Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физическое картирование генома цианобактерии Synechocystus sp. PCC 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Физическое картирование генома цианобактерии Synechocystus sp. PCC 6803"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ АН БЕЛАРУСИ

На правах рукописи ШАЛАК Игорь Николаевич

ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА ЦИАНОБАКТЕРИИ Б^ЕСНОСУЗИЗ ер. РСС 6803

03.00.15 — генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск ■ - 1992

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского государственного университета им. М. Е Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ : доктор биологических наук КАМЕНЕВА С. Е

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ : ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ РАН (г.Москва)

К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика в ; ютитуте генетики и цитологии АНБ по адресу : г. Минск, ул. $. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотеке им. Я. Ко ласа

автореферат разослан____1992 г.

40МИЧЕВ Ю. К.

кандидат биологических наук БАКАНЧИКОВА Т. И.

Защита состоится _1!

в//часов на заседании специализированного совета

Защита состоится

1992 г.

Ученый секретарь специализировг совета К 006.02.01, к. б. н.

Лобанок Е. Е

- 1 -ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования, фотосинтез является основным источником органического вещества и кислорода на планете. Удобной моделью для генетического изучения фотосинтеза являются цианобак-терии, у которых процесс фотосинтеза, как и у высших растений и водорослей, сопровождается выделением кислорода. В последние годы возрос интерес к фотогетеротрофной цианобактерии Synechocyetis вр. РСС 6803 (Synechocystie 6803), у которой клонировано большинство известных генов, контролирующих синтез структурных компонентов фотосинтетического аппарата (Rogner et al., 1990). Генетическое картирование этих генов у Synechocystie 6803 ограничено из-за отсутствия систем трансдукции и конъюгационного г^реноса.

Использование метода пульс-электрофореза (Янковский, 1989) для'разделения крупных (более 50 т.п.н.) фрагментов ДНК позволяет строить физические карты хромосом различных бактерий и локализовать на них гены с помощью гибридизации. Физическая и генетическая карты были недавно получены для азотфиксирующей цианобактерии Anabaena вр. РСО 7120 (Bancroft et al.,1989).

Цель й задачи исследования. Данная работа посвящена построению физической и генетической карты генома Synechocyetie 6803 В задачи данной работы входило:

1. Отработка методики получения препаратов высокомолекулярной ДНК Synechocystie 6803;

2.Определение рестрикционннх эндонукпеаз (РЭ), расщепляющих хромосомную ДНК Synechocystie 6803 цр достаточно крупные фрагменты; 3.Создание физической карты генома Synechocystie 6803 с использованием редкощепящих рестрикционннх эндонуклеаз;

4. Локализация генов фотосинтеза на физической карте Synechocystis 6803.

Отрпботана методика

- г -

выделения высокомолекулярной ДНК Synechocystis 6803, что позволяет производить рестрикцию и мечение непосредственно в агарозном геле. Для хромосомы Synechocyetie 6803 установлены редкощепящие РЭ и определен размер фрагментов образуемых ими ДНК. Эти данные могут Сыть использованы при анализе полиморфизма длины рестрик-ционных фрагментов ДНК Synechocyetie 6803 с последующем клонированием генов неселектквных маркеров (Beckmann et al.,1983). Определен размер генома Synechocystis 6803, который составляет 3300 -3400 т.п.н. Построена физическая карта хромосомы Synechocystis 6803. Используя ДНК-зонды различных генов, можно картировать их положение на физической карте хромосомы Synechocystis 6803 , что позволит получить информацию о структурно-функциональной организации генома цианобактерйи. В настоящей работе установлено положение 13 генов фотосинтеза на физической карте хромосомы Synechocyetie 6803.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на семинарах Института общей генетики РАН, кафедры генетики и селекции Биологического факультета МГУ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 103 стр., содержит 13 рисунков и 9 таблиц. Список литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .

В работе использовали бактериологически чистую культуру Synechocystis вр. РСС 6803 из коллекции Пастеровского института (Франция). Выделение тотального препарата ДНК из клеток Synechocystis 6803 проводили по методу (Grigorieva, Shestakov- 1982). Выделение плазмидной ДНК из Е. coli, обработку рестрикционными эндонуклеазами, перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновые

фильтры, мечение препаратов ДНК in vitro методом "рассеянного" праймирования, блот-гибридизацию проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984; Peinberg et al.,1983). Ферменты получены из НПО "Фермент" (Вильнюс). Пульс-электрофорез проводили на аппарате производства НПО "Диагностикум" (г.Львов). Препараты ДНК для пульс-электрофореза получали согласно методики Матеу (Ма-thew et al.,1988).

Вариации вышеуказанных методик обсувдается в разделе результаты и обсуздение.

Результаты и обсуждение 1. Получение препаратов ДНК. Препараты ДНК с очень большой молекулярной массой невозможно получить, использу.. традиционнные методы растворения, поскольку такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям. Для предотвращения разрушительного воздействия сдвиговых сил процедуру экстракции ДНК из клеток Synechocystis 6803 проводили непосредственно в агарозном геле. Живые клетки суспендировали в расплавленной низкоплавкой агарозе, а затем помещали в лизирующий раствор. Полученные таким способом препараты использовали в экспериментах.

Средний размер фрагментов хромосомной ДНК Synechocystie 6803 в образцах , приготовленных по описанной выше методике, составляет более 800 т.п.н. Мы определили, что критической стадией при получении препаратов высокомолекулярной ДНК Synechocystis 6803 является фаза роста. При OD^ao « 1,5 клетки плохо лизируются и препараты получаются с низксТй концентрацией ДНК. Это, по-видимому, обусловлено либо более прочной клеточной стенкой молодых клеток, либо увеличением копийности хромосомы Synechocystis 6803 на более поздних стадиях роста (Labarre et al.,1989). При od580 >> 1,5 полосы па пульс-электрофорограммо получаются более

размытыми, возможно, вследствие проявления дополнительных актив- ; ностей РЭ. Показателем получения качественных препаратов ДНК является полный переход окраски образцов от зеленого цвета к желтому в процессе обработки ДНК с помощью протеиназы К (см."Материалы и методы"). Препараты ДНК цианобактерий часто загрязнены полисахаридами ( Joeet, 1988 ), которые ингиОируют активность формантов. Для их удаления препараты обрабатывали 0,5 li NaCl (55°С, 1 % ЕШ, 30 мин ). Такая процедура но приводит к значительному увеличению концентрации фрагментированной ДНК, но позволяет избежать вторичной активности РЭ.

Описанная нами методика по качеству получения препаратов ДНК Synechocyetia 680Э, пригодных для пульс-электрофореза, сравнима с мотодикой для цианобактерии Anabaena 7120 (Bancroft et al., 1989). Однако предлагаемый нами метод значительно проще в исполнении.

2. Рестрикционный анализ хромосомы. ДНК SynechocyBtie 6803, содержащуюся в блоке агарозы, и ДНК Escherichia coli в агарозе (контроль) отмывали в бидистилированной воде и, после уравновешивание в буфере, подвергали рестрикции. Затем образцы помещали в лунки геля.

Большинство проверенных нами РЭ, узнающих последовательности ДНК из 6 и более нуклеотидных пар [ 6 ], расщепляет хромосому Sy-nechocystis 6803 более чем на 100 фрагментов и не пригодно для картирования. Содержание 0/0 пар в геноме Synechocyetia 6803 составляет 47 % (Herdman et al., 1979). Редкощепящими РЭ ДЛЯ ДНК данного G/C - состава должны быть Avrll, Nhel, NotI, Sfil (McCleland et al., 1987 ). К сожалению РЭ Nhel, Sfil проявляют вторичную активность при обработке препаратов ДНК Synechocystis 6803 и не пригодны для картирования. Наименьшее количество фрагментов образуют следующие рестриктазы: Notl, которая расщепляет

хромосому Synechocystis 6803.на 31 фрагмент, Mlul - 19 фрагментов и Есо72.1 (Рша01f - около 40 фрагментов (рис.г). Относительно редкощепящими РЭ являются Cpol(Rsril) (около 60 фрагментов), PvuII (около 100 Фрагментов), Ehel(Narl), Xhol, SalGl (около 200 фрагментов) (табл.1).

То, что РЭ Есо72.1, Mlul и PvuII являются редкощепящими для генома датой цианобактерии, находится в противоречии с выводами обзора Маклеланда ( McCleiand et al., 1987 ). Мы предполагаем, что Synechocystis 6803 имеет контр-селекцию определенных сайтов рестрикции: О A g | Т G (ЕС072.1, PvuII) И | С G С G | ( Mlul, cfr42.i ). Такая кот p-ce лекция отдельных сайтов рестрикций характерна,по крайней мере, для различных видов цианобактерий Апа-baena и Nostoc. В случае, если метилирование недостаточно эффективно, контр-селекция сайтов расщепления эндогенных РЭ является преимуществом для бактерий (Bancroft et al-, 1988).

При обработке ДНК Synechocystis 6803 РЭ СГг42.1 и Есо52.1 МЫ не обнаружили следов активности данных РЭ. Это может быть обусловлено 3 причинами:.

1) сайты расщепления данных РЭ метилированы;

2) РЭ чувствительны к цианобактериальным загрязнениям;

3) фрагменты ДНК, образуемые данными РЭ, tie разделяются на приборе "Диапульс".

Сайт расщепления Есо52.1 идентичен внутренней области сайта расщеп-лония Notl. Поэтому скорее РЭ Есо52.1 очень чувствителен к цианобактериалышм загрязнениям. Однако нельзя исключить вероятность того, что РЭ Noti и Есо52.1 отличаются по чувствительности к метилированию .

Для каждого данного времени пульса происходит разрешение фрагментов ДНК в узком диапазоне размеров ("окно разрешещш"). Все фрагменты большего размера движутся плотной группой впереди

области разрешения, а фрагменты меньшего размера за областью разрешения. Наибольшая разница в подвижности фрагментов близкого размера обеспечивается длительностью пульса, при которой фрагмент только вошел в "окно разрешения" (МаШеч et а1., 1988). Оказалось, что оптимальным для Яо^, Есо72.1, тиТ - фрагментов хромосомы БупесКосуаив ер. РОС 6803 является 4 режима работы пульс-электрофорваного аппарата НПО "Диагностикум"

Для определения размера средних фрагментов образуемых N011, Есо72.1 и М1и1 мы Использовали время пульса 20 с в течение 20 ч, верхних фрагментов, образуемых N011 и Есо72.1 - 50 с, а М1и1 -70 с в течение 20 ч. Режим работы, при котором разделяется максимальное количество фрагментов составляет: 4 с в течение 11 ч, 10 с -3 ч, 20 с - 6 ч.

Табл.1. Сайты расщепления РЭ на хромосоме ЗупесЖосував 6803.

РЭ Сайты расщепления Количество сайтов

Notl GCGGCCGC 31

Есо72.1 CACGTG около 40

MluI ACGCGT 19

PvulI CAGOTG около 100

Alw44.I GTGCAC около 200

Ehel GGGGGO около 200

XhoX CTCGAG около 200

Pael GCATGC около 200

PaU CTGCAG около 200

Kpnl GGTACC свыше 200 а

Bap12Q.I GGGOCC свыше 200 а

ВоЛЗбЛ OIGCTC свыше 200 а

Xbal TCTAGA свыше 200 8

Продолжение таблицы 1.

РЭ Сайты расщепления Количество сайтов

Есо47.III AGCCCT свыше 200 a

Dral ТТТААА свыше 200 a

Sraal CCCGGG свыше 800 a

Есо81.1 CCTNAGG свыше 200 a

Ndel CATATO свыше 200 8

CpoI(Rerll) CGG(A/T)CCG около 50

SalGI GTCGAC около 200

BamHI CGATCO свыше 200 а

EcoRX GAATTO свыше 200 0

HihdIII AAGCTT свыше 200 а

Cfr42.I CCGCGG ?б

E0052.I CGGCCG ?б

Sfil РЭ проявляет вторичную активность

Nhel. — // —

Примечание: а) свыше 200 - РЭ дает "шмер", б) ? - активность РЭ не была обнаружена.

В качестве маркеров для определения размеров фрагментов ДНК использовали конкатемеры фага лямбда (МаШек е1 а1., 1988) и \ (нХгкПИ). При каждым из 4 режимов работы пульс-электрофорез проводили с 6-10 кратным повтором. После фотографирования геля размеры фрагментов рассчитывали на компьютере, используя программы "Веоктап М1сгс^впе 7вгв1оп 6.0я И "81а1вгарЫо".

В таблице г приведены размеры фрагментов хромосомной ДНК ВупеоЬооувИв 6803 после обработки РЭ Notl, Вео72,1 и М1и1. Размер генома ЗупесУюсуоИо 6803, опродвлшпшй яо сумме раэмеров

рестрикционных фрагментов, составляет 3300 - 3400 т.п.н. Хотя в работе Хердмана размер генома данной цианобактерии, установленный ио кинетике реассоциации, определен как 3000 т.п.н. (Herdman et al., 1979 ), данное уточнение, по-видимому, закономерно для многих работ по физическому картированию (Bancroft et al., 1989).

Таким образом, для хромосомы Synechocystie 6803 установлены редкощепящие РЭ и определен размер фрагментов образуемых ими ДНК. Эти данные могут быть использованы при анализе полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК Synechocyatie 6803 с последующем клонированием генов неселективных маркеров (Beckmann et al.,1983). Таблица 2. Длина (т.п.н.) рестрикционных фрагментов хромосомы Synechocystie 6803 .

РЭ Notl РЭ EC072.1 РЭ Mlul

название длина название длина название длина

А. 458 + 15 А 418 + 20 А 870 - 50

В 325 + 8 В 327 + 5 В 471 ± 16

С 300 + 7 с 214 + 6 С 330 ± 13

I) 217 ± 6 D 206 + 4 D 310 ± 5

Е 207 + 5 Е 204 + 5 Е 204 - 3

F 191 + 3 Р 159 + 3 Р 189 ± 5

0 178 + 2 G 147 + 2 0 140 - 3

н 164 + 4 G 141 + 6 Н 133 - 3

1 157 + 3 0 132 + 4 I 116 ± 3

J 133 + 7 Н 102 + 5 к 109 - 3

JJ 116 + 2 I 93 + 6 L 92а - 1

к 106 + 2 J 80а + 4 м 77 ± 1

1. 95 + 1 К 69 + 3 N 71 \

и 91 < 1 1, 64 + 3 0 57 ± 1

Продолжение табл. 2.

РЭ Notl РЭ EC072.1 РЭ Mlul

название длина название длина название длина

N 86 ± 2 и 58 ± 3 Р 50 i 2

0 82 ± 1 N 51е * 2 Q 44 ± 1

Р 69 ± 1 0 49° i 2 R 23 i 2

Q 57а ± 2 Р 40® ± 2 S 15 i 2

R 48 ± 1 Q ЗЭ*1 ± 2

S 44 i 1 R 278 ^ 1

т 42 t 1 S 15 ¿1

и 38а ± 2 Т 12 i 1

V 35 t 1 и 10 ± 1

ч 28 ± 2 V 5 ± 1

X 23 i 2 W 2 ± 1

Y 20а ± 3

АА 11 i 1

АВ 9 ± 1

Примечание : e-дуплет, б-триплет, в-чвтырв фрагмента, г-около шести фрагментов .

3. Физическая карта хромосомы Synechocyatia вр, РОО 6603. Хотя для Syneohocyetie 6803 описана система генетической трансформации (Origorieva and Sheetakov, 1962). картирование генов у данной цианобактерии ограничено из-за отсутствия систем трансакции и коныогационного переноса. Наличие построенной по редкощепя-шда РЭ физической карты хромосомы позволяет в результате одной гибридизации определить положение на ней любого клонированного гона.

Для построения физической карты Synechocyetis ввоз применяли четыре метода с использованием: ■

а) ДНК-зондов NotI (М1Ш, Всо721)-рестрикционных фрагментов;

б) клонированных фрагментов ДНК Synechooyetie 6803;

в) ДНК-зондов Motl-линкбрных клонов;

г) неполной рестрикции.

Для выделения ДНК NotI, iilul, Есо721-рдстрикциошшх фрагментов были использованы 3 метода: экстракция ДНК, гидролизованной частоще-пящей рестриктазой Sau3XI из лекгоплавкой агарозы; электроэлюция в аппарате, выпускаемом НПО "Еиотех"; мечение непосредственно в легкоплавкой агарозе. .

Рис.1 Пульс-электрофорегрвмма ДНК Synechocyetis 6803 ,

обработанной РЭ NotI (2), Есо72.1 (3,4), Mlul (6,7) Время пульса 50с. 1, 5, в - дорожки - конкатемеры фага

Мечение непосредственно в легкоплавкой агарозе оказалось наиболее эффективным из трех опробованных методов. Включение Р не ниже, чем при стандартных условиях. Блок агарозы, содержащий ДНК Not!- , Eco72I- , Mlul - фрагментов, разводили водой в три раза со случайным праймером, затем ДНК денатурировали (95°С 5 мин.), охлаждали (37°С 10,мин.) и в дальнейшем метили 32Р по стандартной методике (Feinberg et al.,1983).

V

рис.2 рис.3

Рис.2. Пульс-электрофореграмма ДНК Synechocyetie 6803 , обработашой РЭ Notl (1), Есо72.1 (2), Miul(3). Время пульса 4с, 10с, 20с. 4 дорожка - конкатемеры фага

Рис.3. Результаты блот-гибридизации с Есо72.1 и Mlul -фрагментами: (а) 310 т.П.Н. Mlul-фрагмента ДНК Synechocystis 6803 ( дорожки 1, 2,3 геля на рис.^); б) 418 т.п.н. Есо72.1-фрагм9Нта.

а

Банк из 30 ш>и-линкерных клонов был предоставлен д.б.н. м. Ю. Фонштейном. ДНК этих клонов, меченную Э2Р, гибридизовали с ДНК ЗупесЬосув1;1в 6803, обработанной РЭ N011 , Есо721 и Ы1и1 (рис.4). Оказалось, что уникальными являются только 7 клонов (см.табл. 4).

На основании результатов блот-гибридизаций с рестрикционными фрагментами (табл.э и рис.3), -линкерными клонами (табл.4) и зондами генов была построена физическая карта хромосомы ЗупесЬо-суаИв 6803 по РЭ N011 , Есо72.1, М1и1 (рис.6). Связь I и Т Но«-фрагментов была определена по результатам неполной рестрикции.

12 3

! а

I ■

• jTaJi и., iiVitt^J б

Рис.4. Блот-гибридазация ДНК Notl-линкерных клонов с ДНК фраг ментов Synechocystis 6803. в) пульс-электрофорегрвмма ДНК Syne chocystis 6803, обработанной РЭ Hotl (1), Всо72.1 (2) и Mlul (3) б) гибридизация с зондом 5 линкер-клона (см. табл.4)

Чтобы исключить вероятность того, что зонд данного рестрик-ционного фрагмента даст гибридизанионный сигнал с несмежным фрагментом, содержащим гомологичные области, мы применяли следующие приемы:1) в первую очередь принимали во внимание только самые интенсивные сигналы;

2) в случае, если суша длин всех рестрикционных фрагментов, от которых был получен положительный сигнал, превысила теоретически возможную величину, эксперимент повторяли с более жесткой отмывкой;

3) окончательный вывод о стыковке фрагментов делали только после проведения гибридизации со всеми рестрикционными фрагментами. табл.3. Кросс-гибридизация рестрикционных фрагментов ДНК

8упес1тосувив вр. РОС 6803.

Рестриктаза фрагмент -зонд фрагменты, дающие положительные сигналы при гибридизации

№э1;1-фрагм. М1и1 -фрагмент Есо72.1-фрагмент

М1и1 в • О.К.О.Р.Л, в О.Р.СМ.С.ХХ

ил

0 <7,|Т<Т,0,ХХ с В

И НЛ.Ь.Б.и 0 А,И,Р

Е С,XX Е 3,0,Р,Р

р Р.Н/Х Р В,Е

0 н С Ь.ХХ

. н р Н Б/С

ъ 0,11,XX Ь Р,0,0/0

ч а /и И К

N к N с

0 Б 0 О.ХХ

р С/Е,С Р 02

N011 А А А 0/С,0,Р,0,Н

В в Б.ОЛ.К.М р.и.ог.н.а

в в А,В г.хх.и^

Есо72.1 к в/с ГД.У А,Е,1),Й/1, N А/Й-.Й | 'А л/с

примечание: 1) н/1-фрагменты не разделены на данном блоте, 2) м - слабый сигнал на блоте,э) хх-фрагмент(ы) не определены, см.табл.2.

Физическая карта хромосомы бупесносувив 6803 является основанием для построения генетической карты с использованием ДНК клонированных генов в качестве гибридизационных зондов. Это позволит получить информацию о структурно-функциональной организации генома цианобактериий .

4. Локализация генов фотосинтеза на физической карте хромосомы БупесЬосувив 6803.

Используя зонды клонированных генов из цианобактерий (табл.б), было установлено положение 13 генов, участвующих в генетическом контроле фотосинтеза, на физической карте БупесЬооув-Нв 6803 (рис.6). В первую очередь можно отметить, что гены фотосинтеза не кластеризованы на хромосоме БупесПосувНв 6803. Около 500 т.п.н. отделяет .гены рвьбс от генов рвьа и рвьс, около 100 т.п.н. рвьв - от рвьис, около 100 т.п.н. рвьк и рвьер - от. рваб рвьо, около гоо т.п.н. рвав и рвЬО - от рвас. На расстоянии около 700 т.п.н. находятся ген рвас и ген рвън. Табл.4 Гибридизация Ло«-линкерных клонов с фрагментами ДНК бупесьосувив вр. рос 6803.

N Ц/П Фрагменты, дающие положительные сигналы при гибридизации

йо и-фрагмент Еоо72.1-фрагмент М1и1 -фрагмент

1 А + АА Ъ/С А

2 ' Е + АА Г)/0 А

3 Е 1 Ы А

4 Н 4 и с В

В 1? 1 V в 0

Продолжение таблицы 4..

N п/П Фрагменты, дающие положительные сигналы при гибридизации

Noti-фрагмент Есо72.1-фрагмент Hlui-фрагмент

6 Р + н Е р

7 и + s N D

1 • и Р Е

Примечание: Б/О-фрагменты не разделены на данном блоте; а+аа -два соседних фрагмента дают положительные сигналы при гибридизации; 1'- гибридизация о фрагментом хромосомы из банка генов; см. табл.2.

В таблице 6 суммированы данные об относительном расположении генов фотосинтеза в геномах Synechocystis 6803, Anabaena 7120 (Bancroft et al., 1989). цианеллы (Breiteneder et al.,1988), a также в хлоропластной ДНК Nicotiana tabacum (Sugiura, 1987). Предполагается (Breiteneder et al.,1988), что цианеллы являются промежуточным звеном между эндосимбиотическими цианобактериями и хлоропластами. К сожалению, не все гены, прокартированные на хромосоме Synechocyetia 6803 (табл.5), упорядочены на картах геномов этих организмов. 1

В геноме цианобактерии Anabaena 7120. также как и у Synechocystie 6803. и в хяДНК растений, гены фотосинтеза не кластеризованы Сотни тысяч пар оснований отделяют две копии pab D от pab ер и, возможно. ОТ pab в; pet А и pet в от pet у; atp ас от atp BE; рва АВ от ps&D и, возможно, аре D от аре в. Следовательно, хотя некоторые гены К II в К I Anabaena 7120 расположена близко, нельзя говорить о тандемностн всех генов этих комплексов.

Г

Т

■ С£>

-

рис. 5. Гибридизация с использованием ДНК зондов генов: а) рвьо, б) рцъК, в) рвЪА. Гибридизацию проводили без отмыва предыдущего зонда для того, чтобы улучшить ориентацию радиоавтографа.

Табл.5. Зонды, использованные для локализации генов.

ген ОбЪект Источник Фрагменты, дающие положительные сигналы

N011 Есо72.1 М1и1

рвЬА1 Б;, песЬосувИв 6714 £.11с1п1;ов)1 А/В Р/О 1 к/С

раЬВ ЕупесйосувИв 6803 W. Уегтаав с I В

раЪЙС БупеаЬосувив 6803 V. Уегтаав Ы + У и + V А

Продолжение таблицы 5

ген Объект Источник фрагменты, дающие по-'

ложительные сигналы

Noti Есо72.1 М1и1

рвЬЕР Synechocyetis 6803 'н. Pakraai Н L G

рвЬО Synechocystie 6803 R. Buroap АВ D Ь

рвЬН Synechocyetia 6803 D.Bryant т А А

рвЬК Synechocystia 6803 W. Vennaas Н L G

peaD Noatoc 7906 D.Bryant XXX D L

рваАВ Synechococeu:; 7002 D.Bryant XXX А D

рваС Synechococcus 7002 D.Bryant JJ/D В/О С/0

БК18 Synechocyetis 6803 каф. генетики К G В

petH Synechococcus 7002 D.Bryant 0 I В

рвЬО Synechocyetis 6803 L. Bogorad А 0 А

[римечание: ххх-гибридизация с Noti-фрагментами не проводилась; l/b- два различных фрагмента дают положительные сигналы при 'ибридизации; m+y - два соседних фрагмента дают положительные :игналы при гибридизации; см.табл.1

Ген рРНК (ггпА) гибридизуется с двумя противоположными райо-ами генома Anabaena 7120. Одна область включает гены в следующем орядке: atp BE, рва АВ, atp АС, рвЬ В, rbc L, гро BC^g, тогда ак другая - pet A, pet В, рвЪ ЕР,И две КОПИИ psbD (Bancroft et l. 1989). Для сравнения, большой уникальный район хцЦНК табака Sugiura, 1987) содержит pet В, psb F, рвЬ В, pet A, rbc Ъ. atp е, рва ав, рвЬ d ( последовательность генов консервативна для эльшинства хпДНК наземных растений ).

*

Рис.6. Физическая и генетическая карты хромосомы ЗупесЬосуа^в ер.РСС 6803. На внешнем кольце показаны фрагменты, образуемые РЭ N0«; на среднем - РЭ М1и1; на внутреннем - РЭ Есо72.1. О,X,У-порядок фрагментов не определен; * - порядок расположения фрагментов в данном месте был определен по слабым сигналам гибридизаций (см. таблицу 2); ХХ-фрагмент не определен; рвас* и рзЬА* -вторые более слабый сигналы зондов рзаС и раЬА.

Табл.6 Последовательность расположения генов фотосинтеза на хромосоме Synechtfcyetis 6803, Anabaena 7120 (Bancroft et al.,1989). цианеллы (Breiteneder et al.. 1988) и хлоропластной ДНК Nicotiana tabacum (Suglura, 1987).

Объект Последовательность генов фотосинтеза

s.6803 Anab. Nicot. cyanel рвЬН рваАВ рваС peaD pebEF рвЬВ psbDC pebQ рвЬА /VfV/V IVIVM IV/V/V рваАВ psaD psbEP psbD рвЬН рвЬВ psbEP pBbG psbDC рвЬА рваС рваАВ ' рвЬВ psbD

Примечание : в таблице растояние между генами показано непропорционально их реальному расстоянию на хромосоме ( хпДНК ); ~~~ -относительное положение данных генов значительно отличается. Сокращения: S.6803 - Synechocystis 6803, Anab. - Anabaena 7120, cyanel - цианолла, Nicot. - Nicotiana tabacum.

Уникальный район генома цианеллы Cyanophora paradoxa включает рва АВ, рвЬ В, рвЬ ЕР, atp A, rbs Ь, atp BE, pet A, pet D (Breiteneder et al.,1988). Таким образом, если хпДНК произошла от бактериальной ДНК, организованной подобно ДНК цианобактерии Anabaena 7120 и Synechocystis 6803, то в процессе эволюции должны были произойти множественные перестройки .

ВЫВОДЫ

1. Отработана методика выделения высокомолекулярной ДНК Synechocystis вр. рос 6803, что позволяет производить рестрикцию и мечение непосредственно в агарозном геле.

2. Определен размер генома Synechocystis sp. PCO 6803, который соствляет 3300 - 3400 т.п.н.

3. Построена физическая карта хромосомы Synechocyetis вр. рос 6803 по рестрикционным эндонуклеазвм Notl, Eco72.l, Mlul.

4. Определено положение 13 генов фотосинтеза на физической карте хромосомы Synechocystis ер. РОС 6803.

Основные результаты изложены в публикациях:

1. Шалак И.Н., Еланская И.В., Фонштейн М.Ю. Физическая карта генома цианобактери SynechooystiB вр. РОС 6803 - Генетика, 1992, Т.28 , № 4, С. 46-52.

2. Шалак И.Н. Физическая и генетическая карты генома цианобак-терии SjmechocyetiB вр. РОС 6803 - Тезисы vil съезда ВОГиС, Минск, 1992 (в печати).

3. Shalak I.N., Elanekaya I.V., Fonetein M.U., Sheetakov s.V. Physical and genetic maps of the genome of the cyanobacterium Synechocystis вр. РОС 6803 - Mol. Microbiol., 1992, in press.

Подписано н печати 15.on.9Z, Формат 60x84 1//6,

Усл. печ.л. 1J *ирах энз. Бесплатно. Занав 6Т-5,

ППП БелНИИНТИ. 220004, Минск, пр. Машерова, 23.