Э.А., Еланская И.В. Выделение фрагмента хромосомной ДНК, определяющего устойчивость цианобактерии s.vnechocystís 6f¿jGj к диносебу.- Материалы vn Всесоюзного С;;'.й[юзюма "Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва,

1990, стр. 129.

2. Еланская И.В., Ермакова C.D., Станбекова Г.Е., Гаджиев А.Г., Броун М.Н., Карбышева Е.А., Шахнабатян Л.Г., Чеснавичене Э.Д., Еэ стаков С.В. ■ Молекулярно - генетический анализ генов кнотролируюцпх синтез , компонентов OCII в цианобактории Syneohooystis 6803.- Материалы мевдународной конференции "Фотосинтез п фотобиотэхнология", Пущино, 1991, стр. 81.

3. Elanskaya I., Cheenaviohiene. Е., Shestakov S. "Cloning of the gene involved in resistance to phenolio herbioide dinoseb in the oyanobaoterium Syneohooystis PCC 6803".- In: Abstr. VII Int. Synp. on Photosynthetio -Prokaryotes, Amherst, Massachusetts, USA,

1991, p. I9A.