Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ гена pabs, ..одирующего хлорофилл А - связывающий белок СР47 фотосистемы II

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ гена pabs, ..одирующего хлорофилл А - связывающий белок СР47 фотосистемы II"

12 Л~2 з 2

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ пм.Н.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи удк: 582.232.7: 581.132: 577.113: 579.254

EFMAK0BA Светлана Юрьевна

ШЛЕШЛРИО - ГЕНЕТИЧЕСШ1 АНАЛИЗ ГЕНА рвЬВ,

:одирукщего zr.âtomm л - сслпыващий белок ср*7 готосистЕШ il.

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискшшо ученой степей/ кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа виполнена на кафедре генетики п селекции Биологии факультета Московского 'государственного университета -¿.В.Ломоносова и в лаборатории генетики микроорганизмов Инс общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор, члац-корр. РАН С.В.Шестаков

официальные оппоненты: .

доктор биологических наук С.В.Каменева, доктор биологических наук, профессор Н.К.Янковский

ведущая организация:

Научно-исследовательский Институт генетики и селеки нроыишлетшх микроорганизмов

Защита состоится — 1992 г. в

на заседании специализировашюго Ученого совета Д002.49.С Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (117809, Ыосква, В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института гонетгаси им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан /¿Л 19д2 г

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полу;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Одним из актуальных вопросов современной биологии является выяснение закономерностей и механизмов окспгенного фотосинтеза, процесса, являющегося основным источником молекулярного кислорода и органического вещества на планете. Проблема имеет не только фундаментальное теоретическое, но и большое практическое значение в связи с задачами создания методами селекции и генной инженерии новых высокопродуктивных сортов растений с ценными свойствами, конструирования биоэлектронных систем на основе белков аппарата фотосинтеза. Для достижения этих целей необходимо детальное изучение структурно-функциональной организации фотосиатетического аппарата.

В • последние насколько лет достигнут большой прогресс в исследовании молекулярной организации пигмент-белкового комплекса фотосистемы II. Это было .обусловлено, прежде всего, успешным применением методов молекулярной генетики, ¡тонированием и секвенированием генов, контролирующих фотосинтез у высших растений, водорослей п цианобактернй, что позволило определить порвичпуи структуру большинства балков аппарата фотосинтеза. Во-вторых,, большое значение имело определение с помощью рэнтгеноструктурпого анализа пространственной организации реакционного центра фотосистемы пурпура . бактерий (Во1сеп1гоГег в! а!.,1985). Кроме того, существенный и все возрастающий вклад в -¿зучопт'о молекулярных основ оксигенпох-о фотосинтеза вносит использование в качестве модельного объекта цианобактерий. Процесс фотосинтеза и структура фотосинтотического аппарата у этих микроорганизмов практически идентичны таковы?,1 у высппт растений и эукариотических водорослей, с другой стороны, прокариотический тип строения клетки, простота организации генома, способность некоторых штаммов к генетической трансформации открывают возможность широкого пименешя методов молекулярной генетики и генной инженерии. Способность некоторых видов цианобактерий к гетеротрофному росту в отсутствие-активности фотосистемы II позволяет получать жизнеспособные мутанты, дефектные по генам, контролирувдим работу этого комплекса. Сайт-направлешоо изменение этих генов у цианобактерии БупесНосузив 6803 оказалось чрезвычайно плодотворным подходом в исследовании тонкой организации реакционного центра СЮ II и каталитического центра окисления Н^О, определении молекулярной

природа некоторых элементов фотосинтетических мембран и цепи транспорта электронов (Debu3 et al.t 1988; Carpenter, Vermaas, 1989; Pakrasi . i al., 1991).

Однако многие вопросы структурной организации . и функционирования комплекса фотосистемы II пока нэ ясны.. В частности, мало известно о структурно-функциональной организации хлорофилл а - связывающих белков фотосистемы II (СР47 и С.43), не имеющих прямых аналогов в реакционном центра пурпурных бактерий. Это ограничивает возмокиость применения для их изучения метода сайт-направленного мутагенеза. Более удобным • представляется альтернативный подход - отбор спонтанных или ицдуцировашшх мутантов с нарушениями в генах, кодирушщх am бал си, о последующей локализацией мутационных поврездений. Это позволит, определить функционально ваише домены п аминокислоты в структуре этих белков, для последупцого анализа которых ыоШо будет использовать сайт-направленный мутагенез.

Цель и задачи исследования. Данная работа посвящена молекулярно-генетическому анализу гена рзъв, кодирующего хлорофилл а - связывающий белок СР47 фотосистемы II Synechocystis 6803. Основные задачи исследования:

1. создание геномного б-чка Synechocystis 6803 и выделение из него рекомбинантных плазмид, трансформирующих к фотоавтотрофности дефектные по фотосинтезу мутанты этой цианобактерии;

2. идентификация и локализация генов фотосинтеза в составе клонированных фрагментов ДНК Synechocystis 6803;

3. молекулярно-генетический анализ серии фотосинтетнческих <ФС ) мутантов Synechocystis 6803, дефектных по гену раьв, определение молекулярной природы мутационных повреждений;

4. определение функционально значимых районов' и отдельных аминокислот белка СР47, необходимых для обеспечения активности комплекса фотосистемы II.

Научная новизна i практическая ценность. Клонирован геи рзЪЕ SynechocystiB 6803, кодирующий 47 кБа хлорофилл а - связывающий белок фотосистемы II. Проведен молекулярно-генетический аналиг серии рзЪВ-мутантов Synechocyetie 6803, позволивший локализован генетически. повреждения в пределах гена. Определение молекулярной природы повреждений у ряда мутантов дало возможное« выявить ' функционально важные» участки белка СР47. Серш раЪВ-мутантов Synechocystis 6803, охарактеризованных генетичесга и биофизически в данной работе, может быть использована дт

детального изучения структурно-функциональной организации белка СР47 в составе фотосинтетических мембран, для решения задач создания фотобиотехшгаеских систем.

Структура н объеи диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярной организации аппарата окспгепного фотосинтеза цианобактерий, описания материалов и методов исследования, изложения результатов • и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа

изложена па _ стр. машинописного текста и содержит _ рисунков

и _ г"блиц. Список литературы включает _ наименований.

Сокращения в тексте.

ФС II - фотосистема II; ФС I - фотосистема I; ФС~-мутант - не способный к фотоавтотрофнсму росту; КВК - кислород-выделяющий комплекс; РЦ - реакционный центр; ак - аминокислота; ил. -тысяча пар нуклеотидов; KDa - килодальтон.

Материалы и ыетоды. Штамш.' В работо использовали бактериологически чистую культуру Syn2chocjT3ti3 ср. PCO 6803 из коллекции Пастеровского института ' (Пария, Франция), ФС--мутаптц этой цпапобактерии из коллекции кафедры генетики и селекции МГУ и штаммы е.coli: ПВЮ1, ли09, 1Ы552, описанные в (Маниатио и , 1984; Гловер и др., 1990). Кудьтивированиа бактерий. Культуру Synechocyati3 вр. PCO 6803 выращивали па модифицированной среде "С" vСтолетов и др., 1965) в лшшостате при 30. С и освещенности 2000 ж. Твердая среда "Сп содержала 1,2!? пластинчатого агара. Для выращивания E.coli использовали среду LB (Маниатио и др., 1984)'. Трансформацию клеток E.coli проводили по стандартной методике. Трансформации циапобактерий - по методу, предложенному в рабогэ (Dselskalns, Bogorad, 1988), с ¡гадфпсация'Л".

Выделение ДНК. Выделение тотального препарата ДНК Synechocystis 6803 проводили по методу, опубликованному в статьс (Van den Hondel et al.,1979), с модификациями. Плазмид- то ДНК из клеток E.coli выделяли по методу Вирнбойма и Доли (Birnboin, Doly, 1979). Днк очищали центрифугированием в ступенчатом градиенте'" плотности csci по методу Зинченко и Бабшшна (1984). Ферментативную обработку ДНК проводили . ферментами

производства НПО "Фермент" (Вильнюс) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Введение метки_ в ДНК in vitro осуществляли методом "рассеянного" праймирования (Feinberg, Vogelstein, 1983).

Электрофорез и элюцию фрагментов ДНК из агарозы, перенос ДНК на нитроцеллюлозные и нейлоновые фильтры, Слот-гибридизацию проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др.,1984; Мазла и др.,1990).

Нуклеотидную последовательность ДНК ' определяли методом ' дидезокситерминирования по Сэнгеру (Sanger, 1977; Мазин и др.,1990).

■ , Концентрацию кислорода в среде определяли с помощью электрода ; Кларка на полярографе ЬР-7 при температуре 25°С' по методике, описанной в статье (Барский и др.,1939).

Переменную флуоресценцию хлорофилла а измеряли при ' помощи двухлучевого флуориметра по методу Лядского и др. (1987)

Спектры низкотемпературной_флуоресценции снимали па •

спектрофлуориметре "СПИЛ" при длине волны возбуждающего света 440 нм (Гусев, Тетенышн, 1983) ■

Для компъгтерной обработки последовательностей ДНК и белков использовали пакеты программ "PCGBIE", "DNASIS", "PROSIS".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Характеристика фотосинтетических мутантов Synocljocyatio 6803. К началу данной работы нч кафедре генетшш и селекции МГУ была создана обширная коллекция дефектных по фотосинтезу спонтанных и . индуцированных нитрозогуанидином мутантов цианобактерии Synechocystis 6803 (Кокшарова, 1986;. Шестаков И др., 1988; Ст^Нбекова и др., 1992). Большинство мутантов было отобрано путем обогащения популяций клеток цианобактерии <ХС~-мутантами с применением в качестве селективных агентов ингибиторов фотосинтеза (нитрофурантоина, хлорпромазина, парахлормеркуриобен-. зоата). '/ • ;

Все использованные в работе мутанты Synechocyatia 6803 не способны к фотоавтотрофному росту и нуждаются для своего роста в • глюкозе. Измерег э штенсивности фотоиндуцированного выделения кислорода в реакции Хилла (характеризующей активность % фотосистемы II) и поглощения кислорода в реакции Малера (активность фотосистемы I) у ряда (КГ-мутантов показали, что активность i : II у них резко снижена или отсутствует, тогда как по активности. ФС I клетки мутантов и штамма дикого типа практически не различаются. Трким образом, у исследованных КГ-мутантов генетические повреждения, приводящие к потере способности клеток к фотоавтотрофному росту, очевидно, затрагивают

•ош, ответственные за функционирование фотосистемы II.

И.Клонпровапна фрагментов xpcuocoimofl ДНК Synechocystis 6803, фопсфориирущах ФСГ-иутппты к фотоавтотрофиости. П. 1. Конструирование банка генов Synechocystis 6803. Способность «а тек Synechocystis 6803 к генетической трансформации (Grigorieva, Shestakov, 19S2) дает возможность использовать зписашша вшэ мутанты в , качества реципиентов для клонирования генов, коптролпрувдпх фотосинтез-. Для выделения фрагментов ДНК, восстшавливавдих способность к фотосинтезу в клетках КГ-мутаятов, был сконструирован геномный банк штамма дикого типа Synechocyatia 6803. Препарат тотальной ДНК, . обработанный рэстрпктазой ВашН1, фракционировали электрофоретически в 0.6% агарозном гола. Фрагменты размером 5-11 т.п.н. выделяли из геля и дотировали с обработанной ВапШ и щелочной бактериальной фосфатааой ДНК вектора рЛСТС184, пасущего маркеры устойчивости к хдорз-^фоппколу (CnR) п тотрацизелипу (TcR). Продуктами лигирования трансформировали компетентную культуру е.coli HB101 и отбирали СдгТсв колонии. Полученная клонотека содержала. 1780 эзависимых хслонов, которао были объединены в 127 групп по 10-15. Из каад^л груши клопов выделяли плаз-лдную ДНК а использовали ее для трансформации ФСГ-мутантов к фотоавтотрофиости.

II.2. Ецделение из клонотекн рекоибинантных плазыид, трансформирующих ФС--иутапты к фотоавтотрофиости. Цианобактерия Synechocystis 6803 облагает мощной 'системой гомологачпой рекомбинации, позволяющей использовать для клонирования векторы, не способные к автопомпой репликации в клетках этой цианобактерии (Porter, 1986; Williams, 1988). При трансформации ФС~-мутантов Synechocystis 6803 рекомбинантными плазмидами из геномной клопотеки в отсутствие селективных условий для отбора по '-эркеру вектора преимущественно происходит замещение мутантпого аллеля в хромосоме рецишентной клетки за счет гомологичной рекомбинации с фрагментом ДНК цианобактерии на плазмиде, что и приводит к появлению ФС+-трансформянтов.

ФС'-мутанты Synechocystis 6803 трансформировали суммарными препаратами плазмидной ДНК, выделенными из групп по 10-15 клонов, и выявляли группы, обладающие трансформируадей активностью. В группе идентифицировали индивидуалы" Л клон, способный к трансформации, и проводили рестрикционный анализ плазмидной ДНК

этого клона. Таким образом из геномной клонотеки Synechocyatle 6803 было выделено 4 рекомбинантных плазмиды (таол.1):

1.р31 - трансформирует грушу из 18 ФС~-мутантов (группа I);

2. р1624 - трансформирует мутант D21;

3.р.744, рЗЭ - восстанавливают способность к фотоавтотрсфоыу . росту мутанта D13.

II.3. Делеционный анализ клонировавши фрагментов. В целях выявления минимальных участков клонированной ДНК, замещавдих путем гомологичной рекомбинации мутантныо участки в хромосома ФС~-мутантов, субфрагменты рекомбинантных плазмид встраивали в векторы puci э • PACYC184, шш pssi76 и исследовали во способность к трансформации соответствувдих. ФГ-мутантов. Результаты делеционного анализа представлены в таблице 1. Из двух BamHl -Hindin подфрагментов р31 с размерами 2.8 т.п.н., один субфр^гмент (р31.1) не обладал-трансформирующей активностью, а другой (р31.2) трансформировал к фотоввтотрофюсти все мутанты I группы. Причем у И из них ФС+- фенотип восстанавливался при трансформации Smal - PvuII фрагментом (0.8 т.п.н.), субклонированным в составе плазмиды р31.3. (табл.1). Мутант D13 трансформировался к фотоавтотрофиости Hindlll-Bamlll субфрагментом рЗЭ размером 2.0 т.п.н. и BamHI-Hindlll субфрагментом р744 размером 1.7 т.п.н. (табл.1).

III.. Иденпфтацдя клонированных фрагментов хромосомной

ДНК SynechocyBtlB 6803.

Предварительный анализ <КГ-мутантов позволял предполагать, что у них повреждены структурные или регуляторные гены, контролирующие работу ФС II. В целях идентификации этих генов были проведены опыты по гибридизации выделенных из клонотеки плазмид с тотальной хлоропластной ДНК табака (Nicotiana tabacum), кодирующей большинство известных генов ФС II.

Фрагменты ДНК Synechocystis 6803, клонированные в составе , рекомбинантных плазмид р1624, р31 обнаружили гомологию с тотальной хлоропластной ДНК табака, тогда как рЗЭ и р7Ы не дали позитивного сигнала гибридизации. Следовательно, р31 и р1624 несут гены (или фзагменты генов), гомологичные генам фотосинтеза высших растений, кодируемых хлорошастным геномом, а р744 и рЗЭ, по-видимому, могут содержать гены, гомологичные ядерным генам

б

Таблица 1. Делеционный анализ рекомбинантных плазмид из

клонотеки Зупес1госуа1;1в 6803. трансформирующих к фотоавтотрофности ФСГ-мутанты.

Рекомб. плаз-мида Клонированный фрагмэнт ДНК Бупес11осув1;18 6803 Размер Рестрикционная карта т.п.н. Вектор Трансформируемые $С~-мутанты

Р31 Р31И Р31.2 Р31.Э БатН1 Бта1 ШпсИИ ВагаН1 ¿VI»'1.........'............- 5.6 РК н в ВРК ■> „ 2,7 ■»§ 2.7 РК э О.д РАСУ0184 РАСПГ0184 рА0гС184 рЗЕ17б ЫР1 НР2 КР17СР16 РМВ1 РК7 РК12 БК19 БК20 БК4 НР5 N01 Н07 СР5 СР9 N08 N010 НР16 нет КЕЧ N72 ЫР17 СР16 РЫВ1 РК7 РК12 БК19 БКЭО БК4 НР5 N01 N07 СР5 СР9 КСЗ N010 ОТ1б РЫВ1 РК7 РК12 5К4 БК19 БК20 ОТ5 N01 N07 СР5 СР9

■м Р744 ВатН1 Й1 НБ Н ВгшН1 В н . 7 ¿ашяиза!1 РАСУС184 рП019 РА0УС184 РАСУ0184 013 013 013 013

р39 'ВаиШ I??1 КС Н1 ВашШС Н ВНЕ Н Н Н1п(1111 ¿ЯЯСЗЗКЭБЗЗЕЗ^^ ^ 0

"-Т624 ВатН1 Н Н Н ВатН1 ......... шчм.1......пт„г......1 .......—А 8.8 1 1 1 1 0 1.0 5.0 10 Т.Н.Н РАСУС184 021

высших растений. Гибридизация плазмид рЗЭ, р744 с ядерной ДНК гороха (Piaum sativum) и арабидонсис (Arabidopais thaliana) была продемонстрирована в совместной. работе с лабораторией изменчивости генома Института общей генетики РАН (Лысенко и др.,1991).

С целью идентификации участков хлоропластной ДНК, таит. гомологии с рекоыбинантными плазмидами р1624 и р31, фрагменты ДНК Synechocystis 6803, клонированные в их составе, гибридизовали о банком, генов хлоропластов табака (ShinozaM. et al.,1986). Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Гибридизация клонированных фрагментов ДНК

Synechocystis 6803 с банком генов хлоропластов табака.

Рекомбинантная Гомологичны- фрагменты хлоропластной ДНК

.нлазмида

назван. клонир. фрагм. фрагмент размер т.п.н. локализация фрагмента в хлоропластом геноме, наличие фотосинт. генов

р31.2 р1624 5.6 т.п.н 8.9 pTBal: SB pTBal: 11.3 70,77 - 82,12 т.п.н. psbB, psbH, petB, petD

т.п.н. S9 5,5 65,30 - 70,77 Т.П.Н. psbE, psbF

S11 0,6 82,11 - 82,75 Т.П.Н. нет

S10 1.1 82,75 - 83,81 Т.П.Н. нет

Фрагмент ДНК Synechocystis 6803, в плазмиде р31 гибридизуется с Sali - Sali участком хлоропластной ДНК табак размером 11.3 т.п.н., (S8), содержащим несколько гено: фотосинтеза (рзЬВ, рзШ, petB, petD). Фрагмент р1624 обнаруживав гомологию с несколькими участками хлоропластной ДНК табака содержащими, кроме генов фотосинтеза (рзЪЕ, рзЬР) нескольк неидентифицированшх открытых рамок считывания (Shinozaki е al.,1986). Сравнение рестрикционной карты р1624 и фрагмента ДН Synechocystis ' "303, несущего гены раЬЕ и рзЪР (Pakrasi е al.,1988), свидетельствует о том, что р1624 не содержит эта генов. Поэтому не исключено, что у мутанта D21, трансформируемо: к фотоавтотрофности плазмидой р1624, нарушен фотосинтетичесга

8

*

*

гон, гомологичный одной из неидентифицировшшых открытых рамок считывания хлоропластного генома. Дальнейший анализ р1624, р39, р744 в настоящей работе не проводился.

В ходе дальнейшего исследования определяли гомологш р31.2 о идентифицированными ранее генами фотосинтеза.

В качества зонда использовали 2.8 т.п.н. (ВашН! - ШпсПН) фрагмопт, клонированный в р31.2 (табл.1). Была обнаружена ого гомология с генои раЪВ шпината (кодирующего 47 коа хлорофилл а -связыващий белок СС II), предоставленным П.ВесгхофЕом (КевШэГГ оЬ о!.,1985). Для определения,'локализации и ориентации раЬВ Зупзс1юсуз1;1п 6803 в составе плазмиды р31, проводили гибридизации ДНК р31 с различными участками гена рзЪВ шпината в качестве зондов. Результаты представлены нй рисунке 1.

Рио.1. Определение локализации и ориентации гена 'рзЪВ ЗупасЬосув'Ыо 6803 'в составе плазмиды р31.2.

5 464 6 ¿7 1З00

BamHI

Rsal Bomll Hsal . HindIII , l-r-L--1-1--

-1751 ASO

-55

1^)29 H.H.2500

раЪВ шпината

Xbal _1_

1525 п.н.

Rsal t_

Roa

667 П.Н.

зонд 1 |

P3I.2

512 П.Н

| ✓ s

PvuII s BamHI 1 Kpnl Smal

HindIII

1.1 Т.П.Н.

1.65 Т.П.Н.

Вероятная локализация и ориентация в плазмиде р31.2 гена рвЬВ ЗупесЬосувНв РСС 6803

Зонд 2 (BamHI - Hindlll субфрагмент гона раЬЗ швшата размером 641 п.н.) гибридазуется только с 1.1 т.п.н. ВагаН! - Smal фрагментом р31.2, а зонд 3 (Hindlll-Xbal фрагмент 512 П.Н.). расположенный дастальнее, - как о 1.1 т.п.н. BamHI - Bmal, так а с 1.65 т.п.н. Smal - Hinain годфрагментами р31.2. Следовательно, Г ген раЪВ Synechocyotis 6803 начинается в пределах ВадН! - бшаЗ ' участка (1.1 т.п.н.), а З'-конец гена расшшжац в 1.65 т.п.н. ' ' фрагменте р31.2.

Рпнд 1 рзЪВ шпината (рис.1) не гибридазуется с 1.1 т.п.н. BamHI - Smal участком р31.2, что. связано, очевидно, ее значительным отличием 5'-фланкирующих последовательностей гонох рзЪВ шпината И Syne oho cyst is 6803. Но поскольку ОКОЛО одной трек 1 этого фрагмента (~200 п.н.) приходится на начало кодарувще! последовательности рзЪВ шпинату, то отсутствие гибридизации ыожеа свидетельствовать о том, что pal т SynechocyBtio 6803 клонировал i р31,2 не полностью, и не содержит, 5'-концевой участок.

Известно, что в хлоропластах высших растений рзЪВ являет« первым геном оперона рзЪБ-раЪН-petB-petD (Alt et al.,1983; Shinozaki et al.,1986). Поэтому плазмиду p31, несущую фрагмент ДНК (около 4 т.п.н.) дастальнее рзЪВ, исследовали в отношенш гомологии с генами рзЪН (из рБоР1923) и petD (из pSoP937,' шпината. Этот фрагмент не гибридазуется с генами рзЪН и petD, Таким образом, в отличие от хлоропластного генома высшш растений, в хромосоме Synechocyatis 6803 ген рзЪВ не входит i один кластер с генами рзЪН, petB, petD.

Одновременно с работой по клонированию и идентификации генов ФС II Synechocyatis 6803, проводимой нами, ген рзЪВ вто! цианобактерии был клот рован и секвенирован в лаборатории В Вермааса, США (Vermaas et al.,1987). Сравнение полученных нам] данных с опубликованной В.Вермаасом и др. последовательность] нуклеотидов гена рзЬВ показало идентичность построенной нами ] Вермаасом и др. рестрикционной карты и установленной ориентации гена рзЪВ.

« Поскольку клонированный в составе р31.2 фрагмент ДНК в

содержал 256 п.н. 5'-концевого участка гена рзЪВ, был, предпринята попытка клонировать полную кодирующу; последовательность раЬВ. Для этого хромосомную ДНК Synechooysti 6803, ' расщепленную различными рестриктазами, разделял электрофоретически в 0.6% агарозном геле, переносили н

ю

«

«

нейлоновую мембрану Hybond-N и гибридизовали о 1.1 т.п.». BamHl -Croai годфрагкентом р31.2. Полученные данные позволили установить: а\ рзЬВ продставлэп в геноме Synechocyotio 6803 единственной копией;

в\ полная кодирующая последовательность гепа рзЪВ, находится в составе nlndiii - Hindin Фрагмента хромосомной ДНК длиной около 3.5 т.п.ц.

На векторах pUC19 и рАСУС184 были сконструированы миьи-банки Qindlll - Uindlll фрагментов хромосомы Synechocyotic 6803 с размером 3.0 - 4.0 т.п.н. Рекомбинантными плазмидами трансформировали компетентные клетки Е. coli нвю1 и «гаю9. Солокцпо кленов, несущих рекомбинантпую плазмиду с полной псслодоватолыгастыа рзЪВ, вели по' гибридизации полученных клопов Б.coll О 1.1 Т.п.н. EarrJH - Err.al субфрагмептом р31.2. Однако клепов, содорзетщх целая гзн рзЪВ, отобрать не удалось. ЭТо может С'хчъ сбуслсзлзно том, что продукт данного гена токсичен для клеток S.coli. О трудностях клонирования в Е.coli некоторых гонов, гаетгруг^лх бзля фотосинтеза, связанных ,с токсичностью их прздуктез, сообщалось тахсэ в работах других авторов (Golden .о al.,1987; Тсггспз ot al.,198.). Клонирование полной кодирующей послздоваяшзсти гена рзЬВ па векторах - производных фаги Д., позполякупс избегать этих методических ограничений, не входило в задачи пеной работы.

IY. Картирование ыутаг. гонных повреждений у нутаптов, трансформируемых к фотоавтотрофности плазыядой р31.2.

В состава плаз;.ядц р31.2, содержащей ген рзЬВ, не обнаружены другие гепы оперона рзЬВ-рзЪП-petB-petD, Характерного для хлоропластпого генома растений. Однако это не исключает того, что у цианобактерий дпетальнее рзЬВ находится какой-либо другой геи (гены), повреддепие которого также приводит к потере способности к фотоавтотрофпому росту.

Дяя проверки этого предположения, а также в целях определения функционально важных участков белка СР47 была проведена работа цо тонкому генет:гшскому картировашш повреждения у <КГ-мутантов Synechocy3ti3 6003, трансформируе.'яхх к фотоовтотрофпости плазмидой р31.2. Для, этого различные перекрывавдиеся субфжзгменты р31.2 г"1клонировагт в векторе pUCl9, некоторые из них затем дополнительно укорачивали путем обработки экзонуклеазой Ва131 (рис.2) и полученные i as'иди

1Т.П.Н.

р31.2

В

I

р I

к

I

ч— 256

Т

Т

558 759

S Sa

Sa Е

ÎïsbL».I.J.«.ll.ll«.I.II.LLll.! H.lli.li.lS.lLi.l8.H.L 11Д46 ' _

'1446 1338

2215

psbB

1522 П.Н.

302

580 П.Н.

695 П.Н.

502

780

L____!

1332 П.Н.

NP1

РМВ1

' PK7 CP16 pK12

SK19 SK20

SK4 IIG1

i "

NF5 CP9

- 60 П.Н. -300 П.Н. -370 П.Н. -470 П.Н.

1 j. i

CP5 : N07

876. П.Н.

V

IÎT16

NG8

HG10

- 80 П.Н. -220 П.Н.

Рис. 2. Локализация мутационных повреждений у рзЬВ-мутантов \ Бупес1юсувив 6803 с помощью делеционного анализа. В - ВатН1, В - Пга1, Н - ШлИИ, К - Крп1, Р - РтгиП, За - БаиЗа, Б - Бта1.

. использовали для трансформации ФС~-мутантов к фотоавтотрофиостц, На основании результатов трансформационного анализа мутанты был] разделены на 4 группы (А-Г) по локализации ыутационны: повревдений (табл.3).

40~-мутант группы А (НР1, 2ГР2, ИР 17, СР16) трансформируют к фотоавтотрофности субфрагмеЪтами ВатН1 - РтгиИ, 302 п.н длиной и ВатН1 - Крп1 (502 п.н.) (рис.2). Таким образом

12

9

»

Таблица 3. Локализация мутаций в гена раЪВ.

группа ФС~ мутанты Субфрагменты p31.2, трансформирующие 20 -мутанты 1 Локализация мутаций в рзЪВ и в белке СР47

НР1

А ITF2 302 П.Н. BamHI - Pvull 256 - 553 п.н.

ОТ17 502 П.Н. BamHI - Kpnl 85 - 196 ак

PUB1

ш 502 П.Н. BsfflHI - Kpnl 558 - 759 п.н.

Б РК12 SK19 SK20 780 П.Н. Pvull - Kpnl 186 - 253 aie

SK4

NF5 580 П.Н. Kpnl - SmaX

В Ngl 780 П.Н. Pvull - Kpnl 759 - 1339 П.Н.

Ng7 1332 П.Н. ICpnX - Sau3A 253 - 446 ale

CP 5

СР9

гам 6 876 П.Н. Smal - Kpnl 1339 - 1520 П.н.

Г NgB Îig10 1332 П.Н. Kpnl - Sau3A 446 - 473 ак

генетические повреждения у этих мутантов локализуются в участке между 256 и 558 н.н. гзна рзЬВ, что соответствует 85 - 186 аминокислотам белка СР47. Мутационные повреждения у мутантов группы Б (РМВ1, РК7, РК12, SK19» БК20) локализуются в участке Pvull - Kpnl около 200 п.н. длиной (аминокислоты 385 - 253 белка СР47).

У «КГ-мутантов группы В (SK4, HF5, Ng1, Ng7, СР5,- СР9) мутации расположены в.учасисе Kpnl - SimI, длиной 580 п,н. Для' более точного картирования мутаций в этом участке, с помощью обработки экзонуклеазой Ва131 были сконструированы производные субфрагмента Kpnl - Sau3A (1332 п.н.) с делениям! приблизительно 60, 300, 370 и 470 п.н. в 3' направлении от сайта Kpnl

При трансформации ФСГ-мутантов группы В делециошшш вариантами было показано, что мутации у SK4 п К01 локализуются на расстоянии не более 300 п.н. в 3' направлении от сайта Kpnl, а у HF5 и СР9 - на расстоянии более 370 п.н., но менее 470 п.н. от сайта Kpnl. Это соответствует в СР47 аминокислотам 253-353 и 376-408 соответственно.

ФС~-мутанты группы г трансформируются к фотоавтотрофяорти фрагментами 876 п.н. Sisal - Kpnl и 1332 п.н. Kpnl - Sau3A, HO не трансформируются фрагментом 695 п.н. Sau3A-KpnI и Ва131-производными субфрагмента 876 п.н. Sau3A - Kpnl с долецияш в 220 и 80 п.н. в направлении 3' от сайта Smal (рис.2). Следовательно, нарушения в этой группа мутантов локализуются в участке 1339-1418 п.н. гена рзЬВ, что соответствует 44G-473 аминокислотам белка СР47. Поскольку ни один из проворенных мутантов но трансформировался участками ДНК, локализоЕашшш дкстальнее рзЪВ, то могло сделать вывод, что все СС-ыутанта syncohooyotio 6803, тр£нсфор!£фус„а:о к • фэтоавтотрсфцзсти плаз;,идой р31.2, дефектны по гену-рзЬВ.

Эксперименты по перекрестной трансформации мутантов препаратам хромосомной ДНК друг друга показали, что повреждения гена рзЪВ у большинства мутантов одной и той ко группы но идентичны.

V. Анализ иолекулярной природа генетических поврездешй у psbB-ыутантов Synechocystis 6S03.

Чтобы выяснить молекулярную природу генетических повреждений у рзЬ^Г-мутантов Sj îchocystio 6803, определяли нуклеотидные последовательности повреаденных участков генов рзЬВ. Для этого были сконструированы мини-банки 2.8 т.п.н. BamHI-HindIII фрагментов хромосомной ДНК семи рз£>В-мутантов. Отбор рекомбинантных клонов, несущих мутантные копии рзЬВ, проводил!! по гибридизации с ДНК плазмида р31.2. Затем для каждого мутанта мшшмалышй участок ДНК, включающий мутационное повреждение, • субклонировали в векторах Ш3тр18 (19) или рис19 и определяли последовательность нуклеотидов методом тершширования синтеза цепи в присутствии дидезоксинуклеотидов. Резулбтаты представлены но рис.3.

У мутанта ОТ" трансверсия ТА -♦ AT в положении 499 от начала т, .нсляции гена рзЬВ, привела к замене остатка триптофана на аргинин. У двух независимо выделенных мутантов РМВ1 и РК12

5 2?б 555 75? 1000 И.О. 1339 1522 1б00

Рис.3. Изменения нуклеотидпых последовательностей в поврежденных

участках гена рзЪВ у мутантов БупесЬосузНз 6803. Приведены соответствующие фрагменты белков СР47 мутантов и штамма дикого типа (те.-!;.).

обнаружена деления 12 нуклеотидов, которая привела к выпадению 4 аминокислот (208 - 211) белка СР47. Она произошла, вероятно, аа счет рекомбинации по двум прямым повторам:

дикий тш:

мутанты РМВ1, РК12:

Тот факт, что эта делеция обнаружена у двух независимо подученных мутантов,свидетельствует, вероятно, о потенциальной мутагенности этого участка, содержащего короткие прямые повтора. У мутанта ВК4 инсерция т после 1039 нуклеотида вызвала сдвиг рамки считывания и привела к термкнации трансляции после 346 аминокислоты в балке. СР47. у мутантов NG1, N010, и HF16 транзицпя со дт в третьем положении кодонов ТОО (кодирующих триптофан), локализованных в различных участках гена, обусловила образование стоп-кодонов и соответствующее блокирование синтеза толипоптцдаой цепи поело 301, 449 и 468 аминокислотных остатков соответственна.

Для первичной структуры бэлка СР47 Syaecbooystis 6803 (Vermaas et al.,1987), Anabaeaa 7120 (bang, Щшо11сога,1989), шпината (líorris, Herrmann, .1984), табака (ShlaozaJd., et al.,1986), кукурузы (Rock, et al.,1987) И ржи (Bucharov, et al. ,1983) характерна высокая степень гомологии (75-983Í . по аминокислотной последовательности). Црофили гидрофобности СР47 этих объектов практически идентичны, что, вероятно, .указывает на сходство их структурно-функциональной организации в тплакоидиой мембране. Все они имеют шесть "трансмембранных. сегментов" -участков, потенциально способных пересекать мембрану в виде а-спирали (по алгоритмам Kyte, Doolittlo, 1982 И Eieenberg et al.,1984). Вероятная локализация гидрофильных участков, расположенных мевду трансмембранными сегментами, в лшене или строме можог быть определена по правилу Хейне и Гавела (Heijne е., Gavel Y. 1988), в соответствии с которым через мембрану не транслоцирук" ся короткие (до 70 ак) фрагменты белка,- несущие положительно заряженые аминокислоты - аргинин и лизин. Так как СООН-конец белка СР47 и участки между трансмембранными сегментами II и ill (петля В) и IV и V (петля D) насыщены этими —тшокислотвми, -¿о они, видимо, не транслоцируются в люменальное

=ATTGTCGGTATCATlG= — i —

====¿M!G==*==

фостраяство а расположены в строме. Тогда петли А к С засположэвы в жмене (рис.4). В соответствии с этой схемой замена Сгр 167 на аргинин у мутанта №2 приводит к утрате гидрофобного аминокислотного остатка и появлении положительного заряда в грапслоцпруемой по тле О бежа СР47, что, возможно, затрудняет правильную укладку всего белка в мембране, дестабилизируя комплекс <СС II. Однако анализ спектров низкотемпературной флуоресценции клеток мутанта н?2 (раздел VI.з) позволяет предполагать', что его белок СР47, видимо, способен встраиваться в тилакоидпую мембрану. Альтернативным объяснением • ФС~-фенотипа мутанта HF2 можот быть следующее. Имеются данные, свцдэтольствувдпэ о важной роли триптофана в качество медиатора электронного транспорта в реакционном центре ' фотосистемы пурпурных бактерий (Plato et al.,1939). Поэтому не исключено участив этого аминокислотного остатка, локализованного в люмене, в фотохимических реакциях на донорной стороне фотосистемы II. Данные о взаимодействии СР47 с ип+2-связывакшм белком кислород-выделяющего центра ФС II приводятся в целом ряда работ (Enami et al.,1987; Bricker et al.,1988).

Основная функция белка СР47 - связывание хлорофилла а внутренней антешш ФС II. Целый ряд данных свидетельствует о том, что лигандами хлорофилла служат остатки гистидина (способные образовывать координационную связь с центральным атомом Ug порфиринового цикла), Характерно, что остатки His расположены попарно в трансмембранных участках белка вблизи поверхностей мембраны, растояние мезду гиствдшами в каждой паре - 14-15 аминокислот. Кроме того, в связывании хлорофилла могут участвовать аминокислоты аспарагин и глутамин (V7ech3ler et al.,1985).

Транзиция со —» at у мутанта ючб, приводящая к появлению стоп-кодона вместо Тгр 468, (в VI трансмембранном сегменте) лишает белок СР47 мутанта NF16 39 СООН-концеЕых аминокислот (7.7» полнпоптлдной цепи СР47 ), что и является щлгпяюй инактивации, ФС II. Шесть аминокислот из 39 заряжеш положительно (Arg, Lys) к шесть - отрицательно (Asp, Glu), что может указывать на важную, роль этого фрагмента во взаимодействии белка СР47 с другим: белка,и ядра ФС II или фикобйЛисбм* Кроме того, ранняя терминация трансляции приводит к татеро возможных лигандоз хлорофилла а: гистидинового остатка His-469 (одного из пары гистидиновых остатков в 6 тр&нсмембранясм сегменте), й

Рис.4. Предполагаемая модель организации белка СР47 в мембране. Римскими цифрами 1-71 обозначены трансмембранные а-спиральные участки. Указана локализация исследованных мутаций.

>

аспарагшошх и глутаминовых остатков, что может нарушить нормальное связывание СР47 с хлорофиллом а, приводя к дестабилизации всего комплекса ФС п.

Деления 12 нуклеотидов у мутантов РХ12 и РЫВ1 привела к выпадению четырех аминокислот: Val-208, Gly-209, Ile-210, iie-211 в 17 трапсмембранном сегменте СР47 (рис.4). Из четырех делвтированых аминокислот две консервативны - Gly и Не. Однако кажется вероятным, что имеет значение не утрата конкретных аминокислотных остатков, а укорочение вследствие этого гипотетического IV трансмембранного участка до 18 ак, что недостаточно для пересечения 30 А липидного слоя, так как на одага аминокислотный остаток в а-спирали приходится 1.5 A (Eisenberg, 1934). Это, вероятно, нарушает организацию всего белка в мембране, приводя к ФС~-фенотнпу. Нельзя исключить и возможности того, что гидрофобный сегмент IV является не трансмембракшм, а поверхностным, ассоциированным с мембраной участком. Тогда критическим оказывается не его укорочение а сокращение расстояния мезду гистидиновы:.« остатками в паре 202/216.

VI. Характеристика активности фотосистемы II в клетках рвЬВ-цутантов SyncchocyatlB 6803. У мутантов с различной молекулярной природой повреждений в гене рзЪВ исследовал:! активность фотосистемы II с целью выяснения возможной роли поврездеппого или делегированного участка белка СР47 в функционировании ос II.

VI. 1. Измерение интенсивности фотоиндуцнрованпого выделения июлорода, характеризующее фотохимическую активность СО' II, показало, что у всех рзЬВ-мутантов скорости этого процесса сходны и значительно ниже, чем у штамма дикого типа Synechocysti3 6803 (табл. 4).

VI.2. (Сотоицдуцировашше. изменения быстрой флуоресценции (переиенная флуоресценция) пропорциональны квантовому выходу реакции фотовосстановления хинонных акцепторов фотосистемы II и позволяют оценивать фотохимическую активность ОС II (Van Gorkon, 1986). Постоянную флуоресценцию (Р0) целых клеток Synechocy3tia 6803 дикого типа и рзЪВ'-мутантов измеряли в присутствии диурона при возбуздении слабым светом, не вызывающим восстановления Qa. Максимальную (Р ) флуоресценцию измеряли на этих же образцах

поело восстановления оа постоянным действующим светом. Вычисляли величину ДР/Р , где Др = р - р.. Значения интенсивности Р„

ш га о О

мутантов соответствуют Р0 клеток дикого типа, однако переменная флуоресценция у всех мутантов отсутствует шш значительно снижена по сравнению с клетками штамма дикого типа, что свидетельствует о потере активности СС II (табл.4).

Таблица 4. Активность фотосистемы II в клетках штамма дикого . типа и ФСГ-мутантов Synechocystis 6803.

Штата Выделение 0о к» ¡лкМ ьтХл-1 час-1 Относительная величина . переменной флуоресценции др/ р

дик.тип 24 0.73

РК12 2.5 0.10

РМВ 4.3 0.26

SK4 4.7 0.0

SK20 2.7 0.21

NJ2 3.6 0.20

1П?5 2.8 0.0

КР16 3.3 ' 0.17

VI.3. Спектра флуоресценции хлорофилла позволяют исследовать срган"зацшо пигмент-белковых комплексов и процессы, переноса энергии в них. Спек:р флуоресценции целых клеток Synechocystis 6803 при 77 К и длине волны возбуждающего света 440 нм имеет три максимума, один из которых (при 720 нм) связан с ФО I, а два других (при 685 и 695 нм) характерны для нативного комплекса ФС II (рис.5). Спектры всех исследованных мутантов оказались сходными и характеризовались отсутствием максимума флуоресценции при 6S5 нм. Источником флуоресценции при 695 нм ранее считался белок СР47 í'Jakatani, 1983; Pakrasi et al., 1985), однако недавно было показано, что для регистрации этого пика in vivo необходимо присутствие в тилакоидной мембране не только СР47, но и других белков ядра СС II (Pakrasi et al.,1989). Из полученных данных следует, что у всех проанализированных рзЬВ-мутантов oynechocyetic 6803, независимо от локализации генетического повреждения, отсутствует, вероятно, структурю организованное

щро, £0 II. В спектрах ■ мутантов наблюдаются различия в штепспвноотл флуоресценции при 685 ям . Так, у КШ1 и иг? она штспсивпее, чем у меток дикого типа. источником флуоресценции щ 585'ям {при 77 К) считают хлорофилл а внутренней антенны ФС [I, ассощшровшишй с белками СР43 и СР47. Увеличений &луорэсцэшщи при 685 нм в спектрах мутантов РМ31 и га?2 может 5нть шзваао тем,'-что'СР43 и СР47 инкорпорируют в мембрану, >деоко яаруиена • миграция анергии возбуждения от хлорофила штшш на ровкцкогсшй центр ФЗ II. Уменьшение максимума при 695 зм,. вероятно, • сзначаог отсутствие или значительное снижение голичества в. тилакоидной мембране' белков СР43 и СР47, ассоциированных с хлорофиллом а.

(относ.ед-цы) '■1.0

Ф л У

о р

е

с Ц

о

н Ц

-И

я"

I I

685 695

—I-1—

715 725

X (HM)

Рис. 5. Спектрц флуоресценции хлорофилла.целых клеток ССгмутантов и клеток дикого типа Synechocystis 6803 при 77 к, длина волны возбуздоюцого света 440 им.

^ - ДИКИЙ ТИП; РМВ1, ШГ2; ,--"""- IJP16, SK4.

Тагам образом, исследованные рзЬВ-мутанты БупесЬосузиз 6303 с различной - локализацией генетических повреждений: характеризовались отсутствием или ' значительным снижением активности фотосистокы. П. Эти результаты согласуются с литературными данными о том, инактивация, одного из белков ядра фотосистемы II часто приводит к полной потере способности к фотоавтотрофному росту (С2а1гка1пз, Во§огас1, 1983; ^звоп et

-1. ,1927; Ракгаз! ег а!.,1988; РЫ1Ъг1ск, гПшзказ, 1988; Vеггг.ааз et а1.,1987). При этом В тилакоидной мембране Ы0 ТОЛЬКО отсутствует продукт инактивированного гена, но и значительно снижено содержание других белков ядра ФС. II, хотя транскрипция ц ' трансляция кодирующих их генов осуществляются на уровне. клеток штамма дикого тжа (Уегтааз е1; а1.,198б; 1987; 1?83). Вероятно, большинство этих белков необходимы для сборки и поддергания структурной целостности ФС и. Поэтому любое повреждение одного, ко них, в частности СР47, нарушающее его взаимодействие с гт.екулами хлорофилла а или друга,с:' белками ФО II, дестабилизирует весь комплекс ядра фотосистемы II и приводит к блокированию процесса фотосинтеза. •

В результате проведенного анализа ■ шявлеш районы и отдельные аминокислоты белка СР47, необходимые для Функционирования кошлекса ФС II, однако- 'конкретная функциональная роль каждого из участков осталась неясной. Для решения этой задачи, очевидно, необходимы будут эксперименты по сайт-направленному мутагенезу в наиболее консервативных областях СР47, а такжо тох районах и аминокислотах белка, функциональная значимость которых выявлена в настоящей работе.

вывода

1. Клонированы фрагменты хромосомной ДНК БупесЬосуаТас 6803, восстанавливающие при трансформации способность к фотосинтезу 1 различных фотоскнтвтических мутантов этой цианобактерии. Для двуз фрагментов опрздолены участки гомологии в хлоропластном геноме табака.

2. В составе одного из клонированных фрагментов' идентифицировав Г'^м рзЬВ, кодирующий хлорофилл а - связывающий белок СР4' фотосистемы II. В хромосоме БупесЬосуз-Ыз 6803 в отличие о1 хлоропластного генома высших растений, ген раЪБ не входит в одп кластер с генами рзЪН, ре!Б, реШ.

3. Картированы генетические повреждения у группы рзЬВ-мутанто этой цианобактерии. Клонированы и секвенированы фрагменты ген рзЬЗ с о (.я мутантов, определена молекулдаая природа и генетических повреждений.

4. Выявлены функционально значимые районы и отдельнь . аминокислоты в белке СР47, необходимые для обеспечения активное1] комплекса ФС II.

Основные результаты диссертации излсгепы в публикациях:

1. Комарова O.A., какова С.Ю., Гримм Р. Использование мутантов, не способных к фотоавтотрофному росту, для клонироьания :

и анализа генов фотосинтеза цианобактерзш Synechocysti3 6803 - В ' ; сб.: Труда 18 научной конференции колодах ученых Биологического факультета ЮТ, Москва, 1987, чл, .'Í6652-BS7, стр.187-191.

2. Shestakov S., Elanskaya I., Ermakova S-, Koksharova О., Smirnova T. Isolation of genes controlling the photosynthesis in Synechocy3tio зр. PCO 6C03. Ab3tr. oí VI Int. Sjrap. on ' Photosynthetic Prokaryote3, Noordwijkerhaut, Netherlands, 1983, p77.

3. Шэстаков C.B., Еланская И.В., Ермакова С.Ю., Андрианов В.М., Ульмасов' Т.Н., Кокшарова O.A. Клонирование, фрагментов ДНК, восстанавливающих способность к фотосинтезу в клетках мутантов . SynechocystÍ3 6303 - Докл. АН СССР, 1989, Т.308, ГА, стр.211-214 ;•

4. Лысенко Е.С., Гапеева Т.А., Ермакова С.Ю., Ела..ская И.В., 1 Огар'соса O.A., Тарасов В.А. Гомология клетпфованных фрагментов ДНК циапобвктерии Synechocystis 6803 с хлоропластной и ядерной ДНК растений - Генетика, 1991, 4.27, .'54, стр.581-583.

5. Еланская И.В., Ермакова С.Ю., Станбекова Г.Э., Гадкиез А.Г., Броун М.Н., Карбышева Е.А., Шахнабатян Л.Г., Чеснавичене Э.А., . Шостаков C.B. Молекулярно-генетичоский анализ генов, контролирующих синтез компонентов фотосистемы II у цианобактер/ • : Synechocyàtis 6803 - Тезисы международной конференции "Фотосинтез

и фотобиотехнология", Пущино, 1991, стр.81.

6. Shestakov S., Е1апзкауа . I., Erraakova S., Stanbelcova С., Bibikova Ii., Broun Ii. Molecular analysis of genes iör ! photosynthesis in the cyanobacterium Synei_AOcystis 6803. Abstr. of VII Int. Sупр. on Photosynthetic Prokaryotes, Amherst, Massachusetts, USA, 1991.

7. Станбекова г.э., Ермакова С.Ю., Карбшева Е.А., Шахнабатян л.г., Еланская и.в., Шестаков C.B. Молекулярно-генетичоский анализ дефектных по фотосинтезу мутантов цианобактерии. Synechooystie 6803 - Биол. науки, 1992, .S3.

8. Ermakova S.Y., Elanskaya I.V., Kallies K.-U., Weihe A., Borner' T., Shestakov S.V. Cloning and. sequencing oí mutant psbB genes oí the cyanobacterivua Synechocystis PCC 6803. Photosynthetica, 1992, in press.