Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние аминокислотных замещений вблизи молекул бактериохлорофиллов PA и Bb на свойства реакционного центра Rhodobacter sphueroides

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние аминокислотных замещений вблизи молекул бактериохлорофиллов PA и Bb на свойства реакционного центра Rhodobacter sphueroides"

ФУФИНА Татьяна Юрьевна

Влияние аминокислотных замещений вблизи молекул бактериохлорофиллов Ра и Вв на свойства реакционного центра Шо{1оЬас1ег зркаегаШез

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

00460

037

Пущино - 2010

004601037

Работа выполнена в Учреждении Российской проблем биологии РАН

академии

наук Институте фундаментальных

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук

кандидат биологических наук

Шувалов Владимир Анатольевич Васильева Людмила Григорьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор биологических наук, профессор

Прохоренко Изабелла Рувимовна Семёнов Алексей Юрьевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Диссертационного совета Д 002.066.01 при Учреждении Российской академии наук Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН

Автореферат разослан « _ 10 г.

Защита диссертации состоится «23» апреля 2010 г. в

/2-

часов на заседании

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук ¿у^ /7 Г.Н. Назарова

Актуальность темы.

Актуальность изучения фотосинтеза связана с тем, что этот процесс обеспечивает возможность существования жизни на Земле. Пигмент-белковые комплексы фотосинтезирующих организмов осуществляют поглощение и преобразование световой энергии в энергию химических связей продуктов фотосинтеза. Первичное преобразование энергии света происходит в реакционных центрах (РЦ) фотосинтеза. Реакционные центры фотосинтезирующих бактерий являются хорошей модельной системой для исследования первичных процессов разделения зарядов. РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой транс-мембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех белковых субъединиц (H, M и L) и десяти кофакторов. Структура этого РЦ впервые была определена в 1984 г в лаборатории Michel, Германия, открыв возможности для исследования механизмов первичных процессов фотосинтеза. Известно, что процесс фотосинтетического разделения зарядов в РЦ - это чрезвычайно быстрый и эффективный процесс, квантовый выход которого близок к единице. Согласно современным представлениям, высокая эффективность функционирования РЦ определяется свойствами кофакторов, их взаимодействием друг с другом и с белковым окружением. Метод направленного мутагенеза позволяет селективно изменять аминокислотный состав в участках связывания хромофоров, влияя на их свойства. Сочетание этого метода с современными биохимическими и биофизическими методами является перспективным подходом к исследованию механизмов начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и изучению роли белка в этом процессе.

Цель работы и задачи исследования.

Целью работы было выяснение влияния белкового окружения вблизи молекул бактериохлорофиллов РА и Вв на свойства и функциональную активность РЦ Rba. sphaeroides. В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:

• Внесение направленных мутаций в pufL- и pufM- гены реакционного центра Rba. sphaeroides.

• Подбор условий для выделения генетически модифицированных РЦ I(L177)H, H(L173)L+ I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H и их выделение.

• Исследование влияния аминокислотных замещений в позициях L177, L173 и M182 на свойства генетически модифицированных РЦ 1(L177)H, H(L173)L+ I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H.

Научная новизна.

С помощью метода сайт-направленного мутагенеза были созданы новые комбинации аминокислотных замещений I(L177)H, H(L173)L+I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H в реакционном центре Rba. sphaeroides. Получены РЦ 1(И77)Н, в которых атом магния БХл Вв ¿"-координирован. Показано, что в результате аминокислотного замещения lie—»His в РЦ I(L177)H и I(L177)H+H(M182)L произошло ковалентное связьшание молекулы БХл и L-субъединицы. Получены РЦ двойного мутанта I(L177)H+H(M182)L, где лиганд атома магния молекулы БХл Вв расположен не с обычной, а- стороны, а с ß-стороны макроцикла тетрапиррольного кольца. Установлено, что в РЦ H(L173)L+I(L177)H, в отсутствие природного лиганда атома магния - гистидина LI73, аминокислотный остаток гистидина LI77 лигандирует атом магния бактериохлорофилла Ра.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на 9-ой и 11-ой международных конференциях молодых ученых (Пущино, 2005; 2007), Международном биофизическом конгрессе (Франция, 2005), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе (Пущино, 2005), Международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру» (Пущино, 2006), Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Япония, 2006), Международном симпозиуме по фотосинтетическим прокариотам (Франция, 2006), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Япония, 2007), Европейской биоэнергетической конференции (Ирландия, 2008), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), на Гордоновских чтениях по фотосинтезу (США, 2008), на конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), и на XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них одна статья в зарубежном журнале FEBS letters, три статьи в отечественном журнале Биохимия, 23 тезиса в материалах отечественных и международных конференций.

Связь с плапом научно-исследовательского института.

Тема диссертации является частью плановой темы института. Работа выполнялась при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям Российской академии наук (02.512.11.2085; 02.740.11.0293), программами Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Экстремальные световые поля и их приложение», грантом Президента РФ (№ НШ-3277.2006.4; НШ-4525.2008.4) и РФФИ (03-04-48215; 06-0448686; 09-04-00109).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 152 страницах, иллюстрирована 49 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 190 источников (из них 178 на английском языке).

Благодарности.

Выражаю глубокую благодарность моим научным руководителям - академику РАН Владимиру Анатольевичу Шувалову и к.б.н. Людмиле Григорьевне Васильевой за чуткое руководство и всестороннюю помощь в работе. Сердечно благодарю оппонентов моей диссертационной работы д.б.н. Изабеллу Рувимовну Прохоренко и д.б.н., проф. Алексея Юрьевича Семенова за внимательное рассмотрение работы, доброжелательность, отзывчивость и ценные критические замечания. Выражаю глубокую благодарность д.ф.-м.н. Ивану Игоревичу Проскурякову за помощь в проведении экспериментов и обсуждении результатов. Искренне признательна к.б.н. Равилю Александровичу Хатыпову и всем сотрудникам лаборатории первичных процессов фотосинтеза ИФПБ РАН за помощь и поддержку.

Методы исследования.

Мутагенез. Мутагенез реакционного центра пурпурной бактерии КЬа. ¡ркаего1с1е$ проводили с использованием метода ПЦР. Фрагмент ПЦР, содержащий мутацию, расщепляли при помощи эндонуклеаз рестрикции, а затем клонировали по одноименным сайтам в плазмидный вектор. После рестриктного анализа и секвенирования проводили переклонирование фрагмента ДНК, несущего мутацию, в плазмиду, содержащую весь ри/-

оперон. Штамм К coli S-17-1, способный осуществлять перенос вектора путем конъюгации со штаммом Rba. sphaeroides, трансформировали модифицированной плазмидой. Клетки рекомбинантного штамма Rba. sphaeroides выращивали в полуаэробных условиях в темноте при 34 "С на среде Хатнера, в присутствии тетрациклина (1 мкг/мл), канамицина (5 мкг/мл) и стрептомицина (5мкг/мл). Выделение реакционных центров. Культуру Rba. sphaeroides собирали центрифугированием, отмывали 20 мМ Трис-HCl буфером (pH 8.0) от среды, разрушали путем обработки ультразвуком, после чего дважды центрифугировали: при 12000 об/мин отделяли крупные фрагменты клеток, затем надосадочную жидкость центрифугировали при 45000 об/мин для осаждения хроматофоров. Полученные хроматофоры растворяли в 20 мМ Трис-HCl буфере pH 8.0, содержащем 120 мМ NaCl и 0.5 % ЛДАО (ТЛ буфер) и инкубировали 30 мин, затем повышали концентрацию ЛДАО до 0.7% и инкубировали еще 30 мин. После инкубации обработанные хроматофоры центрифугировали при 45000 об/мин 60 мин. Надосадочную жидкость, содержащую РЦ, наносили последовательно на колонки с ДЭАЭ и ЕМД целлюлозой. Промывку колонок производили 20 мМ Трис-HCl буфером pH 8.0, 0.1 % ЛДАО с постепенным повышением концентрации NaCl от 60 до 150 мМ. Затем РЦ элюировали 200 мМ NaCl в 20 мМ Трис-HCl буфере pH 8.0 с 0.1% ЛДАО. Спектры поглощения при комнатной температуре и 90 К измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1601PC. Дифференциальные (свет-минус-темнота) спектры измеряли на том же спектрофотометре с использованием непрерывной подсветки образца лампой накаливания и скрещенных светофильтров СЗС-22 и КС-15. Кинетику и спектры фотоиндуцированных изменений поглощения ÁA в миллисекундном диапазоне измеряли на однолучевом дифференциальном спектрофотометре с фосфороскопом. Для измерения дифференциальных (свет-минус-темнота) ИК-ФТ спектров на ИК-спектрометре EQUINOX-55 подсушенный образец РЦ (Ag0o=30) помещали между стеклами СаРг. Спектры ЭПР измеряли на спектрометре Varían Е 9 (USA) в температурном диапазоне от 5 до 300 К, используя криостат Oxford Instalments ESR 900 (UK), и на спектрометре ЭПР высокого временного разрешения ИФПБ РАН. Фемтосекундные измерения проводили методом возбуждения-зондирования на фемтосекундной лазерной установке «Spitfire Pro» (Spectral Physics, США) с модифицированной системой регистрации «Эксипро» (CDP systems). Электрохимический потенциал Р/Р+ измеряли путем титрования РЦ парой феррицианид калия/аскорбат натрия, с последующей обработкой результатов при помощи уравнения Нернста. Экстракцию пигментов из РЦ, осажденных 26 % сульфатом аммония, проводили ацетон-метанольной смесью в соотношении 7:2. Денатурирующий

электрофорез белков проводили в 18 % полиакриламидном геле в присутствии 6 М раствора мочевины и 0,1 % додецилсульфат натрия (ДСН). Стабильность РЦ в присутствии детергентов исследовали при 20 °С в 20 мМ Трис-HCl буфере рН 8.0/ 0.1 % Тритон Х-100/ 180 мМ NaCl (ТТ буфер), содержащем 5 % ДСН или 8 М мочевину. Исследование термостабильности РЦ проводили в том же буфере без детергентов при 48 °С. Обработку РЦ NaBH4 проводили в ТТ буфере. К образцу РЦ добавляли NaBHi до тех пор, пока рН раствора не становился больше 10. Инкубировали при 20 °С 16 часов до полного завершения реакции. Затем проводили диализ в течение суток при 4 °С против ТТ буфера. После диализа РЦ очищали на колонке с ДЭАЭ целлюлозой. Обработку РЦ протеазами осуществляли в течение 18 часов в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 8.0, в присутствии 1 мМ СаСЬ и в молярном соотношении фермент:субстрат=1:50. Моделирование. Моделирование аминокислотных замещений в РЦ проводили при помощи программы Swiss pdb viewer.

Результаты и обсуждение.

Позиция L177 в РЦ Rba. sphaeroides расположена вблизи кофакторов переноса электрона - бактерохлорофяллов Рд и Bg. Для исследования влияния аминокислотного замещения в положении L177 на свойства РЦ аминокислотный остаток изолейцина был заменен на гистидин (Рис. 1). Мутантный штамм, как пгтамм дикого типа, был способен к фототрофному росту. Показано, что в РЦ дикого типа и генетически модифицированных РЦ на свету происходит процесс разделения зарядов с образованием состояния P+Qa", что указывает на их фотохимическую активность.

Рисунок 1. Структура РЦ Rba. sphaeroides дикого типа (А) и смоделированная структура мутантного РЦ I(L177)H (Б).

0,0

400 500 600 700 800 900 1000

Длина волны, нм

Рисунок 2. Спектр поглощения РЦ дикого типа ('') и РЦ I(L177)Н (—), измеренные при 10К, на вставке представлена область 570-670 нм. Спектры измерены с использованием спектрометра QE 65000 (Ocean Optics).

В низкотемпературном спектре поглощения генетически модифицированных РЦ I(L177)H наблюдается коротковолновый сдвиг максимума полосы поглощения первичного донора электрона до 880 нм и двукратное уменьшение амплитуды этой полосы поглощения, а также уменьшение амплитуды длинноволновой полосы поглощения мономерных БХл при 803 нм (Рис. 2). Кроме изменений в длинноволновой области спектра, в спектре поглощения РЦ I(L177)H появляется полоса поглощения с максимумом при 638 нм (Рис. 2, вставка), которая соответствует поглощению молекулы БХл с 6™-координированным атомом магния. При изучении свойств РЦ с двойным аминокислотным замещением I(L177)H+H(M182)L были получены данные, подтверждающие, что в результате мутации I(L177)H молекула БХл Вв становится 6™-координированной (более подробно см. на стр. 12 автореферата).

Согласно данным спектроскопии высокого временного разрешения скорость переноса электрона в РЦ 1(Ь177)Н существенно не изменилась (Рис. 3).

Рисунок 3. Кинетики фотоиндуцированных изменений поглощения реакционных центров дикого типа (кривая 1) и I(L177)H (кривая 2), измеренные в области 920(А), 850 (Б) и 755(В) нм в интервале от -1 до 11 пс при возбуждении в области 860 нм.

Спектры ЭПР мутантных РЦ показали, что мутация I(L177)H привела к уцшрению полосы Р+ с 0,98±0,02 мТл для РЦ дикого типа до 1,15±0,02 мТл для РЦ I(L177)H. Было установлено, что ширина сигнала Р+ одинакова как для мембраносвязанных, так и для изолированных РЦ, то есть увеличение ширины сигнала Р+ не связано с процессом выделения РЦ из мембран. Исследования электрохимических свойств РЦ показали, что для РЦ I(L177)H значение ЕШ(Р/Р+) равно 450 ± 15 мВ, в то время как для РЦ дикого типа эта величина составляет 500 ± 10 мВ, то есть мутация незначительно влияет на окислительно-восстановительные свойства первичного донора электрона в мутантных РЦ.

В экстракте пигментов из РЦ дикого типа соотношение БХл/БФео равно 2, тогда как в экстракте пигментов из РЦ I(L177)H это соотношение равно 1.5. Было обнаружено, что из РЦ I(L177)H одна молекула БХл не экстрагируется органическими растворителями, такими как ацетон, метанол, гексан, диметилформамид, диметидсульфоксид, толуол. Согласно результатам ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле в РЦ I(L177)H образуется ковалентная связь между молекулой БХл и L-субъединицей РЦ (Рис. 4). Примечательно, что в условиях денатурирующего электрофореза сохраняется лигандирование атома магния у БХл ковалентно связанного с белком.

А

2 3 4

П1

а> ь с

0 0) X

1

о

Е

о

с:

400 600 600 700 800 900

Длина волны,нм

400 500 600 700 800 900

Длина волны, нм

31

17

7.5"**

Н

¿¿м

. I-

Рисунок 4. Спектры поглощения пигментов в геле (А) и фотография полиакриламидного геля (Б; 1-маркер кДа, 2-РЦ 1(Ы 77)Н гель до окрашивания, 3-РЦ дикого типа, гель до окрашивания, 4- РЦ 1(Ы77)Н, окрашенный гель).

Так как позиция Ы77 расположена вблизи молекул БХл Рд и Вв, то наиболее вероятно, что именно один из этих пигментов образует ковалентную связь с Ь-белковой субъединицей. Основываясь на данных ДСН-электрофореза, мы предположили, что ковалентная связь образуется между молекулой Рд и Ь-белковой субъединицей. В этом случае образовавшаяся связь фиксирует лиганд атома магния на оптимальном для координирования расстоянии от БХл Рд, предотвращая феофитинизацию молекулы БХл в денатурирующих условиях.

Для исследования свойств БХл, ковалентно связанного с белком, реакционные центры обрабатывали пептидазами, такими как трипсин, химотрипсин, протеиназа К. В результате был получен фрагмент Ь-субъединицы (не менее 22 аминокислотных остатков), ковалентно связанный с БХл (БХл-пептид,). Сравнение спектров поглощения свободного БХл и БХл, связанного с участком Ь-субъединицы показало, что ковалентно связанный пигмент характеризуется длинноволновым сдвигом максимумов полос поглощения (Рис. 5-

А). Анализ ЭПР спектров триплетного состояния свободного БХл и ковалентно связанного с пептидом БХл не выявил различий между ними (Рис.5-Б).

-150

Б

-.160

--170

-180

500 600 700 800 900 3000 Длина волны,нм

В, с

3500

Рисунок 5. Спектр поглощения свободного БХл (.....) и ковалентно связанного с пептидом

БХл (—) в ТТ буфере, в присутствии 20% метанола и 5% ДСН (А); ЭПР спектр триплетного состояния свободного БХл (.....) и БХл, ковалентно связанного с пептидом (—) в ДСН (Б).

Эти данные позволяют сделать вывод о том, что 7с-электронная система молекулы БХл, ковалентно связанной с белком, не изменилась. По-видимому, причиной длинноволнового сдвига максимумов полос поглощения у ковалентно связанного БХл является сохранение белкового окружения пигмента.

Исследование свойств ковалентно связанного БХл показало, что связь стабильна при рН 8 и при рН 3. Было установлено, что одна из реакционноспособных групп этой молекулы БХл, С-31 ацетильная группа, не задействована в образовании ковалентной связи, так как при обработке образцов свободного БХл и БХл, ковалентно связанного с белком, боргидридом натрия эта группа восстанавливается до гидроксиэтильной, что сопровождается коротковолновым сдвигом максимумов полос поглощения БХл. Согласно данным ЭПР спектроскопии я-электронная система ковалентно связанной с белком молекулы БХл не изменилась, следовательно по положению С-20, участвующему в системе сопряженных связей, реакция маловероятна. Так как мы предполагаем, что в образовании ковалентной связи участвует БХл Ра, то неизменность величины окислительно-восстановительного потенциала Р/Р+ указывает, что С-131 кето группа не принимает участия в образовании ковалентной связи. Результаты, полученные при измерении дифференциальных (свет-минус-темнота) ИК-ФТ спектров РЦ мутанта исключают участие С-132 эфирной группы.

Для получения дополнительной информации о природе спектральных и структурных изменений, вызванных аминокислотным замещением 1(1Л77)Н, мы заменили аминокислотные остатки гистидинов - лигандов атомов магния молекул Вв и Ра - на лейципы (мутации Н(М182)Ь и Н(Ь173)Ь, соответственно). Ожидалось, что мутации приведут к появлению бактериофеофитинов в сайтах связывания указанных бактериохлорофиллов. В ходе работы были получены генетически модифицированные РЦ £Ьа. $ркаего1<1е5 с новыми комбинациями аминокислотных замещений 1(1Л77)Н+Н(М 182)1, и 1(1Л 77)Н+Н(Ы 73)Ь и изучены их свойства.

Реакционные центры ЯЬа. ьркаегоШез с заменами 1(1Л77)Н+Н(М182)1>.

При выделении РЦ этого двойного мутанта было отмечено, что пигмент-белковые комплексы характеризуются меньшей стабильностью по сравнению с РЦ дикого типа и 1(Ь177)Н. При использовании детергента Тритон Х-100 (ТТ буфер) были получены РЦ двойного мутанта с соотношением БХл/БФео равным 1.5, как и в РЦ 1(Ы77)Н. При этом одна молекула БХл оставалась ковалентно связанной с белком, как и в РЦ 1(Ь 177)Н. Неизменность пигментного состава РЦ двойного мутанта указывает на сохранение лигандирования атома магния БХл Вв в отсутствие нативного лиганда Н1з-М182. В спектре поглощения РЦ 1(1Л77)Н+Н(М182)Ь появляются полосы поглощения с максимумами при 588 нм и 819 нм (Рис. 6-А), которые соответствуют поглощению молекулы БХл Вв с лигандом, расположенным с (3-стороны макроцикла.

600 700 800

Длина волны, нм

600 700 800 900 1000

Длина волны, нм

Рисунок 6. Низкотемпературные (90К) спектры поглощения РЦ 1(Ы77)Н+Н(М182)Ь в ТТ (А) и ТЛ (Б) буфере и их вторые производные.

При использовании другого детергента, ЛДАО, получили РЦ с соотношением БХл/БФео, равным 1.26, при этом одна молекула БХл оставалась ковалентно связанной с белком. В спектре поглощения РЦ 1(1Л77)Н+Н(М182)Ь в ЛДАО наблюдаются две полосы поглощения с максимумами при 819 нм и 789 нм, расположенные на коротковолновом и длинноволновом склоне полосы поглощения БХл Вд при 803 нм (Рис. 6-Б). Появление полосы поглощения с максимумом при 819 нм отражает поглощение молекулы БХл Вв с лигандом атома магния, расположенным с Р-стороны макроцикла, а полоса поглощения с максимумом при 789 нм приписывается БФео, находящемуся в сайте связывания Вв. Анализ спектра поглощения РЦ двойного мутанта и данные пигментного анализа указывают на изменения пигментного состава, вызванные частичной феофитинизацией БХл Вв при действии ЛДАО на РЦ. Следует отметить, что в спектре пигмента, ковалентно связанного с белком, присутствовали только полосы БХл. Это является свидетельством того, что не БХл Вв, а БХл Рд участвует в образовании ковалентной связи с белком РЦ 1(1Л77)Н и 1(1Л77)Н+Н(М182)Ь.

В структуре РЦ с Р-стороны БХл Вв отсутствуют аминокислотные остатки, способные образовать координационную связь к атому магния БХл. Разное соотношение БХл/БФео в экстракте пигментов из обоих образцов РЦ указывает на нестабильность координирования и подвижность лиганда атома магния. Основываясь на этих данных было высказано предположение, что в качестве лиганда к атому магния БХл Вв выступает молекула воды. Это предположение подтверждается появлением в <3х области спектра полосы поглощения БХл с максимумом при 588 нм. Возможно, лигандом атома магния БХл Вв является консервативная молекула воды «Б», расположенная вблизи молекул БХл Рд и Вв, положение которой может изменяться при аминокислотном замещении 1(Ы77)Н.

Реакционные центры НЬа. зркаегоЫея с заменами 1(Ы77)Н+Н(Ы73)Ь.

На рис. 7-А приведена модель структуры РЦ с двойным замещением 1(Ы77)Н+Н(Ы73)Ь. В литературе описаны РЦ с замещением гистидина на лейцин в Ы73 позиции и показано, что такое замещение приводит к образованию гетеродимера первичного донора электрона. Реакционные центры, где первичный донор электрона представлен гетеродимером, содержат 3 молекулы БХл и 3 БФео на РЦ.

\ Б

11 V М 532544597 1 8( 842 34

я

о

3

о

в

а В Я о

о

Ь

500 600 700 800 900

Длина волны, нм

1000

Рисунок 7. Смоделированная структура мутантного РЦ 1(1Л77)Н+Н(1Л73)Ь (А) и спектр поглощения РЦ 1(Ы77)Н+Н(1Л73)Ь и его вторая производная (Б).

Результаты пигментного анализа показывают, что в РЦ двойного мутанта 1(1Л77)Н+Н(1Л73)1, пигментный состав такой же, как и в РЦ дикого типа, то есть соотношение БХл/БФео равно 2. Данные оптической спектроскопии с высоким временным разрешением указывают, что время жизни состояния Р* в РЦ двойного мутанта увеличилось вдвое по сравнению с аналогичным показателями для РЦ дикого типа.

В дифференциальном (свет-минус-темнота) ИК-ФТ спектре поглощения РЦ дикого типа (Рис. 8) амплитуда полосы при 2600 см"1 зависит от взаимодействия между двумя молекулами БХл первичного донора электрона, а полосы при ~ 1290, 1480 и 1550 см'1 принадлежат окисленной форме первичного донора электрона. В дифференциальном (свет-минус-темнота) ИК-ФТ спектре поглощения РЦ двойного мутанта наблюдается уменьшение амплитуды этих полос, что указывает на изменения во взаимодействии БХл в специальной паре Р (Рис. 8).

Коротковолновый сдвиг полосы поглощения специальной пары, результаты, полученные при измерении дифференциальных (свет-минус-темнота) ИК-ФТ спектров поглощения РЦ 1(Ы77)Н+Н(1Л73)Ь, а также данные спектроскопии с высоким временным разрешением свидетельствуют об изменении взаимодействия между молекулами БХл внутри димера.

й 5

I

2600 4iiP

1 2600 и/ V

|Г' ' '

4000 3500 3000 2500 2000 1500 Волновое число, см"^

Рисунок 8. Дифференциальные (свет-минус-темнота) ИК-ФТ спектры РЦ дикого типа (1) и РЦ I(L 177)H+H(L 173)L (2).

Несмотря на изменения, вызванные аминокислотными замещениями I(L177)H+H(L173)L, полученные данные указывают на то, что в РЦ двойного мутанта первичный донор электрона остался гомодимером БХл. Следовательно, в РЦ двойного мутанта лигандирование атома Mg молекулы БХл РА сохраняется, однако роль лиганда атома Mg теперь выполняет другая молекула. В РЦ двойного мутанта вблизи БХл РА находятся 3 потенциальных лиганда атома Mg, это аминокислотные остатки гистидинов (His-L168 и His-L177) и консервативная молекула воды. При аминокислотном замещении His—>Leu молекула воды не может быть лигандом к атому магния вследствие гидрофобности лейцина. В нативных реакционных центрах пурпурных бактерий лигандом к атому магния всегда является аминокислотный остаток гистидина. При моделировании аминокислотных замещений с помощью программы Swiss pdb viewer было показано, что расстояние между гистидшгом в позиции L168 и атомом магния БХл РА составляет ~ 6.9 А, а расстояние между His-L177 и атомом магния БХл РА ~ 3.9 А. Если бы лигандом атома магния БХл Рд был His-L168, то, вследствие исчезновения водородной связи между His-L168 и С-3'-ацетильной группой БХл РА, величина Еш (Р/Р+) уменьшилась бы на 80 мВ. Согласно нашим данным в РЦ I(L177)H+H(L173)L значение Ет (Р/Р*) (485 ± 15 мВ) близко к аналогичному показателю для РЦ дикого типа (500 ± 10 мВ), следовательно, водородная связь между аминокислотным остатком His-L168 и С-3'-ацетильной группой БХл РА сохранилась. Этот факт позволяет нам утверждать, что наиболее вероятным лигандом к атому магния БХл Рд является His-L177. Изменения спектральных свойств первичного

донора электрона в РЦ I(L177)H+H(L173)L могут быть вызваны как смещением плоскостей макроциклов относительно друг друга, так и тем, что лиганд к атому магния БХл РА располагается под углом к плоскости молекулы пигмента. Показано, что изменение положения лиганда атома Mg БХл Ра в РЦ H(L173)L+I(L177)H влияет на спектральные свойства Р, но не оказывает влияния па функционирование пигмент-белкового комплекса.

Изучение свойств РЦ с двойными аминокислотными замещениями помогло понять характер изменений локальной структуры РЦ и пигмент-белковых взаимодействий, вызванных одиночным замещением lie—»His в позиции L177. РЦ двойного мутанта H(MI82)L+I(L177)H стали доказательством того, что в РЦ I(LI77)H атом магния БХл Вв 6™-координирован, а также помогли установить, что в образовании ковалентной связи с белком участвует БХл Рд. Падение дипольной силы полосы Р наблюдается только в тех мутантных РЦ, где обнаруживается ковалентная связь между БХл и белком, что свидетельствует об участии БХл Рд в образовании связи с L-субъединицей РЦ. Коротковолновый сдвиг максимума полосы поглощения первичного донора электрона Р в спектрах поглощения РЦ I(L177)H+H(LI73)L, напротив, не связан с образованием ковалентной связи между БХл и белком и может быть обусловлен как смещением плоскостей макроциклов относительно друг друга, так и изменением положения лиганда к атому магния БХл Рд.

Выводы.

1. В реакционные центры Rba. sphaeroides вблизи молекул БХл Рд и Вв введены новые комбинации аминокислотных замещений I(L177)H, H(L173)L+I(L177)H, Н(М 182)L+I(L 177)Н.

2. Показано, что в результате мутации I(L177)H в РЦ Rba. sphaeroides атом магния БХл Вв становится шести координированным, что приводит к появлению полосы 638 нм в видимой области спектра поглощения РЦ.

3. Впервые показано, что в результате аминокислотного замещения I(L177)Н образуется ковалентная связь между молекулой БХл Рд и L-субьединицей РЦ.

4. Установлено, что в генетически модифицированных РЦ H(M182)L+I(L177)H наблюдается случай [3-лигандирования атома магния бактериохлорофилла в реакционных центрах пурпурных бактерий.

5. Показано, что в РЦ H(L173)L+I(L177)H смещение аминокислотного остатка гистидина - лиганда атома магния БХл Рд с L173 на L177 позицию приводит к 45-нм

коротковолновому сдвигу максимума полосы поглощения Р, но не оказывает заметного влияния на электрохимические свойства первичного донора электрона и фотохимическую активность РЦ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи:

1. Хатыпов Р.А., Васильева Л.Г., фуфина Т.Ю.. Болгарина Т.И., Шувалов В.А. Влияние замещения изолейцина L177 гистидином на пигментный состав и свойства реакционного цента пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. II Биохимия. 2005. том 70. вып. 11 с. 1527-1533.

2. Fufina T.Y.. Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. Substitution of isoleucine L177 by histidine in Rhodobacter sphaeroides reaction center results in the covalent binding of PA molecule bacteriochlorophyil to L subunit. // FEBS letters. 2007. V. 581. p. 5769-5773.

3. Забелин A.A., Фуфина Т.Ю.. Васильева Л.Г, Шкуропатова В.А, Зверева М.Г., Шкуропатов А .Я., Шувалов В.А. Мутантные реакционные центры Rhodobacter sphaeroides I(L177)H с прочно связанным бакгериохлорофиллом а: структурные свойства и пигмент-белковые взаимодействия. // Биохимия. 2009. том 74 с. 86-94.

4. Фуфина Т.Ю., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. Исследование стабильности мутантного фотосинтетического реакционного центра Rb. sphaeroides I(L177)H и определение местоположения бактериохлорофилла, ковалентао связанного с белком. // Биохимия, 2010, №2, том 75. с. 256-263.

Тезисы:

1. Фуфина Т.Ю.. Васильева Л.Г., Хатыпов Р.А., Болгарина Т.И., Шувалов В.А. Влияние направленной мутации I(L177)H на пигментный состав и свойства реакционного цента пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. И Сборник тезисов 9-ой международной конференции молодых ученых. 2005. Пущино.

2. Fufina T.Y.. Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Klenina I.B., Bolgarina T.I., Shuvalov V.A. Pigment composition and properties of the mutant reaction center of Rb. sphaeroides I(L177)H. // 15 IUPAB and 5 EBSA International Biophysics Congress. 2005. Montpellier, France.

3. Васильева Л.Г., Хатыпов P.A., Фуфина Т.Ю.. Болгарина Т.И., Шувалов В.А. Пигментный состав и свойства мутантных реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides I(L177)H. // XVIII Путинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе. 2005. Пущино.

4. Khatypov R.A., Vasilyeva L.G., Fufina T.Y.. Bolgarina Т. I., Klenina I.B., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V. A. Substitution of isoleucine L177 by histidine affects the pigment composition and properties of the reaction center of the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. II «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке».2005. Москва.

5. Fnfina T.Y.. Zabelin А.А., Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Proskuryakov I.I., Shkuropatova V.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A.Properties of the Rhodobacter sphaeroides I(L177)H mutant reaction center. / International meeting " Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems". 2006. Pushchino.

6. Leonova M.M., Vasilieva L.G., Fufina T.Y.. Khatypov R.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. Spectral and photochemical properties of the Rhodobacter sphaeroides

reaction center mutated at the position LI 53. // International meeting " Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems". 2006. Pushchino.

7. Vasilieva L.G., Fufma T.Y.. Leonova M.M., Khatypov R.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. Spectral properties of bacterial reaction center with amino acid substitutions near P and В molecules. // 20 IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11 FAOMB Congress. 2006. Kyoto, Japan.

8. Vasilieva L.G., Fufina T.Y.. Leonova M.M., Khatypov R.A., Zabelin A.A., Shkuropatov A.Ya, Shuvalov V.A. Properties of bacterial reaction center with amino acid substitutions near P and В molecules. // 12 International Symposium on Phototrophic Prokariotes. 2006. Pau, France.

9. Fufina T.Y.. Vasilieva L.G., Leonova M.M., Khatypov R.A., Proskuryakov I.I., Zabelin A.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A."Properties and pigment composition of Rhodobacter sphaeroides mutant reaction centers with substitutions near P and В molecules. // III Belarus-Germany Symposium'TBiophysics of Photosynthesis Intracellular Signaling and Gene Regulation in Plants. 2007. Minsk, Belarus.

10. Фуфина Т.Ю.. Васильева JI.Г., Забелин А.А., Хатыпов Р.А., Проскуряков И.И., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. Пигментный состав и свойства мутантного реакционного центра I(L177)H Rhodobacter sphaeroides. II Сборник тезисов 11-ой международной конференции молодых ученых. 2007. Пущино.

11. Fufina Т. Y., Vasilieva L.G., Khatypov R. A., Proskuryakov I. I., Zabelin A. A., Shkuropatov A. Ya., Shuvalov V. A. "The mutant I(L177)H reaction center of Rhodobacter sphaeroides-. properties and pigment composition. // 6th European Biophysics Congress. 2007. London, UK.

12. Fufina T.Y., Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Shuvalov V.A. Substitution of lie LI 77 by His in Rhodobacter sphaeroides reaction center results in covalent binding of Рд molecule to L subunit. // 7 International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors in Photosynthetic 0rganisms.2007. Kyoto, Japan.

13. Vasilieva L.G., Fufina T.Y.. Khatypov R.A., Proskuryakov I.I., Zabelin A.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. Properties of Rhodobacter sphaeroides mutant I(LI77)H reaction center. // 7 International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors in Photosynthetic Organisms. 2007. Kyoto, Japan.

14. Fufina T.Y.. Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Shuvalov V.A. Substitution of lie L177 by His in Rhodobacter sphaeroides reaction center affects interaction of BChI molecule with protein environment. //15 European Bioenergetics Conference. 2008. Dublin, Ireland.

15. Klenina I., Kuzmin A., Fufina Т.. Proskuryakov I. Structural changes accompanying electron transfer from primary to secondary electron acceptor of bacterial reaction center. / V съезд Российского Фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». 8-13 июня, 2008. Пущино.

16. Vasilieva L.G., Fufina T.Y.. Khatypov V.A., Shuvalov V.A. Properties of Rhodobacter sphaeroides mutant I(L177)H reaction center. // V съезд Российского Фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». 2008. Пущино.

17. Shkuropatov A.Ya., Zabelin А.А., Fufina T.Y.. Vasilieva L.G., Zvereva M.G., Shkuropatova V.A., Shuvalov V.A. Purple bacteria reaction centers with modified pigment and aminoacid composition. // V съезд Российского Фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». 2008. Пущино.

18.Fufina T.Y.. Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Shuvalov V.A.The spectral and photochemical properties of H(L173)+I(L177)H mutant reaction center of purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. II V съезд Российского Фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе». 2008. Пущино.

19. Фуфина Т.Ю. Спектральные свойства мутантов бактерий с модифицированной специальной парой. // 6 Всероссийская Школа - Симпозиум « Динамика и структура в химии и биологии». 2008. Пансионат Юность, Московская область.

20. Проскуряков И.И., Фуфина Т.Ю., Кузьмин А.Н., Кленина И.Б. Конформационные изменения, сопровождающие перенос электрона в фотосинтетических реакционных центрах: измерения спектров ЭПР радикальных пар. // Современная химическая физика, XX симпозиум, 2008. Пансионат «Буревестник», г. Туапсе,

21. Vasilieva L., Fufina Т.. Khatypov R., Shkuropatov A. and Shuvalov V. Substitution of lie LI 77 by His in Rhodobacter sphaeroides reaction center results in the covalent binding of a BChl molecule to the L subunit. // Gordon Reseach Conference on Photosynthesis, Mount Holyoke College, South Hadley, 2008. MA, USA.

22. Фуфина Т.Ю.. Васильева Л.Г, Хатьшов Р.А., Шувалов В.А Влияние аминокислотных замещений вблизи молекул бактериохлорофиллов на свойства реакционного центра пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. II «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах». 2009. Пущино.

23. Vasilieva L.G., Fufina Т. Y.. Khatypov R.A., Shuvalov V.A. Properties of Rhodobacter sphaeroides mutant I(L177)H reaction center // XIII European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, August 28 - September 2.2009, Palermo, Italy.

(/у

Заказ № 296. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фуфина, Татьяна Юрьевна

Список условных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Компоненты фотосинтетической мембраны.

1.2. Фотосинтетические пигменты.

1.2.1. Бактериохлорофиллы и хлорофиллы.

1.2.2. Фикобилины.

1.2.3. Каротиноиды.

1.3. Особенности координирования атома магния (бактерио)хлорофиллов в фотосинтетических комплексах.

1.4. Типы, состав и структура фотосинтетических реакционных центров.

1.5 Перенос электрона в бактериальном реакционном центре.:.

1.6 Исследование механизмов переноса электрона в бактериальных реакционных центрах.

1.6.1. Замещение кофакторов переноса электрона.

1.6.2. Сайт - направленный мутагенез РЦ пурпурных бактерий.

1.6.2.1. Использование методов молекулярной биологии для получения РЦ Rba. sphaeroides, в которых отсутствуют кофакторы переноса электрона.

1.6.2.2. Замещение кофакторов переноса электрона в РЦ Rba. sphaeroides при помощи методов генной инженерии.

1.6.2.3. Мутации, которые приводят к изменению водородных связей вблизи кофакторов.

1.6.2.4. Мутации, связанные с изменением ароматических аминокислотных остатков.

1.6.2.5. Изучение роли консервативных молекул воды в бактериальном РЦ.

1.6.2.6. Мутации, способствующие переносу электрона по В-цепи.

1.6.2.7. Мутации, приводящие к изменению симметрии РЦ.

1.6.2.8. Создание химерных РЦ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Используемые в работе бактериальные штаммы и плазмиды.

2.1.2. Антибиотики, используемые в работе.

2.1.3. Буферы и среды, используемые в работе.

2.2. Микробиологические и молекулярно-биологические методы исследования.

2.2.1. Выращивание бактериальных штаммов.

2.2.2. Выделение тотальной ДНК Rba.sphaeroid.es.

2.2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.4. Полимеразная цепная реакция.

2.2.5. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле.

2.2.6. Препаративное выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.

2.2.7. Лигирование молекулы вектора и фрагмента.

2.2.8. Электропорация.

2.2.9. Перенос плазмид для комплементации из Е. coli в Rba. sphaeroides.

2.3. Методы исследования реакционных центров.

2.3.1. Выделение реакционных центров.

2.3.2. Измерение спектров поглощения РЦ.

2.3.3. Измерение дифференциальных (свет-минус-темнота) спектров.

2.3.4. Определение пигментного состава.

2.3.5. Измерение дифференциальных (свет-минус-темнота) ИК-ФТ спектров.

2.3.6. Измерение окислительно-восстановительного потенциала первичного донора электрона Р.

2.3.7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

2.3.8. Обработка РЦ боргидридом натрия.

2.3.9. Исследование стабильности РЦ.

2.3.10. Обработка РЦ I(L177)H протеазами.

2.3.11. Мягкая денатурация мутантных РЦ при помощи 8 М раствора мочевины.

2.3.12. Измерение спектров ЭПР.

2.3.13. Фемтосекундная спектроскопия РЦ дикого типа и генетически модифицированных РЦ I(L177)H и I(L177)H+H(L173)L.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Внесение направленных аминокислотных замещений в РЦ Rba. sphaeroides.

3.1.1. Внесение направленного аминокислотного замещения I(L177)H в РЦЯЬя. sphaeroides.

3.1.2. Внесение направленных аминокислотных замещений H(L 173)L+I(L 177)Н в РЦ Rba. sphaeroides.

3.1.3. Внесение направленных аминокислотных замещений I(L 177)Н+Н(М182)L в РЦ Rba.sphaeroides.

3.2. Особенности выделения и очистки РЦ с аминокислотными заменами I(L177)H; I(L 177)H+H(L 173)L; I(L177)H+H(M182)L.

3.3. Спектры поглощения реакционных центров I(L177)H; I(L 177)H+H(L 173 )L; I(L177)H+H(M182)L, измеренные при комнатной температуре.

3.4. Дифференциальные (свет минус темнота) спектры реакционных центров I(L177)H; I(L 177)H+H(L 173 )L; I(L177)H+H(M182)L, измеренные при комнатной температуре.

3.5. Спектры поглощения реакционных центров I(L177)H; I(L 177)H+H(L 173 )L; I(L177)H+H(M182)L, измеренные при низких температурах.

3.6. Пигментный анализ РЦ дикого типа и генетически модифицированных РЦ.

3.7. Спектры поглощения РЦ дикого типа и I(L177)H, I(L177)H+H(L173)L, I(L177)H+H(M182)L после экстрагирования пигментов.

3.8. Исследование РЦ с прочносвязанной молекулой БХл методом электрофореза в денатурирующих условиях.

3.9. Измерение окислительно-восстановительного потенциала РЦ дикого типа и I(L177)H, I(L177)H+H(L173)L.

3.10 Исследование свойств РЦ I(L177)H.

3.10.1. Исследование стабильности РЦ I(L177)H.

3.10.2. Первичные процессы разделения зарядов в РЦ I(L177)H.

3.10.3. Исследование состояния Р+ методом ЭПР.

3.11. Определение положения БХл, ковалентно связанного с белком.

3.12. Исследование свойств БХл, ковалентно связанного с белковой субъединицей.

3.12.1. Исследование стабильности связи при кислых и нейтральных значениях рН.

3.12.2. Обработка протеазами белка РЦ с ковалентно связанным БХл

3.12.3. Взаимодействие ковалентно связанного с белком БХл с боргидридом натрия.

3.12.4. Исследование спектральных свойств БХл, ковалентно связанного с белком РЦ.

3.12.5. ЭПР спектры триплетного состояния свободного БХл и БХл, связанного с белком.

3.13. Измерение дифференциальных ИК-ФТ спектров РЦ дикого типа и I(L 177)H+H(L 173)L.

3.14. Первичные процессы разделения зарядов в РЦ I(L177)H+H(L173)L.l

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние аминокислотных замещений вблизи молекул бактериохлорофиллов PA и Bb на свойства реакционного центра Rhodobacter sphueroides"

Актуальность темы.

Актуальность изучения фотосинтеза связана с тем, что этот процесс обеспечивает возможность существования жизни на Земле. Известно, что одним из ключевых этапов фотосинтеза являются первичные фотопроцессы реакции, в которых энергия света, поглощенная пигментами фотосинтезирующего организма, преобразуется в энергию химических связей. Начальные этапы фотосинтеза можно назвать «энергетическими воротами жизни», так как именно там происходит непосредственное взаимодействие физических явлений (электронного возбуждения, переноса электрона) с биологическими. Преобразование энергии света происходит в фотосинтетических реакционных центрах (РЦ). РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех белковых субъединиц (Н, М и L) и десяти кофакторов переноса электрона. Структура этого РЦ впервые была определена в 1984 г. в лаборатории Michel, Германия, открыв возможности для детального исследования механизмов первичных стадий фотосинтеза. Фотоиндуцированное разделение зарядов в РЦ является сверхбыстрым процессом, квантовый выход которого близок к единице. Согласно современным представлениям, высокая эффективность функционирования РЦ определяется свойствами кофакторов, их взаимодействием друг с другом и с белковым окружением. Исследования реакционных центров пурпурных бактерий внесли огромный вклад в понимание механизмов трансформации энергии при фотосинтезе и утвердили бактериальные РЦ в качестве хорошей модели для изучения переноса электрона в биологических системах. Одним из подходов к изучению роли белкового окружения в функционировании РЦ является направленный мутагенез, а именно селективное замещение консервативных аминокислотных остатков в участках связывания хромофоров. Сочетание этого метода с современными биохимическими и биофизическими методами является перспективным подходом к исследованию механизмов начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и изучению роли белка в этом процессе.

Цель работы и задачи исследования.

Целью работы было выяснение влияния белкового окружения вблизи молекул бактериохлорофиллов Рд и Вв на свойства и функциональную активность РЦ Rhodobacter sphaeroides. В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:

• Внесение направленных мутаций в pufL- и pufM- гены реакционного центра Rba. sphaeroides.

• Подбор условий для выделения генетически модифицированных РЦ I(L177)H, H(L173)L+ I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H и их выделение.

• Исследование влияния аминокислотных замещений в L177, L173 и Ml82 позициях на свойства генетически. модифицированных РЦ I(L177)H, H(L173)L+ I(L177)H и H(M182)L+ I(L177)H.

Научная новизна.

С помощью метода сайт-направленного мутагенеза были созданы новые комбинации аминокислотных замещений I(L177)H, H(L 173)L+I(L 177)Н и H(M182)L+ I(L177)H в реакционном центре Rba. sphaeroides. Получены РЦ I(L177)H, в которых атом магния БХл Вв 6™-координирован. Показано, что в результате аминокислотного замещения Не

His в РЦ I(L177)H и I(L177)H+H(M182)L произошло ковалентное связывание i молекулы БХл и L-субъединицы. Получены РЦ двойного мутанта I(L177)H+H(M182)L, где лиганд атома магния молекулы БХл Вв расположен не с обычной, а- стороны, а с (3-стороны макроцикла тетрапиррольного кольца. Установлено, что в РЦ H(L 173)L+I(L 177)Н, в отсутствие природного лиганда атома магния — гистидина L173, аминокислотный остаток гистидина L177 лигандирует атом магния бактериохлорофилла РА.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на 9-ой и 11 международных конференциях молодых ученых (Пущино, 2005; 2007), Международном биофизическом конгрессе (Франция, 2005), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе (Пущино, 2005), На международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру» (Пущино,

2006), Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Япония, 2006), Международном симпозиуме по фотосинтетическим прокариотам (Франция, 2006), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Япония,

2007), Европейской биоэнергетической конференции (Ирландия, 2008), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), на Гордоновских чтениях по фотосинтезу

США, 2008), на конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), и на XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009).

Связь с планом научно-исследовательского института.

Тема диссертации является частью плановой темы института. Работа выполнялась при финансовой поддержке Федеральным агентством по науке и инновациям Российской академии наук (02.512.11.2085; 02.740.11.0293), программами Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Экстремальные световые поля и их приложение», грантом Президента РФ НШ-3277.2006.4; НШ-4525.2008.4) и РФФИ (03-04-48215; 06-04-48686; 09-04-00109).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 27 работ, из них одна статья в зарубежном журнале FEBS letters, три статьи в отечественном журнале Биохимия, 23 тезиса в материалах отечественных и международных конференций.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 153 страницах, иллюстрирована 49 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 190 источников (из них 178 на английском языке).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фуфина, Татьяна Юрьевна

ВЫВОДЫ:

1. В реакционные центры Rba. sphaeroides вблизи молекул БХл РА и Вв введены новые комбинации аминокислотных замещений I(L177)H, H(L 173 )L+I(L 177)Н, H(M182)L+I(L177)H.

2. Показано, что в результате мутации I(L177)H в РЦ Rba. sphaeroides атом магния БХл Вв становится шести координированным, что приводит к появлению полосы 638 нм в видимой области спектра поглощения РЦ.

3. Впервые показано, что в результате аминокислотного замещения I(L177)H образуется ковалентная связь между молекулой БХл РА и L-субъединицей РЦ.

4. Установлено, что в генетически модифицированных РЦ H(M182)L+I(L177)H наблюдается случай |3-лигандирования атома магния бактериохлорофилла в реакционных центрах пурпурных бактерий.

5. Показано, что в РЦ H(L173)L+I(L177)H смещение аминокислотного остатка гистидина - лиганда атома магния БХл РА с L173 на L177 позицию приводит к 45-нм коротковолновому сдвигу максимума полосы Р, но не оказывает заметного влияния на электрохимические свойства первичного донора электрона и фотохимическую активность

РЦ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фуфина, Татьяна Юрьевна, Пущино

1. Allen J.P., Feher G., Yeates Т.О., Komiya H., Rees D.S. Strucrure of reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26: the cofactors // PNAS, 1987. v. 84. p. 5730-5734.

2. Angerhofen A., Bittl R., Radicals and Radical Pair in Photosynthesis // Photochemistry and Photobiology, 1996. v. 63. p. 11-38.

3. Apt K.E., Collier J.L., Grossman A.R., Evolution of the phycobiliproteins // J Mol Biol., 1995. v. 248. p. 79-96.

4. Arlt Т., Schmidt S., Kaiser W. Lauterwasser C., Meyer M., Scheer H., Zinth W. The accessoiy bacteriochlorophyll: A real electron carier in primary photosynthesis // Ibid., 1993. v. 90, p. 11757-11761.

5. Bacon Ke. Photosynthesis photobiochemistry and photobiophysics. / Kluwer Academic Publishers, 2001.

6. Balaban T.S., Fromme P., Holzwarth A.R., Krauss N., Prokhorenko V.I. Relevance of the diastereotopic ligation of magnesium atoms of chlorophylls in Photosystem I // Biochim Biophys Acta. 2002. v. 1556. p.197-207.

7. Balaban T.S. Are syn-ligated (bacterio)chlorophyll dimers energetic traps in light-harvesting systems? // FEBS Lett.,2003. v. 545. p. 97-102.

8. Barz W.P., Oesterhelt D. Photosynthetic deficiency of a pufX deletion mutant of Rhodobacter sphaeroides is suppressed by point mutations in thelight-harvesting complex genes pufB or pufA // Biochemistry, 1994. v. 33. p. 9741-9752.

9. Bendall D.S. // Photosynthesis: Light Reactions / ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, 2005. p. 1-8.

10. Blankenship R.E. Origin and early evolution of photosynthesis / Photosynth Res. 1992. v. 33. p. 91-111.

11. Bylina E.J., Jovine R., Youvan D.C. I I The Photosynthetic Bacterial Raection center: Structure and Dynamics, eds. Breton J., and Vermeglio A. (Plenum, New York), 1988. p. 113-118.

12. Bylina E.J., Youvan D.C. Directed mutations affecting spectroscopic and electron transfer properties of the primary donor in the photosynthetic reaction center // PNAS, 1988. v. 85. p. 7226-7230.

13. Kirmaier C., Holten D., Bylina E.J., Youvan D.C. Electron Transfer in a Genetically Modified Bacterial Reaction Center Containing a Heterodimer // PNAS, 1988. v. 85. p. 7562-7566.

14. Callahan P, Cotton T. Assignment of bacteriochlorophyll a ligation state from absorption and resonans raman spectra // J. Am. Chem. Soc., 1987. v. 109. p. 7001-7007.

15. Camara-Artigas A., Magee C., Goetsch A., Allen J.P. The structure of the heterodimer reaction center from Rhodobacter sphaeroides at 2.55 Angstrom resolution // Photosynth Res, 2002. v. 74. p. 87-93.

16. Chadwick B.W., Frank H.A. Electron-spin-resonance studies of carotenoids incorporated into reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R26.1 // Biochim Biophys Acta, 1986. v. 851. p. 257-266.

17. Chang C.H., El-Kabbani O., Tiede D., Norris J., Schiffer M. Structure of the membrane-bound protein photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry, 1991. v. 30. p. 5352-5360.

18. Chekalin S.V., Matveetz Yu.A., Shkuroparov A.Ya., Shuvalov V.A., Yartzev A.P. Femtosecond spectroscopy of primary charge separation in modified reaction centers of Rhodobacter sphaeroides (R-26) // FEBS Lett., 1987. v. 216. p. 245-248.

19. Coleman W.J., Youvan D.C. Spectroscopic analysis of genetically modified photosynthetic reaction centers // Annu Rev Biophys Biophys Chem., 1990. v. 19. p. 333-367.

20. Coleman W.J., Youvan D.C. Atavistic reaction center // Nature, 1993. v. 366. p. 517-518.

21. Collins M.L., Buchholz L.A., Remsen C.C. Effect of Copper on Methylomonas albus BG8 // Appl Environ Microbiol, 1991. v. 57. p. 12611264.

22. Comayras F., Jungas C., Lavergne J. Functional consequences of the organization of the photosynthetic apparatus in Rhodobacter sphaeroides: II. A study of PufX- membranes // J Biol Chem., 2005. v. 280. p. 11214-11223.

23. Cotton A. A., Wilkinson G. / Advanced Inorganic Chemistry, 5th ed., John Wiley & Sons, New-York, 1988.

24. Cramer W.A., Engelman D.M., Von Heijne G., Rees D.C. Forces involved in the assembly and stabilization of membrane proteins // FASEB J., 1992. v. 6. p. 3397-3402.

25. Debus R.J., Feher G., Okamura M.Y. LM complex of reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides: characterization and reconstitution with the H subunit // Biochemistry, 1985. v. 24. p. 2488-2500.

26. Debus R.J., Feher G., Okamura M.Y. Iron-depleted reaction centers from Rhodopseudomonas sphaeroides R-26.1—characterization and reconstitution with Fe , Mn ,Co" , Ni~ , Cu~ , and Zn // Biochemistry, 1986. v. 25. p. 2276-2287.

27. DeGrado W.F., Gratkowski T.T., Lear J.P. How do helix-helix interactions help determine the folds of membrane proteins? Perspectives from the study of homo-oligomeric helical bundles // Protein Sci., 2003. v. 12. p. 647-665.

28. Deisenhofer J., Epp K., Miki K., Huber R., Michel H. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction center of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolutions // Nature, 1985. v. 318. p. 618-624.

29. Deisenhofer J., Michel H. Nobel lecture. The photosynthetic reaction centre from the purple bacterium Rhodopseudomonas viridis И EMBO, 1989. v. 8. p. 2149-2170.

30. Ermler U., Fritzsch G., Buchanan S.K., Michel H. Structure of the photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.65 A resolution: cofactors and protein-cofactor interactions // Structure, 1994. v. 2. p. 925-936.

31. Evans T.A., Katz J.J. Evidence for 5-and 6-coordinated Magnesium in bacteriochlorophyll a from visible absorption spectroscopy // Biochim Biophys Acta, 1975. v. 396. p. 414-426.

32. Fiedor L. Hexacoordination of bacteriochlorophyll in photosynthetic antenna LH1 //Biochemistry, 2006. v. 45. p. 1910-1918.

33. Frank H.A., Chadwick B.W., Taremi S., Kolaczkowski S., Bowman M.K. Singlet and triplet absorption-spectra of carotenoids bound in the reaction centers of Rhodopseudomonas sphaeroides R26 // FEBS Letts., 1986. v. 203. p. 157-163.

34. Fyfe P.K., Ridge J.P., McAuley K.E., Cogdell R.J., Isaacs N.W., Jones M.R. Structural consequences of the replacement of glycine M203 with aspartic acid in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides // Biochemistry, 2000. v.39. p. 5953-5960.

35. Garcia-Martin A., Kwa L.G., Strohmann В., Robert В., Holzwarth A.R., Braun P. Structural role of (bacterio)chlorophyll ligated in the energetically unfavorable beta-position // J Biol Chem., 2006. v. 281. p. 10626-10634.

36. Ghosh R., Hauser H., Bachofen R. Reversible dissiciation of the B873 light-harvesting complex frm Rhodospirillum rubrum G9+ // Biochemistry, 1988. v. 27. p. 1004-1014.

37. Gray K.A., Farchjaus J.W., Wachtveitl J., Breton J., Oesterhelt D. Initial characterization of site-directed mutants of tyrosine M210 in the reaction center of Rhodobacter sphaeroides 11EMBO, 1990. v. 9. p. 2061-2070.

38. Gudowska-Nowak E., Newton M.D., Fajer J. Conformational and environmental effects on bacteriochlorophyll spectra: correlations of calculated spectra with structural results // J Phys Chem., 1990. v. 94. p. 5797-5801.

39. Hanson L.K. Molecular orbital theory of monomer pigments / Chlorophylls, In: Scheer H. (ed), CRC Press, Boca Raton, 1991. p. 993-1014.

40. Heathcote P., Fyfe P.K., Jones M.R. Reaction centres: the structure and evolution of biological solar power // Trends Biochem Sci., 2002. v. 27. p.79-87.

41. Heimdal J., Jensen K.P., Devarajan A., Ryde U. The role of axial ligands for the structure and function of chlorophylls // J Biol Inorg Chem., 2007. v. 12. p. 49-61.

42. Heller B.A., Holten D., Kirmaier C. Characterization of bacterial reaction centers having mutations of aromatic residues in the binding-site of the bac.teriopheophytin intermediary electron carrier // Biochemistry, 1995a. p. 34. v. 5294-5302.

43. Heller B.A., Holten D. Kirmaier C. Control of electron-transfer between the L-side and M-side of photosynthetic reaction centers // Science, 1995b. v. 269. p. 940-945.

44. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene, 1989. v. 77. p. 51-59.

45. Hochman A., Friedberg I., Carmeli C. The location and function of cytochrome c2 in Rhodopseudomonas capsulata membranes // Eur. J. Biochem., 1975. v. 58. p. 65-72.

46. Hoff A.J., Deisenhofer J. Photophysics of photosynthesis: Structure and spectroscopy of reaction centres of purple bacteria // Physics Reports-Review Section of Physics Letters, 1997. v. 287. p. 2-247.

47. Holden-Dye K., Crouch L.I., Jones M.R. Structure, function and interactions of the PufX protein // Biochim Biophys Acta., 2008. v. 1777. p. 613-630.

48. Ни X., Schulten K. Model for the light-harvesting complex I (B875) of Rhodobacter sphaeroides II Biophysical Journal, 1998. v. 75 p. 683-694.

49. Hughes A.V., Rees P., Heathcote P., Jones M.R. Kinetic analysis of the thermal stability of the photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides I I Biophys J., 2006. v. 90. p. 4155-4166.

50. Jackson J.A., Lin S., Taguchi A.K.W., Williams J.C., Allen J.P., Woodbury N.W. Energy transfer in Rhodobacter sphaeroides reaction centers with the initial electron donor oxidized or missing // J Phys Chem B, 1997. v. 101. p. 5747-5754.

51. Jones M.R., Visschers R.W., van Grondelle R., Hunter C.N. Construction and characterization of a mutant strain of Rhodobacter sphaeroides with the reaction center as the sole pigment-protein complex // Biochemistry, 1992. v. 31. p. 4458-4465.

52. Joo Т., Jia Y., Yu J.Y., Jonas D., Fleming G. Dinamics in isolated bacterial light harvesting antenna LH2 of Rhodobacter spaeroides at room temperature // J. Phys. Chem., 1996. v. 100. p. 2399-2409.

53. Lavergne J., Vermfiglio A., Joliot P. Functional Coupling Between Reaction Centers and Cytochrome bcl Complexes / The Purple Phototrophic Bacteria Edited by C. Neil Hunter, Fevzi Daldal, Marion C. Thurnauer, J. Thomas Beatty, 2009. p. 509-536.

54. Katilius E., Babendure J.L., Lin S., Woodbury N.W. Electron transfer dynamics in Rhodobacter sphaeroides reaction center mutants with a modifi ed ligand for the monomer bacteriochlorophyll on the active side // Photosynth Res., 2004. v. 81. p. 165-180.

55. Kee H.L., Laible P.D., Bautista J.A., Hanson D.K., Holten D., Kirmaier C. Determination of the rate and yield of B-side quinone reduction in Rhodobacter capsulatus reaction centers // Biochemistry, 2006. vol. 45. p. 7314-7322.

56. Keen N.T., Tamaki S., Kobayashi D., Trollinger D. Improved broad-host-range plasmids for DNA cloning in gram-negative bacteria // Gene, 1988. v. 70. p. 191-197.

57. Kiley P.J., Donohue T.J., Havelka W.A., Kaplan S. DNA sequence and in vitro expression of the В875 light-harvesting polypeptides of Rhodobacter sphaeroides //J. Bacteriol., 1987. v. 169. p. 742-750.

58. Kirmaier C., Bautista J.A., Laible P.D., Hanson D.K., Holten D. Probing the contribution of electronic coupling to the directionality of electron transfer in photosynthetic reaction centers // J Phys Chem B, 2005. v. 109. p. 2416024172.

59. Kirmaier C., Gaul D., DeBey R., Holten D., Schenck C.C. Charge separation in a reaction center incorporating bacteriochlorophyll for bacteriopheophytin // Science, 1991. v. 251. p. 922-927.

60. Kirmaier C., Weems D., Holten D. M-side electron transfer in reaction center mutants with a lysine near the nonphotoactive bacteriochlorophyll // Biochemistry, 1999. v. 38. p. 11516-11530.

61. Kirmaier C.H., Laible P.D., Hanson D.K., Holten D. B-side charge separation in bacterial photosynthetic reaction centers: nanosecond time scale electron transfer from HB- to QB+ // Biochemistry, 2003. v. 42. p. 2016-2024.

62. Klug G., Cohen S.N. Pleiotropic effects of localized Rhodobacter capsulatus puf operon deletions on production of light-absorbing pigment-protein complexes //J Bacteriol., 1988. v. 170. p. 5814-5821.

63. Kuhlbrandt W., Wang D.N., Fujiyoshi Y. Atomic model of plant light-harvesting complex by electron crystallography // Nature, 1994. v. 367. p. 614-621.

64. Lancaster C. R. D. Photosynthetic reaction centers of purple bacteria: John Wiley & Sons, Chichester, 2001.

65. Li Y.-F., Zhou W., Blankenship R. E., Allen J. A. Crystal structure of the bacteriochlorophyll a protein from Chlorobium tepidum. И J. Mol. Biol., 1997. v. 271. p. 456^471.

66. Lilburn T.G., Haith C.E., Prince R.C., Beatty J.T. Pleiotropic effects ofpufiC gene deletion on the structure and function of the photosynthetic apparatus of Rhodobacter capsulatus II Biochim Biophys Acta, 1992. v. 1100. p. 160— 170.

67. Lin S., Katilius E., Ilagan R.P., Gibson G.N., Frank H.A., Woodbury N.W. Mechanism of carotenoid singlet excited state energy transfer in modified bacterial reaction centers // J Phys Chem B, 2006. v. 110. p. 15556-15563.

68. Lin X., Murchison H.A., Nagarajan V., Parson W.W., Allen J.P., Williams J.C. Specific alterations of the oxidation potential of the electron donor in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides IIPNAS, 1994. v. 91. p. 10265-10269.

69. Mattioli T.A., Gray K.A., Lutz M, Oesterhelt D., Robert B. Resonance Raman characterization of Rhodobacter sphaeroides reaction centers bearing site-directed mutations at Tyrosine M210 I I Biochemistry, 1991. v. 30. p. 1715-1721.

70. Mc Dermott G., Prince S. M., Freer A. A., Hawthornthwaite-Lawless A. M., Papiz M. Z., Cogdell R. J., Isaacs N. W. Crystal structure of an integral membrane light-harvesting complex from photosynthetic bacteria // Nature, 1995. v. 374. p. 517-521.

71. McAuley K.E., Fyfe P.K., Ridge J.P., Cogdell R.J., Isaacs N.W., Jones M.R. Ubiquinone binding, ubiquinone exclusion, and detailed cofactor conformation in a mutant bacterial reaction center // Biochemistry, 2000. v. 39. p. 15032-15043.

72. Michel H., Epp O., Deisenhofer J. Pigment protein interactions in the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonas viridis IIEMBO J., 1986. v. 5. p. 2445-2451.

73. Michels P.A.M., Konings W.N. Structural and functional properties of chromatophores and membrane vesicles from Rhodopseudomonas sphaeroides // Biochim. Biophys. Acta., 1978. v. 507. p. 353-368.

74. Moore L., Boxer S.G. Inter-chromophore interactions in pigment-modifi ed and dimer-less bacterial photosynthetic reaction centers // Photosynth Res., 1998. v. 55. p. 173-180.

75. Moore L.J., Zhou H.L., Boxer S.G. Excited-state electronic asymmetry of the special pair in photosynthetic reaction center mutants: Absoiption and stark spectroscopy//Biochemistry, 1999. v. 38. p. 11949-11960.

76. Moser C.C., Keske J.M., Warncke K., Farid R.S., Dutton P.L. Nature of biological electron transfer//Nature, 1992. v. 355. p. 796-802.

77. Oba Т., Tamiaki H. Which side of the pi-macrocycle plane of (bacterio)chlorophylls is favored for binding of the fifth ligand? // Photosynth Res., 2002. v.74. p. 1-10.

78. Oelze J., Drews G. Membranes of photosynthetic bacteria // Biochim. Biophys. Acta, 1972. v. 265. p. 209-239.

79. O'Reilly J.E. Oxidation-reduction potential of the ferro-ferricyanide system in buffer solutions // Biochim Biophys Acta, 1973. v. 292. p. 509-515.

80. Parson W.W. Photosynthetic bacterial reaction centers / In: Bendall DS (ed) Protein Electron Transfer, BIOS Scientific Publishers, Oxford, 1996. p 125— 160.

81. Maroti P., Kirmaier C., Wraight C., Holten D., Pearlstein R. Photochemistry and electron transfer in borohydride-treated photosynthetic reaction centers //Biochimica et Biophysica Acta, 1985. v. 810. p. 132-139.

82. Popot J.L., Engelman D.M. Helical membrane protein folding, stability, and evolution // Annu Rev Biochem., 2000. v. 69. p. 881-922.

83. Prince R.C. Bacterial photosynthesis: from photons to Ap // Bacteria, 1990. v. 12. p. 111-149.

84. Prince R.C., Dutton P.L. A kinetic completion of the cyclic photosynthetic electron pathway of Rhodopseudomonas sphaeroides: cytochrome b-cytochrome c2 oxidation-reduction I I Biochim Biophys Acta, 1975. v. 387. p. 609-613.

85. Qian P., Bullough P.A., Hunter C.N. Three-dimensional reconstruction of a membrane-bending complex: the RC-LHl-PufX core dimer of Rhodobacter sphaeroides IIJ Biol Chem., 2008. v. 283. p. 14002-14011.

86. Reed D.W., Clayton R.K. Isolation of a reaction center fraction from Rhodopseudomonas spheroides II Biochem Biophys Res Commun., 1968. v. 30. p. 471-475.

87. Reimers J. R., Hush N.S. Nature of the ground and first excited states of the radical cations of photosynthetic bacterial reaction centers // Chem. Phys., 1995. v. 197. p. 323-332.

88. Reimers J. R., Hutter M.C., Hush N.S. The spectroscopy of low-lying bands in the special-pair radical-cations of photosynthetic centers // Photosynth. Res., 1998. v. 55. p. 163-171.

89. Ridge J.P., van Brederode M.E., Goodwin M.G., van Grondelle R., Jones M.R. Mutations that modify or exclude binding of the QA ubiquinone and carotenoid in the reaction center from Rhodobacter sphaeroides И Photosynth Res., 1999. v. 59. p. 9-26.

90. Roberts J.A., Holten D., Kirmaier C. Primary events in photosynthetic reaction centers with multiple mutations near the photoactive electron carriers // J Phys Chem B, 2001. v. 105. p. 5575-5584.

91. Robles S.J., Breton J., Youvan D.C. Partial symmetrization of the photosynthetic reaction center // Science, 1990. v. 248. p. 1402-1405.

92. Samatey F.A., Xu C., Popot J.L. On the distribution of amino acid residues in transmembrane alpha-helix bundles // PNAS, 1995. v. 92. p. 4577-81.

93. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. / Molecular cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

94. Scheer H., Struck A. Bacterial reaction centers with modified tetrapyrrole chromophores / In: Deisenhofer J and Norris JR (eds) The Photosynthetic Reaction Center, Academic Press, San Diego, 1993. v. 1. p 157-192.

95. Scheer H. The Pigments / Beverley R. Green and William W. Parson (eds): Light-Harvesting Antennas, Kluwer Academic Publishers, 2003. 512 p.

96. Schiffer M., Norris J.R. Stucture and function of the photosynthetic reaction center of Rhodobacter sphaeroides. / In: The photosynthetic reaction center, Academic Press, 1993. v. l.p. 1-13.

97. Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. Electron transfer in pheophytin-a modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides R-26 // FEBS Lett., 1993. v. 322. p. 168-172.

98. Shreve A.P., Trautman J.K., Frank H.A., Owens T.G., Albrecht A.C. Femtosecond energy-transfer process in the В800-850 light-harvesting complexof Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. //Biochim. Biophys. Acta, 1991. v. 1058. p. 280-288.

99. Shuvalov V.A., Amesz J., Duysens L.N.M. Picosecond charge separation upon selective exitation of the primary electron donor in reaction center of Rhodopseudomonas viridis II Biochim. et Biophys. Acta., 1986. v. 851. p. 327-330.

100. Shuvalov V.A., Duysens L.N.M. Primary electron transfer in modified reaction centers from Rhodobacter sphaeroides II PNAS, 1986. v. 83. p. 1690-1694.

101. Shuvalov V.A., Klimov V.V. The primary photoreactions in the complex cytochrome-P890 P760 (bacteriopheophytin-760) of Chromatium minutissimum at low redox potentials // Biochim. et biophys. Acta., 1976. v. 440. p. 587-599.

102. Shuvalov V.A., Krasnovskii A.A. Photochemical electron transfer in reaction centers of photosynthesis. / Biofizika, 1981. v. 26. p. 544-556.

103. Shuvalov V.A., Yakovlev A.G. Coupling of nuclear wavepacket motion and charge separation in bacterial reaction centers // FEBS Lett., 2003. v. 540. p. 26-34.

104. Simon R., Priefer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria II Biotechnology, 1983. v. 1. p. 787-791.

105. Spiedel D., Jones M.R., Robert B. Tuning of the redox potential of the primary electron donor in reaction centres of purple bacteria: Effects of amino acid polarity and position // FEBS Letts., 2002. v. 527. p. 171-175

106. Stilz H.U., Finkele U., Holzapfel W., Lauterwasser C., Zinth W., Oesterhelt D. Infl uence of M-subunit Thr222 and Trp252 on quinone binding andelectron-transfer in Rhodobacter sphaeroides reaction centers // Eur J Biochem, 1994. v. 223. p. 233-242.

107. Struck A., Muller A., Scheer H. Modified bacterial reaction centers. 4. The borohydride treatment reinvestigated: comparison with selective exchange experiments at binding sites Вл,в and Нл,в // Biochim.Biophys. Acta, 1991. v. 1060. p. 262-270

108. Tandori J., Tokaji Z., Misurda K., Maroti P. Thermodynamics of Light-induced and Thermal Degradation of Bacteriochlorins in Reaction Center Protein of Photosynthetic Bacteria // Photochem. Photobiol., 2005. v. 81. p. 1518-1525.

109. Tehrani A., Beatty J.T. Effects of precise deletions in Rhodobacter sphaeroides reaction center genes on steady-state levels of reaction center proteins: A revised model for reaction center assembly // Photosynth Res, 2004. v. 79. p. 101-108.

110. Tehrani A., Prince R.C., Beatty J.T. Effects of photosynthetic reaction center H protein domain mutations on photosynthetic properties and reaction centerassembly in Rhodobacter sphaeroides I I Biochemistry, 2003. v. 42. p. 89198928.

111. Theiler R., Suter F., Wiemken V., Zuber H. The light-harvesting polypeptides of Rhodopseudomonas sphaeroides R-26.1.1, isolation, purification and sequence analyses // Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem., 1984. v. 365. p. 703-719.

112. Thompson M.A., Zerner M.C., Fajer J. A theoretical examination of the electronic structure and spectroscopy of the photosynthetic reaction center from Rhodopseudomonas viridis IIJ Am Chem Soc, 1991. v. 113. p. 82108215.

113. Tronrud D. E., Schmid M.F., Matthews B.W. Structure and X-ray amino acid sequence of a bacteriochlorophyll a protein from Prosthecochloris aestuarii refined at 1.9 A° resolution // J. Mol. Biol., 1986. v. 188. p. 443454.

114. Trumpower B.L. Cytochrom bcl complex of microorganisms // Molbiol. Rev., 1990. v. 55. p. 101-129.

115. Usui S.,Yu L. Subunit IV (Mr = 14,384) of the cytochrome b-cl complex from Rhodobacter sphaeroides. Cloning, DNA sequencing, and ubiquinone binding domain//J. Biol. Chem., 1991. v. 266. p. 15644-15649.

116. Utschig L.M., Thurnauer M.C., Tiede D.M., Poluektov O.G. Low-temperature interquinone electron transfer in photosynthetic reaction centers from Rhodobacter sphaeroides and Blastochloris viridis: Characterization of

117. QB-states byhigh-frequency electron paramagnetic resonance (EPR) and electron-nuclear double resonance (ENDOR) // Biochemistry, 2005. v. 44. p. 14131-14142.

118. Van der Rest M., Gingras G. The pigment complement of the photosynthetic reaction center isolated from Rhodospirillum rubrum II J. Biological Chem., 1974. v. 249. p. 6446-6453.

119. Vulto S.I.E., Streltsov A.M., Aartsma T.J. Excited state energy relaxation in the FMO complexes of the green bacterium Prosthecochloris aestuarii at low temperatures IIJ Phys Chem B, 1997. v. 101. p. 4845-4850.

120. Wakeham M.C., Jones M.R. Rewiring photosynthesis: engineering wrong-way electron transfer in the purple bacterial reaction centre // Biochem Soc Trans, 2005. v. 33. p. 851-857.

121. Wakeham M.C., Breton J., Nabedryk E., Jones M.R. Formation of a semiquinone at the QB site by A-branch or B-branch electron transfer in the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry, 2004. v. 43. p. 4755-4763.

122. Wakeham M.C., Goodwin M.G., McKibbin C., Jones M.R Photo-accumulation of the P+Qb~ radical pair state in purple bacterial reaction centres that lack the QA ubiquinone // FEBS Letts, 2003. v. 540. p. 234-240.

123. White S.H., Ladokhin A.S., Jayasinghe S., Hristova K. How membranes shape protein structure // J Biol Chem., 2001. v. 276. p. 32395-32398.

124. White S.H., Wimley W.C. Membrane protein folding and stability: physical principles // Annu Rev Biophys Biomol Struct., 1999 v. 28. p. 319-365.

125. Williams J.C., Alden R.G., Murchison H.A., Peloquin J.M., Woodbury N.W., Allen J.P. Effect of mutations near the bacteriochlorophylls in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides II Biochemistry, 1992. v. 31. p. 11029-11037.

126. Williams J.C., Steiner L.A., Feher G. Primary structure of the reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides //Proteins, 1986. v. 1. p. 312-325.

127. Williams J.C., Steiner L.A., Ogden R.C., Simon M.L., Feher G. Primary structure of the M subunit of the reaction center from Rhodopseudomonas sphaeroides IIPNAS, 1983. v. 80. p. 6505-6509.

128. Zilsel J., Lilburn T.G., Beatty J.T. Formation of functional inter-species hybrid photosynthetic complexes in Rhodobacter capsulatus IIFEBS Letts, 1989. v. 253. p. 247-252.

129. Бриттон Г. / Биохимия природных пигментов (1986)

130. Васильева Л.Г., Болгарина Т.И., Хатыпов Р.А., Шкуропатов А.Я., Мияке Д., Шувалов В.А. Замещение валина-157 на тирозин в Lсубъединице реакционного центра Rhodobacter sphaeroides II ДАН, 2001. Том 376. № 6, с. 826-829.

131. Гуринович Г. П., Севченко А. Н., Соловьев К. Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. — Минск: Наука и техника, 1968.

132. Мокроносов А.Т., Гавриленко В.Ф. (1992) Фотосинтез. Физиолого-экологические и биохимические аспекты, Изд-во МГУ, Москва.

133. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1. М.: Наука, 2004. 526 с.

134. Финкелыптейн А.В., Птицын О.Б. (2005) Физика белка, Изд-во Книжный Дом Университет, Москва, 456 с.

135. Фотосинтез под ред. Говинджи Орт. Д. 1987. Москва: Мир с.728.

136. Шайтан К.В. Каким образом электрон движется по белку IIСОЖ., 1999. No 3. С. 55-62.

137. Шувалов В.А. Преобразование солнечной энергии в первичном акте разделения зарядов в реакционном центре фотосинтеза // Москва: наука, 2000. 47с.