Пигмент-белковые комплексы и их взаимодействие в структурах фотосинтетического аппарата бактерий и растений

Москаленко, Андрей Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пигмент-белковые комплексы и их взаимодействие в структурах фотосинтетического аппарата бактерий и растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пигмент-белковые комплексы и их взаимодействие в структурах фотосинтетического аппарата бактерий и растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

На правах рукописи УДК: 577.152, 577.355, 581.132, 581.174

МОСКАЛЕНКО АНДРЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

ПИГМЕНТ-БЕЛКОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ И СТРУКТУРАХ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО, АППАРАТА БАКТЕРИИ И РАСТЕНИЙ '

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Диссертация

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

ПУЩИНО • 1993

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной организации фотосинтетиче кого аппарата Института фотосинтеза АН СССР и Института почвоведения фотосинтеза РАН.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.В.Карапетян

доктор химических наук, профессор Г.Г.Комиссаров доктор биологических наук, профессор Ф.Ф.Литвин Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Защита состоится июня 1993 г. в [о часов на заседании Спец

лизированного Совета Д 200. 29. 01 по защите диссертаций на соискание учег степени доктора наук при Институте почвоведения и фотосинтеза РАН (1422 Пущино, Институт почвоведения и фотосинтеза РАН).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Диссертация в форме научного доклада разослана " IЪ" мая 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Б.Н.Ива]

Актуальность проблемы. Фотосинтезирующие организмы (высшие растения, водоросли, бактерии) превращают энергию света в химическую энергию, осуществляя таким образом один из фундаментальных биологических процессов на Земле. Преобразование энергии квантов света в энергию химических связей происходит с высокой эффективностью, особенно на стадии первичных процессов фотосинтеза, которые включают: поглощение пигментами светособирающей антенны энергии света, миграцию энергии возбуждения по антенне и ее передачу к реакционным центрам (РЦ), первичное разделение зарядов и их стабилизацию. В процессе поглощения энергии света у разных организмов участвуют разные типы пигментов: хлорофилл а (Хл) и его производные, каротиноиды, фикобиллины и т.д. - а в процессе первичного разделения зарядов только Хл а или бактериохлорофилл (Бхл), а также феофитин. Способность Хл к обратимым фотохимическим реакциям in vitro с запасанием энергии в продуктах реакции была открыта Красновским (1948). Позднее подобные фотохимические превращения Хл были обнаружены у пурпурных бактерий и растений (Дейзенс 1954, Кок 1956). Эти работы положили начало систематическому изучению структур, с которыми связан фотохимически активный Хл, и структур светособирающей антенны (Торнбер 1976, Древе 1985).

Сравнительно простой фотосинтетический аппарат характерен ■ для пурпурных серных и несерных фотосинтезирующих бактерий. Он' состоит из одного-двух светособирающих комплексов и одного типа РЦ, которые отличаются простой организацией и высокой стабильностью при выделении. Первоначально многие универсальные принципы организации и функционирования фотосинтетического аппарата были обнаружены благодаря исследованиям на бактериях, а затем они были распространены на фотосинтетический аппарат растений и водорослей. В частности, Шувалов и др. (1976) установили, что в бактериальных РЦ феофитин функционирует в качестве промежуточного акцептора электронов между спецпарой Бхл и первичным хиноном. Позднее было показано, что феофитин также играет ключевую роль в фоторазделении и стабилизации зарядов в ФС2 (Климов и др., 1977). Бактерии были первым объектом, у которых удалось выделить РЦ, а затем расшифровать пространственную структуру этого комплекса, включая расположение 'кофакторов фотосинтеза" (Дайзенхофер, Михель, 1985, 1987). При сравнении 1минокислотных последовательностей белковых субъединиц РЦ с белками мембран метений, которые, как предполагалось, претендовали на роль "носителей пигментов" 'Ц ФС2, была сформулирована гипотеза о сходстве М и L субъединиц бактериаль-юго РЦ и Д1 и Д2 белков растений и высказано мнение, что на них должен >ыть локализован РЦ ФС2 (Требст 1985). Позже это было подтверждено Нанба г Сато (1987).

Анализ современной литературы показывает, что существует определенный разрыв (ежду изучением функционирования отдельных комплексов и данными по органи-ации комплексов и их взаимодействию в структурах фотосинтетического аппарата. )днако не вызывает сомнения, что именно организация комплексов или ансамблей

их взаимодействие в мембране обеспечивают стабильную работу фотосинтетиче-

ского аппарата, включая эффективный и направленный перенос энергии возбуждения к РЦ. Естественно, что без выявления общих закономерностей и индивидуальных особенностей-построения комплексов, ансамблей и их взаимодействия невозможно понять до конца принципы построения фотосинтетического аппарата и механизм преобразования энергии света при фотосинтезе. Эти вопросы могут быть разрешены только при исследовании как отдельных пигмент-белковых комплексов, так и более крупных ансамблей, ассоциатов, фрагментов мембран или целых мембран, которые отличаются уровнем структурно-функциональной организации, но сохраняют спектральные и фотохимические свойства, присущие этим образцам in vivo.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы - выявление индивидуальных различий и общих принципов в организации структур фотосинтетического аппарата пурпурных фотосинтезирующих бактерий и фотосистемы 2 растений. Для достижения поставленной цели проведено исследование как отдельных пигмент-белковых комплексов, так и более крупных ансамблей, ассоциатов, фрагментов мембран и изучено взаимодействие между комплексами в препаратах с разным уровнем структурно-функциональной организации.

В работе решались следующие конкретные задачи:

- разработать методы препаративного выделения нативных пигмент-белковых комплексов из мембран фотосинтезирующих бактерий;

- на основании изучения спектральных и биохимических характеристик комплекса Б800-850 и ансамбля Б890-РЦ из разных видов бактерий выявить универсальные принципы построения и индивидуальные различия в организации этих комплексов;

- исследовать взаимодействие комплексов Б800-850, Б890 и РЦ в мембранах и отдельных белков в комплексах и ансамблях с помощью бифункциональных сшивающих агентов. Изучить взаимодействие комплексов в реконструированных системах (протеолипосомах);

- изучить роль каротиноидов в стабилизации структуры бактериальных пигмент-белковых комплексов и влияние изменения состава каротиноидов в комплексах на взаимодействие последних в мембранах;

- модифицировать или разработать методы выделения нативных и стабильных препаратов фотосистемы 2 растений с разным уровнем структурно-функциональной организации;

- изучить принципы организации разных типов препаратов фотосистемы 2, используя ограниченный протеолиз и бифункциональные сшивающие агенты.

Научная новизна. У ряда бактерий (Chr. minutissimum, Th. roseopersicina, Ect. shaposhnikovü, Rps. palustris) обнаружено прочное взаимодействие между комплексами Б890 и РЦ и образование ансамбля Б890-РЦ, в котором комплекс реакционного центра окружен светособирающими комплексами Б890 [1, 2, 3, 5, 6, 7, 11, 26, 27].

Впервые установлено как сходство (два низкомолекулярных полипептида, иден-

тичные спектральные характеристики), так и различия (разная устойчивость, способность к обратимым конформационным переходам, избирательное разрушение одной из форм Бхл) в организации светособирающих комплексов пурпурных бактерий [4, 7, 12, 13, 14, 21, 67].

Выдвинута гипотеза о новой, структурной, роли каротиноидов, стабилизирующих структуру светособирающих комплексов бактерий. Из бактерий с ингибированным синтезом каротиноидов выделены комплексы Б800-850, РЦ и ансамбль Б890-РЦ. Они сохраняли нагивные спектральные и биохимические характеристики, способность к конформационным переходам (комплекс Б800-850). Изучен процесс восстановления синтеза каротиноидов у Chr. minutissimum и показано, что промежуточным продуктом биосинтеза является гидронейроспорин. Места локализации каротиноидов в комплексах неспецифичны и могут связывать любые каротиноиды, но в комплексе Б890 всегда накапливаются каротиноиды с большим количеством сопряженных двойных связей и более сложными боковыми заместителями по сравнению с комплексом Б800-850 [8, 20, 21, 25, 37, 61, 63].

Впервые обнаружено, что в хроматофорах, обработанных бифункциональными сшивающими агентами, образуются ассоциаты Б890-РЦ/Б800-850. Предложена модель организации фотосинтетического аппарата бактерий. Он состоит из подобных ассоциатов и небольших пулов свободных комплексов Б800-850 и ансамблей Б890-РЦ. В протеолипосомах зарегистрирован перенос энергии от комплекса Б800-850 к РЦ в ансамбле Б890-РЦ, однако, в реконструированных системах не удалось восстановить нативное взаимодействие между комплексом Б800-850 и ансамблем Б890-РЦ. В выделенном комплексе Б800-850 обнаружено сшивание только аир полипептидов, что повышало термостабильность комплекса и ограничивало его способность к конформационным переходам. В ансамбле Б890-РЦ сшивки образовывались между белками обоих комплексов (Б890 и РЦ) [39, 45, 47, 48, 52, 60, 67, 72, 73].

Найдено, что принципы организации комплекса (ядра) ФС2 такие же как у его бактериального аналога (ансамбль Б890-РЦ): РЦ ФС2 окружен светособирающими Хл-белками СР47 и СР43. Отмечено более тесное взаимодействие между РЦ и Хл-белком СР47 по сравнению с РЦ и СР43, поэтому в выделенном комплексе J>C2 могут присутствовать Хл-белки в разном соотношении. В отличие от бактериальных комплексов, в комплексах ФС2 существует два пула молекул пигментов, соторые различаются по степени прочности связи с белками. Показано, что у <л-белка СР47 в процессе выделения могут быть удалены все молекулы /З-каротина, I из РЦ ФС2 - 2 молекулы Хл и одна /З-каротина [41, 43, 46, 57, 64, 66, 69, 'П.

В комплексах РЦ ФС2 и СР47/РЦ с помощью бифункциональных сшивающих тентов и поликлональных антител впервые показано, что взаимодействуют Хл-бе-гок СР47 и Д2 белок РЦ, Д1 и Д2 белки РЦ с а субъединицей цнтохрома Ь559. ! обоих комплексах цитохром Ь559 присутствует в виде димера. Предложена юдель организации комплекса СР47/РЦ [65, 70].

Обнаружено, что в разных препаратах ФС2 существует более прочное взаимодействие между фрагментами белков несущих кластеры пигментов РЦ и свето-собирающих комплексов, по сравнению с бактериальными комплексами. Оно не нарушается при расщеплении Д1 и Д2 белков РЦ ФС2 и апобелков СР47 и СР43 трипсином. Из ансамбля ФС2,обработанного ферментом,выделен модифицированный комплекс ФС2, который сохранял нативные спектральные характеристики, но состоял из фрагментов соответствующих белков [49, 51, 53, 55, 56, 59, 62, 68].

На основании результатов исследований выявлена новая, структурная роль ка-ротиноидов, установлены принципы взаимодействия разных пигмент-белковых комплексов в мембранах и более простых структурах, сформулированы общие закономерности и различия в организации фотосинтетического аппарата бактерий и ФС1 высших растений.

Научно-практическая значимость работы состоит, прежде всего, в установленш фундаментальных закономерностей организации и взаимодействия пигмент-белковыз комплексов, составляющих фотосинтетический аппарат бактерий и фотосистемы ' растений. Большинство изложенных результатов получено впервые и ряд из ни: получил дальнейшее развитие и был подтвержден в работах отечественных 1 зарубежных авторов. Полученные результаты имеют большое теоретическое зна чение для выяснения механизмов поглощения и трансформации энергии солнечног света при фотосинтезе. Результаты исследований могут явиться основой для раз работки принципов практического использования энергии света на основе ассоциато пигмент-белковых комплексов.

В процессе работы были разработаны ряд конструкций аппаратов для: преш ративного электрофореза в полиакриламидном геле; аналитического электрофорез; электрофореза Хл-белков; обесцвечивания гелей диффузией и т.д. Благодаря про! тоте конструкции они получили широкое распространение в ряде лабораторий СН и за рубежом [1, 6, 18, 19, 27, 34, 44, 57].

Разработаны простые и оригинальные методики выделения пигмент-белковь комплексов из фотосинтезирующих бактерий, стабильных комплексов РЦ ФС2 СР47/РЦ из ансамбля фотосистемы 2, разделения фотохимически активных К01 плексов РЦ ФС2 и СР47/РЦ методом электрофореза с додецилмальтозидом и т. Часть разработанных методов вошла в практикум для студентов кафедры физик химической биологии и ряда других кафедр Биологического факультета МГУ [ 18, 43, 44, 57, 66].

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были пре ставлены и обсуждались на Всесоюзных биохимических съездах (Ташкент 19( Рига 1974, Ленинград 1979, Москва 1982), на Всесоюзном семинаре по электр форезу (Москва 1971), Всесоюзной конференции "Биоприбор 81" (Кишинев 198 семинарах по электрофорезу (Канев 1985, Рига 1990), на IV международн биофизическом конгрессе (Москва 1972), на симпозиуме "Молекулярная оргсп

зация фотосинтетического аппарата" (Москва 1975), на 12 Международном ботаническом конгрессе (Ленинград 1975), на 7 Международном конгрессе по фотобиологии (Рим 1976), на симпозиуме по физико-химической биологии (Москва 1978), на международных симпозиумах "Пигмент-белковые комплексы в фотосинтезе" (Познань 1974, Сегед 1977); на международном симпозиуме по фотосинтетическому запасанию и превращению солнечной энергии (Варшава 1980), на VI и IX международных симпозиумах по каротиноидам (Ливерпуль 1981, Киото 1990), на 8 и 9 Международных конгрессах по фотосинтезу (Стокгольм 1989, Нагойя 1992), на международном симпозиуме "Исследования биогеоценоза, структуры и функции фотосинтетического аппарата в связи с преобразованием солнечной энергии" (Пущино 1981), на советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Ташкент 1983), на 16 конференции ФЕБО (Москва 1984), на 5 и 6 международных симпозиумах по фотосинтетическим прокариотам (Гриндельвальд 1985, Амстердам 1988), на 5 международном симпозиуме по минеральному питанию и фотосинтезу (Варна 1987), на симпозиуме "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск 1988), на Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино 1991), на 5 международном симпозиуме по ультрабыстрым процессам в спектроскопии (Байреф 1991), а также на расширенных семинарах Лаборатории каротиноидов Ливерпульского университета (Ливерпуль 1991), Ботанического отдела Университета Глазго (Глазго 1991), Отдела физико-химической биологии Падуанского университета (Падуя 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано свыше 100 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Методические аспекты работы. Работа проводилась на препаратах с разным уровнем структурно-функциональной организации выделенных из клеток пурпурных фотосинтезирующих бактерий (Chr. minutissimum, Th. roseopersicina, Ect. shaposh-nikovii, Rps. palustris, Rb. capsulatus, Rps. viridis) и водорослей (мутанты Chlamy-domonas reinhardii с неактивной ФС1 или ФС2) или хлоропластов высших растений (шпинат, пшеница). В процессе работы были усовершенствованы или разработаны заново методы выделения пигмент-белковых комплексов с сохранением их нативных характеристик; разработаны аппараты для аналитического и препаративного электрофореза в полиакриламидном геле; холодильная установка для проведения электрофореза при +4°С; малогабаритная хроматографическая камера; усовершенствованы методы измерения спектральных и фотохимических характеристик комплексов непосредственно в геле; создана малогабаритная установка для измерения фотохимической активности РЦ.

В работе использован комплекс современных методов исследования: одно- и двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, ионообменная хроматография, гельфильтрация, абсорбционная, флуоресцентная, производная и дифференциальная

спектроскопия, пихосекундная импульсная флуоресцентная спектроскопия, измерение замедленной и переменной флуоресценции. Для анализа взаимодействия между комплексами или белками в комплексах применяли гидрофобные и гидрофильные бифункциональные сшивающие агенты в сочетании с иммунохимическими методами тестирования образовавшихся продуктов, методы ограниченого протеолиза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделение пигмент-белковых комплексов бактерий и их характеристики

В отличие от высших растений и водорослей в бактериях присутствует одна фотосистема. Они содержат один тип Бхл и каротиноиды. Все пигменты бактерий локализованы в пигмент-содержащих мембранах - хроматофорах. Вместо одной полосы поглощения в ближней ИК-области, характерной для Бхл в растворителях (770-780 нм), in vivo обнаружено не менее трех основных максимумов (форм) Бхл при 800, 850 и 890 (870) нм. Это смещение связано с агрегацией пигментов (Красновский, Войновская 1952), а в поддержании нативного состояния агрегатов определяющая роль принадлежит белкам и, отчасти, липидам (Ерохин 1966-1970). Первые попытки выделения отдельных пигмент-белковых комплексов были предприняты Брилом (1958, 1964) и Клейтоном (1962). Используя метод центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы, они выделили из мембран Rb. sphaeroides, обработанных дезоксихолатом, фракции, обогащенные отдельными комплексами, но добиться полного разделения комплексов в то время не удалось.

Таким образом к началу наших исследований отсутствовали как методы выделения чистых пигмент-белковых комплексов, так и информация по организации отдельных комплексов и взаимодействию комплексов друг с другом в мембранах и более простых структурах. Поэтому работа была начата с разработки метода выделения пигмент-белковых комплексов бактерий. Для этих целей мы модифицировали метод электрофореза в полиакриламидном геле. Были разработаны аппараты для препаративного электрофореза, которые позволили выделить комплексы в препаративных количествах и исследовать их биохимические и спектральные характеристики, а

также взаимодействие как между комплексами в мембранах, так и полипептидами в отдельных ком-Б890-РЦ плексах.

ESOO-SSO Методом электрофореза из мембран разных видов бактерий

Рис. ¡.Электрофорезвполиакрчламидном7% гелехро- <с полным набором форм Бхл), матофоров разных видов бактерий, обработанных Три- обработанных неионным детер-тономХ-lÖO; 1 -Rs. rubrum, 2—Rps. palustris, 3-Th. roseo- ктш Хритоном x_[00i 6ыли вы. persicina, 4 - Ect. shaposhnikovii, 5 - Chr. minulissimum и

выделенные светособирающий комплекс Б800-8}0 (6) и Делены два типа пигмент-белко-ансамбль Б890-РЦ (7) вых комплексов: светособираю-

900 нм

Рис. 2. Спектры поглощения: 1 - хроматофоров, 2 -светособирающего комплекса Б800-850, 3 - ансамбля Б890-РЦ из Chr. minutissimum. Вставка: Кинетика фотовыцветания димера Бхл реакционного центра при 888 нм в ансамбле Б890-РЦ. (I - включение действующего света, f - выключение)

щий Б800-850 и ансамбль Б890-РЦ (рис. 1). Два обстоятельства оказались решающими для успешного разделения комплексов из бактерий: 1. Они отличались высокой стабильностью, в отличие от комплексов из растений (Вернон и др. 1966, Муллет и др. 1980), и Тритон Х-100 только солюбилизировал их, но не разрушал, так как после электрофореза в гелях не были обнаружены ни зона свободных пигментов, ни продукты деградации комплексов; 2. Комплексы обладали существенным отрицательным зарядом, который не экранировался после обработки мембран детергентом, как это отмечено у пигмент-белковых комплексов из высших растений (Торнбер и др. 1991).

Типичные спектры поглощения комплексов, выделенных из бактерий с тремя формами Бхл (Бх800, Бх850 и Бх870/890) с помощью Тритона Х-100 и электрофореза в полиакриламидном геле, представлены на рис. 2. Позднее аналогичные комплексы были выделены Торнбером (1970), Ки и Чани (1971) и другими авторами. Необходимо отметить, что на этом этапе работы было выявлено более тесное взаимодействие длинноволнового светособирающего комплекса Б890 и РЦ, которое не может нарушить неионный детергент Тритон Х-100. Этот вывод затем был подтвержден Древсом (1983, 1985) в работах, проведенных на несерных бактериях.

Оба типа комплексов после выделения сохраняли свое нативное состояние, что подтверждается измерением их спектральных (спектры поглощения, флуоресценции) и фотохимических (фотоиндуцированные изменения поглощения, влияние магнитного поля на рекомбинационную люминесценцию, сигнал ЭПР и т.д.) характеристик. В ансамбле Б890-РЦ соотношение молекул светособирающего Бхл (комплекс Б890) к РЦ составляло 30-5-40:1.

Нами было впервые установлено, что в состав светособирающих комплексов Б800-850 входят два полипептида с молекулярной массой меньше 10000 дальтон, з в состав ансамблей Б890-РЦ — до 10 полипептидов, которые были идентифицированы как Н, М и Ь белки РЦ, полипептиды светособирающего комплекса и 1итохромы. Данные по полипептидному составу светособирающих комплексов были тодтверждены в последующих работах (см. Древе 1985, Цубер 1985).

Полученные результаты позволили сформулировать представление об общих

принципах построения фотосинтетического аппарата бактерий, который состоит из двух блоков: ансамбля Б890-РЦ и светособирающего комплекса Б800-850. У ряда бактерий, особенно у бескаротиноидных мутантов, взаимодействие между комплексами Б890 и РЦ ослаблено, что позволяет сравнительно легко выделить их из мембран в чистом виде (Фейер и др. 1972, 1985; Браун и Шерц 1991).

2. Действие агентов, нарушающих структуру комплексов

С целью детализации принципов организации комплексов, изучения природы сил, стабилизирующих взаимодействие отдельных субъединиц в комплексе или комплексов в более сложных ансамблях, было изучено действие на комплексы различных агентов, нарушающих преимущественно белковую (ферменты, детергенты и т.д.) или пигментную (освещение светом высокой интенсивности, окислители) часть комплексов.

2.1. Конформационные изменения и нарушение взаимодействия между белками в комплексах

Установлена способность светособирающего комплекса Б800-850 к обратимьи конформационным изменениям, для которых характерно уменьшение и смещени! в коротковолновую область длинноволновой полосы поглощения Бхл с максимумов при 856 нм (рис. 3). Смещение на 8-10 нм в синюю область указанной полом зафиксировано при действии на комплекс Б800-850 из Chr. minutissimum 25^ этанола или уменьшении pH с 9.0 до 6.0, на 22-24 нм - при обработке комплекс 0,1-1% Тритоном Х-100 или 14 М LiCl, на 30-32 нм - в присутствии 40^ ацетона, 30% диоксана или высушивании образца. При всех воздействиях н комплекс амплитуда полосы при 800 нм (мономер Бхл) изменялась незначительнс А

700

800

900 нм

Рис. 3. Изменения в спектре поглощения светособирающего комплекса Б800-850 из Chr. minutissit um (А) uRps. palustris (Б) до(1) и после (2) добавления к комплексу0,1% Тритона Х-100 (А) или 30 ацетона(Б). ЗА-разностный спектр "контроль-(+0,1% Тритон Х-100)" комплекса Б800-850

Это свидетельствовало о локализации димера и мономера Бхл на разных участках белкового носителя, что было подтверждено работами лаборатории Цубера <1981, 1985). В ходе проведенных исследований было установлено, что подобные кон-формационные изменения характерны для комплексов Б800-850 из Chr. minutissimum или Rps. palustris (рис. ЗБ). У комплексов Б800-850 из других видов бактерий (Rb. sphaeroides, Rb. capsulatus, Ect. shaposhnikovii, Th. roseopersicina) они отсутствовали. Так как конформационные переходы вызывались агентами, нарушающими белок-белковое, а не пигмент-пигментное взаимодействие, было предположено, что они связаны с изменениями пространственной структуры белкового носителя све-тособирающего комплекса Б800-850. Это предположение нашло свое подтверждение в работе Хантера и др. (1992), которые установили, что замена тирозина 44 и 45 на фенил и лейцин в а полипептиде светособирающего комплекса Б800-850 из Rps. acidophila вызывает смещение длинноволновой полосы поглощения с 855 нм до 829 нм.

Процесс разрушения комплексов Б800-850 и ансамбля Б890-РЦ сопровождался образованием мономерного Бхл (максимум при 780 нм) или продуктов его деградации. Все формы Бхл в комплексах разрушались одновременно. Мы не обнаружили образования промежуточных продуктов (мономерных субъединиц с поглощением около 820 нм), как это позднее было отмечено Лоач и др. (1987, 1988) при исследовании разрушения комплекса Б880, у которого предварительно были экстрагированы каротиноиды. Полученные результаты свидетельствуют о сильном взаимодействии между мономерными субъединицами в светособирающих комплексах, которые объединены в жесткую структуру, реагирующую на внешние поз-действия по принципу "все-ничего".

Более сложно организованный ансамбль Б890-РЦ был менее стабилен по сравнению с комплексом Б800—850 и легко разрушался при обработке ионными детергентами и протеолитическими ферментами. Стабильность комплекса Б800-850 из разных видов бактерий была разной. Наиболее стабильным оказался комплекс Б800-850 из Chr. minutissimum, который не разрушался при обработке проназой или высокими концентрациями ионных детергентов. У комплекса Б800-850 из Rb. capsulatus обнаружена возможность избирательного разрушения формы Бхл с максимумом при 800 нм.

Таким образом удалось выявить как сходство (два низкомолекулярных полипептида, идентичные спектральные характеристики), так и различия (разная устойчивость, способность к конформационным переходам, избирательное разрушение одной из форм Бхл), в организации светособирающих комплексов пурпурных бактерий.

2.2. Выцветание пигментов в комплексах

Организация пигментов в светособирающих комплексах и РЦ в настояшее время достаточно хорошо изучена (Михель и др. 1986, Хантер и др. 1989). Однако до начала наших работ было мало известно о роли пигментов в стабилизации структуры

Рис. 4. Выцветание пигментов в комплексе Б800-850 на красном свету: 1 - контроль, 2-10 мин, 3 -120 мин. Б. Кинетика выцветания форм Бхл в комплексеБ800-850 на красном (I, 2) и синем (3,4) свету одинаковой интенсивности. 1,3- выцветание формы Бх800, 2,4- Бх850

комплексов. Эту роль мы оценивали, изучая процесс выцветания пигментов в комплексах при освещении интенсивным белым, красным (Бхл) или синим (ка-ротиноиды) светом.

Ансамбли Б890-РЦ были в 2—3 раза более устойчивы по сравнению с комплексами Б800—850. Под действием света в них происходило уменьшение всех максимумов поглощения каротиноидов и Бхл и, одновременно, небольшое смещение с 892 до 877 нм основного максимума поглощения Бхл в ближней ИК-области. Аналогичный эффект, связанный с переходом димер Бхл-мономер Бхл (по данным кругового дихроизма) был позднее описан Рафферти и др. (1979) при исследовании выцветания антенного Бхл у Rb. sphaeroides R-26. Существенных различий между действием синего и красного света на ансамбль Б890-РЦ обнаружить не удалось.

В комплексах Б800-850 на белом свету в ближней ИК-области сначала наблюдаются такие же изменения, как при действии Тритона Х-100 или растворителей, а затем происходит выцветание Бхл и образование продуктов его фотодеградации. Эффективность передачи энергии от каротиноидов к Бхл в комплексах Б800-850 из Chr. minutissimum не превышает 50%, поэтому можно было предположить, что формы Бхл должны были быстрее выцветать на красном свету. Однако красный свет действовал менее эффективно, чем синий (рис. 4). Все процессы в комплексах наблюдались только в аэробных условиях, а после удаления из среды Oj фотостабильность комплексов увеличивалась. Аналогичные изменения можно было получить в присутствии химических окислителей. На основании полученных данных была сформулирована гипотеза о важной роли каротиноидов в стабилизации структуры светособирающего комплекса Б800-850.

3. Комплексы у бактерий с подавленным синтезом каротиноидов

3.1. Роль каротиноидов в стабилизации структуры комплексов

Для проверки гипотезы о структурной роли каротиноидов необходимо было исследовать бескаротиноидные комплексы. Существуют два подхода реализации подобной задачи: 1. Мутагенез; 2. Ингибирование синтеза каротиноидов в процессе выращивания. При использовании первого подхода обычно получаются беска-

ротиноидные мутанты, лишенные светособирающего комплекса Б800—850 (Когдел и Торнбер 1980, Древе 1985). Поэтому мы использовали второй подход, выращивая бактерии в присутствии дифениламина (ДФА), который, как известно, ингибирует синтез окрашенных каротиноидов, и в клетках бактерий увеличивается количество бесцветных предшественников Фитоина и Фитофлуина (Гудвин и др. 1953; Бриттон 1981). Разные бактерии по-разному реагировали на добавление в среду выращивания ДФА. Одни из них прекращали рост (Th. roseopersicina), у других (Rps. palustris) -синтез каротиноидов снижался на 40—50% и только у Chr. minutissimum нам удалось получить почти полное ингибирование (93-96%) синтеза каротиноидов без изменения спектра поглощения в ближней ИК-области (рис. 5А).

Наибольшая часть каротиноидов сохранялась в светособирающем комплексе Б800-850 (рис. 5Б). Полностью удалить каротиноиды из этого комплекса, используя ингибитор, не удалось. Очевидно, существует определенный критичес-

Рис. 5. Спектры поглощения хроматофоров из контрольных клеток Chr. minutissimum (1)и клеток, шращенных с ДФА (2). Вставка: электрофорез с Тритоном Х-100 контрольных хроматофоров (1)и ЦФЛ-хроматофоров (2).

Б. Спектры поглощения РЦ (1), комплекса Б800-850 (2) и ансамбля Б890-РЦ (3), выделенных из Л -хромат офоров Chr. minutissimum. Вставка: кинетика фотовыцветания димера Бхл при 888 нм в тсамбле Б890-РЦ ( JA) и РЦ(ЗА). ( j - включение действующего света, t - выключение).

В. Разрушение ансамбля Б890-РЦ, выделенного из ДФА-хроматофоров в присутствии 1% Тритона {-100:1 - контроль, 2 - 15 мин, 3 - 60 мин.

Г. Разрушение комплекса Б800-850, выделенного из ДФА-хроматофоров в присутствии /% Три-чона Х-100:1 - контроль, 2-1+2 мин, 3-120 мин

кий уровень содержания каротиноидов, который сохраняется в присутствии ингибитора, и только в результате мутации можно полностью лишить клетки бактерий каротиноидов с одновременной потерей комплекса Б800-850.

Сравнение спектральных и биохимических характеристик комплексов, выделенных из контрольных и ДФА-хроматофоров, показало их большое сходство в: положении и соотношении максимумов поглощения Бхл; способности к обратимым конфор-мационным переходам; полипептидном составе; сохранении способности к фотоинду-цированным изменениям поглощения (рис. 5Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что при выращивании бактерий в присутствии ингибитора синтеза каротиноидов сохраняется взаимодействие между отдельными мономерными субъединицами в светособирающих комплексах и между комплексом Б890 и РЦ в1 ансамбле Б890-РЦ.

Для проверки гипотезы о стабилизирующей роли каротиноидов мы проверили действие на "бескаротиноидные" комплексы Тритона Х-100, который при концентрации "до 5% и времени инкубации до 24 часов не был способен разрушить комплексы из контрольных бактерий. Комплекс Б800-850 и ансамбль Б890-РЦ, выделенные из ДФА-хроматофоров, разрушались при добавлении 1 % Тритона Х-100 в течение 1-2 часов (рис. 5В и Г). Таким образом, резкое снижение содержания каротиноидов в комплексах уменьшает их стабильность и они легко разрушаются в таких условиях, в которых контрольные комплексы остаются стабильными.

Каротиноидам в мембранах фотосинтезирующих организмов приписывают две основные функции: 1. Поглощение и передачу энергии к РЦ; 2. Защиту Бхл от фотоокисления (Крински 1968, Бриттон 1981, Когдел и Франк 1987). На основании полученных результатов можно считать, что существует также структурная функция каротиноидов, которая заключается в стабилизации структуры светособирающих комплексов бактерий. К аналогичному выьоду пришли Жирсакова и др. (1992) и Зурдо и др. (1992). В последнее время появились работы по изучению сборки Хл-белковых комплексов у растений in vivo в присутствии ингибиторов синтеза каротиноидов, авторы которых также сделали вывод о важной роли каротиноидов для стабилизации структуры комплексов фотосистемы 2 (Хумбек и др. 1989, Карапетян и др. 1989).

3.2. Изменение состава каротиноидов в комплексах

Изучение контрольных и ДФА-комплексов позволило предположить, что должна существовать определенная "пороговая" концентрация каротиноидов в комплексах, стабилизирующая их структуру. Если количество каротиноидов в комплексах меньше этой концентрации, то комплексы теряют свою стабильность. Кроме того, было неясно, какие именно каротиноиды или их предшественники и в каких количествах накапливаются в комплексах при выращивании бактерий с ДФА.

Для решения указанных выше задач было проведено исследование комплексов

Таблица 1

Содержание каротиноидов* в хроматофорах, выделенных из клеток Chr. minutissimum, выращенных при снижающейся концентрации ДФА

Каротиноид Образец, N?

1 2 - 3 4 5 6

фитоин 47,5 20,6 15,5 10,8

Фитофлуин 7,2 3,6

Тетрагидроликопин 27,8 26,6 13,2 6,2

Нейроспорин 1,7 8,3

Гидрокси-£-каротин 4,6 8,6 8,2 6,6 ' 1,7

Гидроксинейроспорин 10,7 31,7 55,5 49,0 10,5

Родопин 0,5 0,7 7,5 20,6 60,3 61,7

Ликопин 2,1

Ангидро родовибрин 4,8 4,2

Деметилспириллоксатин 1,8 6,3 4,5

Спириллоксантин 5,1 16,3 27,5

Количество каротиноидов в образце в % от контроля (образец №6) 3-5 12 24 52 75 100

* Относительное количество каждого каротинонда в процентах от общего содержания каротиноидов в образце.

из бактерий с разным содержанием каротиноидов. Для этого клетки сначала выращивали на среде с ДФА, а затем их переносили в среду с меньшей концентрацией-ингибитора и выращивали на белом свету, вызывающем' дальнейшее разрушение ДФА. Было отобрано 6 образцов, которые отличались по составу каротиноидов (табл. 1) и спектрам поглощения в области 400-570 нм.

Рассматривая процесс биосинтеза каротиноидов у Chr. minutissimum в целом следует отметить, что при увеличении синтеза каротиноидов происходит постепенное заполнение мест связывания каротиноидов в комплексах. Chr. minutissimum относится к спириллоксанти-новой группе бактерий, у которых конечным звеном биосинтеза каротиноидов является Спириллоксантин. В старых клетках Rs. rubrum его содержание чожет составлять до 95% от общего «оличества каротиноидов и его синтез адет по следующей цепочке: Фитоин-.. -Ликопин-... -Родовибрин-... -Спи->иллоксантин (Шмидт 1978). Обнару-кено, что в отличие от Rs. rubrum в ¡летках Chr. minutissimum как типич-1ый промежуточный продукт ведет се-

Рис. 6. Изменение состава каротиноидов в хро-матофорах Chr. minutissimum. 1 — Фитоин, 2-Тет-рагидроликопин, 3 - Гидрокси-^-каротин, 4 — Гидро-ксинейроспорин, 5 - Родопии, 6 - Родовибрин, 7 -Спириллоксантин. Номера образцов соответствуют номерам образцов в табл. 1,2 и рис. 7

бя Гидронейроспорин: его количество увеличивается до появления основных ка-ротиноидов, а затем он начинает замещаться Родопином (рис. 6). Ликопин в небольших количествах выявлен только в образце 6 и очевидно, что он не может быть промежуточным звеном в цепи биосинтеза Спириллоксантина у Chr. minutis-siraum.

г Таблица 2

Содержание каротиноидов* в светособирающем комплексе Б800-850 и ансамбле Б&90-РЦ

Каротиноид Образец, №

2 3 4 5 6

Б800-850 Б890-РЦ Б800-»50 Б890-РЦ ¡¡800850 Б890-РЦ В800-850 Б890-РЦ Б800-850 Б890-РЦ Б800-850 Б890-РЦ

Фитоин 17,8 24,4 16,0 7,9

Фитофлуин 2Д 1,1

Тетрагидроликопин 46,5 24,7 58,8 10,0 22,3 2,4

Нейроспорин 2,1

Ликопин 2,9

Гид рокси-^-каротин 8,9 8,2 11,8 5,7 2,9

Гидроксинейроспорин 26,7 39,0 41,2 55,5 44,3 64,2 19,6 11,0

Родопин 1,6 3,5 25,5 25,5 42,1 78,3 32,3 80,0 12,1

3,4-Дегидрородопин 38,3 2,0

Ангидрородовибрин 2,5 3,1 5,2 5,2 1,2

Д ем етил спирилл оксантин 10,8 2,4 5,2

Спириллоксантин 3,0 45,7 9,5 85,2

* Относительное количество каждого карогиномда я процентах от общего содержания каротиноидов в образце.

Комплексы Б800-850 и ансамбли Б890 также отличались по составу каротиноидов (табл. 2) и спектрам поглощения в области 400—570 нм (рис. 7). Было установлено, что в хроматофорах и комплексах предшественники Фитоин' и Фитофлуин не накапливаются в количествах, эквивалентных количеству каротиноидов в контроле, как считалось ранее (Бриттон, 1981): отношение каротиноиды : предшественники составляло 0,8. Следовательно, потеря стабильности "бескаротиноидными" свето-собирающими комплексами связана с утратой комплексами основной части каротиноидов. Рассмотрим это на примере комплекса Б800-850. Предполагая," что одна пара полипептидов в нем связывает 4 молекулы Бхл и отношение Бхл: каротиноиды = 2 : 1, получим, что один комплекс Б800-850, состоящий из 6 мономерных субъединиц, содержит до 12 молекул каротиноидов. Он сохраняет свою стабильность в присутствии Тритона Х-100, если содержит около 10% каротиноидов, то есть одну молекулу каротиноида на комплекс. При количестве каротиноидов в комплексе менее 10% или если при этом часть каротиноидов в комплексе заменена предшественниками, он теряет свою стабильность в присутствии неионных детергентов. Таким образом, одно место связывания каротиноидов имеет определяющее значение для поддержания взаимодействия между мономерными субъединицами в

400

500

700 нм

400

500.

700 нм

A ГэёГ

26 22

14 см"1

14 см 1

Рис. 7. Спектры поглощения комплексов Б800-850 (А) и ансамблей Б890-РЦ (Б), выделенных из iлеток Chr. minutissimum с разным содержанием каротиноидов. Номера комплексов соответствуют юмерам образцов в табл. 2

сомплексе. Из этого места связывания каротиноиды удается выбить только с томощъю мутации, после чего светособирающий комплекс типа Б800—850 не может !ыть собран in vivo.

Интересно, что при восстановлении синтеза каротиноидов в ансамбле Б890-РЦ :сегда присутствуют каротиноиды с большим количеством сопряженных двойных вязей и (или) с более сложными боковыми заместителями на концах полиеновой 1епи, чем в комплексе Б800-850 (табл. 2). Возникает вопрос, где происходит годификация каротиноидов и как заполняются каротиноидами свободные места

комплексах? Известно, что процесс превращения Фитоина в Спириллоксантин ключает десатурацию, дегидроксилирование и метилирование с обеих сторон олиеновой цепи и находится под контролем не менее, чем 7 генов (Бриттон 981, Гуплиано и др. 1988). Представляется вероятным, что в процессе роста леток на фоне снижающейся концентрации ингибитора происходит увеличение нггеза каротиноидов и одновременно de novo идет синтез а и ß полипептидов зетособирающих комплексов, белков РЦ и Бхл. Затем из имеющихся ком-онентов происходит самосборка комплексов, причем места связывания ка-этиноидов в ансамбле Б890-РЦ имеют сродство к более модифицированным зротиноидам. Работами по изучению процесса самосборки комплексов из мипептидов и пигментов показано, что комплексы Б880 из Rs. rubrum легко >бираются in vitro (Паркер-Лоач и др. 1988).

4. Организация фотосинтетического аппарата бактерий

4.1. Взаимодействие пигмент-белковых комплексов в мембранах

Пигмент-содержащие мембраны (хроматофоры) бактерий представляют сложные образования, в которых взаимодействие между отдельными компонентами (пигмент-белковыми комплексами и РЦ, компонентами ЭТЦ и т.д.) обеспечивают высокую эффективность поглощения, передачи и утилизации солнечной энергии в энергию химических связей. Одним из подходов, позволяющих исследовать взаимодействия между комплексами, является применение бифункциональных сшивающих агентов, которые, взаимодействуя с аминогруппам» белков, образуют мостики между отдельными белками или полипептидами. Для исследования образовавшихся продуктов обычно используют электрофорез с ДСН, при котором регистрируются взаимодействия между отдельными белками и полипептидами, входящими в тот или иной комплекс, и затем полученная картина реконструируется до нативных комплексов (Петере и др. 1983, Людвиг и Джей 1985). Мы использовали другой, более эффективный метод, заключавшийся в том, что после сшивания белков хроматофоры обрабатывали мягким детергентом Тритоном Х-100, которой солюбилизировал, но не разрушал образовавшиеся ассоциаты комплексов; их состав затем анализировали методом электрофореза (рис. 8). Сравнение действия гидрофильных (имидоэфиры) и гидрофобных (гидроксисукцинимидоэфиры) сшивающих агентов (длина от 4 до 16 А) показало, что гидрофобные агенты действуют более эффективно, чем гидрофильные, и эффективность их действия увеличивается с длиной сшивки. Образовавшиеся ассоциаты имеют одинаковую электрофоретическую подвижность независимо от длины используемого агента, что свидетельствует об упорядоченном и достаточно близком расположении основной части комплексов. К такому же выводу пришли Варга и Стахелин (1985) на основании исследования мембран несерных бактерий методом электронной спектроскопии. Часть комплексов Б800-850

и ансамблей Б890-РЦ не включались в состав более крупных ассоциа -тов и находились в "свободном" состоянии. Существование пула "периферийных" комплексов Б800—850 подтверждают результаты по изучению переноса энергии возбуждения от комплекса Б800-850 к Б870 у Rb. sphaeroides (Годик и др. 1986).

ДМСО 5% ДСТ ДСП эге

Б890-РЦ • Б800-850 '

Рис. 8. Электрофорез с Тритоном Х-100 контрольных хромато-форов (Л) и хроматофорое, обработанных 10 мМ сшивающими агентами: Б - ДСТ (6,4 А), В -ДСП (12 А) и Г-ЭГС (16,1 А). Цифрами обозначены зоны комплексов (4, 7) или соответствующихассоциатов (1,2, 3, 4', 5, 6)

Рис. 9. Спектры поглощения пигмент-белковых комплексов и их ассоциатов, выделенных из хроматофоров, обработанных ДСТ. Номера спектров соответствуют номерам зон на рис. 8Б

Пигмент-содержащие зоны, появившиеся после обработки хроматофоров сшивающими агентами, представляют, в основном, ассоциаты типа Б890-РЦ/Б800-850 с разным содержанием второго светособирающего комплекса (рис. 9). Образование димеров или тримеров в очень небольших количествах было характерно только для комплекса Б800-850 (рис. 8, зоны 5, б). Отсутствие агрегатов ансамбля Б890-РЦ свидетельствовало о том, что в мембране они окружены комплексами Б800-850. Анализ ас-социатов Б890-РЦ/Б800-850 с низкий содержанием комплекса Б800-850 показал, что последний может сшиваться с Н субъединицей РЦ. Аналогичный продукт был обнаружен в мембранах ИЬ. сар5и1аШ5 Петере и др. (1983). Поэтому было предположено, что существует два канала передачи энергии, поглощенной комплексами Б800-850 к РЦ: первый, основной, через комплекс Б890; второй - через комплекс Б800-850, -контактирующий с РЦ.

4.2. Взаимодействие бифункциональных сшивающих агентов с белками и полипептидами в выделенных комплексах

Для изучения ансамбля Б890-РЦ были использованы синтезированные нами -идрофильные гидроксисульфосукцинимидоэфиры, растворимость которых достига-тась за счет введения двух сульфогрупп в молекулу сшивающего агента. Ансамбли 3890-РЦ не был'и склонны к образованию димеров в присутствии сшивающего >гента, что хорошо согласуется с данными, полученными на хроматофорах (раз-1ел 4.1). Образование сшивок в мономерном ансамбле Б890-РЦ наблюдалось между 1 и М субьединицами РЦ и полипептидами светособирающего комплекса Б890. )бразование сшивок между белками одного комплекса (РЦ или Б890) обнаружено ге было. Сшивки не повышали стабильности ансамбля Б890ГРЦ, и он легко изрушался под действием соответствующих агентов. Полученные данные свиде-ельствуют о взаимодействии комплексов Б890 и РЦ и подтверждают предположение | том, что в ансамбле Б890-РЦ реакционный центр окружен комплексами Б890.

В комплексе Б800-850, обработанном сшивающими агентами, обнаружено небольшое кЬличество димеров. Очевидно, несмотря на его склонность к образованию 1ультимерных структур (Ерохин и др. 1977), в них отсутствует такое взаимодействие [ежду комплексами, которое может быть зафиксировано с помощью сшивающих

агентов. Основной тип сшивок, обнаруженный в комплексе, соответствует a/¡i гетеродимеру. Его образование ведет к ограничению конформационной подвижности в комплексе Б800—850 и повышению термоустойчивости комплекса. Полученные данные подтверждают, что основным звеном комплекса Б800-850 является субъединица, состоящая из двух полипептидов (а и /¡), с которой связаны Бхл и каротиноиды. Изменение взаимодействия а и /? полипептидов приводит к наблюдаемым конформационным изменениям в комплексе Б800-850 (раздел 2.1). Поэтому ограничения, которые накладываются на подвижность а и /3 полипептидов (по отношению друг к другу) с помощью сшивок, приводят также к ограничениям в изменении пигмент-пигментного взаимодействия.

4.3. Реконструкция взаимодействия комплекса Б800-850 и ансамбля Б890-РЦ

Результаты исследований по действию сшивающих агентов на хроматофоры показал, что основная часть комплексов Б800-850 и ансамблей Б890-РЦ in vivo находится в тесном взаимодействии. Естественным было стремление попытаться реконструировать подобное взаимодействие in vitro. Выделенные комплексы освобождались от избытка детергента ультрафильтрацией и встраивались в липосомы из соевого лецитина в соотношении, характерном для хроматофоров (Б890-РЦ:Б800-850 = 1:2). В спектре флуоресценции полученных протеолипосом отсутствовала полоса при 865 нм, характерная для комплекса Б800-850, а спектры возбуждения флуоресценции протеолипосом с комплексами Б800-850 и Б890-РЦ и хроматофоров были практически идентичны. Следовательно, комплексы Б800-850 в искусственных мембранах находятся во взаимодействии с ансамблями Б890-РЦ и энергия возбуждения эффективно переносится на РЦ. Подобные результаты обычно характерны для реконструированных систем "светособирающий комплекс - РЦ" ле только для бактерий, но и растений (Гуляев 1990). Однако наши опыты, проведенные со сшивающими агентами, показали, что восстановить нативное взаимодействие между комплексами не удалось. В отличие от хроматофоров, в которых после обработки сшивающими агентами присутствовало несколько типов ассоциатов Б890-РЦ/Б800-850 (см. раздел 4.1), в протеолипосомах комплексы Б800-850 и ансамбли Б890-РЦ практически не сшиваются друг с другом. Следовательно, критерий эффективной передачи энергии от светособирающих комплексов к РЦ не является достаточным доказательством восстановления в протеолипосомах контактов (взаимодействия) между комплексами, характерными для них в мембранах.

5. Исследование свойств препаратов, обогащенных фотосистемой 2

Фотосистема 2 (ФС2), РЦ которой по ряду параметров обнаруживает существенное сходство с РЦ бактерий (Требст 1985; Михель, Дайзенхофер 1986; Шувалов, Климов 1987), являются одним из самых сложных и наиболее лабильных ансамблей.

В первых работах по пространственному разделению фотосистем (Андерсон, Бордман 1966; Верной 1966) были получены фрагменты мембран, обогащенных ФС1 или ФС2. Затем удалось существенно улучшить результаты по выведению Хл-белковых комплексов ФС1 (Шиозава и др. 1976). Однако к началу данной работы существенного прогресса в области выделения комплексов ФС2 достигнуто не было. Оставалось неясным, на каких белках локализованы пигменты РЦ ФС2, сколько и какие Хл-белки входят в состав РЦ и его ближайшего окружения, как они взаимодействуют друг с другом и т.д.

В данной работе были исследованы разные объекты (гранальные и стромальные мембраны из разных сортов пшеницы; мутанты Chlamidomonas reinhardii, лишенные ФС1 или ФС2, из коллекции, полученной в нашем Институте Ладыгиным В.Г.; частицы ДТ-20 и т.д.) с целью подбора оптимальных условий выделения ансамбля ФС2 и изучения его характеристик.

Сравнение мембран из хлоропластов пшеницы и мембран мутантов Chlamidomonas reinhardii без ФС1 или ФС2 показало, что только во втором случае удается обнаружить корреляцию между активностью ФС2 и присутствием на электрофо-реграммах Хл-белка CP; у мутантов с неактивной ФС1 (Al, А8, А12, А18, А55, А66, А129) сохранялись как активность ФС2, так и Хл-белок CP; у второй группы мутантов без ФС2 (А13, А20, А76, А82, Al 10) отсутствовали Хл-белок CP, белки с молекулярной массой около 47 и 20 кДа и фотохимическая активность ФС2. Аналогичная взаимосвязь между Хл-белком CP, белком 47 кДа и активностью ФС2 была выявлена также Чуа и Беннон (1975). Полученные результаты свидетельствовали о тесном взаимодействии между РЦ ФС2 и Хл-белком CP (СР47), что позднее было подтверждено Вермаас и др. (1987): у мутантов Svnechocystis, дефицитных по Хл-белку, СР47, отсутствовали также белки РЦ ФС2 (Д1 и Д2).

Особенностью исследованных мутантов была высокая светочувствительность, затруднявшая их выращивание в количестве, необходимом для препаративного выделения ансамбля ФС2, поэтому в дальнейшем исследовали частицы (ансамбль ФС2), получаемые из мембран хлоропластов шпината после их обработки детергентами.

5.1. Действие трипсина на ансамбль ФС2

Сложная организация ансамбля ФС2 и отсутствие метода, позволяющего выявить в нем одновременно все Хл-белковые комплексы, накладывали определенные ограничения на использование бифункциональных сшивающих агентов. Поэтому для изучения организации ансамбля ФС2 использовали другой подход: были исследованы изменения спектральных 'и фотохимических характеристик, а также состава Хл-белков, которые наблюдаются в ансамбле ФС2 после его обработки трипсином. Этот фермент широко применялся для изучения организации ансамбля ФС2, но при этом последний рассматривали как единое целое, уделяя основное внимание инактивации донорной или акцепторной обла-

Рис. JO. Флуорограмма разделения Хл-белков ансамбля ФС2 методом злектро-

стей указанного ансамбля (Ренгер и др., 1986, 1987; Изогаи и др. 1985; Ирганг и др. 1987; Волкер и др. 1986).

Основным Хл-белковым комплексом, который входит в состав ансамбля ФС2, является светособирающий комплекс (ССК). Он определяет способность ансамбля ФС2 и гранальных тилакоидов in vivo к агрегации (Маллет и Арнтцен 1980; Картер, Стахелин 1980). Поэтому было исследовано действие трипсина на ансамбль ФС2 в мономерном и агрегированном состоянии. ССК в обоих случаях был доступен для фермента, который отщеплял от его субъединиц (СРП или LHC) низкомолекулярный пептид (1,5-форезадо(А)ипосле{Б)обработкитрип- 2 кДа), что не влияло на способность ком-сином (1,6 мг!мл): 1 и 5 - димер и мономер

,„. , . , плекса к димеризации при электрофорезе

LHC, 2 - неидентифицированныи Хл-а/б- r г

белок, 3 - зона Хл-белков СР47 и СР43, 4 — (рис. 10). В мономерах ансамбля ФС2

Хл-белок СРа, 6 - зона свободных пигмен- (рН 7.6) очень быстро расщепляются белки

moe(FP) .

системы окисления воды (33, 24 и 17 кДа),

Д1 и Д2 белки РЦ и несколько медленнее - апобелки Хл-белков СР47 и СР43. В агрегатах ансамбля ФС2 не обнаружено расщепление апобелков Хл-белков СР47.И СР43, а Д1 и Д2 белки РЦ были менее доступны для фермента. Очевидно, в области локализации ядра ФС2 (Хл-белки СР47 и СР43, РЦ) наблюдаются наиболее тесные контакты между ансамблями ФС2 при агрегации последних. Необходимо подчеркнуть, что в обоих случаях (мономер/агрегат) независимо от степени расщепления соответствующих апобелков не изменяются спектральные и фотохимические характеристики ансамбля ФС2, что свидетельствует о сохранении нативного состояния как кластеров пигментов, так и соответствующих фрагментов апобелков, которые являются носителями пигментов. При анализе агрегатов и мономера ансамбля ФС2, обработанных трипсином, был обнаружен Хл-белок СРа, который мигрировал при электрофорезе несколько медленнее, чем мономер светособирающего комплекса (рис. 10). Указанный Хл-белок может быть частью или светособирающих комплексов СР47 и СР43, или частью РЦ ФС2. Результаты наших исследований по действию трипсина на ансамбль ФС2 обобщены на схеме (рис. И). Полученные данные указывают на сильное взаимодействие между фрагментами белков, несущих пигменты, как у светособирающих Хл-белков СР47 и СР43, так и в РЦ ФС2, которые не нарушаются после расщепления белков трипсином.

А Б

Трипсин

сск сипит] - B^zntz:

СР47/43 - (Щ:

в (3

рц yj Р680

сск [¡^

шп

LH02

С Ра LHC

Хл а и б

Рис. II. Схема действия трипсина на Хл-белки в ансамбле ФС2: .1 - контроль. Б - Хл-белки обра-екппанпые трипсином. В - Хл-белки после элекгпро<1>оре.ш. Г-схема pu iделении Хл-белков после электрофореза

6. Пигмент-белковые комплексы»цыделе>тые из ансамбля ФС2

6. Î. Свсшособири/осцай Хл-и-б-бе.чковыи комплекс (ССК)

ССК - один из наиболее стабильных комплексов в мембранах хлоропластов и легко может быть выделен методом электрофореза с ДСН (комплекс СРП или LHC; Огава и др. 1966, Торнбер 1975), который, однако, вызывал часшчиое разрушение комплекса. Позднее, используя способность ССК к агрегации, были разработаны более мягкие методы его выделения (Шутилова, 1976; Либерман, Арнтцен, 1978). В этом случае спектральные характеристики ССК также не соответствовали полностью его характеристикам в мембране. Например, в спектре поглощения ССК, выделенного по методу Шутиловой (1976), длинноволновая полоса поглощения была расположена при 673-674 нм. Мы модернизировали последнюю методику, после чего был получен ССК, в котором длинноволновый максимум Хл-а был локализован около 678-679 нм. Вторая производная спектра поглощения комплекса почти не отличалась от аналогичной характеристики тила-коидов гран. Он не обладал фотохимической активностью. Его полипептидный состав был представлен тремя субъединицами 23.5, 24.3 и 24.8 кДа в соотношении, близком к 1:1:1. Сходные результаты по полипептидному составу были получены для ССК из хлоропластов гороха и ячменя (Маллет, Арнтцен 1976; Махольд и др. 1979). В этих условиях комплекс был способен к образованию двухмерных агрегатов. Позднее Ли (1982) и Кюлбрандт (1984) установили наличие в таких агрегатах гексогональных структур. Для ССК в этом состоянии были характерны две полосы низкотемпературной флуоресценции при 685 и 695 нм. Агенты, нарушающие белковую структуру комплекса (40% ацетон, проназа, 1 M UCIO4 и т.д.) или пигментную часть ССК (окислители) не вызывали преимущественного разрушения формы Хл с флуоресценцией при 695 нм. Последняя исчезала только при

обработке ССК низкими концентрациями (0.02-0.1%) Тритона Х-100, который способен нарушить взаимодействие между ССК в агрегатах. Одновременно на разностном спектре поглощения наблюдалось смещение с 684 до 668 нм полосы Хл, ответственной за эту флуоресценцию, а на спектре поглощения указанный эффект появлялся как синее смещение на 1.5-2 нм длинноволновой полосы поглощения. Процесс полностью обратим и после удаления детергента диализом полоса флуоресценции при 695 нм появляется снова.

Проводя аналогию с бактериальным фотосинтетическим аппаратом, на основании выполняемой функции и взаимодействия комплексов с РЦ, можно сравнить ССК растений и комплекс Б800-850 бактерий. В ССК растений спектральные эффекты, связанные с длинноволновой формой пигмента, происходят при диссоциации агрегатов ССК, в то время как у комплексов Б800-850 из бактерий они наблюдаются при изменении взаимодействия между полипептидами в самом комплексе.

6.2. Комплекс (ядра) ФС2 (РЦ/СР47/СР43)

В настоящее время из фотосинтетических мембран выделены препараты, которые сохраняют высокую скорость фотоокисления воды (Икери и др. 1985, Сато и др". 1985, Гонотакис, Йокум 1986). При их выделении были использованы разные типы детергентов, и они получили название "кислород выделяющие комплексы ФС2" или "комплекс (ядра) ФС2". Похожие фотохимически активные препараты ФС2, лишенные способности к фотоокислению воды, были получены при обработке мембран дигитонином и Дерифатом 160 (Сато 1985, Климов 1986, Ганаго и др. 1985; 1987). Характеристики этих комплексов варьировали в зависимости от метода выделения и используемого детергента.

Одной из задач работы было выделение нативного комплекса ФС2 из ансамбля ФС2. Для оптимизации методики выделения было отобрано 6 детергентов, по-разному действовавшие на ансамбль ФС2 или успешно используемые ранее для выделения подобных комплексов: Тритон Х-100, додецилмальтозид, октилглюкозид,, Сульфобетаин СБ-12, Дерифат 160 и дезоксихолат натрия. Два последних не были способны солюбилизировать ансамбль ФС2 на отдельные комплексы. Фотохимически активные комплексы ФС2 получены с додецилмальтозидом, октилглюкозидом и Сульфобетаином СБ-12. Установлено, что комплексы обладали переменной флуоресценцией, которая согласно последним работам (Севдималиев 1990, Фейзи-ев 1992) соответствует наличию в образце первичного хинона, взаимодействующего с фотохимически активным РЦ. Определение концентрации РЦ по фотово'сстанов-лению феофитина в присутствии дитионита и метилвиологена показало, что в выделенных комплексах отношение РЦ:Хл составляет 1:20+40.

Длинноволновая полоса поглощения в фотохимически активных комплексах ФС2 локализована около 676 нм, что характерно для большинства аналогичных комплексов (Танг, Сато 1985, Гонотакис, Йокум 1987, Икери и др. 1985). В спектрах низкотемпературной флуоресценции комплексов ФС2' обычно присутствовали -

полосы при 685 и 695 нм в соотношении около единицы, а в одном образце (выделение с октилглюкозидом и додецилмальтозидом) доминировала полоса с флуоресценцией при 695 нм. Комплекс ФС2 с преобладанием в спектре флуоресценции этой полосы был также выделен Гуляевым и др. (1988) из АласузйБ шсШапэ. Известно, что полосы низкотемпературной флуоресценции при 685 нм и 695 нм принадлежат соответственно Хл-белкам СР43 и СР47. Следовательно, изменение соотношения между этими полосами свидетельствует об изменении состава Хл-белков в комплексах ФС2 в зависимости от.типа детергента, используемого при выделении, что подтверждают данные электрофореза. Полученные результаты отражают особенности организации комплекса ФС2, в котором, также как в ансамбле Б890-РЦ бактерий, светособирающие комплексы так называемой прицентровой антенны окружают РЦ, поскольку Хл-белки СР47 и СР43 более доступны для детергента, чем РЦ.

6.2.1. Модификация комплекса ФС2 трипсином

Приведенные выше данные по сохранению спектральных характеристик РЦ ФС2 после расщепления трипсином белков ансамбля ФС2 вызвали необходимость продолжить исследования этого феномена на более простом объекте — комплексе ФС2.

Спектральные характеристики комплекса ФС2 сохранялись после его обработки трипсином. Единственный эффект, наблюдаемый после действия на комплекс ФС2 фермента — увеличение в 1,2-1,4 раза амплитуды сигнала фотовосстановления феофитина. Известно, что в подобных комплексах часть РЦ (до 30%) находится в закрытом состоянии (Гуляев и др. 1988) и, следовательно, фермент способствует "открыванию" этих РЦ, возможно, за счет устранения стерических факторов, например, агрегатов, препятствующих взаимодействию экзогенных доноров и акцепторов с РЦ.

Сохранение нативного состояния пигментов в комплексе ФС2, обработанном трипсином, не коррелирует с изменениями в его полипептидном составе: фермент расщеплял все белки этого комплекса и молекулярная масса образовавшихся фрагментов не превышала 23 кДа. Аналогичным образом изменялся состав Хл-белков. Оба Хл-белка, присутствующие в комплексе ФС2, СР47 и СР43 исчезали после обработки трипсином, и появлялся Хл-белок, обозначенный ранее как СРа.

В связи с сохранением характеристик комплекса ФС2, обработанного трипсином, была предпринята попытка выделения ядра комплекса ФС2, которое объединяет полипептиды, связывающие пигменты. Для этого были использованы мономеры ансамбля ФС2, обработанные трипсином, а выделение модифицированного комплекса ФС2 проводили по стандартной методике, включающую обработку образца 1,5% октилглюкозидом и центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы, причем два верхних слоя сахарозы (10 и 15%) содержали 1% детергента. Несмотря на высокие концентрации детергента у ансамбля ФС2, обработанного ферментом, наблюдалась такая же картина распределения Хл-содержащих зон, как и в контроле.

0,5

500

600 700 680 720 нм

Рис. 12. Спектральные характеристики модифицированного комплекса ФС2, выделенного из ансамбля ФС2, обработанного трипсином: а - спектр поглощения: б - спектр низкотемпературной флуоресценции: в-кинетика фотовосстановления феофитина( 1 - включение действующего света, Т — выключение)

Нижняя зона соответствовала модифицированному комплексу ФС2. Его спектральные характеристики приведены на рис. 12. По спектрам поглощения и низкотемпературной флуоресценции он не отличался от контрольного комплекса ФС2, но фотохимическая активность в этом комплексе была в несколько раз ниже, чем в контроле. В нем не удалось выявить модифицированного Хл-белка СРа. Его отсутствие, также как и снижение фотохимической активности, показывает, что в процессе выделения имеет место уменьшение стабильности выделенного препарата, возможно, за счет длительного контакта с высокими концентрациями детергента. В состав модифицированного комплекса входят пять основных (38.5, 31, 26, 21 и 16 кДа) и несколько минорных полипептидов. Так как полипептиды с молекулярной массой 38.5 и 31 кДа отсутствуют при протеолизе контрольного комплекса ФС2, то сохранение спектральных характеристик (пигмент-пигментного взаимодействия) обеспечивают более низкомолекулярные полипептиды (21 и 16 кДа). Совокупность полученных данных по протеолизу комплекса ФС2 и выделению модифицированного комплекса ФС2 показывают, что после обработки ферментом в комплексе ФС2, как и в ансамбле ФС2, сохраняются в состоянии, , близком к нативному, кластеры пигментов, ответственных за флуоресценцию при 685 и 695 нм, и ядро РЦ, несущее первичный донор и акцептор электрона. Основные полипептиды, которые определяют эту стабильность, имеют молекулярную массу 21 и 16 кДа. Таким образом после расщепления ферментом белков комплекса ФС2 пигмент-несущие полипептиды сохраняют нативное белок-белковое взаимодействие и, как следствие, нативное состояние пигментных кластеров.

Первая методика выделения РЦ ФС2 (Д1/Д2/цит Ь559 комплекс) была разработана Нанба и Сато (1987). Методика была основана на использовании одного . типа детергента (Тритон Х-100) и полученные препараты отличались нестабильностью. Все последующие методики выделения РЦ ФС2 являются в той или иной степени модификацией метода Нанба и Сато. Мак-Тавиш и др." (1989) разработали

6.3. Комплексы РЦ ФС2

методику, на второй стадии которой для удаления детергента было использовано осаждение РЦ полиэтиленгликолем. Другой подход в получении стабильных РЦ ФС2 состоял в замещении Тритона Х-100 неионным детергентом додецилмаль-тозидом, который стабилизировал этот комплекс. В данной работе одновременно с Чапман и др. (1990) была разработана двухстадийная методика выделения стабильных РЦ ФС2.

Было обнаружено, что РЦ ФС2 сохраняет способность к фотовосстановлению феофитина в темноте при +4°С на уровне 85-90% в течение 48 часов, но быстро разрушается при хранении на рассеянном свету. Позднее было установлено, что свет стимулирует процесс автопротеолиза белков в РЦ ФС2 (Барбато и др. 1991, Шиптон и Барбер 1991, Андерсон и Барбер 19S1), и поэтому проблема стабилизации РЦ ФС2 в принципе не может быть решена изменением условий выделения или заменой детергентов.

Спектр поглощения выделенного комплекса (основные максимумы при 417 и 676 им) соответствовал спектрам РЦ, выделенных другими авторами (Нанба и Сато 1987; Барбер, Чапман 1987). Он сенсибилизировал фотоин- tfrmmrw«™»™« дуцироеанный перенос электрона от дифенилкарбазида к молибдату кремния, был способен накапливать под действием сильного света фотовосстановленный феофитин в присутствии дитионита и метилвиологена или окисленный Р680 в присутствии молибдата кремния. В его состав входили Д1 и Д2 белки' и их гетеродимер (■Д1/Д2), а и ¡1 субъеди.чицы цитохрома Ь559 и 4.8 кДа белок с неустановленной функцией, а также 4 молекулы Хл л 2 феофитина.

При модернизации описанной выше методики выделения РЦ ФС2 была получена фракция с отношением оптических плотностей 417/436 = 1 (для РЦ ФС2 это отношение равно 1.15). При анализе взаимодействия ансамбля ФС2 с детергентом было предположено, что это фракция представляет смесь РЦ ФС2 и СР47/РЦ. Методы разделения подобных комплексов были разработаны (Акабори и др. 1991; Деккер и др. 1991) только для ансамбля ФС2 и требовали обработки последнего хаотропными агентами. Мы разработали более простой метод - электрофорез с додецилмальтозидом. Этим методом удалось разделить комплексы РЦ ФС2 и СР47/РЦ (рис. " 13) с сохранением фотохимической активности: отношение Хл:феофитин составляло 10:2 для РЦ ФС2 и 17:2 для СР47/РЦ. Результаты ВЭЖХ подтвердили данные пигментного состава для комплекса СР47/РЦ, а для РЦ ФС2 получено отношение Хл-феофитин 6:2 (табл. 3), то есть часть РЦ после электрофореза находится в

А 436

417д 676

~2 Д

0,5 — / 675

~\J \\1

400 500 600 нм

Рис. 13. Спектры поглощения комплексов, полученных методом электрофореза с додецилмальтозидом: 1 - СР47/РЦ, 2-РЦ ФС2. Вставка: Электрофорез с додецилмальтозидом фракции, обогащенной РЦ ФС2. Гель не окрашен. Номера зон в геле соответствуют номерам спектров поглощения

закрытом состоянии. В настоящее время известны два типа РЦ ФС2 с отношением Хл:феофитин 4:2 (Нанба и Сато 1987; Барбер, Чапман 1987; Мак-Тавиш и др. 1989; Гуляев 1990) и 6:2 (Монтойа и др. 1991; Телфер и др. 1991, 1992) и более высоким содержанием /З-каротина (2 молекулы) во втором типе комплекса, который, как считается, сохраняет более нативное состояние.

Таблица 3

Содержание пигментов в комплексах РЦ ФС2 и СР47/РЦ выделенных методом электрофореза с додецидмальтозидом

Хлорофилл Феофитин /¡-каротин

РЦ ФС2 6,65±0,43 2 1,6±0,15

СР47/РЦ 17,46±0,4 2 1,5±0,23

Базируясь на приведенных выше результатах, была разработана простая одностадийная методика одновременного выделения двух комплексов РЦ ФС2 и СР47/РЦ. Нативное состояние в них пигментов, кроме обычных тестов (спектры поглощения, фотохимические реакции, низкотемпературная флуоресценция), оценивали, измеряя пико- и наносекундную кинетику флуоресценции. Для РЦ ФС2 при комнатной температуре были характерны 5 компонентов с временами жизни 13±3 пс, 110± пс, 1.7±0.2 не, 5.0±0.5 не. У СР47/РЦ пикосекундные компоненты замедлялись до 35±5 пс и 190±30 пс, соответственно. Предполагается, что регистрируемое увеличение времени жизни этих компонент отражает тесное взаимодействие двух кластеров пигментов в РЦ и СР47 и является следствием быстрого перераспределения энергии возбуждения между Р680 и дополнительными пигментами.

Таким образом установлено, что в РЦ ФС2 существует два пула молекул Хл: 4 прочно связанных молекулы пигмента (часть из них участвует в процессах первичного разделения зарядов) и 2 молекулы Хл, которые солюбилизируются при определенных условиях выделения. Роль последних до конца не ясна, но возможно, что они, как и каротиноиды, участвуют в защите П680 от деструктивного фотоокисления (Андерсон, Барбер 1992), передавая энергию возбуждения от РЦ, например, к Хл-белку СР47. Очевидно, что указанные две молекулы Хл расположены в той области РЦ, которая непосредственно контактирует с Хл-белком СР47, и только после его удаления эти молекулы Хл становится доступными для детергента. Диссоциация комплекса СР47/РЦ происходит после удаления из СР47 молекул /9-каротина (табл. 3). Впервые было показано, что для мягкого удаления Хл-белка СР43 из комплекса ФС2 достаточно использовать один неионный детергент Тритон Х-100 без хаотропных агентов. Суммируя полученные результаты и данные из литературы, можно предположить, что после обработки детергентом ансамбля ФС2 образуется смесь трех комплексов: ССК, СР43 и СР47/РЦ. ССК не задерживается на колонке, а Хл-белок СР43 связывается с ДЕАЕ-Фрактогелем, но затем элюируется быстрее, чем комплексы с РЦ. При длительном промывании колонки состав

:вязанных с ней комплексов меняется: в начале основным является комплекс СР47/РЦ, затем два комплекса СР47/РЦ и РЦ ФС2 с 6 молекулами Хл (их :оотношение постоянно изменяется в пользу второго комплекса), в конце промывки — основным является комплекс РЦ ФС2 с 4 молекулами Хл. Нанба и Сато (1987), Барбер и Чапман (1987) промывали колонку до третьей стадии и поэтому выделили РЦ ФС2 с 4 молекулами Хл и не обнаружили присутствия комплекса СР47/РЦ. Другие авторы (Барбато и др. 1991, Монтойа и др. 1991) прерывали промывку солонки на второй стадии, но анализировали только фракцию, которая элюировалась : колонки 110 М N801 (РЦ ФС2 с 6 молекулами Хл).

6.3.1. Взаимодействие между белками в комплексах с РЦ

В ансамбле ФС2 с помощью бифункциональных сшивающих агентов были установлены тесные контакты между комплексом СР47 и 33 кДа белком, комплексами СР47 и СР29, ССК и Д1 белком (Енами и др. 1987, 1989, 1990; Милнер 1 др. 1987; Брикер и др. 1988). Прием, который использовался в данной работе щя изучения взаимодействия между комплексами бактерий, нельзя было реализовать У1Я выявления взаимодействия между комплексами в ансамбле ФС2 из-за сложности тоследнего и высокой лабильности некоторых Хл-белков. Поэтому в качестве збъекта были использованы наиболее простые комплексы РЦ ФС2 и СР47/РЦ.

При специфическом окрашивании на гем гелей после электрофореза с ДСН и жтилглюкозидом комплекса РЦ ФС2 была обнаружена адсорбция Д1 белком РЦ -ема цитохрома Ь559, который диссоциировал в этих условиях на гем и субъединицы, г был сделан вывод о тесном взаимодействии цитохрома Ь559 и Д1 белка РЦ. Эн был подтвержден результатами, полученными на комплексах РЦ ФС2 и СР47/РЦ ; помощью бифункциональных сбивающих агентов разной длины (6.4, 12 и 16.1 \). Используя поликлональные антитела против Д1 и Д2 белков, о:-субъединицы датохрома Ь559 и Хл-белка СР47 методами одно- и двумерного электрофореза [рис. 14) было впервые установлено образование в комплексах 7 продуктов: ;Р47/Д2, Д1/Д2/а, Д1/Д2, Д1/а, Д2/а, а/а, а/р. Наиболее эффективно белки :шивал ДСП, что соответствует расстоянию в 12 А между аминогруппами белков, ювлекаемых в реакцию со сшивающим агентом. Ранее Д1/Д2 гетеродимер тестировался только иммунохимическими методами (Мардер и др. 1987). В данной )аботе впервые показано, что гетеродимер Д1/Д2 и аналогичный продукт, обра-ювавшийся после действия сшивающего агента имеют одинаковую электрофо->етическую подвижность. Образование димера а-субъединицы цитохрома Ь559 в >боих комплексах свидетельствует о том, что сам цитохром также должен присут-:твовать в виде димера. В вопросе о количестве цитохрома Ь559 в комплексах •ипа РЦ нет полной ясности. По данным Нанба и Сато (1987), Барбера и др. :1987), Ван Леувена и др. (1991), Монтойа и др. (1991) РЦ ФС2 связывает 1 ■ем цитохрома Ь559. Шувалов и др. (1989), Деккер и др. (1989) выявили присутствие ! цитохромов Ь559 в этих комплексах, что хорошо согласуется с приведенными

Д1/Д2

'III

Д2

l Д1

VIII

выше данными. Интересно также отметить, что гетеродимер Д1/Д2, который всегда присутствует в препаратах РЦ ФС2 (Нанба, Сато 1987; Барбер, Чапман 1987), не участвует в реакциях со сшивающим агентом. Можно предположить, что он не является частью нативного РЦ ФС2, и из-за одинаковых биохимических характеристик Д1/Д2 гетеродимер (по-видимому, лишенный пигментов) и РЦ ФС2 элюируются с колонки вместе.

Таким образом, зафиксировано образование только одной сшивки между СР47 и РЦ ФС2 (СР47/Д2), а остальные образовывались внутри РЦ ФС2. Подобные сшивки, как было показано выше (см. раздел 4.2), стабилизировали светособирающий комплекс Б800—850 из бактерий. В связи с высокой фоточувствительностью РЦ ФС2 была проверена возможность стабилизации их структуры с помощью сшивающих агентов. Оказалось, что сшивки не увеличивают стабильность комплексов на свету. Одновременно было установлено, что под действием света образуются фотосшивки Д1/а и Д2/а (рис. 15). Природа этого процесса не ясна, но несомненно, что он является одной из первых стадий при фотоповреждении РЦ, и стимулируется процессами, происходящими после первичного разделения зарядов. По-видимому, гетеродимер Д1/Д2 также

является следствием указанного процесса.

Рис. 14. Двумерный электрофорез комплекса РЦ ФС2, обработанного ДСП. Стрелками соединены белки, которые сшиваются между собой

' Q Д1/Д2 — Д1/а

д]

Д1/Д2

Рис. 15. Иммуноблот с антц-Д1 (А) ианти-Д2 (Б) поликлональными антителами контрольного РЦ ФС2. (1, 3, 5) и РЦ ФС2 обработанного ДСП (2-, 4, 6) при разном времени освещения (1,2-0 Мин, 3,4-5 мин, 5, 6 -30 мин) в присутствии ДБИМБ

6.3.2. Действие трипсина на РЦ

Учитывая высокую стабильность РЦ в комплексах ФС2 и ансамбле ФС2, обработанных трипсином, было проведено сравнение его действия на РЦ из Rps. viridis и РЦ ФС2, которые очень похожи по ряду показателей (Михель, Дайзенхофер 1986; Требст 1986; Шувалов, Климов 1987).

После обработки РЦ ФС2 трипсином не изменялись его спектральные (спектр поглощения, 4-я производная спектра поглощения, соотношение форм Хл) и фотохимические (фотовосстановление феофитина, фотоокисление Р680, кинетика пико-секундной флуоресценции) характеристики. Расщепление белков в РЦ ФС2 другими ферментами

(карбоксипептидаза, протеиназа К, папаин, Lys-C и Glu-C эндопротеиназы) также не влияло на указанные характеристики. Следовательно, в РЦ ФС2, как и в более крупных препаратах ФС2, сохраняется нативное состояние кластеров пигментов, ответственных за фотохимические реакции. Была предпринята попытка выделения ядра РЦ ФС2 методом электрофореза с додецилмальтозидом, но оказалось, что в этих условиях "трипсинизированный" РЦ мигрировал как единое целое, и не было обнаружено отделения от него пигментов или низкомолекулярных пептидов.

Бактериальные РЦ, выделенные с помощью ЛДАО и обработанные ферментом, быстро теряли свою фотохимическую активность, а в спектре поглощения таких РЦ наблюдалось разрушение нативных форм Бхл и появление полосы поглощения мономерного феофитина. Чтобы оценить, какую роль в процессе разрушения "трипсинизированного" РЦ играет цвитгерионный детергент ЛДАО, последний был заменен додецилмальтозидом, после чего стабильность РЦ возросла, но добиться такой же стабильности по отношению к трипсину, как у РЦ ФС2, не удалось. Разная стабильность бактериального и растительного РЦ после расщепления в них белков ферментом связана, очевидно, с разными принципами организации двух РЦ: РЦ ФС2 построен только из трансмембранных белков и на взаимодействие, их гидрофобных фрагментов, несущих пигменты, не влияет расщепление полипептидных цепей в гидрофильных областях (петлях). В составе бактериального РЦ два трансмембранных белка (М и L субъединицы - аналоги Д1 и Д2 белков), а прочносвязанный цитохром и большая часть Н субъединицы экспонированы на обе стороны мембраны. В нем большая роль в стабилизации структуры принадлежит электростатическим взаимодействиям, которые изменяются после протеолиза белков и, как следствие, наблюдаются изменения спектральных и фотохимических характеристик в бактериальном РЦ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение общих закономерностей и различий в построении фотосинтетического аппарата у бактерий, водорослей и растений, а также принципов организации отдельных пигмент-белковых комплексов является одной из фундаментальных задач фотосинтеза, важной для выяснения эффективных механизмов поглощения и трансформации энергии солнечного света в химическую энергию.

Были изучены объекты с разным уровнем структурно-функциональной организации: от простых пигмент-белковых комплексов (Б800—850 и ССК, РЦ бактерий и РЦ ФС2, СР47/РЦ растений и т.д.) до более сложных фрагментов мембран (ансамбль ФС2) или целых мембран (хроматофоры бактерий). Все исследованные комплексы являлись трансмембранными и для их выделения использована обработка мембран разным детергентами, которая в сочетании с разработанными методами выделения позволила получить препараты, сохранившие нативные спектральные и фотохимические характеристики.

Из мембран бактерий и ансамбля ФС2 выделены комплексы, которые выполняли

одинаковые функции в фотосинтетическом аппарате, но отличались по организации: комплекс Б800—850 и ССК, ансамбль Б890-РЦ и комплекс ФС2 (СР47/СР43/РД).

Светособирающие комплексы в пределах одной группы организмов построены по одинаковым принципам. У бактерий в их состав входят низкомолекулярные полипептиды. Пара таких полипептидов (а и fi) связывает 3-4 молекулы Бхл и составляет мономерную субъединицу, а 6 подобных субъединиц объединяются в комплекс Б800-850. Взаимодействие между субъединицами в комплексе достаточно сильное, и комплексы разрушаются по принципу "все или ничего". У некоторых комплексов зарегистрирована способность к обратимым конформационным переходам, которые связаны с изменением взаимодействия между а и /3 полипептидами. Этот феномен может отражать процесс регуляции передачи энергии от свето-собирающих комплексов к РЦ у некоторых бактерий. ССК растений построен из более крупных субъединиц (23-26 кДа), которые связывают два типа молекул Хл. В этих комплексах спектральные эффекты (образование длинноволновой формы Хл при 684 нм с максимумом низкотемпературной флуоресценции при 695 нм) наблюдаются при образовании двумерных агрегатов и тоже связаны с изменением пигмент-белкового и белок-белкового взаимодействия, как и в бактериальных комплексах. Оба типа комплексов (Б800-850 и ССК) являются наиболее стабильными структурами по сравнению с другими комплексами бактерий и растений.

Ансамбль Б890-РЦ и комплекс ФС2 кроме РЦ содержит светособирающие комплексы Б890 у бактерий и Хл-белки СР47 и СР43 с аналогичной функцией -у растений. Для них характерно почти одинаковое соотношение между пигментами антенны и РЦ (30-40:1), что свидетельствует об общих принципах их функциональной организации. В обоих типах препаратов светособирающие комплексы окружают РЦ. Установлено образование сшивок между полипептидами комплекса Б890 и Н и М субъединицами РЦ в ансамбле Б890-РЦ у бактерий и между Хл-белком СР47 и Д2 белком РЦ в комплексе ФС2 растений. Ансамбль Б890-РЦ более консервативен, и связь между комплексами в нем более прочная, чем в комплексе ФС2 растений. Варьируя тип детергентов, можно получить комплекс ФС2 с разным соотношением Хл-белков СР47 и СР43 или комплекс ФС2 без Хл-белка СР43 (СР47/РЦ комплекс). В процессе выделения комплексов ФС2 происходит не только отделение отдельных комплексов, но и потеря комплексами части пигментов, что никогда не наблюдается у бактерий. Например, в зависимости от условий выделения, можно получить РЦ ФС2 с разным соотношением Хл:фео-фитин (4:2 или 6:2). Однако, несмотря на высокую лабильность комплексов ФС2 при обработке детергентами в них обнаружена способность ядра ФС2 к сохранению нативного состояния кластеров пигментов (Хл-белков СР47 и СР43, и РЦ) после расщепления трипсином всех белков на фрагменты с молекулярной массой ниже 23 кДа. В отличие от комплексов ФС2 ансамбль Б890-РЦ и РЦ бактерий быстро разрушаются после обработки ферментом. По-видимому, подобная устойчивость комплексов ФС2 связана с процессами его репарации in vivo. В настоящее время с читается, что после быстрой деградации Д1 белка оставшаяся часть комплекса

ФС2 не разрушается, а достраивается вновь синтезированным Д1 белком (Барбато и др. 1992).

Совокупность полученных в работе результатов позволила уточнить общие принципы организации фотосинтетического аппарата бактерий и ФС2 растений (рис. 16). Фотосинтетический аппарат бактерий состоит из центральной части - ансамбля Б890-РЦ, в котором светособирающие комплексы Б890 окружают РЦ. Эти ансамбли не контактируют непосредственно друг с другом. Их окружают светособирающие комплексы Б800-850, образуя ассоциаты Б890-РЦ/Б800-850 с разным содержанием второго светособирающего комплекса Б800-850. Небольшая часть комплекса Б800-550 в подобных ассоциатах может напрямую контактировать с РЦ, что отражает альтернативный путь передачи энергии к РЦ. Ассоциаты Б890-РЦ/Б800-850 до-:таточно тесно взаимодействуют в мембранах, обеспечивая таким образом повышение эффективности поглощения и передачи энергии с комплексов Б800-850 к РЦ. В мембранах также присутствуют пулы свободных комплексов Б800-850 и ансамблей Б890-РЦ, что связано с процессами регулирования размеров фотосинтетической

Б890-РЦ

Б800-850

Рис. 16. А- схема взаимодействия пигмент-белковых комплексов в мембранах пурпурных бактерий. Стрелками показаны альтернативные пути миграции энергии.

Б - схема организации комплекса СР47/РЦ фотосистемы 2 высших растений. Пунктиром показаны другие светособирающие комплексы, которые окружают комплекс СР47/РЦ

единицы. Указанные принципы построения фотосинтетического аппарата бактерий характерны и для ансамбля ФС2.

При исследовании бактериальных комплексов с небольшим количеством кароти-ноидов (3-5% от контроля) было установлено, что они, в отличие от контрольных комплексов с нормальным содержанием каротиноидов, легко разрушаются неионными детергентами. На основании этих данных и результатов по изучению процесса выцветания пигментов в бактериальных комплексах была установлена новая -структурная - функция каротиноидов. Очевидно для ряда комплексов недостаточно только белок-белкового взаимодействия для стабилизации их структуры и поэтому включаются дополнительные механизмы, которые заключаются в использовании молекул каротиноидов для стабилизации структуры комплексов. Литературные данные подтверждают, что структурная функция каротиноидов характерна для некоторых пигмент-белковых комплексов из растений.

Выявленные в данной работе закономерности в построении фотосинтетического аппарата у разных групп фотосинтезирующих организмов имеют важное значение для понимания принципов эффективной работы фотосинтетического аппарата и процессов преобразования энергии света в энергию химических связей и могут найти применение при создании экологически чистых источников энергии для биотехнологии и других целей.

ВЫВОДЫ

1. Для выяснения принципов организации и взаимодействия пигмент-белковых комплексов в структурах фотосинтетического аппарата бактерий и фотосистемы 1 высших растений проведено систематическое изучение препаратов с разными структурно-функциональными характеристиками с помощью комплекса современных методов, включающего разработанные или модифицированные методики выделение и анализа комплексов, использования бифункциональных сшивающих агентов ограниченного протеолиза и ингибирования синтеза каротиноидов.

2. Установлено как сходство (два низкомолекулярных полипептида, идентичные спектральные характеристики) так и различия (разная устойчивость к внешнии воздействиям и способность к обратимым конформационным переходам, избирательное разрушение одной из форм бактериохлорофилла) в организации бакте риальных светособирающих комплексов.

3. Показано, что обратимые спектральные конформационные переходы в свето собирающих комплексах Б800-850 связаны с изменением взаимодействия межд; а и /3 полипептидами, а ограничение взаимной подвижности этих полипептидов ( помощью бифункциональных сшивающих агентов приводит к ограниченям в из менении пигмент-пигментного взаимодействия.

4. Выявлена новая - структурная - функция каротиноидов, которые выполняю1 роль структурных элементов в некоторых пигмент-белковых комплексах. Пр1 сопоставлении действия неионных детергентов на контрольные комплексы и комп

лексы, выделенные из бактерий с ингибированным синтезом каротиноидов установлено, что каротиноиды способны стабилизировать структуру светособирающих комплексов бактерий. Показано, что эти комплексы восстанавливают стабильность своей структуры при содержании в них каротиноидов выше 10%.

5. При восстановлении синтеза каротиноидов у Chr. minutissimum обнаружено, что места локализации каротиноидов в комплексах не специфичны и могут связывать как предшественники (Фитоин, Фитофлуин) так и любые каротиноиды. В ансамбле Б890-РЦ всегда накапливаются каротиноиды с большим количеством ненасыщенных двойных связей и более сложными боковыми заместителями по сравнению с комплексом Б800-850.

6. При исследовании взаимодействия комплексов в мембранах бактерий с помощью бифункциональных сшивающих агентов выявлено, что ансамбли Б890-РЦ не контактируют друг с другом, а окружены комплексами Б800-850. Основная часть ансамблей Б890-РЦ и комплексов Б800-850 образуют ассоциаты Б890-РЦ/Б800-850, взаимодействующие в мембране между собой. Показано, что в мембране существуют небольшие пулы свободных комплексов Б800—850 и ансамблей Б890-РЦ, что отражает процессы рефляции переноса энергии к РЦ в фотосинтетическом аппарате бактерий.

7. Установлено, что в ансамбле Б890-РЦ бактерий и комплексе ФС2 (СР47/СР43/РЦ) растений светособирающие комплексы (Хл-белки) окружают РЦ. Показано, что, в отличие от ансамбля Б890-РЦ, связь между Хл-белками и РЦ ФС2 менее прочная, поэтому комплекс ФС2 можно выделить с разным отношением Хл-белков СР43 и СР47 к РЦ.

8. Обнаружено существование контактов между Хл-белком СР47 и Д2 белком РЦ ФС2, Д1 и Д2 белками РЦ ФС2 и а субъединицей цитохрома Ь559 в комплексах РЦ ФС2 и СР47/РЦ. Установлено присутствие димера цитохрома Ь559 в этих комплексах. Показано, что после диссоциации комплекса СР47/РЦ из РЦ ФС2 можно удалить две дополнительные молекулы хлорофилла без нарушения фотохимической активности.

9. На основании сопоставления свойств ансамбля ФС2, комплекса ФС2 и РЦ ФС2, обработанных-трипсином, сделан вывод о способности ядра ФС2 к сохранению нативного состояния кластеров пигментов Хл-белка СР47 и РЦ ФС2 за счет сохранения белок-белкового взаимодействия между соответствующими а-спираль-ными участками белков после расщепления ферментом белков в этих комплексах.

10. Предложены модели организации фотосинтетического аппарата бактерий и комплекса фотосистемы 2 высших растений, отражающих взаимодействие отдельных комплексов между собой, и пути переноса энергии от светособирающих комплексов к РЦ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Москаленко А.А., Ерохин Ю.Е. О 971) Применение электрофореза в полиакриламидном re.it для выделения и изучения пигмент-липопротеидных комплексов пурпурных бактерий, в сб. "Электрофорез в полиакрил амид ном геле и его применение в биологии, сельском хозяйстве, медицине j пищевой промышленности", Москва, 154-156.

2. Москаленко А.А. (1971) Изучение некоторых свойств комплексов, выделенных из хроматофорое Chromatium, в сб. "Биология и научно-технический прогресс", Пущино, 174-176.

3. Ерохин Ю.Е., Москаленко А.А. (1972) Некоторые свойства двух бактериохлорофилл-белковых комплексов из хроматоф°ров Chromatium, Тезисы 4 Международного биофизического конгресса, Москва, 364.

4. Ерохин Ю.Е., Москаленко А.А. (1973) Характеристика белков (число цепей и молекулярные веса) пигмент-липопротеиноеых комплексов Chromatium, ДАН СССР, 212, 495-498.

5. Ерохин Ю.Е., Москаленко А.А., Демина JI.il., Махнева З.К. (1974) Состояние бактерио-хлорофилла и организация пигментной системы пурпурных бактерий, в сб. "Хлорофилл", Минск, 242-248.

6. Москаленко А.А., Ерохин Ю.Е. (1974) Выделение пигмент-липопротеиновых комплексов из пурпурных бактерий методом препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, Микробиология, 43, 654-657.

7. Ерохин Ю.Е., Чугунов В.А., Москаленко А.А., Демина Л.П., Махнева З.К. (1974) Общие закономерности организации пигментной системы пурпурных фотосинтезирующих бактерий, в сб. "Итоги исследования механизма фотосинтеза", Пущино, 148-161.

8. Ерохин Ю.Е., Москаленко А.А., Ганаго А.О. (1974) Некоторые данные о роли каротиноидов в структуре и функциях пигментной системы пурпурной бактерии Chromatium minutissimum, в сб. "Итоги исследования механизмов фотосинтеза", Пущино, 162-171.

9. Москаленко А.А., Ерохин Ю.Е. (1974) Спектральные свойства и стабильность пигмент-липо-протеинового комплекса Б890 у Chromatium, Stud, biophysica, 44, 17-32.

10. Шувалов В.А., Климов В.В., Крахмалева Н.И., Москаленко А.А., Красновский А.А. (1976) Фотопревращение феофитина в реакционных центрах Rhodospmllum rubrum и Chromatium minutissimum, ДАН СССР, 227, 984-987.

11. Ерохин Ю.Е., Чугунов В.А., Москаленко А.А., Махнева З.К., Агрикова И.М. (1976) Молекулярная организация пигментных систем фотосинтезирующих бактерий, в сб. "Итоги исследования механизма фотосинтеза", Пущино, 12-15.

12. Erokhin Yu.E., Chugunov V.A., Moskalenko А.А. (1976) Some common feature in molecular organization of pigment system of purple photosynthetic bacteria. Abstracts of international congress on photobiology, Rome, 285.

13. Moskalenko A.A., Abdurakhmanov LA., Erokhin Yu.E. (1977) Investigation of conformational changes in Light-harvesting pigment-lipoprotein complexes of purple photosynthetic bacteria, Abstracts of international symposium "Pigment-protein complexes in photosynthesis", Szeged, 1-2.

¡4. Moskalenko Л.А., Erokhin Yu.E. (1978) Investigation of iigh (-harvestingcomplex Rhodopseudomonas sphaeroides, FEBS Lett. 122-124.

15. Москаленко A.A., Ладыгин В.Г. (1979) Белковый состав мембран хлоропластов Chlamidomonas reinhardii с неактивными фотосистемами I или И, ДАН СССР, 249, 1017-1020.

16. Возняк В.М., Ганаго А.О., Москаленко А.А., Елфимов Е.И. (1979) Влияние магнитного поля на выход флуоресценции хлорофилл-белковых комплексов, обогащенных фотосистемой I, Stud, biophysica, 77, 13-20.

17. Voznyak V.M., Ganago A.O., Moskalenko A.A., Elfimov E.I. (1989) Magnetic field-induced fluorescence changes in chlorophyll-proteins enriched with P700, Biochim. Biophys. Acta, 592, 364-368.

18. Москаленко A.A. (1981) Электрофорез в полиакриламидном геле, в сб. "Практикум по физико-химическим методам в биологии", Москва, 154-178.

19. Москаленко А.А. (1981) Комплекс аппаратов для вертикального электрофореза и электрофокусировки в трубках, Тезисы докладов Всесоюзной конференции Биоприбор 81, Кишинев, ч. 11, 32-33.

20. Moskalenko А.А. (1981) Structural role of carotcnoids in organization of pigment-protein complexes from purple photosynthetic bacteria, Abstracts of VI International Symposium on carotcnoids, Liverpool, 23.

21. Москаленко А.А, Ерохин Ю.Е. (1981) Структурная роль каротиноидов в организации пигмент-белковых комплексов из пурпурных фотосинтезирующих бактерий, Препринт, Пущино, 1-20.

22. Воскресенская Н.П., Дроздова Н.С., Москаленко А.А., Четвериков А.Г., Цельникер ЮЛ. (1982) Перестройки фотосинтстического аппарата под влиянием длительного действия красного и синего света, Физиол. раст. 29, 447-456.

23. Москаленко А.А., Сулейманов С.Ю., Кузнецова И.Ю., Ерохин Ю.Е., Алиев Д.А. (1982) Спектральные характеристики и особенности состояния пигментов в светособирающем комплексе из хлороги.гстов пшеницы, Физиол. раст. 29, 687-696.

24. Алиев Д.Л., Москаленко А.А., Сулейманов С.Ю., Ерохин Ю.Е. (1982) Некоторые харак-еристики тилакоидов гран и стромы из хлоропластов пшеницы, Докл. АН АзССР, XXXVII, 47-51.

25. Москаленко А.А., Кузнецова И.Ю., Ерохин Ю.Е. (1983) Выделение, спектральные и фото-имические характеристики трех типов пигмент-белковых комплексов из Chromatium с подавленным иктезом каротиноидов, ДАН СССР, 269, 1248-1251.

26. Москаленко А.А., Махольд О., Ерохин Ю.Е. (1983) Локализация полипептидов из пигмент-елковых комплексов Chromatium minutissimum ДАН СССР, 270, 251-253.

27. Москаленко А.А., Ерохин Ю.Е. (1983) Применение электрофореза в пластинчатом поли-криламидном геле для изучения мембранных белков на примере фотосинтезирующих организмов, [репринт, Пущино, 1-41.

28. Сулейманов С.Ю., Москаленко А.А., Алиев Д.А., Ерохин Ю.Е. (1983) Состав и спектральные арактеристики хлорофилл-белковых комплексов, выделенных из мембран хлоропластов пшеницы етодом электрофореза, Физиол. раст. 30. 557-562.

29. Moskalenko А.А., Toropygina О.А., Erokhin Yu.E. (1983) Isolation and partial characterization F two types of pigment-protein complexes from Rb. capsulatus, Abstracts of III Soviet-Swiss symposium Biological membranes: Structure and functions", Tashkent, 132.

30. Ладыгин В.Г., Фомина И.Р.У Биль К.Я., Москаленко А.А., Ширшикова Г.И. (1983) Хлорофилл-елковые комплексы зеленых водорослей и высших растений. Идентификация хлорофилл-содержащих олос в геле с использованием мутантов Chlamidomonas reinhardii. Биохимия, 48, 1421-1428.

31. Фомина И.Р., Биль К.Я., Ладыгин В.Г., Москаленко А.А., Магомедов И.М. (1983) Хлорофилл-елковые комплексы зеленых водорослей и высших растений. Гетерогенность комплексов хло-опластов диморфных тканей листьев С4-растений, Биохимия, 48, 1604-1610.

32. Кузнецова Н.Ю., Москаленко А.А. (1983) Роль каротиноидов в стабилизации структуры ^стособирающего и светофокусируюшего комплексов из Chr. minutissimum, в сб. "Некоторые :пскты физиологии микроорганизмов: физиологические, биохимические и молекулярно-биологи-ескис исследования, Пущино, 15-20.

33. Ерохин Ю.Е., Москаленко А'.А., Абдурахманов И.А., Прохоренко И.Р., Махнева З.К. (1984) 'рганизация фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий, Тезисы 16 конференции ФЕБО, [осква, 249.

34. Москаленко А.А., Махольд О., Ерохин Ю.Е. (1984) Прибор для проведения электрофореза пластинах полиакриламидного геля. Физиол. раст. 31, 988-996.

35. Ссадималиев P.M., Возпяк В.М., Москаленко А.А. (1985) К вопросу о природе переменной луорссцснции фотосистемы II высших растений при исследовании фосфороскопическим методом, tud. biophysica, 106, 9-20.

36. Возняк В.М., Севдималиев P.M., Москаленко А.А. (1985) рН-зависимая магнитно-чувстви-;льная стадия переноса электрона в первичных реакциях фотосистемы II высших растений, Stud, .ophysica, 106, 21-31.

37. Moskalenko А.А., Toropygina O.A., Elfimov E.I. (1985) The organization of Photosynthetic эparatus in purple sulfur bacteria, Abstracts of V International symposium on photosynthetic procarites, rindelwald, 298.

38. Москаленко A.A., Кузнецова Н.Ю., Махольд О., Ерохин Ю.Е. (1987) Состав и некоторые зрактеристики хлорофилл-белковых комплексов в частицах, обогащенных фотосистемой II. Био-г!мия, 52, 934-942.

39. Москаленко А.А., Торопыгина О.А. (1987) Взаимное расположение пигмент-белковых компасов в мембранах серной фотосинтезирующей бактерии Chromatium minutissimum, ДАН СССР, )6, 483-486.

40. Moskalenko А.А., Kuznetsova N.Yu., Erokhin Yu.E. (1987) Content and some characteristics of ilorophyll-proteins in particles enriched with photosystem II, in "Proceedings of International symposium

Plant mineral natrition and Photosynthesis", Varna, V. 2, 32-35.

41. Moskalenko A.A., Kuznetsova N.Yu., Erokhin Yu.E. (1987) Properties of photochemically active SII complex isolated from spinach by using various detergents, in "Proceedings of International mposium of Plant mineral nutrition and Photosynthesis", Varna, V. 2, 36-39.

42. Москаленко A.A., Ладыгин В.Г., Кузнецова Н.Ю., Ширшикова Г.Н., Ерохин Ю.Е. (1988) ^явление двух хлорофилл-а-белковых комплексов фотосистемы II у мутантов Chlamidomonas inhardii. Биофизика, 33, 13-17.

43. Москаленко А.А., Кузнецова Н.Ю., Ерохин Ю.Е. (1988) Свойства фотохимически активного шплекса фотосистемы II, выделенного из шпината с использованием разных детергентов, Биохимия, I, 424-433.

44. Москаленко А.А., Торопыгина О.А. (1988) Выявление с помощью ионов серебра дополнительных iH белков в градиентных гелях, окрашенных кумасси, Биол. науки, 5, 101-105.

45. Москаленко А.А., Торопыгина О.А. (1988) Выявление связи светособирающего комплекса 500-850 с Н-субъединицей реакционного центра в хроматофорах серной фотосинтезирующей [ктерии Chromatium minutissimum, Биохимия, 53, 1220-1223.

46. Москаленко А.А., Кузнецова Н.Ю., Ерохин Ю.Е. (1988) Фотохимически активный комплекс этосистемы II, ДАН СССР, 299, 1015-1019.

47. Москаленко А.А., Торопыгина О.А. (1988) Исследование латерального расположения пигмент-

белковых комплексов в мембранах серной фотосинтезируюшей бактерии Chromatium minutissumn с помощью бифункциональных сшивающих агентов, Мол. биол, 22, 944-954.

48. Moskalenko A.A., Toropygina О.А. (1988) Spatial relationspips between pigment-protein complete in the membrane of Chromatiura minutissimum, Abstracts of VI International symposium on Phoiosynthcu Procariotes, Amsterdam, 188.

49. Москаленко A.A., Кузнецова Я.Ю., Ерохин Ю.Е. (1989) Действие трипсина на комплек фотосистемы И, ДАН СССР, 306, 492-495.

50. Москаленко А.А., Кузнецова И.Ю., Ерохин Ю.Е. (1989) Взаимодействие гидрофильного с> к цинимидилового эфира с полипептидами пигмент-белковых комплексов в ансамбле- А890 из серж» фотосинтезируюшей бактерии Chromatium minutissimum, Биол. мембраны, 6, 947-954.

51. Moskalenko А.А., Erokhin Yu.E., Kuznetsova N.Yu. (1989) Effect of trypsin on the agregata PSII particles, Photosynthetica, 23, 324-332.

52. Moskalenko A.A., Toropygina O.A., Erokhin Yu.E. (1989) Interaction of hydrophylic succininiidi esters with polypeptides in the assembly B890-RC from Chromatium minutissimum, Physiol. Plantarum 76, Fasc 3, P. 2, A. 69.

53. Moskalenko A.A., Kuznetsova N.Yu. (1989) The trypsin effect on Chl-protein complexes, poly pep tides and photochemical activity of BBY-particles, Physiol. Plantarum, 76, Fasc 3, P.2, A. 102.

54. Москаленко A.A., Кузнецова Н.Ю.,' Ерохин Ю.Е. (1990) Действие трипсина на частицы обогащенные фотосистемой II, в агрегированном состоянии, Биохимия, 55, 240-246. ^

55. Moskalenko А.А., Kuznetsova N.Yu., Erakkin Yu.E. (1990) Trypsin effect on Photosystem 2 Cor< Complex, Photosynthetica, 24, 16-21.

56. Москаленко A.A., Кузнецова И.Ю. (1990) Хлорофилл-белковые комплексы, полипептидньп состав и фотохимическая активность частиц, обогащенных фотосистемой II при обработке трипсином Биол. мембраны, 7, 487-496.

57. Москаленко А.А. (1990) Выделение стабильных реакционных центров фотосистемы 2, Биол мембраны, 7, 736-741.

58. Москаленко А.А., Йорданов И. (1990) Прибори за пластинчата гелелектрофореза, обезцветяване чрез дифузия и сушене на гелите, Физиол. на растенията (Болгария) XVI, 83-89.

59. Moskalenko А.А., Kuznetsova N.Yu. (1990) Chiorophyli-protein complexes, polypeptide content and photochemical activity in photosystem II particles treated with trypsin, in "Progress in Photosynthesis", Dordrecht, 1, 283-286.

60. Moskalenko A.A., Toropygina O.A., Erokhin Yu.E. (1990) Interaction of hydrophylic succinimidilc esters with polypeptides of pigment-protein complexes in assembly B890-RC from sulfur photosynthctic bacterium Chromatium minutissimum, in "Progress in Photosynthesis", Dordrecht, 2, 85-88.

61. Britton G., Connor A., Young A., Toropygina O.A., Moskalenko A.A. (1991) Changes in the composition of carotenoids in pigment-protein complexes isolated from Chromatium minutissimum cells grown at decreasing concentration of diphenylamine, in Abstracts of IX International symposium on carotenoids, Kyoto, 165.

62. Москаленко A.A., Кузнецова Н.Ю. (1991) Расщепление трипсином белков Д1 и Д2 не влияет на фотохимическую активность реакционного центра фотосистемы II, Биол. мембр., 8, 586-594.

63. Москаленко А. А., Брит тон Г., КЬннор А., Йанг А., Торопыгина О.А. (1991) Состав каро ти-ноидов в хроматофорах и пигмент-белковых комплексах, выделенных из клеток Chromatium minutissimum, выращенных в присутствии дифениламина, Биол. мембр., 8, 249-260.

64. Timpmann К., Freiberg A., Moskalenko A., Kuznetsova N.Yu. (1991) Picosecond fluorescence of photosystem И Dl/D2/cyl b559 and Dl/D2/cyl b559/CP47 pigment-protein, in ."Proceeding of Vll International Symposium on Ultrafast Process in Spectroscopy", Bristol, 613-616.

65. Москаленко А.А., Кузнецова Н.Ю. (1992) Идентификация гем-содержащих зон в препаратах фотосистемы 2 после электрофореза с гликозидными детергентами, Биол. мембр., 9, 5-11.

66. Москаленко А.А., Кузнецова И.Ю. (1992) Выделение двух типов фотохимически активных комплексов реакционных центров фотосистемы 2 методом электрофореза с додецил-^-О-мальтозидом, Биохимия, 57, 226-235.

67; Moskalenko A. A., Toropygina О.А. (1992) Chemical cross-linking studies of the isolated light-harvesting complex B800-850 of Chromatium minutissimum, Photosynth. Res., 34, 115.

68. Moskalenko A.A., Kuznetsova N.Yu. (1993) Effect of trypsin on reaction center of Photosystem 2 and Reaction centre of Rhodopseudomonas virids, Photosynthess. Res. 35, 227-234.

69. Freiberg A., Timpmann K., Moskalenko A., Kuznetsova N.Yu. (in press) Pico-nanosecond fiuores-cencc kinetics of photosystem 2 Reaction Center and its complex with CP47 antenna, Biochim. Biophys. Acta

70. Moskalenko A., Barbato K., Giacometti G.M. (1992) Investigation of the neighbour relationships between photosystem 2 polypeptides in the two types of isolated Reaction Centers (Dl/D2/cyt b559 and CP47/Dl/D2/cyl b559 complexes), FEBS Lett., 314, 271-274.

71. Moskalenko A.A., Kuznetsova N.Yu. (in press) Separation of photochemically active Dl/D2/cyto-chrome. b559 and CP47/Dl/D2/cytochrome b559 complexes of photosystem 2 by electrophoressis with dodecyimaltoside Biochim. Biophys. Acta.

72. Moskalcnka A.A., Toropygina O., Godik V., Timpmann K. and Freiberg A. (1992) Investigation spatial relationships and energy transfer between complexes B-800-850 and B890-RC from chromatium inutisMmum rcconstuted into lyposomes, FEBS Lett., 308, 133-136.

73. Moskulctkn A.A, Toropygina O.A. (1993) Chemical cross-linking studies of the isolated light-har-

1>хл бактериохлорофилл

Хл хлорофилл

ФС фотосистема

1'Ц реакционный центр

ССК светособирающий комплекс

Л1П1М1» 2-5-Дибром-З-метил-изопропил-п-бензохинон

ДСП лодецилсульфат натрия

ДФД дифениламин

ДСТ дисукцинимидилтартарат

ДСП дитиобис (сукцинимидилпропионат)

')ГС отиленгликольбис (сукцинимидилсукцинат)

ДМСО диметилсульфоксид

кД.т килодальтон >

1Г )ЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ЛИ ллектрон-транслортная цепь

Chr Chromatium

I'd Ectothiorhodospira

Hl) Rhodobacter

Us Rhodospirillum

Hps Rhodopseudomonas

I'll Thiocapsa

12.04.93 г. Зап. 5576P. Тир. 150 эяз. Уч.-изд.л. 2.2

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН

Информация о работе

Москаленко, Андрей Анатольевич
доктора биологических наук
Пущино, 1993
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы