Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и исследование мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides с аминокислотными заменами вблизи бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides с аминокислотными заменами вблизи бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов"

На правах рукописи

Хмельницкая Татьяна Игоревна

Получение и исследование мутантных реакционных центров Я1нн!оЬасГег $р1шего1с1е.ч с аминокислотными заменами вблизи бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов

Специальность 03.00 .04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г#

Пущино - 2008

003455981

Работа выполнена в лаборатории первичных процессов фотосинтеза Института фундаментальных проблем биологии РАН

Научные руководители:

академик, доктор биологических наук Шувалов ВладимирАнатолиевич кандидат биологических наук Васильева Людмила Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор биологических наук

Мамедов Махир Джафар оглы Цыганков Анатолий Анатолиевич

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится « 24 » декабря 2008 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 002.066.01 в Институте фундаментальных проблем

биологии РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино,

ул. Институтская, 2, Институт фундаментальных проблем биологии РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН

Автореферат разослан «_» ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотосинтез относится к тем важным процессам, за счет которых поддерживается жизнь на Земле. Преобразование энергии света в энергию химических связей происходит в реакционных центрах (РЦ) фотосинтеза. Структура и принципы функционирования реакционных центров пурпурных бактерий достаточно хорошо изучены, что позволяет использовать их для исследования механизмов первичных процессов фотосинтеза, а также в качестве модельных систем для изучения более сложных комплексов, таких, как фотосистема 2 растений. Бактериальный РЦ ЮгойоЪас1ег (КЪа.) ьркаегогйев представляет собой транс-мембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех белковых субъединиц и десяти кофакторов. Накопленные научные данные свидетельствуют о том, что белок РЦ играет не только структурную роль, обеспечивая оптимальное для переноса электрона взаимное расположение и ориентацию кофакторов внутри фотосинтетической мембраны. Показано, что определенное белковое окружение пигментов РЦ принципиально важно для эффективного первичного разделения зарядов. Одним из перспективных подходов к исследованию роли участков полипептидов РЦ в его функционировании является направленный мутагенез консервативных аминокислотных остатков в участках белка, ответственных за связывание кофакторов переноса электрона, с последующим изучением свойств модифицированных реакционных центров. Особенно интересна роль консервативных аминокислотных остатков, располагающихся вблизи бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов переноса электрона. Сочетание молекулярно-биологических, биохимических и биофизических методов, и, в частности, используемого в нашей лаборатории метода оптической спектроскопии высокого временного разрешения, позволяет получить новую информацию о механизмах образования и стабилизации состояния с разделенными зарядами Р+ВА~, Р+ВАНА~и Р+ВаНаРа.в~ в РЦ КЬа. зркаего'гйеБ.

Цель и задачи работы. Целью является изучение роли аминокислотных остатков, расположенных в непосредственной близости от молекул бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов переноса электрона, в процессе первичного разделения зарядов в реакционных центрах КЬа. 5ркаего1с1ез.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Создание генетической системы для направленного мутагенеза, позволяющей вносить точечные мутации в гены, кодирующие ЬиМ белковые субъединицы

РЦ КЪа. зрИаегоЫез и получать рекомбинантные штаммы со следующими фенотипами: ЯСПЛ 1нЪН2+, КС+Ш1+ЬН2", ЯС+ЬН1" Ш2~

2. Получение мутантных РЦ с замещениями аминокислотных остатков располагающихся вблизи бактериохлорофиллов Р и ВА: М210УЬ, M210YW, М210УЬ/М197БУ, М2061Н.

3. Исследование роли этих аминокислотных остатков в процессе разделения и стабилизации зарядов в РЦ.

Научная новизна работы. На основе сконструированной генетической системы для мутагенеза реакционного центра ЯЪа. БрНаегоЫеь впервые были получены мутантные РЦ М210УЪ/М197РУ и М2061Н. Были получены новые данные о динамике кофакторов и белка РЦ в процессе первичного разделения зарядов. При исследовании мутантных РЦ М210У\У и М2ЮУЪ методом фемтосекундной спектроскопии впервые было показано, что одним из основных факторов, определяющих высокую эффективность разделения зарядов и стабилизацию состояния с разделенными зарядами, является сочетание переноса электрона от первичного донора электрона Р* к первичному акцептору ВА и изменения ядерных координат за счет переориентации гидроксильной группы тирозина М210. Исследование спектральных свойств РЦ мутанта М2061Н позволило получить новую информацию о влиянии белкового окружения бактериохлорофиллов Рв и ВА на квантовую эффективность разделения зарядов и скорость переноса электрона в РЦ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной школе - конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на 10-м Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Барселона, Испания, 2000), на 5-й Всесоюзной школе- конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2001), на Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001), на Международных Пущинских чтениях по фотосинтезу (Пущино, 2002), на Международной научной конференции «Фотосинтез и получение урожая» (Киев, Украина, 2002), на 11-м Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Токио, Япония, 2003), на Международной конференции по первичньм процессам фотосинтеза (Пущино, 2003), на 29-м Конгрессе ФЭБС (Варшава, Польша, 2004), на 3-м Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на научной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), на Международном Биофизическом Конгрессе (Монпелье, Франция, 2005), на XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции

«Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005), на 9-й международной Путинской школе - конференции молодых ученых «Биология -наука 21 века» (Пущино, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 1 - в зарубежном журнале списка ВАК (J. Phys. Chem.), 4 - в отечественных журналах списка ВАК, 17 тезисов докладов на отечественных и международных конференциях.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена

на _ страницах, иллюстрирована_рисунками и_таблицами. Список

литературы содержит_источника.

Материалы и методы исследования

Выращивание бактериальных штаммов, выделение и анализ ДНК, методы

генетической инженерии

Объектом исследования служила пурпурная несерная бактерия Rhodobacter (Rba.) sphaeroides. Клетки Rba. sphaeroides выращивали в полуаэробных условиях в темноте на жидкой среде Хатнера при перемешивании 130 об/мин при 34°С в течение 3-4 дней. Антибиотики добавляли в зависимости от используемых штаммов и плазмид: канамицин 5, стрептомицин 5, тетрациклин 1 (мкг/мл). Клетки E.coli выращивали в жидкой среде LB при 37°С с интенсивной аэрацией. В зависимости от используемых штаммов добавлялись антибиотики канамицин 30, ампициллин 50, тетрациклин 10 (мкг/мл). Плазмцдную ДНК из клеток Е. coli выделяли, используя набор "DNA purification system" фирмы Promega. Для выделения тотальной ДНК из клеток Rba. sphaeroides клетки с 1 мл культуры собирали центрифугированием (8000 об/мин, 5 мин), удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали в 0,5 мл среды LB, добавляли по 0,5 мл фенола и хлороформа, перемешивали и центрифугировали (12000 об/мин, 5 мин). К водной фазе, содержащей ДНК, повторно добавляли 0,5 мл хлороформа, перемешивали и смесь разделяли центрифугированием (12000 об/мин, 5 мин.). ДНК осаждали добавлением 1 мл 98% холодного этанола с добавлением 1/10 объема 3 М ацетата натрия, pH 4.5. Осадок ДНК отмывали от соли 70% этанолом и растворяли в 50-100 мкл воды. Для разделения и анализа ДНК и плазмид использовали горизонтальный электрофорез в 0,5-1,5% агарозном геле. Гель фотографировали в проходящем

УФ-свете при длине волны 254 или 366 нм. Определение нуклеотидной последовательности ДНК и праймеры для мутагенеза заказывали в фирме «Евроген Ру», Москва. Для получения рекомбинантных ДНК использовали стандартные методы генетической инженерии: расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигироваяие фрагментов ДНК, генетическую трансформацию с помощью теплового шока или электропорации. Для конъюгативного переноса плазмид из Е. coli в Rba. sphaeroides использовали двухродительское скрещивание с промежуточным штаммом E.coli S17-1.

Методы выделения хроматофоров и очистки реакционных центров

Для выделения хроматофоров клетки Rba. sphaeroides собирали центрифугированием (6000 об/мин, 20 мин), отмывали от кулмуральной среды буфером 20 мМ Трис-HCl, pH 8.0 (Т-буфер), ресуспендировали в том же буфере и разрушали ультразвуком. Хроматофоры отделяли от фрагментов клеток центрифугированием (60 мин, 12000 об/мин, 4°С). Для отделения хроматофоров от фракции растворимых белков надосадочную жидкость центрифугировали (60 мин, 40000 об/мин, 4°С). Осадок хроматофоров ресуспендировали в Т-буфере до оптической плотности 0,5 при 875 нм для штаммов, содержащих антенные комплексы, а для безантенных штаммов до плотности 0,015-0,02 при 800 нм. Хроматофоры обрабатывали детергентом LDAO при комнатной температуре и перемешивании с добавлением 125 мМ NaCl. Концентрация детергента и время обработки подбирались индивидуально для каждого мутанта. Затем супернатант, полученный центрифугированием (60 мин, 40000 об/мин), разводили TL-буфером до концентрации NaCl 60 мМ и наносили на колонку с DEAE-целлюлозой, уравновешенную 60 мМ NaCl. Колонку промывали Т буфером с 0.1% LDAO с возрастающим градиентом NaCl (80-145 мМ). РЦ элюировали 165-200 мМ NaCl в том же буфере. Второй этап очистки РЦ производили на EMD-целлюлозе. Очищенные РЦ элюировали 180 мМ NaCl в том же буфере. Степень чистоты РЦ оценивали по соотношению полос поглощения белка (280 нм) и мономерного Бхл (804 нм), которое для чистых РЦ составляет - 1,3.

Методы исследования реакционных центров

Спектры поглощения РЦ измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-160IPC при комнатной температуре. Дифференциальные (свет минус темнота) фотоиндуцированные спектры поглощения РЦ (ДА) измеряли при комнатной температуре в миллисекундном диапазоне на однолучевом дифференциальном спектрофотометре с фосфороскопом (длина волны действующего света 875 нм) в области от 700 до 950 нм с интервалом в 5 нм.

4

Для оптической спектроскопии высокого временного разрешения использовали очищенные РЦ и хроматофоры безантенных штаммов Rba. sphaeroides. с оптической плотностью около 0.5 при 850-870 нм (длина оптического пути 1 мм). К образцам добавляли 5 мМ дитионит натрия и освещали слабым бельм светом в течение 5 минут для восстановления первичного акцептора электрона QA. Фемтосекундные импульсы света (длительность - 40 фс; длина волны - 800 нм; частота - 1КГц; энергия в импульсе -1 мДж) получали на фемтосекундной установке «Spitfire Pro» (фирма Spectra Physics, США). Излучение от лазера «Tsunami 35fs» с накачкой от лазера непрерывного действия «Millennia 5sJ», с энергией в импульсе 10 нДж и частотой 80 МГц направляли в регенеративный усилитель импульсов лазер «Spitfire -40F» с накачкой от лазера непрерывного действия «Empower 15» и увеличивали энергию в импульсе до 1 мДж. Фотоиндуцированные изменения поглощения измеряли методом возбуждения - зондирования на модифицированной установке «Эксштро» (CDP systems). Для генерации континуума усиленный фемтосекундный импульс, энергию которого понижали до 40 мкДж, фокусировали на кварцевую пластину толщиной 2 мм. Свет континуума направляли на линию задержки и использовали для возбуждения образца. Длины волн короче 850 нм в возбуждающем импульсе отсекали двумя светофильтрами RG850. Малую долю континуума (~ 4%) использовали в качестве импульса зондирования и опорного импульса. Все три импульса пропускали через вращающуюся кювету с образцом. Импульс накачки и зондирования совмещали в плоскости образца. После прохождения образца импульс зондирования и опорный импульс фокусировали на входную щель полихроматора «CDP 2002» и на регистрирующие фотодиоды. Значения интенсивностей опорного и зондирующего импульсов при каждом значении времени задержки получали в результате усреднения 2000 измерений.

Результаты и их обсуждение

Создание генетической системы для направленного мутагенеза Rba.

sphaeroides

В состав генетической системы для мутагенеза РЦ входят следующие компоненты: /«//-дефицитный родительские штаммы (ДЬМ1 или DD13) и шшмиды для их комплементации (Табл. 1). В /^//дефицитных штаммах из генома удалена часть /ж/оперона, кодирующая полипептиды РЦ. Вместо удаленных генов в бактериальную хромосому встроены гены устойчивости к

5

антибиотикам. Клетки /"«^дефицитных штаммов не способны к синтезу РЦ и фототрофному росту. Для восстановления фотосинтетической функции в родительский ри/-дефицитный штамм переносили плазмиду, несущую ДНК-фрагмент с недостающими генами. В полученных рекомбинантных штаммах восстанавливалась способность синтезировать фотохимически активные РЦ (так называемые РЦ псевдо-дикого типа) или, в случае внесения мутации в ри/-ДНК фрагмент в составе плазмиды, мутантные РЦ.

Таблица 1. Использованные в работе штаммы Rbci. sphaeroides и полученные плазмиды

Штаммы Rb. spaeroides Генотип/описание Ссылка

RV Дикий тип J. Miyake, 1978

ALM1 Геномные делеции pufLM, замена на KmR Feer G., Okamura M. Y, 1977

DD13 Геномные делеции pufBALMX и рисВА, замена на KmR и SmR, соответствено Jones et al.,1992

Плазмиды

pRK415 ТсК Keen, 1988

pUC-4,9 4.9 т.п.о. EcoRI-EcoRV фрагмент из pRVB2 клонирован в плазмиду pUCl 8 данная работа

pUC4,5 4,5 т.п.о. EcoRI-Sphl фрагмент клонирован в плазмиду pUC 18 данная работа

Blue-1,7 1,7 т.п.о. Xhol-Xhol фрагмент клонирован в плазмиду Bluescript данная работа

Blue-0,44 0,44 т.п.о. Kpnl-Sall фрагмент клонирован в Bluescript данная работа

pRK-ри/ 4.9 т.п.о. EcoRI-EcoRI puf -фрагмент клонирован в pRK-415 данная работа

pREHD2 TcR, EcoRI-HindlII фрагмент, содержащий puf-оперон с делегированными puf-ВА генами данная работа

В данной работе была использована плазмида р!1УВ2 любезно предоставленная Мдуаке, Япония, несущая фрагмент 15 тысяч пар оснований (т.п.о.) с/ж/^опероном (Рис. 1).

Рис. 1. Схема пере клонирования фрагментов ДНК, с одержащих ри/-оперон Rba. sphaeroides

Фрагмент 15 т. п. о.

EcoRI

Полил инкерный сайт

EcoRI-EcoRV ДНК фрагмент с полным puf-опероном размером 4,9 т.п.о. был изолирован из плазмиды pRVB2. Этот фрагмент был клонирован в плазмиду pUC18, а затем в плазмиду pRK415 для последующей комплементации puf-дефицитного штамма Rba. sphaeroides ALMI, в котором рufL и М гены заменены на канамициновую кассету. Для puf -М мутагенеза

использовались Xhol-Xhol фрагмент размером 1,7 т.п.о., а для puf-L мутагенеза Kpnl-Sall фрагмент 440 п.о., клонированные в плазмиду Bluescript.

Несовершенство данной генетической системы состояло в том, что переклонирование мутантных фрагментов ДНК после мутагенеза производилось по одноименным сайгам (Рис. 2а), и возникала необходимость определения ориентации встроенных фрагментов с помощью рестриктного анализа. Кроме того, данная система давала возможность получать штаммы Rba. sphaeroides только с одним фенотипом, т.е. содержащие РЦ и оба светособирающих комплекса (RCtLHl+LH2+). Для исследования РЦ в нативном состоянии и для изучения нестабильных мутантных РЦ предпочтительно использовать рекомбинантные штаммы, содержащие РЦ как единственный пигмент-белковый комплекс. С этой целью из /да/оперона были удалены гены, ответственные за синтез коровой антенны. Из плазмиды pUC4,9 был изолирован EcoRI-Sphl фрагмент ДНК и клонирован в плазмиду pUC18. Полученная плазмида pUC4,5 послужила матрицей для удаления puf- ВА генов с помощью метода ПЦР. В результате сайт Xhol стал уникальным в составе puf-оперона, что значительно упростило схему клонирования мутантных фрагментов. Для удобства клонирования в состав ри/оперона был также введен новый уникальный сайт рестрикции Xbal (Рис. 26).

11 lis HlI2I

4,51 n.O. (pUC-4,5)

Z- - «

Ри/-промотор

—ЕЖИ-т-г1

-Ш

J_1_

II

ts

я s

Рис. 2. Усовершенствование генетической системы дляри/-Ь ири/-М мутагенеза

Усовершенствование системы для направленного мутагенеза РЦ позволило получать рекомбинантные штаммы КЬа. вркаегоЫеъ с фенотипами ЯС+ШГЪН2*; КС+Ш1"ЪН2". Штамм КЬа. зрИаегогЛез, содержащий РЦ и два светособирающих комплекса (11СЪН1+ЬН2+) получается при комлементации /»^дефицитного штамма ДЬМ1 плазмидой рКК.-ри/. Комплементация штамма БОП плазмидами рКК-ри/ или р!1ЕН-02 приводит к получению рекомбинантных штаммов КЬа. sphaeroid.es с двумя фенотипами: 11С+ЬШ+ЬН2" или КС+ЬН1~Ш2~, соответственно (Рис. 3).

Рис. 3. Спектры хроматофоров КЬа. sphaeroides с тремя фенотипами.

Спектры хроматафоров

— РЦ + LHI+LH2 -- PL4*LHl

— Ривмамрачак

Точечные мутации в puf-M ген вносились с помощью метода полимеразной цепной реакции или системы «GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System» фирмы Promega. После мутагенеза наличие мутаций подтверждалось с помощью секвенирования ДНК, а также с помощью рестриктного

Длина волны, нм

1- маркер 1 т.п.о.

2- р11С-4,9М20б1Н/Руи1

3- р1)С-4,9/Руи1

анализа, поскольку олигонуклеотиды для мутагенеза были составлены таким образом, что вблизи мутаций исчезает сайт рестрикции Р\'и1. На рисунке 5 представлен электрофорез в агарозном геле фрагментов ДНК, образующихся при расщеплении плазмиды риС4,9, несущей ри/-оперон дикого типа (дорожка 3) и плазмиды р11С4,9, несущей мутацию М2061Н (дорожка 2). Исчезновение одного из Руи1 сайтов позволяет подтвердить наличие мутации с помощью рестриктного анализа.

Рис.4. Рестриктный анализ плазмид р1ГС4.9 и РиС4.9М2061Н/Руи1

Исследование мутантных реакционных центров М210УЬ и M210YW методом фемтосекундной спектроскопии.

Представленные на рисунках (5 правая панель (а) и 6 правая панель (а)) фемтосекундные кинетики изменения поглощения одиночных мутантов при 935 нм сходны и показывают отсутствие затухания состояния Р* в пикосекундном диапазоне при 90К. При этом амплитуды полос поглощения при 1020 нм и при 4.5 пс в обоих мутантах примерно в сто раз меньше чем в феофетин-модифицированных РЦ (Рис. 5, левая панель (а), Рис. 6, левая панель (а)). Эти факты указывают на почти полное отсутствие квазиэкспоненциальной стабилизации состояния Р+ВА~ в обоих мутантах в течение 4.5 пс. Заметно также, что в частотных спектрах осциллирующих частей кинетик при 1020 нм мутантов M210YW и М210УЪ мода 32 см"1 и ее гармоники подавлены по сравнению с кинетикой при 935 нм (Рис. 5, левая панель (в), Рис. 5, правая панель (в), Рис. 6, левая панель (в), Рис. 6, правая панель (в)). Гармоники этой моды подавлены в кинетиках при 935 нм в сухой пленке РЦ мутанта М210У\У (Рис. 5, правая панель (в), кривая 2 (тонкая)). В пленках обоих мутантов не регистрируется полоса ВА" и, следовательно, отсутствует перенос электрона от Р* к ВА в пикосекундном интервале. В пленках обоих мутантов присутствует мода 140-150 см'1, которую приписывают колебаниям в возбужденном состоянии Р* (Рис. 5, правая панель (в), Рис. 6, правая панель (в)). Присутствие этих осцилляции в кинетике при 935 нм и отсутствие полосы ВА~ в сухой пленке мутантов показывают, что осцилляции в возбужденном димере не зависят от переноса электрона от Р к ВА. Приведенные данные по наличию моды 32 см"1 и ее гармоник говорят о том, что молекула воды НОН55, расположенная между

9

двумя кофакторами переноса электрона участвует в переносе электрона от Р к

вА.

1020 нм

'К ^ ~

0.1

2 3 4

Ерем«, пс

153

М т

Частота, см-1

935 нм

■м

0.2

«.О

(а)

1 2 3

И «Л158

Врём«, г,с

Частота, см-!

Рис. 5. Фемтосекундные кинетики (ДЛ) (а), их осцилляторные части (б) и спектр ФП осцилляторных частей (в) для полосы 1020 нм в мутанте М210У№ (1) и феофетин-модифицированных РЦ (2) при 90 К. Фемтосекундные кинетики (ДА) (а), их осцилляторные части (б) и спектр ФП осцилляторных частей (в) для полосы при 935 нм в мутанте M210YW (1 и 2) феофетин-модифицированных РЦ (3) в нативном состоянии (1 и 3) и в сухой пленке (2) при 90 К

Наличие обратимого фемтосекундного переноса электрона от Р* к ВА, наблюдаемого в кинетиках мутантов при 1020 и отсутствие стабилизации состояния Р+ ВА~, демонстрирует важную роль гидроксильной группы тирозина М210 в процессе стабилизации состояния с разделенными зарядами. Возможная

роль полярной ОН - группы тирозина может заключаться в ее переориентации в процессе формирования состояния Р"ВА~. При этом движение Н8+ в направлении ВА~ может уменьшать энергшо Р+ВА~ по отношеншо к Р*, тем самым стабилизируя состояние с разделенными зарядами.

к

1020 нм

0.6002 0.0Ю

0,0002 О.СООО

ъ

(б)

2 3 4 Ере»«, м

'»Я

150

303 h

Щ

0 100 200 308 400 Я Чютта,«'1

О МО 200 300 400 S3 Частота, с»'1

Рис. 6. Фемтосекундная кинетика (ДЛ) (а), ее осцилляторная часть (б) и спектр ФП осцилляторных частей (в) для полосы 1020 нм в мутанте М210УЬ при 90 К. Фемтосекундная кинетика (АА) (а), ее осцилляторная часть (б) и спектр ФП осцилляторных частей (в) для полосы 1020 нм в мутанте М210УЬ при 90 К

Исследование мутантных реакционных центров двойного мутанта M210YL/M197FY методом фемтосекундной спектроскопии.

Ранее было показано, что замена фенилаланина в положении Ml97 на тирозин приводит к образованию водородной связи между ОН-группой тирозина и ацетил карбонильной группой первого кольца Рв- Частоты осцилляции в кинетиках стимулированного излучения Р* при 940 нм и в кинетиках при 1020 нм сдвинуты со 150 до 100 см"1 (Рис.7-1(в), 7-2(в)).

Частотный сдвиг, скорее всего, является результатом увеличения эффективной массы первого пиррольного кольца кольца Рв, которое участвует в ядерном движении по отношению к РА.

1

о.хте ооозэ

o.ocecl

О 1 2

Время, пс

0,0 0,02 * 0 03 -0,02

О 100 200 300 400 500 600 Частота, cm'1

Рис. 7. Фемтосекундные кинетики (АЛ) (а), их осцилляторные части (б) и спектр ФП осцилляторных частей (в) для полосы при1020 им в РЦ мутанта M210YL (тонкая линия) и двойного мутанта M210YL/M197FY (толстая линия) при 90 К (1). Фемтосекундные кинетики (ДЛ) (а), их осцилляторные части (б) и спектр ФП осцилляторных частей (в) для полосы при 935 нм в РЦ мутанта М210YL (тонкая линия) и двойного мутанта M210YL/M197FY (толстая линия) при 90 К (2).

Исследование мутантных реакционных центров M206IH

Рис. 8. Спектры поглощения РЦ

Из спектров поглощения золированных РЦ мутанта М2061Н и дикого типа, нормированных в области поглощения Бфео при 760 нм (Рис. 8) следует, что наиболее значимые изменения в спектре РЦ мутанта наблюдаются в области полосы поглощения первичного донора электрона Р при 866 нм.

Полоса поглощения Р в РЦ мутанта уширяется, ее максимум смещается на 10 нм в коротковолновую область. Экстинкция длинноволновой полосы поглощения Р, расположенной в РЦ дикого типа при 866 нм, в мутантных РЦ уменьшается примерно в полтора раза.

Длина волны,нм

Рис. 9. Спектры обратимых изменений поглощения, индуцированных освещением близким инфракрасным светом изолированных РЦ и хроматофоров мутанта М2061Н и РЦ дикого типа.

Полоса поглощения мономерного Бхл в РЦ мутанта сдвигается от 804 до 809 нм. Сходная структура спектров фотоиндуцированных изменений поглощения РЦ и хроматофоров мутанта и РЦ дикого типа (Рис. 9) свидетельствует о том, что мутантные РЦ сохраняют способность осуществлять реакцию переноса электрона на свету с образованием состояния с разделенными зарядами. Так же, как и в спектрах поглощения РЦ на рисунке 8, в дифференциальном спектре ДА РЦ мутанта, измеренного в миллисекундном интервале, наблюдается коротковолновый сдвиг и уширение фотовыцветающей полосы поглощения первичного донора Р. Этот факт позволяет сделать вывод, что изменение спектральных и фотохимических свойств функционально активного Р мутанта не обусловлены гетерогенностью РЦ или частичным окислением первичного донора, а связаны с изменением экситонных взаимодействий между молекулами Бхл специальной пары в результате аминокислотного замещения. Изобестическая точка дифференциального спектра поглощения в области 800 нм, отражающего электрохромный сдвиг полосы поглощения мономерного Бхл в поле зарядов Р+(3А" в мутантных РЦ, смещена на 4 нм в красную область по сравнению со спектром дикого типа. Этот сдвиг согласуется с наблюдаемьм длинноволновым сдвигом максимума поглощения мономерного Бхл в мутантных РЦ на рисунке 8. Из соотношения тангенсов угла наклона на начальном участке кинетики выцветания Р при низкой интенсивности

действующего света было найдено, что квантовый выход разделения зарядов Р+Оа" в мутантных РЦ приблизительно в 4 раза ниже, чем в РЦ дикого типа. Эти данные согласуются с данными, полученными при исследовании мутантных РЦ с помощью спектроскопии высокого временного разрешения. На рисунке 10-1 представлены кинетики световых изменений поглощения в РЦ дикого типа и мутанта М2061Н, измеренные в максимуме поглощения первичного донора электрона Р при 870 нм.

870 НМ -о-дикий тип

-•-М2С61Н

200 360 100

Время (пс) 1

ОИии -о-дикийтип

УШНМ —М2061Н

Врат (пс)

Рис.10. Фемтосекундные кинетики (АЛ) при 870 нм в мутанте М2061Н и РЦ дикого типа при 293 К (1). Фемтосекундные кинетики (АА) при 910 нм в мутанте М2061Н и РЦ • дикого типа при 293 К (2).

И в РЦ дикого типа, и в РЦ мутанта в области поглощения первичного донора Р наблюдается быстрое уменьшение поглощения, обусловленное переходом Р в возбужденное состояние Р*, вслед за которым наблюдается медленный, за время около 100 пс, переход в состояние Р+, уровень которого через 300 пс после воздействия возбуждающего импульса, в три раза ниже уровня состояния Р+ в РЦ дикого типа. Исходя из этих данных, можно заключить, что квантовый выход образования состояния Р+Нд"в РЦ мутанта в 4 раза ниже; чем в РЦ дикого типа. На рисунке 10-2 приведены кинетики световых изменений поглощения в РЦ дикого типа и мутанта М2061Н, измеренные при 293 К в интервале от 10 до 300 пс в области стимулированного излучения Р* при 910 нм. В РЦ дикого типа время жизни возбужденного состояния Р* составляет 4 пс, в то время как у мутанта время жизни возбужденного состояния увеличивается до 80-100 пс.

Выводы

1. Создана генетическая система для направленного мутагенеза, позволяющая вносить точечные мутации в Ьи М субъединицы реакционных центров Rba. sphaeroides. Модифицикация системы позволила получить рекомбинантные штаммы с тремя фенотипами, содержащими две, одну светособирающие антенны, а также безантенные реакционные центры

2. Получены мутантные РЦ Rba. sphaeroides: M210YL, M210YW, M210YL/M197FY, M206IH.

3. Установлено, что квантовый выход разделения зарядов в РЦ мутанта M206IH приблизительно в 4 раза ниже, чем в РЦ дикого типа, а скорость разделения зарядов ниже в 100 раз.

4. Показано, что в РЦ дикого типа обратимая переориентация полярной ОН-группы тирозина М210 стабилизирует состояние с разделенными зарядами

Р+ Вд". В мутантных РЦ M210YL, M210YW, отсутствует стабилизация состояния с разделенными зарядами Р+ ВА~в пикосекундном временном интервале.

5. В РЦ двойного мутанта M210YL/M197FY как и в одинарном мутанте M210YL не наблюдается стабилизации состояния с разделенными зарядами Р+Вд" в пикосекундном временном интервале. В результате образования водородной связи между атомами тирозина Ml97 и ацетил-карбонильной группой первого тетрапиррольного кольца Рв мутанта наблюдается низкочастотный сдвиг осцилляций в кинегиках стимулированного излучения при 940 и в области поглощения ВА~ при 1020 нм, связанный с увеличением эффективной массы первого пиррольного кольца Рв, совершающего движение в направлении к Рд.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. "Л.Г. Васильева, Т.И. Болгарина. Р.А. Хатыпов, А .Я. Шкуропатов, Д. Мияке, В.А. Шувалов. Замещение валина - 157 на тирозин в L-субъединице реакционного центра Rhodobacter sphaeroides - ДАН, т. 376, №6, с. 826-829, (2001).

2. A. G. Yakovlev, L. G. Vasilieva, A. Ya. Shkuropatov, Т. I. Bolgarina. V. A. Shkuropatova and V. A. Shuvalov, Mechanism of Charge Separation and Stabilization of Separated Charges in Reaction Centers of Chloroflexus aurantiacus and of YM210W(L) Mutants of Rhodobacter sphaeroides Excited by 20 fs Pulses at 90 K, J. Phys. Chem. A 107,8330-8338, (2003).

3. Т.И. Болгарина, Р.А. Хатыпов, JI.Г. Васильева, А.Я. Шкуропатов, академик РАН В.А. Шувалов, Замещение изолейцина М206 на гистидин в реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides приводит к изменению структуры молекулы бактериохлорофилла специальной пары, ДАН, т. 394, №2, с. 1-4, (2004).

4. А.Г. Яковлев, Л.Г. Васильева, А.Я. Шкуропатов, Т.И. Болгарина, В.А. Шкуропатова, Т.А. Долгова, В.А. Шувалов. Механизм разделения зарядов и их стабилизации в бактериальных реакционных центрах, Биофизика, 49, 199-211, (2004).

5. Р.А. Хатыпов, Л.Г. Васильева, Т.Ю. Фуфина, Т.И. Болгарина, В.А. Шувалов. Влияние замещения изолейцина L177 на гистидин на пигментный состав и свойства реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides, Биохимия, том 70, вып. 11, с. 1527-1533, (2005).

Тезисы:

1. Болгарина Т.И.. Васильева Л.Г., Шувалов В.А. Замещение валина на тирозин в позиции 157 в L-субъединице реакционного центра пурпурных бактерий, Сборн. Материалов всесоюзной школы - конф. мол. ученых "Горизонты физико-химической биологии", с. 22, Пущино, 2000.

2. Vasilyeva L., Bolgarina Т.. Khatypov R., Shuvalov V. Substitution of valine by tyrosine in position LI57 in reaction center of Rhodobacter, Intern. Symp. On Photosynth. Procariots, Barcelona, Spain, 2000, Book of abstracts, p. 216.

3. Болгарина Т.И.. Васильева Л.Г., Хатыпов Р.А., Шувалов В.А. Внесение аминокислотных замещений в L-субъедишщу реакционного центра пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides, Сборн. Материалов 5-й всесоюзной школы -конф. мол. ученых "Биология - наука 21-го века", с. 9, Пущино, 2001.

4. Т.И. Болгарина, Л.Г. Васильева, Р.А Хатыпов, Шкуропатов АЛ., Шувалов В.А. Направленный мутагенез реакционного центра Rhodobacler sphaeroides,

Сборн. Материалов Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие», с. 23, Пущино, 2001.

5. Vasilyeva L.G., Bolgarina T.I.. Khatypov R.A., Khmelnitsky A.Y., Voitcekh O.O., Shkuropatov A.Y., Shuvalov V.A. Site-directed mutagenesis of the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides, XVII Pushchino Readings in Photosynthesis, Book of abstracts p. 41, Pushchino, 2002.

6. Bolgarina T.I.. Khatypov R.A., Vasilyeva L.G., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. Primary characterization of the mutant reaction center from Rhodobacter sphaeroides with substitution of tyrosine L128 by phenylalanine, XVII Pushchino Readings in Photosynthesis, Book of abstracts p. 9, Pushchino, 2002.

7. Болгарина Т.И.. Хатыпов P.A., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я. Очистка и спектральный анализ реакционных центров мутантов Rhodobacter sphaeroides, Сборн. Материалов 6-й всесоюзной школы - конф. мол. ученых "Биология -наука 21-го века", т. 1, с. 218, Пущино, 2002

8. Bolgarina T.I.. Khatypov R.A., Vasilyeva L.G., Khmelnitsky A.Y., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. Site-directed mutagenesis of the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides, International conference "Photosynthesis and crop production", Book of abstracts p.43,7-12 0ct.2002, Kyiv, Ukraine.

9. T.I. Bolgarina , R.A. Khatypov, L.G. Vasilieva, A.Ya. Shkuropatov and V.A. Shuvalov "Effects of IM206H mutation on spectral and photochemical properties of the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides", 11th International Symposium on Phototrophic Procaryotes, August 24-29, 2003, Tokyo, Japan, Book of abstracts, p.118.

10. A.G. Yakovlev, L.G. Vasilyeva, A.Ya. Shkuropatov, T.I. Bolgarina. V.A. Shkuropatova and V.A. Shuvalov " On Mechanism of Charge Separation and Stabilization of Separated Charges in Reaction Centers of Rhodobacter sphaeroides and Chloroflexus aurantiacus", 11th International Symposium on Phototrophic Procaryotes, August 24-29, 2003, Tokyo, Japan, Book of abstracts, p.l 18.

11. T.I. Bolgarina, R.A. Khatypov, L.G. Vasilieva, A.Ya. Shkuropatov and V.A. Shuvalov "Effects of IM206H mutation on spectral and photochemical properties of the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides", International Conference on Primary processes of Photosynthesis, 19-22 Oct. 2003, Pushchino, Russia, Book of abstracts, p.9.

12. L.G. Vasilieva, T.I. Bolgarina. R.A. Khatypov, A.Ya. Shkuropatov and V.A. Shuvalov. Effects of site-directed mutations in the vicinity of P and В on spectral and

photochemical properties of the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides, 29th FEBS Congress, 26 June-1 July 2004, Warsaw, Poland, Book of abstracts

13. А.Г. Яковлев, Л.Г. Васильева, А.Я. Шкуропатов, Т.И. Болгарина, В.А. Шкуропатова, Т.А. Долгова, В.А. Шувалов. Фемтосекундная спектроскопия первичных процессов разделения зарядов и их стабилизации в бактериальных реакционных центрах фотосинтеза при 90 К, 3 съезд биофизиков России, 24-29 июня 2004 г., Воронеж, Тезисы т.2, с.484.

14. R.A. Khatypov, L.G. Vasilyeva, T.Y. Fufina, T.I. Bolgarina. I.B.Klenina, A.Ya. Shkuropatov, V. A. Shuvalov Substitution of isoleucine L177 by histidine affects the pigment composition and properties of the reaction center of the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides, «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» 21-23 февраля 2005 г, МГУ, Москва.

15. T.Y. Fufina, L.G. Vasilyeva, R. A. Khatypov, I.B.Klenina, T.I. Bolgarina. V.A. Shuvalov. Pigment composition and properties of the mutant I(L177)H reaction center of Rhodobacter sphaeroides, International Biophysics Congress, Montpellier, France, Book of abstracts, p.811,2005.

16. Л.Г. Васильева, P.A. Хатыпов, Т.Ю. Фуфина, Т.И. Болгарина. В.А. Шувалов, Пигментный состав и свойства мутантных реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с замещением I(L177)H, XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Тезисы докладов, 2005, с. 11.

17. Т.Ю. Фуфина, Л.Г. Васильева, Р.А. Хатыпов, Т.И. Болгарина. В.А. Шувалов, Влияние направленной мутации I(LI77)H на пигментный состав и свойства реакционного центра пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Сборники Материалов 9-й международной Пущинской школы - конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 18-22 апреля, Тезисы докладов, 2005, с.

Заказ №788. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хмельницкая, Татьяна Игоревна

ВВЕДЕНИЕ 8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОТРОФИЫХ ПУРПУРНЫХ НЕСЕРНЫХ БАКТЕРИЙ

1.1.1. Филогения, морфология, метаболизм 12

1.1.2. Пигменты и фотосинтетеческие мембраны 12

1.1.3. Структура фотосинтетических комплексов Rba. sphaeroides 15

1.1.4. Первичные процессы фотосинтеза в реакционных центрах 18-19 Rba. sphaeroides

1.2 ГЕНЕТИКА БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

1.2.1. Структура фото синтетического генного кластера и ри/-оперона 19-21 Rba. sphaeroides

1.2.2. Регуляция фотосинтетических генов пурпурных бактерий 21

1.3. ОСНОВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФОТОСИНТЕЗА

1.3.1. Генетические системы для направленного мутагенеза 22-25 реакционных центров пурпурных бактерий

1.3.2. Методы генной инженерии, используемые для получения мутантных реакционных центров 25

1.3.3. Влияние аминокислотных замещений вблизи кофакторов переноса электрона на первичное разделение зарядов в бактериальных реакционных центрах 31

1.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И ПЕРВИЧНЫХ ПРОЦЕССОВ РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ В РЕАКЦИОННОМ ЦЕНТРЕ

1.4.1. Оптическая спектроскопия 38

1.4.2. Дифференциальная спектроскопия 40

1.4.3. Спектроскопия высокого временного разрешения

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

2.1.1. Составление олигонуклеотидов для направленного мутагенеза

L и М субъединиц РЦ Rba. sphaeroides 41

2.1.2. Методы направленного мутагенеза 42

2.1.3. Выращивание бактериальных штаммов

2.1.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК из клеток Е. coli

2.1.5. Выделение тотальной ДНК из клеток Rba. sphaeroides

2.1.6. Расщепление плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.1.7. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

2.1.8. Препаративное выделение ДНК из геля

2.1.9. Приготовление вектора и фрагментов ДНК для лигирования

2.1.10. Лигирование вектора и фрагментов ДНК

2.1.11. Количественное определение ДНК в образце . 45

2.1.12. Получение компетентных клеток 46 2.1.13 Трансформация клеток E.coli. плазмидной ДНК 46-47 2.1.14. Конъюгативный перенос плазмид в Rba. sphaeroides через Е. coli 47

2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ Rba. sphaeroides

2.2.1. Получение хроматофоров

2.2.2. Очистка реакционных центров методом жидкостной хроматографии 48

2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ

2.3.1. Оптическая спектроскопия

2.3.2. Количественное определение содержания бактериохлоринов в РЦ 49

2.3.3. Разделение пигментов экстрагированных из реакционных центров с помощью метода HPLC

2.3.4. Дифференциальная спектроскопия

2.3.5. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА Rba. sphaeroides

3.1.1. Конструирование плазмид, несущих отдельные участки ^М/^оперона 51

3.1.2. Удаление из^м^оперонаpufBA генов, кодирующих коровый светособирающий комплекс 52

3.1.3. Комплементация /ги/Яцефицитных штаммов Rba. sphaeroides плазмидой, содержащей полный puf-оперон 55

3.1.4. Спектральные характеристики рекомбинантных штаммов

Rba. sphaeroides

3.2. ВНЕСЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕЩЕНИЙ BLnM СУБЪЕДИНИЦ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ Rba. sphaeroides

3.2.1. Составление олигонуклеотидов, использованных для мутагенеза

3.2.2.Мутагенез с помощью GeneEditor in vitro

Site-Directed Mutagenesis 58

3.2.3. Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции 59

3.2.4. Схемы переклонирования мутантных фрагментов 60

3.2.5. Рестриктный анализ плазмид, несущих мутации в puf- М гене

3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ Rba. sphaeroides

3.3.1. Оптическая спектроскопия 63

3.3.2. Дифференциальная спектроскопия мутантных РЦ M206IH

3.3.3. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения в исследовании мутанта M206IH 65

3.3.4. Количественное определение содержания бактериохлоринов в РЦ мутанта M206IH

3.3.5. Разделение пигментов реакционных центров мутанта M206IH с помощью метода HPLC 67

3.3.6. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения в исследовании мутантов M210YL и M21YW 68

3.3.7. Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения в исследовании РЦ двойного мутанта М21OYL/ M197FY

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 .Свойства новых мутантных РЦ с замещением M206IH 72

4.2. Свойства мутантных РЦ с замещением М210YL и М210YW 77

4.3.Свойства мутантных РЦ с замещением M210YL/M197FY 79-80 ВЫВОДЫ 81 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 82список сокращений

Rba. - Rhodobacter Rps. - Rhodopseudomonas Blc. - Blastochloris

Трис-трисгидроксиметиламинометанхлорид ПЦР - полимеразная цепная реакция Бхл - бактериохлорофилл Бф - бактериофеофитин РЦ - реакционный центр

ВА- мономерный бактериохлорофилл активной цепи переноса электрона

Вв - мономерный бактериохлорофилл неактивной цепи переноса электрона

НА - бактериофеофитин активной цепи переноса электрона

Нв - бактериофеофитин неактивной цепи переноса электрона

Р - димер бактериохлорофилла, первичный донор электрона

LH1 - светособирающий комплекс 1(коровый антенный комплекс)

LH2 - светособирающий комплекс 2 (периферический антенный комплекс)

Qa , Qb - убихиноны

Km - канамицин

Тс - тетрациклин

Amp - ампицилин

Sm - стрептомицин

DEAE - диэтиламиноэтил целлюлоза

LDAO - лаурилдиметиламинооксид т.п.о. - тысяча пар оснований

DTT — дитиотриэтол

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат DMSO - диметилсульфоксид PEG - полиэтиленгликоль ФСБ - фотосинтетическая единица Фс - фемтосекунда

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и исследование мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides с аминокислотными заменами вблизи бактериохлорофиллов активной цепи кофакторов"

Актуальность проблемы. Первый этап преобразования энергии света в энергию химических связей происходит в реакционных центрах (РЦ) фотосинтеза. В настоящее время бактериальные РЦ пурпурных бактерий достаточно хорошо исследованы, что позволяет использовать их как удобный объект для изучения первичных процессов фотосинтеза и в качестве модельных систем для исследования более сложных комплексов, таких, как фотосистема 2 высших растений. Важным достижением стала работа по кристаллизации РЦ Blc. viridis в середине 80-годов. В настоящее время имеются рентгеноструктурные данные о строении РЦ дикого типа Rba. sphaeroides с разрешением около 2,5 А и многих мутантных РЦ. Объединение молекулярно-биологичсских и биофизических методов исследования позволяет получить новую информацию о взаимодействии хромофоров реакционных центров с белковым окружением. Именно это взаимодействие обеспечивает предельную эффективность первичного разделения зарядов при фотосинтезе. Метод направленного мутагенеза позволяет вносить направленные замещения в белковые субъединицы РЦ для изучения роли отдельных аминокислот в процессе переноса электрона и исследования их влияния на эффективность и направленность данного процесса. В нашей лаборатории используется сочетание современных молекулярно-биологических и таких биофизических методов, как оптическая спектроскопия высокого временного спектрального разрешения. В данной работе сконструирована и усовершенствована система для направленного мутагенеза РЦ Rba. sphaeroides, а также получены РЦ с одинарными и двойными аминокислотными замещениями вблизи первичного донора электрона Р и первичного акцептора Ва.

Цели и задачи работы. Диссертация посвящена конструированию и усовершенствованию генетической системы для создания мутантных штаммов пурпурной бактерии Rba. sphaeroides и их исследованию с помощью методов оптической спектроскопии и биохимических методов. Задачи работы состояли в следующем:

1. Создание генетической системы для направленного мутагенеза, позволяющей вносить точечные мутации в puf- L puf -М гены, кодирующие L и М белковые субъединицы реакционного центра Rba. sphaeroides.

2. Усовершенствование данной генетической системы для получения рекомбинантных штаммов с тремя фенотипами: RC+ LH1+LH2+, RC+LH1+LH2", RC1 LH1"LH2".

3. Получение мутантных РЦ с заменой остатков тирозина в положении М210 на лейцин и триптофан (M210YL, M210YW), двойного мутанта (M210YL/M197FY), расположенных вблизи кофакторов переноса электрона и исследование роли этих остатков в процессе первичного разделения зарядов в РЦ.

4. Создание мутантных РЦ с заменой изолейцина на гистидин в положении М206 (M206IH).

Научная новизна. На основе сконструированной генетической системы для мутагенеза реакционного центра Rba. sphaeroides впервые были получены мутантные РЦ

M210YL/M197FY и M206IH. В результате проведенных исследований были получены новые данные о динамике кофакторов и белков РЦ в процессе первичного разделения зарядов. При исследовании мутантных РЦ M210YW и M210YL методом фемтосекундной спектроскопии впервые было показано, что одним из основных факторов, определяющих высокую эффективность разделения зарядов и стабилизацию состояния с разделенными зарядами в реакционных центрах пурпурных бактерий, является сочетание переноса электрона от первичного донора электрона Р* к первичному акцептору ВА и изменения ядерных координат за счет переориентации гидроксильной группы тирозина М210.

Исследование спектральных свойств РЦ мутанта M206IH позволило получить новую информацию о влиянии белкового окружения бактериохлорофиллов Рв и ВА на квантовую эффективность разделения зарядов и скорость переноса электрона в РЦ. 9

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной школе - конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на 10-м Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Барселона, Испания, 2000), на 5-й Всесоюзной школе- конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2001), на Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001), на Международных Путинских чтениях по фотосинтезу (Пущино, 2002), на Международной научной конференции «Фотосинтез и получение урожая» (Киев, Украина, 2002), на 11 -м Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (Токио, Япония, 2003), на Международной конференции по первичным процессам фотосинтеза (Пущино, 2003), на 29-м Конгрессе ФЭБС (Варшава, Польша, 2004), на 3-м Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), на научной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), на Международном Биофизическом Конгрессе (Монпелье, Франция, 2005), на XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005), на 9-й международной Пущинской школе - конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 1 - в зарубежном журнале списка ВАК (.Т. Phys. Chem.), 4 - в отечественных журналах списка ВАК, 17 тезисов докладов на отечественных и международных конференциях.

Автор выражает глубокую благодарность руководителю В. А. Шувалову за научные консультации и общее руководство. JI. Г. Васильевой за помощь в разработке и освоении методов направленного мутагенеза РЦ, а также за активное участие в интерпретации и обсуждении результатов. Искренне благодарю сотрудников лаборатории Р. А. Хатыпова за помощь в измерении дифференциальных спектров поглощения и фемтосекундных кинетик мутантных РЦ, а также А. Я. Шкуропатова и В.А. Шкуропатову за консультации в разработке методов выделения РЦ. Большая благодарность Т.С Волщуковой за техническую помощь в приготовлении сред и обеспечении реактивами. Особенная благодарность А.Г Яковлеву за фемтосекундные измерения (Институт им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова) и И.А. Кашпарову за проведение HPLC-хроматографии пигментов (Институт белка РАН).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хмельницкая, Татьяна Игоревна

Выводы

1. Создана генетическая система для направленного мутагенеза, позволяющая вносить точечные мутации в L и М субъединицы реакционных центров Rba. sphaeroides. Модифицикация системы позволила получить рекомбинантные штаммы с тремя фенотипами, содержащими две, одну светособирающие антенны, а также безантенные реакционные центры

2. Получены мутантные РЦ Rba. sphaeroides: M210YL, M210YW, M210YL/M197FY, M206IH.

3. Установлено, что квантовый выход разделения зарядов в РЦ мутанта M206IH приблизительно в 4 раза ниже, чем в РЦ дикого типа, а скорость разделения зарядов ниже в 100 раз.

4. Показано, что в РЦ дикого типа обратимая переориентация полярной ОН-группы тирозина М210 стабилизирует состояние с разделенными зарядами

Р+ Вд~. В мутантных РЦ M210YL, M210YW, отсутствует стабилизация состояния с разделенными зарядами Р+ ВЛ~в пикосекундном временном интервале.

5. В РЦ двойного мутанта M210YL/M197FY как и в одинарном мутанте M210YL не наблюдается стабилизации состояния с разделенными зарядами РВд~ в пикосекундном временном интервале. В результате образования водородной связи между атомами тирозина Ml97 и ацетил-карбонильной группой первого тетрапиррольного кольца Рв мутанта наблюдается низкочастотный сдвиг осцилляций в кинетиках стимулированного излучения при 940 и в области поглощения ВА~ при 1020 нм, связанный с увеличением эффективной массы первого пиррольного кольца Рв, совершающего движение в направлении к Рд.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хмельницкая, Татьяна Игоревна, Пущино

1. Говинджи Орт. Д. Фотосинтез ,1987. М: Мир с.728.

2. Кондратьева Е. Н. Пурпурные бактерии.В кн.: Кондратьева Е.Н., Максимова И.В., Самуилов В.Д. Фототрофные микроорганизмы. 1989. С. 6-82. Изд. Московского Университета.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: пер. с англ. / М: Мир. 1984. 480 с.

4. Мокроносов, Гавриленко, Фотосинтез: Физиолого-экологические и биохимические аспекты. М., Академия. 2006. 446 с.

5. Нолтинг Б. Мир биологии и медицины. Серия "Новейшие методы исследования биосистем". Техносфера, М., 2005, 19 с.

6. Охапкина С. С., Акишев А. Г., Дегтярев С. X. Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и ее применение // http://www.sibenzyme.ru.

7. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1. М.: Наука, 2004. 526 с.

8. Хатыпов Р. А., Васильева Л. Г., Фуфина Т. Ю. и др. Влияние замещения изолейцина L177 на гистидин на пигментный состав и свойства реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides II Биохимия. 2005.

9. Шайтан КВ. Каким образом электрон движется по белку//СОЖ., 1999. No 3. С. 55-62.

10. М.Шувалов В.А. Первичное преобразование световой энергии при фотосинтезе. М.:1. Наука, 1990. 208 с.

11. Шувалов В.А. Преобразование солнечной энергии в первичном акте разделения зарядов в реакционном центре фотосинтеза // Москва: наука, 2000. 47с.

12. Яковлев А. Г., Шувалов В. А. Разделение зарядов в реакционных центрах фотосинтеза при фемтосекундном возбуждении //Биохимия. 2001. Т. 66, С. 261 -272.

13. Яковлев А. Г., Шувалов В. А. Перенос электрона в дейтерированных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides при 90°К по данным фемтосекундной спектроскопии // Биохимия. 2003. Том 68, вып. 6. С. 741 749.

14. Allen, J. P., and Williams, J. C. Relationship between the oxidation potential of the bacteriochlorophyll dimer and electron transfer in photosynthetic reaction centers // J. of Bioenergetics and Biomembranes. 1995. Vol. 27. P. 275 -283.

15. M.Allen J.P., Feher G., Yeates Т.О., Komiya H., Rees D.S. Strucrure of reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: the cofactors // Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1987. Vol.84. P. 5730-5734.

16. Arlt Т., Schmidt S., Kaiser W. et al. The accessory bacteriochlorophyll: A real electron carier in primary photosynthesis//Biochemistry, 1993. Vol. 90. P. 11757-11761.

17. Armitage J.P., Ingham C. and Evans M.C. Role of proton motive force in phototactic and aerotactic responses of Rhodopseudomonas sphaeroides //J Bacteriol. 1985. V. 161 P. 967972.

18. Ashby M. K., Coomber S. A., Hunter C.N. Kloning, nucleotide sequence and transfer of genes for the B800-850 light-harvesting complex of Rhodobacter sphaeroides // FEBS Letters. 1987.Vol. 213. P. 245-248.

19. Beens H., Weller A. Excited molecular я -complexes in solution. In: Organic Molecular Photophysics. Birks J.B. (ed). John Willey and Sons, London. 1975. V. 11. P. 159-215.

20. Bergey A. Taxonomic outline of the Archaea and Bacteria. 2000. Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd Edition, 2002.

21. Burgess, J. C., Ashby, M. K., and Hunter, C. N. Characterization and complementation of a mutant of Rhodobacter sphaeroides with a chromosomal deletion in the light-harvesting (LH2) genes // J. Gen. Microbiol., 1989. Vol. 135, P. 1809 1816.

22. Bylina E.J., Kolaczkowski S. V., Norris J. R., Youvan D. C. EPR characterization of genetically modified reaction centers of Rhodobacter capsulatus II Biochemistry, 1990. Vol. 29. P. 6203-6210.

23. Bylina E.J., Jovine R., Youvan D.C. In: The Photosynthetic Bacterial Raection center: Structure and Dynamics, eds. Breton J., and Vermeglio A. (Plenum, New York), 1988. P. 113-118.

24. Bylina E.J., Ismail S., Youvan D.C. Plasmid pU29, a vehicle for mutagenesis of the photosynthetic puf operon in Rhodopseudomonas capsidata II Plasmid, 1985. Vol. 16. P. 175-181.

25. Bylina E.J., Youvan D.C. Directed mutations affecting spectroscopic and electron transfer properties of the primary donor in the photosynthetic reaction center // Proc. Natl. Acad. Sci., 1988. Vol. 85. P. 7226-7230.

26. Chang, C.-K., Chen, L. X.-O., Dimagno, T. J. et al. Initial electron transfer in photosynthetic reaction centers of Rhodobacter capsulatus mutants // Chem. Phys. 1991. Let. 176. P. 366 — 372.

27. Chirino, A. J., Lous, E. J., Huber, M. Crystallografic analyses of site-directed mutants of the photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 4584-4593.

28. Cogdell R., Gardiner A. T. Li ght harvesting by purple bacteria: a circular argument // Microbiology Today, 2001. Vol. 28. P. 120-122.

29. Deisenhofer J., Epp K, Miki K, Huber R., Michel H. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction center of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolutions // Nature, 1985. Vol. 318. P. 618-624.

30. Donohue, T. J., Kiley, P. J., and Kaplan, S. The puf operon region of Rhodobacter sphaeroides //Photosynthes. Research. 1988a. Vol. 19. P. 39 61.

31. Donohue, T. J., McEwan, A. G., VanDoren, S. et al. Phenotypic and genetic characterization of cytochrome c2-deficient mutants of Rhodobacter sphaoides II Biochemystry. 1988b. Vol. 27. P. 1918- 1925.

32. Farchaus J.W., Qesterhelt D. A Rhodobacter sphaeroides puf L, M and X deletions mutant and its complementation in trans with a 5.3 kb puf operon shuttle fragment // EMBO J., 1989. Vol. 8. P. 47-54.

33. Finkele U., Lautervasser C., Zinth W. Role of tyrosine M210 in the initial charge separation of reaction center of Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry, 1990. Vol. 29. P. 8517-8521.

34. Finkele U, Lautenvasser Ch., Zinth W., Gray K.A., Oesterhelt D. Role of tyrosine M210 in the initial charge separation of reaction centers of Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry, 1990. Vol. 29. P. 8517-8521.

35. Fufina TY, Vasilieva LG, Khatypov RA, Shkuropatov AY, Shuvalov VA. FEBS Lett. 2007 Dec 22; 581(30):5769-73. Epub 2007 Nov 26.

36. Ghosh R., Iiauser H., Bachofen R. Reversible dissociation of the B873 light-harvesting complex frm Rhodospirilium rubrum G9+ // Biochemistry, 1988. Vol. 27. P. 1004-1014.

37. Giraud E., Fardoux J., Fourrier N., Hannibal L., Genty В., Bouyer P., Dreyfus B. and Vermeglio A. Bacteriophytochrome controls photosystem synthesis in anoxygenic bacteria// Nature 2002.V. 417. P. 202-205.

38. Goldmith, J. O., King, В., and Boxer, S. G. Mg coordination by amino acid site chains is not required for assembly and function of the special pair in bacterial photosynthetic reaction centers // Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 2421 -2428.

39. Gouterman M. Spectra of porphyrins// J. Mol. Spectroscopic., 1961. Vol. 6. P. 138-163.

40. Gray K. A., Farchjaus J.W., Wachtveitl J., Breton J., Oesterhelt D. Initial characterization of site-directed mutants of tyrosine M210 in the reaction center of Rhodobacter sphaeroides 11 EMBO J., 1990. Vol. 9. P. 2061-2070.

41. Grishanin R.N., Gauden D.E. and Armitage J.P. Photoresponses in Rhodobacter sphaeroides: Role of photosynthetic electron transport// J. Bacteriol. 1997. V.179 P. 24-30

42. Iiemsley, A., Arnheim, N., Toney, M. D. et al. A simple method for site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction // Nucleic Acids Research. 1989. Vol. 17. P. 6545 -6551.

43. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horlon, R. M. et al. Site-directed mutagenesis by overlap extansion using the polymerase chain reaction// Gene. 1989. Vol. 77. P. 51 59.

44. Holden-Dye K, Crouch LI, Jones MR. Structure, function and interactions of the PufX protein. Biochim Biophys Acta. 2008 Jul-Aug; 1777(7-8):613-30. Epub 2008 Apr 18.

45. Ни X., Schidten K. Model for the light-harvesting complex I (B875) of Rhodobacter sphaeroides II Biophysical Journal, 1998. Vol. 75 P. 683-694.

46. Jia, Y., Dimagno, T. J., Chan, C.-K. et al. Primary charge separation in mutant reaction centers of Rhodobacter capsulatus II J. Phys. Chem. 1993. Vol. 97. P. 13180 13191.

47. Kalman, L., LoBrutto, R., Allen, J. P. et al. Manganese oxidation by modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides II Biochmistry. 2003. Vol. 42. P. 11016 11022.

48. Kaplan, S., and Donohue, T. J. Genetic analysis of photosynthetic membrane biogenesis in Rhodobacter sphaeroides // The Photosynthetic reaction center / Ed. Deisenhofer, J., and Norris, J. P. Academic Press, .INC. 1993. Vol. 2. P. 101 131.

49. Kehoe D.M. and Grossman A.R. Similarity of a chromatic adaptation sensor to phytochrome and ethylene receptors// Science 1996. V.273. P. 1409-1412.

50. King, B. A., Stanley, R. J., and Boxer, S. G. Excited stale energy transfer pathways in photosynthetic reaction centers. 2. Heterodimer special pair // J. Phys. Chem. B. 1997. Vol.101. P. 3644-3648.

51. Kiley P.J., Kaplan S. Molecular genetics of photosynthetic membrane biosynthesis in Rhodobacter sphaeroides 11 Microbiol Rev., 1988. Vol. 52. P. 50-69.

52. Kirmaier C.H., Laible P.D., Hanson D.K., Holten D. B-side charge separation in bacterial photosynthetic reaction centers: nanosecond time scale electron transfer from HB" to QBh // Biochemistry, 2003. Vol.42. P2016-2024.

53. Klug G., Regulation of expression of photosynthesis genes in anoxygenic photosynthetic bacteria. //Arch Microbiol., 1993, Vol. 159. P. 397-404.

54. Klug G., Masuda S. Regulation of genes by light. In: Edvances in Photosynthesis and Respiration, V. 28 The Purple Phototrophic Bacteria, (Hunter C., Thumaer C., Beatty J, eds.), Elsevier, 2009, Ch. 36, P.727-740.

55. Kyndt J.A., Meyer Т.Е. and Cusanovich M.A. Photoactive yellow protein, bacteriophytochrome, and sensory rhodopsin in purple phototrophic bacteria// Photochem Photobiol Sci 2004.V. 3. P. 519-530

56. Lancaster, C. R. 11, and Michel, H. Photosynthetic reaction centers of purple bacteria // Handbook of metalloproteins / Ed. Messerschmidt, A., Huber, R., Poulos, T. et al.: K. John Wiley &Sons, Ltd, Chichester. 2001. P. 119-135.

57. Lang F.S., Oesterhelt D. Gene transfer system for Rhodopseudomonas viridis II J Bacteriol., 1989. Vol. 171. P. 4425-4435.

58. J An, X., Murchison, H. A., Nagarajan, V. et al. Specific alteration of the oxidation potential of the electron donor in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides И Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. Let. 91. P. 10265 10269.

59. Lockhart, D. J., Kirmaier, C., Holten, D. et al. Electronic field effects on the initial electron-transfer kinetiks in the bacterial photosynthetic reaction centers // J. Phys. Chem. 1990. Vol. 94. P. 6987-6995.

60. Madigan MT, Gest LI. Growth of the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata chemoautotrophically in darkness with H2 as the energy source. J Bacteriol. 1979 Jan; 137(l):524-30.

61. Mattioli, T. A., Gray, K. A., Lutz, M. et al. Resonance Raman characterization of Rhodobacter sphaeroides reaction centers bearing site-directed mutations at tyrosine M 210 // Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 1715 1722.

62. McDowell, L. M., Gaul, D., Kirmaier, C. et al. Investigation into the source of electron transfer asymmetry in bacterial reaction centers // Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 8315 -8322.

63. Meyer Т.Е. Isolation and characterization of soluble cytochromes, ferredoxins and other chromophoric proteins from the halophilic phototrophic bacterium EctothiorhodospiraHalophilall Biochim Biophys Acta 1985. V. 806. P. 175-183.

64. Molecular Cloning / Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis Т., 1989. Gold Spring Harbor Laboratory Press.

65. Moore, L. J., and Boxer, S. G. Inter-chromophore interactions in pigment-modified and dimer-less bacterial photosynthetic reaction centers // Photosynthesis Res. 1998. Vol. 55. P. 173- 180.

66. Parson W.W., Chu Z.-T., Warshel A. Electrostatic control of charge separation in bacterial photosynthesis // Biochem. Biophys. Acta., 1990. Vol. 1017. P.251-272.

67. Peloqum, J. M., Williams, J. C., Lin, X. el al. Time-dependent thermodynamics during early electron transfer in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 8089-8100.

68. Robles, S. J., Breton, J., and Youvan, D. C. Partial symmetrization of the photosynthetic reaction center // Science. 1990. Vol. 248. P. 1402 1405.

69. Romagnoli S. and Armitage J.P. Roles of chemosensory pathways in transient changes in swimming speed of Rhodobacter sphaeroides induced by changes in photosynthetic electron transport// J Bacteriol 1999. V. 181. P. 34-39.

70. Scheer, Struck A. Bacterial Reaction centers with Modified Tetrapyrrole Chromofores. In: the Photosynthetic Reaction Center .Vol. 2, P. 157-192. 1993, Academic press.

71. Schmidt S., Arlt Т., Hamm P. et al. Energetics of the primary electron transfer reaction revealed by ultrafast spectroscopy on modified bacterial reaction centers // Chem. Phys. Lett., 1994. Vol. 223. P. 116-120.

72. Shreve A.P., Trautman J.K., Frank H.A., Owens T.G., Albrecht A.C. Femtosecond energy-transfer process in the B800-850 light-harvesting complexof Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. //Biochem. Biophys. Acta, 1991.Vol. 1058. P. 280-288.

73. Shuvalov V.A., Amesz J., Duysens L.N.M. Picosecond charge separation upon selective exitation of the primary electron donor in reaction center of Rhodopseudomonas viridis II Biochem. Biophys. Acta., 1986. Vol. 851. P. 327-330.

74. Shuvalov V.A., Duysens L.N.M. Primary electron transfer in modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides II Proc Natl. Acad. Sci USA, 1986. Vol. 83. P. 1690-1694.

75. Smvanto, A., and Kaplan, S. Physical and genetic mapping of the Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 genome: Genome size, fragment identification, and gene localization // J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P. 5840-5849.

76. Tang, С.-К., Williams, J. С., Taguchi, А. К. W. et al. P+HA" charge recombination reaction rate constant in Rhodobacter sphaeroides reaction centers is independent of the P/P+ midpoint potential // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 8794 8799.

77. Takahashi E., Maroti P., Wraight C.A. In Current Researchin Photosynthesis. 1989. Vol.1. Baltscheffsky, M. (ed.). Dordrecht: Kluver. P. 169-172.

78. Tarutina M., Ryjenkov D.A. and Gomelsky M. An unorthodox bacteriophytochrome from Rhodobacter sphaeroidesinvob/ed in turnover of the second messenger c-di-GMP// J Biol Chem. 2006. V. 281. P. 34751-34758

79. Thielges M, Uyeda G, Camara-Artigas A, Kdlman L, Williams JC, Allen JP. Design of a redox-linked active metal site: manganese bound to bacterial reaction centers at a site resembling that of photosystem II. Biochemistry. 2005 May 24;44(20):7389-94.

80. Tiede, D. N., Kellogg, E., and Breton, J. Conformational changes following reduction of the bacteriopheophytin electron acceptor in reaction centers of Rhodopseudomonas viridis II Biochim. Biophys. Acta. 1987. Vol. 892. P. 294-302.

81. Vermeglio A., Joliot P. The photosynthetic apparatus of Rhodobacter sphaeroides II Tendends in Microbiology, 1999. Vol 7. P. 435-440.

82. Williams, J. C., Alden, H. A., Murchson, H. A. el al. Effects of mutations near the bacteriochlorophylls in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 11029- 11037.

83. Williams, J. C., Steiner, L. A. Ogden, R. C. et al. Primary structure of the M subunit of the reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983. Vol. 80, No. 21. P. 6505 6509.

84. Woese C.R. On the evolution of cells // Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 2002. Vol. 99. P. 8742-8747.

85. Woodbury, N. W, Peloquin, J. M., Alden, R. G. et al. Relationship between thermodynamics and mechanism during photoinduced charge separation in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry. 1994. Vol. 33. P. 8101 8112.

86. Yang, Z, and Bauer, С. E. Rhodobacter capsulatus genes involved in early steps of the bacteriochlorophyll biosynthetic pathway // J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 5001 -5010

87. Yeh K-C, Wu S.H., Murphy J.T. and Lagarias J.C. A cyanobacterial phytochrome two-component light sensory system// Science 1997. V. 277. P. 1505-1508

88. Youvan D.C., Ismail S., Bylina E.J. Chromosomal deletion and plasmid complementation of the photosynthetic reaction center and light-harvesting genes from Rhodopseudomonas capsulata И Gene, 1985. Vol. 38. P. 19-30.

89. Youvan, D. C., Alberti, M., Begusch, H. et al. Reaction Center and Light-Harvesting I Genes from Rhodopseudomonas capsulata II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984a. Vol. 81. P. 189-192.

90. Youvan, D. C., Bylina, E. J., Alberti, M. et al. Nucleotide and deduced polypeptide sequence of the photosynthetic reaction center, В879 antenna, and flanking polypeptides from R. capsulata II Cell. 1984b. Vol. 37. P. 949 957.

91. Youvan, D. C., and Ismail, S. Light-harvesting II (B800 B850) complex structural genes from Rhodopseudomonas capsulata II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. Let. 82. P. 58 -62.

92. Youvan, D. C., Ismail, S., Bylina, E. J. Chromosomal deletion and plasmid complementation of the photosynthetic reaction center and light-harvesting genes from Rhodopseudomonas carsulata И Gene. 1985. Vol. 38. P. 19 301. Г7РЩ о У Е- L/UE У.

93. О ALFwin Sequence Analyser 2.00 For research use only amersham pharmacy boWi1. Page