Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки

Кокшарова, Ольга Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки"

На правах рукоппсп

Кокшарова Ольга Алексеевна

Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2006 год

обязательный

бесплатный ,

экземпляр ^

Работа выполнена в Институте общей генетики имени Н.И.Вавилова РАН и па кафедре генетики Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоцосова

Научный консультант: доктор биологических паук, профессор

академик РАН

Шестаков Сергей Васильевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических паук Доктор биологических наук Доктор биологических иаук

Лось Дмитрий Анатольевич Прозоров Александр Александрович Хмель Ипесса Александровна

Ведущая организация:

кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится « »_2006 года в_часов

На заседании диссертационного совета Д 002.214.01 в Институте общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва, ул. Губкина, д.З. Факс (495) 135-12-89

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослап « »_2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Полухина Г.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Генетика клеточного деления, дифференцировки и внутриклеточного метаболизма - основные направления фундаментальных исследований в молекулярной генетике цианобактерий. Расшифровка генетического контроля этих процессов и адаптивных ответов на действие факторов среды базируется на использовании данных о структурно-функциональной организации геномов модельных видов цианобактерий. Одноклеточная цианобактерия БупескосузШ эр. РСС 6803 (5. 6803), способная к гетеротрофному росту, служит модельным объектом для изучения процесса фотосинтеза и его регуляции, устойчивости к стрессовым факторам окружающей среды. Нитчатая цианобактерия АпаЬаепа Бр. РСС 7120 (А. 7120), способная к формированию специализированных гетероцист, в которых происходит фиксация азота, используется для исследования генетического контроля процессов клеточной дифференцировки. Облигатный фотоавтотроф, одноклеточная цианобактерия ¡ьупескососст эр. РСС 7942 (5.7942) служит моделью в изучении механизмов клеточного деления, циркадных ритмов, адаптивных ответов на различные стрессы. Для этих видов цианобактерий с полностью секвенированными геномами разработаны генетические методы исследования: методы переноса ДНК с помощью трансформации и конъюгации; наличие плазмидных векторов для переноса, клонирования и экспрессии генов; использование генов-репортеров для изучения экспрессии генов и локализации их продуктов; разнообразные методы мутагенеза.

Полные нуклеотидные последовательности геномов 12 видов и штаммов цианобактерий представлены в базах данных (ЬЦр://Ыо.с.и-Сокуо.аслрЛаЬвЛкеисЫ/с genomeE.html).

ШТЙЩШШ с; тарркие БИБЛИОТЕКА

С.-Пстериур|

Ос> 2»Д>(У>м ¡^4-6

возможности для молекулярно-биологического анализа функций различных генов, механизмов регуляции их экспрессии. Активно развиваются исследования в области функциональной геномики и протеомики, дополняемые современными биохимическими и биофизическими методами.

Наличие эффективных методов генетики и геномики позволяет создавать штаммы цианобактерий перспективные для использования в биотехнологии при производстве различных продуктов (ферменты, пигменты, молекулярный водород и т.д.), а также для биодеградации органических загрязнений и для многих других целей. Цели и задачи исследования

Идентификация и изучение функций генов, контролирующих разные процессы жизнедеятельности цианобактериальной клетки: деление, дифференцировку, метаболизм, важны для понимания механизмов функционирования, развития и эволюции этих древнейших организмов, предшественников хлоропластов высших растений. Изучение метаболизма у фотосиптезирующих прокариот может способствовать и пониманию механизмов аналогичных процессов в клетках высших растений. В данном исследовании представлены результаты более чем двадцатилетней экспериментальной работы, выполненной на кафедре генетики Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, в Институте общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН, а также в лабораториях Института генетики Браунгшвайгского технического университета (Германия), университета штата Мичиган (США), Института ботаники Стокгольмского Университета (Швеция). Цель исследования:

Поиск и изучение генов, контролирующих клеточное деление, дифференцировку и метаболизм цианобактерий.

В задача исследования входило:

1). Идентификация, клонирование и секвенирование новых генов, контролирующих клеточное деление; их изучение с применением метода транспозонного мутагенеза.

2). Изучение белкового состава клеток штамма дикого типа и мутантов по клеточному делению цианобактерии Synechococciis sp. РСС 7942 на основе методов протеомики и компьютерного анализа белковых баз данных.

3). Идентификация и изучение новых ДНК-связывающих белков, регулирующих координированную экспрессию генов ИерА и hepC в процессе дифференцировки гетероцист азотфиксирующей цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120.

4). Определение метаболических функций продуктов GAPDH генов (gapl и gap2) в Synechocystis sp. РСС 6803 и выявление особенностей экспрессии гена gap3 в клетках Synechococciis sp. РСС 7942 и Anabaena variabilis АТСС 29413 с помощью метода РНК-ДНК гибридизации.

5). Получение с помощью химического мутагенеза мутантов Synechocystis sp. РСС 6803, неспособных к фотоавтотрофному росту, а также мутантов, устойчивых к различным ингибиторам фотосинтеза.

6). Селекция и изучение мутантов Anabaena variabilis АТСС 29413, способных к выделению молекулярного водорода в аэробных условиях.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе впервые разработана модельная система для поиска и изучения генов, контролирующих клеточное деление цианобактерий: идентифицированы, клонированы и секвенированы два новых гена, ftn2 и ftn6, необходимые для нормального протекания процесса деления клеток. Идентификация гена ftn2 позволила обнаружить

гомологичный ядерный ген агсб в Arabidopsis, участвующий в контроле деления хлоропластов высших растений. Гомологи гена ftn2 выявлены в геномах различных видов цианобактерий и зеленых растений.

Впервые проведен сравнительный протеомиый анализ клеток мутантов Ftn2 и Ftn6 Synechococcus sp. РСС 7942, дефектных по клеточному делению. Мутации в ftn2 и ftn6 генах обладают плейотропным эффектом, изменяя экспрессию не менее 44 белков, принадлежащих к разным функциональным категориям. Построена первая белковая карта клеток штамма дикого типа Synechococcus sp. РСС 7942.

Изолированы, очищены и идентифицированы четыре новых фактора транскрипции, контролирующие экспрессию генов hepA и hepC, участвующих в дифференцировке гетероцист Anabaena sp. РСС 7120. Установлено, что два из них, АЬр2 и АЬрЗ, необходимы для активации экспрессии генов, ответственных за формирование гликолипидного слоя, специфичного для гетероцист.

Впервые установлено, что два гена, относящихся к одному семейству, gap1 и gap2, кодирующих глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу, обладают различными физиологическими функциями в клетке цианобактерий; ген gapl отвечает за гликолитичсское расщепление глюкозы, а ген gap2 кодирует фермент, подобный хлоропластному белку, участвующему в фотосинтетическом цикле. Показано, что гены gapl и gap3 окспрессируются в клетках Synechococcus sp. РСС 7942 в составе двух различных оперонов. Выявлены условия экспрессии считавшегося ранее критическим гена gap3 в клетках Synechococcus sp. РСС 7942 и Anabaena variabilis.

Разработаны новые методические подходы в селекции мутантов дефектных по фотосинтезу и резистентных к ингибиторам

фотосинтеза. Эти мутанты нашли применение в работах по клонированию и анализу ранее не изученных генов, контролирующих фотосинтез.

Разработан метод выделения мутантов цианобактерии Anabaena variabilis, способных к выделению молекулярного водорода в аэробных условиях. Полученные мутанты были использованы в ряде лабораторий для разработки технологии получения водорода в фотобиореакторах.

Полученные результаты послужили основой для изучения генов, ответственных за деление хлоропластов высших растений (Университет штата Мичиган, США), генетического контроля клеточного деления у цианобактерии Synechocystis 6803 (CNRS, Франция); изучения путей энергетического метаболизма и ассимиляции углекислоты в клетках цианобактерий (Брауншвайг, Германия, МГУ), для разработки методов продуцирования молекулярного водорода в фотобиореакторах (Пущино, Россия и Лондон, Великобритания). Апробация работы

Результаты работы были представлены на 9 Российских конференциях и на 14 международных, включая: Третий Съезд ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», 2004, Москва; 10-й международный симпозиум «Фотоавтотрофные прокариоты», Испания, Барселона, 2000; 7-ая международная конференция «Молекулярная биология цианобактерий», США, Асиломар, 2001; 5-ая Европейская конференция «Молекулярная биология цианобактерий», Швеция, Стокгольм, 2002; а также на научных семинарах кафедры генетики МГУ имени М.В. Ломоносова (Россия, 1984-87), Брауншвайгского Технического Университета (Германия, 1995-1998), Университета

штата Мичиган (США, 1998-2001), МГУ, Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (2003,2006). Объем и структура работы. Публикации

Диссертация, изложенная на 308 страницах, содержит 22 таблицы, 35 рисунков. Результаты исследований представлены в 39 публикациях; 19 статьях в российских и международных журналах; двух авторских свидетельствах на изобретение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Идентификация новых генов, контролирующих деление цианобактериальных клеток и пластид растений.

Генетические основы клеточного деления у цианобактерий гораздо менее изучены но сравнению с гетеротрофными бактериями. Ряд генов, важных для деления клеток нефотосинтезирующих бактерий (например, Escherichia coli, Bacillus subtilis) был идентифицирован (Bramhill, 1997; Bouche, and Pichoff. 1998). Только некоторые из этих генов, ftsE, ftsl, ftsQ, ftsW, ftsZ, minC, minD, minE, sulA и divIVA были обнаружены в геномах цианобактерий. При использовании транспозона Тп-692 мы получили мутантов с нарушенным процессом клеточного деления у цианобажтерии Synechococcus sp. РСС 7942. Изучение этих мутантов позволило идентифицировать два новых гена, ответственных за клеточное деление, ftn2 и ftnó. Обозначение FTN означает yílameníatio«, поскольку клетки этих мутантов в 10 раз длиннее клеток штамма дикого типа вследствие нарушения нормального клеточного деления (Рис.1 и 2). Фрагменты ДНК из мутантов были клонированы и секвенированы (GenBank accession nos. AF421196 и AF421197). В полностью сегрегированных мутантах Ftn2 и Ftnó (Рис. ЗА,В), транспозон инактивировал присутствующие в единичных копиях (Рис. 3C,D) открытые рамки считывания, которые и были названы генами

fini и ftn6. Белок FTN2 содержит DnaJ домен, одиночный TPR повтор и характерную последовательность лейцинов, что позволяет предположить, что FTN2 является частью белкового комплекса, выполняющего регуляторную функцию. Белок FTN6 специфичен для цианобактерий, не имеет консервативных доменов, функция его неизвестна. В мутантах Ftn2 и Fta6 не формируются четко определенные Z кольца. Эти мутанты делятся случайным образом. На месте образования септы в клетках мутантов Ftn2 и Ftn6 отмечена незначительная и диффузная локализация FtsZ белка. Поэтому можно предположить, что у мутантов нарушен процесс размещения белка FtsZ в сайте деления или этап последующей сборки Z кольца. Ортологи белка FTN2 в Aràbidopsis thaliana, ARC6, и в Synechocystis sp. РСС 6803, ZipN, вероятно непосредственно связываются с белком FtsZ (Vitha et al., 2003; Mazouni et al., 2004). Неизвестно, взаимодействует ли белок FTN6 с белком FtsZ, но очевидно, что утрата функции этих двух fin генов дезорганизует деление клеток цианобактерий, а в случае потери ARC6 нарушается деление хлоропластов высших растений (Vitha et al., 2003).

Нами были получены у Anabaena sp. РСС 7120 инсерционные мутанты по генам ftn2A (all 2707) и ftnóA (all 1616) с нарушениями в клеточном делении (Рис.4). Кроме удлиненных вегетативных клеток, встречаются округлые клетки, напоминающие по форме споры цианобактерий - акинеты. Присутствие у мутантов больших округлых клеток, которые по своей форме и расположению напоминают акинеты, позволяет предположить, что белки Ftn2A и Ftn6A могут быть вовлечены не только в регуляцию клеточного деления, но и в процессы дифференцировки клеток.

V'»'«V * 1 К'.'

'/('г*" , ' '"'V -

Рисунок 1. Морфология клеток штамма дикого типа БупесЪососст РСС 7942 (А) и клеток мутантов Рш2 (В) и Бшб (С), выросших в жидкой среде. Световая микроскопия. Масштабная линейка - 12.5 цш (А,В) или 25.6 цт (С).

Рисунок 2. Структура клеток штамма дикого типа 5.7942 (А), и мутантов Рш2 (С, см. выделенный участок на В) и Ртб (Е, см, выделенный участок на Б). Клетки обоих мутантов делятся несимметрично, случайным образом. Масштабная линейка - 1 |дт (А,С,Е) или 10|дт (В,Б).

ABC D

123 123 1234 1234

№ kb kb kb

-9.4 •4.4

-9.4 -4.4

, -2J

Рисунок 3. ДНК-ДНК гибридизация по Саузерну с ftn2 зондом (А, С) или с ftn6 зондом (В, D). (А,В) Геномная ДНК из клеток штамма дикого типа 5.7942 (1) или мутантов Ftn2 (2) или Ftn6 (3), порезаны Sail и перенесены на мембрану. (С, D) Геномная ДНК дикого типа порезана Sail (С, 1; D, 2), £coRI (С, 2; D, 3), Hindlll (С, 3; D, 4), или Xhol (С, 4; D, 1), и перенесена на мембрану.

Рисунок 4. Морфология клеток штамма дикого типа АпаЪаепа эр. РСС 7120 (А,В) и клеток мутантов Рш2А (С,Б) и Рш6А (Е,Р) выросших в жидкой безазотистой среде (А,С,Е) или в присутствие 5 шМ нитрата натрия (В,Б,Р). Масштабная линейка - 12.5 цш. Акинетоподобные клетки указаны стрелками.

2. Изучение клеточного деления цианобактерии Synechococcus s р. РСС 7942 с помощью методов функциональной протеомики.

Клеточное деление - это скоординированный и тонко настроенный процесс, в котором участвует большое количество структурных и регуляторных компонентов. Нарушение механизма деления клетки может приводить к формированию очень длинных клеток и/или мини-клеток. Такое изменение размеров может существенно изменить физиолого-биохимические характеристики. При блокировании клеточного деления многие метаболические системы, которые регулируются клеточным циклом, будут адаптироваться к новым условиям в клетке, отличающейся по своей морфологии от клеток штамма дикого типа. Об изменениях, происходящих на белковом уровне в клетках с нарушенным делением, известно очень мало.

Целью исследования было установление спектра изменений, связанных с блокированием клеточного деления и плейотропным влиянием мутаций fini и ftnô на протеомную картину клеток Synechococcus sp. РСС 7942. Предполагаемые функции белков FTN2 и FTN6, а также функции идентифицированных белков, экспрессия которых изменена в клетках мутантов, обсуждаются в свете представлений о метаболических путях, затрагиваемых при нарушении клеточного деления.

2.1. Белковая «карта» клеток Synechococcus sp. РСС 7942.

Создана первая белковая «карта» клеток штамма дикого типа 5.7942. Прогеомный анализ проведен при использовании двумерного электрофореза, MALDI-TOF масс-спектроскопии и анализа геномных баз данных. Из 140 проанализированных белковых пятен были идентифицированы 110, которые представляют 62 различных белка

(Рис.5 и Таблица 1), участвующих в основных метаболических и клеточных процессах, происходящих в клетках в экспоненциальной фазе роста. Двадцать три белка были найдены как наборы из нескольких пятен. Так, например, ГТФаза (FtsZ белок) присутствует в виде трех пятен (11 а,Ь,с), альфа субъединица сульфит редуктазы обнаруживается в виде пяти пятен (16 a,b,c,d,e), различающихся значениями изоэлектрической точки (pi) (Рис. 5). Белок оболочки карбоксисом представлен набором из пяти пятен, четыре из которых имеют предсказанный молекулярный вес около 11 кДа (19 Ь, с, d, е, рис.5 и Таблица 1) и отличаются значениями pi. Пятно 19а имеет более высокий молекулярный вес (около 44 кДа) и может представлять тетрамер, который не диссоциировал в ходе электрофоретического разделения. Множественные пятна, соответствующие одному и тому же белку, могут представлять собой посттрасляционные модификации белков, возможно связанные с регуляцией функций или активности этих белков.

Четырнадцать неизвестных и гипотетических белков локализованы впервые на белковой «карте» 5.7942: это свидетельствует о том, что они являются истинными генными продуктами. Полученная информация может быть полезна при аннотации недавно секвенированного генома этой цианобактерии, а также для биохимических и физиологических исследований этой цианобактерии. Знание фактической (а не только предсказанной) молекулярной массы белков существенно при проведении экспериментов по Western гибридизации.

Рисунок 5. Белковый профиль клеток цианобактерии Бупгскососсиз эр. РСС 7942. Представлен белковый гель, полученный в результате двумерного электрофореза и окрашивания белков Кумасси синим. Показаны белковый стандарт (маркер) молекулярной массы (ось, у) и изоэлектрические точки (ось х). Идентификация каждого отмеченного белкового пятна представлена в Таблице 1.

Таблица 1. Белки, идентифицированные в клетках цианобактерин Бупескососсш ер. РСС 7942

Номер пятна Название белка Предполагаемые М.мУр! Номер в базе данных >!СВ1 Номер гена

Группа 1. Морфогенез клетки

I Молекулярный шаперон 67.7/4.7 46130530 2468

11а ГТФаза белок) 40214.9 46130477 2378

11Ъ ГТФаза (Рвг белок) 40.2/4.9 46130477 2378

11с ГТФаза (Т^г белок) 40.2/4.9 46130477 2378

24 Актиноподобная АТФаза (МгеВ) 35.0/5.1 53763074 0300

5 Белок внешней мембраны 57.6152 45513235 1761

13а Белок, содержащий РРЕ-повтор 57.2/5.4 46129905 1464

13Ь Белок, содержащий РРЕ-повтор 57.2/5.4 46129905 1464

14а НоАф, компонент секреторного пути (тип 11) 80.3/8.4 46130521 2450

|4Ь НоК}, компонент секреторного пути (тип И) 80.3/8.4 46130521 2450

14с НоА}, компонент секреторного пути (тип И) 80.3/8.4 46130521 2450

46 Белок 0$[А (устойчивость к органическим растворителям) 15.2/9.3 45511847 0514

7а УДФ-М-ацстилмурамнлтрипептид синтеза 53.1/5.1 46129915 1484

7Ь УДФ-Н-ацетилмурамилтрипептид синтаза 53.1/ 5.1 46129915 1484

7с УДФ-М-ацетилмурамилгрипептид синтаза 53.1/5.1 46129915 1484

33а Диаминопимелат эпимераза 30.3/4.8 46130191 1927

ЗЗЬ Диаминопимелат эпимераза 30.3/4.8 46130191 1927

Группа 2. Белковый синтез

15а Субъединица Б Азр-АэпЛЛи-тРНКСЬ амидотрансферазы 54.6/5.4 53763184 0118

15Ь Субъединица Б А5р-А8пЛ31и-тРНКС1п амидотрансферазы 54.6/5.4 53763184 0118

28 Рибосомальный белок 81 31.8/5.2 22002498 1591

29а Фактор элонгации трансляции Т$ 24.4/5.3 46130565 2531

29Ь Фактор элонгации трансляции 'Гэ 24.4/5.3 46130565 2531

40 Белок, участвующий в рециклизации рибосом 19.2/6.4 53762955 0507

53 РНК-связывающий белок (ШШ домен) 10.7/4.9 45513450 1999

59 РНК-связываюшнй белок (1УШ домен) 11.3/5.5 81299490 0679

Группа 3. Посттраисляциоиный процессипг, модификация, созревание белков, шапероны, белок-белковые взаимодействия

2а Шаперон СгоЕЬ (ШРбО семейство) 58.2/4.7 53762838 0685

2Ь Шаперон СгоЕЬ (НБРбО семейство) 58.2/4.7 53762838 0685

4а Шаперон бгоЕЬ 58.0/5.1 46130438 2313

4Ь Шаперон СгоЕЬ 58.0/5.1 46130438 2313

4с Шаперон СгоЕЬ 58.0/5.1 46130438 2313

46 Шаперон СгоЕЬ 58.0/5.1 46130438 2313

4е Шаперон СгоЕЬ 58.0/5.1 46130438 2313

4Г Шаперон СгоЕЬ 58.0/5.1 46130438 2313

18а Периплазматическая лротеаза 46.2/8.9 53762820 0712

18Ь Периплазматнмеская протеаза 46.2/8.9 53762820 0712

34 Молекулярный шаперои вгрЕ 23.0/4.7 45513516 2072

42а Циклофилин; пептидилпролил изомераза; ротамаза 15.8/5.7 46489 1431

42Ь Циклофилин; пептиднлпролил изомераза; ротамаза 15.8/5.7 46489 1431

54 Белок ОгоЕБ 10.7/4.7 97572 2314

61 ИКВ-тип пептидил-пролил цис-транс изомераза1 18.2/5.3 56686717 2354

31 ТРЯ повтор 31.7/5.4 53762940 0531

Группа 4. Регуляториые функции

3 Метил-акцептирующий белок хемотаксиса 45.9/4.4 46129853 1397

Группа 5. Образование и конверсия энергии

6а АТФ синтеза, бета субъединица 52.2/5.0 48024 2315

6Ь АТФ синтеза, бета субъеднница 52.2/5.0 48024 2315

бс АТФ синтаза, бета субъедшшца 52.2/5.0 48024 2315

6(1 АТФ синтаза, бета субъединица 52.2/5.0 48024 2315

37 Неорганическая пирофосфатаза 19.1/4.6 46129844 1383

38 Аденилат киназа 20.3/5.0 45513641 2213

Группа б. Метаболизм аминокислот

8а Б-аденозилметионин синтетаза 45.4/5.0 46130527 2463

8Ь 8-аденозилметионин еннтетаза 45.4/5.0 46130527 2463

8с З-аденозилметиокин синтетаза 45 4/5.0 16130527 2463

27 Цистеин синтаза 34.1/5,5 45512974 1466

Группа 7, Глюкозный метаболизм

9а Энолаза 45.4/4.7 53762871 0639

9Ь Энолаза 45.4/4.7 53762871 0639

9с Энолаза 45.4/4.7 53762871 0639

21а Фруктозо-1,6-бифосфатаза 37.3/5.1 45511855 0505

21Ь Фруктозо-1,6-бифосфатаза 37.3/5.1 45511855 0505

21с Фруктозо-1,6-бифосфатаза 37.3/5.1 45511855 0505

22а Фруктозо/кетозо бифосфат альдолаза 39.1 /5.3 46129889 1443

22Ь Фруктозо/кетозо бифосфат альдолаза 39.1 /5.3 46129889 1443

22с Фруктозо/кетозо бифосфат альдолаза 39.1/5.3 46129889 1443

Группа 8. Синтез ДНК

10а Бета субъединица ДНК полимеразы III 40.5/4.9 974615 0001

10Ь Бета субъединица ДНК полимеразы III 40.5/4.9 974615 0001

Группа 9. Метаболизм сульфата

16а Сульфит редуктаза, альфа субъедшшца (флавопротеии) 44.4/ 5.7 45512552 0978

16Ь Сульфит редуктаза, альфа субъединииа 44.4/5.7 45512552 0978

16с Сульфит редуктаза, альфа субъедшшца 44.4/5.7 45512552 0978

1бс1 Сульфит редуктаза, альфа субъсдиница 44.4/5.7 45512552 0978

16е Сульфит редуктаза, альфа субъедшшца 44.4/ 5.7 45512552 0978

Группа 10. Липидный метаболизм

17 Предсказанная дейнелактон гидролаза 56.0/6.3 53763021 0391

Г руппа] 1. Углеродный концеитрирующий механизм и фиксация углекислого газа

19а Белок оболочки карбоксисом 10.9/5.9 46129870 1421

19Ь Белок оболочки карбоксисом 10.9/5.9 46129870 1421

19с Белок оболочки карбоксисом 10.9/5.9 46129870 1421

19(1 Белок оболочки карбоксисом 10.9/5.9 46129870 1421

19е Белок оболочки карбоксисом 10.9/5.9 46129870 1421

58а Рибулозо бифосфат карбоксилаза, малая субъедишща 13.3/5.6 46129874 1427

5вЬ Рибулозо бифосфат карбоксилаза, малая субъедишща 13.3/5.6 46129874 1427

ГруппаП. Транспорт п метаболизм нуклеотияов

20а ИМФ дегидрогеназа/ГМФ редуктаза 40.6/53 46130119 1831

20Ь ИМФ дегидрогеназа/ГМФ редуктаза 40.6/5.3 46130119 1831

20с ИМФ дегидрогеназа/ГМФ редуктаза 40.6/53 46130119 1831

гоа ИМФ дегидрогеназа/ГМФ редуктаза 40.6/53 46130119 1831

Группа 13. Фотосинтез

39а Бета субъединица фикоцианина 18.4/5.2 38900 1052

39Ь Бета субъединица фикоцианина 18.4/5.2 38900 1052

39с Бета субъединица фикоцианина 18.4/5.2 38900 1052

39а Бета субъединица фикоцианина 18.4/5.2 38900 1052

39е Бета субъединица фикоцианина 18.4/5.2 38900 1052

39Г Бета субъединица фикоцианина 18.4/5.2 38900 1052

39в Бета субъедишща фикоцианина 18.4/5.2 38900 1052

57 Пластоцианин 13.4/5.5 45512645 1088

60 рзаЛ белок 15.6/9.3 226392 1002

62 Гипотетический белок 8е1о03000602 (РзаЕ) 8.1/8.0 45512850 1322

Группа 14. Зашита от окислительного стресса

30 Глугатион Э-трансфераза 29.1/5.1 45512374 0788

35 Пероксиредоксин 23.7/4.8 81301258 2449

43 Пероксиредоксин 16.6/5.5 45513396 1942

45 Пероксиредоксин 17.6/5.4 45513279 1806

52а Пероксиредоксин 15.8/4.5 46130348 2180

52Ь Пероксиредоксин 15.8/4.5 46130348 2180

Группа 15. Неизвестные и гипотетические белки

23 Гипотетический белок 43.6/6.4 24414820 0443

25 Гипотетический белок 8е1о03001742 33.5/4.7 45513861 2456

26 Гипотетический белок 8е1о03000717 20.8/5.0 56750131 1434

32 ^охарактеризованный консервативный белок 25.0/6.6 53762884 0620

36 Гипотетический белок 8е1о03002321 11.4/4.5 53763101 0259

41 Гипотетический белок 20.8/5.0 56750131 1434

44 Неизвестный белок 23.0/5.5 24251256 1827

47 Гипотетический белок 8е1о03002005 20.4/8.0 53762906 0575

48 Неизвестный белок 16.9/5.1 24251259 1824

49 Предсказанный мембранный белок 18.3/4.9 45512224 0096

50 Гипотетический белок 8е1о03000898 20.9/6.2 46129994 1613

51 Гипотетический белок 8е1о03000735 16.6/5.1 45512960 1451

55 Неизвестный белок 14.0/4.7 17220757 2094

56 Неизвестный белок 11.8/4.9 24251253 1830

12 Гипотетический белок 46.4/4.9 56750625 0926

2.2. Сравнительный протсомный анализ клеток мутантов с нарушенным клеточным делением и штамма дикого типа цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942.

Более 800 белковых пятен выявлено на каждом из 2-Д гелей, окрашенных Sypro Ruby (Рис. 6). При использовании компьютерной программы PDQuest отобрано для анализа 76 белковых пятен, в которых уровень белка количественно изменен у мутантов по клеточному делению. С помощью MALDI-TOF масс спектроскопии и поиска в базах данных, удалось идентифицировать 53 белковых пятна, представляющих 44 белка, сгруппированных в семь функциональных категорий (Таблица 2). В клетках мутантов возрастает уровень белков, участвующих в морфогенезе клетки и в биогенезе клеточной оболочки, в посттрансляционной модификации белков. Усиливается синтез шаперонов, а также некоторых белков, участвующих в метаболизме глюкозы, аминокислот, в нуклеотидном метаболизме, в синтезе ДНК, в фотосинтезе, в системах защиты от окислительного стресса, а также некоторых белков с неизвестными функциями. Уровень некоторых из идентифицированных бежов в клетках одного из мутантов выше, а в другом - ниже, чем в клетках штамма дикого типа. Например, восемь белков представлены в большем количестве у мутанта Ftn2, а три других белка усиленно образуются только в клетках мутанта Ftn6. Очевидно, мутации в двух различных генах, ftn2 и ftn6, могуг вызывать помимо общих (как отмечено выше), и некоторые специфические для каждой мутации функциональные изменения в цианобактериальной клетке.

В клетках этих мутантов повышен уровень бета субъединицы (DnaN) ДНК полимеразы III, что может отражаться на процессе репликации ДНК и, как следствие, нарушать клеточное деление. Бактерии обладают тремя основными цитоскелетными структурами:

МгеВ структуры, сходные с F-актином, физиологическим полимером актина эукариот (van den Ent, 2001), MinCDE структуры (Shih et al, 2003) и внутриклеточные филаменты, содержащие белок EF-Tu (Mayer, 2003). Экспрессия двух из этих белков, МгеВ (SSP 4401) и EF-Tu (SSP 3603) заметно усилена (Таблица 2) у мутантов Ftn2 и Ftn6. Функция гена тгеВ может заключаться также в регуляции последовательности событий во время деления и элонгации клетки. Повышенный уровень белка МгеВ в мутантах Ftn2 и Ftn6 позволяет предположить существование возможной прямой или опосредованной негативной регуляции гена тгеВ продуктами генов ftn2 и ftnô.

Уровни двух белков, вовлеченных в белок-белковые взаимодействия и процессинг/деградацию белков, снижены у обоих мутантов. Лейцил аминопешидаза (SSP 2606, Таблица 2), обнаружена только в экстракте белков из штамма дикого типа. Фермент является экзопептидазой, которая селективно удаляет N-концевые аминокислотные остатки из полипептидов и белков, вовлеченных в процессинг внутриклеточных белков (Gonzales et al, 1996). Белок, содержащий FHA домен (SSP 2203) отсутствует в клетках мутанта Ftn6 и его экспрессия снижена в клетках Ftn2. Этот маленький белковый мотив (FHA домен) отвечает за узнавание фосфотреониновых, фосфосериновых и иногда фосфотирозиновых пептидов в белках (Durocher and Jackson, 2002). Экспрессия шаперонов SSP 6913 (GroEL) и SSP 0202 (Grp E) усиливается у мутантов по клеточному делению.

Результаты исследования демонстрируют количественное влияние мутаций в генах ftn2 и ftnô как на целый ряд известных, так и функционально не идентифицированных белков. Плейотропное проявление мутаций затрагивает различные физиологические процессы. Это может быть обусловлено: 1) стрессом, вызванным изменением морфологии клетки; 2) нарушением прямых или

косвенных регуляторных свойств белков FTN2 и FTN6, 3) проявлением компенсаторных механизмов, с помощью которых клетка «приспосабливается» к блокированному клеточному делению. Идентификация функций различных белков, уровень которых изменяется в результате мутаций в генах ftn2 или finó, даст новую информацию о механизмах координации систем, участвующих в процессе деления цианобактериальной клетки.

- » л. .

w t ■•■ --í

v V^feíífxjMí

Г ! t Ч л bv^'í

¿ЮГ*: ^ .-'v

. ^ r. .. - .'esiroo*.1. '

H^fps«^ "я«»

^.•¿iÇ'jJH^iWi.

i л

ifu > IB kDa

.■íí.síssvsí • "

/14 .. .fí--"*.. --f . ' . > -, *

«teol „

- //~1 -s,»»» , »

v- -'^'П £1 Ï ,

Л : ^АЧщк а .»'Д.

e ^ ^Ííj. ., -

j, Ц^-'' " ' T~;,'¿j- / '

pï3_i-S « 7

--¿л

г;. i ♦

4 5 6 7 8 9

í¡>

is-

Рисунок 6. Белки клеток Synechococcus sp. PCC 7942, обнаруженные с помощью двумерного электрофореза (окрашивание с помощью SYPRO Ruby, диапазон рН 3-10): синтетический гель, созданный по программе PDQuest (а), штамм дикого типа (b), Ftn2 мутант (с), Ftn6 мутант (d). Белковый стандарт молекулярного веса (ось у) и изоэлектрические точки (ось х). Идентификация каждого помеченного пятна, чья экспрессия изменена у мутантов, представлена в Таблице 2.

Таблица 2. Идентифицированные белки, экспрессия которых изменена в клетках мутантов по клеточному делению 8упес1юсоссш ер. РСС 7942

Номер белка

Название белка и номер соответствующего гена в геноме S.7942

Предпо- Номер в лагае- базе

мне данных

Мм/р1(с) NCB1

Уровень экспрессии ( условные единицы) Дикий Рт2 Ртб

тип мутант мутант

3608* 0701

4401

0903

1912

3603 6707

40.5/4.9 64.1/4.6

974615 46129703

1. Клеточный цикл и морфогенез клетки Бета субъединица ДНК полимеразы III (0001)

Сегрегирующая хромосому АТФаза (1139)

Аетиноподобная АТФаза, вовлеченнаяв морфогенез клетки (Мге В) (0300)

Молекулярный шаперон (Hsp70) (2468)

Белок внешней мембраны / защитный антиген ОМА87 (0928)

2. Синтез п модификация белков ГТФаза - фактор элонгации трансляции (0884) Полнрибонуклсотид нуклеотидилтрансфераза(полинуклеотид фосфорилаза) (2440)

35.0/5.1 81299111

67.8/4.7 46130530

76.9/5.0 46129574

44.2/5.2 46129550

77.2/5.1 46130513

1474 3005

557 621

1857 3094

4781 6240

138

3687 0

482

7040 1123

1911 274

3291

5158

281

6077 541

9001 РНК-связывающий белок (ЯКМ домен) (0790) Рибосомальный белок 81 (1591) 15.4/6.4 45512376 1673 5300 293

3305 31.8/5.2 22002498 1313 1974 2121

2606" | Лейцил аминопептидаза (1190) 51.1/5.0 46129730 1201 0 0

8503 6913 0202 4203 Периплазматическая протеаза (0712) Шаперон вгоНЬ (НЭРбО семейство) (0685) Молекулярный шаперон бгрЕ (белок теплового шока) (2072) ТРИ. повтор (0531) 46.3/8.9 58.2/4.8 23.0/4.7 31.7/5.4 53762820 53762838 45513516 53762940 1257 0 2726 1133 2627 372 5463 1352 1328 127 3667 2154

2203 БНА домен (0565) 24.5/5.0 53762913 715 444 0

3. Фотосннтез

9002 рзаО-белок, ФС1 (1002) 15.6/9.3 226392 3808 231 111

7002 рБаО-белок, ФС1 (1002) 15.6/9.3 226392 7879 0 0

6003 Гипотетический белок 8е1о03002341, Белок фикобшшеом (0240) 18.2/6.3 45512096 1336 304 0

8007 Гипотетический белок Эе1о03002341, Белок фикобилисом (0240) 18.2/6.3 45512096 930 1052 291

7301 Гипотетический белок 8е1о03000334, Белок фикобилисом (1050) 31.7/9.1 46129650 787 169 142

7304 Гипотетический белок 8е1о03000334, Белок фикобилисом (1050) 31.7/9.1 46129650 1690 958 306

7308 Гипотетический белок 8е1о03000334, Белок фикобилисом (1050) 31.7/9.1 46129650 2774 2047 1455

4002 Гипотетический белок 8е1о03000332, Белок фикобилисом (1053) 17.3/5.4 45512619 13241 6677 3496

6002 Гипотетический белок 8е1о03000332, Белок фикобилисом (1053) 17 3/5 4 45512619 9154 697 457

0209 Мп-стабилизирующий белок, ФСН (0294) 29.5/5.0 142156 1692 3254 7312

4. Защита от окислительного стресса и редокс-контроль

0204 Пероксирсдоксин (2309) 22.0/4.7 45513728 6063 12477 10824

0006 | Тиоредоксин (1793) 12.0/4.5 46130096 917 779 44

7203 Белок, вовлеченный в биосинтез 23.7/6.1 53763070 797 3826 710

убихитина(0304)

8203 Белок, вовлеченный в биосинтез 23.7/6.1 53763070 886 7673 461

8305

7204

7004

5001

8801 8802

4704

7102

1909

4301

4504 2704

7101

7306

8408 0107

1003

6608

4503

4507

1301

0207 2703 3605

убихитина (0304)

5. Фиксация углекислоты и углерод-концентрнрующнй механизм Регулятор транскрипции (1980)

Цепь Л, рибулозо 1,5 бифосфат карбокснлаза ОКСИГЕНАЗА (1426) Малая субъединица рибулозо бифосфат

карбокснлазы (1427) Малая субъединица рибулозо бифосфат

карбокснлазы (1427) Углеродная ангидраза/ацетилтрансфераза (1423)

Углеродная ангидраза/ацетилтрансфераза (1423)

6. Образование энергии и различные биосинтстичсскис процессы Пируват/2-оксоглутарат дегидрогсназный

комплекс,дигидролипоамид дегидрогеназный (ЕЗ) компонент (1198) Дельта субъединица АТФ синтезы F0F1-типа (0335) Фруктозо/тагатоза бифосфат альдолаза (1443)

Фруктозо/тагатоза бифосфат альдолаза (1443)

36.6/6.3 45513432 514 716 195

52.2/6.1 576253 1406 0 0

13.3/5.6 46129874 10921 0 15776

13.3/5.6 46129874 7609 1606 2921

53.1/6.9 46129871 883 536 1227

58.1/6.9 46129871 1900 957 1955

51.1/5.2 46129736

286

19.5/6.2 39.1/5.3 39.1/5.3

53763057 46129889 46129889

Диаминопимелатэпимераза(1927) 30.3/4.8 46130191

N-ацетилглутамат синтаза (1896) 43.6/4.9 46130169

Глутамин синтетаза (2156) 50.5/4.5 46130337

Арпшиносукцинат синтаза (0009) 43.7/5.2 53763244

Фосфорибозилформилглицинамидин 83.1/7.8 53763249 (FGAM) синтаза (0003)

Фосфорибозиламиноимидазол синтаза 37.4/5.0 45512432 (0851)

IMP дегидрогеназа/GMP редукгаза (1831) 40.6/5.3 46130119

AICAR трансформилазаЛМР 54.6/5.0 53763017 циклогидролаза PurH (0396)

Дегидрогеназа с различными 25.5/5.4 53762839 специфичностями (0684)

Бета субъединица ацетил-коэнзим А 34.1/6.2 45513409 карбокснлазы (1956)

7. Неизвестные и гипотетические белки

Гипотетический белок (0443) 43.6/6.4 24414820

Гипотетический белок Selo03002321 11.4/4.5 53763101 (0259)

Гипотетический белок Selo03000898 20.9/6.2 46129994 (1613)

Неизвестный (2483) 52.1/8.9 25019695

987 4П 3S5

2904 6058 3932

8515 13079 12787

1315 2910 3943

437 1002 566

1330 470 0

1391 1473 522

735 354 220

1600 1473 2125

1229 2474 899

354 1241 433

2258 1081 1877

1961 771 525

163 732 167

3310 5999 6071

4052 8130 6301

338

276

Примечание: а) жирным шрифтом выделены белки, уровень которых возрастает в обоих мутантах; б) в рамку взяты те белки, уровень которых снижен у обоих мутантов; с) Мм- молекулярная масса белка, р1 - изоэлектрическая точка белка.

3. Выделение и молекулярно-генетическпй анализ новых ДНК-связывающих белков, участвующих в регуляции клеточной дифференцировки цианобактерии Anabaena sp. FCC 7120

У нитчатой цианобактерии Anabaena sp. FCC 7120 процесс азотфиксации тесно связан с клеточной дифференцнровкой и межклеточными взаимодействиями. В присутствии аммония или нитрата, филаменты цианобактерии Anabaena состоят целиком из фотосинтезирующих вегетативных клеток. Когда же источники фиксированного азота отсутствуют, вегетативные клетки начинают с определенной регулярностью дифференцироваться в специализированные клетки, гетероцисты, в которых осуществляется фиксация N2, но прекращается фотосинтез. В ходе дифференцировки гетероцист происходят метаболические и структурные изменения, которые регулируются каскадным механизмом с участием транскрипционных активаторов, о координированном функционировании которых еще мало известно.

Для изучения механизмов регуляции процесса дифференцировки гетероцист у цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120 мы использовали сочетание биохимических и молекулярно-генетических подходов. Выделены и идентифицированы белки, которые взаимодействуют с последовательностью ДНК Х12 размером 150 пн., расположенной перед геном hepC (Рис.7), контролирующим формирование зрелых гетероцист (Wölk, 2000). Эта последовательность выявлена в результате проведенного Gel-shtö анализа по специфичному связыванию фрагментов ДНК с белковым экстрактом из клеток цианобактерии.

■656

-378 -311 -167

АТС

-580 -503 -255 -166

-656

I Х11

Х1

ЬерС |Дт[

[ вг | +1 ИерА

-527

-378

Рисунок 7. Схема участка ДНК АпаЬаепа РСС 7120, кодирующего белки НерС и НерА, с прилежащими районами. Для выделения ДНК-связывающих белков использовали фрагмент ДНК, обозначенный на схеме как XI2.

ДНК-связывающие белки очищены в четыре этапа из экстракта вегетативных клеток и проанализированы по пептидному составу. Молекулярно-генетическая идентификация соответствующих пептидов была проведена при использовании данных о полной нуклеотидной последовательности генома АпаЬаепа зр. РСС 7120 (Капеко е1 а1., 2001). Выявлено четыре белка, характеризующихся близкой молекулярной массой. Два их этих белков (АЬр1 и АЬр2) кодируются соседними генами (а!11939, аП1940) в хромосоме АпаЬаепа эр. (Таблица 3). Гены, кодирующие третий (АЬрЗ) и четвертый белки (АЬр4) расположены в двух других локусах, а1г3608 и а1г4240, соответственно. Инсерционные мутации в генах аЪр2 и аЬрЗ блокируют экспрессию ИерС и керА (Рис.8), и предотвращают созревание гетероцист и аэробную фиксацию N2. Мутанты по генам аЬр! и аЬр4 имеют нормальный фенотип и способны к азотфиксации. Белки АЬр2 и АЬрЗ могут функционировать как активаторы экспрессии генов ИерС и НерА. В клетках мутантов АЬр2 и АЬрЗ не образуются гликолипиды, специфичные для гетероцист (Рис. 9).

Таблица 3. Характеристики ДНК-связываюпгах белков, выделенных из

клеток Anabaena sp. 7120.

Белок Abpl Abp2 АЬрЗ АЬр4

Кодирующий ген (http://www. kazusa.or.jp/ cyano/Anabaena) Ы11940, abpl Ы11939, abp2 Ыг3608, аЬрЗ а1Ы240, abp4

Количество аминокислот 512 512 552 523

Молекулярная масса (кДа) 57.754 56.782 58.272 58.748

Изоэлектрическая точка 7.74 9.61 9.41 8.93

Мотив Семейство инсулиназ, связывание с цинком Не отмечено Домен, характерный для белков С-слоя Последовательность из лейцинов

BLAST search (частичная гомология с известными белками) Пептидаза sli 0915 Synechocystis sp, РСС 6803 (идентичность 58 %) Пептидаза sir 1331 Synechocystis PCCsp. 6803 (идентичность 52%) Белок адгезии N05100 рипсИ/огте РСС 73102 (идентичность 75%) Гемолизин подобный белок Synechocystis sp. РСС 6803 (идентичность 40%)

Белки Abpl и АЬр2, специфично связывающиеся с ДНК, имеют гомологию с пептидазами (Таблица 3). Белок АЬр2 проявляет сходство с митохондриальными процессирующими пептидазами, Мрр. Бактериальный гомолог Мрр, пептидаза MlpA Bacillus subtilis, также может участвовать в транскрипции и/или секреции 1руппы белков (Bolhuis et al, 2000). В случае Lon протеазы из клеток Escherichia coli, показано, что она связывается с ДНК специфично и является важным регуляторным белком (Fu et al., 1997). Предполагается, что Lon протеаза специфично связывается с ДНК в непосредственной близости от участка, взаимодействующего с каким-то другим регуляторным белком, деградацию которого и осуществляет. ДНК-связывающий белок CND41 из хлоропластов табака (Murakami et al., 2000) также характеризуется протеазной активностью. Обсуждая ДНК-связываюшую активность и возможное участие в регуляции генов белка АЬрЗ Anabaena sp. РСС 7120,

гомологичного белкам С-слоя бактерий, можно провести аналогию с белком, SlpM Thermus thermophilus НВ8, который участвует в регуляции экспрессии гена slpA, кодирующего один из белков поверхностного слоя клеток (Fernández-Herrero, et al. 1997). С помощью инсерционной инактивации гена slpM показано, что его функция /'п vivo заключается в активации транскрипции гена slpA.

Наши данные пополняют ряд примеров (Bes et al, 2001; Cronan, 1989; Kyrpides and Ouzounis, 1995; Prior et al, 1993), демонстрирующих, что белки, не имеющие известного ДНК-связывающего домена, тем не менее, могут взаимодействовать специфично с ДНК и участвовать в регуляции транскрипции. Таким образом, при прогнозировании возможной функции белков нельзя полагаться только на их гомологию с уже известными белками, обнаруживаемую с помощью компьютерных программ: необходима экспериментальная проверка свойств анализируемых белков.

Инсерционные мутанты по генам аЪр2 и аЬрЗ не способны фиксировать атмосферный азот. С помощью тонкослойной хроматографии показано, что у этих мутантов отсутствуют специфичные для оболочек гетероцист гликолипиды, что приводит к нарушению морфологии клеток (Рис.9). Дефектные гетероцисты лишены плотных защитных оболочек, что и является причиной утраты нитрогеназной активности, чувствительной к кислороду. В мутантах АЬр2" и АЬрЗ" отсутствует экспрессия генов hepC и hepA, что позволяет предположить участие белков АЬр2 и АЬрЗ в регуляции экспрессии этих генов.

Дикий тип

аЬр2

мутант

1 2 3 4 5 6 7 8

hepC

аЬрЗ

мутант

1 2 3

5 6 7 8

hepA

rnpB

hepC

hepA

Рисунок 8. Транскрипты ИерС и ИерА в штамме дикого типа и мутантах АпаЬаепа ер. штамма РСС 7120, Норзерн гибридизация с ИерС и ИерЛ зондами показывает индукцию экспрессии соответствующих генов через 10 часов в ответ на азотное голодание клеток штамма дикого типа АпаЬаепа ер. Индукция экспрессии отсутствует у мутантов аЬр2 и аЬрЗ. Зонд гпрВ использован как контроль нанесения образцов на гель. 1: клетки росли в присутствие нитрата, не отмыты; 2: клетки сразу после отмывки от среды с азотом; 3-8: отмытые клетки голодали по азоту в течение 3,6,10,24, 30, и 48 часов, соответственно.

Рисунок 9. Клетки мутантов аЬр2 и аЬрЗ формируют полисахаридную капсулу гетероцист, но лишены гликолипидного слоя. (В; см. выделенный участок на рисунке А). В гетероцистах штамма дикого типа АпаЬаепа. виден слой гликолипидов (гликолипидные слои располагаются вертикально на фото В) обернутый слоем полисахаридов. Только полисахаридный слой виден в гетероцистах мутанта аЬрЗ (О; выделенный участок на С) или мутанта аЪр2 (Р; выделенный участок на фото Е; и Э). Н, гетероциста; V, вегетативная клетка; И., гликолипидный слой; Р8, полисахаридный слой.

4. GAPDH-гены цианобактерий и их роль в клеточном метаболизме.

4.1. Генетические и биохимические доказательства различных функций двух дивергированных GAPDH генов в катаболическом и анаболическом путях метаболизма углерода в цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803.

В растениях фотосинтетический цикл Кальвина и гликолиз/глюконеогенез функционируют в двух различных метаболических системах клетки, в хлоропласте и в цитоплазме, соответственно. Эти системы разделены физически оболочкой хлоропласта, несущей набор специфических транспортных систем (Stitt, 1990). Как следствие этого, разнообразные реакции, общие для обоих метаболических путей, катализируются различными изоферментами, уникальными для каждого компартмента (Gottlieb 1982). Хлоропластная и цитоплазматическая глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) являются примером таких изоферментов. Они катализируют одну и ту же реакцию:

1,3-бифосфоглицерат + НАД(Ф)Н глицеральдегид-3-фосфат + НАД(Ф)+, но различаются по субстратной специфичности, составу субъединиц и первичной структуре (Cerff 1982; Martin, Cerff 1986; Brinkmann et al, 1989).

В отличие от растений и водорослей, свободноживущие цианобактерии не имеют органелл и морфологических барьеров, разграничивающих биосинтетические реакции цикла Кальвина от реакций гликолиза/глюконеогенеза. Поэтому можно было бы ожидать, что функционально эквивалентные реакции в анаболическом и катаболическом путях цианобактерий катализируются амфиболическими ферментами. Однако, сообщения о молекулярном клонировании нескольких GAPDH генов в клетках Anabaena variabilis

(Martin et al., 1993) не согласуются с этим взглядом. Три отдельных, достаточно сильно дивергированных GAPDH гена обнаружены у этой цианобактерии. Два гена, gapl и gap2, функционально гомологичны эукариотическим ядерным генам GapC и GapAB, кодирующим соответственно цитогогазматическуго и хлоропластную GAPDH. Исходя из этих данных была предложена гипотеза о том, что оба эукариотических гена, кодирующих как хлоропластную, так и цитоплазматическую GAPDH, были перенесены в ядро соответственно от эубактериальных предшественников хлоропластов и митохондрий (Liaud et al, 1994; Martin et al, 1993; Cerff 1995).

Структурные характеристики ясно указывали на филогенетическую связь между gapl цианобактерий и GapC растений с одной стороны, и gap2 и GapAB, с другой стороны, но функциональная роль gapl и gap2 в метаболизме цианобактерий не была установлена. С помощью методов молекулярной генетики мы исследовали функции генов gapl и gap2 Synechocysis РСС 6803. Эти гены были клонированы и секвенированы, а затем подвергнуты инсерционному мутагенезу. В полностью сегрегированных мутантах были изучены функции этих ферментов, кодируемых gapl и gap2 генами. Мутанты проявляли реципрокные физиологические фенотипы в условиях анаболического или катаболического роста. Клетки мутанта gapl' не способны расти в среде с глюкозой в темноте, но растут с органическими кислотами и в фотоавтотрофных условиях. Клетки мутанта gap2~ росли только с глюкозой в темноте и не могли расти на свету фотоавтотрофно. Измерение анаболической активности (восстановление 1,3-бифосфоглицерата) в экстрактах из клеток штамма дикого типа и мутантов показало, что Gap2 является главным ферментом с двойной косубстратной специфичностью к НАД и НАДФ, тогда как Gapl проявляет только минорную НАД-

специфичную GAPDH активность. Однако, при измерении реакции в катаболическом направлении (окисление глицеральдегид-3-фосфата), обнаруживается низкая активность Gap2, которая возрастает в 3-5 раз после фильтрации бесклеточных экстрактов через Sephadex G25. Полученные результаты позволили предположить, что ферменты Gapl и Gap2, хотя и экспрессируются одновременно в клетках штамма дикого типа, играют различную роль в метаболизме. Фермент Gap2 функционирует в фотосинтетическом цикле Кальвина и глюконеогенезе, a Gapl, по-видимому, необходим для гликолиза, когда катаболическая активность Gap2 репрессируется специфическим низкомолекулярным ингибитором.

4.2. Gapl-onepoH цианобактеригг Syneckococcus sp. FCC 7942 кодирует гликогенфосфорилазу и индуцируется в анаэробных условиях.

В экспериментах по Нозерн-гибридизации мы обнаружили, что gapl ген транскрибируется в Syneckococcus sp. РСС 7942 как протяженная молекула РНК (Рис.10). Sail геномный фрагмент ДНК, с геном gapl, был субклонирован в плазмиде pBluescript и секвенирован. Длинная открытая рамка считывания (ОРС) была идентифицирована после З'-конца гена gapl на расстоянии 295 пн. Анализ аминокислотной последовательности на основе базы данных GeneBank выявил значительное сходство этой ОРС с генами, кодирующими гликогенфосфорилазы из различных организмов. Нуклеотидная последовательность гена glgP была депонирована в базе данных GenBank под номером AF 428099. Обнаруженный в геноме Synechococcus sp. РСС 7942 новый gap-кластер отличается от gap-оперонов из других организмов, поскольку содержит как gapl, так и ген, кодирующий гликогенфосфорилазу - аллостерический

фермент, принимающий участие в метаболизме бактериального гликогена (Schinzel and Nidetzky, 1999). Экспрессия оперона gapl-glgP усиливается в анаэробных условиях (Рис.11). Таким образом, впервые показано, что у фотоавтотрофной цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 два гена, кодирующие гликолитические ферменты (GAPDH и GLGP) котранскрибируются и их экспрессия активируется в анаэробиозе.

Рисунок 10. Гибридизация РНК из клеток штамма дикого типа S. 7942 с ДНК- зондами gap! и glgP. Клетки росли в течение 2 дней на ярком свету и с 1% С02(1) и потом были перенесены на 24 часа в анаэробные условия (2). M-маркер молекулярной массы (в нуклеотидах).

gapl- зонд 1 2 3 4 М

Рисунок 11. Экспрессия оперона дар!- д^Р усиливается в анаэробных условиях. РНК из клеток дикого типа 5. 7942 гибридизовалась с ДНК -зондом gapl. Клетки росли в течение 5 дней при низкой интенсивности света(1500 люкс) на воздухе (1) и потом переносились на 28 часов в условия: яркий свет (3000 люкс) и воздух (2); яркий свет и анаэробиоз (3); свет низкой интенсивности и анаэробиоз (4).

М - маркер молекулярной массы (в нуклеотидах).

4.3. Экспрессия гена gap3 цианобактерни Synechococcus sp. РСС 7942 в условиях адаптации к низким концентрациям С02

Цианобактерии Synechococcus и АпаЪаепа обладают геном gap3, функция которого неизвестна. Ранее полагали, что он имеется только у некоторых прокариотических организмов, но недавно этот ген был обнаружен и у эукариот (Qian, Keeling, 2001). Для выявления условий экспрессии гена gap3 в клетках Synechococcus sp. РСС 7942 были проведены эксперименты с использованием метода Нозерн гибридизации. Ген gap3 не экспрессируется в клетках, выращиваемых в стандартных лабораторных условиях. Экспрессия этого гена индуцируется в условиях адаптации клеток к низким концентрациям углерода при высокой освещенности. Ген gap3 экспрессируется в виде протяженной мРНК, вероятно, отражающей оперонную организацию геномного района. Секвенирование прилегающей к gap3 гену последовательности ДНК позволило обнаружить другой ген (1259 п.н.), который перекрывается на 4 нуклеотида с геном gap3 (Рис.12). Этот ген предположительно кодирует мембранный белок, имеющий гомологию с белками-транспортерами. Нуклеотидная последовательность этого гена, кодирующего белок-транспортер была депонирована в базе данных GenBank под номером AF 428100. В геноме Synechococcus sp. РСС 7942 ему соответствует открытая рамка считывания syf:Synpcc7942_1940 (Рис.12).

Опыты по гибридизации РНК, выделенной из клеток Anabaena variabilis АТСС 29413, позволили обнаружить сходную картину. Ген gap3 экспрессировался как моноцистронная мРНК в стандартных условиях роста (1%С02, яркий свет) и транскрибировался в виде длинной мРНК при адаптации клеток к низкой концентрации С02 в условиях яркой освещенности (Рис. 13).

Рисунок 12. Схемы gapЗ генных кластеров в геномах Зупескососсиз Бр. РСС 7942 и АпаЪаепа уапаЫШ АТСС 29413.

В рамке заглавными буквами представлены нуклеотиды, по которым перекрываются ОРС 1939 (ЯарЗ) и 1940.

сддсадЬАТвАдиссд

6533

Рнсунок 13. Гибридизация по Нозерну суммарной РНК из клеток дикого типа АпаЬаепа уапаЫШ АТСС 29413. В качестве гибридизационного зонда использован ген ¿арЗ. Клетки росли в течение 3 дней на ярком свету с 1% СО:(1) и потом перенесены на яркий свет в условия низкого содержания углерода в воздухе (0.03% С02) на 8 часов (2), на 24 часа (3), на 48 часов (4). М - маркер молекулярной массы (в нуклеотидах).

Способность быстро приспосабливаться к изменяющимся условиям окружающей среды очень важна для роста и выживания бактерий в их природном окружении. Для того чтобы оптимизировать фиксацию углерода в условиях, лимитирующих концентрацию СОг, цианобактерии используют СОг-концентрирующий механизм, который обеспечивает активный транспорт неорганического углерода

для увеличения концентрации СОг вблизи главного карбоксилирующего фермента - рибулозобифосфаткарбоксилазы (Kaplan et al., 1994). Молекулярные механизмы этого процесса до сих пор недостаточно изучены. Гомология генного продукта syf:Synpcc7942_1940 с некоторыми транспортными белками позволяет предположить, что он также выполняет транспортные функции. Один из предполагаемых НСОз" специфичных транспортеров был идентифицирован при анализе мутанта CCM-IL-2 цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 (Bonfil et al., 1998). Этот транспортный белок не имеет никакой гомологии с продуктом syf:Synpcc7942_1940. Вполне вероятно, что клетки Synechococcus sp. РСС 7942 содержат несколько различных IICO3' переносчиков, которые могут обеспечить цианобактериальную клетку углеродом в различных условиях окружающей среды. Мы предполагаем, что роль гена gap3 может быть связана с активностью углерод-концентрирующего механизма в клетках цианобактерий Synechococcus sp. РСС 7942 и Anabaena variabilis АТСС 29413.

5. Получение мутантов цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 для разработки систем клонирования генов фотосинтеза и устойчивости к гербицидам

У Synechocystis sp. РСС 6803 с использованием ингибиторов фотосинтеза в качестве селектирующих агентов получена коллекция ФС-мутантов, неспособных к фотоавтотрофному росту. Исследование первичных реакций фотосинтеза в клетках ФС-мутантов показало, что они характеризуются нарушениями электронного транспорта, связанного с функцией фотосистемы II. На основании данных по перекрестной генетической трансформации ФС-мутанты были разделены на несколько групп, имеющих различные^ генетические

П^ГТГхТиши ' ■ ; '

< -И- 'Зз

и.

повреждения (Таблица 4). Из геномного банка штамма дикого типа 8упесЬосу$1Ы эр. РСС 6803 с помощью генетической трансформации ФС-мутантов выделены фрагменты ДНК, восстанавливающие способность к фотосинтезу у различных групп мутантов. Эти фрагменты были использованы другими исследователями для клонирования и молекулярно-генетического анализа генов, кодирующих белки фотосистемы II (Еланская и др., 1993; Егтакоуа е! а!., 1995).

Таблица 4. Перекрестная генетическая трансформация ФС-мутантов по признаку возвращения к фотоавтотрофпостп.

Штамм реципиент Донор хромосомной ДНК

Дикий тип РМВ-1 РК-7 РК-4 РК-12 Д-13 Д-21

РМВ-1 + - + + + + +

РК-7 + + - + + + +

РК-4 + + + - + + +

РК-12 + + + + - + +

Д-13 + + + + + - +

Д-21 + + + + + + -

Таблица 5. Устойчивость клеток штамма дикого типа и мутантов З^иесАосуя'и 6803 к ингибиторам фотосинтеза при роете на плотной среде.

Тип мутанта Число стабильных мутантов Ингибитор фотосинтеза Устойчивость (концентрация, х10"3М)

Дикий тип мутант

3 диурон 1 50 (Ог-1)

Бш 9 диносеб 5 70 (От-2)

РЯ 4 ПХМБ 1 30 (Р1*-3)

Выделена серия мутантов Synechocystis sp. РСС6803, устойчивых к ингибиторам фотосинтеза: диурону, диносебу, парахлормеркурибензоату (Таблица 5). Признак устойчивости к этим агентам передается клеткам штамма дикого типа с помощью генетической трансформации. Эти мутанты были использованы сотрудниками кафедры генетики МГУ для клонирования и идентификации генов, ответственных за резистентность к ингибиторам фотосинтеза.

Таким образом, в данной работе получены несколько групп мутантов цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, использование которых позволяет клонировать гены, контролирующие фотосинтез и гены, ответственные за устойчивость к некоторым гербицидам. Клонированные гены цианобактерии могут найти применение в генетической инженерии растений. Мутанты были использованы для изучения фотосинтетического электронного транспорта на кафедре биофизики МГУ и механизмов фиксации углерода на кафедре микробиологии МГУ.

6. Создание мутантных штаммов цианобактерии Anahaena variabilis, способных продуцировать молекулярный водород.

Водород является экологически чистым видом топлива, представляющим значимую альтернативу традиционным источникам энергии, запасы которых ограничены. Азотфиксирующие цианобактерии используют энергию света для образования аммиака и водорода в процессе фиксации азота и биофотолиза воды.

Целыо данной работы было выделение и изучение мутантов нитчатой азотфиксирующей цианобактерии Anabaena variabilis с измененным метаболизмом водорода и способных к выделению значительного количества водорода в атмосфере воздуха.

В результате химического мутагенеза и последующей селекции отобраны два штамма, РК84 и РК17, способные к выделению водорода не только в атмосфере аргона, но и на воздухе. На рисунке 14 представлены результаты определения уровней выделения водорода и восстановления ацетилена клетками мутанта PKI7 и штамма дикого типа Anabaena variabilis. Мутант характеризуется значительно более высоким уровнем выделения водорода по сравнению со штаммом дикого типа. Выделенные мутантные штаммы Anabaena variabilis нашли применение при разработке технологии получения молекулярного водорода в фотобиореакторах (Sveshnikov et al., 1997; Tsygankov et al, 1998; Tsygankov et al., 1999; Borodin et al., 2000; Fedorov et al., 2000; Fedorov et al., 2002).

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

'• f Л» >.

ЬШ;

Шг-

.¡¿гЛ...

тя

......

-OZ5.

.0.4-6

¡□воздух С2Н4 ■ воздух Н2 □ аргон С2Н4 Шаргон Н21

Рисунок 14. Уровни восстановления С2Н4 и выделения Н2 клетками штамма дикого типа (1) и мутанта РК17 (2) Anabaena variabilis в разных условиях инкубации.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1). С применением метода транспозонного мутагенеза выявлены новые гены Synechococcus sp. РСС 7942, ftn2 и ftnô, контролирующие деление клеток цианобактерий.

2). Ген ftn2 имеет гомологов в цианобактериях, зеленых растениях и водорослях; ген ftnô специфичен для цианобактерий.

3). Ортологи продуктов генов ftn2 и ftnô в цианобактерии ЛпаЪаепа sp. РСС 7120 участвуют не только в клеточном делении, но и в дифференцировке клеток.

4). В построенной белковой «карте» клеток штамма дикого типа цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 представлены белки, участвующие в основных метаболических процессах, проходящих в активно растущей цианобактериальной культуре.

5). Экспрессия 44 различных белков изменена в клетках мутантов Ftn2 и Ftnô Synechococcus sp. РСС 7942.

6). Выявлены и изучены ранее неизвестные ДНК-связывающие белки АЬр2 и АЬрЗ цианобактерии АпаЪаепа РСС 7120, необходимые для активации экспрессии генов hepA и hepC в ходе клеточной дифференцировки и образования гликолипидов, специфичных для гетероцист.

7). Методами обратной генетики и ферментного анализа показана роль двух gap генов, кодирующих глицеральдегид-3-фосфат -

дегидрогеназы. Белок Gap2 функционирует в фотосинтетическом цикле Кальвина и глюконеогенезе, Gapl функционирует в гликолизе, в условиях, когда катаболическая активность Gap2 репрессируется специфическим низко молекулярным ингибитором.

8). Ген gapl экспрессируется в составе оперона gapl-glg в клетках Synechococcus sp. РСС 7942 и его экспрессия усиливается в анаэробных условиях; ген gap3 в клетках Synechococcus sp. РСС 7942 и в Anabaena variabilis экспрессируется в составе оперона в условиях адаптации клеток цианобактерий к низким концентрациям С02.

9). Создана коллекция мутантов Synechocystis sp. РСС 6803, дефектных по фотосинтезу и мутантов, устойчивых к некоторым ингибиторам фотосинтеза.

10). Выделены мутанты цианобактерии Anabaena variabilis, способные к активному выделению молекулярного водорода в аэробных условиях; эти мутантные штаммы перспективны для использования в фотобиотехнологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полухина Л.Е., Кокшарова O.A., Майсурян H.A., Шестаков C.B. Мутанты цианобактерии Anabaena variabilis, устойчивые к метионинсульфоксимину и метронидазолу. Вестник МГУ. Серия 16. Биология, 1985, № 2, стр.59-65.

2. Кокшарова O.A. Изучение мутантов цианобактерии Synechocystis 6803, неспособных к фотоавтотрофному росту. В сб.: Проблемы современной биологии. Труды 17 Научной конференции молодых ученых биологического факультета МГУ. М. ВИНИТИ, 1986, № 6662-И. Деи, ч.З, cip. 40-44.

3. Shestakov S., Koksharova О., Elanskaya I. Mutants of the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 unable to grow photoautotrophically. Abstr. XIV Internat. Congress of Microbiology, Manchester, England, 1986, p.110.

4. Шестаков C.B, Еланская И.В., Кокшарова O.A. Цианобактерии -модельные объекты для клонирования генов, ответственных за фотосинтез. Тезисы Всесоюзной конференции « Новые методы биотехнологии», Пущино, 1986, стр.139.

5. Кокшарова O.A., Ермакова С.Ю., Гримм Р. Использование мутантов, неспособных к фотоавтотрофному росту, для клонирования и анализа генов фотосинтеза цианобактерии Synechocystis 6803. В сб: Труды 18 научной конференции молодых ученых Биологического факультета МГУ, Москва, 1987, ч.1. № 6652-В87, стр. 187-191.

6. Шестаков С .В., Кокшарова О.А., Грошев В.В., Еланская И.В. Дефектные по фотосинтезу мутанты цианобактерии Synechocystis 6803. Биологические Науки, 1988, № 1, стр.75-80.

7. Кокшарова О.А., Васильев И.Р. Исследование первичных фотопроцессов в клетках мутантов Synechocystis sp. 6803 неспособных к фотоавтотрофному росту. Физиология растений, 1988, т. 35, № 3, стр.472-478.

8. Shestakov S., Elanskaya I., Ermakova S., Koksharova 0., Smirnova T. Isolation of genes controlling the photosynthesis in Synechocystis

sp. 6803 Abstr. VI Internat. Symp. on Phototrophic Prokaryotes, Noordwijkerhout (Netherlands), 1988, p.77.

9. Шестаков C.B., Еланская И.В., Ермакова С.Ю., Андрианов В.М., Ульмасов Т.Н., Кокшарова О.А. Клонирование фрагментов ДНК, восстанавливающих способность к фотосинтезу в клетках мутантов Synechocystis 6803. ДАН СССР, 1989, т.308, № 1, стр. 211-214.

10. Кокшарова О.А., Шестаков С.В. Мутанты цианобактерии Synechocystis 6803, устойчивые к ингибиторам фотосинтеза. Вестник МГУ Сер. 16. Биология, 1990, № 1, стр.42-46.

11. Васильев И.Р., Кокшарова О.А., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Влияние диурона на реакции фотосистемы II у мутантов Synechocystis 6803, устойчивых к диурону. Физиология растений, 1990, т.37, № 1, стр.39-46.

12. Колотилова Н.Н., Кокшарова О.А., Фирсов Н.Н., Ивановский Р.Н. Фотоассимиляция углекислоты цианобактерией Synechocystis sp. 6803 и ее мутантом, неспособным к автотрофному росту. Микробиология, 1990, т.59, № 1, стр.165-168.

13. Полухина JI.E., Кокшарова О.А., Шестаков С.В. Мутанты цианобактерии Anabaena variabilis, способные к выделению молекулярного водорода. Вестник МГУ, Сер. 16. Биология, 1994, № 2, стр. 54-57.

14. Bulteau S, Cassier-Chauvat С., Koksharova О, Chauvat F. Light-regulated promoters from Synechocystis PCC6803 share a consensus motif involved in photoregulation. Abstr. VIII Intemat.Symposium on Phototrophic Prokaryotes, Urbino, Italy, September 1994, p.68B.

15. Schubert M., Koksharova 0., Cerff R., Shestakov S. Structural and functional characterization of two highly divergent glyceraldehade-3-phosphate dehydrogenase genes in Synechocystis PCC 6803. Abstr. Vth Cyanobacterial Molecular Biology Workshop, Asilomar, California, USA, Juli,1995, p.37.

16. Schubert M., Koksharova O., Brinkmann H., Cerff R., Shestakov S. Phylogenetic and functional analysis of two highly divergent GAPDH genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Abstr. German-East European Cooperation Workshop. St.Petersburg, 1996, p.38.

17. Koksharova O., Schubert M., Figger R., Cerff R. Genetic evidence for distinct key functions of two highly divergent GAPDH genes in photosynthetic and non-photosynthetic carbon flow of cyanobacteria.

Abstr. International Conference on Molecular Biology and Genetics of Photosynthesis. Moscow, June 1997, p.13.

18. Koksharova O., Schubert M., Shestakov S., Cerff R. Genetic evidence for distinct physiological roles of two highly divergent GAPDH genes in sugar phosphate metabolism of Synechocystis sp. PCC6803. DC Intemat. Symposium on Phototrophic Prokaiyotes, Vienna, Austria, September, 1997, p.l35B.

19. Koksharova 0., Schubert M., Shestakov S., Cerff R. Genetic and biochemical evidence for distinct key functions of two highly divergent GAPDH genes in catabolic and anabolic carbon flow of the cyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803. Plant Mol. Biol.,1998, v.36/1, p.183-194.

20. Koksharova 0., Wolk C.P. Transcriptional control of hepA during heterocyst formation in Anabaena PCC 7120. Abstr. Xth Internat. Symp. on Phototrophic Prokaiyotes, Barcelona, Spain, 2000, p.193.

21. Zhou R., Koksharova O.A., Wolk C.P. Mechanism of action of HepK from Anabaena sp. strain PCC 7120. Abstr. Xth Internat. Symposium on Phototrophic Prokaryotes, Barcelona, Spain, 2000, p.200.

22. Zhu J., Jager K., Black T., Zarka K., Koksharova O., Wolk C.P. HcwA, an autolysin, is required for heterocyst maturation in Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacterid. 2001, v.183, p.6841-6851.

23. Koksharova O.A., Wolk C.P. Genetic tools for cyanobacteria. Appi. Microbiol. Biotechnol. 2002, v.58, p.123-137.

24. Koksharova O.A., Wölk C.P. Novel DNA-Binding proteins in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 2002, v.184, p.3931-3940.

25. Koksharova O.A., Wölk C.P. A novel gene that bears a DnaJ motif influences cyanobacterial cell division. Abstr, 5th European Workshop on the Molecular Biology of Cyanobacteria. Stockholm, Sweden, 2002, p. 108.

26. Koksharova O.A., Wölk C.P. A novel gene that bears a DnaJ motif influences cyanobacterial cell division. J. Bacteriol. 2002, v.184, pp. 55245528.

27. Vitha S., Froehlich J.E., Koksharova 0„ Руке K.A., van Erp H., Osteryoung K.W. ARC6 is a J-domain plastid division protein and an evolutionary descendant of the cyanobacterial cell division protein Ftn2. Plant Cell. 2003, v. 15. pp.1918-1933.

28. Кокшарова O.A. Экспрессия СорЗ-оперонов в клетках цианобактерий Synechococcus PCC 7942 и Anabaena variabilis АТСС 29413 в условиях адаптации к низким концентрациям С02. Тезисы Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке», Москва, 2003, стр. 111-113.

29. Кокшарова O.A., Брандт У., Церфф P. Gapl-оперон цианобактерии Synechococcus PCC 7942 кодирует гликогенфосфорилазу и индуцируется в анаэробных условиях. Микробиология, 2004, т.73, № 3, стр,388-392.

30. Кокшарова О.А., Лиауд М-Ф., Церфф P. Gap3-ген цианобактерии Synechococcus РСС 7942 экспрессируется в условиях адаптации к низким концентрациям С02. Микробиология, 2004, т.73, № 3, стр. 393-397.

31. Кокшарова О.А. Деление цианобактерий - модель для изучения генетической регуляции деления пластид. Тезисы III Съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 2004, т.1, стр.339.

32. Кокшарова О.А. Идентификация новых генов, контролирующих деление цианобактериальных клеток и пластид растений. Тезисы Международной научной конференции « Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 2004, стр. 78-79.

33. Tikhonov A.N., Trubitsin B.V., Agafonov R.V., Grigor'ev I.A., Kirilyuk I.A., Koksharova O.A., Ptushenko V.V., Mamedov M.D. EPR study of Bioenergetic Processes in Oxigenic Photosynthetic Systems. Abstracts 13th European Bioenergetic Conference (EBEC), Pisa (Italy), 2004, p.262.

34. Trubishin B.V., Ptushenko V.V., Koksharova O.A., Mamedov M.D., Vitukhnovskaya L.A., Grigor'ev I.A., Semenov A.Yu., Tikhonov A.N. EPR study of electron transport in the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803: Oxygen-dependent interrelations between photosynthetic and respiratory electron transport chains. Biochim. Biophys. ActaJBioenergetics. 2005, v.1708, pp. 238-249.

35. Кокшарова О.А., Клинт И., Расмуссен У. Сравнительный анализ белковых различий мутантов по клеточному делению и дикого типа цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 с помощью методов протеомики. Тезисы Международной научной конференции

« Современные проблемы генетики», Минск, 2005, стр. 90.

36. Кокшарова О.А., Клинт И., Расмуссен У. Протеомика Synechococcus sp. РСС 7942. Тезисы Всероссийского Симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы», Москва, 2005, стр. 43.

37. Кокшарова О.А., Клинт И., Расмуссен У. Функциональная протеомика клеточного деления цианобактерии. В сборнике материалов международной научной конференции « Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», Москва, 2006, стр.57.

38. Изобретение: Штамм Anabaena variabilis, используемый для получения молекулярного водорода. Авторское свидетельство № 1271064 от 15 июля 1986 г., зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР.

Авторы: Шестаков С.В., Михеева JI.E., Кокшарова О.А.

39. Изобретение: Биологический способ получения аммония. Авторское свидетельство № 1465457 от 15 ноября 1988 г., зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР.

Авторы: Карякина Е., Орозгожоева В.Б., Стругалина Т., Михеева Л., Кокшарова О., Шестаков С.В., Варфоломеев С.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данные, представленные в диссертации, получены в результате плодотворного сотрудничества с проф. Шестаковым С.В., Михеевой Л.Е., Трошевым В.В., Васильевым И.Р., Колотиловой H.H., Еланской И.В., Карякиной Е., Ермаковой-Гердес С.Ю., проф. Тихоновым А.Н., проф. Семеновым А.Ю., Трубициным Б.В., Птушенко В.В., Мамедовым М.Д. (Россия, МГУ), проф. Церфом Р., Лиауд М.-Ф., Шуберт М. (Германия, Брауншвайгский университет), проф. Уолком П. (США, Университет штата Мичиган), проф. Расмуссен У., Клинт И. (Швеция, Стокгольмский университет), которым автор приносит глубокую и искреннюю благодарность. Автор благодарит за поддержку сотрудников Института общей генетики Муху Д.В., Полухину Г.Н., Кузьмину А., а также преподавателей и сотрудников кафедры генетики Биологического факультета МГУ. Автор благодарит РФФИ за поддержку исследований по функциональной геномике клеточного деления цианобактерий (грант 03-04-49332). Автор приносит глубокую благодарность своим родителям, брату, мужу и детям за постоянную поддержку и понимание.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ЦДО 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 02.10,2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 668. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

¿KZOâA-¿-fffâ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кокшарова, Ольга Алексеевна

СПИСОК ОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Идентификация новых генов, контролирующих деление цианобактериальных клеток и пластид растений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки"

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 49

РЕЗУЛЬТАТЫ 55

ОБСУЖДЕНИЕ 62

ВЫВОДЫ ИЗ ГЛАВЫ 1 74

ГЛАВА 2. Изучение клеточного деления цианобактерии

БупесНососсия ер. РСС 7942 с помощью методов функциональной протеомики 75

2.1. Первая белковая карта дикого типа Бупескососсю ер. РСС 7942 75

ВВЕДЕНИЕ 75

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 77

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 81

2.2. Сравнительный протеомпый анализ клеток мутантов с нарушенным клеточным делением и штамма дикого типа цианобактерии БупесЬососсю ер. РСС 7942. 96

ВВЕДЕНИЕ 96

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 98

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 102

ВЫВОДЫ ИЗ ГЛАВЫ 2 129

ГЛАВА 3. Выделение и молекулярно-генетический анализ новых ДНК-связывающих белков, участвующих в регуляции клеточной дифференцировки цианобактерии АпаЬаепа ер. РСС 7120 130

ВВЕДЕНИЕ 130

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 132

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 140

ВЫВОДЫ ИЗ ГЛАВЫ 3 164

ГЛАВА 4. САРБН-гены цианобактерии и их роль в клеточном метаболизме. 165 4.1. Генетические и биохимические доказательства различных функций двух дивергированных САРШ! генов в катаболическом и анаболическом путях метаболизма 165 1 углерода в цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803

ВВЕДЕНИЕ 165

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 168

РЕЗУЛЬТАТЫ 173

ОБСУЖДЕНИЕ 184

4.2. Gapl-oncpoii цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 кодирует гликогснфосфорилазу и индуцируется в анаэробных условиях 191

ВВЕДЕНИЕ 191

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 191

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 194

4.3. Экспрессия гена gap3 цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 в услов концентрациям СО2 200 ВВЕДЕНИЕ 200 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 201 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 203 ВЫВОДЫ ИЗ ГЛАВЫ 4 209

ГЛАВА 5. Получение мутантов цианобактерии Synechocystis sp. РСС6803 для разработки систем клонирования генов фотосинтеза и устойчивости к гербицидам 210

ВВЕДЕНИЕ 210

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 211

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 220

ВЫВОДЫ ИЗ ГЛАВЫ 5 240

ГЛАВА 6. Создание цианобактериальных штаммов, способных продуцировать молекулярный водород. 241

ВВЕДЕНИЕ 241

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 242

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 247

ВЫВОДЫ ИЗ ГЛАВЫ 6 252

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 253

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 257

БЛАГОДАРНОСТИ 259

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 260

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ (в алфавитном порядке)

Диурон (DCMU) 3,4-дихлорфенил1,1-диметилмочевина 2-Д электрофорез- двумерный электрофорез ЗФ- замедленная флуоресценция МД метронидазол

НГ- А^-метил- Nнитро- JV-нитрозогуанидин

ПХМБ парахлормеркурибензоат

Л.7120 Anabaena sp. РСС 7120

A.v. А nabaena variab ilis АТС С 29413

Е. coli Escherichia coli

5.7942 Synechococcus sp. РСС 7942

5.6803 Synechocystis sp. PCC 6803

ВВЕДЕНИЕ

Генетика клеточного деления, дифференцировки и внутриклеточного метаболизма - основные направления фундаментальных исследований молекулярной генетики цианобактерий. Расшифровка процессов клеточного деления, дифференцировки, адаптивных ответов на действие факторов среды базируется на использовании генетических подходов и данных о структурно-функциональной организации геномов цианобактерий. Модельные виды цианобактерий широко используются для изучения фундаментальных процессов жизнедеятельности. Одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp. РСС 6803, способная к гетеротрофному росту, служит модельным объектом для изучения процесса фотосинтеза и его регуляции, устойчивости к стрессовым факторам окружающей среды, молекулярной эволюции. Нитчатая цианобактерия Anabaena sp. РСС 7120, способная к формированию специализированных гетероцист, в которых происходит фиксация азота, но прекращается фотосинтез, используется для исследования генетического контроля процесса клеточной дифференцировки. Облигатный фотоавтотроф, одноклеточная Synechococcus sp. РСС 7942 служит моделью в исследованиях клеточного деления, циркадных ритмов, адаптивных ответов на различные стрессы. Для всех этих модельных видов цианобактерий разработаны генетические методы исследования: методы переноса ДНК с помощью трансформации и конъюгации; наличие плазмидных векторов для переноса, клонирования и экспрессии генов; использование генов-репортеров для изучения экспрессии генов и локализации их продуктов; разнообразные методы мутагенеза; определены полные нуклеотидные последовательности геномов.

Наличие эффективных генетических методов позволяет использовать цианобактерии в биотехнологии для производства различных продуктов (ферменты, пигменты, молекулярный водород и т.д.), для биодеградации органических загрязнений на поверхности вод, для многих других целей.

Полные нуклеотидные последовательности геномов 12 видов и штаммов цианобактерий представлены в базах данных (http://bio.c.u-tokyo.ac.ip/labs/ikeuchi/c genomeE.htmQ, что открывает широкие возможности для молекулярно-биологического анализа функций различных генов, механизмов регуляции их экспрессии. Активно развиваются исследования в области функциональной геномики и протеомики, дополняемые современными биохимическими и биофизическими методами.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель исследования:

Поиск и изучение генов, контролирующих клеточное деление, дифференцировку и метаболизм цианобактерий. В задачи иследования входило:

1. Поиск и изучение генов, контролирующих клеточное деление цианобактерий.

2. Анализ процессов клеточного деления цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 с применением методов функциональной протеомики.

3. Выделение и изучение новых транскрипционных факторов, контролирующих дифференцировку гетероцист.

4. Выяснение физиологических функций двух GAPDH генов (gap! и gap2) в углеродном метаболизме Synechocystis sp. РСС 6803. 5

5. Изучение экспрессии гена и gap3 в клетках Synechococcus sp. РСС 7942 и Anabaena variabilis АТСС 29413.

6. Выделение и изучение мутантов Synechocystis sp. РСС 6803, дефектных по фотосинтезу.

7. Получение мутантов Synechocystis sp. РСС 6803, устойчивых к ингибиторам фотосинтеза.

8. Выделение мутантов Anabaena variabilis АТСС 29413, способных продуцировать молекулярный водород в аэробных условиях.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ЦИАНОБАКТЕРИИ: ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ОБЪЕКТЫ ДЛЯ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ И ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Цианобактерии - это оксигенные фотоавтотрофные бактерии, которые широко используются для исследования различных биологических процессов, таких как фотосинтез и его регуляция, клеточное деление и дифференцировка, азотфиксация, метаболизм азота, углерода и водорода; устойчивость к различным стрессовым факторам, эволюция. Для одноклеточных и нитчатых цианобактерий созданы разнообразные векторные системы и другие генетические инструменты для клонирования генов и изучения их экспрессии и функций (Koksharova and Wolk, 2002).

Для генетического переноса в клетки цианобактерий используются трансформация, электропорация и конъюгация. Разнообразные методы мутагенеза позволяют изолировать многие типы мутантов, включая сайтнаправленные мутации конкретных генов. Использование геноврепортеров позволяет измерить уровень транскрипции отдельных генов и 6 обнаружить транскрипцию внутри индивидуальных колоний или даже внутри отдельных клеток в филаменте in vivo.

Доступен полный сиквенс геномов 12 видов и штаммов цианобактерий, в том числе: одноклеточной цианобактерии S. 6803 (S.6803), нитчатой азотфиксирующей гетероцистной цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120 (А.7120), Nostoc punctiforme РСС 73102 (АТСС 29133), цианобактерий Thermosynechococcus elongatus ВР-1, Prochlorococcus и Gloeobacter . Закончена работа над аннотированием генома одноклеточной цианобактерии Synechococcus elongatus (РСС7942) (S.7942) (http://genome.igi-psf.org/finished rnicrobes/synel/synel.horne.html'). Наличие данных о нуклеотидных последовательностях всего генома обеспечивает:

1) возможность наблюдений за изменениями в генной экспрессии на уровне транскрипции в ответ на изменения условий окружающей среды сразу по всему геному или по большим группам генов;

2) изучение методами протеомики генетической регуляции различных биологических процессов на белковом уровне;

3) более быструю идентификацию, изучение, модификацию и сравнение цианобактериальных генов;

4) помогает анализировать эволюционные взаимосвязи, в том числе эволюционные связи между хлоропластами и цианобактериями.

Наличие разработанных методов молекулярной генетики цианобактерий позволяет шире использовать разнообразные биосинтетические возможности этих фотоавтотрофных организмов в биотехнологии.

ЦИАНОБАКТЕРИИ В БИОСФЕРЕ

Цианобактерии - большая группа грамотрицательных микроорганизмов, роль которой в эволюции и существовании биосферы нашей планеты трудно переоценить (Громов, 2000). Цианобактерии по характеру своей клеточной организации соответствуют грамотрицательным бактериям и представляют их самостоятельную эволюционную ветвь. Это фототрофные микроорганизмы, осуществляющие фотосинтез с выделением кислорода. Они характеризуются высокой морфологической сложностью. Описано более 1500 видов цианобактерий. Морфологическое разнообразие описанных видов охватывает широкий спектр форм - от одиночных клеток и простых трихомов до многорядных трихомов с истинным ветвлением, содержащих дифференцированные клетки (Пиневич, Аверина, 2002).

Клетка цианобактерий - типичная прокариотическая клетка. Фотосинтетический аппарат представлен тилакоидами - сдвоенными мембранами. На поверхности тилакоидов находятся фикобилисомы -структуры, улавливающие фотоны света и передающие их реакционным центрам фотосинтетического аппарата. Сине-зеленый цвет цианобактерий обусловлен наличием пигментов - зеленого пигмента, хлорофилла «а», и синего пигмента, фикоцианина; у некоторых видов имеется еще красный пигмент, фикоэритрин. Клетка цианобактерий содержит также карбоксисомы - полиэдральные тела, которые образованы молекулами ключевого фермента фотосинтеза рибулозодифосфаткарбоксилазы. Эти карбоксисомы служат для увеличения концентрации С02 вблизи главного фермента цикла Кальвина. Цианобактерии обладают углеродконцентрирующим механизмом, который и позволяет им создавать большие концентрации углерода в клетке (Kaplan et al, 1994).

Некоторые цианобактерии способны к клеточной дифференцировке.

Одним из типов специализированных клеток являются акинеты (или споры) - это крупные покоящиеся клетки с утолщенной оболочкой. Они служат для выживания организма в неблагоприятных условиях. При наступлении оптимальных условий акинеты прорастают. Другим типом дифференцированных клеток являютя гетероцисты - специализированные клетки, в которых осуществляется процесс фиксации атмосферного азота.

Их могут образовывать некоторые нитчатые цианобактерии {Anabaena,

Nostoc). Молекулярный азот может быть использован живыми организмами благодаря активности ферментного комплекса нитрогеназы.

Фермент нитрогеназа не активен в присутствии кислорода, поэтому специализированные клетки гетероцисты служат оптимальным местом для анаэробной фиксации азота. Отсутствие активности фотосистемы 2 и повышенная активность дыхательных ферментов в гетероцистах усиливают защиту нитрогеназы от кислорода. Образующиеся соединения связанного азота поступают в соседние вегетативные клетки через микроплазмодесмы, а от них в гетероцисты поступает органический субстрат, необходимый для фиксации азота. Цианобактерии представляют собой единственный пример прокариотического многоклеточного организма, у которого происходит функциональная специализация клеток.

Другим приспособлением для защиты нитрогеназы от инактивации ее кислородом служит способность некоторых видов осуществлять фиксацию азота при отсутствии фотосинтеза, в ночное время, или посредством чередования фотосинтеза и азотфиксации, подчиняясь 9 определенному эндогенному ритму. Так происходит азотфиксация у морской планктонной цианобактерии Trichodesmium. Массы этой цианобактерии населяют теплые моря и океаны, поэтому фиксация азота этим организмом имеет огромное значение для жизни океана.

ЦИАНОБАКТЕРИИ - ОБЪЕКТЫ ГЕНЕТИКИ Генетический перенос у цианобактерии

Чтобы начать любые манипуляции с генами, нужно иметь возможность осуществить генетический перенос молекулы ДНК в клетку изучаемого организма. Генетический перенос может быть осуществлен в результате естественных способов передачи ДНК: трансформации, конъюгации и трансдукции. Для цианобактерий к настоящему моменту известны и используются в научных исследованиях первые два способа переноса генетического материала. Трансформация и электропорация.

Генетическая трансформация у цианобактерий была впервые открыта в России. Как было показано на кафедре генетики МГУ (Shestakov and

Khyen, 1970; Grigorieva and Shestakov, 1982), некоторые цианобактерии способны к естественной трансформации экзогенными молекулами ДНК. В результате этого открытия, по сути, была начата эра изучения цианобактерий с помощью методов молекулярной генетики. Так, штамм одноклеточной цианобактерии S. 6803, способный к "светом активируемому" росту в темноте на глюкозе (Anderson and Mcintosh, 1991) сыграл главную роль в изучении цианобактериального фотосинтеза. Другая одноклеточная цианобактерия 5.7942 используется активно при изучении циркадных ритмов (Holtman et al, 2001), углеродного метаболизма

10 цианоактерий (Kaplan et al., 1994), механизмов клеточного деления (Dolganov and Grossman, 1993; Koksharova and Wölk, 2002).

Трансформация описана и для одноклеточной цианобактерии Agmenellum quadruplicatum штамм PR-6, также известной как Synechococcus sp. РСС 7002 (Stevens and Porter, 1980). Пример эффективной трансформации был приведен в экспериментах (Dzelzkalns and Bogorad, 1988), где авторы продемонстрировали трансформацию отдельными кусочками геля из легкоплавкой агарозы, содержащими ДНК дикого типа 5.6803, порезанную ферментом рестрикции Hindlll. В сочетании с известной последовательностью ДНК генома 5.6803, этот способ трансформации позволяет быстро идентифицировать специфичный рестрикционный фрагмент ДНК, комплементирующий мутацию (Vermaas, 1998; Kufryk and Vermaas, 2001).

Почему трансформация возможна у некоторых одноклеточных цианобактерий, но не у других? Одной из причин может быть наличие в клетках нетрансформируемых цианобактерий экстраклеточных нуклеаз, которые часто встречаются, например, у нитчатых, образующих гетероцисты цианобактерий (Wölk and Kraus 1982). Такие ферменты расщепляют вносимую ДНК. Молекулярные механизмы, лежащие в основе естественной генетической трансформации цианобактерий, начали изучаться относительно недавно. Так, (Yoshihara et al., 2001) было показано, что продукт открытой рамки считывания slr0197 S.6803 требуется для процесса поглощения ДНК.

Исскуственным способом трансформации цианобактерий экзогенной

ДНК является электропорация (Bruns et al., 1989; Miihlenhoff and Chauvat,

1996). Несмотря на интенсивные исследования различных цианофагов

11 вирусов цианобактерий), включая лизогенные штаммы (Козяков и др., 1972; Rimon and Oppenheim, 1975; Sherman and Brown, 1978; Hu et al., 1981; Mendzhul et al., 1985; Sarma and Kaur, 1997), не было обнаружено ни одного вирусного вектора, способного осуществлять трансдукцию какой-либо цианобактерии. Коныогация

Наиболее общим способом переноса ДНК в цианобактериальную клетку является конъюгация, которая осуществляется с помощью плазмиды RP4 и ее производных. Эта плазмида относится к плазмидам широкого круга хозяев, Р-группы несовместимости. Хотя нет доказательств того, что эта плазмида может сама реплицироваться в клетках цианобактерий, было показано, что она может мобилизовать плазмиды для переноса в разные цианобактерии (Таблица1), включая морские штаммы.

ДНК можно сделать мобилизуемой для коньюгационного переноса путем обеспечения ее фрагментом, несущим «начало переноса» (oriT) из плазмиды RP4. Кодируемый плазмидой RP4 фермент надрезает двухцепочечную ДНК плазмиды в районе oriT, создавая тем самым одноцепочечную ДНК для переноса. RP4 может также мобилизовать ДНК, которая несет oriT район плазмиды широкого круга хозяев RSF1010. Другая возможность может представлять собой включение района oriT (также известного как bom, 6asis of mobilization) из плазмиды pBR322 (район, который был утрачен у плазмиды pUC19 и тесно связанных с ней плазмид). Этот район обеспечивает в донорной клетке мобилизацию генов колициногенных плазмид ColD, ColK или ColEl (Finnegan and Sherratt, 1982).

Таблица 1. Цианобактерии, для которых описана конъюгация и/или трансформация с помощью электропорации.

Отдел и род Штаммы трансформируются: конъюгацией (К), злектропорацией (Е) Ссылка на литературу Комментарии

Отдел I

Synechococcus lUi'K^E), РСС 6301(5К), и 7942(5К); морские штаммы WH7803(6K), WH8102(6K), WH8103(6K), NKBG15041 c(3'4'8K), NKBG042902(2'3K), NKBG 15031C(3K), PCC7335(4K), NKBG 15031 a(4K), NKBG040606B(3K)? NKBG040607(3K); S. elongatusCK,7E) 'Wolketal., 1984; 2Matsunaga et al., 1990; 3Sode et al., 1992a; 4Sodeet al., 1992b; 5Marraccini et al., 1993 and Mermet-Bouvier et al., 1993; 6Brahamsha, 1996(K); 7Mühlenhoff and Chauvat, 1996(K,E); 8Yu et al., 2000(K); Конъюгация более эффктивна, чем трансформация (Твтогетая й а1., 1994)

Synechocystis РСС 6714(',3K) и 6803(3K); морской штамм 7а(2К) 'Kreps et al., 1990(C); 2Sode et al.,1992a,b; 3Marraccini et al., 1993 and Mermet-Bouvier et al., 1993

Section 11

Chroococcidiopsis Штаммы 029(К,Е), 057(К) и 123(К,Е) Billi et al., 2001 Устойчив к высыханию

Section III

Plectonema UTEX 596('К) и 1АМ-М101(2Е) 'Tuli et al., 1990 и Vachhani et al., 1993; 2Fujita et al., 1992

Pseudanabaena NKBG040605C Sode et al., 1992a

Section IV

Anabaena РСС 7120('К), РСС 7118 ('К), АТСС 29413 (РСС 7937)(3К), М131('К,2Е), 90(4Е) 'Wölket al., 1984; 2Thiel and Poo, 1989; 3Murry and Wölk, 1991; 4Rouhiainen et al., 2000

Nostoc РСС 6310('К), 7107('К), 7121 (2К,2Е), 73102 (АТСС 29133)('К) 'Flores and Wölk, 1985; 2Moser et al., 1993 Для РСС 7121, электропорация более эффективна, чем конъюгация (Moser et al., 1993)

Fremyella/ Calothrix РСС 7601(ll¿K,'E) 'Chiang et al., 1992; 2CobIey et al„ 1993 Элетропорация мутагенна(Вгипз et al.,1989)

Section V

Fischerella muscicola UTEX 1829 Flores and Wölk, 1985 Результаты только предварительные

Влияние рестрикции на эффективность трансформации

Как только барьеры внешней мембраны, клеточной стенки и плазмалеммы преодолены, остается еще один барьер на пути стабильной генетической трансформации: деградация переносимой ДНК эндонуклеазами рестрикции, присущими штамму реципиенту. Хотя некоторые штаммы, такие, как, например, 5.7942 и Nostoc РСС 73102, могут быть лишены таких эндонуклеаз, другие цианобактерии имеют их в большом количестве. Nostoc РСС 7524, например, имеет четыре фермента, которые являются изошизомерами Äs/?1286I (G[g/a/t]GC[c/t/a]C), Aval (CyCGrG), Sau96l (GGnCC) и Asull (TTCGAA) и пятый фермент, для которого мишенью является rCATGy (Reaston et al., 1982). Для Л. 7120 (в последующем тексте Anabaena 7120) было показано, что эффективность коньюгационного переноса уменьшалась как экспоненциальная функция количества незащищенных сайтов (Elhai et al., 1997; Cobley et al., 1993; Moser et al., 1993).Было показано (Thiel and Poo, 1989), что единичный неметилированный Aval сайт уменьшает перенос путем электропорации в сто раз. Следовательно, эффективность генетического переноса может быть увеличена, и вероятно значительно, если удастся идентифицировать эндонуклеазы рестрикции в изучаемом штамме цианобактерии и соответственно метилировать переносимую в данный штамм ДНК.

Плазмидные векторы и генетические маркеры для экспериментов с цианобактериями

Плазмидные векторы можно подразделить на те, которые могут реплицироваться в выбранной клетке-хозяине (репликативные векторы), и на те, которые не способны к такой репликации. Каждый из этих двух типов векторов может найти свое экспериментальное применение. Репликативные векторы могут быть использованы для экспрессии чужеродного гена в новом хозяине. Такие векторы могут иметь широкий круг хозяев. Производные плазмиды RSF1010, например, способны реплицироваться в Synechocystis (Marraccini et al., 1993; Mermet-Bouvier et al., 1993) так же как в Л.7120 (Thiel, 1994), Synechococcus (включая термофильный штамм) и в Pseudanabaena (Sode et al., 1992a; Mühlenhoff and Chauvat, 1996) и могут быть рекомендованы для проверки на способность к репликации в новых штаммах, только вводимых в генетический эксперимент. Плазмидные векторы, которые могут быть перенесены в клетку нового хозяина, но не могут в ней реплицироваться, являются идеальным инструментом для переноса ДНК. Такая ДНК может быть использована для транспозонного мутагенеза, если несет транспозон в своем составе, или для интеграции в хромосому (в результате гомологичной рекомбинации) для того, чтобы стабильно поддерживаться в таком состоянии. Разнообразные плазмидные векторы для цианобактерий описаны в обзоре Терезы Тиль (Thiel, 1994).

Клетки, которые содержат трансформирующую ДНК, обычно идентифицируют с помощью переноса в эти клетки гена, чей белковый продукт способен инактивировать антиметаболит, например, антибиотик.

Когда проводят выращивание бактерий в присутствие антибиотика, только клетки, в которые перенесен соответствующий ген, могут расти. При работе с таким маркером в начале эксперимента необходимо определить концентрации данного антибиотика, превышение которых предотвращает рост нового хозяина. Поскольку цианобактерии структурно относятся к

Грам-отрицательным бактериям, для них часто используют антибиотики и гены устойчивости к антибиотикам, которые эффективны для этой группы бактерий. Среди таких антибиотиков неомицин и канамицин и соответствующие гены, кодирующие неомицин фосфотрансферазу (npt) из транспозонов Тп5 и Тп903, а также стрептомицин и спектиномицин и соответствующие гены, кодирующие аминогликозид аденилтрансферазу aadA) из транспозона Тп7 (Wolk et al., 1993) и из омега интерпозона

Prentki et al., 1991). Хлорамфеникол и ген, кодирующий хлорамфеникол ацетил трансферазу {cat) успешно используются в экспериментах с одноклеточными цианобактериями (Golden and Sherman, 1983; Chauvat et al., 1986) и с нитчатой цианобактерией Anabaena sp. штамм 90 (Rouhiainen et al., 2000). Такие антибиотики, как тетрациклин и рифампицин, являясь светочувствительными, реже используются для цианобактерий. Их можно использовать только в том случае, если поставить фильтр, отсекающий длины волн, к которым чувствительны эти антибиотики.

Поскольку ампициллин-деградирующий фермент р-лактамаза секретируется клетками, клетки донорного штамма, несущего соответствующий ген и участвующего в конъюгации, могут защищать

16 клетки реципиентного штамма, даже если ген не был перенесен. Поэтому плазмида, кодирующая 0-лактамазу, может быть использована для получения трансформантов или для подтверждения конъюгационного переноса, но не совсем удобна для первичной селекции эксконьюгантов. Несколько удобных кассет, несущих гены устойчивости к антибиотикам, были сконструированы и описаны (Elhai and Wolk, 1988). Из антибиотиков, которые обычно используются для Грам-положительных бактерий, для цианобактерий успешно применяеся эритромицин (Shestakov and Khyen, 1970; Grigorieva and Shestakov, 1982; Wolk et al., 1984; Shen et al., 1993).Среди других антибиотиков, используемых обычно для Грам-позитивных бактерий, представляют интерес тиострептон, гигромицин (смотрите Ohkawa et al., 2000), пиромицин и апрамицин.

Некоторые антиметаболиты, действующие на цианобактериальный фотосинтез, например, такие как атразин или 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1диметилмочевина (DCMU), которая блокирует электронный транспорт от фотосистемы 2; метронидазол, который взаимодействует с электронным транспортом от фотосистемы 1; нитрофенольные гербициды использовались для селекции устойчивых к ним мутантов цианобактерий

Golden and Sherman, 1984; Полухина и др., 1985; Ajlani et al., 1989;

Кокшарова и Шестаков, 1990; Bartsevich and Shestakov, 1995; Elanskaya et al., 1998; Narusaka et al., 1998). Однако гены, которые определяют такую устойчивость, не часто применялись в качестве маркеров для генетического переноса. В присутствие гена дикого типа, устойчивость к атразину является рецессивным признаком (Pecker et al., 1987). Для селекции был использован габакулин, который ингбирует синтез 5аминолевулиновой кислоты, и следовательно, хлорофилла, и ген, который

17 обеспечивает устойчивость к габакулину (Allison et al., 1997). Сходным образом для селекции могут быть использованы «гербициды, приводящие к выцветанию» (Hirschberg and Chamovitz, 1994), такие как норфлуразон (Martinez-Férez and Vioque, 1992), который ингибирует синтез каротеноидов, в комбинации с мутантным геном, который функционален, но устойчив к гербициду.

Иногда бывает удобно использовать в качестве маркера ген, который кодирует люциферазу (Engebrecht et al., 1983; Foran and Brown, 1988) или зеленый флуоресцирующий белок (GFP) (Crameri et al., 1996). Люминесценция или флуоресценция позволяют легко и с высокой чувствительностью обнаружить факт осуществления генетического переноса в клетку реципиента (Schmetterer et al., 1986; Murry and Wolk, 1991; Billi et al., 2001).

Способы получения мутаций у цианобактсрий

Мутации занимают центральное место в генетическом исследовании. Они используются как для поиска неизвестных генов, вовлеченных в изучаемый процесс, так и для исследования функции уже известных генов. Мутанты могут быть изолированы после спонтанного мутагенеза, который с определенной частотой идет во всех клетках (Astier et al., 1984; Montesinos et al., 1997). Мутации могут вызываться с помощью воздействия физических факторов, например, после воздействия ультрафиолетового света (Singh and Tiwari, 1969; Herdman and Carr, 1972; Wolk et al., 1988; Vega-Palas et al, 1990). Химический мутагенез дает много мутантов, например, после воздействия на клетки цианобактерий метил сульфонатом или Дометил - N'- нитро- N-нитрозогуанидином (Herdman and Carr, 1972; Currier et al., 1977; Полухина и др. 1985; Шестаков и др., 1988;Vega-Palas et al., 1990;

Buikema and Haselkorn, 1991). Биологический способ мутагенеза представлен мутагенезом с помощью транспозонов и инсерционным мутагенезом. Последний вид мутагенеза приводит к прицельному поражению конкретного гена в результате внедрения чужеродного фрагмента ДНК, несущего чаще всего маркер устойчивости к антибиотику. Этот маркер устойчивости ограничен по флангам гомологичными последовательностями хромосомной ДНК, которые и позволяют произойти в результате гомологичной рекомбинации инсерции в хромосому этого гена устойчивости. Цианобактерии довольно часто имеют примерно 10 копий своей хромосомы на одну клетку (Herdman et al., 1979), а для нитчатых штаммов характерно еще и наличие связанных в один филамент клеток, поэтому транспозонные мутанты могут оказаться довольно удобными: случайный мутагенез с помощью транспозона часто ускоряет поиск мутантов (Borthakur and Haselkorn, 1989; Ernst et al., 1992; Wölk et al., 1991). Транспозоны имеют дополнительное преимущество еще и потому, что они позволяют быстрее найти поврежденный мутацией ген. Они как бы «заякоривают» мутацию. Поиск генов, в которых произошли спонтанные мутации или мутации после физического или химического мутагенеза требует значительных временных затрат. Он осуществляется путем комплементации такой мутации библиотекой хромосомных фрагментов, представленной, например, порядка 20000 космидных клонов (Buikema and Haselkorn, 1991).

Мутагенез с использованием транспозона Тп901, кодирующего ßлактамазу, сыграл громадную роль в распространении техники трансформации цианобактерий из России в лаборатории других стран. Так, van den Hondel (1980) ввел транспозон Тп901 в природную плазмиду

Synechococcus и трансформировал полученной плазмидной конструкцией данный штамм цианобактерии. После этого Kuhlemeier и его коллеги (1981) и Nandeau de Marsac с сотрудниками (1982) использовали транспозицию Тп901 из плазмиды в хромосому как способ мутагенеза хромосомных локусов. Позднее было показано (Borthakur and Haselkorn, 1989), что транспозон Тп5 может перемещаться в нитчатой азотфиксирующей цианобактерии Anabaena. Однако использование этого транспозона становится намного более эффективным с введением в эксперимент его вариантов, например, Тп5-1058 и родственных ему конструкций, которые имеют (1) намного более сильный промотор, запускающий траскрипцию оперона, несущего гены устойчивости к антибиотикам, (2) более высокую частоту транспозиции и (3) начало репликации (ориджин репликации) Е. coli внутри транспозона. Такие конструкции позволяют клонировать последовательности ДНК, прилежащие к транспозону, путем разрезания геномной ДНК рестриктазами, которые не имеют сайтов узнавания внутри транспозона, замкнуть в кольцо такую молекулу ДНК с помощью лигирования in vitro и трансформировать полученной лигазной смесью клетки Е. coli (например, Wölk et al., 1991; Ernst et al., 1992; Black et al., 1993; Cai and Wölk, 1997). Транспозон Tn5-692 увеличивает транспозицию примерно в сто раз, давая большое количество транспозонных мутантов цианобактерии S. 7942 (Koksharova and Wölk, 2002) и A.v.АТСС 29413 (РСС 7937) (Wölk С.Р.и Koksharova O.A.). Недостатком же использования транспозонного мутагенеза могут быть иногда повторные транспозиции.

Цианобактерии Synechocystis и Synechococcus подвергались мутагенезу с помощью трансформации их клеток фрагментами их

20 собственной ДНК, сшитой с селективным маркером. Это так называемый "случайный кассетный мутагенез" (Labarre et al., 1989; Dolganov and Grossman, 1993; Tsinoremas et al., 1994; Broedel and Wolf, 1990).

Определенные гены могут быть мутагенизированы с помощью гомологичной рекомбинации для того, чтобы наблюдать либо эффект инактивации данного гена, либо наблюдать эффект небольших изменений в нуклеотидной последовательности ДНК данного гена. Williams и Szalay (1983) первыми продемонстрировали гомологичную рекомбинацию у цианобактерий, a Golden и Wiest (1988) впервые использовали гомологичную рекомбинацию в клетках Anabaena.

Гомологичная рекомбинация в результате одиночного кроссовера внутри гена инактивирует ген только в том случае, если рекомбинирующий фрагмент не содержит ни начала, ни конца транскрипционной единицы. Для получения мутации с более протяженным фрагментом требуется двойная реципрокная рекомбинация (Williams and Szalay, 1983; Golden et al., 1986,1987; Golden, 1988 ). Этот подход позволяет охарактеризовать функцию многих цианобактериальных генов (например, Pakrasi et al., 1988; Chitnis et al., 1989; Nyhus et al., 1993; Bhalerao et al., 1994; Ghassemian and Straus, 1996; Boison et al., 1998; Koksharova et al., 1998; Marin et al., 1998; Yoshihara et al., 2001; Галкин и др, 2003.). Поскольку фенотип транспозонного мутанта может быть результатом комбинированного эффекта спонтанной мутации где-нибудь в геноме и устойчивости к антибиотику, привнесенной транспозоном, обычно реконструируют транспозонных мутантов с помощью гомологичной рекомбинации для проверки, обусловлен ли мутантный фенотип только инсерцией транспозона в данный ген.

Двойная рекомбинация в одних штаммах цианобактерий происходит чаще, в других - реже. Одним из успешных способов селекции двойных рекомбинантов, например, в А.7120 может послужить использование гена sacB (Cai and Wölk, 1990; Black et al., 1993). Наличие гена sacB в присутствии высокой концентрации сахарозы в твердой среде летально для клеток. Введение мутантного аллеля в результате одиночного кроссинговера и затем использование sacB для селекции одной из двух полученных копий вводимого аллеля, позволяет заменить аллель дикого типа мутантным аллелем без введения в клетку гена устойчивости к антибиотику (Andersson et al., 2000).Такой подход может оказаться рацианальным, если, например, нужно получить штамм, который будет активно использоваться (например, если нужно инактивировать ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции), а ген, определяющий устойчивость к антибиотику, может быть включен в будущие плазмидные вектора, которые будут работать в данном штамме. Целые гены могут быть делетированы и рекомбинантные формы исходного гена затем могут быть введены в клетку для изучения, например, влияния одиночных или множественных аминокислотных замен на функцию кодируемого данным геном белка (например, Debus et al., 1988; Vermaas et al., 1990; Boerner et al., 1992; Ermakova-Gerdes and Vermaas, 1999; Rosenberg et al., 1999; Tichy and Vermaas, 1999; Ermakova-Gerdes et al., 2001). Анализ псевдоревертантов, в которых супрессорная мутация картируется в локусе, отличном от локуса, в котором произошла первичная мутация, может помочь идентифицировать гены, чьи продукты взаимодействуют с белком, затронутым первичной мутацией (Tichy and Vermaas, 2000; Kufryk and

Vermaas, 2001). Недавно был описан метод, основанный на ПЦР, для

22 локального изменения гена и для создания генных сшивок в Synechocystis (Taroncher-Oldenburg and Stephanopoulos, 2000). Ранее Vermaas (1996,1998) подробно рассмотрел способы мутагенеза для Synechocystis.

Несмотря на продолжительную процедуру сегрегации мутации, часто невозможно инактивировать все множественные копии определенного гена в цианобактериальных клетках. Для того чтобы определить, действительно ли данный ген существенен для жизнеспособности клетки, можно использовать два подхода. Оба они основываются на использовании конструкции, в которой изучаемый ген будет находиться под регулируемым промотором. Один из таких подходов (Poncelet et al., 1998; Pieulle et al., 2000) подразумевает подстановку копии изучаемого гена под температурой регулируемый промотор фага лямбда в репликативной плазмиде. При температуре, позволяющей активно функционировать промотору фага лямбда в цианобактериальной клетке на плазмиде, копия гена, находящегося под промотором дикого типа цианобактерии в хромосоме, инактивируется инсерцией и мутация сегрегируется. Затем температура меняется так, что единственно остающаяся копия гена больше не транскрибируется, и можно оценить эффект такой инактивации транскрипции на фенотип. Во втором подходе (Callahan and Buikema, 2001) природный промотор гена замещают на регулируемый медью petE промотор. Пока присутствует медь в среде, ген поддерживается в активном состоянии. Затем медь удаляют и эффект транскрипционной инактивации гена становится очевидным.

Гены-репортеры для изучения транскрипции в клетках цианобактерий

Использование генов-репортеров является чувствительным методом измерений уровня транскрипции определенного гена (например, Wölk et al., 1993; van Thor et al., 1999; Kunert et al., 2000; а также в обзорах Wölk,

1996 и Fernändez-Pinas et al., 2000). Этот метод также позволяет изучать транскрипцию внутри отдельной бактериальной колонии на чашке Петри

Wölk et al., 1991; Kondo and Ishiura, 1994; Kondo et al., 1994; Cai and Wölk,

1997; Schwartz et al., 1998; Zhu et al., 1998) или даже внутри особого типа клеток в филаменте у нитчатых форм. Например, в исследованиях механизмов, которые определяют местоположение будущей гетероцисты среди вегетативных клеток, важно знать, транскрибируются ли определенные гены во всех клетках или только внутри дифференцирующихся или уже зрелых гетероцист, или только в вегетативных клетках. Такие исследования можно провести с помощью генов luxAB, кодирующих люциферазу (Elhai and Wölk, 1990; Black et al.,

1993; Wölk et al., 1993; для обзора Fernändez-Pinas et al., 2000); гена gfp, кодирующего зеленый флуоресцирующий белок GFP (Haselkorn, 1995;

Yoon and Golden, 1998; Callahan and Buikema, 2001; Xu and Wölk, 2001) и гена lacZ, кодирующего ß-галактозидазу (Thiel et al., 1995). Fernändez-Pinas и Wölk (1994) продемонстрировали возможность использования генов luxC, luxD и luxE для синтеза субстрата для люциферазы внутри клетки, тем самым предотвращая токсичное воздействие этого субстрата при экзогенном добавлении его к клеткам. Как было замечено выше, экспрессия гена-репортера в реципиенте неопровержимо доказывает факт генетического переноса (Murry and Wölk, 1991; Billi et al., 2001). Если

24 экспрессия с промотора изучаемого гена очень слаба, она может быть усилена, что позволит локализовать экспрессию данного гена. Для этого слабый промотор связывают транскрипционно с геном, кодирующим РНК полимеразу колинофага Т7 и промотор, узнаваемый этой полимеразой помещают перед генами luxAB (Wölk et al., 1993).

При изучении генетических механизмов, управляющих биологическими часами цианобактерий (циркадными ритмами), успешно использовались гены liixAB для изучения генной экспрессии в индивидуальных колониях одноклеточной цианобактерии S. 7942. Были идентифицированы и изолированы колонии, несущие мутации в генах, контролирующих циркадные ритмы (Kondo et al., 1993; Liu et al., 1995; Katayama et al., 1999).

Если гены luxA и luxB помещали в транспозон, они позволяли идентифицировать транспозиции в последовательностях ДНК, находящихся под контролем промоторов, которые регулируются изменениями в условиях окружающей среды, такими, например, как наличие источников азота, температура или концентрация соли (Wölk et al., 1991; Cai and Wölk, 1997; Schwartz et al., 1998). Вторичные мутации, которые приводят к несветящемуся или конститутивно-светящемуся фенотипу, позволяют найти регуляторные гены (например, Schwartz et al., 1998; Zhu et al., 1998).

Векторы для изучения регуляции промоторов, сконструированные для Synechocystis (Kunert et al., 2000) позволяют сделать транскрибируемую сшивку промоторных последовательностей с генами репортерами luxAB и gfp и стабильно интегрировать такую конструкцию в нейтральный сайт на хромосоме Synechocystis.

Каждый ген-репортер имеет свои преимущества и свои недостатки. Бактериальные гены luxAB имеют высокую чувствительность и низкий фон, но требуют наличия кислорода в среде и довольно дорогой аппаратуры для детекции свечения. Трудно бывает получить и четкое изображение при высокой плотности клеток. Использование LacZ как репортера имеет длинную историю количественных исследований. Однако когда используют этот репортер с флуоресцентной ß-галактозидазой в качестве субстрата для локализации экспрессии гена, клетки должны быть подвергнуты фиксации глютаральдегидом (Thiel et al., 1995). GFP требует наличия кислорода для образования и стабилизации светящегося продукта, для его созревания требуются часы и фотовыцветание может оказаться проблемой. Как и в случае с lacZ, высокая плотность клеток не яляется проблемой, но для обоих этих репортеров фон, вызванный естественной флуоресценцией цианобактериальных клеток, ограничивает чувствительность этого экспериментального подхода. Все три типа генов-репортеров работают хорошо; исследователю необходимо только выбрать, какой из них лучше всего использовать в конкретном эксперименте. Ген cat, который кодирует хлорамфеникол ацетил трансферазу, так же был использован как репортер в цианобакериях (Ferino and Chauvat, 1989; Marraccini et al., 1993, 1994; Bauer and Haselkorn, 1995), так же как и ген uidA, который кодирует ß-глюкоронидазу (GUS; Casey and Grossman, 1994; Dolganov and Grossman, 1999).

Геномные последовательности ДНК цианобактерий

Геномные последовательности являются всеобъемлющими энциклопедиями, созданными природой в течение миллионов лет

26 эволюции. Мы только начинаем изучать и понимать язык этих последовательностей. Очень многое еще необходимо определить: каковы функции конкретных белков, как происходит регуляция метаболизма, каковы эволюция и экологические взаимосвязи цианобактерий. На сегодняшний день определены полные нуклеотидные последовательности геномов разнообразных видов цианобактерий. Среди них - одноклеточная цианобактерия S. 6803 (3.57 Mb хромосома и еще ее плазмидные ДНК), нитчатая образующая гетероцисты цианобактерия Л. 7120 (6.41 Mb и еще ее плазмидные ДНК) (Kaneko et al., 1996а,b,200lb; Kaneko and Tabata, 1997; http://www.kazusa.or.jp/cyano/), два экотипа (MED4, адаптированный к интенсивному свету экотип из Средиземного моря и MIT9313, адаптированный к свету низкой интенсивности экотип из Гольфстрима) одноклеточной цианобактерии Prochlorococcus http://www.jgi.doe.gov/JGI microbial/html/prochlorococcus/prochlo pickastrai n.html).

Имеются полные данные о нуклеотидной последовательности генома Nostoc 73102, штамма, который формирует гетероцисты, акинеты, гормогонии и симбиотические ассоциации с роголистником Anthoceros и с цикадой Macrozamia http://www.jgi.doe.gov/JGI microbial/html/nostoc/nostoc homepage.html). Кроме того, сегодня можно работать с данными о нуклеотидных последовательностях таких цианобактерий, как Gloeobacter, нескольких штаммов Synechococcus (Bryant et al., 2001; Holtman et al., 2001; Kaneko et al., 2001a). Для большинства этих штаммов разработаны генетические методы и они были объектами многих исследований, которые упоминались ранее.

Наличие данных о геномных последовательностях чрезвычайно важно для поиска, изучения, изменения и сравнения цианобактериальных генов. Данные о цианобактериальном геноме уже использовались для идентификации регуляторных и структурных генов (например, Hein et al., 1998; Vinnemeier and Hageman, 1999; Ochoa de Alda and Houmard, 2000; Zhulin, 2000), для изучения молекулярных механизмов естественной генетической трансформации (Yura et al., 1999; Yoshihara et al., 2001) и для анализа эволюционных событий (Boiter et al., 1998; Reumann et al., 1999; Herdman et al., 2000; Rujan and Martin, 2001).

Анализ нуклеотидных последовательностей генома Prochlorococcus, наименьшего по размеру и наиболее многочисленного фотосинтетического организма в океане и может быть на Земле (Partensky et al., 1999), может пролить свет на эволюцию цианобактерий и хлоропластов. Штаммы

Prochlorococcus имеют размер генома примерно 2 МЬр, они не имеют фикобилисом, которые характерны для цианобактерий, и обладают пигментным составом, необычным для цианобактерий: так, они имеют дивиниловые производные хлорофилла «а» и «Ь», а-каротин, зеаксантин и пигмент, связанный с хлорофиллом «с». Штамм Prochlorococcus, SSI20, адаптированный к свету низкой интенсивности, содержит пигмент типа фикоэритрина (обзор Partensky et al., 1999). Штамм SSI20 обладает семью транскрибируемыми генами, которые кодируют различные хлорофилл а/Ьсвязывающие белки, что позволяет предположить, что наличие множественных генов для антенного белка может способствовать выживанию данного организма при очень низких интенсивностях света

Garczarek et al., 2000). Поскольку Prochlorococcus вносит довольно большой вклад в общий фотосинтез океана (30-80%), эта цианобактерия

28 играет существенную роль в глобальном цикле углерода и климате нашей планеты. Наличие полной информации о геноме двух данных микроорганизмов должно ускорить процесс понимания регуляции этих важных процессов и экологического разнообразия этих двух штаммов (Яосаре! а1., 2001).

Нуклеотидные последовательности 12 цианобактериальных геномов доступны в настоящее время в базах данных (ЬИр://Ыо.с.и-tokvo.ac.jP/labs/ikeuchi/c genomeE.html). Среди них восемь одноклеточных цианобактерий и четыре нитчатых вида. Стремительное накопление информации о нуклеотидных последовательностях геномов цианобактерий приводит к необходимости выяснения на молекулярном уровне биологических функций генов цианобактерий, понимания механизмов регуляции их активности.

Наличие данных о геномных последовательностях значительно изменило стратегию исследований в ходе генетического анализа тех цианобактерий, геномы которых секвенированы. Например, при поиске сайта инсерции транспозона, необходимо лишь секвенировать ДНК, прилежащую к транспозону. Нужно лишь секвенировать фрагмент белка для того, чтобы потом идентифицировать ген, которым он кодируется. Или, например, если ДНК-связывающий сайт идентифицирован, все такие сайты при наличии геномной нуклеотидной последовательности могут быть определены в геноме данной и вероятно близких к ней цианобактерий.

Анализ геномов позволяет выявить все гены, которые кодируют особые типы белков (например, сигма факторы или протеин киназы), а их функции могут быть определены с помощью систематического мутагенеза этих генов. Например, так были найдены гены 5.6803, кодирующие белки,

29 связывающие циклические нуклеотиды (Ochoa de Alda and Houmard, 2000). Путем систематической инактивации генов, кодирующих протеин-гистидин-киназы, и осуществляя ненаправленный кассетный мутагенез генома 5.6803, были обнаружены гены, вовлеченные в процессы восприятия низких температур и ответа на их воздействие (Suzuki et al., 2000, 2001).Данный подход позволил продемонстрировать, что 5.6803 имеет множественные NAD(P)H дегидрогеназные комплексы со специфическими функциями (Ohkawa et al.,2000). Были обнаружены пять генов, которые кодируют маленькие Cab-подобные белки, новая группа цианобактериальных белков, которые могут быть вовлечены в связывание с пигментами (Funk and Vermaas, 1999). Анализ геномных последовательностей позволил установить, что нитчатая цианобактерия А. 7120 имеет девять ДНК метил трансфераз (Matveyev et al.,2001).

Наличие информации о геномных последовательностях позволяет развивать методы для их анализа (Hirosawa et al., 1997). Так, например, гены, претерпевшие горизонтальный перенос, могут быть предположительно идентифицированы in silico (Mrazek et al., 2001).

Майкроэррей анализ доступен сейчас для генома 5.6803 благодаря разработкам компании TaKaRa Shuzo. Этот тип исследований позволяет оценить на уровне транскрипции ответ большинства генов данного организма на изменение условий окружающей среды, например, на увеличение интенсивности света (Hihara et al., 2001). Скоро такой тип анализа активности генов будет доступен и для нитчатой гетероцистной цианобактерии Anabaena 1120.

Хочется отметить, что информация о полной нуклеотидной последовательности геномов небольшого количества цианобактерий

30 является ценным источником информации при изучении других цианобактерий. Например, информация о пептидах из белка, предположительно специфичного для акинет (цианобактериальных спор), и выделенного из Anabaena cylindrica, проявляющих сходство с пептидами белка, предсказанного для А. 7120, позволила ускорить выделение соответствующего гена из A. v. (Zhou and Wolk, 2002).

Хотя у цианобактерий нет жгутика, некоторые виды могут скользить по поверхности, когда контактируют с твердой поверхностью и известны некоторые виды, которые могут плавать в жидкой среде. Была высказана гипотеза о связи между генами, кодирующими пиллины, и подвижностью 5.6803 (Bhaya et al., 1999). Гены, связанные с образованием пили, были идентифицированы путем инсерционного мутагенеза найденных в геноме соответствующих генов. Это позволило подтвердить и расширить взаимосвязь между подвижностью и толщиной пили (Bhaya et al., 2000а; Yoshihara et al., 2001). Было обнаружено, что положительный фототаксис в 5.6803 может быть опосредован фоторецептором типа фитохрома и сигнал передающей системой типа CheA/CheY (Yoshihara et al., 2000). Анализ мутантов, дефектных по фототаксису позволил предположить, что Che-подобные полипептиды могут быть вовлечены как в биосинтез пили, так и в ориентацию движения в соответствии с освещенностью (Bhaya et al., 2001).

Быстрое накопление данных о геномных последовательностях приводит исследователей к мысли о том, что нужны экспериментальные подходы для выяснения биологических функций всех этих многочисленных генов. Одним из таких подходов является протеомика, которая дополняет геномику, поскольку позволяет изучать белковые

31 продукты конкретных генов, а именно от активности белковых продуктов зависит жизнь клетки (Pandey and Mann, 2000). Эта быстро развивающаяся область науки может способствовать более глубокому пониманию функций генов и того, как организмы реагируют на разные физиологические воздействия. Кроме того, протеомика позволяет выяснить, действительно ли конкретная, предсказанная с помощью компьютерных программ, открытая рамка считывания кодирует данный белок, т.е. процесс аннотирования генома наполняется вполне конкретным содержанием.

Первые работы с использованием методов протеомики были проведены для цианобактерии £6803. Японские исследователи (Sazuka and Ohara,

1997; Sazuka et al., 1999) соотнесли 234 белковых пятен на электрофоретограммах после проведения двумерного электрофореза с соответствующими генами. В результате проведенного анализа стало возможным охарактеризовать сигнальные последовательности и модифицирование белки цианобактерий. Протеомный анализ был использован для идентификации периплазматических белков клеток

5". 6803, включая группу, чьи продукты соответствуют строго условиям солевого стресса; все изученные белки имели один или другой из двух типов сигнальных пептидов (Fulda et al., 2000). Недавно начаты исследования по протеомике Nostoc commune DRH1 (Ehling-Schulz et al.,

2002) и Nostoc punctiforme PCC 73102 (Hunsucker et al., 2004). К настоящему времени опубликовано всего несколько работ, в которых проводился двумерный электрофорез и идентификация нескольких специфичных для конкретных условий выращивания белков £7942 (Görl et al., 1998; Pandey et al., 2000; Cha et al., 2005). Использование двумерного электрофореза в сочетании с MALDI-TOF масс спектрометрией (Mann et

32 al., 2001) при наличии сиквенса всего генома данного организма открывает хорошие перспективы для обнаружения и анализа белков, экспрессирующихся в конкретных условиях и в определенных структурах клетки (Fulda et al., 2000; Zak et al., 2001; Huang et al., 2002; Kashino Y et al., 2002; Simon et al., 2002). Кроме того, только этот метод позволяет увидеть пост-трансляционные модификации генных продуктов.

Наличие данных о нуклетидных последовательностях всего генома обеспечивает возможность наблюдения за глобальными изменениями в генной экспрессии на уровнях транскрипции и трансляции в ответ на различные изменения условий окружающей среды. Методы, используемые для исследования глобальной экспрессии генов эукариот (Schena et al., 1995; Zhao et al., 1995) менее пригодны для работы с прокариотами, поскольку в случае прокариот нельзя использовать poly(A) (Aviv and Leder, 1972) для отделения бактериальной мРНК от рРНК. При гибридизации кДНК, полученной на основе тотальной РНК прокариот, значительный вклад в фон вносит имеено большое количество рРНК, что понижает чувствительность метода. Несмотря на успех, достигнутый в работе с Е. coli (Richmond et al., 1999), в случае цианобактерий без удаления рРНК, трудно достичь повышения чувствительности метода. Трудность заключается в том, как уменьшить количество рРНК без одновременного уменьшения популяции мРНК.

Одним из методов селективного уменьшения пула рРНК может быть процедура, разработанная фирмой Affymetrix: праймеры, специфичные к 23

S и 16 S рРНК гибридизуются с такими же рРНК и затем, используя обратную транскрипцию для образования первой цепи кДНК для рРНК, что приводит к образованию рРНК/кДНК гибрида. Затем для деградации

РНК в таких РНК/ДНК гибридах используют специфичный фермент РНКазу Н (Nicholson, 1997). После этого образцы обрабатывают ДНКазой I, свободной от РНКаз, для разрушения оставшейся кДНК цепи рРНК. Ни один из этих этапов не затрагивает мРНК.

Другой подход (Graham and Clark-Curtiss, 1999) заключается в захвате обратно транскрибированной кДНК из общего пула РНК путем связывания с таким количеством биотинилированной геномной ДНК, какое будет достаточно для связывания с большинством кДНК, соответствующих мРНК, и только с малой фракцией кДНК, синтезированных на рРНК.

Существует и третья возможность, которая недавно была применена для изучения 5.6803 (Singh and Sherman, 2000). Этот подход заключается в амплификации с помощью ПЦР всех не рРНК генов (создается так называемая " customized amplification library", или CAL), затем проводится насыщение меченной биотином кДНК с CAL, задержка таких комплексов на стрептовидиновых шариках, отмывка этих шариков, элюция и мечение оставшейся связавшейся с шариками библиотеки CAL, которую используют в качестве зондов в экспериментах с ДНК эррей (Alland et al., 1998). "Differential display" - метод, основанный на обратной транскрипции и сопряженной с ней ПЦР, позволяет проводитьбыстрый скрининг генов, которые экспрессируются в специфических условиях. Этот метод был использован, например, в работе по идентификации генов, регулируемых интенсивностью света в цианобактерии 5.6803 (Bhaya et al., 2000b).

Экологическое значение цианобактерий и их использование в биотехнологии

Цианобактерии играют важную роль в различных экологических системах. Они распространены в водных экологических нишах, включая морские, солоноватые и пресные воды, в почве и на камнях, и в особенноси на влажных поверхностях; и в таких местах обитания, где практически нет другой жизни - в горячих источниках и в щелочных озерах. Они формируют симбиозы с водорослями, папоратниками, с беспозвоничными (кораллами) (Fogg et al. 1973; Wilkinson and Fray 1979). В ассоциации с грибами, они формируют лишайники и помогают превращать камни в почву, пригодную для жизни других организмов. Совем недавно стало возможным начать изучение механизмов, позволяющих цианобактериям выживать в условиях экстремальной засухи, с помощью генетических методов. Этому способствовало развитие генетического анализа для цианобактерии Chroococcidiopsis, доминирующей в микробных сообществах, живущих в наиболее экстремально сухих горячих или холодных пустынях (Billi et al., 2001). Перенос лишь одного гена, кодирующего сахарозо-6-фосфат синтазу,(5ртЛ), из цианобактерии 5.6803 в чувствительную к высыханию кишечную палочку Е. coli привел к увеличению в 104 раза выживаемости бактерии по сравнению с клетками дикого типа после высушивания в результате замораживания, высушивания на воздухе или обезвоживания после обработки пеитоксидом фосфора (Billi et al., 2002).

Если не заботиться об очистке фосфат- и нитрат- содержащих промышленных, сельскохозяйственных, бытовых сточных вод, они могут засорять озера и пруды, приводя к массивному росту цианобактерий

35 цветению" водоемов) (Atkins et al., 2001). Поверхность воды становится мутной и свет не может проникнуть в более низкие слои воды. Часть цианобактерий затем умирает, создавая неприятные запахи. Бактерии, которые разлагают погибших цианобактерий, используют весь имеющийся кислород; и рыба затем гибнет от нехватки кислорода. Некоторые цианобактерии, образующие такие зоны цветения, выделяют токсины, которые делают воду непригодной для потребления (Hitzfeld et al., 2000). Некоторые из этих токсинов и другие натуральные продукты цианобактерий имеют значение для использования в медицине (Patterson et al., 1991; Boyd et al., 1997). Показано, что многие цианобактерии Trichodesmium thiebautii, Synechococcus sp. PCC 6302, Symploca sp. PCC 8002, Nostoc sp. PCC 7107 образуют ВМАА, нейротоксичную не белковую аминокислоту, которая, как предполагается, вызывает некоторые нейродегенеративные болезни, в частности, болезни Паркинсона и Альзаймера (Сох et al., 2005). При «цветении» водоемов и даже морей (проблема Балтийского моря) может происходить накопление цианобактериальных матов и соответственно накопление токсинов.

Цианобактерии могут разлагать (деградировать) природные ароматические углеводороды (Cerniglia et al., 1979, 1980a,b; Ellis, 1977) и ксенобиотики (Megharaj et al., 1987; Kuritz and Wölk, 1995). С помощью методов генетики можно модифицировать цианобактерий для усиления их биодеградирующей способности (Kuritz and Wölk, 1995). Микробные маты, богатые цианобактериями, ускоряют очистку загрязненных нефтью вод в результате использования этих загрязнений в качестве источника углерода и энергии (Sorkoh et al. 1992, 1995).

Цианобактерии могут также осуществлять синтез продуктов, имеющих биотехнологическое значение. При этом они являются наиболее выгодными в энергетическом отношении продуцентами, так как используют для своей жизнедеятельности энергию солнечного света. Промышленное выращивание этих объектов может осуществляться на поверхности естественных или искусственных водоемов, в фотобиореакторах (Шестаков, 1984). Как многие другие бактерии, цианобактерии синтезируют полигидроксиалканоаты (PHAs), термопластичный класс биодеградируемых полиэстеров, которые включают полигидроксибутарат (РНВ). PHAs представляют собой вещества, которые являются запасом и хранилищем углерода и энергии. Хранятся же они в цитоплазме как клеточные включения. С помощью транспозонного мутагенеза (Miyake et al., 2000) был получен мутант цианобактерии с повышенной аккумуляцией РНВ. При использовании сиквенса генома 5".6803, был идентифицирован и охарактеризован ген, кодирующий РНВ синтазу (Hein et al., 1998). Два связанных с ним гена, кодирующие РНА-специфическую Р-кетотиолазу и ацетоацетил-коэнзимА редуктазу, были идентифицированы и охарактеризованы (Taroncher-Oldenburg et al., 2000).

Примером другого такого биосинтеза может служить синтез eicosapentaenoic acid (20:5n-3, ЕРА), полиненасыщенной жирной кислоты, которая является существенным источнико питания для личинок морских рыб и важна для здоровья человека. Генный кластер, вовлеченный в синтез

ЕРА, из ЕРА-образующей бактерии, Shewanella sp. SCRC-2738, был перенесен в результате конъюгации в морскую цианобактерию,

Synechococcus sp. Штамм NKBG 15041с (Yu et al., 2000). Такой

37 трансгенный цианобактериальный штамм продуцирует ЕРА и ее предшественник (20:4п-3).

В клетках цианобактерий был обнаружен и структурно проанализирован цианобактериальный полимер, цианофицин, являющийся кополимером аргинина и аспартатовой кислоты (Simon, 1971, 1987). Этот полимер образует гранулы внутри клетки (Lang et al., 1972). Было показано (Simon, 1973 а, b, 1976), что полимер синтезируется не на рибосомах и может служить резервом азота для клетки: в случае азотного голодания этот полимер подвергается внутриклеточной деградации. Из клеток азотфиксирующей цианобактерии А. v. была выделена цианофицин синтаза, затем был осуществлен ее микросиквенс. Данные об ее частичной аминокислотной последовательности были использованы для идентификации соответствующего гена в базе данных 5.6803 (Zieger et al., 1998). Это, в свою очередь, позволило обнаружить, а затем и определить нуклеотидную последовательность ДНК соответствующего гена из А. v. (Berg et al., 2000). Проведена экспрессия соответствующего этому гену белка и проанализирован механизма синтеза цианофицина. Наличия одного этого гена достаточно для синтеза цианофицина в E.coli. Цианофициназный ген из 5.6803 экспрессировался в кишечной палочке, и очищенный белок гидролизовал полипептид цианофициновых гранул до дипептида аспарагин-аргинин (Richter et al., 1999). На основе знания нуклеотидных последовательностей этих генов, соответствующие гены из 5.6803 были клонированы, что привело к тому, что гетерологичная продукция цианофицина может достигать 26% сухой клеточной массы (Aboulmagd et al., 2000).

Использование цианобактерии Spirulina в качестве ценного источника белка и витаминов для человека и животных рассмотрено в обзорах (Ciferi, 1983, Kay, 1991). Полагают, что еще с античных времен два вида, Spirulina platensis и Spirulina maxima, использовались в пищу в той части Африки, где сейчас расположена Республика Чад, и в Мексике, соответственно (Ciferri and Tiboni, 1985). Эти виды имеют необычно высокое для фотосинтезарующих организмов содержание белка - до 70% от сухого веса. Nostocßagelliforme рассматривается как деликатес в Китае (Gao, 1998; Takenaka et al., 1998). Других цианобактерий используют в пищу в Индии и на Филлипинах (Tiwari, 1978; Martinez, 1988). Аминокислотный состав Spirulina maxima (Clément et al., 1967), которая может расти на отходах животноводства (Wu and Pond, 1981), также является одним из наилучших для питания человека по сравнению с другими фотосинтезирующими организмами. Подобно другим микроводорослям, Spirulina используется как источник природных красителей для пищи и как диетическая добавка к питанию (Kay, 1991).

С-фикоцианин и аллофикоцианин являются фикобиллипротеинами, пигментированными компонентами антенной структуры второй фотосистемы- фикобилисомы (Glazer, 1988). Фикобиллипротеины с прикрепленными к ним моноклональными или поликлональными антителами, образуют флуоресцирующие комплексы со свойствами антител и представляют собой ценность как флуоресцирующие метки при сортировке клеток, при исследовании антигенов клеточной поверхности.

Spirulina является удобным и недорогим источником аллофикоцианина и

С-фикоцианина (Jung and Dailey, 1989). В качестве альтернативного подхода, может быть использована генетически модифицированная Л. 7120,

39 которая позволяет получить in vivo стабильную фикобилипротеиновую конструкцию, несущую tag для очистки с помощью аффинной хроматографии, пригодную для использвания в качестве флуоресцентных меток без последующих химических обработок (Cai et al., 2001).

Поскольку цианобактерии обитают в тех же самых экологических нишах, что и личинки комаров, и поедаются ими (Thiery et al., 1991; Avissar et al., 1994), эти микроорганизмы могут служить привлекательными кандидатами для контроля за численностью комаров. Трансгенные цианобактерии, нитчатые и одноклеточные, обладающие убивающей комаров активностью, были сконструированы в нескольких лабораториях (Tandeau de Marsac et al., 1987; Angsuthanasombat and Panyim, 1989; Chunjatupornchai, 1990; Murphy and Stevens, 1992; Soltes-Rak et al., 1993, 1995; Xu et al., 1993, 2000; Wu et al., 1997). Высокий уровень токсичности наблюдался в рекомбинантных клонах А 7120, несущих два гена, кодирующих 5-эндотоксин (crylVA и crylVD) и ген р20 из Bacillus thuringiensis подвид israelensis (Wu et al., 1997). Было показано, что генетически измененная А7120 может защищать контейнеры с природной водой от заселения ее личинками Culex в течение более двух месяцев (Xu et al., 2000). Хотя можно ожидать, что лабораторные штаммы имеют более низкий уровень выживаемости в природных условиях, эта самая их характеристика может помочь предотвратить нежелательное распространение генетически модифицированных микроорганизмов.

Использование жидких суспензионных культур или иммобилизованных клеток цианобактерий открывает возможности для фотопродукции молекулярного водорода (Gisby et al., 1987; Lindblad, 1999).

Цианобактерии имеют несколько ферментов, прямо вовлеченных в

Л»0ССИЙСХАЯ

ГОЬУДДРСТЁЕННЛП БИБЛИОТЕКА водородный метаболизм: (1) нитрогеназа, которая катализирует образование водорода как побочного продукта восстановления молекулярного азота до NH3; (2) поглощающая гидрогеназа, катализирующая потребление водорода, образованного нитрогеназой; и (3) двунаправленная гидрогеназа, которая способна как полощать водород, так и образовывать его (Papen et al., 1986; Schmitz et al., 1995; Tamagnini et al., 2000). Для увеличения продукции H2 были изолированы мутанты A.v. (Михеева и др., 1994), дефектные по утилизации водорода. Два таких мутанта были охарактеризованы (Mikheeva et al., 1995; Sveshnikov et al., 1997) и один из них, PK 84, был использован для получения водородана автоматическом фотобиореакторе (Borodin et al., 2000).

Другим интересным аспектом в использовании цианобактерий, может служить их способность секретировать различные биологически важные молекулы. Так, иммобилизация на алюмоборосиликатном волокне клеток мутантов A.v., выделяющих ионы аммония в среду роста (Полухина и др., 1982), демонстрирует возможность практического использования мутантов этой азотфиксирующей цианобактерии для биотехнологического получения аммиака. Такие мутантные штаммы, вероятно, могут рассматриваться в качестве биофертилизаторов, например, на рисовых полях.

Цианобактерии могут быть использованы в качестве организмов, секретирующих белки в среду роста. Так, были проведены исследования по дентификации семи секретируемых белков 5.6803 и охарактеризованы сигнальные последовательности, обеспечивающие их секрецию

Sergeyenko, Los, 2000; 2003). Показана возможность использования сигнальных последовательностей одного из идентифицированных

41 секретируемых белков S.6803 и его гомолога из этой же цианобактерии для секреции гетерологичного белка. Опыт по созданию рекомбинантных штаммов, способных секретировать чужеродные белки в среду культивирования важен для практического применения этих знаний и созданных с их учетом генно-инженерных конструкций в биотехнологии, в медицине и в фармакологии.

Недавно было обнаружено, что цианобактерии способны продуцировать фитогормон индол-3-уксусная кислота (1АА) (Sergeeva et al, 2002), который синтезируется в процессе установления симбиотических отношений между цианобактерией и высшим растением.

Цианобактрии в эволюции высших растений

Хлоропласты возникли более 1,2 млрд лет назад, когда свободно-живущие цианобактерии стали эндосимбионтами эукариотической гетеротрофной клетки. В течение эволюции образующейся растительной клетки геномы эндосимбионта и клетки-хозяина существенно перестраивались. С того времени хлоропластные геномы претерпели уменьшение, поскольку они кодируют от 50 до 200 белков, в то время как цианобактериальные геномы кодируют несколько тысяч. Иначе говоря, это означает, что в процессе эволюции гены должны были быть перенесены из древнего хлоропласта в ядро, где они должны были правильно экспрессироваться и приобрести сигнальные последовательности, благодаря которым синтезированные на цитоплазматических рибосомах белки должны были реимпортироваться в органеллу с помощью сигнальных пептидов. Этот эндосимбиотический генный перенос, вероятно, широко распространен в природе: так примерно 18% ядерных генов Arabidopsis пришли из цианобактерий (Martin, 2003).

Сравнительный анализ пептидаз различных семейств из цианобактерии 5.6803 и пептидаз из хлоропластов Arabidopsis показал, что гомологичные ферменты, возникшие в результате дупликации генов цианобактерий, функционально различны и часто не комплементируют друг друга (Sokolenko et al., 2002). Основываясь на компьютерном анализе геномов и экспериментальном анализе инсерционных мутантов, авторы идентифицировали 49 хлоропластных пептидных субъединиц и их гомологов бактериального происхождения в Arabidopsis thaliana. Это количество близко к тому, что обнаружено у 5.6803, имеющей 62 гена, коирующих субъединицы пептидаз. Очевидно, некоторые метаболические функции, обнаруженные в цианобактериях и контролируемые бактериальным типом пептидаз, могли быть перенесены либо в ядерно-цитоплазматическую часть растительной клетки, либо утрачены, как это произошло с генами, контролирующими биогенез пили, клеточной стенки, или цианофициновых комплексов (Sokolenko et al., 2002).

Идентификация и изучение цианобактериальных генов помогает обнаружить соответствующие растительные ортологи и понять их функции. Так, изучение цианобактериальных генов, ответственных за деление клетки, помогает идентифицировать соответствующие гены растений и изучать их роль в делении хлоропластов (Koksharova and Wolk,

2002; Vitha et al, 2003). При изучении аппарата транспорта белков хлоропластов было обнаружено, что несколько его компонентов имеют цианобактериальных ортологов и, вероятно, произошли от последних

Reumann et al, 1999). Эндосимбиотическая теория происхождения

43 эукариотической клетки была сформулирована более ста лет тому назад, но только сейчас, анализируя и сравнивая нуклеотидные последовательности геномов растений и цианобактерий, стало возможным начать изучение эволюции одноклеточных и многоклеточных цианобактерий, пластид высших растений и водорослей на молекулярном уровне.

Некоторые итоги и перспективы

Подводя некоторый итог всему вышеизложенному, можно подчеркнуть, что цианобактерии, по структуре относящиеся к Грамотрицательным прокариотам, и являясь древними родственниками хлоропластов, представляют собой более удобную модель для изучения фотосинтеза и его регуляции, поскольку экспериментальная работа с этими фотосинтезирующими бактериями более проста, чем соответствующие эксперименты с высшими растениями. На сегодняшний день имеются эффективные методы генетического переноса, множество удобных векторов для клонирования генов, транспозоны, разнообразные методы мутагенеза, гены-репортеры, а также секвенированны геномы разных представителей этой большой группы древнейших организмов. Все эти генетические инструменты обеспечивают широкие возможности для идентификации новых генов; в том числе и генов растений; для изучения структуры, регуляции, функции и эволюции генов; для понимания экологической роли цианобактерий; и для возможного практического их использования в биотехнологии.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кокшарова, Ольга Алексеевна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1). С применением метода транспозонного мутагенеза выявлены новые гены Synechococcus sp. РСС 7942, ftn2 и ftn6, контролирующие деление клеток цианобактерий.

2). Ген ftn2 имеет гомологов в цианобактериях, зеленых растениях и водорослях; ген ftn6 специфичен для цианобактерий.

3). Ортологи продуктов генов ftn2 и ftn6 в цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120 участвуют не только в клеточном делении, но и в дифференцировке клеток.

4). Экспрессия 44 различных белков изменена в клетках мутантов Ftn2 и Ftn6 Synechococcus sp. РСС 7942.

5). В построенной белковой «карте» клеток штамма дикого типа цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942, представлены белки, участвующие в основных метаболических процессах, проходящих в активно растущей цианобактериальной культуре.

6). Выявлены и изучены ранее неизвестные ДНК-связывающие белки АЬр2 и АЬрЗ цианобактерии Anabaena РСС 7120, необходимые для активации экспрессии генов hepA и hepC в ходе клеточной дифференцировки и образования гликолипидов, специфичных для гетероцист.

7). Методами обратной генетики и ферментного анализа показана роль двух gap генов, кодирующих глицеральдегид-3- фосфат - дегидрогеназы. Белок Gap2 функционирует в фотосинтетическом цикле Кальвина и глюконеогенезе, Gapl функционирует в гликолизе, в условиях, когда катаболическая активность Gap2 репрессируется специфическим низко молекулярным ингибитором.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данные, представленные в диссертации, получены в результате плодотворного сотрудничества с проф. Шестаковым C.B., Михеевой Л.Е., Трошевым В.В., Васильевым И.Р., Колотиловой H.H., Еланской И.В., Карякиной Е., Ермаковой-Гердес С.Ю., проф. Тихоновым А.Н., проф. Семеновым А.Ю., Трубициным Б.В., Птушенко В.В., Мамедовым М.Д. (Россия, МГУ), проф. Церфом Р., Лиауд М.-Ф., Шуберт М. (Германия, Брауншвайгский университет), проф. Уолком П. (США, Университет штата Мичиган), проф. Расмуссен У., Клинт И. (Швеция, Стокгольмский университет), которым автор приносит глубокую и искреннюю благодарность. Автор благодарит за поддержку сотрудников Института общей генетики Муху Д.В., Полухину Г.Н., Кузьмину А.Н., а также преподавателей и сотрудников кафедры генетики Биологического факультета МГУ. Автор благодарит РФФИ за поддержку исследований по функциональной геномике клеточного деления цианобактерий (грант 0304-49332). Автор приносит глубокую благодарность своим родителям, брату, мужу и детям за постоянную поддержку и понимание.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цианобактерии являются удобными объектами для экспериментального изучения фотосинтеза, углеродного метаболизма, клеточной дифференцировки, деления клеток, и, наконец, как перспективные продуценты разнообразных практически важных соединений.

В задачи данной работы входило изучение целого ряда фудаментальных процессов, протекающих в цианобактериальной клетке. Среди них генетические механизмы клеточного деления и дифференцировки, изучение функций нескольких генов, кодирующих глицеральдегидфосфатдегидрогеназу; создание основы для клонирования генов фотосинтеза и устойчивости к гербицидам; получение продуцента экологически чистого вида топлива - молекулярного водорода.

Необходимой предпосылкой для изучения любых процессов, происходящих в клетке, является использование генетического подхода. Одним из инструментов генетического метода исследования является получение и исследование мутантов, несущих изменения в неизвестных или в известных генах. Так, спонтанный или индуцированный мутагенез применен нами для получения мутантов по фотосинтезу и устойчивых к гербицидам с целью создания системы клонирования соответствующих генов. Этот подход позволяет идентифицировать новые гены, ранее неизвестные, часто регуляторные. Мутанты цианобактерий по фотосинтезу служат также модельными объектами для изучения процессов переноса электронов в фотосинтетических мембранах, позволяют изучать углеродный метаболизм фотосинтезирующих микроорганизмов.

Другой тип мутагенеза, инсерционный мутагенез, используемый в рамках «обратной» генетики для изучения функций уже известных генов, позволил нам впервые показать различие функций двух генов, кодирующих глицеральдегидфосфатдегидрогеназу цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Кроме того, этот метод способствовал доказательству функциональной значимости обнаруженных нами новых ДНК-связывающих белков, участвующих в процессе клеточной дифференцировки у нитчатой азотфиксирующей цианобактерии. Инсерционная инактивация генов, кодирующих новые ДНК-связывающие белки, привела к появлению мутантов, неспособных формировать зрелые гетероцисты.

Третий тип мутагенеза, с применением транспозона Тп629, оказался плодотворным для идентификации новых генов, контролирующих деление клеток цианобактерий. Он позволил получить мутантов и успешно клонировать и секвенировать инактивированные гены.

Сочетание мутационного подхода и методов функциональной протеомики позволило впервые показать, насколько обширен плейотропный эффект мутации только в одном гене, контролирующем деление клеток.

Наконец, благодаря мутационному подходу нам удалось создать штаммы цианобактерии АпаЪаепа variabilis, способные к выделению молекулярного водорода.

Использование сравнительной протеомики для изучения процессов деления клеток цианобактерий позволило идентифицировать 44 различных белка, уровень которых изменен в клетках мутантов по клеточному делению. Это одна из первых работ по протеомике Synechococcus sp. РСС

7942. Построена первая белковая «карта» Synechococcus sp. РСС 7942. Наличие такой карты облегчает работу с определенными белками, например, при использовании метода Western гибридизации. Знание реальных значений молекулярной массы белков (это значение может отличаться от предсказанного с помощью компьютерных программ) позволяет оценить уровень специфичности антител, использумых при гибридизации.

Сочетание генетического и биохимического подходов оказалось плодотворным для выделения и идентификации новых ДНК-связывающих белков, контролирующих дифференцировку специализированных клеток цианобактерий - гетероцист. Показано, что белки, не имеющие известных ДНК-связывающих доменов, могут играть роль в регуляции генной экспрессии цианобактерий. Таким образом, при прогнозировании возможной функции белков in silico необходима экспериментальная проверка свойств анализируемых белков.

Изучение экспрессии генов, регулируемых этими новыми факторами транскрипции, проводилось с использованием таких методов функциональной геномики как ДНК-РЖ гибридизация и использование репортерных систем. Показано, что новые ДНК-связывающие белки необходимы для активации экспрессии генов ИерА и ИерС в ходе клеточной дифференцировки и образования гликолипидов, специфичных для гетероцист.

Применение метода ДНК-РНК гибридизации также позволило впервые показать, что GAPDH гены {gapl и gap3) цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 экспрессируются в составе оперонов, а для гена gap3, считавшегося ранее криптическим, впервые выявлены условия его экспрессии в цианобактериях Synechococcus и АпаЪаепа variabilis .

Использование транспозонного мутагенеза позволило идентифицировать два новых гена, контролирующих деление клеток цианобактерий, ftn2 и ftn6. До сих пор практически не было информации о генах цианобактерий, вовлеченных в контроль клеточного деления. Исследования ограничивались лишь несколькими генами, гомологичными соответствующим генам гетеротрофных бактерий. Один из обнаруженных нами генов, ftn2, имеет гомологов во всех зеленых растениях и цианобактериях. Идентификация этого цианобактериального гена позволила обнаружить соответствующий ядерный ген растений (агсб), контролирующий деление хлоропластов. Гомологи второго гена, ftn6, до сих пор обнаружены только в геномах цианобактерий. Примечательно, что ортологи продуктов генов ftn2 и ftn6 в цианобактерии Anabaena sp. РСС 7120 участвуют не только в клеточном делении, но и в дифференцировке клеток.

В работе получены перспективные для использования в фотобиотехнологии мутанты цианобактерии Anabaena variabilis, способные к активному выделению водорода в аэробных условиях. В настощее время, когда секвенирован геном Anabaena variabilis, мутанты представляют и фундаментальный интерес для изучения регуляции водородного метаболизма цианобактерий.

Таким образом, сочетание методов мутационного анализа, функциональной геномики и сравнительной протеомики в приложении к модельным видам цианобактерий позволяет решать фундаментальные научные и практические задачи.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кокшарова, Ольга Алексеевна, Москва

1. Бабыкин М.М., Сидорук К.В., Зинченко В.В., Нефедова JI.H., Церфф Р., Шестаков С.В. Об участии регуляториого гена prqR в развитии устойчивости к метилвиологену у цианобактерии Synechocysiis sp. РСС 6803. Генетика. 2003. Т. 39. №1. С. 25-32.

2. Васильев И., Кокшарова О., Маторин Д., Венедиктов П. Эффект диурона на реакции фотосистемы II в мутантах Synechocysiis 6803, устойчивых к диурону. Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 39-46.

3. Галкин А.Н., Михеева JI.E., Шестаков С.В. Инсерционная инактивация генов, кодирующих серин/треониновые протеиназы эукариотического типа у цианобактерии Synechocysiis sp. РСС 6803. Микробиология. 2003. Т. 72. №1. С. 64-69.

4. Громов Б.В. Ультраструктура сине-зеленых водорослей. Наука, Ленинград, 1976.

5. Громов Б.В. Цианобактерии в биосфере. Энциклопедия «Современное естествознание», Том 2, Общая Биология, под редакцией Ю.П.Алтухова, Издательский Дом МАГИСТР-ПРЕСС, Москва, 2000. С. 307-313.

6. Гусев М.В., Никитина К.А. Цианобактерии. Наука. Москва. 1979.

7. Жевнер В.Д., Глазер В.М., Шестаков С.В. Мутанты Anacystis nidulans с измененным процессом клеточного деления. Микробиология 1973. Т. 42. С. 290-297.

8. Козяков С.Ю., Громов Б.В., Худяков И.Ю. А-1(Ь)-цианофаг сине-зеленойводоросли Anabaena variabilis. Микробиология .1972 Т. 41. С. 555-559.

9. Кокшарова О., Васильев И. Первичные фотосиптетические процессы в мутантах Synechocysiis sp. 6803, неспособных к фотоавтотрофному росту. Физиология растений. 1988. Т.35: С. 472-478

10. Кокшарова О., Шестаков С. Мутанты цианобактерии Synechocystis 6803, устойчивые к ингибиторам фотосинтеза. Вестн Моек Ун-та, СЕР. 16. Биология 1990.1:42-46

11. И. Кокшарова О., Брандт У., Церфф P. Gapl-onepon цианобактерии Synechococcus РСС 7942 кодирует гликогенфосфорилазу и индуцируется в анаэробных условиях. Микробиология. 2004. Т.73. № 3. С. 388-392.

12. Кокшарова О., JIuayd М-Ф., Церфф P. Gap3-ren цианобактерии Synechococcus РСС 7942 экспрессируется в условиях адапации к низким концентрациям С02. Микробиология. 2004. Т.73. № 3. С. 393-397.

13. Кокшарова О. А., Клинт И., Расмуссеп У. Первая белковая карта Synechococcus sp. strain РСС 7942. Микробиология. 2006. Том75, № 6.

14. Кондратьева Е. Н. Биоконверсия солнечной энергии при участии фо-тотрофных микроорганизмов. Прикл биохим. и микробиол. 1978. Т.14, № 6. С. 805—817.

15. Кондратьева Е.Н., Гоготов И.Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. Наука, Москва, 1981.

16. Колотилова Н, Кокшарова О., Фирсов Н, Ивановский Р. Фотоассимиляция диоксида углерода цианобактерией Synechocystis sp. 6803 и ее мутантом, неспособным к фотоавтотрофному росту. Микробиология. 1990. Т.59. С. 165168.

17. Менджул М. И., Нестерова Н. В., Горюшин В. А., Лысенко Т. Г.(1985) Цианофаги вирусы цианобактерий, Наукова Думка, Киев.

18. Михеева Л.Е., Кокшарова О.А., Шестаков С.В. Мутант цианобактерии Anabaena variabilis, АТСС 29413, продуцирующий молекулярный водород. Вестн Моек Ун-та, СЕР. 16. БИОЛОГИЯ 1994. Т.2. С. 54-57.

19. Нефедова Л.Н., Фантин Ю.С., Зинченко В.В., Бабыкин М.М. Гены prqA и mvrA, кодирующие белки-транспортеры, контролируют устойчивость к метилвиологену у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Генетика. 2003. Т.39.№3. С. 336-340.

20. Пиневич А.В., Аверина С.Г. Оксигенная фототрофия. Петербургский университет. Санкт-Петербург. 2002.

21. Полесская О. Г., Мальцев С. В., Красновский А. А. Образование и поглощение водорода культурами и изолированными гетероцистами цианобактерий. Прикл. биохим. и микробиол. 1982. Т.18. № 3. С. 316-323.

22. Полухина Л.Е., Сахуриева Т.Н., Шестаков С.В. Устойчивые к этилендиамину мутанты Anabaena variabilis с дерепрессированной системой азотфиксации. Микробиология. 1982. Т. 51. С. 90-95.

23. Полухина Л., Кокшарова О., Майсурян Н., Шестаков С. Мутанты цианобактерии Anabaena variabilis, устойчивые к метионинсульфоксимину и метронидазолу. Вести Моек Ун-та, СЕР. 16. БИОЛОГИЯ 1985. Т.2. С.59-65

24. Шестаков C.B. Перспективы использования фототрофных бактерий в биотехнологии. 1984. В кн.: Биотехнология. М., Наука, с.212-216.

25. Шестаков С.В., Кокшарова O.A., Трошев В.В., Еланская И.В. Дефектные по фотосинтезу мутанты цианобактерии Synechocystis 6803.Биологические науки. 1988.1:75-80.

26. Шестаков С., Еланская И., Ермакова С., Андрианов В., Ульмасов Т., Кокшарова О. Клонирование фрагментов ДНК, которые восстанавливают способность к фотосинтезу в мутантных клетках Synechocystis РСС6803. ДАН СССР. 1989. Т. 308. С. 211-214.

27. Aboulmagd Е., Oppermann-Sanio FB, Steinbüchel A. Molecular characterization of the cyanophycin synthetase from Synechocystis sp. strain PCC6308. Arch Microbiol. 2000. 174:297-306.

28. Addinal S.G., Lutkenhaus J. FtsA is localized to the septum in an FtsZ-dependent manner. J. Bacteriol. 1996.178:7167-7172.

29. Ajlani G., Meyer I., Vernotte C., Astier C. 1989 Mutation in phenol-type herbicide resistance maps within the psbA gene in Synechocystis 6714. FEBS Lett 246: 207210.

30. Akerlund T., Gullbrand B., Nordstrom K. Effects of the Min system on nucleoid segregation in Escherichia coli. Microbiology 2002. 148:3213-3222.

31. Allen M. B., Arnon D. J. Studies on nitrogen-fixing blue-green algae. 1. Growth and nitrogen fixation by Anabaena cylindrica Lemm. Plant Physyol. 1955. 30: 366372.

32. Allison G., Gough K., Rogers L., Smith A. A suicide vector for allelic recombination involving the gene for glutamate 1-semialdehyde aminotransferase in the cyanobacterium Synechococcus PCC 7942. Mol. Gen. Genet. 1997. 255: 392-399.

33. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997. 25:3389-3402.

34. Anderson S.L., Mcintosh L. Light-activated heterotrophic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803: a blue-light-requiring process. J. Bacteriol. 1991. 173:2761-2767.

35. Andersson C.R., Tsinoremas N.F., Shelton J., Lebedeva N. V., Yarrow J., Min H., Golden S.S. Application of bioluminescence to the study of circadian rhythms in cyanobacteria. Methods Enzymol. 2000. 305:527-542.

36. Angsuthanasombat C., Panyim S. Biosynthesis of 130-kiIodalton mosquito larvicide in the cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6. Appl. Environ. Microbiol. 1989.55:2428-2430.

37. Aono R., Negishi T., Nakajima H. Cloning of organic solvent tolerance gene ostA that determines n-hexane tolerance level in Escherichia coli . Appl. Environ. Microbiol. 1994.60: 4624-4626.

38. Astier C., Elmorjani K., Meyer I., Joset F„ Herdman M. Photosynthetic mutants of the cyanobacteria Synechocystis sp. strain PCC 6714 and PCC 6803: sodium p-hydroxymercuribenzoate as a selective agent. J. Bacteriol. 1984. 158:659-664.

39. Atkins R„ Rose T., Brown R.S., Robb M. The Microcystis cyanobacteria bloom in the Swan River-February 2000. Water Sci Technol 2001.43:107-114.

40. Aviv H., Leder P. Purification of biologically active globin messenger RNA by chromatography on oligothymidylic acid-cellulose. Proc Natl Acad Sci USA 1972. 69:1408-1412.

41. Avissar Y.J., Margalit J., Spielman A. Incorporation of body components of diverse microorganisms by larval mosquitoes. J Amer Mosquito Control Assoc. 1994. 10: 45-50.

42. Badger M. R., Hanson D. 71, Price G. D. Evolution and diversity of C02 concentrating mechanism in cyanobacteria. Functional Plant Biol. 2002. 29:407416.

43. Badger, M. R., and G. D. Price. 2003. CO2 concentrating mechanisms in cyanobacteria: molecular components, their diversity and evolution. J. Exp. Bot. 54:609-622.

44. Balmer Y., Koller A., del Val G., Manieri IV., Schurmann P., Buchanan B. B. Proteomics gives insight into the regulatory function of chloroplast thioredoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. 100:370-375.

45. Barber J: Molecular basis of photoinhibition. In: Mathis P (eds) Photosynthesis: from Light to Biosphere, vol. 4, pp. 159-164.Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands 1995.

46. Barber J., Andersson B. Too much a good thing: light can bebad for photosynthesis. Trends Biochem Sci.1992.17:61-66.

47. Bateman A. The structure of a domain common to archaebacteria and the homocystinuria disease protein. Trends. Biochem. Sci. 1997.22:12-13.

48. Bath J., Wu L. J., Errington J., Wang J. C. Role of Bacillus subtilis SpoIIIE in DNA transport across the mother cell-prespore division septum. Science 2000. 290:995-997.

49. Bauer C.C., Haselkorn R. Vectors for determining the differential expression of genes in heterocysts and vegetative cells of Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 1995.177:3332-3336.

50. Beck B. £)., Arscott P.G., and A. Jacobson. Novel properties of bacterial elongation factor Tu. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978.75:1250-1254.

51. Beebe K. D„ Shin J., Peng J., Chaudhury C., Khera J., Pei D. Substrate recognition through a PDZ domain in tail-specific protease. Biochemistry. 2000. 39:31493155.

52. Belasco J.G., Higgins, C.F. Mechanisms of mRNA decay in bacteria: a perspective. Gene 1988. 72:15-23.

53. Bes M. T., Hernández, J. A., Peleato M. L., M. F. Filial. Cloning, overexpression and interaction of recombinant Fur from the cyanobacterium Anabaena PCC 7119 with isiB and its own promoter. FEMS Microbiol. Lett. 2001. 194:187-192.

54. Bhalerao R. P., Lind L. K., Gustafsson P. Cloning of the cpcE and cpcF genes from Synechococcus sp. PCC 6301 and their inactivation in Synechococcus sp. PCC 7942. Plant Mol. Biol. 1994. 26: 313-326.

55. Bhaya D., Watanabe N., Ogawa T., Grossman A. R. The role of an alternative sigma factor in motility and pilus formation in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96:3188-3193.

56. Bhaya D., Bianco N. R., Bryant D., Grossman A. Type IV pilus biogenesis and motility in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Mol. Microbiol. 2000a. 37: 941-951.

57. Bhaya D., Vaulot D., Amin P., Takahashi A. W., Grossman A. R. Isolation of regulated genes of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by differential display. J. Bacteriol. 2000b 182:5692-5699.

58. Bhaya D., Takahashi A., Grossman A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC 6803. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. 98:7540-7545.

59. Bi E., Lutkenhaus J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature 1991.354:161-164.

60. Billi D., Wright D. J., Helm R. F., Prickett T., Potts M., Crowe J. H. Engineering desiccation tolerance in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2000. 66:16801684.

61. Billi D., Friedmann E. /., Helm R. F„ Potts M. Gene transfer to the desiccation-tolerant cyanobacterium Chroococcidiopsis. J. Bacteriol. 2001. 183:2298-2305.

62. Black T. A., Cai Y., Wolk C. P. Spatial expression and autoregulation of hetR, a gene involved in the control of heterocyst development in Anabaena. Mol. Microbiol. 1993.9: 77-84.

63. Blatch G. L., Lassie M. The tetratricopeptide repeat: a structural motif mediating protein-protein interactions. Bioessays 1999. 21:932-939.

64. Bolhuis A., Koetje E., Dubois J. Y., Vehmaanpera J., Venema G., Bron S., van Dijl J. M. Did the mitochondrial processing peptidase evolve from a eubacterial regulator of gene expression? Mol. Biol. Evol. 2000.17:198-201.

65. Bolter B., Soil J., Schulz A., Hinnah S., Wagner R. Origin of a chloroplast protein importer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. 95: 1583I-I5836.

66. Bonfil D. J., Ronen-Tarazi M., Sultemeyer D., Lieman-Hurwitz J., Schatz D., Kaplan A. A putative HCO3" transporter in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. FEBS Lett. 1998. 430: 236-240.

67. Boot, H. J., Powels P. H. Expression, secretion and antigenic variation of bacterial S-layer proteins. Mol. Microbiol. 1996. 21:1117-1123.

68. Borodin V. B„ Tsygankov A. A., Rao K. K„ Hall D. O. Hydrogen production by Anabaena variabilis PK84 under simulated outdoor conditions. Biotechnol. Bioeng. 2000. 69: 478-485.

69. Bork P., Sander C., Valencia A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89:7290-7294.

70. Borthakur D„ Haselkorn R. Tn5 mutagenesis of Anabaena sp. strain PCC 7120: isolation of a new mutant unable to grow without combined nitrogen. J. Bacteriol. 1989. 171:5759-5761.

71. Bothe H. Hydrogen production by algae. Experientia 1982. 38:59-64.

72. Bothe H., Tennigkeit J., Eisbrenner G. Utilization of molecular hydrogen by blue-green alga Anabaena cylindrical. Arch. Microbiol. 1977.114:43-49.

73. Bouche J. P., Pichoff S. On the birth and fate of bacterial division sites. Mol. Microbiol. 1998. 29:9-26.

74. Braun M., Silhavy T. J. Imp/OstA is required for cell envelope biogenesis in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 2002. 45:1289-1302.

75. Brahamsha B. A genetic manipulation system for oceanic cyanobacteria of the genus Synechococcus. Appl. Env. Microbiol. 1996. 62: 1747-1751.

76. Brahamsha B., Haselkorn R. Isolation and characteriazation of the gene encoding the principal sigma factor of the vegetative cell RNA polymerase from the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 1991. 173:2442-2450.

77. Brahamsha B., Haselkorn R. Identification of multiple RNA polymerase sigma factor homologs in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120: cloning, expression, and inactivation of the sigB and sigC genes. J. Bacteriol. 1992. 174:7273-7282.

78. Bramhill D. Bacterial cell division. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1997. 13:395-424.

79. Bremer D., Gassier C., Rist W., Mayer M. P., Bukau B. Influence of GrpE on DnaK-substrate interactions. J. Biol. Chem. 2004. 279:27957-27964.

80. Brinkmann H., Cerff R., Salomon M., Soil J. Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding the cytosolic precursors of subunits GapA and GapB of chloroplast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from pea and spinach. Plant Mol.Biol. 1989.13:81-94.

81. Broedel S. E„ Wolf R. E. Genetic tagging, cloning, and DNA sequence of the Synechococcus sp. strain PCC 7942 gene (gnd) encoding 6-phosphogluconate dehydrogenase. J. Bacteriol. 1990. 172:4023-4031.

82. Bruns B. U„ Briggs W. R., Grossman A. R. Molecular characterization of phycobilisome regulatory mutants of Fremyella diplosiphon. J. Bacteriol. 1989. 171:901-908.

83. Buchanan B. B. Regulation of CO2 assimilation in oxygenic photosynthesis: the ferredoxin/thioredoxin system: perspective on its discovery, present status, and future development. Arch. Biochem. Biophys. 1991. 288:1-9.

84. Buikema W. J., Haselkorn R Isolation and complementation of nitrogen fixation mutants of the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacterid. 1991. 173:1879-1885.

85. Bukau B. (ed.). 1999. Molecular Chaperones and Folding Catalysts-Regulation, Cellular Function and Mechanisms. Hardwood, Amsterdam.

86. Bukau B„ Horwich A.L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 1998. 92:351-366.

87. Bukau B., Walker G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J. Bacterid. 1989. 171:2337-2346.

88. Bullock W 0., Fernandez J. M., Short J. M. XL-1 Blue: A high effciency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with B-galactosidase selection. Biotechniques 1987. 5: 376-379.

89. Busch S. J., Sassone-Corsi P. Dimers, leucine zippers and DNA-binding domains. Trends Genet. 1990.6:36-40.

90. Cai Y., Wolk C. P. Use of a conditionally lethal gene in Anabaena sp. strain PCC 7120 to select for double recombinants and to entrap insertion sequences. J. Bacterid. 1990. 172:3138-3145.

91. Cai Y., Wolk C. P. Anabaena sp. strain PCC 7120 responds to nitrogen deprivation with a cascade-like sequence of transcriptional activations. J. Bacterid. 1991. 179:267-271.

92. Cai Y„ Wolk C. P. Nitrogen deprivation of Anabaena sp. strain PCC 7120 elicits rapid activation of a gene cluster that is essential for uptake and utilization of nitrate. J. Bacterid. 1997. 179:258-266.

93. Cai Y. A., Murphy J. T., Wedemayer G. J., Glazer A. N. Recombinant phycobil¡proteins. Analyt. Biochem. 2001. 290:186-204.

94. Caldovic L„ Tuchman M. N-acetylglutamate and its changing role through evolution. Biochem. J. 2003. 372:279-290.

95. Callahan S. M„ Buikema W. J. The role of HetN in maintenance of the heterocyst pattern in Anabaena sp. PCC 7120. Mol. Microbiol. 2001. 40: 941-950.

96. Casey E. S., Grossman A. In vivo and in vitro characterization of the lightregulated cpcB2A2 promoter of Fremyella diplosiphon. J. Bacterid. 1994. 176: 6362-6374.

97. Cerff R. The chimeric nature of nuclear genomes and the antiquity of introns as demonstrated by the GAPDH gene sys-tem.In: Go M, Schimmel P (eds) Tracing Biological Evolution in Protein and Gene Structures, pp. 205-227. Elsevier, Amsterdam(1995).

98. Cerff R. Glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (NADP) from Sinapis alba: steady state kinetics. Phytochemistry 1978.17: 2061-2067.

99. Cerff R., Chambers S. E. Subunit structure of higher plant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases (EC 1.2.1.12 and EC 1.2.1.13). J. Biol. Chem.1979. 254:6094-6098.

100. Cerniglia C. E., Gibson D. T., Baalen C. Algal oxidation of aromatic hydrocarbons: formation of 1-naphthol from naphthalene by Agmenellum quadruplicatum, strain PR-6. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. 88:50-58.

101. Cerniglia C. E„ van Baalen C., Gibson D. T. Metabolism of naphthalene by the cyanobacterium Oscillatoria sp., strain JCM. J. Gen. Microbiol. 1980a 116:485494.

102. Cerniglia C. E., Gibson D. T., van Baalen C. Oxidation of naphthalene by cyanobacteria and microalgae. J. Gen. Microbiol. 1980b 116:495-500.

103. Chauvat F., De Vries L., Van der Ende A., Van Arkel G. A. A host-vector system for gene cloning in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Mol. Gen. Genet. 1986 204: 185-191.

104. Cheetham, M.E., Caplan A.J. Structure, function and evolution of DnaJ: conservation and adaptation of chaperone function. Cell Stress Chaperones 1998.3:28-36.

105. Chiang G. G., Schaefer M. R., Grossman A. R. Transformation of the filamentous cyanobacterium Fremyella diplosiphon by conjugation or electroporation. Plant. Physiol. Biochem. 1992. 30: 315-325.

106. Chiînis P. R., Reilly P. A., Nelson N. Insertional inactivation of the gene encoding subunit II of photosystem I from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. J Biol Chem 1989 264:18381-18385.

107. Chungjatupornchai W. Expression of the mosquitocidal-protein genes of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis and the herbicide-resistance gene bar in Synechocystis PCC 6803. Curr. Microbio. 1990. 21:283-288.

108. Churin Y N., Shalak I. N., Borner T., Shesîakov S. V. Physical and genetic map of the chromosome of the unicellular cyanobac-terium Synechocystis sp.strain PCC6803. J. Bact. 1995.177:3337- 3343.

109. Ciferri O. Spirulina, the edible microorganism. Microbiol. Rev. 1983.47:551-578.

110. Ciferri O., Tiboni O. The biochemistry and industrial potential of Spirulina. Annu Rev Microbiol. 1985. 39:503-526.

111. Clément G., Giddey C., Menzi R. Amino acid composition and nutritive value of the alga Spirulina maxima. J Sci Fd Agric 1967. 18:497-501.

112. Coburn G. A., Mackie G. A. Degradation of mRNA in Escherichia coli: an old problem with some new twists. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1999.62:55-108.

113. Cohen M.F., Meeks J.C., Cai Y.A., Wolk C.P. Transposon mutagenesis of heterocyst-forming filamentous cyanobacteria. Methods Enzymol. 1998.297:3-17.

114. Crameri A., Whitehorn E. A., Tate E„ Stemmer W. P. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nature Biotechnol. 1996. 14:315-319.

115. Cronan, J. E. The E. coli bio operon: transcriptional repression by an essential protein modification enzyme. Cell 1989. 58:427-429.

116. Currier T. C., HauryJ. F„ Wolk C. P. Isolation and preliminary characterization of auxotrophs of a filamentous cyanobacterium. J. Bacteriol. 1977. 129:1556-1562.

117. Das A. K., Cohen P. IV., Barford D. The structure of the tetratricopeptide repeats of protein phosphatase 5: implications for TPR-mediated protein-protein interactions. EMBOJ. 1998.17:1192-1199.

118. Das A. K., Cohen P. W., Barford D. The structure of the tetratricopeptide repeats of protein phosphatase 5: implications for TPR-mediated protein-protein interactions. EMBOJ. 1998.17:1192-1199.

119. Debus R. J., Barry B. A., Babcock G. T., Mcintosh L. Site-directed mutagenesis identifies a tyrosine radical involved in the photosynthetic oxygen-evolving system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988. 85:427-430.

120. Doherty H. M., Adams D. G. Cloning and sequence offtsZ and flanking regions from the cyanobacterium Anabaena PCC 7120. 1995. Gene 163:93-99.

121. Dolganov N., Grossman A. R. Insertional inactivation of genes to isolate mutants of Synechococcus sp. strain PCC 7942: isolation of filamentous strains. J.Bacteriol. 1993. 175:7644-7651.

122. Dolganov N„ Grossman A. R. A polypeptide with similarity to phycocyanin a-subunit phycocyanobilin lyase involved in degradation of phycobilisomes. J. Bacteriol. 1999. 181:610-617.

123. Donachie W. D., Begg K.J. "Division potential" in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1996.178:5971-5976.

124. Doolittle R. F., York A. L. Bacterial actins? An evolutionary perspective // Bioessays. 2002. V. 24. P. 293-296.

125. Durham K. A., Porta D., McKay R. M„ Bullerjahn G. S. Expression of the iron-responsive irpA gene from the cyanobacterium Synechococcus sp strain PCC 7942 Arch. Microbiol. 2003. 179:131-134.

126. DurocherD., Jackson S. P.The FHA domain. FEBS Letters 2002. 513:58-66.

127. Dzelzkalns V. A., Bogorad L. Molecular analysis of a mutant defective in photosynthetic oxygen evolution and isolation of a complementing clone by a novel screening procedure. EMBO J. 1988. 7:333-338.

128. Easter J. Jr., Gober J. W. ParB-stimulated nucleotide exchange regulates a switch in functionally distinct ParA activities. Mol. Cell. 2002.10:427-434.

129. Ehling-Schulz M„ Schulz S„ Wait R., Gorg A., Scherer S. The UV-B stimulon of the terrestrial cyanobacterium Nostoc commune comprises early shock proteins and late acclimation proteins. Mol. Microbiol. 2002. 46:827-843.

130. Elhai J. Genetic techniques appropriate for the biotechnological exploitation of cyanobacteria. J. Appl. Phycol. 1994. 6:177-186.

131. Elhai J., Wolk C.P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods Enzymol. 1988a. 167:747-754.

132. Elhai J., Wolk C. P. A versatile class of positive selection vectors based on the nonviability of palindrome-containing plasmids that allows cloning into long polylinkers. Gene 1988b 68:119-138.

133. Elhai J., Wolk C. P. Developmental regulation and spatial pattern of expression of the structural genes for nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena. EMBO J 1990. 9:3379-3388.

134. Elhai J., Thiel T., Pakrasi H. B. DNA transfer into cyanobacteria. In: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) PI Molec Biol Manual A12. Kluwer Academic Publ, Dordrecht, The Netherlands, 1990. 1-23.

135. Elhai J., Vepritskiy A., Muro-Pastor A. M., Flores E., Wolk C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC7120. J. Bacterid. 1997. 179: 1998-2005

136. Ellis B. E. Degradation of phenolic compounds by fresh-water algae. Plant Sci Lett 1977.8:213-216.

137. Engebrecht J., Nealson K., Silverman M. Bacterial bioluminescence: isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri. Cell 1983. 32:773-781.

138. Erickson H. P. Atomic structures of tubulin and FtsZ. Trends Cell Biol. 1998. 8:133-137.

139. Ernst A., Black T„ Cai Y, Panoff J.-M., Tiwari D. N. Wolk C. P. Synthesis of nitrogenase in mutants of the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120 affected in heterocyst development or metabolism. J. Bacteriol. 1992. 174: 60256032.

140. Ermakova-Gerdes S„ Yu Z, Vermaas W. Targeted random mutagenesis to identify functionally important residues in the D2 protein of photosystem II in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol. 2001.183:145-154.

141. Errington, J., Bath J., Wu L. J. DNA transport in bacteria. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001.2:538-545.

142. FedorovA. S., Kosourov S. N., Rao K. K. Hydrogen production by cyanobacteria in an automated outdoor photobioreactor under aerobic conditions, biotechnology and Bioengineering, 2002. 80:777-783.

143. FedorovA. S„ Tsygankov A. A., Rao K. K„ Hall D. O. Production of hydrogen by an Anabaena variabilis mutant in a photobioreactor under aerobic outdoor conditions. In: Miyake J., editor. Biohydrogen 99. Tsukuba, Japan: Elservier. 2000. P.211-216.

144. Feinberg A. P., Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 1984.137: 266.

145. Ferino F., Chauvat F. A promoter-probe vector-host system for the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Gene 1989.84:257-266.

146. Fernandez-Herrero L. A., Olabarria G„ Berenguer J. Surface proteinsand a novel transcription factor regulate the expression of the S-layer gene in Thermus thermophilics HB8. Mol. Microbiol. 1997. 24:61-72.

147. Ferndndez-Pinas F., Wolk C. P. Expression of luxCD-E in Anabaena sp. can replace the use of exogenous aldehyde for in vivo localization of transcription by luxAB. Gene 1994. 150:169-174.

148. Ferndndez-Pinas F„ Leganes F., Wolk C. P. Bacterial lux genes as reporters in cyanobacteria. Methods Enzymol. 2000. 305:513-527.

149. Figge R., Schubert M., Brinkmann H., Cerff R. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene diversity in eubacteria and eukaryotes: evidence for intra- and inter-kingdom gene transfer. J. Mol. Biol. Evol. 1999. 16:429-440.

150. Fink A. Chaperone-mediated protein folding. Physiological Rev. 1999.79:425-449.

151. Finnegan J., Sherratt D. Plasmid ColEl conjugal mobility: the nature of bom, a region required in cis for transfer. Mol. Gen. Genet. 1982. 185:344-351.

152. Flores E., Wolk C. P. Identification of facultatively heterotrophic, N2-fixing cyanobacteria able to receive plasmid vectors from Escherichia coli by conjugation. J. Bacterid. 1985. 162:1339-1341.

153. Flores E., Herrero A. Assimilatory nitrogen metabolism and its regulation. In: Bryant DA (eds) The Molecular Biology of Cyanobacteria, pp. 487-517. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands 1994.

154. Fogg G. E., Stewart W D. P., Fay P., Walsby A. E. The Blue-Green Algae. Academic Press, London 1973.

155. Foran D. R., Brown W. M. Nucleotide sequence of the LuxA and LuxB genes of the bioluminescent marine bacterium Vibrio fisheri. Nucleic. Acids Res. 1988. 16:777

156. Frias J., Flores E., A. Herrero. Requirement of the regulatory protein NtcA for the expression of nitrogen assimilation and heterocyst development genes in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Mol. Microbiol. 1994. 14:823-832.274

157. Frías J„ Flores E., Herrero A. Activation of the Anabaena nir operon promoter requires both NtcA (CAP family) and NtcB (LysR family) transcription factors. Mol. Microbiol. 2000. 38:613-625.

158. Fried M., Crothers D. M. 1981. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9:65056525.

159. Fujita Y., Takahashi Y., Chuganji M., Matsubara H. The niffl-Yike (JrxC) gene is involved in the biosynthesis of chlorophyll in the filamentous cyanobacterium Plectonema boryanum. Plant Cell Physiol. 1992. 33:81-92.

160. Fulda S., Huang F., Nilsson F., Hagemann M., Norling B. Proteomics of Synechocystis sp. strain PCC 6803. Identification of periplasmic proteins in cells grown at low and high salt concentrations. Eur. J. Biochem. 2000.267: 5900-5907.

161. Funk C., Vermaas W. A cyanobacterial gene family coding for single-helix proteins resembling part of the light-harvesting proteins from higher plants. Biochemistry 1999.38:9397-9404.

162. Gao K. Chinese studies on the edible blue-green alga Nostoc flagelliforme: a review. J. Appl. Phycol. 1998. 10:37-49.

163. Garczarek L., Hess W. R., Holtzendorff J., van der Staay G. W. M., Partensky F. Multiplication of antenna genes as a major adaptation to low light in a marine prokaryote. Proc. Natl. Acad. Sci USA 2000. 97: 4098-4101.

164. Garner M. M., Revzin A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: applications to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 1981. 9:3047-3060.

165. Genin S., Boucher C. A. A superfamily of proteins involved in different secretion pathways in gram-negative bacteria: modular structure and specificity of the N-terminal domain. Mol. Gen. Genet. 1994. 243:112-118.

166. Gerdes K., Moller-Jensen J., Ebersbach G., Kruse T., K. Nordstrom. Bacterial mitotic machineries. Cell. 2004.116:359-366.

167. Gething M.-J. Protein folding. The difference with prokaryotes. Nature 1997.388:329-331.

168. Ghassemian M., Straus N. A. Fur regulates the expression of iron-stress genes in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. Microbiology 1996. 142: 1469-1476.

169. Gisby P. F, Rao K., Hall D. O. Entrapment techniques for chloroplasts, cyanobacteria and hydrogenases. Methods Enzymol. 1987. 135:440-454.

170. Glazer A. N. Phycobiliproteins. Methods Enzymol. 1988. 167: 291-303.

171. Goebl M., Yanagida M. The TPR snap helix: a novel protein repeat motif from mitosis to transcription. Trends Biochem. Sci. 1991. 16:173-177.

172. Golden J. W., Wiest D. R. Genome rearrangement and nitrogen fixation in Anabaena blocked by inactivation of xisA gene. Science 1988. 242:1421-1423.

173. Golden S. S. Mutagenesis of cyanobacteria by classical and gene-transfer based methods. Methods Enzymol.1988 167: 714-727.

174. Golden S. S., Sherman L. A. A hybrid plasmid is a stable cloning vector for the cyanobacterium Anacystis nidulans R2. J. Bacteriol. 1983. 155:966-972.

175. Golden S. S., Sherman L. A. Optimal conditions for genetic transformation of the cyanobacterium Anacystis nidulans R2. J. Bacteriol. 1984.158:36-42.

176. Golden S. S., Brusslan J., Haselkorn R. Expression of a family of psbA genes encoding a photosystem II polypeptide in the cyanobacterium Anacystis nidulans R2. EMBO J. 1986. 5:2789-2798.

177. Golden S. S., Brusslan J., Haselkorn R. Genetic engineering of the cyanobacterial chromosome. Methods Enzymol. 1987. 153:215-231.

178. Golden S. S„ Canales S. R. Cyanobacterial circadian clocks-timing is everything. Nat. Rev. Microbiol. 2003. 1:191-199.

179. Gonzales T., Robert-Baudouy J. Bacterial aminopeptidases: properties and functions. FEMS Microbiol Rev. 1996 18:319-344.

180. Gorl M., Sauer J., Baier T., Forchhammer K. Nitrogen-starvation-induced chlorosis in Synechococcus PCC 7942: adaptation to long-term survival. Microbiology. 1998. 144:2449-2458.

181. Gornicki P., Scappino L. A., Haselkorn R. Genes for two subunits of acetyl coenzyme A carboxylase of Anabaena sp. strain PCC 7120: biotin carboxylase and biotin carboxyl carrier protein. J. Bacteriol. 1993.175:5268-5272.

182. Gottlieb L. D. Conservation and duplication of isozymes in plants. Science 1982. 216:373-380.

183. Gitai Z, Dye N., Shapiro L. An actin-like gene can determine cell polarity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci U S A. 2004.101:8643-8648.

184. Graham J. E., Clark-Curtiss J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96: 11554-11559.

185. Grant S. G. N., Jessee J., Bloom F. R., Hanahan D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. 87:4645-4649.

186. Graumann P. L. SMC proteins in bacteria: condensation motors for chromosome segregation? Biochimie 2001. 83:53-59.

187. Gray M. W. Origin and evolution of organelle genomes. Curr. Opin. Genet. Devel. 1993.3:884-890.

188. Grigorieva G., Shestakov S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp. 6803. FEMS Microbiol. Lett. 1982. 13:367-370.

189. Gupta R„ Thomas P., Beddington R. S. P., Rigby P. W. J. Isolation of developmental^ regulated genes by differential display screening of cDNA libraries. Nucl. Acids. Res. 1998.26:4538-4539.

190. Hall D. R., Bond C. S„ Leonard G. A., Watt C. I., Berry A., Hunter W. N. Structure of tagatose-l,6-bisphosphate aldolase. Insight into chiral discrimination, mechanism, and specificity of class II aldolases. J. Biol. Chem. 2002. 277:2201822024.

191. Hansel A., Pattus F., Jurgens U. J., Tadros M. H. Cloning and characterization of the genes coding for two porins in the unicellular cyanobacterium Synechococcus PCC 6301. Biochim. Biophys. Acta. 1998. 1399:31-39.

192. Harry E. J., Rodwell J., Wake R. G. Co-ordinating DNA replication with cell division in bacteria: a link between the early stages of a round of replication and mid-cell Z ring assembly. Mol Microbiol. 1999. 33:33-40.

193. HartlF.U. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 1996.381:571579.

194. Haselkorn R. Molecular genetics of nitrogen fixation in photosynthetic prokaryotes. In: Tikhonovich IA, Provorov NA, Romanov VI, Newton WE (eds) Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995. pp. 29-36.

195. Hebbar P. B., Curtis S. E. Characterization of devH, a gene encoding a putative DNA binding protein required for heterocyst function in Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 2000. 182:3572-3581.

196. Hein S., Tran H, Steinbüchel A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch. Microbiol. 1998. 170:162-170.

197. Helms M. K., Jameson D.M. Polymerization of an Escherichia coli elongation factor Tu. Arch Biochem Biophys. 1995. 321:303-310.

198. HenikoffS., Haughn G. W, Calvo J. M„ Wallace J. C. A large family of bacterial activator proteins. Proc. Natl. Acad. Sei U S A 1988. 85:6602-6606.

199. Herdman M., CarrN. G. The isolation and characterization of mutant strains of the blue-green alga Anacystis nidulans. J. Gen. Microbiol. 1972. 70:213-220.

200. Herdman M., Janvier M., Rippka R., Stanier R. Y. Genome size of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 1979.111:73-85.

201. Herdman M., Coursin T., Rippka R., Houmard J., Tandeau de Marsac N. A new appraisal of the prokaryotic origin of eukaryotic phytochromes. J. Mol. Evol. 2000. 51:205-213.

202. Herrero A., Muro-Pastor A., Flores E. Nitrogen control in cyanobacteria. J. Bacteriol. 2001.183:411-425.

203. Heukeshoven J., Dernick R. Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 1988. 9:28-32.

204. Higgins D. G., Sharp P. M. CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignments on a microcomputer. Gene 1988.73:237-244.

205. Hihara Y., Kamei A., Kanehisa M., Kaplan A., Ikeuchi M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell 2001. 13:793-806.

206. Hirosawa M., Isono K., Hayes W., Borodovsky M. Gene identification and classification in the Synechocystis genomic sequence by recursive gene mark analysis. DNA Seq. 1997. 8:17-29.

207. Hirota Y., Ryter A., Jacob F. Thermosensitive mutants of E. coli affected in the processes of DNA synthesis and cellular division. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1968.33:677-693.

208. Hirschberg J., Chamovitz D. Carotenoids in cyanobacteria. In: Bryant D. A. (ed), The Molecular Biology of Cyanobacteria. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 1994. pp 559-579.

209. Hitzfeld B. C., Hoger S. J., Dietrich D. R. Cyanobacterial toxins: removal during drinking water treatment, and human risk assessment. Environ Health Perspect 2000. 108:113-122.

210. Hofmann K., Bucher P. The FHA domain: a putative nuclear signaling domain found in protein kinases and transcription factors. Trends Biochem. Sci. 1995. 20:347-349.

211. Hohn B., Murray K: Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophages particles in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1977. 74: 3259.

212. Hood W., Carr N. G. Association of NAD and NADP linked glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the blue-green alga Anabaena variabilis. Planta 1969. 86:250-258.

213. Hood W., Carr N. G. A single glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase active with NAD and NADP in Anabaena variabilis. Biochim. Biophys. Acta 1967. 146: 309-311.

214. Hu N-T., Thiel T„ Giddings T. H., Wolk C. P. New Anabaena and Nostoc cyanophages from sewage settling ponds. Virology 1982. 114:236-246.

215. Huang F., Parmryd I, Nilsson F., Persson A. L., Pakrasi H. B., Andersson B., Norling B. Proteomics of Synechocystis sp. Strain PCC 6803: Identification of plasma membrane proteins. Mol. Cell. Proteomics 2002. 1:956-966.

216. Huber 0., Sumper M. Algal-CAMs: isoforms of a cell adhesion molecule in embryos of the alga Volvox with homology to Drosophila fasciclin I . EMBO J. 1994. 13:4212-4222.

217. Hunding, A., Ebersbach G., Gerdes K. A mechanism for ParB-dependent waves of ParA, a protein related to DNA segregation during cell division in prokaryotes. J. Mol. Biol. 2003.329:35-43.

218. Hunsucker S. W., Klage K., Slaughter S. M„ Potts M., Helm R. F. A preliminary investigation of the Nostoc punctiforme proteome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. 317:1121-1127.

219. Ingram L. 0., Thurston E. L. Cell division in morphological mutants of Agmenellum quadruplicatum, strain BG-1. Protoplasma 1970. 71:55-75.

220. Ingram L. O., Van Baalen C. Characteristics of a stable, filamentous mutant of a coccoid blue-green alga. J. Bacteriol. 1970. 102:784-789.

221. Ingram L. O., Van Baalen C., Fisher W.D. Cell division mutations in the blue-green bacterium Agmenellum quadruplicatum strain BG1: a comparison of the cell wall. J. Bacteriol. 1972. 11:614-621.

222. Ingram L. O., Fisher W.D. Novel mutant impaired in cell division: evidence for a positive regulating factor. J. Bacteriol. 1973a. 113:999-1005.

223. Ingram, L. O., Fisher W. D. Mechanism for the regulation of cell division in Agmenellum. J. Bacteriol. 1973b. 113:1006-1014.

224. Ingram I. O., Olson G. J., Blackwell M. M. Isolation of a small-cell mutant in the blue-green bacterium Agmenellum quadruplicatum. J. Bacteriol. 1975. 123:743746.

225. Jacobs C„ Shapiro I. Bacterial cell division: a moveable feast. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1999.96:5891-5893.

226. Jensen R.B., Shapiro I. Proteins on the move: dynamic protein localization in prokaryotes. Trends Cell. Biol. 2000. 10:483-488.

227. Jensen R. B., Wang S. C., Shapiro I. Dynamic localization of proteins and DNA during a bacterial cell cycle. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. 3:167-176.

228. Jones L. J. F., Carballido-Lopez R., Errington J. Control of cell shape in bacteria: helical, actin-like filaments in Bacillus subtilis. Cell. 2001. 104:913-922.

229. Johnson J. M., Church G.M. Alignment and structure prediction of divergent protein families: periplasmic and outer membrane proteins of bacterial efflux pumps. J. Mol. Biol. 1999.287:695-715.

230. Jornvall H., Persson B., KrookM., Atrian S., Gonzalez-Duarte R., JefferyJ., Ghosh D. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR). Biochemistry 1995. 34:60036013.

231. Jung 71, Dailey M. A novel and inexpensive source of allophycocyanin for multicolor flow cytometry. J. Immunol. Meth. 1989.121:9-18.

232. Kadonaga, J. 71, Tjian R. Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. 83:5889-5893.

233. Kaiser K, Murray N. E. The use of phage lambda replacement vectors in the construction of representative genomic DNA libraries. In: Glover DM (eds) DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1, pp. 1-48. IRL Press, Oxford 1988.

234. KameiA., Yuasa 71, Orikawa K, GengX. X, Ikeuchi M. A eukaryotic-type protein kinase, SpkA, is required for normal motility of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacterid. 2001. 183: 1505-1510.

235. Kaneko 71, Matsubayashi 71, Sugita M., Sugiura M. Physical and gene maps of the unicellular cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC6301 genome. Plant. Mol. Biol. 1996b 31:19-201.

236. Kaneko T, Tabata S Complete genome structure of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. Plant Cell Physiol. 1997. 38:1171-1176.

237. Kappock T. J., Ealick S. E., Stubbe J. Modular evolution of the purine biosynthetic pathway. Curr Opin Chem Biol. 2000.4:567-572.

238. Katayama T., Kubota T., Kurokawa K., Crooke E., Sekimizu K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell 1998. 94:61-71.

239. Katayama M., Tsinoremas N. F., Kondo T., Golden S. S. cpmA, a gene involved in an output pathway of the cyanobacterial circadian system. J. Bacteriol. 1999. 181: 3516-3524.

240. Kawakami H., Iwura T., Takata M„ Sekimizu K., Hiraga S., Katayama T. Arrest of cell division and nucleoid partition by genetic alterations in the sliding clamp of the replicase and in DnaA. Mol. Genet. Genomics 2001. 266:167-179.

241. Kay R. A. Microalgae as food and supplement. Crit. Rev. Food Sci Nutr. 1991. 30: 555-573.

242. Kentemtch T., Bahnweg M., Mayer F., Bothe H. 1989. Localization of the reversible hydrogenase m cyanobactena. Z. Naturforsch. 440:384-391.

243. Kentemich T„ Haverkamp G., Bothe H. Die gewinnung von molekularen Wasserstoff durch cyanobakterien. Naturwissenchaften. 1990. 77:12-18.

244. Khudyakov I., Wölk C. P. Evidence that the hanA gene coding for HU protein is essential for heterocyst differentiation in, and cyanophage A-4(L) sensitivity of, Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 1996. 178:3572-3577.

245. Kiel J.A.K W., Boels J.M., Beldman G., Venema G. Nucleotide sequence of the Synechococcus sp. PCC7942 branching enzyme gene (glgB): expression in Bacillus subtilis . Gene. 1990. 89:77-84.

246. Klint J., Rasmussen U., Bergman B. FtsZ may have dual roles in the filamentous cyanobacterium Nostoc/Anabaena sp. Strain PCC 7120. J. Plant Physiol, (in press).

247. Kohn J., Wilchek M. A new approach (cyano-transfer) for cyanogen bromide activation of sepharose at neutral pH, which yields activated resins, free of interfering nitrogen derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. 107:878884.

248. Koksharova O. A., Wölk C. P. Novel DNA-Binding Proteins in the Cyanobacterium Anabaena sp. Strain PCC 7120. J. Bacteriol. 2002. 184:3931-3940.

249. Koksharova O. A., Wölk C. P. Genetic tools for cyanobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. 58:123-137.

250. Koksharova O. A., Wölk C. P. A novel gene that bears a DnaJ motif influences cyanobacterial cell division. J. Bacteriol. 2002. 184. 5524-5528.

251. Köhler U., Cerff R., Brinkmann H. Transaldolase genes from the cyanobacteria Anabaena variabilis (ATCC 29413) and Synechocystis sp. PCC 6803: Comparison with other eubacterial and eukaryotic homologs. Plant Mol. Biol. 1996. 30: 213— 218.

252. Kondo T., Ishiura M. Circadian rhythms of cyanobacteria: monitoring the biological clocks of individual colonies by bioluminescence. J. Bacterid. 1994. 176:1881-1885.

253. Kondo T., Strayer C. A., Kulkarni R. D„ Taylor W„ Ishiura M„ Golden S. S„ Johnson C. H. Circadian rhythms in prokaryotes: luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1993. 90: 5672-5676.

254. Kondo T., Tsinoremas N. F., Golden S. S., Johnson C. H., Kutsuna S., Ishiura M. Circadian clock mutants of cyanobacteria. Science 1994. 266:1233-1236.

255. Kong R„ XuX., Hu Z A TPR-family membrane protein gene is required for light-activated heterotrophic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol. Lett. 2003. 219:75-79.

256. Konno M., Sano Y., Okudaira K., Kaxvaguchi Y., Yamagishi-Ohmori Y., Fushinobu S., Matsuzawa H. Escherichia coli cyclophilin B binds a highly distorted form of trans-prolyl peptide isomer. Eur. J. Biochem. 2004. 271:3794-3803.

257. Kovacs E., vander Vies S. M., Glatz A., TorokZ., Varvasovszki V., HorvathI, Vigh L. The chaperonins of Synechocystis PCC 6803 differ in heat inducibility and chaperone activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001.289:908-915.

258. Kreps S., Ferino F., Mosrin C., Gerits J., Mergeay M, Thuriaux P. Conjugative transfer and autonomous replication of promiscuous IncQ plasmid in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Mol. Gen. Genet. 1990. 221: 129-133.

259. Kruse T., Moller-Jensen J., Lobner-Olesen A., Gerdes K. Dysfunctional MreB inhibits chromosome segregation in Escherichia coli. EMBO J. 2003. 22:52835292.

260. Kufryk G. I., Vermaas W. F. J. A novel protein involved in the functional assembly of the oxygen-evolving complex of photosystem II in Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry 2001. 40:9247-9255.

261. Kuhn I., Peng L., Bedu S„ Zhang C.-C. Developmental regulation of the cell division protein FtsZ in Anabaena sp. strain PCC 7120, a cyanobacterium capable of terminal differentiation. J. Bacteriol. 2000.182:4640-4643.

262. Kulkarni R. D., Golden S. S. mRNA stability is regulated by a coding-region element and the unique 5' untranslated leader sequences of the three Synechococcus psbA transcripts. Mol. Microbiol. 1997.24:1131-1142.

263. Kunert A., Hagemann M., Erdmann N. Construction of promoter probe vectors for Synechocystis sp. PCC 6803 using light-emitting reporter systems Gfp and LuxAB. J. Microbiol. Methods 2000. 41:185-194.

264. Kumada Y., Benson D. R., Hillemann D., Hosted T. J., Rochefort D. A., Thompson C. J., Wohlleben W., Tateno Y. Evolution of the glutamine synthetase gene, one of the oldest existing and functioning genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. 90:3009-3013.

265. Kumar J. K., Tabor S„ Richardson C. C. Proteomic analysis of thioredoxin-targeted proteins in Escherichia coli. 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101:37593764.

266. Kuritz T., Wolk C. P. Use of filamentous cyanobacteria for biodégradation of organic pollutants. Appl. Env. Microbiol. 1995.61:234-238.

267. Kyrpides N. C., Ouzounis C. A. Nucleic acid-binding metabolic enzymes: living fossils of stereochemical interactions? J. Mol. Evol. 1995.40:564-569.

268. Labarre J., Chauvat F„ Thuriaux P. Insertional mutagenesis by random cloning of antibiotic resistance genes into the genome of the cyanobacterium Synechocystis strain PCC 6803. J. Bacteriol. 1989. 171:3449-3457.

269. Lamb J. R., Tugendreich S., Hieter P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem. Sci. 1995. 20:257-259.

270. Lambert G. R., Smith G. D. Hydrogen metabolism by filamentous cyanobacteria. Arch. Biochem Biophys. 1980. 211:360-367.

271. Lambert G. R., Smith G. D., Smith G. Duration of hydrogen formation by Anabaena cylindrica in atmospheres of argon, air and nitrogen. Appl. Env. Alicrobiol. 1979.38:530-536.

272. Landschulz W. H., Johnson P. F., McKnight S. L. The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science 1988.240:1759-1764.

273. LangN. J., Simon R. D., Wolk C. P. Correspondence of cyanophycin granules with structured granules in Anabaena cylindrica. Arch. Mikrobiol. 1972. 83:313-320.

274. Langley K. E., Villarejo M. R., Fowler A. K., Zamenhof P. J., Zabin I. Molecular basis of beta-galactosidase alpha-complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1975.72:1254-1257.

275. Laufen T., Mayer M. P., Beisel C., Klostermeier D., Mogk A., Reinstein J., Bukau B. Mechanism of regulation of Hsp70 chaperones by DnaJ cochaperones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96:5452-5457.

276. Lemaire M., Ohayon H., Gounon P., Fujino T„ Beguin P. OlpB, a new outer layer protein of Clostridium thermocellum, and binding of its S-layer-like domains to components of the cell envelope. J. Bacteriol. 1995.177:2451-2459.

277. Lemon K. P., Grossman A. D. The extrusion-capture model for chromosome partitioning in bacteria. Genes Dev. 2001. 15:2031-2041.

278. Len A. C., Harty D. W., Jacques N. A. Stress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance. Microbiology 2004.150:1339-1351.

279. Levin, P.A., Losick R. Asymmetric division and cell fate during sporulation in Bacillus subtilis, pp. 167-189. In Brun YV, and LJ Shimkets, (eds), Prokaryotic Development. Am. Soc. Microbiol., Washington, DC. 2000.

280. Li C., Kappock T. J., Stubbe J., Weaver T. M., Ealick S. E. X-ray crystal structure of amino imidazole ribonucleotide synthetase (PurM), from the Escherichia coli purine biosynthetic pathway at 2.5 A resolution. Structure Fold Des. 1999. 7:11551166.

281. Li S.-J., Cronan J. E., Jr. Growth rate regulation of Escherichia coli acetyl coenzyme A carboxylase, which catalyzes the first committed step of lipid biosynthesis. J. Bacteriol. 1993. 175:332-340.

282. Li H., Singh A. K., Mclntyre L. M., Sherman L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol. 2004.186:3331-3345.

283. Lindblad P. Cyanobacterial H2-metabolism: knowledge and potential/strategies for a photobiotechnological production of H2. Biotecnol Apl. 1999.16:141 -144.

284. Liu Y., Golden S. S., Kondo T., Ishiura M., Johnson C. H. Bacterial luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria. J. Bacteriol. 1995. 177: 2080-2086.

285. Liu Y., Tsinoremas N. F., Golden S. S., Kondo T„ Johnson C. H. Circadian expression of genes involved in the purine biosynthetic pathway of the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. Mol. Microbiol. 1996. 20:1071-1081.

286. Liu Y., Tsinoremas N. F. An unusual gene arrangement for the putative chromosome replication origin and circadian expression of dnaN in Synechococcus sp. strain PCC 7942. Gene 1996.172:105-109.

287. Liu M., Yang Y, Romeo T. The product of the pleiotropic Escherichia coli gene csrA modulates glycogen biosynthesis via effects on mRNA stability. J. Bacteriol. 1995. 177:2663-2672.

288. Long M., De-Souza S. J., Rosenberg C., Gilbert W. Exon shuffling and the origin of the mitochondrial targeting function in plant cytochrome cl precursor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. 93:7727-7731.

289. Los D. A., Murata N. Responses to cold shock in cyanobacteria. Mol Microbiol Biotechnol. 1999. 1:221-230.

290. Lowe J., Amos L.A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature 1998.391:203-206.

291. Lowe J., van den Ent F., Amos L. A. Molecules of the bacterial cytoskeleton. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. 33:177-198.

292. Luinenburg I., Coleman J. R. Arequirement for phosphoenolpyruvate carboxylase in the cyanobacterium Synechococcus PCC 7942. Arch. Microbiol. 1990. 154: 47M74.

293. Luque I., HerreroA., Flores E., Madueho F. Clustering of genes involved in nitrate assimilation in the cyanobacterium Synechococcus. Mol. Gen. Genet. 1992.232:711.

294. Lupas A., Engelhardt H., Peters J., Santarius U., Volker S., Baumeister W. Domain structure of the Acetogenium kivui surface layer revealed by electron crystallography and sequence analysis. J. Bacteriol. 1994. 76:1224-1233.

295. Mackinney G. Absorption of light by chlorophyll solutions. J. Biol. Chem. 1941. 140:315-322.

296. Madueno F., Borrias W.E., Van Arkel G.A., Guerrero M.G. Isolation and characterization of Anacystis nidulans R2 mutants affected in nitrate assimilation: establishment of two new mutant types. Mol. Gen. Genet. 1988. 213:223-228.

297. Mann M, Hendrickson R. C., Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annu.Rev.Biochem. 2001. 70:437-473.

298. Marcus V., Altman-Gueta H., Finkler A., Gurevitz M. Dual role of cysteine 172 in redox regulation of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activity and degradation. J. Bacteriol. 2003. 185:1509-1517.

299. Margolin W. Themes and variations in prokaryotic cell division. FEMS Microbiol. Rev. 2000. 24:531-548.

300. Marin K., Zuther E., Kerstan T., Kunert A., Hagemann M. The ggpS gene from Synechocystis sp. strain PCC 6803 encoding glucosyl-glycerol-phosphate synthase is involved in osmolyte synthesis. J. Bacteriol. 1998. 180:4843-4849.

301. Marraccini P., Bulteau S., Cassier-Chauvat C., Mermet-Bouvier P., Chauvat F. A conjugative plasmid vector for promoter analysis in several cyanobacteria of the genera Synechococcus and Synechocystis. Plant. Mol. Biol. 1993.23: 905-909.

302. Marraccini P., Cassier-Chauvat C., Bulteau S., Chavez S., Chauvat F. Lightregulated promoters from Synechocystis PCC6803 share a consensus motif involved in photoregulation. Mol. Micriobiol. 1994. 12:1005-1012.

303. Martin W. Gene transfer from organelles to the nucleus: frequent and in big chunks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003. 100: 8612-8614.

304. Martin W., Brinkmann H., Savona C., Cerff R. Evidence for a chimeric nature of nuclear genomes: eubacterial origin of eukaryotic glyceraIdehyde-3-phosphate dehydrogenase genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. 90: 8692-8696.

305. Martin W„ Cerff R. Prokaryotic features of a nucleus-encoded enzyme: cDNA sequences for chloroplast and cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases from mustard. Eur. J. Biochem. 1986. 159: 323-331.

306. Martinez M. R. Nostoc commune Vauch., a nitrogen-fixing blue-green alga, as source of food in the Philippines. Philippine Naturalist 1988. 71: 295-307.288

307. Martinez-Ferez I. M„ Vioque A. Nucleotide sequence of the phytoene desaturase gene from Synechocystis sp. PCC 6803 and characterization of a new mutation which confers resistance to the herbicide norflurazon. Plant. Mol. Biol. 1992. 18: 981-983.

308. Martinez P., Martin W., Cerff R. Structure, evolution and anaerobic regulation of a nuclear gene encoding cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from maize. J. Molec. Biol. 1989. 208:551-565.

309. Maruyama K., Sato N., Ohta N. Conservation of structure and cold-regulation of RNA-binding proteins in cyanobacteria: probable convergent evolution with eukaryotic glycine-rich RNA-binding proteins. Nucleic Acids Res. 1999. 27: 20292036.

310. Mary I., Tu C-J., Grossman A., Vaulot D. Effects of high light on transcripts of stress-associated genes for the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 and Prochlorococcus MED4 and MIT9313. Microbiology. 2004. 50:1271-1281.

311. Mateos M. I., Serrano A. Occurrence of phosphorylating and non-phosphorylating NADP+-dependent glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenases in photosynthetic organisms. Plant Sci 1992. 84:163-170.

312. Matveyev A. V., Young K. T., Meng A., Elhai J. DNA methyltransferases of the cyanobacterium Anabaena PCC 7120. Nucleic Acids Res. 2001. 29:1491-1506.

313. Mayer F. Cytoskeletons in prokaryotes. Cell Biol. Int. 2003. 27:429-438.

314. Mazouni K., Domain F., Cassier-Chauvat C., Chauvat F. Molecular analysis of the key cytokinetic components of cyanobacteria: FtsZ, ZipN and MinCDE. Mol. Microbiol. 2004.52: 1145-1158.

315. McCarthy J., Hopwood F., Oxley D., Laver M., Castagna A., Righetti P. G., Williams K., Herbert B. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis myth or reality? J. Proteome Res. 2003.2:239-242.

316. McFadden G., Gilson P. Something borrowed, something green: lateral transfer of chloroplasts by secondary endosym-biosis. TREE 1995. 10: 12-17.

317. Megharaj M., Venkateswarlu K., Rao A. S. Metabolism of monocrotophos and quinalphos by algae isolated from soil. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1987. 39: 251-256.

318. Mermet-Bouvier P., Cassier-Chauvat C„ Marraccini P., Chauvat F. Transfer and replication of RSFlOlO-derived plasmids in several cyanobacteria of the genera Synechocystis and Synechococcus. Curr. Microbiol. 1993. 27:323-327.

319. Mesnage S., Fontaine T., Mignot T., Delepierre M., Mock M., Fouet A. Bacterial SLH domain proteins are non-covalently anchored to the cell surface via a conserved mechanism involving wall polysaccharide pyruvylation. EMBO J. 2000. 19:4473-4484.

320. Mikheeva L. E., Schmitz O., Shestakov S. V., Bothe H. Mutants of the cyanobacterium Anabaena variabilis altered in hydrogenase activities. Z Naturforsch 1995. 50c: 505-510.

321. Mirelman D. Biosynthesis and assembly of cell wall peptidoglycan / Bacterial outer membranes // Ed. Inouye M., John Wiley & Sons, Inc., New York, 1979. P. 115166.

322. Miyake M., Takase K., Narato M., Khatipov E„ Schnackenberg J., Shirai M., Kurane R., Asada Y. Polyhydroxybutyrate production from carbon dioxide by cyanobacteria. Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. 84:991-1002.

323. Miyagishima S., Wolk C. P., Osteryoung K. W. Identification of cyanobacterial cell division genes by comparative and mutational analyses. Mol. Microbiol. 2005. 56: 126-143.

324. Moller-Jensen J., Lowe J. Increasing complexity of the bacterial cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 2005. 17:75-81.

325. Morand L. Z, Cheng R. H., Krogmann D. IV., Ho K. K. Solubleelectron transfer catalysts of cyanobacteria. In: Bryant DA(eds) The Molecular Biology of Cyanobacteria, pp. 381-407.Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, 1994.

326. Mori S., Castoreno A., Mulligan M. E., hammers P. J. Nitrogen status modulates the expression of RNA-binding proteins in cyanobacteria. FEMS Microbiol. Lett. 2003.227:203-210.

327. Moser D. P., Zarka D., Kallas T. Characterization of a restriction barrier and electrotransformation of the cyanobacterium Nostoc PCC 7121. Arch. Microbiol. 1993.160:229-237.

328. MrázekJ., Bhaya D., Grossman A. R., Karlin S. Highly expressed and alien genes of the Synechocystis genome. Nucleic Acids Res. 2001. 29:1590-1601.

329. Mühlenhoff U., Chauvat F. Gene transfer and manipulation in the thermophilic cyanobacterium Synechococcus elongatus. Mol. Gen. Genet. 1996. 252:93-100.

330. Mukherjee A., Lutkenhaus J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 1998.17:462-469.

331. Muro-Pastor M. I., Reyes J. C., Florencio F. J. Cyanobacteria perceive nitrogen status by sensing intracellular 2-oxoglutarate levels. J. Biol. Chem. 2001. 276:38320-38328.

332. Muro-Pastor A. M., Valladares A., Flores E., Herrero A. The hetC gene is a direct target of the NtcA transcriptional regulator in cyanobacterial heterocyst development. J. Bacterid. 1999.181:6664-6669.

333. Murphy R. C., Stevens S. E. Cloning and expression of the crylVD gene of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis in the cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 and its resulting larvicidal activity. Appl. Environ. Microbiol. 1992. 58:16501655.

334. Murry M. A., Wolk C. P. Identification and initial utilization of a portion of the smaller plasmid of Anabaena variabilis ATCC 29413 capable of replication in Anabaena sp. strain M-131. Mol. Gen. Genet. 1991. 227:113-119.

335. Murray N. E. Phage lambda and molecular cloning. In: Hendrix RW(eds) Lambda II Monograph 13, pp. 395^32. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1983.

336. Nagaraja R., Haselkorn R. Protein HU from the cyanobacterium Anabaena. Biochimie 1994.76:1082-1089.

337. Narro M. L., Cerniglia C. E., van Baalen C., Gibson D. T. Metabolism of phenanthrene by the marine cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6. Appl. Environ. Microbiol. 1992. 58:1351-1359.

338. Narusaka Y, Narusaka M., Kobayashi H., Satoh K. The herbicide-resistant species of the cyanobacterial D1 protein obtained by thorough and random in vitro mutagenesis. Plant Cell Physiol. 1998. 39:620-626.

339. Neidhardt F. C., VanBogelen R. A. Proteomic analysis of bacterial stress responses. In "Bacterial stress responses", Storz G., Hengge-Aronis R. (eds), ASM Press, Washington, D.C., 2000, 445-452.

340. Nichols B. W., Wood B. J. B. New glycolipid specific to nitrogen-fixing blue-green algae. Nature (Lond.) 1968. 217:767-768.

341. Nicholson A. W. Escherichia coli ribonucleases: paradigm for understanding cellular RNA metabolism and regulation. In: D'Alessio G, Riordan JF (eds) Ribonucleases Structures and Functions. Academic Press, San Diego, CA, 1997. pp 1-49.

342. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S., von Heijne G.A. Neural network method for identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Int J Neural Syst. 1997. 8:581-599.

343. Nimura K„ Yoshikawa H., Takanashi H. 1994. Identification of dnaK multigene family in Synechococcus sp. PCC7942. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201:466-471.

344. Nimura K., Takahashi H., Yoshikawa H. Characterization of the dnaK multigene family in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC7942. J. Bacterid. 2001.183:1320-1328.

345. Norris V., Woldringh C., Mileykovskaya E. A hypothesis to explain division site selection in Escherichia coli by combining nucleoid occlusion and Min. FEBS Lett. 2004.561:3-10.

346. Nyhus K. J., Thiel T., Pakrasi H. B. Targeted interruption of the psaA and psaB genes encoding the reaction-centre proteins of photosystem I in the filamentous cyanobacterium Anabaena variabilis ATCC 29413. Mol. Microbiol. 1993) 9: 979988

347. Ochoa de Alda J. A., Houmard J. Genomic survey of cAMP and cGMP signalling components in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Microbiology 2000. 146:3183-3194.

348. O' Farrell P.H. High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 1976. 250:4007-4021.

349. Ogino H., Wachi M., Ishii A., Iwai N., Nishida T., Yamada S., Nagai K, Sugai M. FtsZ-dependent localization of GroEL protein at possible division sites. Genes to cells. 2004.9:765-771.

350. Ohkawa H., Price G., Badger M., Ogawa T. Mutation of ndh genes leads to inhibition of CO2 uptake rather than HCO3' uptake in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol. 2000. 182:2591-2596.

351. Ohtsuka K, Hata M. Molecular chaperone function of mammalian Hsp70 and Hsp40-a review. Int. J. Hyperthermia 2000.16:231-245.

352. Oka A., Sugisaki H., Takanami M. Nucleotide sequence of the kanamycin resistance transposon Tn903. J. Mol. Biol. 1981. 147:217-226.

353. O'Shea E. K, Rutkowski R., Kim P. S. Evidence that the leucine zipper is a coiled coil. Science 1989. 243:538-542.

354. Osteryoung K. W., Stokes K D„ Rutherford S. M. Percival A. L., Lee W. Y Chloroplast division in higher olants requires members of two functionally divergent gene families with homology to bacterial ftsZ. Plant Cell 1998. 10:19912004.

355. PaciorekJ., Kardys K, Lobacz B., Wolska K.I. Escherichia coli defects caused by null mutations in dnaK and dnaJgenes. Acta Microbiol. Pol. 1997. 46:7-17.

356. Pakrasi H. B„ Riethman H. C., Sherman L. A. Organization of pigment proteins in the photosystem II complex of the cyanobacterium Anacystis nidulans R2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. 82:6903-6907.

357. Pakrasi H. B., Williams J. G. K., Arntzen C. J. Targeted mutagenesis of the psbE and psbF genes blocks photosynthetic electron transport: evidence for a functional role of cytochrome b559 in photosystem 11. EMBO J. 1988. 7:325-332.

358. PallenM., Chaudhuri R., Khan A. Bacterial FHA domains: neglected players in the phospho-threonine signalling game? TRENDS Microbiol. 2002. 10:556-563.

359. Pandey R., Chauhan S., Singal G. S., Kale R. K Spectral light quality affects protein profile of Synechococcus sp. PCC 7942: a comparative 2-dimensional gel electrophoresis (2-DGE) analysis. Current Microbiol. 2000. 40:297-301.

360. Pandey A., Mann M. Proteomics to study genes and genomes. Nature 2000. 405: 837-846.

361. Papen H., Kentemich T., Schmulling T., Bothe H. Hydrogenase activities in cyanobacteria. Biochimie 1986. 68:121-132.

362. Papen H., Neuer G., Sauer A., Bothe H. Properties of glyceraldehyde-3-P dehydrogenase in heterocysts and vegetat-ive cells of cyanobacteria. FEMS Microbiol. Lett. 1986. 36:201-206.

363. Partensky F., Hess W. R., Vaulot D. Prochlorococcus, a marine photosynthetic prokaryote of global significance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. 63:106-127.

364. Pecker I., Ohad N., Hirschberg J. The chloroplast-encoded type of herbicide resistance is a recessive trait in cyanobacteria. In: Biggins J (ed) Progress in Photosynth Res, vol III. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrccht, 1987, pp 811-814.

365. Peschek G. A. Respiratory electron transport. In: Fay P, van Baalen C (eds) The Cyanobacteria, Elsevier Sci-ence Publishers, Amsterdam, 1987, pp. 119-161.

366. Pieulle L., Guedeney G., Cassier-Chauvat C., Jeanjean R., Chauvat F., Peltier G. The gene encoding the NdhH subunit of type 1 NAD(P)H dehydrogenase is essential to survival of Synechocystis PCC6803. FEBS Lett. 2000. 487: 272-276.

367. Poncelet M., Cassier-Chauvat C., Leschelle X., Bottin //., Chauvat F. Targeted deletion and mutational analysis of the essential (2Fe-2S) plant-like ferredoxin in Synechocystis PCC 6803 byplasmid shuffling. Mol. Microbiol. 1998. 28:813-821.

368. Powell B., Mergeay M„ Christofi N. Transfer of broad-host-range plasmids to sulphate-reducing bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 1989. 59:269-274.

369. Prentki P., Binda A., Epstein A. Plasmid vectors for selecting IS 1-promoted deletions in cloned DNA: sequence analysis of the omega interposon. Gene 1991. 103:17-23.

370. Prior C„ Mamessier P., Fukuhara //., Chen X. J., Wesolowski-Louvel M. The hexokinase gene is required for transcriptional regulation of the glucose transporter gene RAG1 in Kluyveromyces lactis. Mol. Cell Biol. 1993. 13:3882-3889.

371. Pyke R. A., Page A. M. Plastid ontogeny during petal development in Arabidopsis. Plant Physiol. 1998. 116:797-803.

372. Pyke R. A., Rutherford S. M., Robertson E. J., Leech R. M. Arc6, fertile Arabidopsis mutant with only two mesophyll cell chloroplasts. Plant Physiol. 1994. 106:1169-1177.

373. Qian Q., Keeling P. J. Diplonemid glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and prokaryote-to-eukaryote lateral gene transfer. Protist. 2001. 152: 193-201.

374. Raskin D. M„ de Boer P. A. Rapid pole-to-pole oscillation of a protein required for directing division to the middle of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999a. 96:4971-4976.

375. Raskin D. M., de Boer P. A. MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli. J. Bacterid. 1999b. 181:6419-6424.

376. ReastonJ., Duyvesteyn M. G. C., de WaardA. Nostoc PCC7542, a cyanobacterium which contains five sequence-specific deoxyribonucleases. Gene 1982. 20:103110.

377. Reumann S., Davila-Aponte J., Keegstra K The evolutionary origin of the protein-translocating channel of chloroplastic envelope membranes: identification of a cyanobacterial homolog. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96: 784-789.

378. Richmond C. S., Glasner J. D., Mau R., Jin H., Blattner F. R. Genome-wide expression profiling in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res 1999. 27: 38213835.

379. Rimon A., Oppenheim A. B. Heat induction of the blue-green alga Plectonema boryanum lysogenic for the cyanophage SPlctsl. Virology 1975. 64:454-463.

380. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J. B., Herdman M., Stanier R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 1979. Ill: 1-61.

381. Roberts M. W„ Rabinowitz J. C. The effect of Escherichia coli ribosomal protein SI on the translational specificity of bacterial ribosomes. J. Biol. Chem. 1989. 264: 2228-2235.

382. Robertson E. J., Pyke K. A., Leech R. M. Arc6, an extreme chloroplast division mutant of Arabidopsis also alters proplastid proliferation and morphology in shoot and root apices. J. Cell Sci. 1995. 108:2937-2944.

383. Romeo T. Global regulation by the small RNA-binding protein CsrA and the non-coding RNA molecule CsrB. Mol. Microbiol. 1998. 29:1321-1330.

384. Romeo T., Kumar A., Preiss J. Analysis of the Escherichia coli glycogen gene cluster suggests that catabolic enzymes are encoded among the biosynthetic genes. Gene. 1988.70:363-376.

385. Rothfield L., Justice S., Garcia-Lara J. Bacterial cell division. Annu Rev. Genet. 1999. 33:423-448.

386. Rouhiainen L., Paulin L., Suomalainen S., Hyytiainen H., Buikema W., Haselkorn R„ Sivonen K. Genes encoding synthetases of cyclic depsipeptides, anabaenopeptilides, in Anabaena strain 90. Mol. Microbiol. 2000. 37:156-167.

387. Rujan T., Martin W. How many genes in Arabidopsis come from cyanobacteria? An estimate from 386 protein phylogenies. Trends Genet. 2001. 17:113-120.

388. Sakamoto T., Bryant D. A. Nitrate transport and not photoinhibition limits growth of the freshwater cyanobacterium Synechococcus species PCC 6301 at low temperature. Plant Physiol. 1999.119:785-794.

389. Salmond G. P., Reeves P. J. Membrane traffic wardens and protein secretion in gram-negative bacteria. Trends Biochem. Sci. 1993.18:7-12.

390. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.

391. Sandstrom S., Ivanov A. G., Park Y. I., Oquist G., Gustafsson P. Iron stress responses in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942. Physiol. Plant. 2002.116:255-263.

392. Sarma T. A., Kaur B. Characterization of host-range mutants of cyanophage N-l. Acta Virol. 1997.41:245-250.

393. Sauer J., Schreiber U., SchmidR., Volker U., Forchhammer K. Nitrogen starvation-induced chlorosis in Synechococcus PCC 7942. Low-level photosynthesis as a mechanism of long-term survival. Plant Physiol. 2001.126:233-243.

394. Sazuka T„ Ohara 0. Towards a proteome project of cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803: linking 130 protein spots with their respective genes. Electrophoresis 1997. 18:1252-1258.

395. Sazuka T., YamaguchiM., Ohara 0. Cyano2Dbase updated: linkage of 234 protein spots to corresponding genes through N-terminal microsequencing. Electrophoresis 1999. 20:2160-2171.

396. Schena M., Shalon D„ Davis R. W., Brown P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995. 270: 467-470.

397. Scherer G., Telford J., Baldari C., Pirotta V. Isolation of cloned genes differentially expressed at early and late stages of Drosophila embryonic development. Devel. Biol. 1981. 86:438-447.

398. Schinzel R., Nidetzky B. Bacterial alpha-glucan phosphorylases. FEMS Microbiol. Lett. 1999. 171:73-79.

399. Schmetterer G„ Wölk C. P., Elhai J. Expression of luciferases from Vibrio harveyi and Vibrioßscheri in filamentous cyanobacteria. J. Bacteriol. 1986. 167:411-414.

400. Schmetterer G. Cyanobacterial respiration. In: Bryant DA (eds) The Molecular Biology of Cyanobacteria, pp. 409-435. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, 1994.

401. Schmitz O., Boison G., Hilscher R., Hundeshagen B., Zimmer W, Lottspeich F., Bothe H. Molecular biological analysis of a bidirectional hydrogenase from cyanobacteria. Eur. J. Biochem. 1995. 233:266-276.

402. Schütz K., Happe T., Troshina O., Lindblad P., Leitäo E., Oliveira P., Tamagnini P. Cyanobacterial H2 production a comparative analysis. Planta 2004. 218:350359.

403. Schwartz S. H„ Black T. A., Jäger K., Panoff J-M., Wölk C. P. Regulation of an osmoticum-responsive gene in Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 1998. 180:6332-6337.

404. Schwarz R., Grossman A. R. A response regulator of cyanobacteria integrates diverse environmental signals and is critical for survival under extreme conditions. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. 95:11008-11013.

405. Sergeeva E„ LiaimerA., Bergman B. Evidence for production of the phytohormone indole-3-acetic acid by cyanobacteria. Planta. 2002. 215:229-238.

406. Sergeyenko T. V., Los D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiol. Lett. 2000. 193:213-216.

407. Sergeyenko T. V., Los D. A. Cyanobacterial leader peptides for protein secretion. FEMS Microbiol. Lett. 2003. 218:351-357.

408. Shapiro L., Losick R. Dynamic spatial regulation in the bacterial cell. Cell 2000.100:89-98.

409. Shen G., Boussiba S., Vermaas W. F. J. Synechocystis sp PCC 6803 strains lacking photosystem I and phycobilisome function. Plant Cell 1993. 5: 1853-1863.

410. Sherman L. A., Brown R. M. Cyanophages and viruses of eukaryotic algae. In: Fraenkel-Conrat H, Wagner RR (eds) Comprehensive Virology, Plenum Press, NY, 1978.

411. Sherratt D. J. Bacterial chromosome dynamics. Science 2003. 301:780-785.

412. Shestakov S. V., Khyen N. T. Evidence for genetic transformation in the blue-green alga Anacystis nidulans. Mol. Gen. Genet. 1970. 107:372-375.

413. Shestakov S. V., Reaston J. Gene transfer and host-vector sys-tems of cyanobacteria. Oxford Surv Plant Mol. Cell. Biol. 1987. 4:137-166.

414. Shevchenko A., Chernushevich I., Wilm M., Mann M. De novo peptide sequencing by nanoelectrospray tandem mass spectrometry using triple quadrupole and quadrupole/time-of-flight instruments. Methods Mol Biol. 2000.146:1-16.

415. Shih Y. L., Le T., Rothfield L. Division site selection in Escherichia coli involves dynamic redistribution of Min proteins within coiled structures that extend between the two cell poles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003.100:7865-7870.

416. Sikorski R. S., Boguski M. S., Goebl M., Hieter P. A repeating amino acid motif in CDC23 defines a family of proteins and a new relationship among genes required for mitosis and RNA synthesis. Cell 1990. 60:307-317.

417. Simon R. D. Cyanophycin granules from the blue-green alga Anabaena cylindrical a reserve material consisting of copolymers of aspartic acid and arginine. Proc Natl Acad Sci USA 1971. 68:265-267.

418. Simon R. D. (a). The effect of chloramphenicol on the production of cyanophycin granule polypeptide in the blue-green alga Anabaena cylindrica. Arch. Mikrobiol. 1973.92:115-123.

419. Simon R. D. (b). Measurement of the cyanophycin granule polypeptide contained in the blue-green alga Anabaena cylindrica. J. Bacteriol. 1973. 114:1213-1216.

420. Simon R. D. The biosynthesis of multi-L-arginyl-poly(L-aspartic acid) in the filamentous cyanobacterium Anabaena cylindrica. Biochim. Biophys. Acta 1976. 422:407-418.

421. Simon R. D. Inclusion bodies in the cyanobacteriaxyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies. In: Fay. P and Van Baalen C (eds) The Cyanobacteria, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 1987. pp 199-225.

422. Singh R. N„ Tiwari D. N. Induction by ultraviolet irradiation of mutation in the blue-green alga Nostoc linckia (Roth) Born, et Flah. Nature 1969. 221:62-64.

423. Singh A. K., Sherman L. A. Identification of iron-responsive, differential gene expression in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 with a customized amplification library. J. Bacteriol. 2000. 182:3536-3543.

424. Sirover M. A. Emerging new functions of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in mammalian cells. Life Sci 1996. 58:2271-2277.

425. Smith A., Quivey R., Faustoferri R. Cloning and nucleotide sequence analysis of the Streptococcus mutants membrane-bound, proton-translocating ATPase operon. Gene. 1996. 183:87-96.

426. Soballe B., Poole R. K. Microbial ubiquinones: multiple roles in respiration, gene regulation and oxidative stress management. Microbiology 1999. 145:1817-1830.

427. Soballe B., Poole R. K. Ubiquinone limits oxidative stress in Escherichia coli. Microbiology 2000. 146:787-796.

428. Sode K, Tatara M., Takeyama H., Burgess J. G., Matsunaga T. (a) Conjugative gene transfer in marine cyanobacteria: Synechococcus sp., Synechocystis sp. and Pseudanabaena sp. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. 37:369-373.

429. Sode K, Tatara M., Ogawa S., Matsunaga T. (b) Maintenance of broad host range vector pKT230 in marine unicellular cyanobacteria. FEMS Microbiol. Lett. 1992. 99:73-78.

430. Soltes-Rak E., Kushner D. J., Williams D. D., Coleman J. R. Effect of promoter modification on mosquitocidal crylVB gene expression in Synechococcus sp. strain PCC 7942. Appl. Environ. Microbiol. 1993. 59:2404-2410.

431. Soltes-Rak E., Kushner D. J., Williams D. D., Coleman J. R. Factors regulating crylVB gene expression in the cyanobacterium Synechococcus PCC 7942. Mol. Gen. Genet. 1995.246:301-308.

432. Sorkhoh N., Al-Hasan R., Radwan S., Hopner T. Self-cleaning of the Gulf. Nature 1992.359:109.

433. Sorkhoh N. A., Al-Hasan R. H., Khanafer M„ Radwan S. S. Establishment of oil-degrading bacteria associated with cyanobacteria in oil-polluted soil. J. Appl. Bacteriol. 1995.78:194-199.

434. Stevens S. E., Porter R. D. Transformation in Agmenellum quadruplicatum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980. 77:6052-6056.

435. Stewart W. D. P., Fitzerald G. P., Bums R. H. Acetylene reduction by nitrogen-fixing blue-green algae. Arch. Microbiol. 1968. 62:336-340.

436. Stitt M. The flux of carbon between the chloroplast and the cytosol. In: Dennis DT, Turpin DH (eds) Plant Physiology, Biochemistry and Molecular Biology, pp. 309— 326. Longman, Singapore, 1990.

437. Sueltemeyer D., Klughammer B., Badger M., Price G. Fast induction of high-affinity HC03" transport in cyanobacteria. Plant. Physiol. 1998. 116:183-192.300

438. Sullivan S. M., Maddock J. R. 2000. Bacterial division: finding the dividing line. Curr. Biol. 10:249-252.

439. Suzuki K., Ehara T., Osafune T., Kuroiwa H., Kawano S., Kuroiwa T. Behavior of mitochondria, chloroplasts and their nuclei during the mitotic cycle in the ultramicroalga Cyanidioschyzon merolae. Eur. J. Cell Biol. 1994. 63:280-288.

440. Suzuki I., Los D. A., Kanesaki Yu., Mikami K., Murata N. The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocysiis. EMBO J. 2000.19:1327-1334.

441. Suzuki I., Kanesaki Y, Mikami K., Kanehisa M., Murata N. Cold-regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocysiis. Mol. Microbiol. 2001. 40: 235-244.

442. Sveshnikov D. A., Sveshnikova N. V., Rao K. K., Hall D. O. Hydrogen metabolism of mutant forms of Anabaena variabilis in continuous cultures and under nutritional stress. FEMS Microbiol. Lett. 1997. 147:297-301.

443. Tamagnini P., Costa J-L., Almeida L., Olivera M-J., Salema R., Lindblad P. Diversity of cyanobacterial hydrogenases, a molecular approach. Curr Microbiol 2000. 40:356-361.

444. Tamagnini P., Axelsson R., Lindberg P., Oxelfelt F., Wunschiers R., Lindblad P. 2002. Hydrogenases and hydrogen metabolism of cyanobacteria. Micobiology and Molecular Biology Reviews, 66:1 -20.

445. Tandeau de Marsac N., de la Torre F., Szulmajster J. Expression of the larvicidal gene of Bacillus sphaericus 1593M in the cyanobacterium Anacystis nidulans R2. Mol. Gen. Genet. 1987. 209:396-398.

446. Taroncher-Oldenburg G., Stephanopoulos G. Targeted, PCR-based gene disruption in cyanobacteria: inactivation of the polyhydroxyalkanoic acid synthase genes in Synechocysiis sp. PCC 6803. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. 54:677-680.

447. Thiel T. Genetic analysis of cyanobacteria. In: Bryant DA (ed) The Molecular Biology of Cyanobacteria. Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, 1994, pp 581-611.

448. Thiel T., Poo H. Transformation of a filamentous cyanobacterium by electroporation. J. Bacteriol. 1989. 171:5743-5746.

449. Thiel T., Lyons E. M., ErkerJ. C., Ernst A. A second nitrogenase in vegetative cells of a heterocyst-forming cyanobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. 92: 9358-9362.

450. Thiery I., Nicolas L., Rippka R., Tandeau de Marsac N. Selection of cyanobacteria isolated from mosquito breeding sites as a potential food source for mosquito larvae. Appl. Environ. Microbiol. 1991. 57:1354-1359.

451. Thomaides H. B., Freeman M., El Karoui M., Errington J. Division site selection protein DivIVA of Bacillus subtilis has a second distinct function in chromosome segregation during sporulation. Genes Dev. 2001. 15:1662-1673.

452. Tichy M., Vermaas W. In vivo role of catalase-peroxidase in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol. 1999. 181:1875-1882.

453. Tichy M„ Vermaas W. Combinatorial mutagenesis and pseudorevertant analysis to characterize regions in loop E of the CP47 protein in Synechocystis sp. PCC 6803. Eur. J. Biochem. 2000. 267:6296-6301.

454. Tiwari D. N. The heterocysts of the blue-green alga Nostochopsis lobatus: effects of cultural conditions. New Phytol. 1978. 81:853-856.

455. Tsinoremas N. F„ Kutach A. K., Strayer C. A., Golden S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp. strains PCC 7942 and PCC 6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. J. Bacteriol. 1994. 176:6764-6768.

456. Tsygankov A. A., Serebryakova L. T„ Rao K. K., Hall D. O. Acetylene reduction and hydrogen photoproduction by wild-type and mutant strains of Anabaena at different C02 and 02 concentrations. FEMS Microbiol. Letters 1998.167:13-17.

457. Tsygankov A. A., Borodin V. B„ Rao K. K„ Hall D. O. H2 photoproduction by bath culture of Anabaena variabilis ATCC 29413 and its mutant PK84 in a photobioreactor. Biotechnol Bioeng 1999. 64: 709-715.

458. Umeda H., Aiba H., Mizuno T. SomA, a novel gene that encodes a major outermembrane protein of Synechococcus sp. PCC 7942. Microbiology. 1996. 142: 2121-2128.

459. Vachhani A. K., Iyer R. K., Tuli R. A mobilizable shuttle vector for the cyanobacterium Plectonema boryanum. J. Gen. Microbiol. 1993. 139:569-573,

460. Vazquez-Bermudez M. F., Paz-Yepes J., Herrero A., Flores E. The NtcA-activated amtl gene encodes a permease required for uptake of low concentrations of ammonium in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942. Microbiol. 2002. 48:861-869.

461. Vega-Palas M. A., Madueno F., Herrero A., Flores E. Identification and cloning of a regulatory gene for nitrogen assimilation in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. J. Bacteriol. 1990. 172:643-647.

462. Vermaas W. F. J. Molecular genetics of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: principles and possible biotechnology applications. J. Appl. Phycology 1996. 8:263-273.

463. Vermaas W. Gene modifications and mutation mapping to study the function of photosystem II. Methods Enzymol. 1998. 297:293-310.

464. Vermaas W., Charité J., Shen G. Z. Glu-69 of the D2 protein in photosystem II is a potential ligand to Mn involved in photosynthetic oxygen evolution. Biochemistry 1990.29:5325-5332.

465. Vinnemeier J., Hagemann M. Identification of salt-regulated genes in the genome of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by subtractive RNA hybridization. Arch. Microbiol. 1999. 172:377-386.

466. Vitha S., Froehlich J. E., Koksharova 0., Pyke K. A., van Erp H., Osteryoung K. W. ARC6 is a J-domain plastid division protein and an evolutionary descendant of the cyanobacterial cell division protein Ftn2. Plant Cell 2003. 15:1918-1933.

467. Vlcek C., Paces V., Maltsev N. Paces J., Haselkorn R., Fonstein M. Sequence of a 189-kb segment of the chromosome of Rodobacter capsulatus SB 1003. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94:9384-9388.

468. Wachi M., Matsuhashi M. Negative control of cell division by mreB, a gene that functions in determining the rod shape of Escherichia coli cells. J. Bacteriol. 1989. 171:3123-3127.

469. Watanabe K., Iwashiro T„ Suzuki Y. Features of dnaK operon genes of the obligate thermophile Bacillus thermoglucosidasius KP1006. Antonie Van Leeuwenhoek. 2000.77:241-250.

470. Weisshaar H„ Boger. Pathways of hydrogen uptake in the cyanobacterium Nostoc muscorum. Arch. Microbiol. 1985. 142:349-353.

471. Wilkinson C. R., Fay P. Nitrogen fixation in coral reef sponges with symbiotic cyanobacteria. Nature 1979.279:527-529.

472. Williams J. G„ Szalay A. A. Stable integration of foreign DNA into the chromosome of the cyanobacterium Synechococcus R2. Gene 1983. 24: 37-51.

473. Wilm M., Shevchenko A., Houthaeve T., Breit S., Schweigerer L„ Fotsis 71, Mann M. Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. Nature. 1996. 379:466-469.

474. Wolk C. P. Heterocyst formation in Anabaena. In: Y.V. Brun and L.J. Shimkets (ed), Prokaryotic Development. American Society for Microbiology, Washington. 2000, pp.83-104.

475. Wolk C. P., VonshakA., Kehoe P., Elhai J. Construction of shuttle vectors capable of conjugative transfer from Escherichia coli to nitrogen-fixing filamentous cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984. 81: 1561-1565.

476. Wolk C. P., Cai Y., Panoff J.-M. Use of a transposon with luciferase as a reporter to identify environmentally responsive genes in a cyanobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991.88:5355-5359.

477. Wolk C. P., Elhai J., Kuritz T., Holland D. Amplified expression of a transcriptional pattern formed during development of Anabaena. Mol. Microbiol. 1993.7:441-445.

478. Wolk C. P. Heterocyst formation. Annu Rev. Genet. 1996. 30:59-78.

479. Wolk C. P., Kraus J. Two approaches to obtaining low, extracellular deoxyribonuclease activity in cultures of heterocyst-forming cyanobacteria. Arch. Microbiol. 1982. 131:302-307.

480. Wood Z. A„ Schroder E., Robin Harris J., Poole L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends Biochem Sci. 2003.28:32-40.305

481. Wu J., Pond W. Amino acid composition and microbial contamination of Spirulina maxima, a blue-green alga, grown on the effluent of different fermented animal wastes. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1981.27:151 -159.

482. Xia Z„ Broadhurst R. W„ Laue E. D„ Bryant D. A., Golbeck J. H„ Bendall D. S. Structure and properties in solution of PsaD, an extrinsic polypeptide of photosystem I. Eur. J. Biochem. 1998.255:309-316.

483. Xu X., Kong R., Hu Y. High larvicidal activity of intact recombinant cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 expressing gene 51 and gene 42 of Bacillus sphaericus sp. 2297. FEMS Microbiol. Lett. 1993. 107:247-250.

484. Xu X., Yan G., Kong R., Liu X., Yu L. Analysis of expression of the binary toxin genes from Bacillus sphaericus in Anabaena and the potential in mosquito control. Curr. Microbiol. 2000. 41:352-356.

485. Xu X, Wolk C. P. Role for hetC in the transition to a nondividing state during heterocyst differentiation in Anabaena sp. J. Bacteriol. 2001. 183:393-396.

486. Yalowitz J. A., Jayaram H. N. Molecular targets of guanine nucleotides in differentiation, proliferation and apoptosis. Anticancer Res. 2000. 20:2329-2338.

487. Yamamoto K, Pyke K A., Kiss J. Z. Reduced gravitropism in inflorescence stems and hypocotyls, but not roots, of Arabidopsis mutants with large plastids. Physiol. Plant. 2002. 114: 627-636.

488. Yanisch-Perron C., VieiraJ., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 1985. 33:103-119.

489. Yoon H-S., Golden J. W. Heterocyst pattern formation controlled by a diffusible peptide. Science 1998.282:935-938.

490. Yu R., Yamada A., Watanabe K, Yazawa K, Takeyama H., Matsunaga T., Kurane R. Production of eicosapentaenoic acid by a recombinant marine cyanobacterium, Synechococcus sp. Lipids 2000. 35:1061-1064.

491. Yura K, Toh H., Go M. Putative mechanism of natural transformation as deduced from genome data. DNA Res. 1999. 6:75-82.

492. Zak E., Norling B., Maitra R., Huang F., Andersson B., Pakrasi H. B. The initial steps of biogenesis of cyanobacterial photosystems occur in plasma membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. 23:13443-13448.

493. Zhang C.-C., Huguenin S„ Friry A. Analysis of genes encoding the cell division protein FtsZ and a glutathione synthetase homologue in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Res. Microbiol. 1995. 146:445-455.

494. Zhao N., Hashida H„ Takahashi N. Misumi Y„ Sakaki Y. High-density cDNA filter analysis: a novel approach for large-scale quantitative analysis of gene expression. Gene 1995.156:207-213.

495. Zhao G., Pease A. J., Bharani N. Winkler M. Biochemical characterisation of gapB-tncoded erythrose 4-phosphate dehydrogenase of Escherichia coli K-12 and its possible role in pyridoxal 50-phosphate biosynthesis. J. Bacteriol. 1995. 177:2804-1-2812.

496. Zhou M„ BhasinA., ReznikoffW. S. Molecular genetic analysis of transposase-end DNA sequence recognition: cooperativity of three adjacent base-pairs in specific interaction with a mutant Tn5 transposase. J. Mol. Biol. 1998. 276:913-925.

497. Zhou R., Wolk C. P. Identification of an akinete marker gene in Anabaena variabilis. J. Bacteriol. 2002. 184:2529-2532.

498. Zhu J., Kong R„ Wolk C. P. Regulation of hepA of Anabaena sp. strain PCC 7120 by elements 5' from the gene and by hepK. J. Bacteriol. 1998.180:4233-4242.

499. Zhu J., Jager K, Black T., Zarka K, Koksharova 0.,Wolk C. P. HcwA, an autolysin, is required for heterocyst maturation in Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol. 2001. 183:6841-6851.

500. Zhulin I. B. A novel phototaxis receptor hidden in the cyanobacterial genome. J Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000.2:491-493.

Информация о работе

Кокшарова, Ольга Алексеевна
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кокшарова, Ольга Алексеевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки"

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кокшарова, Ольга Алексеевна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кокшарова, Ольга Алексеевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки
ВАК РФ 03.00.15, Генетика