Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ гена psbB, кодирующего хлорофилл А - связывающий белок СР47 фотосистемы II

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ гена psbB, кодирующего хлорофилл А - связывающий белок СР47 фотосистемы II"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им.Н.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи УЩ: 582.232.7: 681.132: 577.113: 579.254

ЕРМАКОВА Светлана Юрьевна

ИОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНА рвЪВ, КОДИРУЮЩЕГО ХЛОРОФИЛЛ А - СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК СР47 ФОТОСИСТЕМЫ II.

03.00.15 - Генетика

Автореферат даосвртации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Бнологичеа Факультета Московского государственного университета и М.В.Ломоносова и в лаборатории генетики микроорганизмов Иноот общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН С.В.Шестаков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук С.В.Каменева, доктор биологических наук, профессор Н.К.Шжовокий

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский Институт генетики и селашвш промиаленных микроорганизмов

Защита состоятся "-"-1992 г. в - ч

' на заседании специализированного Ученого ' совета Д002.49.01 Институте общей генетики 1м. Н.И.Вавилова РАН (117(309, ГС Москва, В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией шшо ознакомится в библиотеко Ида юту те с генетики им. НЛ.Вавилова РАН.

Авторзфзрат разослан "--1932 г.

УчешЗ сакра^арь

стацпасшровалшзго сойота, . •

каадакзг ссахзгз&схзх. иауг: Г.И.Полухг

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш исследования. Одним из актуальных вопросов современной биологии является выяснение закономерностей и механизмов оксигенного фотосинтеза, процесса, являющегося основным источником молекулярного кислорода и органического вещества на планета. Проблема имеет не только фундаментальное теоретическое, но и большое практическое значение в связи с задачами создания методами селекции и генной инженерии новых высокопродуктивных сортов растений с ценными свойствами, конструрования бйоэлектронных систем на основе белков аппарата фотосинтеза. Для достижения этих целей необходимо детальное изучение структурно-функциональной организации фотосиптетичоского аппарата.

В • последние насколько лет достигнут большой прогресс в исследовании молекулярной, организации пигмент-белкового комплекса фотосистемы и. Это Шло .обусловлено, правде всего, успешным применением; методов молекулярной генетики, клонированием й секвенарованизм генов, контролирующих фотосинтез у высших растений, водорослей и цианобактерий, что позволило определить первичную структуру большинства белков аппарата фотосинтеза. Во-вторых, большое .значение имело определение с помощью рентгеноструктурного • анализа пространственной организации реакционного центра фотосистемы пурпурн. : бактерий №е1веп}юГег ей а!.,1985). Кроме того, существенный и все возрастающий вклад в изучение, молекулярных осной оксигенного фотосинтеза вносит использование в качестве модельного объекта цианобактерий. Процесс фотосинтеза и структура фотосинтетического аппарата у этих микроорганизмов практически идентичны таковым у выспта растений и эукариотических водорослей. С другой стороны, прокариотический тип строения клетки, простота организации генома, способность некоторых штаммов к генетической трансформации открывают возможность широкого пименения методов молекулярной генетики и генной инженерии. Способность некоторых видов цианобактерий к гетеротрофному росту в отсутствие-активности фотосистемы II позволяет получать жизнеспособные мутанты, дефектные по генам, контролирующим работу этого комплекса. Сайт-направленное изменение этих генов у цианобактерии БупесЬосувив баоз оказалось чрезвычайно плодотворным подходом в исследовании тонкой организации реакционного центра ФО и и каталитического центра окисления Н^О, определении молекулярной

природа некоторых элементов фотосинтетических мембран и цеп транспорта электронов (Debus et al., 1983; Carpenter, Vermaas 1989; Palcrasi . i el., 1991).

Однако многие вопросы структурной организации . функционирования комплекса фотосистемы II пока нэ ясны., частности, мало известно о структурно-функциональной органпзащ хлорофилл а - связывающих белков фотосистеш II (СР47 и С. 43), г имеющих прямых аналогов в реакционном центра пурпурных бактори! Это ограничивает возможность применения для их изучения мю} сайт-направленного мутагенеза. Более удобнш • прэдставляак альтернативный подход - отбор спонтанных или шдуцпрованш мутантов с нарушениями в генах, кодирующих эти белки, последующей локализацией мутационных повреждений. Это позвол : определить функционально важные домены и аминокислоты в структу; этих белков, для последунцего анализа которых можно буд использовать сайт-направленный мутагенез. Цель и задачи исследования. Данная работа посвяще: молекулярно-генетическому анализу гена psbB, кодарующе хлорофилл а - связывающий белок СР47 фотосистеш II Synechocyst ' 6803. Основные задачи исследования:

; 1. создание геномного б~чка Synechocystie 6803 И выделение : него рекомбинантных плазмид, трансформирующих к фотоавтотрофнос дефектные по фотосинтезу мутанты этой цианобактерии;

2. идентификация и локализация генов фотосинтеза в состе клонированных Фрагментов ДНК Synechooystis 6803 г

3. молекулярно-генетический анализ серии фотосинтетическнх (ФС мутантов Syneohocystis 6803, дефектных по гену psbB, определе! молакулярной природы мутационных повревдений;

4. определение функционально значимых районов "и отделы аминокислот бежа СР47, необходимых для обеспечения вктивно« комплекса фотосистеш II.

Научная новизна i практическая ценность. Клонирован ген pt Syneohocystis 6803, кодирующий 47 кБа хлорофилл а - связывай белок фотосистеш II. Проведен молекулярно-генетический ана , серии раЬВ-мутантов Synechocyetie 6803, позволивший локализов. генетически. повреждения в пределах гена. Определе! молекулярной природа поврездений у ряда мутантов дало возможно выявить ' функционально важные» участки белка СР47. Се рзЬВ-мутантов Synechocyetie 6803, охарактеризованных генетиче и биофизически в данной работе, может быть использована

детального изучения структурно-функциональной организации белка СР47 в составе фэтосштетических мембран, для решения задач создания фотобиотехнических систем.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярной организации аппзрата оксигешюго фотосинтеза цианобактерий, описания материалов и методов исследования, изложения результатов • и их обсувдения, заключения* выводов и списка цитируемой литературы. Работа

изложена на __стр. машинописного текста и содержит_рисунков

и_таблиц. Список литературы включает_наименований.

Сокращения в тексте.

ЗИ П - .фотосистема II; ФС I - фотосистема I; ФСГ-мутант - не способный к фотоавтотрофному росту; КВК - кислород-выделяющий ксняыюкс; РЦ - реакционный центр; ale - аминокислота; т.пч. -тысяча пар нуклоотидов; ква - килодальтон.

Материалы и ыетода. ЗГх'вммн■• В работе использовали бактериологически чистув культуру 3ynsciiocyBti3 sp. PCO 6803 из коллекции Пастеровского института (Париж, Франция), ФС--мутанты этой цианобактерии из коллекции кафедры генетики и селекции. ¡ЛГУ й. штаммы е.coli: нвю1, <ш09, ИМ552, описанные в (Маниатис и 1984; Гловер и др., 1990). Культивирование бактерий. Культуру Synechocy3tis вр. рсс 6803 выращивали на модафщированной среде "С" \Столетов и др., 1965) в шмшостате при 30. С и освещенности 2000 лк. Твердая среда "С" ¿одержала 1,2% пластинчатого агара. Для выращивания е.coli использовали среду ЕВ (Маниатис и др.,1984). Ррансформацшо клеток E.coli проводили то стандартной методике. Грансформащю цианобактерий - по методу, предложенному в рабогэ (Dzelzkalns, Bogorad, 1988), с модификациям". Выделение ДНК. Зыделение тотального препарата ДНК Synechocystis 5803 проводили по методу, опубликованному в статьи (Yan den äondel et al., 1979), с модификациями. Плазмид: то ДНК из клеток E.coli выделяли по методу Бирнбойма и Доли (Birnboim, Doly, 1979). Днк очищали центрифугированием в ступенчатом градиенте'* злотности CsCl по методу Зинченко и Бабыкина (1984). Верментативную обработку ДНК проводили ферментами

производства НПО "Фермент" (Вильнюс) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Введение метки_ в ДНК in vitro эсуществляли методом "рассеянного" праймирования (Feinberg, ¡fogeletein, 1983).

Электрофорез и алюцию фрагментов ДНК из агарозн, перенос ДНК на нитроцеллвдозные и нейлоновые фильмы, Слот-гибридизацию проводили по общепринятым методикам (Машютас и др., 1984; Мазщ и др.,1990).

Нуклеотидную последовательность ДНК ' определяли методом 1 дидезокситерминирования по Сэнгеру (Sanger, 1977; Мазин и др. ,1990).

! Концентрацию кислорода в среде определяли с помощью электрода ; Кларка на полярографе ЕР-7 при температуре 25°С по методике, описанной в статье (Барский и др.,1989).

Переменную флуоресценцию хлорофилла а измеряли при ' помощи двухлучевого флуоршетра по методу Лядского и др. (1987) Спектры низкотемпературной флуоресценции снимали • на ' спектрофдуориметре "СПИЛ" при длине волгш возбуждающего света 440 нм (Гусев, Тетенькин, 1983)

Для компьютерной обработки последовательностей ДНК и белков использовали пакеты программ "PCGENE", "DHASIS", "PROSIS".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ :

I. Характеристика фотосицтеткческих мутантов Synechocyetie 6803.: К началу данной работы ня кафедре генетики и селекции МГУ была создана обширная коллекция дефектных по' фотосинтезу спонтанных и . индуцированных нитрозогуанидином мутантов цианобактерш Synechocystia 6803 (Кокшарова, 1986;. Шестаков и др., 1988; Стгщбекова и др., 1992). Большинство мутантов было отобрано путем обогащения популяций клеток цианобактерш СС-мутантами о применением в качестве селективных агентов ингибиторов фотосинтеза (нитрофурантоина, хлорпромазюю, парахлормерсуриобен-. зоата). " ;

Все использованные в работе мутанты Synechocystis 6803 не способны к фотоавтотрофаому росту и нуждаются для своего роста в : глюкозе. Измврег i интенсивности фотоиндуцированного выделения кислорода в реакции Хилла (характеризующей активность фотосистемы и) и поглощения кислорода в реакции Малера (активность фотосистемы I) у ряда ФС~-мутантов показали, что активность < : II у них резко снижена или отсутствует, тогда как по активности. ФС I клетки мутантов и шташа дикого типа практически не различаются. Т^жим образом, у исследованных ФС~-мутантов генетические повреждения, приводящие к потере способности клеток к фотоавтотрофаому росту, очевидно, затрагивают

гены, ответственные за функционирование фотосистемы и.

П.Клонировавне фрагментов хроиосошоП ДШС Synecbocyetis 6803, трапсфоршфупща ФС~-иутапты к фотоавтотрофности. XI.1. Конструирование банка генов Synechocyatlo 6803. Способность клеток Synechocystis 6803 к генетической трансформации (Grigorieva, Shestakov, 1982) дает возможность использовать описанные вше мутанта в качестве реципиентов для клонирования генов, контролирующих фотосинтез. Для выделения фрагментов ДНК, восстанавливающих способность к фотосинтезу в клетках ИГ-мутантов, был сконструирован геномный банк штамма дикого типа Synechocystis 6803. Препарат тотальной ДНК, . обработанный рэстрактазой ВаиН1, фракционировали электрофоретнчески в 0.6% агарозном голе. Фрагменты размером 5-11 т.п.н. выделяли из геля и лпгаровалн с обработанной ВашН1 и щелочной бактериальной фасфатааой ДНК вектора pACYCi84, несущего маркеры устойчивости к хдорамфешкоду {Cmß) и тетрациклину (ïcR). Продуктами датирования трансформировали компетентную культуру е.coli HB101 и отбирали CÄ3 колоши. Полученная клонотека содержала. 1780 эзависимых клонов, которые балл объединены в 127 груш по 10-15. Из казд.л группы клонов выделяли плвз..лднуи ДНК и использовали ее для трансформации ФСГ-мутантов к фотоавтотрофности.

11.2« Евдалсшге из клонотеки рекоибшгаютшх шшзмид, трансфоршрувда «кГ-иутантц к фотоавтотрофности. Цианобактерия SyneohocystiB. 6803 облагает мощной 'системой гомологичной рекомбинации, позволяющей использовать для клонирования векторы, не способные к автономной репликации в клетках этой цианобактерии (Porter, 1936; Williams, 1988). При трансформации 5С~-мутантов Synechocystis 6803 рекомбинантными плазмидами из геномной клонотеки в отсутствие селективных условий для отбора по 'чркеру вектора преимущественно происходит замещение мутантного аллеля в хромосоме реципиентной клетки за счет гомологичной рекомбинации с фрагментом ДНК цианобактерии на плазмиде, что и приводит к появлению ФС+-трансформзнтов.

ФС~-мутанты Synechocystis 6803 трансформировали суммарными . препаратами плазмидной ДНК, выделенными из групп по 10-15 клонов, и выявляли группы, обладающие трансформирующей активностью. В группе идентифицировали индивидуалы-1 клон, способный к трансформации, и проводили рестрикционный анализ плазмидной ДНК

f,

этого клона. Таким образом из геномной клонотеки ßynechocyetie 6803 было выделено 4 рвкомбинантных плазмада (табл.1):

1.р31 - трансформирует группу из 18 ©Г-мутантов (груша I);

2. р1624 - трансформирует мутант D21;

3.р.744, рЗЭ - восстанавливают способность к фотоавтотрофному . росту мутанта D13.

II.3. Делециошшй анализ клонированных фрагментов, В целях выявления минимальных участков клонированной ДНК, замэщащих путем гомологичной рекомбинации ыутантше участки в хромосоме ФС~-мутантов, субфрагменты рекомбивавтшх плазмид встраивали в векторы puci9, PACYC184, или PSE176 и исследовали на способность к трансформации соответствующих ©Г-ыутвнтов. Результата делеционного анализа представлены в таблице 1. Из двух BamHI -Hindin подфрагмантов р31 с размера}® 2.8 т.п.н., один субфр^гмент (р31.1) не обладал трансформирующей активностью/в другой (р31.2) трансформировал к фотоавтотрофности все мутанты I группы. Причем у 11 из них ФС+- фенотип восстанавливался при трансформации Smal - PvuII фрагментом (0.8 т.п.н.), субклонированным в составе плазмида р31.3. (табл.1). Мутант D13 трансформировался к фотоавтотрофности Hindlll-BamHI субфрагментом рЗЭ размером 2.0 т.п.н. и BaraHI-Hindlll субфрагментом р744 размером 1.7 т.п.н. (табл.1).

III.. Идентификация клонированных фрагментов хроиосоиной

ДНК Synechocyetis 6803.

Предварительный анализ ФС~-мутантов позволял предполагать, что у них повреждены структурные или регуляторные гены, контролирующие работу ФС II. В целях идентификации этих генов были проведены опыты по гибридизации выделенных из клонотеки плазмид с тотальной хлоропластной ДНК табака (Nicotiana tabacum), кодирующей большинство известных генов ФС II.

Фрагменты ДНК Synechocyetis 6803, клонированные в составе , рекомбинантных плазмид р1624, р31 обнаружили гомологию с тотальной хлоропластной ДНК табака, тогда как рЗЭ и {/744 не дали позитивного сигнала гибридизации. Следовательно, р31 и р1624 несут гены (или фпагменты генов), гомологичные генам фотосинтеза высших растений, кодируемых хлорошшстным геномом, а р744 и рЗЭ, по-видимому, могут содержать гены, гомологичные ядерным генам

Таблица 1. Делеционный анализ рекомбинантных плазмвд из

клонотеки 5упеоЬосув11в 6803, трансформирующих к фотоавтотрофности ФС'-мутанта.

Рекомб. плаз-мида Клонированный фрагмент ДНК 5упес1юсув1;18 6803 Размер Рестрикционная карта т.п.н. -------- Вектор Трансформируемые ФС~-мутанты

Р31 Р31.1 Р31.2 Р31.3 ВашН1 БтаХ Н1п(1111 ВатН1 РК Н В ВРК н . т Б о.д рАСТГС184 РАСУС184 РА0У0184 рЭЕПб N14 МР2 ЫР17СР16 РКВ1 Ш РК12 БК19 8К20 БК4 №5 N01 Ы07 СР5 СР9 N08 N010 КР16 нет ИР1 ИР2 №17 СР16 РЫВ1 РК7 РК12 БК19 ЭК20 БК4 N75 N01 N07 СР5 СР9 КСЗ N010 Ы?16 РМВ1 РК7 РК12 БК4 БК19 БК20 МР5 N01 N07 СР5 СР9

Р744 ВатНХ М НЗ Н ВатН1 ¿вшы^швЦддг^ви'^я»'.! пияяявА б.о В Н л ГУ ||ГШ|1,.,..,' •' рАСУС184 рИ019 рАСУС184 РА0УС184 013 013 013' 013

рЭ9 "ВатН! I??1 Н1 М ВатНХ Н НН Н Н Н Н±шШ1 АтмилшА -.о

-1624 ВатН1 Н Н Н ВашН1 1— 1 1 . 1 11 0 1.0 5.0 10 Т.П.Н рАСУС184 021

высших, растений. Гибридизация шазмид р39, р744 с ядерной ДНК гороха (Р1вит ваИтот) И арабидопсис (АгаЪ1йорв1в Й1а11апа) была продемонстрирована в совместной. работе с лабораторией изменчивости генома Института общей .генетики РАН (Лысенко и Др..1991).

С целью идентификации участков хлоропластной ДНК, шевдих гомологию с рекомбинантными плазмидами р1624 и р31, фрагменты ДНК зупесПосуэив 6803, клонированные в их составе, гибрвдизовали с банком, генов хлоропластов табака (БШпоааМ. ^ а1.,198б>. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Гибридизация клонированных фрагментов ДНК

Synechocystis 6803 с банком генов хлоропластов табака.

Рекомбинантная Гомологичны^ фрагменты хлоропластной ДНК

.плазмида

назван. клоннр. фрагм. фрагмент размер т.п.н. ■ локализация фрагмента в хлоропластом геноме, наличие фотосинт. генов

р31.2 р1624 5.6 т.п.н а.9 pTBai: S8 рТВа1: 11,3 70,77 - 82,12 т.п.н. рвЪВ, psbH, petB, petD

т.п.н. S9 5,5 65,30 - 70,77 т.п.н. рвЬЕ, раЪР

S11 0,6 82,11 ~ 02,75 т.п.н. лет

S10 1,1 82,75 - 83,81 т.п.н. нет

Фрагмент ДНК Syneohocystis 6803 в плазмиде р31. гибриднзуется с Sali - Sali участком хлоропластной ДНК табак размером 11.3 т.п.н., (S8), содержащим несколько . гене фотосинтеза (рзЬВ, рзЪН, pets, petD). Фрагмент р1624 обнаруживав ; гомологию с несколькими участками хлоропластной ДНК табакг содержащими, кроме генов фотосинтеза {рзЪЕ, psbF) несколы* неидентифицированных открытых рамок считывания (Shinozaki £ ai.,1986). Сравнение рестрикционной карты р1624 и фрагмента Д! Syneohocystis " "303, несущего гены рзЬЕ и paöP (Pakrasl t al.,1988), свидетельствует о том, что р162.4 не содержит эи генов. Поэтому не исключено, что у мутанта D21, трансформируемо] к фотоавтотрофности плазмидой р1624, нарушен фотосинтетичесм

а

■

ген, гомологичный одной из неидентифицировашшх открытых рамок считывания хлорошгастного генома. Дальнейший анализ р1б24, р09, р744 в настоящей работе не проводился.

' В ходе дальнейшего исследования определяли гомолога р31.2 с вдентафацированшага ранее генами фотосинтеза.

В качестве зонда использовали 2.8 т.н.н.: (Ваяет - Н1п<И11) фрагмент, клонированный в р31.2 (табл.1). Была обнаружена его гомология о геном рзЪВ шшшата (кодирущего 47 М)а хлорофилл а -связывающий белок СО II), предоставленным П.Вестхоффом (Яеайюгг et а1.,1935). Для 1 определения,"локализации и ориентация раЪВ Бупес2юсуз41в 6803 в составе плазмиды р31, проводили гибридизацию ДШ р31 о различными. участками гена рзЬВ шпината в качестве зоцдов. Результаты представлены на рисунке 1.

> Рно.1. Определение локализации и ориентации гена ЗупеоЬосув-Ыа 6803'в составе плазмиды р31.2.

• 5 464 б£? "

■'рвЪВ

, Real

БаяШ Bamll Rsal

-1V5I ¿ГО -55

1300

Hlndlir

1^29 H.H. 2^00

psbB шпината

Xbal i

1525 П.Н.

Rsal 1_

Raa

667 п.н.

зонд 1 )

ВашШ: Hlndlll -

I-1 л зонд 2

641 П.Н

Xbal

P3I.2

, 512 П.Н.

I /'S

PvuII s

BamHI 1 Kpnl Smal

aJ- J-

i 30НД 3

Hindlll

1.1 Т.П.Н.

1.65 Т.П.Н.

Essa

Вероятная локализация и ориентация в плазмиде р31.2 гена рвьв Synechocystls FCC 6803

i

Зонд 2 (BamHI - Hindlll субфрагмент гена paЬВ шпинат) размером 641 п.н.) гибридазуется только с 1.1 т.п.н. BazaSI - Бша фрагментом р31.2, а зонд 3 (HlndlII-Xbal фрагмент 512 п.н.) расположенный дастальнее, - как с 1.1 т.п.н. ВашШ - Bmal, так. з ; с 1.65 т.п.н. Smai - Hindin подфрагментами р31,2. Следовательно ¡ ген раЪВ Synechooystis 6803 начинается в пределах EaaHI - Вша ' участка (1.1 т.п.н.), а З'-конец гена расположен о 1.65 т.п.н 1 ' фрагменте р31.2.

Ронд 1 раьв шпината (рис.i) не гибридазуется с 1.1 т.п.н BareHl - Smai участком р31.2, что. связано, очевидно, о значительным отличием 5 • -флашагрущих послэдовательнсютей гсшо; рзЪВ шпината и Synechocyetis 6803. Но поскольку исоло одной трал этого фрагмента (~200 п.н.) приходится на начало кодарукца последовательности раЪВ пшинат§, то отсутствие гибридизации можэ: свидетельствовать о том, что pst i Syneclwcystis 6803 клонировал з р31,2 не полностью, и не содержит 5'-концевоЙ участок. ! Известно, что в хлоропластах высших растений рзЬЗ являете;

первым геном оперона рвЪВ-раЪН-petB-petD (Alt et al.,1983 , Shinozaki et al.,1985). Поэтому плазмвду р31, несущую фрагмен1 ДНК (около 4 т.п.н.) дастальнее рзЪВ, исследовали в отношени гомологии с генами рзЪН ("из pSoP1923) и petD (из pSoP937 шпината. Этот фрагмент не гибридазуется с генами раЪН и petD Таким образом, в отличие от хлоропластного генома высок растений, в хромосоме Synechocyetis 6803 ген рзЪВ не входит з один кластер с генами рäbH, petB, petD.

Одновременно с работой по клонированию и идентификации генов ФС II SynechocystiQ 6803, проводимой на.чи, ген раЪВ stoJ цианобактерии был юют рован и секве1шрован в лаборатории В. Вермааса, США (Vermaas et al., 1987). Сравнение полученных нагл данных с опубликованной В.Вермаасом и др. последовательность] нукпеотидов гена раЪВ показало идентичность построенной нами i Вермаасом и др. рестрикционной карты и установленной ориентацш гена рзЪВ. .

i Поскольку клонированный в составе р31.2 фрагмент ДНК не

содержал 256 п.н. 5'-концевого участка гена рзЪВ, был; предпринята попытка клонировать полную кодируищп последовательность раЪВ. Для этого хромосомную ДНК Synsehocyetii 6803, 'расщепленную различными рестриктазами, разделял! электрофоретически в 0.6% агарозном геле, переносили ш

аейлзповуи мембрану Hybond-H и гибридизовали с 1.1 т.п.н. Banfll -Srsal шдфрагментом р31.2. Полученные данные позволили установить: з\ рзЪВ представлен в геноме Synechocystis 6803 единственной копией;

в\ полная кодирующая последовательность гена рзйВ, находится в составе Hindin - Hindill фрагмента хромосомной ДНК длиной около 3.5 т.п.н.

На векторах рис19 и pACYCi84 были сконструированы миьи-банки Ilindlll - Hindlll фрагментов хромосомы SynsohocystiG 6803 с размэром 3.0 - 4.0 т.шн. Рекомбинантными плазмидамя трансформировали компетентные клетки в. coli нвю1 и лл09. Сзлзкщш клонов, посудах, рекомбинантную плазмиду с полной сослодователыюстыз psbB, воли по' гибридизации полученных клонов Б.coli с 1.1 т.п.н. ВашЛ1 - smal субфрагментом р31.2. Однако клопов» содзркгних цолнй геп рэЬВ, отобрать не удалось, это может бить обусловлено тем, что продаст данного гена токсичен для клзтои E.coli. О трудностях клонирования в E.coli некоторых генов, кодирующих белки фотосинтеза, связанных ,с токс-чностью их продуктов, сообщалось шага в работах других авторов (Golden „; al.,1987; Yermaas et al.,196.). Клонирование полной кодирующей таолздовальшсти гена рзЬВ на векторах - производных фага X, позволящдх избежать этих методических ограничений, не входило в задачи нашей работы. ■ - •

П. Картирование Myrat. юнйых повреждений у мутантов, трансформируемых к фотоавтотрофности плазыидой р31.2.

В составе плазмида р31.2, содержащей геп рэЪВ, не обпарукены другие гены оперона рзЪВ-рзЬЗ-petB-petD, Характерного для хлоропластпого генома растений. Однако это не исключает того, что у цианобактерий дистальнее рзЪВ находится какой-либо друтй геь (гены), повреждение которого также приводит к потере способности к фотоавтотрофяому росту.

Для проверки втого предположения, а такие в целях определения функционально важных участков белка СР4? была проведена работа ¿га тонкому генетическому картированию повревдений у ФС_-мутантов Synechocystis 6803, трансформируемых к фотоавтотрофности плазмидой р31.2. Для, этого различные перекрывающиеся субф^згменты р31.2 с"1клонирова.пч в векторе рОС19, некоторые из них затем дополнительно укорачивали путем обработки акзонуклоазой Ва131 (рис.2) и полученные г ab' иды

1Т.П.Н.

р31.2

i— 256

Р

т

к

-г

55В 759

S Sa D Sa К Н'

s|=rj)Llll.l.k.Lla.llB.ILi.i.lL' ¡LiiiiiiiilliiLL

11446 1338

2215

рвЬВ

1522 П.Н..

302

580 П.Н.

695 П.Н.

502

780

ШЧ IJP2 МР17 СР16

т

РЫВ1

РК7

РК12

SK19

SK20

1332 П.Н.

SK4 NG1

i

IIF5 СРЭ

_____!

- 60 п.н.

-300 П.II. -370 п.н. -470 П.Н.

СР5 NG7

876. П.н.

'Г

НГ16 HG8 IIG10

- 80 П.Н. -220 П.Н.

Рнс. -2. Локализация мутационных повреждений у psbS-мутантов < Synechocystis 6803 с помощью далещюнного анализа. В - BamHI, D - Dral, Н - Hindlll, К - Kpnl, Р - PvuII, Sa - Sau3a, S - Smal.

. использовали для трансформации ФС~-мутаптов к фотоавтотрофноств На основании результатов трансформационного анализа мутанты бш разделены на 4 группы (А-Р) по локализации мутацаоннь повреждений (табл.3).

ФС"-мутант группы A (NF1, HF2, ЮЧ7. 0Р16) трансформируют« к фотоавтотрофности субфрагме'&тами BamHI - PvuII, 302 n.i t длиной и BamHI - Kpnl (502 п.н.) (рис.2). Таким образо!

is

Таблица 3. Локализация мутаций в гена psbS.

группа ФС" мутанты Субфрагменты p31.2, трансформирующие йО"-мутанты 1 Локализация мутаций в рзЪЗ к в белке СР47

NP1

А •НР2 302 п.н. BamHI - Pvull 256 - 558 П.Н.

К3?17 502 П.Н. BainHI - Kpnl 85 - 136 ак

НШ

РК7 502 П.Н. BaitiHI - Kpnl 553 - 759 П.К.

Б ÏK12. SK19 SK20 780 П.Н. Pvull - Kpnl 186 - 253 ак

SK4

ÎÎÏ5 580 П.Н. Kpnl - Smal

В Ng1 780 П.Н. Pvull - Kpnl 759 - 1339 П.н.

Ng7 1332 П.Н. Kpnl - Sau3A 253 ~ 446 ак

СР5

СР9

MPI 6 876 П.Н. Smal - Kpnl 1339 - 1520 П.Н.

Г Ng8 Mg10 1332 П.Н. Kpnl - Sau3A 446 - 473 ак

генетические повреждения у зтих мутантов локализуются в участке между 256 и 558 п.н. гена рзЪБ, что соответствует 85 - 18S аминокислотам белка СР47. Мутационные повреждения у мутантов груша Б (КШ1, РК7, РК12, SK19, БК20) локализуются в участке Pvull - Kpnl около 200 п.н. длиной (аминокислоты 186 - 253 белка СР47).

У ФС"-мутантов группы В (SK4, NT5, Ng1, îïg7, С?5,- СР9) мутации расположены в.участке Kpnl - Smal, длиной 5ÔQ плг. Для7 ■более точного картирования мутаций в этом участке/ с помощью обработки акзонуклеазой Ва131 были сконструированы производные субфрагмента Kpnl - Sau3A (1332 п.н.) с делениями приблизительно 60, 300, 370 и 470 п.н. в 3' направлении от сайта Kpnl (pzc.-Z}.-

При трансформации ФС~-мутантов группы В делеционными вариантами было показано, что мутации у SK4 и Ш1 локализуется на расстоянии не более 300 п.н. в 3* направлении от сайта IÇpnl, а у , ;<?5 и СР9 - на расстоянии более 370 п.н., но менее 470 п,п. от сайта Kpnl. Это соответствует в СР47 аминокислотам 253-353. и 376-408 соответственно.

СС~-мутанты группы Г трансформируются к фотоавтотрофности фрагментами 876 п.н. Siaal - Kpnl и 1332 П.П. Kpnl - Sau3A, НО не трансформируются фрагментом 695 п.н. Sau3A-KpnI и Ва131 -производными субфрагмента 876 п.н. Sau3A - Kpnl с долацаяш в 220 и 80 п.н. в направлении 3' от сайта Smal (рио.2). Следовательно, нарушения в этой груша мутантов локализуются в участке 1339-1418 п.н. гена рзЬВ, что соответствует 44S-473 аминокислотам белка СР47. Поскольку ни один из проверенных мутантов не трансформировался участками ДНК, дасшшоваашми дистальнее psbB, то мошо сделать вывод, что вса (КГ-ыутанта . synechocysti3 6303, трансформируемые к • фэтоавготрофнооти плазмвдой р31.2, дефектны по гену*рзЬВ.

Эксперименты . по перекрестной трансформации мутантов препаратами хромосомной ДНК. друг друга показали, что повраздешш гена psbB у большинства ыутантоз одной и" той кэ группы нэ 1 идентичны.

V. Анализ шлекулярной прглрода генетических повреждений у psbB-аутантов Synechocystis 6В03.

Чтобы выяснить молекулярную природу генетических повреждений , у рзЬдГ-мутантов sy schocystic 6803, определяли нуклзотидныэ последовательности поврезденных участков генов рзЬВ. Для этого были сконструированы мини-банки 2.8 т.п.н. BaisHI-HindIII Фрагментов хромосомной ДНК семи psbB-мутантов. Отбор рексмбшгантных клоков, несущих мутантные копии раЬВ, проводили по гибридизации с ДНК плазмида р31.2. Затем для каздого мутанта минимальный участок ДНК, включающий мутационное поврездеше, субклонировали в векторах М13тр18 (19) или рис19 и определяли последовательность нуклвотидов методом терминирования синтеза цепи в присутствии дидезоксшуклеотидов. Результаты представлены на рис.3.

У мутанта ïiî" трансверсия ТА -» AT в положении 499 от начала .нсляции гена рзЬВ, привела к замене остатке триптофана на аргтм. У двух независимо выделенных мутантов РМВ1 и Ш2

6

г5б 55? 75? 1000 п.О.

!атН1_Руц!Х Крп! _

1339 1522 1б00

ВашН!

Бта1 БаиЗА

р31.2

1404,

рЬЪВ

1522 И.О.

И.-и всо АТО ТОО С1А 01у Тгр УаХ

ИР2 вао АТО ЛСО СТА 01у Не* ЛГЙ Уа1 а/а 165 167

ил. аи етс сст атс лет йсс бот

Не 7а1 01у Не Не А1а 01у

рвм1 атт <3--------со ест

РК12 11о А1а (Яу а/а 203_211 213

ПЛ. 6АА ССС ТОв ТОО АСО 01и А1а Тгр 5ег ТЬг

ко1 ОАА бсс тал ТСС АСО

А1а Б^ор -а/а 300 302

ст.1;. ССС АТА ОТО ААА ЙАС

Рго Х1е РЬе Ьуз Лар -

БК4 ССС АТА ТТС ТАА АСА С

Рго 11е РЬе Б*ор -а/а 344 346_

я.-ь. сао ост тса ттт асс

Агз й1у Тгр РИе ТЫ

чаю шз аст тал таг асс

агй оху эгор -а/а 448 450

У!Л. САО АТО ТОЙ САШ ОСТ Н1в 11е Тгр Н1з в!у

11Р16 САО АТО ТйА САТ ССТ Н1в 11о БЪор - -466 468_

Рйо.З. Изменения нуклеоиодшх последовательностей в поврежденных . . участках гена раЬВ у мутантов ЗупесИосувИв 6803. Приведены соответствующие фрагменты белков СР47 мутантов и штамма дикого типа (я. О.

обнаружена деления 12 нуклеотидов, которая привела к выпадению 4 аминокислот (208 - 211) белка СР47. Она произошла, вероятно, sa счет рекомбинации по двум прямым повторам:

дикий тип:

мутанты РМВ1, РК12:

Тот факт, что эта делэция обнаружена у двух независимо полученных мутантов,свидетельствует, вероятно, о потенциальной мутагенности этого участка, содержащего короткие прямые повторы. У мутанта SK4 инсерция Т после 1039 нуклеотвда вызвала сдвиг рашш считывания и привела к терминации трансляции после 346 аминокислоты в белка СР47. У мутантов NG1, кою, и ИР1б траязицая оо АШ в третьем положении кодонов тоо. (кодарувдих триптофан), локализованных в различных участках гена, обусловила образован®) отоп-кодонов и соответствующее блокирование синтеза полипешщноа цепа поело 301, 449-и 463 аминокислотных остатков соотвзгсгвзено.

Для первичной структуры белка СР47 Syaechooyotie 6803 (Vermaas et al., 1987), АпаЪаепа 7120 (bang, Easelkorn,1SS9), шпината (Morris, Hermann, .1984), табака (ShinosaM, , et al.,1986), кукурузы (Roclc, et al.,1987) И рШЗ (Bucharov, . et al., 1988) характерна высокая степень гомологии (75-38% пс аминокислотной последовательности). Профили гэдрофобностп СР47 этих объектов практически идентичны, что, вероятно, указывает Н£ сходс во их структурно-функциональной организации в гаяакоидао£ мембране. Все они лмеют весть "транедамбранных сегментов" -участков, потенциально способных пересекать мембрану в вид« а-слирали (по алгоритмам Kyte, Doolittl'e, 1982 и Eisenberg е; ai.,1984). Вероятная локализация гидрофильных участков расположенных между трансмембранными сегментами, в люмене ил строме может быть определена по правилу Хейне и Гавела (Heijn .е., Gavel У. 1988), в соответствии с которым через мембрану н транслоцирук :ся короткие (до 70 ак) фрагменты бежа, несущи положительно зарякеные аминокислоты - аргинив и лизин. Так ка СООН-конец белка СР47 и участки между трансмембранными сегментам и и ill (петля В) и IV и V (петля D) насыщены атик "илскислотами, ио они, видимо, не транслошфуются в люменальное

=attgtcggtaïcatîc= t

ростраяотво и ракшоаены в сгроме. Тогда петли А и с асположеш в жмене (рис.4). В соответствии с этой схемой замена гр 167 на. аргинин у мутанта НР2 приводит к утрате гидрофобного мипокиолотного остатка я появлению положительного заряда в ршслоцируемой петдэ О белка СР47, что, возможно, затрудняет гравильную укладам всего белка в мембране, дестабилизируя юмплзкс ФС И. Однако анализ спектров низкотемпературной 51луйросцонши клеток мутанта ЯР2 (раздел vi.3) позволяет предполагать, что его белок СР47,.видимо, способен встраиваться в галакоидную мембрану.' Альтернативным объяснением • ФСГ-фэкотипа мутанта ОТ2 может . быть следующее. Имеются денные, свидетельствующие о важной рож триптофанв в качестве медиатора электронного транспорта в реакционном центре фотосистемы пурпурных бактерий. (Plato et al., 1989). Поэтому не исключено участие этого аминокислотного остатка, локализованного в люмене, в фотохимических реакциях на донорной стороне фотосистемы и. Данные о взаимодействии СР47 с ?&1+2-связывающим белком кислород-выдэлягацего центра ФС XI приводятся в целом ряде работ (Bnami et al.,1987; Bricker et al.,1983).

Основная функция белка CP47 - связывание хлорофилла а внутренней антенны ФС и. Целый ряд данных свидетельствует- о том, что лигандами хлорофилла служат остатки гистидина (способные образовывать координациохшую связь с центральным атомом :íg порфиринового цикла), Характерно, что остатки His расположены попарно в трансмембранных участках белка вблизи поверхностей мембраны, растояниег между гистидинами в каждой паре - 14-15 аминокислот. Кроме того, в связывании хлорофилла могут участвовать аминокислоты аспарагин и глутамин (Wechglei- et al.,1985).

Транзиция GO -» АН у мутанта NF16, приводящая к появлении стоп-кодона вместо Тгр 468, (в yi трансмембранном сегменте) лишает белок СР47 мутанта HF16 39 СООН-концевых аминокислот (7.7% полияептидной цепи СР47), что и является причиной инактивации, ФС ii. Шесть аминокислот из 39 заряаэйы положительно (Arg, Lys) к шесть - отрицательно (Авр, Glu), что мокет указывать на важную, роль этого фрагмента во взаимодействии белка СР47 с другими белка?® ядра ФС ' ii или фякобилисбш Кроме того, ранняя тэрминация . трансляции приводит к потере возможных лигаидов хлорофилла а: гистидинового остатка Hls-469 (одного из пары гистидановых остатков в 6 трйнсмвмбранйШ сегменте), й

Рис.4. Предполагаемая модель организации белка СР47 в мембране. Римскими цифрами 1-У1 обозначены трансмембранные а-спиральные участки. Указана локализация исследованных мутаций.

аспарагиновшс и глутвминовых остатков, что может нарушить нормально© связывание СР4? с хлорофиллом а, приводя к дестабилизации всего комплекса ФС п.

Делецпя 12 нуклеотидов у мутантов РК12 и РЫВ1 привела к выпадении четырех аминокислот: val-208, Giy-209, Ue-гю, lie-211 в IV трансмембранном сегменте СР47 (рис.4). Из четырех далетированых аминокислот две консервативны - Gly и Не. Однако кажется вероятным, что имеет значение не утрата конкретных аминокислотных остатков, а укорочение вследствие этого гипотетического I7 трансмембранного участка до 18 ак, что недостаточно для пересечения 30 А лишдаого слоя, так как на один аминокислотный остаток в а-спирали приходится 1.5 A (Eisenberg, 1984). Это, вероятно, нарушает организацию всего белка в мембране, приводя к ФС~-фенотипу. Нельзя исключить и возможности того, что гидрофобный сегмент it является не трансмембранным, а поверхностным, ассоциированным с мембраной участком. Тогда критическим оказывается не его укорочение а сокращение расстояния . наяду гистидшювыми остатками в паре 202/216.

VI. Характеристика активности фотосистемы II в клетках рвЬВ-нутантов Synechocyatis 6803. У мутантов с различной молекулярной природой повреждений в гене раЪВ исследовали активность фотосистемы II с целью выяснения возможной роли • поврежденного или делегированного участка белка СР4? в функционировании ФС и.

VI. 1. Измерение интенсивности фотоиндуцироваккого выделения кислорода, характеризующее фотохимическую активность ФС ■' II, показало, что у всех рзЬВ-мутантов скорости этого процесса сходны и значительно ниже, чем у штамма дикого типа Synechocyatis €803 1 (табл. 4).

VI.2. Фотоиндуцированные. изменения быстрой флуоресценции (переменная флуоресценция) пропорциональны квантовому выходу' реакций фотовосстаяовления хинонных акцепторов фотосистемы II и, позволяют оценивать фотохимическую активность ФС и (Van Gorkom, 1936). Постоянную флуоресценцию (?с) целых клеток Syneebocystis 6803 дикого типа и рзЬВ'-мутантов измеряли в присутствии диурона при возбуждении слабым светом, не вызывающим восстановления Qa. Максимальную (Fm) флуоресценцию измеряли на этих же образцах -

поело восстановления <За постоянным действующим светом. Вычисляли величину др/рт, где ЛР = Рт- р0. . Значения интенсивности Р0 мутантов соответствуют Р0 клеток дикого типа, однако переменная флуоресценция у всех мутантов отсутствует или значительно сшпена по сравнению с клетками штамма дикого типа, что свидетельствует о потере активности СО II (табл.4).

Таблица 4. Активность фотосистема II в клетках штамма дикого . типа и СС""-мутантов ЗупееЬооувШ 6303.

Штамм Выделение мкМ мгХл °2 час-1 Относительная величина . переменной флуоресценции Ш Ри

дик.тип 24 0.73

РК12 2.5 0.18

РЬШ 4.3 0.26

SK4 4.7 0.0

БК20 2.7 0.21

N?2 3.6 0.20

NP5 2.8 0.0

НР16 3.3 0.17

VI.3. Спектра флуоресценции хлорофилла позволяют исследоват срган"зацюо пигмент-белковых комплексов и процессы, перенос энергии в них. Спектр флуоресценции целых клеток Synecliocystl 6803 при 77 К и длине волны возбуждающего света 440 нм имеет тр максимума, один из которых (при 720 нм) связан с ФС I, а да других (при 685 и 695 нм) характерны для нативного комплекса i II (рис.5). Спектры всех исследованных, мутантов оказали сходными и характеризовались отсутствием максимума флуоресцанщ при 6S5 нм. Источником флуоресценции при 695 нм ранее считал* белок СР47 (^akatani, 1983; Paicrasi et al., 1985), однако не дав: било покапано, что для регистрации этого пика in vivo неоСхода присутствие в тилакоидной мембране не только СР47, но и друг белков ядра СС II (Ракгааз. et al.,1989). Из полученных данн следует, что у всех проанализированных раЪВ-мутант ü;--neohocyetiB 6803, независимо от локализации генетическс повреадения, отсутствует, вероятно, структурно организован*

ядро ФС -IX. В спектрах,- мутантов наблюдаются различия з ягавпеивгостк флуоресценции при 685 нм . Так, у ми и мр? оно ¡штепсивнеё, чей у, клеток' дикого типа. Источником флуоресценции при 685 ям (при 77 К) считают хлорофилл а внутренней антенны фс II, ассоциированный с белками СР43 и СР47. Увеличение флуоресценции при 685 вм в спектрах мутантов РМ31 и к?2 мокет быть внзвайо тем, • что' СР43 и' СР47 инкорпорируют в мембрану, однако нарушена ■ миграция- анергии возбуждения от хлорофилла антенны па реакционный центр ФС и. Уменьшение гаксимума при 695 юл, вероятно, • означает отсутствие или значительное снихенне количества ;в. мшкоидяой; мембране' белков СР43 к СР47, ассоциированных с хлорофиллом а.

(относ.ед-цы) -1.0

Ф л У

о р

е

с Ц

е

н ц

-«а.

я ~

685 695

—I-1—

715 725

X (нм)

Рис. 5. Спектры флуоресценции хлорофилла „целых клеток С<Згмутантов и клеток дикого типа Synechocystis 6803 при 77 К, длина еолкы возбувдакщего света 440 нм.

- дикий Tinr; PtiB1, №"2; НР16, SK4.

Тагам образом, исследованные рз&В-мутанты БупесЬосуз^з 6803 с различной -локализацией генетических - повреждений:' характеризовались отсутствием или ' значительным снижением активности фотосистемы. П. Эти результаты согласуются с ( литературными данными о том, инактивация, одного из белков ядра фотосистемы II часто приводит к полной потере способности к фотоавтотрсфюму росту (С2е1гка1пз, Во£огас1, 1983; ¿апззоп

ai

Л.,1987; Ра'лгаз! е-Ь а!.,1988; РЬПЬгхск, ¿И^зкав, 1988; Уетаааз et а1.,1987). При этом в тилакоидной мембране на только отсутствует продукт инактивированного гена, но и значительно снижено содержание других белков ядра ОС и, хотя транскрипция и ' трансляция кодирующих их генов осуществляются на уровне клеток штамма дикого тина (Уеппааз et а1.,1985; 1987; 1988). Вероятно, больпинст^о этих белков необходам для сборки и поддержания структурной целостности ФС хх. Поэтому любое повреждение одного, кз них, в частности СР47, нарушающее его взаимодействие . с г-'лвкулзки хлорофилла а или другими.' белками ФО II,: дестабилизирует весь комплекс ядра фотосистеш II и' приводит к блокированию процесса фотосинтеза. • '

3 результате проведанного анализа ' выявлены ■ районы и 'лдедыше аминокислоты белка СР47, необходимые для функционирования комплекса ' . ФС II, ' однако- конкретная функциональная роль каздого из участхадв осталась неясной. Для решения этой задачи, очевидно, необходимы будут эксперимента по сайт-направленному мутагенезу в наиболее консервативных областях СР47, а также тех районах и аминокислотах бежа, функциональная значимость которых выявлена в настоящей работе. "-

ВЫВОДЫ

1. Клонированы фрагменты хромосомной ДНК 5упес1юоув1й8 6803, восстанавливающие при трансформации -способность к фотосинтезу у различных фотоскнтатических мутантов этой цианобактерии. Для двух фрагментов определены участки гомологии в хлоропластном геномо табака.

2. В составе одного кз клонированных фрагментов' идентифицирован г^ч раЪВ, кодирующий хлорофилл а - связывающий белок СР47 фотосистеш II. В хромосоме БупесЬосув^з 6803 в отличие от хлорошюстного генома высших растений, ген рзЬВ не входит в один кластер с генами рзЪН, ре!В, peíD.

3. Картированы генетические повреждения у группы рзЬВ-мутантов этой цианобактерии. Клонированы и секвенированы фрагменты гена рсЬБ семи мутантов, определена молекулярная природа их генетических повреждений.

4. Выявлены функционально значимые районы и отдельные .аминокислоты в белке СР47, необходимые для обеспечения активности комплекса ФС II.

Осповше результата диссертации изложены в публикациях:

1. 'Комарова ■ O.A., Ермакова С.Ю., Гримм Р. Использование . : мутантов, не способннх к фотоавтотрофному росту, для клонирования :

и анализа генов фотосинтеза цианобактерии synechocystio ввоз - В ' : сб.: Труда 18 паучной конференции молодых ученых Биологического . факультета МГУ, Москва, 1987, ч.1, JÎ6652-B87, стр.187-191.

2. Sliest aira V S., Elanskaya I., Ermakova S-, Koksharova О., ; Smirnova Isolation of genes controlling the photosynthesis in ; Synechocysti3 зр.- PCO 6303. Abstr. of VI Int. Symp. on ' PhotOBynthetic Prokaryote3, Noordwijkerhaut, Netherlands,, 1988, • P77.

3. Шзстаков O.B., Еланская И.В., Ермакова С.Ю., Андрианов В.М., Ульмасов ' Т.Н., Комарова O.A. Клонирование, фрагментов ДНК, восстанавливающих способность к фотосинтезу в клетках мутантов , ; Syneehocystis 6803 - Докл. All СССР, 1989, т.308, Л1, стр.211-214 '

4. Лысенко B.C., Гапеева I.A., Ермакова С.Ю., Еланская И.В., ' Огаркова O.A., Тарасов В.А. Гомология клонированных фрагментов ' ' ДНИ цианобактерии'Syneohocystis 6803 с хлоропластной и ядерной • ^ ДНЕ? растений - Генетика, 1991, i.27, М, стр.581-588.

5. Еланская И.В., Ермакова С.Ю., Станбекова Г.Э., Гадзкиез. А.Г., ' Броун М.Н., Карбышева Е.А., Шахнабатян Л.Г.,. Чеснавичене Э.А., ' Шзстаков C.B. Молакулярно-генетический анализ гонов, контролирующих синтез компонентов фотосистемы II у цизнобактэрг - < Synechocys-tis. 6803 - Тезисы международной конференции "Фотосинтез : и фотобиотехнология", Пущино, 1991, стр.81.

S. Shestakov S., Elanskaya I., Erroakova S., Stanbekova - G., Bibikova Ii., Brom M. Molecular analysis of genes ■ for photosynthesis in the cyanobacterium Syne^nocystia 6803. Abstr. of VII Int. Symp. on Photosynthetio Prokaryotes, Amherst, . . Massachusetts, USA, 1991.

7. Станбекова Г.Э., Ермакова С.Ю., Карбышева E.A., Шахнабатян Л.Г., Еланская И.В., Шестаков C.B. Молекулярно-генетический анализ дефектных по фотосинтезу мутантов цианобактерии, Synechooystia 6803 - Виол, науки, 1992, .43.

8. Ermakova S.Y., Elanskaya I.V., Kallies K.-TJ., Weihe A., Borner' T., Shestakov S.V. Cloning and sequencing of mutant pabB genes of the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. Photosynthetica, 1992, in press.