Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фемтосекундные исследования процесса разделения зарядов в бактериальных реакционных центрах

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фемтосекундные исследования процесса разделения зарядов в бактериальных реакционных центрах"

005059194

Хмельницкий Антон Юрьевич

На правах рукописи

ФЕМТОСЕКУНДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЦЕССА РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ

03.01.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 б т 2013

Пущино- 2013

005059194

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФГТБ РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, академик РАН

Шувалов Владимир Анатольевич

Официальные оппоненты: Проскуряков Иван Игоревич, доктор физико-

математических наук, ИФПБ РАН, заведующий лабораторией

Семенов Алексей Юрьевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук

и Защита состоится «14» июня 2013 г. в 13-30 на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при ИФПБ РАН

по адресу: 142290, г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН

Автореферат разослан «¿¿&?> апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотосинтез растений и водорослей является основным источником кислорода и органических соединений на Земле, которые служат для питания человека и различных живых организмов, а также запасены в виде ископаемых углеводородов. Преобразование солнечной энергии в химическую начинается с разделения зарядов в специализированных пигмент-белковых комплексах, называемых реакционными центрами (РЦ) и входящими в состав цитоплазматических мембран бактерий и мембран хлоропластов растений. Эффективность данного процесса исключительно высока (-60%), а квантовый выход первичных стадий близок к 100 %.

По ряду причин особую роль в изучении начальных стадий фотосинтеза играют бактериальные РЦ, в особенности РЦ пурпурных несерных бактерий. Они относительно легко и в больших количествах выделяются, сохраняя свою функциональную активность в течение нескольких дней при хранении в темноте при комнатной температуре. Структура РЦ пурпурных бактерий была определена кристаллографически еще в 80-х годах прошлого века. В отличие от РЦ растений и цианобактерий она сравнительно проста, в ней меньше кофакторов, причем большинство из них имеет хорошо различимые полосы поглощения в спектре РЦ. И, наконец, для реакционных центров пурпурных бактерий разработаны методы сайт-направленного мутагенеза, позволяющие делать точечные аминокислотные замены в белковых субъединицах РЦ.

Начальные стадии разделения зарядов и переноса электрона в РЦ проходят с очень высокой скоростью - порядка пикосекунд. Для изучения столь быстрых реакций используется спектроскопия с фемтосекундным разрешением. К тому же фемтосекундная спектроскопия предоставляет возможность исследовать ядерные движения кофакторов и белка, которые могут вызывать или сопровождать реакции переноса электрона. Идентификация же когерентных сигналов колебаний или вращений молекулярных групп, связанных с хромофорами и молекулами окружения, также может дать информацию о путях начального переноса электрона. А внесение аминокислотных замен вблизи кофакторов переноса электрона позволяет изменять их физико-химические свойства.

Изучая мутантные реакционные центры ШойоЪас1ег (КЬа.) $рИаего1(1е$, мы пытаемся определить роль белкового окружения кофакторов в процессе разделения зарядов и динамику переноса электрона в РЦ, чтобы в итоге выяснить, чем же обусловлен поразительно высокий, близкий к 100 процентам, квантовый выход первичного разделения зарядов. В связи с этим особенно интересны детали динамики возбужденного состояния димера специальной пары, а также первого состояния с разделенными зарядами Р+ВА~.

Недавно было показано, что молекула воды, находящаяся между молекулой специальной пары и ВА (НОН55), может участвовать в процессе разделения зарядов в РЦ пурпурной бактерии КЬа. зрИаего'1с1ез. Чтобы ответить на вопрос об универсальности такого механизма переноса электрона на первичный акцептор с участием молекулы воды для бактерий необходимо

з

изучение РЦ других бактерий, например зеленой несерной бактерии Chloroflexus (Cjx.) aurantiacus, ставшей вторым объектом настоящей работы.

Цели и задачи исследования. Целью являлось исследование механизма первичного разделения зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rba. sphaeroides и зеленой несерной бактерии Cjx. aurantiacus методом фемтосекундной спектроскопии. Ставились следующие задачи:

1. Фемтосекундные исследования РЦ дикого типа и мутантных РЦ Rba. sphaeroides L173HL и M202HL, в которых одна из молекул бактериохлорофилла димера специальной пары заменена на бактериофеофитин.

2. Исследование разделения зарядов в мутантных РЦ Rba. sphaeroides с повышенным окислительно-восстановительным потенциалом первичного донора электрона Р.

3. Исследование высушенных пленок РЦ Rba. sphaeroides и Cfx. aurantiacus методом когерентной оптической спектроскопии с фемтосекундным разрешением.

Научная новизна работы. Получены данные, указывающие на то, что переносу электрона на первичный акцептор ВА предшествует сверхбыстрое разделение зарядов внутри димера специальной пары Р. В РЦ дикого типа и мутантов в дифференциальных спектрах свет-минус-темнота в ближнем ИК-диапазоне найдена полоса, предположительно принадлежащая поглощению катион-радикала одной из молекул бактериохлорофилла (БХл) специальной пары - Ра5+. Впервые продемонстрировано непосредственное участие молекулы мономерного бактериохлорофилла Ва в переносе электрона в мутантных РЦ с повышенным потенциалом первичного донора Р. Обнаружены также свидетельства того, что положение уровня свободной энергии состояния Р+ВА" по отношению к уровню P* на ранних задержках составляет величину порядка энергии kf при комнатной температуре. В результате экспериментов выяснилось, что молекула кристаллографической воды НОН55 оказывает сильное влияние на первичное разделение зарядов в РЦ Rba. sphaeroides, либо прямо участвует в этом процессе. Наши данные подтверждают предположение, что и в РЦ Cfx. aurantiacus присутствует молекула (или молекулы) воды, играющая ту же роль, что и молекула НОН55 в РЦ Rba. sphaeroides.

Практическая значимость работы. Полученные данные о начальных стадиях разделения зарядов в бактериальных реакционных центрах важны с точки зрения создания оптимальных искусственных преобразователей солнечной энергии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на трех международных конференциях: «Преобразование света при фотосинтезе» (Пущино, Россия, 2008), «15th International Congress of Photosynthesis» (Beijing, China, 2010) и «Photosynthesis Research for Sustainability» (Baku, Azerbaijan, 2011), а также на VI съезде Российского фотобиологического общества (Шепси, Россия, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ, в том числе четыре в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждегам полученных результатов, выводов и списка литературы. Объем работы составляет 110 страниц, в ней содержится 33 рисунка и 2 таблицы. Список литературы включает 164 источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили реакционные центры пурпурной бактерии Rba. sphaeroides дикого типа RV, штамма R-26, мутантов: L131LH, с заменой лейцина в L-цепи на гистидин, M160LH, с заменой лейцина на гистидин в М-цепи, M197FH, с заменой фенилаланина на гистидин в М-цепи, тройного мутанта, несущего все три указанные замены, мутантов с гетеродимером L173HL и M202HL, с заменой гистидина на лейцин в L- и М-цепи соответственно, а также РЦ зеленой несерной бактерии Cfx. aurantiacus.

■ В работе использована генетическая система для направленного мутаганеза РЦ, состоящая из штамма Rba. sphaeroides DD13, дефицитного по синтезу РЦ и антенных комплексов, и плазмиды для комплементации pRKP. Мутагенез проводили с помощью полимеразной цепной реакции методом перекрывающихся ДНК фрагментов. РЦ дикого типа и мутантов Rba. sphaeroides и Cfx. aurantiacus были изолированы путем обработки мембран LDAO с последующим применением хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. РЦ были ресуспсндированы в буфере, содержащем 20 mM Tris-HCl (рН 8,0) и 0,1% Triton XI00, и сконцентрированы до оптической плотности 0,5 при 870 нм (длина оптического пути 1 мм). Затем к образцам добавляли дитионит натрия до концентрации 5 мМ и освещали в течение 5 минут слабым рассеянным белым светом для восстановления первичного хинонного акцептора Qa. Сухая пленка РЦ получалась при высушивании раствора РЦ при комнатной температуре и относительной влажности ~40%. Затем она выдерживалась в вакууме в течение 2 суток.

Фемтосекундные дифференциальные спектры поглощения при комнатной температуре получали при помощи спектрометра, работающего по методу накачки-зондирования. Титан-сапфировый лазер Tsunami (Spectra-Physics, США) использовали для получения импульсов длительностью ~35 фс при длине волны 800 нм и частотой повторения 80 МГц. Данные импульсы поступали в оптический регенеративный усилитель Spitfire (Spectra-Physics, США), на выходе из которого получали 40 фс импульсы с энергией 0,9 мДж и частотой повторения 50 Гц. Выходящий из усилителя пучок делили на два луча. Первый луч ослаблялся до энергии ~60 мкДж и фокусировался в кювете с водой толщиной 5 мм для генерации континуума. Небольшая доля континуума (~4%) использовалась в качестве импульсов пробного луча и луча сравнения. Импульс накачки с энергией -0,54 мДж фокусировали на кювету с водой толщиной ~5 мм и полученный континуум использовали для возбуждения

образца. Все три импульса проходили через вращающуюся кварцевую кювету с образцом толщиной 1 мм, импульсы накачки и зондирования проходили образец в одной и той же точке. Временная задержка между импульсами накачки и зондирования варьировалась с помощью управляемой компьютером оптической задержки PI-M531.DD (Physik Instrumente, Германия). После кюветы с образцом пробный импульс и импульс сравнения направлялись на входную щель спектрографа Spectra Рго 2300i (Acton Research Corporation, США). Спектры регистрировались с помощью чувствительной в ИК диапазоне камеры Pixis 400BR CCD (Princeton Instruments, США). Свет с длиной волны короче 850 нм в возбуждающем импульсе отрезался светофильтром RG850 (Newport, США). Относительная поляризация импульса возбуждения была параллельна измерительному импульсу. При измерении темновых спектров излучения для получения дифференциального свет-минус-темнота спектра поглощения импульс возбуждения блокировали с помощью механического затвора SR475 (Princeton Instruments, США) при каждой задержке времени. Импульсом возбуждались примерно 10-25% реакционных центров в образце. Дифференциальные спектры поглощения при каждой задержке времени получали усреднением 1000 измерений.

Измерения при температуре 90К с импульсом длительностью 20 фс проводили, как описано в (Яковлев, 2012).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разделение зарядов внутри первичного донора электрона Р в нативных и мутантиых реакционных центрах

В некоторых теоретических работах авторами высказывалось предположение, что после возбуждения под действием света молекула первичного донора Р, еще до переноса электрона на первичный акцептор ВА, переходит в состояние, в котором обнаруживается примесь состояния с разделенными зарядами Р^СРа^Рв8") или Р*(Ра5"Рв5+). Кроме того, данные Штарк-спектроскопии четко показывают, что возбуждение димера Р сопровождается значительным увеличением его дипольного момента, а это тоже указывает на разделение зарядов.

На Рис. 1 отображены дифференциальные спектры РЦ дикого типа Rba. sphaeroides, измеренные на задержках 20 фс (кривая 1) и 480 фс (кривая 2) после возбуждения при 870 нм лазерными импульсами длительностью 40 фс при 293 К. На задержке 20 фс спектральные изменения отражают выцветание полосы первичного донора Р при 870 нм после поглощения кванта света. В результате первичный донор электрона Р переходит в первое возбужденное синглетное состояние Р*, стимулированное излучение которого представляет собой отрицательное поглощение в дифференциальном спектре. В начальный момент времени максимум стимулированного излучения из Р* совпадает с

максимумом поглощения Р, а затем, через ~40 фс, сдвигается с 870 до 910 нм в результате колебательной релаксации возбужденного димера Р*. Спустя десятки фемтосекунд после поглощения света в дифференциальных спектрах наблюдаются отрицательные изменения поглощения при 940 нм, амплитуда которых растет в диапазоне от 20 до 480 фс. Одновременно с этим прогрессируют положительные изменения поглощения в области 1060 - 1100 нм.

1080

Длина волны, нм

Рис. 1 Дифференциальные спектры поглощения РЦ Rba. sphaeroides дикого типа, полученные на задержке 20 фс (кривая 1) и 480 фс (кривая 2) после возбуждения при 870 нм 40-фс импульсами при 293 К. Дифференциальный спектр поглощения на задержке 480 фс был аппроксимирован функциями Гаусса. На вставке показано увеличение поглощения при длине волны >1050 нм на задержках 20, 100, 250 и 480 фс

На Рис. 2 показаны кинетики изменений поглощения, измеренные после возбуждения первичного донора Р при 870 нм 40-фс импульсами при временных задержках от -0,2 до 2 пс. Кинетики стимулированного излучения при 940 нм (Рис. 2 (»)) и увеличения поглощения при 1080 нм (Рис. 2 (•)) совпадают и смещены по времени относительно кинетики выцветания Р при 870 нм на 180 фс. Виден также рост поглощения в области 1060 - 1100 нм с последующим появлением и нарастанием полосы при 1020 нм. Увеличение оптической плотности при 1020 нм сопровождается заметным уменьшением стимулированного излучения при 935 - 940 нм и некоторым уменьшением в полосе поглощения при 1060 - 1100 нм. На задержке 1,5 пс полоса при 1020 нм становится сравнимой по амплитуде с положительным поглощением при 1080 нм. В обоих случаях изменения поглощения при 1020 нм являются результатом

переноса электрона от Р* к молекуле ВА, что приводит к образованию состояния с разделенными зарядами Р+ВА~.

Время, фс

Рис. 2. Кинетики ДА РЦ Rba. sphaeroides при 870 нм (о), 940 нм (*), 1080 нм (•) и 1020 нм (А), измеренные в диапазоне -400 - 2000 фс после возбуждения при 870 нм 40-фс импульсами при 293 К

В соответствии с современными представлениями, отрицательная полоса с максимумом при 940 нм принадлежит стимулированному излучению из возбужденного состояния первичного донора электрона Р*, возможно с примесью состояния с разделенными зарядами. В этом случае увеличение поглощения в области 1060 - 1100 нм, рост кинетки которого совпадает с ростом кинетики изменения поглощения при 940 нм, может принадлежать поглощению катион-радикала бактериохлорофилла - например, одной из молекул специальной пары Р - Рд6^ или возбужденному состоянию Р*.

Данные результаты позволяют предположить, что стимулированное излучение с максимумом при 940 нм стало следствием образования возбужденного состояния первичного донора Р* с разделенными зарядами (Ра5+Рв5' ) через -180 фс после поглощения света. Амплитуды изменений поглощения при 940 нм и 1080 нм достигают максимума на задержках -300 -400 фс, после чего начинается их затухание, которое сопровождается нарастанием полосы анион-радикала ВА~ при 1020 нм, что, в свою очередь, отражает перенос электрона на молекулу ВА.

В то время как кинетики изменения поглощения при 940 и 1080 нм совпадают, кинетики затухания при тех же длинах волн различаются. Поглощение при 940 нм затухает со временем жизни ~3 пс вследствие переноса электрона на ВА и НА. Как видно из Рис. 2, поглощение при 1080 нм затухает медленнее, что,

вероятнее всего,

обусловлено нарастанием в этой области поглощения катион-радикала Р+, компонента состояний РЪЛ~ и P+BAHA~, чей спектр поглощения в этой области

представляет собой бесструктурную

полосу.

Длина волны, нм

Рис. 3 Дифференциальные спектры поглощения РЦ мутантов L173HL (А) и M202HL (Б), измеренные в диапазоне длин волн 640 - 1150 нм с задержками от -20 фс до 260 фс после возбуждения при 870 нм 40-фс импульсами при 293 К

Из Рис. 2 видно, что положительное изменение поглощения при 1020 нм (кривая становится заметным, когда изменения поглощения при 940 и 1080 нм достигают насыщения, а рост поглощения при 1020 нм сопровождается уменьшением поглощения при 940 и 1080 нм. Такую закономерность можно объяснить переходом состояния с разделенными зарядами внутри специальной пары Р*(Ра54Рв5~) в состояние Р+ВА~ вследствие переноса электрона с Р* на первичный акцептор ВА.

Увеличение поглощения в диапазоне 1060 - 1100 нм, наблюдаемое на ранних задержках, может принадлежать как катион-радикалу бактериохлорофилла димера РА5+, так и анион-радикалу Рв6-. Для уточнения природы полосы около 1100 нм были проведены измерения на мутантах, в которых молекула РА или Рв заменена на бактериофеофитин (БФео). Такой димер принято называть гетеродимером и обозначать как D. В этом случае

9

электронная плотность димера D* смещена на молекулу 1)БФео, которая обладает большим окислительно-восстановительным потенциалом. Ранее было продемонстрировано, что в мутантных РЦ L173HL и M202HL под действием света происходит образование состояний Ds^Dae«^6- и Da ^ввоео^ соответственно.

Измерения, проведенные с использованием 40-фс разрешения, показывают (Рис. ЗА и ЗБ), что на задержке ~0 фс (когда выцветание полосы D в мутантах при 850 нм достигает половины от максимума) появляются полосы при 660-670 нм, 960 нм и 1080 нм. А предыдущие исследования ряда лабораторий обнаружили, что анион-радикал бактериофеофитина поглощает при 660 и 960 нм. Очевидно, что присутствие этих полос в дифференциальных спектрах мутантов обусловлено образованием БФео~ внутри D* (Db6+DAMco5" в РЦ L173HL и DA5+DBEi,c05~ в РЦ M202HL), поскольку перенос электрона на молекулу НА за это время невозможен. Полоса при 1080 нм, по амплитуде почти равная полосе при 960 нм, может принадлежать поглощению катион-радикала DBS+ в мутанте L173HL и DAS+ в мутанте M202HL, по аналогии с полосой при той же длине волны в РЦ дикого типа (Рис. 1,2), появляющейся с задержкой в -180 фс.

Из Рис. ЗА и ЗБ следует, что в РЦ гетеродимерных мутантов на ранних задержках (-20 - 260 фс), когда амплитуда стимулированного излучения еще мала, можно наблюдать образование полос при 960 нм (ОвФе/~) и -1080 нм (DB(a)5+)- Отсутствие задержки при образовании полос при 660, 960 и —1080 нм в РЦ гетеродимерных мутантов связано, скорее всего, с отсутствием энергетического барьера при разделении зарядов внутри гетеродимера.

Можно сделать вывод, что полоса при -1080 нм в дифференциальных спектрах РЦ дикого типа также принадлежит поглощению катион-радикала бактериохлорофилла - скорее всего РА6+, так как состояние Р*(РА гв5"), по данным теоретических расчётов [Parson and Warshel, 1987], должно быть энергетически более выгодным по сравнению с состоянием в ). Полоса

же второй половины димера (Рв5-), которая, по аналогии с полосой мономерного БХл, должна наблюдаться в районе 1020 нм, полностью маскирована стимулированным излучением (Рис. 1).

Разделение зарядов в мутантных реакционных центрах Rhodobacter

sphaeroides_с повышенным_окислительно-восстановительным

потенциалом первичного донора электрона Р

Эксперименты с использованием техники мутагенеза показали, что водородные связи между остатками гистидина и карбонильными группами молекул БХл специальной пары Р оказывают существенное влияние на его окислительно-восстановительный потенциал, который в РЦ дикого типа равен -500 мВ. Замена фенилаланина в положении 197 М-субъединицы белка на гистидин приводит к образованию водородной связи между остатком гистидина и второй ацетильной группой молекулы Рв, при этом потенциал первичного донора увеличивается на -125 мВ. Замены лейцина на гистидин в

положениях 1Л31 и М160 вызывают образование водородных связей между остатками гистидипа и 9-кето группами РА и Рв соответственно, что отражается в увеличении потенциала Р на ~80 мВ в первом случае и на -60 мВ во втором. Исследования показали, что изменения потенциала при аминокислотных заменах носят аддитивный характер. Так, потенциал первичного донора электрона Р в РЦ мутанта М160ЬН/Ь131ЬН/М197РН, несущего все три

указанные замены,

увеличивается на -260 мВ, по сравнению с диким типом.

Рис. 4. Дифференциальные спектры свет-минус-темнота РЦ дикого типа (А) и тройного мутанта М160Ш /1Л31Ш/ М197РН (Б), измеренные с

0,006

0,003

. 0,000

-0,003

-0,006

различными задержками

На

временными

950

1000

1050

1100

1150

Длина волны (нм)

рисунке 4 приведены дифференциальные спектры поглощения РЦ

дикого типа (Рис. 4А) и тройного мутанта

M160LH/L131LH/M197F Н (Рис. 4Б) в области 9201150 нм, измеренные при различных временных задержках после

возбуждения 40-фс

импульсами при длине волны 870 нм и комнатной температуре. В результате поглощения света первичный донор электрона Р переходит в возбужденное состояние Р*, стимулированное излучение из которого проявляется в спектре в виде отрицательного поглощения в области <930 нм. Примерно через -150 фс наблюдается сдвиг стимулированного излучения в длинноволновую область, сопровождаемый появлением положительного поглощения в области -1100 нм, которое достигает максимума за 300-400 фс (Рис. 4, точечно-пунктирная линия).

В ходе экспериментов выяснилось, что эти изменения в спектрах поглощения могут отражать процесс разделения зарядов внутри димера первичного донора электрона Р с образованием состояния P*(Pa5+Pb5+X а -1100 нм может принадлежать катион-радикалу РА • С

0,006

0,003

0,000

-0,003

-0,006

-0,009

950

1000 1050 Длина волны (нм)

1100

1150

поглощение при

дальнейшим ростом задержки в спектрах поглощения РЦ дикого типа и мутантов с одиночными аминокислотными заменами начинает появляться полоса при 1020 нм, приписываемая поглощению анион-радикала мономерного бактериохлорофилла активной цепи ВА~ (Рис. 4, пунктирная линия). Тем не менее, значительного уменьшения поглощения при ~1100 нм не происходит, по-видимому, из-за образования в то же самое время состояния Р+, спектр поглощения которого в этой области представляет собой бесструктурную «подставку».

Различная скорость нарастания полосы при 1020 нм в мутантах отражает скорость переноса электрона от Р* к ВА и согласуется со временем жизни стимулированного излучения состояния Р*. На поздних задержках, когда стимулированное излучение из состояния Р+ уже отсутствует, спектр фотоиндуцированных изменений поглощения в области 920 — 1150 нм для РЦ дикого типа (Рис. 4А, сплошная линия) и одиночных мутантов в основном обусловлен поглощением состояний Р+ и НА~ в области 950 нм, а также остаточным поглощением состояния ВА~ в области 1020 нм. Кинетические кривые поглощения при 935 нм удовлетворительно аппроксимировались с помощью двух экспонент (Таблица 1).

В тройном мутанте полоса поглощения при 1020 нм отсутствует на временах от единиц до сотен пикосекунд, когда стимулированного излучения из Р* уже нет (Рис. 4Б, сплошная линия), а спектр поглощения в области 9201150 нм не соответствует спектру поглощения катион-радикала Р+. Отсюда можно сделать вывод, что в данном мутанте не происходит перенос электрона от Р* ни на молекулу БХл ВА, ни на молекулу БФео НА, а затухание стимулированного излучения обусловлено переходом Р* в основное состояние.

Таблица I. Параметры аппроксимации кинетик изменения поглощения при 935 нм РЦ КЬа. зркагго1с1е$. АЕт - изменение окислительно-восстановительного потенциала Р по сравнению с РЦ дикого типа ^\УТ)____

Т1 (пс) А,(%) т2(пс) А2(%) Д£т(мВ)

\УТ 2,9 80 15,5 20 0

М160Ш 3,7 70 17,0 30 60

Ы31Ш 4,5 40 20,0 60 80

М197РН 2,2 50 10,2 50 125

М160ЬН/Ы31ЬН/М197РН 12,0 17 137 83 260

Наши данные свидетельствуют о том, что гетерогенность кинетик стимулированного излучения Р* в РЦ одиночных мутантов растет с повышением потенциала Р. Такая закономерность вполне объяснима с позиции модели обратного переноса Р*«—Р^Вл" - рост гетерогенности кинетик может быть результатом роста скорости обратного переноса и одновременно замедления скорости прямого переноса электрона вследствие повышения уровня энергии состояния Р^ТЗд" относительно состояния Р* в мутантах. Перепое электрона в РЦ замедляется по мере увеличения окислительно-восстановительного потенциала первичного донора электрона Р, что выражается в увеличении амплитуды медленного компонента кинетики.

12

Из этого ряда выпадает лишь мутант M197FII, у которого окислительно-восстановительный потенциал Р повышен на 125 мВ, тогда как скорость переноса электрона на ВА близка к таковой у дикого типа. Одно из объяснений этого явления заключается в предположении, что замена лейцина на гистидин в положении М197 приводит, помимо увеличения потенциала Р, к увеличению потенциала анион-радикала мономерного бактериохлорофилла ВА.

Исследования выявили, что в нативпых РЦ Rba. sphaeroides уровень Р+ВА- находится ниже уровня Р* на 50-70 мВ. Так как в мутанте L131LH величина окислительно-восстановительного потенциала Р повышена на 80 мВ, по сравнению с нативными РЦ, то уровень состояния РВА~ теоретически должен быть выше уровня состояния Р*, что должно приводить к существенному замедлению переноса электрона на молекулу ВА. В экспериментах при низкой температуре (90 К) полосу ВА~ при 1020 нм в РЦ мутанта L131LH регистрировать не удавалось. Как следует из наших данных, полоса ВА~ хорошо регистрируется при комнатной температуре, хотя ее амплитуда и понижена. Это указывает на то, что энергетический зазор (AG) между состояниями и Р* в мутанте L131LH, скорее всего, не намного больше величины энергии AT при комнатной температуре (—25 мВ), и, следовательно, в диком типе величина AG близка к 60 мВ.

Остаточная полоса ВА~ присутствует в дифференциальных спектрах поглощения РЦ дикого типа (Рис. 4) и одиночных мутантов на временных задержках, когда перенос электрона на молекулу БФео уже завершен. Это можно объяснить наличием термодинамического равновесия между состояниями Р+ВА и Р+НА~ при комнатной температуре. Данный факт согласуется с ранее выдвигавшимся предположением о том, что на временах порядка десятков пикосекунд разность в свободной энергии состояний Р* и Р+НА~ мала (~90 мВ) и лишь через сотни пикосекунд, в результате конформационных изменений белкового окружения, происходит релаксация радикального состояния и AG(P*/P+Ha") увеличивается до -200-250 мВ, чем обеспечивается необратимость реакции.

Фемтосекундное разделение зарядов в высушенных пленках реакционных центров ЯЪойоЪа^ег svhaeтoides и СЫотоИехш аигапИаст

Показано, что возбуждение Р в РЦ пурпурных бактерий сверхкороткими (<30 фс) лазерными импульсами с широким спектром приводит к осцилляциям в кинетике спада стимулированного излучения Р* с частотами 10-400 см"1. Эти данные объясняются формированием и когерентным распространением ядерного волнового пакета на поверхности потенциальной энергии возбужденного состояния Р*. Волновой пакет, образующийся при взаимодействии системы с суперкоротким импульсом (<30 фс), представляет собой суперпозицию волновых функций нескольких колебательных уровней возбужденного состояния. Интересно, что волновой пакет ведет себя как квазиклассическая частица.

Из-за того, что положение волнового пакета на поверхности потенциальной энергии зависит от времени, а также из-за относительного смещения поверхностей Р* и Р, полоса стимулированного излучения Р* имеет коротковолновый (~900 нм) и длинноволновый (930-940 нм) максимумы. Осцилляции в обоих максимумах противоположны одна другой по фазе, но имеют одинаковые частоты.

После того как волновой пакет образован на поверхности потенциальной энергии состояния Р*ВА, он начинает движение по этой поверхности в сторону длинноволновой области стимулированного излучения при 935-940 нм и приходит в точку пересечения поверхностей состояний Р* и Р+ВА" через 120 фс с образованием полосы ВА~ при 1020 нм. Когерентные компоненты удалось обнаружить в кинетике состояния с разделенными зарядами Р^ВдГ в РЦ ЯЬа. зрЬаегоЫез Я-26, а именно: в кинетике полосы поглощения при 1020 нм,

характерной для анион-радикала Ва~, в кинетике А выцветания ВА при 800 нм, а

_ также в кинетике

электрохромного сдвига з мономера БХл.

Б Фемтосекундные осцилляции ~ в кинетике стимулированного

_ излучения Р* при 945 нм и

_, поглощения ВА~ при 1028 нм

3 были найдены в РЦ С/х. ашап^асиБ при 90 К.

-ДА

о!

-ДА §1

Г2

1 2 Время, ПС

щ

со X

о

о.

е;

с

5 <

100

Частота, см

200 -1

300

Рис. 5. Кинетика АА при 940 нм (А), осциллирующая компонента кинетики (Б) и спектр преобразования Фурье

осциллирующей компоненты (В) сухих пленок РЦ С/х. аигапЧасш (жирные кривые) при возбуждении 20-фс импульсами при 870 нм. Кинетика измерялась при 90 К. Для сравнения тонкими кривыми приведены аналогичные данные для РЦ С/х. аигапйаст в буфере глицерин-вода. Числа у кривых -характерные частоты спектров преобразования Фурье

Ранее было показано, что удаление кристаллографической воды НОН55 из структуры РЦ посредством замены глицина на лейцин в положении М203 сопровождается исчезновением полосы при 32 см"1, приписываемой вращению молекулы воды, из Фурье-спектра осцилляций в кинетике при 1020 и приводит к замедлению переноса электрона от Р* к ВА более чем в 4 раза. Эти данные указывают на участие молекулы воды НОН55 в переносе электрона в РЦ ЯЬа.

и

sphaeroides. Предполагалось, что НОН55 образует между молекулами ВА и Рв мостик из водородных связей через His М202, которые облегчает перенос электрона с Р* на ВА. Структура РЦ Cfx. aurantiacus до сих пор не известна, а также нет данных о существовании аналога молекулы воды НОН55 в данных РЦ.

Мы изучали высушенные пленки РЦ Rba. sphaeroides и Cfx. aurantiacus методом фсмтосекундной спектроскопии, возбуждая РЦ при 870 нм 20-фс импульсами при 90 К.

Нсосциллирующая часть кинетики АА пленок РЦ Cfx. aurantiacus при 940 нм затухает в 1,2 раза медленнее по сравнению с водными РЦ той же бактерии (Рис. 5А). Таким образом, при высушивании РЦ Cfx. aurantiacus происходит замедление первичной реакции разделения зарядов.

Осцилляции в кинетике Cfx. aurantiacus при 940 нм имеют начальный период -220 фс (Рис. 5Б). Амплитуда этих осцилляции в кинетике сухих пленок

РЦ незначительно меньше (на -15%), чем в кинетике РЦ в буфере. Фурье-спектр

осцилляций кинетики водных РЦ содержит слабые узкие полосы, большинство которых примерно кратны частоте 3537 см , а также полоса при 37 см"1 (Рис. 5В). Отметим, что в Фурье-спектре кинетики сухих пленок РЦ не наблюдается полос с частотами, кратными 35-37 см"1, однако присутствует небольшая узкая полоса при 37 см"1.

Рис. 6. Кинетика ДА при 1028 нм (А), осциллирующая компонента кинетики (Б) и спекгр преобразования Фурье

осциллирующей компоненты (В) сухих пленок РЦ Cfx. aurantiacus (жирные кривые) при возбуждении 20-фс импульсами при 870 нм. Кинетика измерялась при 90 К. Для сравнения тонкими кривыми приведены аналогичные данные для РЦ Cfx. aurantiacus в буфере глицерин-вода

Анион-радикал мономерного БХл ВА" в спектре АА РЦ Cfx. aurantiacus поглощает при 1028 нм. Фурье-спектр осцилляций водных РІД Cfx. aurantiacus при 1028 нм содержит узкие интенсивные полосы при 35 и 109 см"1, менее

100 200 Частота, см"1

300

интенсивные узкие полосы при 52 и 72 см-1 (Рис. 6В). При высушивании РЦ С/х. аигапйасиз происходит сильное уменьшение поглощения ВЛ при 1028 нм в 5-10 раз (Рис. 6А, 6Б). Амплитуда начальных осцилляций в кинетике сухих пленок РЦ с периодом -200 фс уменьшена в ~3 раза по сравнению с водосодержащими РЦ. Фурье-спектр осцилляций сухих пленок РЦ содержит слабые полосы при 37 и 90 см-1.

Таким образом, обнаружено замедление процесса разделения зарядов, уменьшение амплитуды осциллирующих компонент и обеднение их спектра при высушивании РЦ С/х. аигапИасш. Этот результат согласуется с полученными ранее данньми в мутанте М2030Ь ЯЬа. sphaeroid.es, в котором вода НОН55 стерически удалена, а также в сухих пленках феофитинмодифицированных РЦ ЯЬа. зркаегоісіех 11-26.

В сухих пленках РЦ ЯЬа. зрНаегогйея спад вынужденного излучения Р* замедляется по сравнению с таковым в РЦ в буфере глицерин-вода в 1,7 раза, а в сухих пленках РЦ С/х. аигапИасиБ — в 1,2 раза. В мутанте ЯЬа. яріилегоісіез М203вЬ отмечалось четырехкратное замедление спада Р*. Причиной этому могло быть неполное удаление воды из РЦ при их высушивании. Мода 32 см-1 и ее обертоны являются вращательными модами воды и они не проявляются в аналогичных кинетиках мутанта М203СЬ ЯЬа. аріїаегоісіез, где вода НОН55 отсутствует. В РЦ С/х. аигаШасш аналогом моды 32 см-1 является, вероятно, мода 35-37 см-1. Полученное в настоящей работе при высушивании РЦ уменьшение амплитуд этих фундаментальных мод в Фурье-спектре осцилляций примерно в 2 раза, а также существенное уменьшение амплитуд их обертонов подтверждают принадлежность этих мод к вращению воды. Наиболее сильно высушивание РЦ проявляется в кинетике полосы ВА~ С/х. аигапйаст.

Таким образом, представленные результаты явно свидетельствуют о том, что молекула кристаллографической воды НОН55 оказывает сильное влияние на первичное разделение зарядов в РЦ или прямо участвует в этом процессе. Полученные данные подтверждают предположение, что и в РЦ С/х. аигапііаст присутствует молекула (или молекулы) воды, играющая ту же роль, что и молекула НОН55 в РЦ ЯЬа. яркаегоісіеї.

ВЫВОДЫ

1. Переносу электрона на первичный акцептор ВА предшествует сверхбыстрое разделение зарядов внутри димера специальной пары Р с образованием состояния Р*(РА5+РвЪ- В РЦ дикого типа, а также мутантов 1Л73НЬ и М202НЬ в дифференциальных спектрах свет-минус-темнота в ближнем ИК-диапазоне найдена полоса при ~1100 нм, предположительно принадлежащая поглощению катион-радикала одной из молекул бактериохлорофилла специальной пары - РА5+.

2. Впервые показано непосредственное участие молекулы мономерного бактериохлорофилла ВА в переносе электрона в мутантных РЦ с повышенным потенциалом первичного донора Р.

3. Положение уровня свободной энергии состояния Р+ВА" по отношению к уровню Р* в РЦ Rba. sphaeroides дикого типа на ранних задержках, по нашим оценкам, составляет величину около 60 мВ при комнатной температуре.

4. Наши данные указывают на то, что разность свободной энергии между состояниями Р+ВА~НА и Р+ВАНА~ в РЦ Rba. sphaeroides с восстановленным Qa на временах до нескольких десятков пикосекунд составляет величину порядка кТ при комнатной температуре.

5. Получены экспериментальные свидетельства того, что молекула кристаллографической воды НОН55 оказывает сильное влияние на первичное разделение зарядов в РЦ Rba. sphaeroides либо прямо участвует в этом процессе. Наши данные подтверждают предположение, что и в РЦ Cfx. aurantiacus присутствует молекула (или молекулы) воды, играющая ту же роль, что и молекула НОН55 в РЦ Rba. sphaeroides.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Хатыпов P.A., Хмельницкий А. Ю., Христин А. М., академик Шувалов В. А. (2008) Фемтосекундное образование полос поглощения при 1080 и 1020 нм как отражение состояний РА6+Рв^~ и Р+ВА~ в фотосинтетических реакционных центрах пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Доклады Академии Наук, 430, 416-420.

2. Khatypov R. A., Khmelnitskiy A.Yu., Khristin А. М., Fufina Т. Yu., Vasilieva L. G., Shuvalov V. A. (2012) Primary charge separation within P870* in wild type and heterodimer mutants in femtosecond time domain. Biochimica et Biophysica Acta, 1817,1392-1398.

3. Яковлев А. Г., Хмельницкий А. Ю., Шувалов В. A. (2012) Фемтосекундное разделение зарядов в сухих плёнках реакционных центров Rhodobacter sphaeroides и Chloroflexus aurantiacus. Биохимия, 77, 555-567.

4. Хмельницкий А. Ю., Хатыпов Р. А., Христин А. М.,. Леонова М. М,. Васильева Л.Г., Шувалов В.А. (2013) Разделение зарядов в мутантных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides с повышенным потенциалом первичного донора электрона Р. Биохимия, 78, 82-91.

Тезисы докладов

5. Хмельницкий А.Ю., Яковлев А.Г., Шкуропатов АЛ., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. Фемтосекундная спектроскопия мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides с измененным редокс потенциалом первичного донора электрона, XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу н Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Тезисы докладов, 2005, с. 63.

6. A.Y. Khmelnitskiy, R.A. Khatypov, А.М. Khristin, V.A. Shuvalov. Light-induced formation of intradimer charge separation state PA8+PB6" in

17

photosynthetic reaction centers of purple bacteria Rhodobacter sphaeroides. 15th International Congress of Photosynthesis, Beijing, China, August 22-27, 2010. Book of abstracts p. 26.

7. Хмельницкий А., Хатыпов P., Христин А., Леонова M., Шувалов В. Фемтосекундные процессы разделения зарвдов в реакционных центрах Rba. sphaeroides с измененным потенциалом первичного донора электрона. Сборник тезисов VI съезда Российского фотобиологического общества, 15-22 сентября 2011 г., пос. Шепси, Россия, с. 31.

8. Khatypov R. A., Khmelnitskiy A.Yu., Zakharchenko A.V., Khristin A.M., Vasilieva L.G., Shuvalov V. A Primary charge separation within P870* in WT and mutants of heterodimers of P in femtosecond time domain. Book of abstracts of International Meeting "Photosynthesis Research for Sustainability", July 24-30,2011, Baku, Azerbaijan, p 96.

Подписано в печать:

24.04.2013

Заказ № 84 ] 7 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwvv.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хмельницкий, Антон Юрьевич, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

0420135^305

на правах рукописи

Хмельницкий Антон Юрьевич

ФЕМТОСЕКУНДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОЦЕССА РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ

03.01.04- биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: академик В.А. Шувалов

Пущино-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1 Общая характеристика фотосинтеза 9

1.1.1 Антенны и процесс переноса энергии 9

1.1.2 Первичный перенос электрона в бактериальных реакционных центрах 10

1.2 Фотосинтез в аноксигенных бактериях 12

1.2.1 Система антенн 14

1.2.2 Перенос энергии в пурпурных бактериях 16

1.2.3 Структура бактериальных реакционных центров 17

1.2.4 Кофакторы РЦ фотосинтезирующих бактерий и влияние белкового окружения

на их физико-химические свойства 18

1.2.5 Оптический спектр РЦ ЛЬа. зрИаего1с1е$ 29

1.3 Начальные стадии переноса электрона в бактериальных РЦ 31

1.3.1 Теоретический анализ переноса электрона 31

1.3.2 Спектральные и кинетические свойства возбужденного состояния первичного донора электрона Р ЯЬа. 8р]гаего1с1е$ 34

1.3.3 Перенос электрона от Р* на ВА и далее на молекулу НА в РЦ КЪа. зр}гаего1с1е.<; 36

1.3.4 Особенность начальных стадий переноса электрона в РЦ с. аигстИасш 39

1.3.5 Связь когерентного движения ядер с переносом электрона в бактериальных реакционных центрах 40

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 44

2.1 Молекулярно-биохимические методы 44

2.1.1 Генетические системы для направленного мутагенеза ЯЬа. $рИаего1с1е$ 44

2.1.2 Методы генной инженерии 44

2.1.3 Выращивание мутантных штаммов и выделение РЦ 48

2.1.4 Приготовление образцов для измерений 49

2.2 Оптическая спектроскопия сверхбыстрого временного разрешения 49 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 54

3.1 Разделение зарядов внутри первичного донора электрона Р в нативных и мутантных реакционных центрах 54

3.2 Разделение зарядов в мутантных реакционных центрах Ккос1оЪас1ег 5ркаего'к1е$ с повышенным окислительно-восстановительным потенциалом первичного донора электрона Р 67

3.3 Фемтосекундное разделение зарядов в сухих пленках реакционных центров Шю(1оЬас1ег зрЬаегохйеь и СЫогоАехш аигапйасиь 76

ВЫВОДЫ 92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

L131LH - реакционный центр, в котором лейцин в позиции L131 заменен на гистидин M160LH - реакционный центр, в котором лейцин в позиции L160 заменен на гистидин M197FH - реакционный центр, в котором фенил ал анин в позиции М197 заменен на гистидин M202HL - реакционный центр, в котором гистидин в позиции М202 заменен на тирозин L173HL - реакционный центр, в котором гистидин в позиции L173 заменен на лейцин M160LH/L131LH/M197FH - реакционный центр, в котором лейцин в положении L160, лейцин в положении L131 и фенилаланин в положении М197 заменены на лейцин ОВ - окислительно-восстановительный

Qa, Qb - первичный и вторичный хинонный акцептор электрона

РЦ - реакционный центр

Rba. - Rhodobacter

Cjx. - Chloroflexus

Ble. - Blastochloris

АТФ - аденозинтрифосфат

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат (Б)Фео - (бактерио)феофитин (Б)Хл - (бактерио)хлорофилл

ВА, Вв - мономерный бактериохлорофилл A-цепи и В-цепи кофакторов переноса электрона

ДЭАЭ целлюлоза - диэтиламиноэтил целлюлоза

К - градус Кельвина

к - константа Больцмана

G - свободная энергия Гиббса

LB среда - среда Лурия-Бертани

ЛДАО - лаурилдиметиаминоксид

НА, Нв - бактериофеофитин A-цепи и В-цепи цепи кофакторов переноса электрона ПЦР - полимеразная цепная реакция пс - пикосекунда фс - фемтосекунда

Р - димер бактериохлорофилла, первичный донор электрона, специальная пара D - димер бактериохлорофилла и бактериофеофитина, первичный донор электрона гетеродимер-ных реакционных центров

Ра, Рв - бактерихлорофиллы, образующие первичный донор электрона

РЦ - реакционный центр

LH - светособирающий комплекс

ТЛ буфер - Трис-ЛДАО буфер

ТТ буфер - Трис-Тритон буфер

ФСЕ - фотосинтетическая единица

ВЦМ - внутрицитоплазматическая мембрана

ЦМ - цитоплазматическая мембрана

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Фотосинтез растений и водорослей является основным источником кислорода и органических соединений на Земле, которые служат для питания человека и различных живых организмов, а также запасены в виде ископаемых углеводородов. Преобразование солнечной энергии в химическую начинается с разделения зарядов в специализированных пигмент-белковых комплексах, называемых реакционными центрами (РЦ) и входящими в состав цитоплазматических мембран бактерий и мембран хлоропластов растений. Эффективность данного процесса исключительно высока (~60%), а квантовый выход первичных стадий близок к 100 %.

По ряду причин особую роль в изучении начальных стадий фотосинтеза играют бактериальные РЦ, в особенности РЦ пурпурных несерных бактерий. Они относительно легко и в больших количествах выделяются, сохраняя свою функциональную активность в течение нескольких дней при хранении в темноте при комнатной температуре. Структура РЦ пурпурных бактерий была определена кристаллографически еще в 80-х годах прошлого века. В отличие от РЦ растений и цианобактерий она сравнительно проста, в ней меньше кофакторов, причем большинство из них имеет хорошо различимые полосы поглощения в спектре РЦ. И, наконец, для реакционных центров пурпурных бактерий разработаны методы сайт-направленного мутагенеза, позволяющие делать точечные аминокислотные замены в белковых субъединицах РЦ.

Начальные стадии разделения зарядов и переноса электрона в РЦ проходят с очень высокой скоростью - порядка пикосекунд. Для изучения столь быстрых реакций используется спектроскопия с фемтосекундным разрешением. К тому же фемтосекундная спектроскопия предоставляет возможность исследовать ядерные движения кофакторов и белка, которые могут вызывать или сопровождать реакции переноса электрона. Идентификация же когерентных сигналов колебаний или вращений молекулярных групп, связанных

с хромофорами и молекулами окружения, также может дать информацию о путях начального переноса электрона. А внесение аминокислотных замен вблизи кофакторов переноса электрона позволяет изменять их физико-химические свойства.

Изучая мутантные реакционные центры Ююс1оЬаМег (ЯЬа.) $ркаего1с1е$, мы пытаемся определить роль белкового окружения кофакторов в процессе разделения зарядов и динамику переноса электрона в РЦ, чтобы в итоге выяснить, чем же обусловлен поразительно высокий, близкий к 100 процентам, квантовый выход первичного разделения зарядов. В связи с этим особенно интересны детали динамики возбужденного состояния димера специальной пары, а также первого состояния с разделенными зарядами Р+ВА~.

Недавно было показано, что молекула воды, находящаяся между молекулой специальной пары и ВА(НОН55), может участвовать в процессе разделения зарядов в РЦ пурпурной бактерии ЯЬа. 8ркаего1с1е5. Чтобы ответить на вопрос об универсальности такого механизма переноса электрона на первичный акцептор с участием молекулы воды для бактерий необходимо изучение РЦ других бактерий, например зеленой несерной бактерии СМого/1ехш (С/х) аигапНаст, ставшей вторым объектом настоящей работы.

Цели и задачи исследования. Целью являлось исследование механизма первичного разделения зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии ЯЬа. Брр1аего1с1е8 и зеленой несерной бактерии С/х. аигапИаст методом фем-тосекундной спектроскопии. Ставились следующие задачи:

1. Фемтосекундные исследования РЦ дикого типа и мутантных РЦ ЯЬа. яркаегогс^ея Ь173НЬ и М202НЬ, в которых одна из молекул бакте-риохлорофилла димера специальной пары заменена на бактериофеофи-тин.

2. Исследование разделения зарядов в мутантных РЦ ЯЬа. sphaeroides с повышенным окислительно-восстановительным потенциалом первичного донора электрона Р.

3. Исследование высушенных пленок РЦ ЯЪа. 8рЬаего1йе8 и С/х. аигапйа-сш методом когерентной оптической спектроскопии с фемтосекунд-ным разрешением.

Научная новизна работы. Получены данные, указывающие на то, что переносу электрона на первичный акцептор ВА предшествует сверхбыстрое разделение зарядов внутри димера специальной пары Р. В РЦ дикого типа и мутантов в дифференциальных спектрах свет-минус-темнота в ближнем ИК-диапазоне найдена полоса, предположительно принадлежащая поглощению катион-радикала одной из молекул бактериохлорофилла (БХл) специальной пары - РА6+. Впервые продемонстрировано непосредственное участие молекулы мономерного бактериохлорофилла ВА в переносе электрона в мутант-ных РЦ с повышенным потенциалом первичного донора Р. Обнаружены также свидетельства того, что положение уровня свободной энергии состояния P*BA по отношению к уровню Р* на ранних задержках составляет величину порядка энергии кТ при комнатной температуре. В результате экспериментов выяснилось, что молекула кристаллографической воды НОН55 оказывает сильное влияние на первичное разделение зарядов в РЦ Rba. sphaeroides, либо прямо участвует в этом процессе. Наши данные подтверждают предположение, что и в РЦ Cfx. aurantiacus присутствует молекула (или молекулы) воды, играющая ту же роль, что и молекула НОН55 в РЦ Rba. sphaeroides. Практическая значимость работы. Полученные данные о начальных стадиях разделения зарядов в бактериальных реакционных центрах важны с точки зрения создания оптимальных искусственных преобразователей солнечной энергии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на трех международных конференциях: «Преобразование света при фотосинтезе» (Пущино, Россия, 2008), «15th International Congress of Photosynthesis» (Beijing, China, 2010) и «Photosynthesis Research for Sustainability» (Baku,

Azerbaijan, 2011), а также на VI съезде Российского фотобиологического общества (Шепси, Россия, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ, в том числе четыре в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика фотосинтеза

Фотосинтез — это биологический процесс преобразования солнечной энергии в химическую, которая необходима для поддержания жизни организма. Фотосинтез растений и водорослей является основным источником кислорода и органических соединений на Земле, которые служат основой питания человека и всевозможных живых организмов, а также запасены в виде ископаемых углеводородов.

Наиболее распространена форма фотосинтеза с участием хлорофилл-подобных пигментов в серии светоиндуцируемых реакций переноса электрона. Таким способом энергию получают растения, водоросли, цианобактерии, а также аноксигенные (не выделяющие кислород) фотосинтезирующие бактерии. Начальные стадии фотосинтеза осуществляются встроенными в ли-пидные мембраны пигмент-содержащими белками. Более поздние стадии процесса проходят с участием белков и хинонов, которые свободно диффундируют в водной среде или липидной фазе.

Фотосинтез принято разделять на четыре различные фазы, которые вместе образуют единый законченный процесс - начиная от поглощения фотона и заканчивая образованием химически стабильных продуктов: (1) поглощение света и транспорт энергии возбуждения системой антенн, (2) первичное разделение зарядов и перенос электрона в реакционных центрах, (3) стабилизация энергии посредством вторичных процессов, (4) синтез и экспорт стабильных продуктов. Остановимся на двух первых стадиях подробнее.

1.1.1 Антенны и процесс переноса энергии

Для того, чтобы энергия света могла быть запасена в процессе фотосинтеза, сперва она должна быть поглощена одним из пигментов фотосинте-

тического аппарата. В результате поглощения фотона образуется возбужденное состояние, которое впоследствии приводит к разделению зарядов в реакционном центре. Таким образом, роль пигментов антенных комплексов сводится к поглощению света и доставке энергии к реакционному центру. Почти во всех случаях пигменты антенн связаны с белками, образуя хорошо структурированные комплексы. Помимо хлорофиллов в состав пигментов антенн могут входить каротиноиды, а также билины - тетрапирролы с открытой цепью, найденные в фикобилисомных антенных комплексах (В1апкепзЫр, 2002).

1.1.2 Первичный перенос электрона в бактериальных реакционных центрах

Преобразование энергии возбуждения в энергию разделенных зарядов происходит в реакционных центрах (РЦ), которые представляют собой встроенные в мембраны мультисубъединичные пигмент-белковые комплексы.

Реакционный центр бактерий содержит специальный димер пигментов, который служит первичным донором электрона в фотосинтезе. Данные пигменты химически идентичны (или почти идентичны) бактериохлорофиллам антенн, однако их аминокислотное окружение и взаимное расположение в РЦ наделяет их уникальными свойствами. Именно на этот димер в итоге переносится электронное возбуждение с антенных пигментов.

р

hv *

Р fast

Р+ А"

very fast

+ v D PAA

slow

Рис. 1. Общая схема переноса электрона в фотосинтетических реакционных центрах (ВкпкешЫр, 2002)

На Рис. 1 показана схема процесса, который наблюдается во всех бактериальных реакционных центрах. Первичный донор электрона (Р) переходит в возбужденное электронное состояние в результате поглощения фотона, либо, что наиболее вероятно, в результате переноса энергии с антенны. Возбужденный пигмент — это сильнейший восстановитель, а потому он быстро отдает электрон близлежащему электронному акцептору (А), образуя состояние с разделенными зарядами Р+А~. Так протекает первичная реакция фотосинтеза - энергия возбужденного электрона трансформируется в разность электрохимических потенциалов. Однако при этом существует высокая вероятность потери энергии в результате рекомбинации зарядов из-за переноса электрона от А- обратно к Р+. Избежать нежелательных последствий позволяет серия очень быстрых вторичных реакций переноса электрона, которые помогают разделить в пространстве положительный и отрицательный заряды за счет переноса электрона на вторичный акцептор А', в результате чего скорость рекомбинации падает на порядки.

В итоге менее чем за наносекунду окисленные и восстановленные соединения становятся разделенными расстоянием, приблизительно равным толщине биологической мембраны (~30А). Далее наступает черед более медленных процессов, которые приводят к дальнейшей стабилизации запасенной

энергии. Квантовый выход процесса чрезвычайно высок и достигает почти 1,0.

1.2 Фотосинтез в аноксигенных бактериях

Пурпурные несерные бактерии составляют большую группу фотосинтетических бактерий: 8 родов и 30 видов. К этой же группе принадлежит Rhodobacter sphaeroides — один из объектов исследования в данной диссертации. Отличительной особенностью аноксигенных фотосинтетических пурпурных бактерий является наличие внутрицитоплазматической мембраны (ВЦМ), которая представляет собой специализированную часть цитоплазма-тической мембраны (ЦМ) и содержит весь фотосинтетический аппарат бактерии. Такую структуру также называют фотосинтетической единицей (ФСЕ) (Рис. 2). ВЦМ образуется в результате впячивания ЦМ, образуя структуру в виде пузырька (Collins et al., 1991; Oelze and Drews, 1972; Drews and Golecki, 1995). Многие виды, включая Rba. sphaeroides, способны расти хемигетеро-трофно в темноте и в присутствии кислорода. В этом случае ВЦМ в плазматической мембране не образуется.

Рис.2. Структура ФСЕ пурпурных бактерий (Sener et al., 2007)

Фотосинтез также разделяют на два этапа: световые реакции, в результате которых образуются АТФ и НАДФН, и темновые реакции, позволяющие использовать энергию, запасенную в этих соединениях, для синтеза углеводов из СО2.

В Rba. sphaeroides световые реакции протекают в ВЦМ, где находятся светособирающие комплексы, РЦ и цитохромный комплекс bel. Сама мембрана действует как непроницаемый для ионов барьер, разделяя содержимое бактерии на два компартмента: периплазму и цитоплазму.

Процесс фотосинтеза начинается с поглощения фотона светособираю-щим (антенным) комплексом, который переносит возбуждение на первичный донор электрона в РЦ, называемый специальной парой (или просто спецпарой) Р, представляющий собой димер молекул бактериохлорофилла (БХл), расположенных около периплазматической стороны. Димер Р переходит в возбужденное синглетное состояние и вслед за этим донирует электрон ближайшему акцептору - молекуле БХл в активной цепи ВА. Далее электрон переносится на молекулу бактериофеофетина (БФео) НА, затем — на хинон активной цепи Qa и, наконец, — на хинон QB около цитоплазматической стороны мембраны. Во время последней реакции переноса электрона димер Р восстанавливается цитохромом водорастворимым белком периплазмы, за счет чего теперь второй фотон способен вызвать перенос еще одного электрона на QB, который в результате полностью восстанавливается до хинола.

Восстановленный таким образом QB принимает на себя два протона из цитоплазмы и покидает место связывания с РЦ в форме дигидрохинона QH2. Тем вре