Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физическое картирование генома цианобактерии SYNECHOCYSTIS sp. РСС 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Физическое картирование генома цианобактерии SYNECHOCYSTIS sp. РСС 6803"

12 5 С э 3 2,

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ АН БЕЛАРУСИ

На правах рукописи ШАЛАК Игорь Николаевич

ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОМА ЦИАНОБАКТЕРИИ БУ^СНОСУБИЗ ер. РСС 6803

03.00.15 — генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 1992

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского государственного университета им. М. Е Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ : доктор биологических наук КАМЕНЕВА С. Е

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук,профессор 50МИЧЕВ 1йК

кандидат биологических наук БАКАНЧИКОВА Т. И.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ : ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЯ ХИМИИ РАН (г. Мэсква)

Защита состоится _1992 г.

в часов на заседании специализированного совета . К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика в ; .статуте генетики и цитологии АНБ по адресу : г. Минск, ул. Ф. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомится в Центральной научной библиотеке им. Я. Ко ласа

автореферат разослан__1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета К 006.02.01 .к. б. н.

Лобанок Е.Е

; ВВЕДЕНИЯ

,. Актуальность темы исследования. Фотосинтез является основным :Исто'«ЙКом органического вещества и кислорода на планоте. Удобной моделью для генетического изучения фотосинтеза являются цианобак-терии, у которых процесс фотосинтеза, как и у высших растений и водорослей, сопровождается выделением кислорода. В последние годы возрос интерес к фотогетеротрофной цианобактерии Synechocyetla вр. РСС 6803 (Synechocystls 6803), у которой клонировано большинство известных генов, контролирующих синтез структурных компонентов фотосинтетического аппарата (Rogner et al., 1990). Генетическое картирование этих генов у Synechocystia 6803 ограничено из-за отсутствия систем трансдукции и конъюгациснного ^реноса.

Использование метода пульс-электрофореза (Янковский, 1989) для"разделения крупных (более 50 т.п.н.) фрагментов ДНК позволяет строить физические карта хромосом различных бактерий и локализовать на них гены с помощью гибридизации. Физическая и генетическая карты были недавно получены для азотфиксирующой цианобактерии АпаЪаепа sp. РСС 7120 (Bancroft et al.,1989). Цель й задачи исследования. Данная работа посвящено построению физической и генетической карты генома Synechocyatis 6803 В задачи данной работы входило:

1. Отработка методики получения препаратов высокомолекулярной ДНК Synechocyatie 6803; 2.Определение рестрикциошшх эндонуклеаз (РЭ), расщепляющих хромосомную ДНК Synechocyatiß 6803 цр достаточно крупные фрагменты; 3.Создание физической карты генома Synechocystls 6803 с использованием редкощепящих рестрикциошшх эндонуклеаз; 4. Локализация генов фотосинтеза на физической карте Synechocystls 6803.

Лаучнпя^говизш^ и__Щ)актаческая^ детюсть. Отработана методика

- г -

выделения высокомолекулярной ДНК Synechooystis 6803, что позволяет производить рестрикцию и мечение непосредственно в агарозном геле. Для хромосомы Synechocyetie 6803 установлены редкощепящие РЭ и определен размер фрагментов образуемых ими ДНК. Эти дашше могут быть использованы при анализе полиморфизма длины рестрик-циошшх фрагментов ДНК Synechooystis 6803 с последующем клонированном генов неселектшших маркеров (Beckmann et ai.,1983). Определен размер генома Synechocystis 6803, который составляет 3300 " 3400 т.п.н. Построена физическая карта хромосомы Synechocyetie 6803. Используя ДНК-зонды различных генов, можно картировать их положение на физической карте хромосомы Synechooystis 6803 , что позволит получить информацию о структурно-функциональной организации генома цианобактерии. В настоящей работе установлено положенно 13 генов фотосинтеза на физической карте хромосомы Synechocystis 6803.

Апробация работы. Материалы диссертации долокены на семинарах Института общей генетики РАН, кафедры генетики и селекции Биологического факультета МГУ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 103 стр., содержит 13 рисунков и 9 таблиц. Список литературы включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали бактериологически чистую культуру Synechocystis sp. рос баоз из коллекции Пастеровского института (Франция). Выделение тотального препарата ДНК из клеток Synecho-cystie 6803 проводили ПО методу (Grigorieva, Shestakov 1982). Выдологаю плазмидной ДНК из е. coli, обработку рестрикциошшми эндонуклеазами, перенос ДНК из агарозних гелей на нейлоновые

фильтры, мечение препаратов ДНК in vitro методом "рассеянного" праймирования, Слот-гибридизацию проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984; Feinberg et al.,1983). Ферменты получены из НПО "Фермент" (Вильнюс). Пульс-электрофорез проводили на аппарате производства НПО "Диагностикум" (г.Львов). Препараты ДНК для пульс-электрофореза получали согласно методики Матеу (Ма-thew et al.,1988).

Вариации вышеуказанных методик обсуждается в разделе результаты и обсуждение.

Результаты и обсуждение 1. Получение препаратов ДНК. Препараты ДНК с очень большой молекулярной массой невозможно получить, использу.. традиционнные методы растворения, поскольку такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям. Для предотвращения разрушительного воздействия сдвиговых сил процедуру экстракции ДНК из клеток Synechocys-tis 6803 проводили непосредственно в агарозном геле. Живые клетки суспендировали в расплавленной низкоплавкой агарозе, а затем помещали в лизирующий раствор. Полученные таким способом препараты использовали в экспериментах.

Средний размер фрагментов хромосомной ДНК Synechocystls 6803 в образцах , приготовленных по описанной выше методике, составляет Солее 800 т.п.н. Мы определили, что критической стадией при получении препаратов высокомолекулярной ДНК Synechocystis 6803 является фаза роста. При OD580 << 1,5 клетки плохо лизируются и пропараты получаются с низкий концентрацией ДНК. Это, по-видимому, обусловлено либо более прочной клеточной стенкой молодых клеток, либо увеличением копийности хромосомы Synechocystis 6803 на более поздних стадиях роста (Labarre et al.,1989). При od580 >:> 1,5 полосы 113 пульс-элоктрофорограммо получаются более

размытыми, возможно, вследствие прояш1еш1Я дополнительных активностей РЭ. Показателем получения качественных препаратов ДНК является полный переход окраски образцов от зеленого цвета к желтому в процессе обработки ДНК с помощью протеиназы К (см."Материалы и методы"). Препараты ДНК цивнобактерий часто загрязнены полисахаридами ( Jouet, 1988 ), которые ингибируют активность ферментов. Для их удаления препараты обрабатывали 0,5 М NaCl (55°с, 1 % EDS, 30 мин ). Такая процедура но приводит к значительному увеличению концентрации фрагментированной ДНК, но позволяет избежать вторичной активности РЭ.

Описанная нами методика по качеству получения препаратов ДНК Synechocyetla ввоз, пригодных для пульс-элоктрофореза, сравнима с мотодикой для цианобактерии АпаЬаепа 7120 (Bancroft et al., 1909). Однако предлагаемый наш метод значительно проще в исполнении.

2. Рестрикционный анализ хромосомы. ДНК Synechocyotie 6803, содержащуюся в блоке агарозы, и ДНК Escherichia coli в агарозе (контроль) отмывали в бидистилироватюй воде и, после уравновешивать в буфере, подвергали рестрикции. Затем образцы помещали в лунки геля.

Большинство проверенных нами РЭ, узнающих последовательности ДНК из 6 и более нуклеотидных пар [ 6 ], расщепляет хромосому Synechocyotie 6803 более чем на 100 фрагментов и не пригодно для картирования. Содержание G/C пар в геноме Synechocyatie 6803 составляет 47 % (Herdman et al., 1979). Редкощепящими РЭ ДЛЯ ДНК данного G/C - состава должны быть Avrll, Nhel, NotI, Sfil (McCieiand et al., 1987 ). К сожалению РЭ Nhel, sxii проявляют вторичную активность при обработке препаратов ДНК Synechocystis 6803 и но пригодны для картирования. Наименьшее количество фрагментов образуют следующие рестриктазы: Notl, которая расщепляет

хромосому SynechocystiB 6803 на 31 фрагмент, Mlul - 19 фрагментов и Есо72.1 (Pmaci'r - около 40 фрагментов (рис.2). Относительно редкощепящими РЭ являются Cpol(Rsrll) (около 60 фрагментов), PvuII (около 100 фрагментов), Ehel(Narl), Xhol, SalGl (ОКОЛО 200 фрагментов) (табл.1).

То, что РЭ Есо72.1, Mlul и PvuII являются редкощепящими для генома данной цианобактерии, находится в противоречии с виводами обзора Маклеланда ( McCleland et al., 1987 ). Mil предполагаем, что Synechocyatis 6803 имеет контр-селекцию определешшх сайтов рестрикции: С A g g Т G (Eco72.I, PvuII) и | С G О G | ( Mlul, СГг42.1 ). Такая koH'iр-селекция отдельных сайтов рестрикции характерна, по крайней мере, для различных видов цишюбактерий Апа-baena и Hostoo. В случае, если метилирование недостаточно эффективно, контр-селекция сайтов расщепления эндогенных РЭ является преимуществом для бактерий (Bancroft et al., 1988).

При обработке ДНК Synechocystis 6803 РЭ Cfr42.I И Есо52.1 мы не обнаружили следов активности данных РЭ. Это может быть обусловлено 3 причинами:

1) сайты расщепления данных ГО метилированы;

2) РЭ чувствительны к цианобактериалышм загрязнениям;

3) фрагменты ЙИ, образуемые данными РЭ, не разделяются на приборе* "Дианульс".

Сайт расщепления Есо52.1 идентичен внутренней области сайта расщеп-лония Noti. Поэтому скорое РЭ Есо52.1 очень чувствителен к цианобактериалышм загрязнениям. Однако нельзя исключить вероятность того, что РЭ Noti и Есо52.I отличаются по чувствительности к метилированию .

Для каждого данного времени пульса происходит разрешение фрагментов ДНК в узком диапазоне размеров »."окно разреше!шя"). Все фрагменты большего размера движутся плотной группой впереди

области разрешения, а фрагменты меньшего размера за областью разрешения. Наибольшая разница в подвижности фрагментов близкого размера обеспечивается длительностью пульса, при которой фрагмент только вошел в "окно разрешения" (Mathew et al., 1988). Оказалось, что оптимальным для Notl, Eco72,I, Mlul - фрагментов хромосомы Synechocyetia ер. POO 6803 является 4 режима работы пульс-электрофорозного аппарата НПО "Диагностикум"

Для определения размера средних фрагментов образуемых Notl, Есо72.1 и Mlul мы использовали время пульса 20 с в течение 20 ч, верхних фрагментов, образуемых Notl и Есо72.1 - 50 с, a Mlul -70 с в течение 20 ч. Режим работы, при котором разделяется максимальное количество фрагментов составляет: 4 с в течение 11 ч, 10 с -3 ч, 20 с - 6 ч.

Табл.1. Сайты расцепления РЭ на хромосоме Synechocystis 6803.

РЭ Сайты расщепления Количество сайтов

Notl GCGGCCGC 31

Есо72.1 CACGTG около 40

Mlul ACGCGT 19

PvuII CAGQTQ около 100

Alw44.X CTGCAO около 200

Ehel GGCGCC около 200

Xhol CTCGAG около 200

Pael GCATGQ около 200

Fat! CTGCAG около 200

Kpnl GGTACC свыше 200 а

взр1гол GGGCCC свыше 200 а

ЕоШбЛ GAGCTC свыше 200 а

Xbal TCTAGA свыше 200 а

Продолжение таблицы 1•

РЭ Сайты расщепления Количество сайтов

Eco47.HI AGCGCT свито 200 а

Dral ТТТААА свыше 200 а

Smal CCCGGO свыше 200 а

Есо81.1 CCTNAGG свыше 200 a

Ndel CATATG свшио 200 a

CpoI(Rsrll) CGG(A/T)CCG около 50

SalOI GTCGAC около 200

BamHI GGATCO свшпе 200 a

EcoRI GAATTO свыше 200 a

HIhdIII AAGCTT свыше 200 a

Cfr42.I CCGCGG ?б

Eco52.I CGGCCG ? 6

Sfil РЭ проявляет вторичную активность

Nhel. — // —

Примечание: а) свыше 200 - РЭ дает "шмер", б) ? - активность РЭ не была обнаружена.

В качестве маркеров для определения размеров фрагментов ДНК использовали конкатемеры фага лямбда (Mathew et al., 1988) и Л. (Hindin). При каждым из 4 режимов работы пульс-электрофорез проводили с 5-10 кратным повтором. После фотографирования геля размеры фрагментов рассчитывали на компьютере, используя программы "ВеоЧшап Mlorogene versión 6.0" И "Statgraphio".

В таблица 2 приведет размеры фрагменте« хромосомной дик Synochooystis 6803 поело обработки ra Notl, Еоо7й.1 и Mlul. Размер генома Synechocyutio 6803, опрэдолшшмй по сумме раомерон

рестрикциошых фрагментов, составляет 3300 - 3400 т.п.н. Хотя в работе Хердмана размер генома датой цианобактерии, установленный по кинетике реассоциации, определен как 3000 т.п.н. (Негйтап е1 а1., 1979 ), данное уточнение, по-видимому, закономерно для многих работ по физическому картированию (В&псгоП е1 аХ., 1989).

Таким образом, для хромосомы ЗупосЬосувие 6803 установлены редкощепящив РЭ и определен размер фрагментов образуемых ими ДНК. Эти данные могут быть использованы при анализе полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК БупесЬосуиив 6803 с последующем клонированием генов неселективных маркеров (Весктапп et аХ.,1983). Таблица 2. Длина (т.п.н.) рестрикциошшх фрагментов хромосомы

ВупесЬосувНв 6803 .

РЭ N011 РЭ Есо72.1 РЭ М1и1

название длина название длина название длина

А 458 1 15 А 418 £ 20 А 870 1 50

Б 325 ± 8 в 327 5 В 471 1 16

С 300 7 с 214 + 6 С 330 1 13

С 217 ± 6 п 206 ± 4 0 310 ± 5

Е 207 + 5 Е 204 + 5 : Е 204 ± 3

Р 191 + 3 ¥ 159 + 3 Р 189 ± 5

С 178 + 2 С 147 + 2 0 140 - Э

Н 164 * 4 в 141 + 6 н 133 ~ э

I 157 + 3 а 132 + 4 I 116 ± 3

J 133 4 7 н . 102 + 5 к 109 - 3

,ы 116 + 2 I 93 + 6 I, 92а - 1

к 106 + 2 J 80а + 4 и 77 ± 1

I. 4 1 к 69 + 3 N 71 i 1

м 91 < 1 1, 64 + 3 0 57 i 1

Продолжение табл. 2.

РЭ Notl РЭ ЕС072. 1 РЭ itlul

название длина название длина название длина

N 86 - 2 К 58 ± 3 Р 50 i 2

0 82 - 1 N 51* ± 2 Q 44 ± 1

Р 69 - 1 0 49° ± 2 _ R 23 - 2

Q 57а ± 2 Р 40® ± 2 S 15 i 2

R 48 ± 1 Q 39Г ± 2

S 44 i 1 R 27е t 1

Т 42 ± 1 S 15 ± 1

и 38а i 2 т 12 i 1

V 35 i 1 и 10 ± 1

ч 2а - г V 5 ± 1

X 23-8 . W 2 t 1

Y 20а ± 3

АЛ И ± 1

АВ 9 ± 1

Примечание : а-душют, б-триплет, в-четыре фрагмента, г-около шести фрагментов .

3. Физическая карта хроиосош Synechocystle вр. РСО 6803. Хотя для Synechoeyetis 6803 описана система генетической трансформации (Grigorieva and Bheetakov, 1982), картирование генов у данной цианобактерии ограничено из-за отсутствия систем трансакции и коныогационного переноса. Наличие поотроетюй по редкощепя-щим РЭ физической карты хромосомы позволяет в результате одной гибридизации определить положение но ней любого клонированного гона.

- Для построения физичоской карта Бупес1юсувив 6803 применяли чотире метода с использованием:

а) ДНК-зондов Лои (М1ц1, Есо721)-рестрикционных фрагментов;

б) клонированных фрагментов ДНК 5упес1юсувИв 6803;

в) ДНК-зондов N01. клинкерных клонов;

г) нополной рестрикции.

Для выделения ДНК ИоЦ, М1и1, Есо721-рестрикциошшх фрагментов были использованы 3 метода: экстракция ДНК, гидролизованной частоще-пящой ростриктазой БаиЗА1 из лекгоплавкой агарозы; электроэлюция в аппарате, выпускаемом НПО "Биотех"; мечение непосредственно в легкоплавкой агарозе. .

Рис.1 Пульс-электрофореграмма ДНК ЗупесЬосувИв 6803 ,

обработанной РЭ N011 (2), Есо72.1 (3,4), Ы1и1 (6,7) Время пульса 'Д)с. 1, Ь, в - дорожки - конкатемеры фага X..

Мвчение непосредственно в легкоплавкой агарозе оказалось

ад

наиболее эффективным из трех опробованных методов. Включение Р не ниже, чем при стандартных условиях. Блок агврозы, содержащий ДНК Notl- , Eco72l- , «lui - фрагментов, разводили водой в три раза со случайным праймером, затем ДНК денатурировали (95°С 5 мин.), охлаждали (37°С 10 мин.) и в дальнейшем метили 32Р по стандартной методике (Feinberg et al.,1983).

ч

а б

рис.2 рис.3

Рис.2. Пульс-электрофореграмма ДНК ЗупесЬосувив 6803 , обработанной РЭ N011 (1), Есо72.1 (2), М1и1(3). Время пульса 4с, Юс, 20с. 4 дорожка - конкатемеры фага

Рис.3. Результаты Олот-гиОридазации с Есо72.1 и М1и1 -фрагментами: (а) 310 т.п.н. М1и1 -фрагмента ДНК БупесЬосувив 6803 ( дорожю! 1, 2,3 геля на рис.2); б) 418 т.п.н. Есо72.1-фрагмента.

Банк из 30 ноп-линкерных клонов был предоставлен д.б.н. п. Ю. Фонштейном. ДНК этих клонов, меченную Э2Р, гибридизовали с ДНК ЗупесЬосув^в 6803, обработанной РЭ N0« , Есо721 И М1и1 (рис.4). Оказалось, что уникальными являются только 7 клонов (см.табл. 4).

На основании результатов блот-гибридазаций с рестрикционными фрагментами (табл.3 и рис.3), -линкерными клонами (табл.4) и зондами генов была построена физическая карта хромосомы БупесЬо-суаНв 6803 ПО РЭ N011 , Есо72.1, М1ц1 (рис.6). СВЯЗЬ I И Т фрагментов была определена по результатам неполной рестрикции.

1

: • I

Рис.4. Блот-гибридизация ДНК Ыои-линкерных клонов с ДНК фрагментов Зупес1госувив 6803. а) пульс-электрофореграмма ДНК Бупе-сЫсувив 6803, обработанной РЭ Ыои (1), Есо72.1 (2) и М1и1 (3); б) гибридизация с зондом 5 линкер-клона (см. табл.4)

О

Чтобы исключить вероятность того, что зонд данного рестрик-ционного фрагмента даст гибридизационный сигнал с несмежным Фрагментом, содержащим гомологичные области, мы применяли следующие приемы:1) в первую очередь принимали во внимание только самые интенсивные сигналы;

2) в случае, если сумма длин всех рестрикциошшх фрагментов, от которых был получен положительный сигнал, превысила теоретически возможную величину, эксперимент повторяли с более жесткой отмывкой;

3) окончательный вывод о стыковке фрагментов делали только после проведения гибридизации со всеми рестрикционными фрагментами. табл.3. Кросс-гибридизация рестршщионных фрагментов ДНК

БупесКосувив вр. РОС 6803.

Рестриктаза фрагмент -зонд фрагменты, дающие положительные сигналы при гибридизации

мт-фрагм. М1а1-фрагмент Есо72.1-фрагмент

М1и1 в ■ а.к.о.р.и, В о.р.ад.о.хх

с <Т, <Т<Т,0,ХХ 0 в

Н/1,Ь,3,и Б А.Н.Р

Е С,XX Е Э.О.Р.Р

р Р.Н/1 Р В,Е

с н С ь,хх

. н Б Н Б/С

ь о.и.хх Ь р,а,с/с

ч а /и м и

я к N 0

0 в 0 о.хх

р Р/Е,С Р 02

N011 А А А 0/С,0.Р.0,Н

в в Б,ал.к И. р.м.-г.н.о

С! в А,В 1,ХХ,и

Есо72.1 А О/С н/1 -X. а .в.. Т.х.у А,Е,1),Й/1, ■ N й А с/о

примечание: 1) H/l-фрагменты не разделены на данном Слоте, г) к - слабый сигнал на блоте.Э) ХХ-фрагмент(ы) не определены, см.табл.2.

Физическая карта хромосомы Syneohocyetie 6803 является основанием для построения генетической карты с использованием ДНК клонированных генов в качестве гибридизационных зондов. Это позволит получить информацию о структурно-функциональной организации генома цианобактериий .

4. Локализация генов фотосинтеза на физической карте хромосомы synechocyatlb 6803.

Используя зонды клонированных генов из цианобактерий (табл.Б), было установлено положение 13 генов, участвующих в генетическом контроле фотосинтеза, на физической карте Synechooye-tls 6803 (рис.6). В первую очеродь можно отметить, что гены фотосинтеза не кластеризованы на хромосоме Synechocyetis 6803. Около 500 т.п.н. отделяет .гены рвьюс от генов рвЬА и pebG, около 100 т.п.н. рвЬВ - от pebDC, около 100 т.п.н. рвЬК и рвЬЕР - от. peaD рвЬО, около 200 т.п.н. psaD И рвЬО - от рваО. На расстоянии около 700 т.п.н. находятся ген рваО и ген рвьн. Табл.4 Гибридизация Notl-линкерных клонов с фрагментами ДНК SynechocyBtlB ер. PCO 6803.

N ii/П Фрагменты, дающие положительные сигналы при гибридизации

Noti-фрагмент Есо72.1-фрагмент Ului-фрагмент

1 А + АА D/0 а

2 ' Е + АА D/0 А

3 Е i ы Q а

4 И ■( и G В

в 1' i V В С

Продолжение таблицы 4..

N П/П Фрагменты, дающие положительные сигналы при гибридизации

6 7 Notl-фрагмент Есо72.1-фрагмент М1и1-фрагмент

F + Н и + s Е N Р D

1 • и Р Е

Примечание: D/c-фрагменты но разделены на данном блоте; А+АА -два соседних фрагмента дают положительные сигналы при гибридизации; 1'- гибридизация о фрагментом хромосомы из банка генов; см. табл.2.

В таблице G суммированы данные об относительном расположении генов фотосинтеза в геномах Synechocystie 6803, Anabaena 7120 (Bancroft et al.t 1989). цианеллы (Breiteneder et al.,1988), a также В хлоропластной ДНК Nicotiana tabacum (Sugiura, 1987). Предполагается (Breiteneder et al.,1988), что цианеллы являются промежуточным звеном между эндосимбиотическимн цианобактериями и хлороовастами. К сожалению, не все гены, прокартированные на хромосоме Synechoeyetia 6803 (табл.5), упорядочены на картах геномов этих организмов. '

В геноме цианобактерки Anabaena 7120, также как и у Synecljocyatia 6803, » в хпДНК растений, гени фотосинтеза не кластеризованы Сотни тысяч пар оснований отделяют две копии рзЬ D от рвЬ ЕР И, возможно, ОТ рвЬ В; pat к И pet Е от pet Р; atp AG от atp BE; рва АВ от psaD и, возможно, аре D от аре Е. Следовательно, хотя некоторые гены ТС XI и ФС I Anabaena 7120 расположены близко, нельзя говорить о тандемиости всех генов этих комплексов.

а б в

рис. 5. Гибридизация с использованием ДНК зондов генов: а) риьо, С) р^.ьк, в) рвЪА. Гибридизацию проводили без отмыва предыдущего оовда для того, чтобы улучшить ориентацию радиоавтографа.

Табл.5. Зонды, использованные для локализации генов.

гон Объект Источник Фрагменты, дающие положительные сигналы

N011 Есо72.1 М1и1

рвЬА1 риЬВ [изЪВС Б;. песЬосувНв 6714 СупесЪосувИв 6803 БупесЬосувНв 6803 Ь.ис1п1;овЬ И. Уеппаав И. Уегтааа А/В С 11 + У Р/Ч I и + V к/3 в А

Продолжение таблица 5

ген ОбЪект Источник Фрагменты, дающие по-'

ложительные сигналы

Not1 Есо72.1 1I1U1

рвЬЕР Synechocystis 6803 H. Pakrasi H L G

рвЬО Synechocystis 6803 R. Burnap АВ D L

рвЬН Synechocystis 6803 D.Bryant т А А

рвЬК Synechocystis 6803 W. Veiniaas н Ъ G

peaD Nostoc 7906 D.Bryant XXX D Ъ

рваАВ Synechococcuj 7002 D.Bryant XXX А D

рваС SynechococcuB 7002 D.Bryant JJ/D В/О С/О

SK18 Synechocystis 6803 каф.генетики К а В

petH Synechococcus 7002 D.Bryant G i В

psbC Synechocyetis 6803 L. Bogorad А 0 А

Примечание: ХХХ-гибридизация с Notl-фрагментами не проводилась; А/в- два различных фрагмента дают положительные сигналы при гибридизации; м+Y - два соседних фрагмента дают положительные сигналы при гибридизации; см.табл.1

Ген рРНК (ггпА) гибридизуется с двумя противоположными районами генома Anabaena 7120. Одна область включает гены в следующем порядке: atp BE, рва АВ, atp АС, рвЬ В, rbc L, гро B^Cg, тогда как другая - pet A, pet В, рвЬ ЕР,и две копии psbD (Bancroft et al, 1989). Для сравнения, большой уникальный район хдПНК табака (Sugiura, 1987) содержит pet В, psb Р, рвЬ В, pet A, rbc Ъ, atp BE, рва АВ, psb D ( последовательность генов консервативна для большинства хпДНК наземных растений ).

¥r

Рис.6. Физическая и генетическая карты хромосомы Synechocystis ер.PCO 6803. На внешнем кольце показаны фрагменты, образуемые РЭ Notl; на среднем - РЭ Mlul; на внутреннем - РЭ Есо72.1. Q.x,Y-порядок фрагментов не определен; * - порядок расположения фрагментов в данном месте был определен по слабым сигналам гибридизаций (см. таблицу 2); ХХ-фрагмент не определен; рвас* и рзЬА* -вторые больше слабые сигналы зондов рзаС и рзЬА.

Табл.6 Последовательность расположения генов фотосинтеза на хромосоме Synechicyatie 6803, Anabaena 7120 (Bancroft et al.,1989), цианеллы (Breiteneder et al., 1988) И хлоропластной ДНК Nlcotlana tabacum (Sugiura, 1987).

Объект Последовательность генов фотосинтеза

S.6803 Anab. Nicot. cyanel рвЬН рваАВ рваС paaD рвЬЕР рвЬВ pabDO pabG pabA fWAin fW»V/V (VfVIV рваАВ paaD рвЬЕР pebD psbH psbB pabEF pabG - pobDO pabA рваС рваАВ * psbB pabD

Примечание : в таблице растояние между генами показано непропорционально их реальному расстоянию на хромосоме ( хпДКК ); ~— -относительное положение данных генов значительно отличается. Сокращения: S.6803 - Synechocystia 6803, Anab. - Anabaena 7120, cyanel - цианелла, Nicot. - Nlcotlana tabacum.

Уникальный район генома цианеллы Cyanophora paradoxa включает pea AB, peb B, psb EF, atp A, rbs L, atp BE, pet A, pet D (Breiteneder et al.,1988). Таким образом, если хпДНК произошла от бактериальной 'ДНК,- организованной подобно ДНК цианобактерии Anabaena 7120 и Synechocyatle 6803, то в процессе эволюции должны были произойти множественные перестройки .

выводы

1. Отработана методика выделения высокомолекулярной ДНК Ву-nechocystis вр. Рсс 680Э, что позволяет производить рестрикцию и мочение непосредственно в агарозном геле.

2. Определен размер генома Synechocyetie вр. РСС 6803, который соствляет 3300 - 3400 т.п.н.

3. Построена физическая карта хромосомы Synechocyetis вр. рсс 6803 по рестрикционным эндонуклеазам Noti, Eco72.l, Miui.

4. Определено положение 13 генов фотосинтеза на физической карте хромосомы Synechocyetis вр. PCO 6803.

Основные результаты изложены в публикациях:

1. Шалак И.Н., Еланская И.В., Фонштейн М.Ю. Физическая карта генома цианобактери Syneahoeyetie вр. POO 6803 - Генетика, 1992, Т.28 , № 4, С. 46-52.

2. Шалак И.Н. Физическая и генетическая карты генома цианобак-терии SynechocystiB ер. РОС 6803 - Тезисы VII съезда ВОГиС, Минск, 1992 (в печати).

3. Shalak I.N., Elanekaya I.V., Ponetein M.U., Shestakov S.V. Phyeical and genetic таре of the genome of the cyanobacterium Sy-nochocyBtiB ep.PCC 6803 - Mol. Microbio!., 1992, in ргевв.

Подписано н печати 15.оч,ь?-, Формат 60x84 1/,е.

Усл. печ.л. jj *ирая ■)СО ЭНз. Бесплатно. Занав6 7-5, ППП БелИИИНТИ. 2200С», Минск, пр. Машерова, 23.