Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с измененным белковым окружением мономерного бактериохлорофилла BA

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides с измененным белковым окружением мономерного бактериохлорофилла BA"

на правах рукописи }

Леонова Мария Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ ПУРПУРНОЙ БАКТЕРИИ ЫЮВОВАСТЕК БРНАЕЯОЮЕБ С ИЗМЕНЕННЫМ БЕЛКОВЫМ ОКРУЖЕНИЕМ МОНОМЕРНОГО БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА ВА

03.01.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2013

О V I I ' \ / Г

005060340

Пущино-2013

005060340

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Научные руководители: доктор биологических наук, академик РАН

Шувалов Владимир Анатольевич

кандидат биологических наук, Васильева Людмила Григорьевна

Официальные оппоненты: Москаленко Андрей Анатольевич,

доктор биологических, ИФПБ РАН, ведущий научный сотрудник

Стадничук Игорь Николаевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение пауки Институт имени А.Н. Баха Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Защита состоится «26» июня 2013 г. в 11-00 на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при ИФПБ РАН

по адресу: 142290, г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФПБ РАН Автореферат разослан » мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Фотосинтез является уникальным биосферным процессом, в ходе которого происходит превращение и запасание энергии света в энергию химических связей органических соединений, необходимых для жизнедеятельности большинства организмов Земли. Первичное преобразование поглощенной фотосинтетическими пигментами световой энергии в энергию разделенных зарядов протекает в мембранных белках - реакционных центрах (РЦ) фототрофных организмов, где происходит первичный перенос электрона между кофакторами с образованием трансмембранного потенциала. Квантовая эффективность начальных этапов фотосинтеза, составляющая почти 100%, очевидно, достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов за счет их взаимодействий друг с другом и с окружающим белком.

Исследования РЦ пурпурных аноксигенных бактерий имеют большое значение для понимания принципов и механизмов преобразования энергии при фотосинтезе. Аминокислотная последовательность белков и кристаллографическая структура бактериальных реакционных центров известна с середины 80-х годов XX века [Deisenhofer et al., 1984; Youvan et al., 1984a; Michel et al., 1985; 1986а]. Хорошо охарактеризованные бактериальные РЦ многие годы служат структурной и функциональной моделью для исследования более сложно оргапизовашюй фотосистемы 2 зеленых растений и водорослей. РЦ пурпурных бактерий обладают рядом свойств, делающих их удобным объектом исследований. Среди них можно отметить сравнительную фото- и термостабильность, относительно простую организацию, спектральное разрешение полос поглощения отдельных кофакторов, наличие разработанных методов генетической и химической модификации, позволяющих манипулировать составом и свойствами кофакторов.

Фотосинтетический РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц белка и 10 кофакторов, образующих две структурно-функциональные ветви. Каждая ветвь начинается с димера бактериохлорофиллов (БХл) Р, проходит через молекулы мономерного БХл, бактериофеофитина (БФео), и убихинона. Димер БХл выполняет функцию первичного донора электрона. Перенос электрона в нативных РЦ осуществляется по одной, так называемой А-ветви.

Детальный молекулярный механизм начальной стадии разделения зарядов в бактериальных РЦ остается объектом пристального внимания. До последнего времени активно обсуждалась роль мономерного бактериохлорофилла активной ветви переноса электрона ВА и факторов,

определяющих направленность электронного транспорта. Ранее были предложены две гипотезы переноса электрона от первичного донора Р на баюгериофеофитин НА - по механизму супер-обмена, без непосредственного участия БХл ВА [Martin et al, 1986; Bixon et al., 1989], и двустадийный последовательный перенос с образованием промежуточной радикальной пары Р+ВА~ [Shuvalov et al., 1978]. В процессе исследования нативных и феофитин-замещенных РЦ Rba. sphaeroides методом фемтосекундной спектроскопии была зарегистрирована полоса при 1020 нм, соответствующая поглощению анион-радикала В а", что свидетельствует в пользу второй гипотезы [Arlt et al., 1993; Kennis et al., 1997].

Использование сайт-направленного мутагенеза, позволяющего селективно замещать отдельные аминокислотные остатки в сайтах связывания хромофоров, дает уникальные возможности для исследования начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и роли отдельных пигментных кофакторов и аминокислотных остатков в этом процессе.

Пели и задачи исследования

Целью работы являлось исследование влияния ближайшего белкового окружения первичного акцептора электрона бактериохлорофилла ВА на его спектральные свойства и процессы разделения зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Были поставлены следующие задачи:

1. Внесение сайт-направленных мутаций и получение штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в L-субъединице реакционного центра: H(L153)C, H(L153)L, H(L153)M, H(L153)Y и Y(L128)H; в М-субъединице: H(M182)L, а также с двойным замещением H(L153)Y+H(M182)L.

2. Выделение стабильных генетически-модифицированных реакционных центров, исследование их спектральных свойств и функциональной активности.

3. Исследование нестабильных мутантных РЦ в составе фотосинтетических мембран. Изучение их пигментного состава и фотохимической активности.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены мутантные штаммы Rhodobacter sphaeroides, содержащие реакционные центры с одиночными аминокислотными замещениями гистидина в позиции L153 на цистеин и метионин, а также с двойным замещением, гистидина L153 на тирозин и гистидина М182 на лейцин.

Впервые показано, что замещение гистидина L153 на тирозин в реакционном центре Rba. sphaeroides приводит к потере моиомерного БХл активной цепи кофакторов переноса электрона, сопровождающейся уменьшением стабильности пигмент-белкового комплекса. Впервые исследован процесс переноса электрона в мембраносвязанных мутантных реакционных центрах без первичного акцептора электрона. Методом лазерной спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением установлено, что переноса электрона в РЦ H(L153)Y с восстановленным хиноном QA не происходит, наблюдается лишь релаксация возбужденного состояния специальной пары Р* в основное состояние. Показано значительное замедление скорости электронного транспорта в мутантном РЦ и десятикратное снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами P+Qa~ Выявлено, что такой квантовой эффективности недостаточно для фотосинтетического роста бактерии.

Показано, что дополнительная к H(L153)Y замена гистидина М182 на лейцин, приводящая к замещению бактериохлорофилла Вв молекулой бактериофеофитина Фв, инициирует быстрый перенос электрона с Р* на молекулу Фв за -3,5 пс с последующей рекомбинацией в основное состояние за 180 пс. Наблюдалось полное подавление переноса электрона в А-цспь в РЦ двойного мутанта.

В исследованиях реакционных центров с замещением тирозина L128 на гистидин, которое приводит к образованию водородной связи между аминокислотным остатком и БХл ВА, методом спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением впервые наблюдался сдвиг полосы Поглощения 1020 нм до 1035 нм, подтверждающий, что данная полоса принадлежит анион-радикалу первичного акцептора электрона Ва~

Полученные данные о значимости первичного акцептора электрона и его ближайшего окружения для фотосинтетического электронного транспорта в бактериальных реакционных центрах важны с точки зрения разработки высокоэффективных искусственных систем для преобразования солнечной энергии.

Апробация работы. Основные положения работы изложены на: International Meeting "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems" (Пущино, 2006), 5-м Съезде Российского фотобиологического сообщества и Международной конференции «Преобразование света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), 15th European Bioenergetics Conference (Дублин, 2008), XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), 15th International Congress of Photosynthesis (Пекин, 2010), XXII Симпозиуме

«Современная химическая физика» (п. Шепси, 2010), International Meeting "Photosynthesis Research for Sustainability" (Баку, 2011), VI Съезде Российского фотобиологического общества (п. Шепси, ¿011), Школе-конференции молодых учёных «Биосистема: от теории к практике» (Пущино, 2012) и ряде других конференция молодых ученых.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 24 печатных работы, из которых четыре - в реферируемых журналах из списка ВАК РФ, в том числе одна - в иностранном.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения; обзора литературы; описания объектов и методов исследования; четырех разделов, где изложены результаты и их обсуждение; выводов и списка литературы. Объем работы составляет 117 страниц, в ней содержится 42 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 293 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ состоит из несколько разделов. Раздел 1.1 включает в себя краткую характеристику аноксигенных пурпурных бактерий, в Разделе 1.2 представлены данные о структуре и функциях фотосинтетического аппарата этих бактерий. В пункте 1.2.3 на примере пурпурной аноксигенной

бактерии Rba. sphaeroides подробно описана структура фотосинтетического РЦ, состоящего из трех белковых субъединиц и 10 кофакторов (см. Рис.1), в сравнении с родственными бактериями Rba. capsulatus и Blastochloris (Blc.) viridis. В пункте 1.2.4. изложены современные представления о переносе электрона в РЦ пурпурных бактерий как многостадийном процессе с последовательным образованием

состояний с разделенными зарядами. В Разделе 1.3 коротко представлены основные генетические системы для направленного мутагенеза генов, кодирующих аминокислотные последовательности белковых субъединиц РЦ. Раздел 1.4 посвящен анализу работ по генетическим модификациям структуры РЦ пурпурных бактерий, и, в особенности, использованию методов сайт-направленного мутагенеза для исследования роли аминокислотного окружения отдельных кофакторов в электронном транспорте; для определения значимости асимметричности белкового окружения кофакторов активной и неактивной ветвей; для создания

Рисунок I. Схема расположения кофакторов в РЦ Rba. sphaeroides

условий переноса электрона по неактивной в нативных РЦ В-ветви, а также для изучения взаимодействий белка и кофакторов реакционного центра.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В Разделе 2.1 перечислены использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды. Объектами исследования служили реакционные центры пурпурной бактерии Rba. sphaeroides дикого типа, а также мутантные РЦ с одиночными аминокислотными замещениями: гистидина L153 на цистеин - H(L153)C; лейцин - H(L153)L; метионин - H(L153)M и тирозин - H(L153)Y; тирозина L128 на гистидин - Y(L128)H; гистидина М182 на лейцин - H(M182)L; и РЦ с двойным замещением - H(L153)Y+H(M182)L. В Разделе 2.2 перечислены используемые среды и буферы. В Разделе 2.3 описаны молекулярно-биологические методы. Для создания мутантных штаммов использовалась генетическая система для направленного мутагенеза РЦ, состоящая из puf- и рис-дефицитного штамма Rba. sphaeroides DD13 [Jones et al., 1992a], либо puf-дефицитного штамма ALM1 [Paddock et al., 1989], и плазмиды для комплементации, несущей редуцированный ри^-оперон без puf-BA генов [Хатыпов и др., 2005]. Мутагенез проводили с помощью «Gene Editor in vitro Site-Directed Mutagenesis System» (США) [Васильева и др., 2001], либо с помощью ПЦР методом перекрывающихся ДНК фрагментов [Болгарина и др., 2004]. В Разделе 2.4 описаны микробиологические и биохимические методы. Культуру рекомбинантных штаммов Rba. sphaeroides выращивали в темноте, в полу-аэробных условиях, как описано ранее [Васильева и др., 2001]. В среду Хатнера добавляли тетрациклин (1 мкг/мл), канамицин (5 мкг/мл) и, при выращивании штамма DD13, стрептомицин (5 мкг/мл).

Хроматофоры получали путем обработки клеточной суспензии ультразвуком на приборе «Дезинтегратор УЗДН-1» (СССР) с последовательным центрифугированием (60 мин, 4° С, 12000 об/мин и 60 мин, 4° С, 45000 об/мин). Реакционные центры выделяли с помощью ионно-обменной хроматографии по методике, описанной ранее [Fufina et al., 2007]. Данные о трехмерной структуре РЦ Rba. sphaeroides были взяты из Protein Data Bank, моделирование структуры мутантных РЦ проводили с помощью программы PyMol [DeLano, 2002].

Раздел 2.5 посвящен описанию биофизических методов. Спектры поглощения изолированных и мембраносвязанных РЦ измеряли при 90 и 293 К на двулучевом спектрофотометре Shimadzu UV-1601PC (Япония). При измерении низкотемпературных спектров поглощения использовали самодельный криостат, к образцу добавляли 96% глицерин в соотношении 1:2 и до 2 мМ аскорбат натрия.

Спектры фотоиндуцированных изменений поглощения (АЛ) в миллисекундном диапазоне измеряли на однолучевом дифференциальном спектрофотометре с фосфороскопом [Shuvalov, Asadov, 1979]. В измерительном канале прибора использовали слабый монохроматический свет. Изменения поглощения индуцировали мощной подсветкой белого света. Измерение спектров действия функциональной активности проводили с помощью полярографического метода регистрации скорости обмена 02 в тонком приэлектродном слое платинового макроэлектрода [Бойченко, 2004].

Пигменты из РЦ экстрагировали как описано ренее [Vasilieva et al., 2012]. Экстракцию пигментов из лиофилизированных хроматофоров осуществляли смесью ацетона с метанолом (7:2). На 1 мл смеси брали в среднем 0,1 г образца хроматофоров, ресуспендировали 1 мин и осаждали мембраны (5 мин, 13400 об/мин). Для измерения спектров флуоресценции использовали образцы с OD480 < 1 (в максимуме поглощения каротиноидов). Спектры флуоресценции (А.сх = 603 и 529 нм, Хот = 700-850 нм) и возбуждения флуоресценции (Х^ = 500650 нм, Хеп, = 790 и 760 нм) БХл и БФео в экстрактах измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi 850 (Япония).

Спектры КД измеряли на самодельной установке, аналогичной описанной в работе [Breeze and Ке, 1972]. Полученные на самописце спектры сканировали и оцифровывали в программе Graph2Digit.

Для исследований методом фемтосекундной спектроскопии в образцы безантенных хроматофоров и РЦ Rba. sphaeroides с оптической потностью OD850.870 = 0,4-0,5 (длина оптического пути 1 мм) добавляли до 5 мМ дитионит натрия и освещали слабым белым светом в течение 5 минут для восстановления Qa- Фемтосекундные импульсы света (длительностью 40 фс; с длиной волны 800 нм; частотой 1 КГц; энергией в импульсе 1 мДж) получали с помощью фемтосекундной установки «SpitfirePro». Излучение от лазера «Tsunami 35fs» с накачкой от лазера непрерывного действия «Millennia 5sJ», с энергией в импульсе 10 нДж и частотой 80 МГц направлялось в регенеративный усилитель импульсов лазер «Spitfire-40F» с накачкой от лазера непрерывного действия «Empower 15» (SpectraPhysics, США). Фотоиндуцированные изменения поглощения (ДА) измеряли методом возбуждения-зондирования (pump-probe) на модифицированной установке «Эксипро» (CDP systems) [Хатыпов и др., 2008]. Значения спектров ДА при каждой временной задержке получали в результате усреднения 2000 измерений.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе были исследованы спектральные и функциональные свойства мутантных РЦ с замещениями гистидинов L153 и М182, а также тирозина L128. Выбор позиций для мутагенеза был обусловлен тем, что His L153 выполняет

функцию лиганда атома Mg молекулы БХл ВА, первичного акцептора электрона; His М182 расположен симметрично и лигандирует Mg БХл Вв- В РЦ пурпурных бактерий Rba. capsuîatus, Rba. sphaeroides и Ble. viridis БХл Вв, Ра и Рв можно заменить на БФео, обладающий более высоким окислительно-восстановительным потенциалом, если вместо лигандирующего Mg гистидина ввести лейцин [Bylina, Youvan, 1988; McDowell et al., 1991]. С целью исследования первичного разделения зарядов в РЦ также делались попытки замещения БХл Вд на БФео, что получилось для Blc. viridis при замещении His L153 на Leu [Arlt et al., 1996]. Из большого количества замещений His L153 в РЦ Rba. sphaeroides и Rba. capsuîatus, по имеющимся данным, ни одно не привело к замене БХл ВА на БФео [Bylina et al., 1990, Katilius et al., 2004], кроме того, была отмечена нестабильность большинства мутантных РЦ. Повышение окислительно-восстановительного потенциала БХл ВА путем введения дополнительной водородной связи между белком и хромофором является альтернативным подходом изменения уровня свободной энергии состояния Р+ВА~. Туг L128 расположен на расстоянии, достаточном для образования водородной связи с 3'-ацетильной группой БХл В д.

Внесение направленных аминокислотных замещений в РЦ Rba. sphaeroides

Раздел 3.1. Первая часть экспериментальной работы заключалась в создании плазмидных ДНК, несущих сайт-направленные мутации для аминокислотных замещений в L и M субъединицах РЦ. Затем полученные плазмиды были перенесены puf- и puc-дефицитный штамм Rba. sphaeroides DD13 или в р«/'-дефицитный штамм ALM1 методом конъюгации. В первом случае были получены рекомбинантные штаммы Rba. sphaeroides-. RCO-H(L153)C, RCO-H(L153)L, RCO-H(L153)M, RCO-H(L153)Y, RCO-H(M182)L, RCO-H(L 153)Y+H(M 182)L и RCO-Y(L128)H, в фотосинтетических мембранах которых РЦ был единственным БХл-содержащим пигмент-белковым комплексом. Во втором случае были получены рекомбинантные штаммы Rba. sphaeroides ALMl-pREHDl и ALM1-H(L153)Y, содержащие полный набор фотосинтетических комплексов.

Раздел 3.2 Исследование изолированных мутантных реакционных центров H(L153M.H(L153)C

Из мутантных штаммов Rba. sphaeroides H(L153)M и H(L153)C были выделены стабильные РЦ. В низкотемпературном спектре поглощения РЦ дикого типа (Рис. 2, кривая 1) полоса 888 нм принадлежит низкоэнергстичсскому экситонному Qy-переходу димера БХл (Qy Р), полоса с максимумом 805 нм (Qy В) соответствует Qy-переходам двух мономерных БХл (Ва и Вв) и высокоэнергетическому Qy-переходу димера, полоса при 760 нм

соответствует Qy-псрсходу двух молекул БФео (Qy Н). В Qx-области спектра наблюдаются полосы поглощения четырех молекул БХл с максимумом при 598 нм, полосы при 533 и 545 нм принадлежат молекулам БФео активной и неактивной цепей переноса электрона (Qx На и Qx Нв).

В РЦ H(L153)M и H(L153)C (Рис. 2, кривые 2 и 5) наблюдается уменьшение амплитуды полосы Qy Р и расщепление полос поглощения мономерных БХл в Qy- и Qx-областях спектров, вследствие коротковолнового сдвига полосы поглощения мономерного БХл ВА- Данные сдвиги полос указывают на модификацию электронных

переходов в молекуле ВА и связаны с изменением природы его аксиального лиганда. Наши исследования показали, что изменение спектральных свойств первичного акцептора не повлияло на фотохимическую активность мутантных РЦ. Амплитуды дифференциальных «свет-минус-темнота» спектров РЦ дикого типа и мутантов H(L153)M и H(L153)C, отражающих фотоиндуцированный процесс образования состояния с разделенными зарядами P+Qa~. совпали. Следовательно, эффективность разделения зарядов в мутантных РЦ близка к единице.

Проведенный анализ пигментов в РЦ дикого типа и мутантов показал сохранение соотношения БХл:БФео, равного 2:1, а именно — сохранение лигандирования молекулы БХл в данных РЦ.

Раздел 3.3 Исследование мембраносвязанных мутантных реакционных центров H(L153)L. H(L153)Y и H(L1531Y+H(M182)L

Исследование свойств мутантных РЦ с аминокислотными замещениями H(L153)L, H(L153)Y и H(L153)Y+H(M182)L проводилось в составе хроматофоров, в связи с их нестабильностью в изолированном состоянии. Для работы были использованы рекомбинантные штаммы Rba. sphaeroides, в хроматофорах которых РЦ был единственным БХл-содержащим фотосинтетическим комплексом [Jones et al., 1992а].

В спектре поглощения хроматофоров РЦ дикого типа (90 К) наблюдаются те же полосы поглощения хромофоров, что и в спектре поглощения изолированных РЦ (Рис. ЗА, кривая /), и соотношение полос QY P/Qy В

С,6

0,3

0,0

о с 0,3

с; т

o,s

0,3

0,0

801 | 812

д 591 602 / 3

8ö0 г 813

\ 584 603 / 2

805

\ «>s зб 760 д 888

v--ч_/ \__ -A/ly'v 1

400 5О0 600 700 ВСЮ 900 1000 Длина волны (нм)

Рисунок 2. Спектры поглощения РЦ дикого типа (/) и мутантов Н(1Л53)М (2) и Н(Ь153)С (3), измеренные при 90 К.

практически не меняется. В спектре РЦ H(L153)Y полоса QY Р претерпевает коротковолновый сдвиг до 866 нм (Рис. ЗБ, кривая 1) со значительным снижением дипольной силы перехода, что отражает уменьшение экситонного взаимодействия между молекулами специальной пары. Также наблюдается длинноволновый сдвиг полосы Qy В до 812 нм и значительное уменьшение ее амплитуды. Во второй производной спектра поглощения хроматофоров дикого типа (Рис. ЗА, кривая 2) наблюдается расщепление полосы поглощения мономерных БХл на две с максимумами 804 нм (QY Вд) и 813 нм и (Qy Вв), и только одна полоса с максимумом 812 нм наблюдается во второй производной спектра хроматофоров H(L153)Y (Рис.ЗБ, кривая 2). В Qx-области спектра также наблюдается уход полосы мономерного БХл при 598 нм. Это позволяет заключить, что полоса поглощения мономерного БХл Вд в спектре мутанта H(L153)Y отсутствует. При этом никакие новые полосы не появляются. Надо отметить, что наличие изменений не только в области поглощения мономерных БХл, но и димера Р свидетельствует о менее специфичном и более значительном влиянии данной мутации на свойства РЦ.

С целью выявления причины изменения поглощения мономерных БХл был создан мутантный штамм Rba. sphaeroides, РЦ которого содержали двойную аминокислотную замену H(L153)Y+H(M182)L. Было сделано предположение, что в спектре поглощения таких РЦ, помимо изменений, связанных с мутацией в L-субъединице, появятся изменения, свойственные РЦ с одиночной заменой H(M182)L (Рис. 4) и связанные с уходом поглощения БХл Вв и появлением полос

Длина волны (нм)

Рисунок 3. 1 ~ спектры поглощения безантенных хроматофоров дикого типа (А), мутантов Н(Ы53)У (Б) и Н(1Л53)У+Н(М182)Ь (В), измеренные при 90 К, и 2 - их вторые производные (*50).

Длина волны (ни)

Рисунок 4 Разностный спектр «Н(М182)Ь -минус-дикий тип»

поглощения молекулы БФео Фв при 785 и 541 нм [Katilius et al., 1999]. При этом изменений спектральных свойств других хромофоров в таких РЦ не наблюдается. После объединения двух мутаций был получен новый штамм с измененными РЦ.

В спектре поглощения мембраносвязанных РЦ двойного мутанта (Рис. ЗВ, кривая 1) и во второй производной спектра (Рис. ЗВ, кривая 2) отсутствуют полосы поглощения БХл ВА и Вв в области 800-815 нм, но появляется полоса поглощения при 785 нм, принадлежащая молекуле БФео Фв■ Полоса Qy Р сдвигается до 866 нм и, как видно из второй производной спектра поглощения (Рис. ЗВ, кривая 2), состоит из двух полос с максимумами при 845 и 870 нм. Было сделано предположение, что неоднородность полосы поглощения димера может быть связана либо с гетерогенностью специальной пары мутантных РЦ, либо с присутствием агрегатных форм бактериохлоринов.

С целью исследования природы гетерогенности полосы поглощения димера Р были измерены спектры кругового дихроизма (КД) (Рис. 5). Поскольку молекулы БХл и БФео обладают свойством хиралыгасти, они по-разному поглощают свет левой и правой круговой поляризации. Также отличается форма КД спектра у мономерных форм и их димерных и олигомерных комплексов из-за наличия в последних экситонных взаимодействий [Клейтон, 1984]. В спектре КД хроматофоров дикого типа (Рис. 5, спектр 1) широкая положительная полоса с максимумом при 862 нм принадлежит низкоэнергетическому переходу, а отрицательная при 812 нм - высокоэнергетическому переходу димера БХл, положительная полоса с максимумом 796 нм приписывается одному или обоим мономерным БХл, а отрицательная полоса с максимумом 750 нм - мономерным БФео [Клейтон, 1984; Mar and Gingras, 1995]. В спектре КД хроматофоров H(L153)Y+H(M182)L (Рис. 5, спектр 2) отрицательная полоса при 750 также принадлежит БФео, а отсутствие положительной полосы 796 нм, по всей видимости, означает отсутствие мономерных форм БХл в РЦ. Кроме того в спектре присутствует большая по амплитуде узкая положительная полоса с максимумом 859 нм, переходящая в отрицательную при 810 нм. Форма и расположение этой полосы указывает на то, что она может быть результатом наложения полос димера БХл РЦ и олигомерных форм БФео, по-видимому, накапливающихся в мембранах мутантного штамма [Scherz &

4 . 859

э. А2

2 «f 1 <t 0 795 / \ A /А*' ; f 862

-1

-3 ~812

700 750 800 650 900

Длина волны (нм) Рисунок 5 Спектры КД хроматофоров дикого типа (/) и мутанта H(L153)Y+H(M182)L (2)

Parson, 1984]. Эти агрегаты проявляются на низкотемпературном спектре поглощения в виде полосы 870 нм.

Работа с мембраносвязанными РЦ H(L153)L показала, что они отличаются нестабильностью не только в изолированном состоянии, но также и в составе фотосинтетической мембраны. Наблюдалась гетерогенность спектров поглощения хроматофоров. Не смотря на это, удалось получить дифференциальный_спектр.

0,02-

—h(l153)l (2] -о- h(l153)y (3)

а,оо ■ даза

%

-0,01-0,02-0,03-0,04-

750 800 850 Длина волны (нм)

s50

Рисунок 6. Дифференциальные «свет-минус-темнота» спектры мембраносвязанных РЦ дикого типа (WT, 1, •) и мутантов Ii(L153)L (2, Ф) и H(L153)Y (3, о).

отражающий фотоиндуцированное разделение зарядов в РЦ с образованием радикальной пары Р+(За~ (Рис. б, кривая 2), по-видимому, менее эффективное, чем в РЦ дикого типа (Л\ГГ) (Рис. 6, кривая 1).

Амплитуда дифференциального спектра

мутанта Н(Ь153)У (Рис. 6, кривая 3)

по крайней мере в 10 раз ниже, чем у дикого типа, что говорит о наличии переноса электрона в мутантных РЦ, но также свидетельствует о значительном уменьшении либо эффективности процесса разделения зарядов, либо количества функциональных РЦ в хроматофорах. Изменение поглощение в области 816 — 790 нм отражает, по-видимому, только электрохромный сдвиг полосы поглощения БХл Вв.

Анализ спектров действия в реакции фотоингибиропания дыхания безантенных хроматофоров дикого типа (Рис. 7, кривая 1) и мутанта Н(Ы53)У (Рис. 7, кривая 2), форма которых сходна со спектрами поглощения, измеренными при 293 К, показал, что большая часть РЦ внутри хроматофоров функционально

активна [Бойченко, 2004]. Амплитуда спектра РЦ Н(Ь153)У составила 7% от амплитуды спектра дикого типа (при равенстве оптической плотности

600

900

700 800 Длина волны (нм) Рисунок 7. Спектры действия хроматофоров: 1 - дикого типа, 2 - мутанта H(L153)Y (амплитуда *15) в реакции фотоингибирования дыхания.

образцов). Исходя из этого, наблюдаемое десятикратное снижение амплитуды дифференциального «свет-минус-темнота» спектра может говорить о сопоставимом снижении квантовой эффективности разделения зарядов в мутантных РЦ. Отсутствие полосы БХл ВА в спектре действия мутанта H(L153)Y позволяет нам утверждать, что отсутствует перенос энергии возбуждения с этой молекулы на первичный донор электрона.

С целью изучения способности мутантного штамма Rba. sphaeroides H(L153)Y поддерживать фототрофный рост, были получены рекомбинантиые штаммы ALMl-pREHDl (дикий тип) и ALM1-H(L153)Y, несущий гены светособирающих комплексов и РЦ. Культуру клеток выращивали на свету, после чего выделяли общую ДНК и трансформировали ею штаммм Е. coli DH5a. Затем из трансформанта выделяли плазмидную ДНК и определяли

нуклеотидиую последовательность

L-субъединица 151 152 153 154

Тгр Thr Iiis Leu

WT: ... TGG-ACG-CAC-CTC...

Тгр Thr Тут Leu

H(L153)Y: ... TGG-ACC-TAC-CTC...

(ДО) AspSl9I

анализ плазмидной ДНК мутанта после

выращивания на свету:

Trp Thr Iiis Leu

"WT": .. TGG-ACC-CAC-CTC...

AspS19I

Рисунок 8. Последовательность участка плазмидной ДНК в области расположения сайт-направленной мутации. Выделен заменяемый кодон и аминокислота, подчеркнут новый сайт рестрикции Лярв 191 (ЗЛЕпгуте), внесенный вместе с мутацией.

всего /7и/-оперона. Фрагменты последовательностей (в области внесения мутации) /ш/^оперона штамма дикого типа, а также мутантной ДНК до и после фотосинтетического роста культуры, представлены на рисунке 8. Анализ ДНК выявил наличие обратной компенсаторной мутации (реверсии), приводящей к восстановлению гистидина в позиции Ы53. По результаты эксперимента было сделано заключение, что квантового выхода электронного транспорта, равного нескольким %, не достаточно для поддержания фотосинтетического роста

рекомбинантного штамма ЯЬа. хрИаего'Жх ДЬМ1-Н(Ь153)У.

Таким образом, представленные результаты показывают, что в РЦ Н(1Л53)У молекула мономерного БХл активной цепи кофакторов переноса электрона не обнаруживается спектрально и функционально. Было сделано предположение, что она не встраивается в структуру мутантных РЦ, что должно отразиться на соотношении пигментов. Были получены спектры анетон-метанольных Г7:2> экстрактов пигментов из лиофилизированных хроматофоров, на которых наблюдается коротковолновый сдвиг полосы поглощения бактериохлоринов с 762 до 758 нам. Соотношение БХл а/БФео а в

РЦ оценивалось по спектрам флуоресценции и возбуждения флуоресценции при избирательном возбуждении этих пигментов.

При малой концентрации бактериохлоринов (OD<0,05) амплитуды полос спектров флуоресценции пропорциональны количеству БФео и БХл в экстракте. На основании сопоставления спектров поглощения и спектров действия хроматофоров дикого типа и мутанта H(L153)Y было сделано заключение, что доля свободных молекул БФео и БХл в мембранах незначительна, и в экстрактах пигментов ею можно пренебречь. Исходя из этого, в спектре флуоресценции экстракта хроматофоров дикого типа полосы с максимумами 762 и 784 нм были соотнесены только с излучением пигментов реакционного центра - двух молекул БФео и четырех молекул БХл на один РЦ соответственно (при условии полной экстракции из мембран). Нормирование спектров по полосам БФео выявило уменьшение количества БХл в экстракте хроматофоров мутанта H(L153)Y на 21%±2 по спектру флуоресценции и на 22%±3 — по спектру возбуждения флуоресценции. То есть, количество пигментов в экстракте из хроматофоров мутанта H(L153)Y соответствует содержанию приблизительно трех молекул БХл на две молекулы БФео в РЦ.

Полученные нами данные позволяют заключить, что в результате замещения H(L153)Y в мембранах клеток Rba. sphaeroides формируются комплексы фотосинтетических РЦ, в которых отсутствует молекула мономерного БХл ВА. Заслуживает особого внимания тот факт, что мутантные РЦ H(L153)Y сохраняют способность к разделению зарядов на свету, хотя и значительно менее эффективному, чем РЦ дикого типа.

Фемтосекундная спектроскопия мембраносвязанных реакционных центров

С помощью спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением были измерены кинетики световых изменений поглощения мембраносвязанных РЦ дикого типа и мутантов H(L153)Y и H(L153)Y+H(M182)L с восстановленными хинонами (Рис. 9) при 920 нм на задержке от -20 до 600 пс. Отрицательные изменения поглощения на этой длине волны принадлежат стимулированному излучению Р*. В РЦ дикого типа время жизни Р* составляет 3 пс (Рис. 9, кривая /), далее идет перенос электрона ВА и затем НА. В РЦ мутанта H(L153)Y время жизни стимулированного излучения увеличилось до 180 пс (Рис. 9, кривая 2). Согласно результатам измерения кинетик изменений поглощения на разных длинах волн, на временной шкале до 600 пс, изменений, связанных с образованием состояний с разделенными зарядами, не наблюдается. Значение в 180 пс почти достигает время жизни Р* в ранее описанных мутантных РЦ с заблокированным переносом электрона [Robles et al., 1990; Woodbury and Allen, 1995].

920 нм

Рисунок 9. Кинетики фотоиндуцированных

изменений поглощения РЦ \УТ (/), Н(Ы53)У (2) и Н(Ь 153)У+Н(М 182)1, (3), измеренные при 293 К в области 920 нм при возбуждении Р.

Вставка: Кинетика

фотоиндуцированных

изменений поглощения реакционных центров

О 100 200 300 400 500 600 Время (пс)

H(L 153) Y+H(M 182)L в

мутанта

области 860 нм.

Если учесть, что эффективность переноса электрона в таких РЦ составляет всего несколько процентов от эффективности в РЦ дикого типа, можно примерно оценить время, за которое происходит разделение зарядов [Blankenship, 2002] - оно составляет несколько наносекунд, что на три порядка медленнее, чем скорость образования первого состояния с разделенными зарядами в РЦ дикого типа. Можно предположить, что перенос электрона от Р* на БФео НА в РЦ H(L153)Y происходит напрямую и, согласно модели Маркуса, значительно замедляется, так как зависит от энергии сопряжения взаимодействующих молекул, которая убывает экспоненциально с увеличением расстояния между донором и акцептором электрона [Marcus and Sutin, 1985; Moser et al., 1992].

Таким образом, наши исследования показали, что БХл Вд - несомненно важный компонент А-цепи переноса электрона в реакционном центре, без которого, очевидно, невозможен фотосинтетический рост бактерии.

Недавно был получен мутантный РЦ Rba. capsulatus с аминокислотным замещением I(M204)Q [Carter et al., 2012], которое привело к потере БХл Вд без значительного нарушения стабильности комплекса. В этих РЦ наблюдался перенос электрона за ~150 пс в B-цепь с образованием состояния Р+Нв~ с квантовым выходом -21% с последующей рекомбинацией в основное состояние. В РЦ H(L153)Y Rba. sphaeroides такой перенос не наблюдается. Сравнительные исследования возможности переноса электрона в B-цепь в ß-мутантных РЦ Rba. capsulatus и Rba. sphaeroides [Kirmaier et al., 2002] показали, что в РЦ Rba. sphaeroides этот процесс затруднен. Различия между двумя РЦ объясняются разницей в уровнях свободной энергии состояний Р*, Р+Вв~ и Р+Нв~, которые зависят как от белкового окружения кофакторов в целом, так и от вклада аминокислотных остатков, удаленных от кофакторов.

При исследовании РЦ П(Ы53)У+Н(М182)Ь методом фемтосекундной спектроскопии был выявлен сдвиг стимулированное излучение из состояния Р* в область меньших длин волн, 860-870 нм (Рис. 9, вставка). Следует отметить, что в РЦ двойного мутанта изменения поглощения при 860 нм происходят за -3,5 пс и отражают быстрые процессы разделения зарядов.

При измерении кинетик фотоиндуцированных изменений поглощения РЦ Н(Ь 153)У+Н(М 182)Ь в области поглощения БФео (755 нм) и БФео Фв (785 нм), в интервале от -20 до 600 пс были выявлены следующие различия. В области поглощения БФео На,в (Рис. 10, кривая 1) происходят быстрые положительные изменения поглощения, обусловленные возникновением и

затуханием Р*, то есть молекулы БФео не участвуют в разделении зарядов. В то же время, в области полосы поглощения Фв помимо быстрого образования Р* наблюдаются отрицательные изменения, обусловленные выцветанием полосы

поглощения Фв в процессе образования состояния с разделенными зарядами Р+Фв~ за 3,5 пс, в соответствии с временем жизни стимулированного излучения из Р*. Затем наблюдается медленная рекомбинация основного состояния за 180±20 пс. Наши данные согласуются с результатами, полученными на РЦ Н(М182)Ь [КаШшя е1 а1., 1999], однако квантовый выход образования Р+Ф3~ в РЦ двойного мутанта приближается к 100%, тогда как в РЦ Н(М182)Ь он составляет всего около 35%, и 65% приходится на образование радикальной пары Р^НЛ~ [КаШик Й а1., 1999]. Дальнейший перенос электрона по А- или В-ветви в РЦ Н(Ы53)У+Н(М182)Ь отсутствует, поэтому данный мутантный штамм ЯЬа. sphaeroid.es не способен к фототрофному росту.

Раздел 3.4 Исследование свойств РЦ У(Ы28)Н

Заключительным этапом нашей работы было исследование мутантных РЦ ЛЬа. sphaeroides с одиночным замещением тирозина Ы28 на гистидин У(Ь128)Н, образующий водородную связь с 3'-ацетильной группой I кольца бактериохлорофилла ВА [ОИзаэ'ши-кг е1 а1., 2011].

Время (пс)

Рисунок 10. Кинетики фотоиндуцированных изменений поглощения РЦ H(L153)Y+H(M182)L, измеренные в области 755 нм (кривая 1) и 785 нм (кривая 2), в интервале от -20 до 600 пс при

p,[i4nv-,i.--ieinui Р

Появление водородной связи приводит к длинноволновому сдвигу полос БХл ВА в Qy- и Qx-области спектра поглощения с 805 до 810 нм (Рис. 11, кравые 2 и 3), что также отражается в дифференциальном фотоиндуцированном «свет-минус-темнота» спектре поглощения РЦ Y(L128)H.

Нами были проведены исследования первичных процессов разделения зарядов в РЦ Y(L128)H методом фс-спектроскопии. Экспоненциальный анализ кинетик изменений поглощения при 940 нм показал, что время жизни возбужденного состояния Р* в реакционных центрах Y(L128)H составляет около 3,2 пс. Это значение близко к времени жизни Р* в РЦ дикого типа. Следовательно, квантовый выход разделения зарядов Р+НА", так же как в РЦ дикого типа, близок к единице. Было показано что, водородная связь в мутантном РЦ Y(L128)H понижает уровень свободной энергии состояния Р+Вл" почти на 40 мэВ [Gibasiewicz et al., 2011], однако, как показывают наши данные, это не приводит к ускорению переноса электрона.

400 600 600 700 800 900 1000 Длина волны (нм)

0,006 0.004 0.002

<

0.000 ■0.002 <004

1020 1035 2

/ -.-"•■'Ч i

2.5 TIC

/

1000 10Ю 1100

Длина волны (нм)

Рисунок 11. Спектры поглощения РЦ дикого Рисунок 12. Дифференциальные «свет-

типа (1) и мутанта У(Ь 128)11 (2), измеренные минус-темнота» спектры поглощения РЦ

при температуре 90 К, и разностный спектр дикого типа (1) и У(1Л28)Н (2), измеренные

«мутант-минус-дикий тип» (3). на задержке 2,5 пс.

На рисунке 12 представлены фемтосекундные дифференциальные спектры поглощения реакционных центров, измеренные на задержке времени 2,5 пс. В спектрах РЦ дикого типа и мутанта У(Ь128)Н наблюдается положительная полоса поглощения с максимумом при 1020 и 1035 нм соответственно. Известно, что полоса при 1020 нм в РЦ дикого типа принадлежит поглощению анион-радикала ВА~ [АгИ й а1., 1990; Кепгш й а1., 1997]. Смещение этой полосы на 15 нм в дифференциальном спектре мутантных РЦ, измеренном на той же временной задержке, позволяет заключить, что полоса при 1035 нм в РЦ мутанта также отражает образование первичной радикальной пары Р+Вл". Таким образом, нами впервые был показан

одновременный длинноволновый сдвиг полос поглощения как молекулы ВА, так и ее анион-радикала ВА~ в РЦ мутанта У(Ы28)Н. В мутантных РЦ временная константа процесса первичного разделения зарядов составляет 3,2 пс, в соответствии с временем жизни Р*, что близко по значению с времени жизни Р* в РЦ дикого типа.

ВЫВОДЫ

1. Методом сайт-направленного мутагенеза были получены семь мутантных штаммов Я1юс1оЬасГег яркаего'кк.ч, содержащих реакционные центры с одиночными аминокислотными замещениями: гистидина Ь153 на цистеин, Н(Ъ153)С; лейцин, Н(Ь153)Ь; метионин, Н(Ь153)М и тирозин, Н(Ь153)У; тирозина Ы28 на гистидин, У(Ы28)Н; гистидина М182 на лейцин Н(М182)Ь; и РЦ с двойным замещением, Н(1Л53)У+Н(М182)Ь. Реакционные центры Н(Ы53)С, Н(1Л53)М, У(Ы28)Н и Н(М182)Ь были выделены, очищены и исследованы в изолированном состоянии; РЦ Н(Ь153)Ь, Н(1Л53)У и Н(Ь153)У+П(М182)Ь изучались в составе фотосинтетических мембран.

2. При исследовании фотохимической активности в миллисекундном временном диапазоне установлено, что во всех изученных мутантных реакционных центрах с одиночным замещением гистидина 1Л53 происходит фотоиндуцированное образование состояния с разделенными зарядами Р+СЗа~. При замещении гистидина Ы53 на цистеин и метионин координационная связь атома БХл ВА сохраняется, и фотохимическая активность существенно не меняется. В мутантных РЦ с двойным замещением Н(1Л53)У+Н(М182)Ь в миллисекундном диапазоне фотохимической активности не наблюдается.

3. Впервые показано, что замещение гистидина 1Л53 на тирозин в реакционном центре КЬа. sphaeroid.es вызывает потерю мономерного БХл активной цепи кофакторов переноса электрона. Это приводит к значительному замедлению скорости электронного транспорта и снижению квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами Р+Оа~ до ~10%. В пикосекундном временном диапазоне перенос электрона в РЦ с восстановленным хиноном С?А не наблюдается, а происходит лишь релаксация возбужденного состояния специальной пары Р* в основное состояние.

4. Установлено, что в мутантных реакционных центрах с двойным замещением Н(Ы53)У+Н(М182)Ь мономерный бактериохлорофилл ВА отсутствует, а бактериохлорофилл Вв замещается молекулой бактериофеофитина Фв- В результате при возбуждении фемтосекундными импульсами мембраносвязанных реакционных центров с восстановленным

хиноном Qa наблюдается быстрый перенос электрона с Р* на молекулу Фв за~3,5 пс с последующей рекомбинацией в состояние РФВ за 180 пс.

5. Показано, что в мутантных реакционных центрах с замещением Y(L128)H появление водородной связи между гистидином LI28 и молекулой БХл ВА приводит к длинноволновому сдвигу полосы поглощения данного кофактора. При исследовании реакционных центров Y(L128)H методом спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением впервые наблюдался сдвиг максимума полосы поглощения 1020 нм до 1035 нм, подтверждающий, что данная полоса принадлежит анион-радикалу первичного акцептора электрона Ва~-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Khatypov R.A., Khmelnitskiy A.Yu., Leonova M.M., Vasilieva L.G., and Shuvalov V.A. (2008) Primary light-energy conversion in tetrameric chlorophyll structure of photosystem II and bacterial reaction centers: I. A review, Photosynthesis Research, 98 (1-3), 81-94.

2. Хатьшов P.A., Хмельницкий А.Ю., Леонова M.M., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. (2008) Первичные процессы разделения зарядов в реакционных центрах мутантов L153HY и L153HY+M182HL Rhodobacter sphaeroides, Доклады Академии наук, 422 (6), 835-840.

3. Леонова М.М., Васильева Л.Г., Хатыпов P.A., Бойченко В.А., Шувалов В.А. (2009) Свойства мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides с аминокислотными замещениями гистидина L153, лигандирующего центральный магний бактериохлорофилла ВА. Биохимия, 74 (4), 558-567.

4. Леонова М.М., Фуфина Т.Ю., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. (2011) Структурно-функциональные исследования бактериальных фотосинтетических реакционных центров. Обзор. Успехи биологической химии, 51,193-232.

Материалы конференций:

5. Фуфина Т.Ю., Леонова М.М., Васильева Л.Г, Шувалов В.А. Роль направленного мутагенеза в исследовании бактериальных фотосинтетических реакционных центров, Всероссийская научно-практическая конференция «Принципы зеленой химии и органический синтез», 9-10 октября, 2009, Ярославль. Материалы, с. 117-123.

6. Васильева Л.Г., Фуфина Т.Ю., Леонова М.М., Хатыпов P.A., Шувалов В.А. Мутантные реакционные центры Rhodobacter sphaeroides с модифицированным белковым окружением бактериохлорофиллов, VI съезд

Российского фотобиологического общества, 15-22 сентября 2011 г., пос. Шепси, Россия. Сборник материалов, с. 11.

7. Леонова М.М., Васильева Л.Г., Хмельницкий А.Ю., Хатыпов Р.А., Шувалов В.А. Первичный перенос электрона в мутантных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides с замещенными лигандами атомов магния мономерпых бактериохлорофиллов, VI съезд Российского фотобиологического общества, 15-22 сентября 2011 г., пос. Шепси, Россия. Сборник материалов, с. 19.

Основные тезисы докладов конференций:

8. Leonova М.М., Vasilieva L.G., Fufina T.Y., Khatypov R.A., Shkuropatov A.Ya. and Shuvalov V.A. Spectral and photochemical properties of Rb. sphaeroides reaction center mutated at the positi on LI53, International Meeting "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems", 20-26 August 2006, Pushchino, Russia, Book of abstracts, p. 199.

9. Leonova M.M., Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Khmelnitsky A.Y., Shuvalov V.A. Properties of the photosynthetic reaction centers Rhodobacter sphaeroides with amino acid substitutions of axial ligands to Mg of the monomer bacteriochlorophylls, 5й съезд Российского фотобиологического сообщества и Международная конференция «Преобразование света при фотосинтезе», 8-13 июня 2008, Пущино, Сборник тезисов, с. 55.

10. Leonova М.М., Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Boichenko V.A., Shuvalov V.A. The bacteriochlorophyll BA is missing in H(L153)Y Rb. sphaeroides RC, 15th European Bioenergetics Conference, 19-24 July 2008, Dublin. Book of abstracts, S22.

11. Леонова M.M., Васильева Л.Г., Хатыпов Р.А., Хмельницкий А.Ю., Христин А.М., Шувалов В.А. Перенос электрона в бактериальных РЦ с заменами аминокислот вблизи мономерных бактериохлорофилоов, XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах». 15-19 июня 2009. г. Пущино. Сборник тезисов, с. 39

12. Leonova М.М., Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Khmelnitskiy A.Yu., Shuvalov V.A. Properties of Rhodobacter sphaeroides reaction centers with changed ligands to the monomer bacteriochlorophylls molecules, 15th International Congress on Photosynthesis, August 22-27 2010, Beijing, China. Book of abstracts., p 21.

13. Шувалов B.A., Хатыпов P.A, Хмельницкий А.Ю., Христин A.M., Леонова M.M. Первичное преобразование энергии света в реакционных центрах фотосинтезиругощих бактерий, XXII симпозиум "Современная химическая

физика", п. Шепси, 22 сентября - 6 октября 2010. Сборник аннотаций, стр. 30.

14. Leonova М.М., Vasilieva L.G., Khmelnitskiy A.Yu., Khatypov R.A, Khristin A.M., Shuvalov VA. Electron transfer in Rhodobacter sphaeroides mutant reaction centers in the absence of the monomer bacteriochlorophyll molecule BA, International Meeting "Photosynthesis Research for Sustainability", July 24-30, 2011, Baku, Azerbaijan. Book of abstracts, p. 57.

15. Христин A.M., Хатыпов P.A., Хмельницкий А.Ю., Леонова M.M., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. Исследование фемтосекундных процессов разделения зарядов в мутантных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides Y(L128)H с измененными спектральными свойствами бактериохлорофилла ВА. Школа-конференция молодых учёных на базе ИФПБ РАН «Биосистема: от теории к практике», Пущино, 4-5 октября 2012 г. Тезисы докладов, с. 2324.

16. Леонова М.М., Хмельницкий А.Ю., Христин A.M., Хатыпов P.A., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. Сравнительный анализ первичных стадий переноса электрона в мутантных реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides. Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12», Пущино, 22-24 октября 2012 г. Сборник тезисов, с. 149.

Список сокращений:

Rba. Rhodobacter,

рА,в БХл в сайтах связывания БФео НА и Нв;

Фв БФео в сайте связывания мономерного БХл ВА;

ср квантовый выход разделения зарядов в РЦ;

ВА, Вв мономерные БХл А-цепи и B-цепи кофакторов переноса электрона;

НА, Нв БФео-ны А-цепи и B-цепи цепи кофакторов переноса электрона;

К Кельвин;

OD оптическая плотность;

Р димер БХл-в, первичный донор электрона, специальная пара;

Р* димер БХл в возбужденном состоянии;

Р+ димер БХл в окисленном состоянии;

Ра, Рв БХл-лы, образующие первичный донор электрона;

Qa первичный хинонный акцептор электрона;

БФео бактериофеофитин;

БХл бактериохлорофилл;

кд круговой дихроизм;

пс пикосекунда;

РЦ реакционный центр.

Подписано в печать:

20.05.2013

Заказ № 8520 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Леонова, Мария Михайловна, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ РАН

на правах рукописи

0420135*3*1 ЛЕОНОВА Мария Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРОВ ПУРПУРНОЙ БАКТЕРИИ ЯНСЮОВАСТЕЯ ЗРНАЕЯОЮЕЯ С ИЗМЕНЕННЫМ БЕЛКОВЫМ ОКРУЖЕНИЕМ МОНОМЕРНОГО БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА ВА

Специальность: 03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук

В.А. Шувалов

кандидат биологических наук Л.Г. Васильева

Пущино - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список условных сокращений..............................................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................................11

1.1 Краткая характеристика аноксигенных пурпурных бактерий....................................................11

1.2 Структура и функции фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий..................12

1.2.1 Компоненты фотосинтетической мембраны..........................................................................12

1.2.2 Светособирающие комплексы..............................................................................................................15

1.2.3 Структура реакционного центра........................................................................................................17

1.2.4 Перенос электрона в реакционном центре................................................................................22

1.3 Фотосинтетический генный кластер и системы для направленного мутагенеза... 25

1.4 Генетические модификации белка..........................................................................................................................26

1.4.1 Исследование симметрии комплекса реакционного центра....................................26

1.4.2 Удаление кофакторов..................................................................................................................................28

1.4.3 Замещение кофакторов..............................................................................................................................28

1.4.4 Изменение окислительно-восстановительного потенциала димера бактериохлорофиллов..............................................................................................................................................31

1.4.5 Исследование прочного взаимодействия между молекулой БХл и

белком в мутантных РЦ..........................................................................................................................................33

1.4.6 Модификация участка взаимодействия РЦ с цитохромом с....................................34

1.4.7 Мутации, затрагивающие молекулы воды..............................................................................35

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................37

2.1 Штаммы и плазмиды..........................................................................................................................................................37

2.2 Среды и буферы......................................................................................................................................................................39

2.3 Методы генной инженерии..........................................................................................................................................40

2.3.1 Мутагенез................................................................................................................................................................40

Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции..............................................40

Получение олигонуклеотидов для направленного мутагенеза..........................41

Мутагенез с помощью «GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis

System»..................................................................................................................................................................42

2.3.2 Выделение и очистка плазмидной ДНК из культуры Е. coli..................................42

2.3.3 Выделение суммарной ДНК из культуры Rba. sphaeroides......................................42

2.3.4 Количественное определение ДНК в образце......................................................................44

2.3.5 Расщепление плазмидной ДНК рестриктазами..................................................................44

2.3.6 Горизонтальный электрофорез в агарозном геле..............................................................44

2.3.7 Препаративное выделение ДНК из геля......................................................................................44

2.3.8 Лигирование вектора и фрагментов ДНК................................................................................45

2.3.9 Получение электрокомпетентных клеток................................................................................45

2.3.10 Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК..............................................................46

2.3.11 Конъюгативный перенос плазмид из Е. coli в Rba. sphaeroides........................46

2.4 Микробиологические и биохимические методы......................................................................................47

2.4.1 Культивирование бактериальных штаммов................................................................................47

2.4.2 Выделение хроматофоров........................................................................................................................47

2.4.3 Выделение и очистка реакционных центров........................................................................48

2.4.4 Пигментный анализ РЦ и хроматофоров....................................................................................49

2.5 Биофизические методы....................................................................................................................................................50

2.5.1 Оптическая спектроскопия в видимой, ближней ИК и УФ области................50

2.5.2 Измерение спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции............50

2.5.3 Измерение спектров действия фотохимической активности..................................51

2.5.4 Измерение спектров кругового дихроизма..............................................................................51

2.5.5 Оптическая спектроскопия высокого временного разрешения............................52

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................................53

3.1 Внесение направленных аминокислотных замещений в РЦ Rba. sphaeroides............54

3.1.1 Получение мутантных штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в положении L153 и LI28................................................................................................54

3.1.2 Получение мутантных штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями H(M182)L и H(L153)Y+H(M182)L в РЦ..............................................................60

3.2 Исследование изолированных мутантных реакционных центров H(L153)M, H(L153)C..................................................................................................................................................................................................64

3.2.1 Спектры поглощения реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами H(L153)M и H(L153)C..................................................................64

3.2.2 Дифференциальные фотоиндуцированные спектры поглощения реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами

H(L153)M и H(L153)C..............................................................................................................................................67

3.2.3 Пигментный состав реакционных центров дикого типа и с аминокислотными заменами H(L153)M и H(L153)C..................................................................68

3.3 Исследование мембраносвязанных мутантных реакционных центров H(L153)L, H(L153)Y и H(L153)Y+H(M182)L..................................................................................................................................68

3.3.1 Спектры поглощения хроматофоров Н(Ы53)М, Н(Ы53)Ь, Н(Ы53)У

и Н(Ъ153)У+Н(М182)Ь и РЦ Н(М182)Ь..................................................................................................69

3.3.2 Измерение спектров кругового дихроизма мембраносвязанных РЦ

дикого типа и мутанта Н(Ы 53)У+Н(М182)Ь....................................................................................73

3.3.3 Исследование фотохимической активности мембраносвязанных РЦ............74

3.3.4 Пигментный анализ мембраносвязанных РЦ Н(Ы53)У............................................78

3.3.5 Фемтосекундные исследования безантенных хроматофоров дикого типа

и мутанта Н(Ь153)У....................................................................................................................................................81

3.3.6 Фемтосекундные исследования безантенных хроматофоров Н<Х153)У+Н(М182)Ь................................................................................................................................................83

3.3.7 Возможное значение аминокислотного остатка гистидина Ы53 для стабильности комплекса РЦ................................................................................................................................86

3.4 Исследование свойств реакционных центров У(Ы28)Н..................................................................90

3.4.1 Спектры поглощения мутантных РЦ У(Ь128)Н..................................................................90

3.4.2 Фотохимическия активность мутантных РЦ У(Ь128)Н..............................................91

3.4.3 Фемтосекундные исследования мутантных РЦ У(Ь128)Н........................................92

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................................................94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................................................................96

БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................................................................................117

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИИ

H(L153)C РЦ, в котором гистидин в позиции L153 заменен на цистеин;

H(L153)L РЦ, в котором гистидин в позиции LI 53 заменен на лейцин;

H(L153)M РЦ, в котором гистидин в позиции L153 заменен на метионин;

H(L153)Y РЦ, в котором гистидин в позиции L153 заменен на тирозин;

Y(L128)H РЦ, в котором тирозин в позиции LI28 заменен на гистидин;

Н(М182)L РЦ, в котором гистидин в позиции Ml 82 заменен на лейцин; H(L153)Y+H(M182)L РЦ, в котором гистидин в позиции L153 заменен на тирозин, и

гистидин в Ml 82 позиции заменен на лейцин;

Ble. Blastochloris;

Е. coli Escherichia coli;

Phs. Phaeospirillum;

Rba. Rhodobacter;

Rps. Rhodopseudomonas;

Rsp. Rhodospirillum\

Rvi. Rubrivivax;

T. Thermosynechococcus;

ßA, ßß БХл-лы в сайтах связывания БФео НА и Нв;

AG разность свободной энергии;

ФА, Фв БФео-ны в сайтах связывания мономерных БХл Вд и Вв;

Ф квантовый выход разделения зарядов в РЦ;

Amp ампициллин;

ВА, Вв мономерные БХл-лы А- и B-цепи кофакторов переноса электрона;

Ет Р/Р+ равновесный окислительно-восстановительный потенциал

первичного донора электрона;

Ид, Hb БФео-ы A-цепи и B-цепи цепи кофакторов переноса электрона;

К Кельвин;

Km канамицин;

LB среда Лурия-Бертани;

OD оптическая плотность;

Р димер БХл-ов, первичный донор электрона, специальная пара;

Р* димер БХл в возбужденном состоянии;

Р+ димер БХл в окисленном состоянии;

РА, Рв БХл-лы, образующие первичный донор электрона;

PDB Protein Data Bank, банк данных структур белков и нуклеиновых

кислот, полученных методами рентгеновской кристаллографии или

ЯМР-спектроскопии;

стрептомицин;

Тс тетрациклин;

сы, (ь первичный и вторичный хинонные акцепторы электрона;

дикий тип;

(Б)Фео (бактерио)феофитин;

(Б)Хл (бактерио)хлорофилл;

ДЭАЭ целлюлоза диэтиламиноэтил целлюлоза;

ИК инфракрасный;

кд круговой дихроизм;

ЛДАО лаурилдиметиламиноксид;

нс наносекунда;

пс пикосекунда;

ПЦР полимеразная цепная реакция;

РЦ реакционный центр;

ССК1 и ССК2 светособирающие комплексы коровой и периферической антенн;

ТЛ буфер Трис-ЛДАО буфер;

т.п.о. тысяча пар оснований (нуклеотидов);

ТТ буфер Трис-Тритон XI00 буфер;

УФ ультрафиолетовый;

ФГК фотосинтетический генный кластер;

ФС фотосистема;

фс фемтосекунда;

цит цитохром.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования.

Фотосинтез является уникальным биосферным процессом, в ходе которого происходит превращение и запасание энергии света в энергию химических связей органических соединений, необходимых для жизнедеятельности большинства организмов Земли. Первичное преобразование поглощенной фотосинтетическими пигментами световой энергии в энергию разделенных зарядов протекает в мембранных белках - реакционных центрах (РЦ) фототрофных организмов, где происходит первичный перенос электрона между кофакторами с образованием трансмембранного потенциала. Квантовая эффективность начальных этапов фотосинтеза, составляющая почти 100%, очевидно, достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов за счет их взаимодействий друг с другом и с окружающим белком.

Исследования РЦ пурпурных аноксигенных бактерий имеют большое значение для понимания принципов и механизмов преобразования энергии при фотосинтезе. Аминокислотная последовательность белков и кристаллографическая структура бактериальных реакционных центров известна с середины 80-х годов XX века [Deisenhofer et al., 1984; Youvan et al., 1984a; Michel et al., 1985; 1986а]. Хорошо охарактеризованные бактериальные РЦ многие годы служат структурной и функциональной моделью для исследования более сложно организованной фотосистемы 2 зеленых растений и водорослей. РЦ пурпурных бактерий обладают рядом свойств, делающих их удобным объектом исследований. Среди них можно отметить сравнительную фото- и термостабильность, относительно простую организацию, спектральное разрешение полос поглощения отдельных кофакторов, наличие разработанных методов генетической и химической модификации, позволяющих манипулировать составом и свойствами кофакторов.

Фотосинтетический РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех субъединиц белка и 10 кофакторов, образующих две структурно-функциональные ветви. Каждая ветвь начинается с димера бактериохлорофиллов (БХл) Р, проходит через молекулы мономерного БХл, бактериофеофитина (БФео), и убихинона. Димер БХл выполняет функцию первичного донора электрона. Перенос электрона в нативных РЦ осуществляется по одной, так называемой А-ветви.

Детальный молекулярный механизм начальной стадии разделения зарядов в бактериальных РЦ остается объектом пристального внимания. До последнего времени активно

7

обсуждалась роль мономерного бактериохлорофилла активной ветви переноса электрона Вд и факторов, определяющих направленность электронного транспорта. Ранее были предложены две гипотезы переноса электрона от первичного донора Р на бактериофеофи-тин Нд - по механизму супер-обмена, без непосредственного участия БХл Ва [Martin et al, 1986; Bixon et al., 1989], и двустадийный последовательный перенос с образованием промежуточной радикальной пары Р+Вд_ [Shuvalov et al., 1978]. В процессе исследования на-тивных и феофитин-замещенных РЦ Rba. sphaeroides методом фемтосекундной спектроскопии была зарегистрирована полоса при 1020 нм, соответствующая поглощению анион-радикала ВА~, что свидетельствует в пользу второй гипотезы [Arlt et al., 1993; Kennis et al., 1997].

Использование сайт-направленного мутагенеза, позволяющего селективно замещать отдельные аминокислотные остатки в сайтах связывания хромофоров, дает уникальные возможности для исследования начальных стадий фотопереноса электрона в РЦ и роли отдельных пигментных кофакторов и аминокислотных остатков в этом процессе.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось исследование влияния ближайшего белкового окружения первичного акцептора электрона бактериохлорофилла Вд на его спектральные свойства и процессы разделения зарядов в реакционных центрах пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides.

Были поставлены следующие задачи:

1. Внесение сайт-направленных мутаций и получение штаммов Rba. sphaeroides с аминокислотными замещениями в L-субъединице реакционного центра: H(L153)C, H(L153)L, H(L153)M, H(L153)Y и Y(L128)H; в М-субъединице: H(M182)L, а также с двойным замещением H(L153)Y+H(M182)L.

2. Выделение стабильных генетически-модифицированных реакционных центров, исследование их спектральных свойств и функциональной активности.

3. Исследование нестабильных мутантных РЦ в составе фотосинтетических мембран. Изучение их пигментного состава и фотохимической активности.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые получены мутантные штаммы Rba. sphaeroides, содержащие реакционные центры с одиночными аминокислотными замещениями гистидина в позиции L153 на ци-стеин и метионин, а также с двойным замещением, гистидина L153 на тирозин и гистидина Ml 82 на лейцин.

Впервые показано, что замещение гистидина L153 на тирозин в реакционном центре Rba. sphaeroides приводит к потере мономерного БХл активной цепи кофакторов переноса электрона, сопровождающейся уменьшением стабильности пигмент-белкового комплекса. Впервые исследован процесс переноса электрона в мембрановстроенных му-тантных реакционных центрах без первичного акцептора электрона. Методом лазерной спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением установлено, что переноса электрона в РЦ H(L153)Y с восстановленным хиноном QA не происходит, наблюдается лишь релаксация возбужденного состояния специальной пары Р* в основное состояние. Показано значительное замедление скорости электронного транспорта в мутантном РЦ и десятикатное снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами P+Qa~. Выявлено, что такой квантовой эффективности недостаточно для фотосинтетического роста бактерии.

Показано, что дополнительная к H(L153)Y замена гистидина Ml 82 на лейцин, приводящая к замещению бактериохлорофилла Вв молекулой бактериофеофитина Фв, инициирует быстрый перенос электрона с Р* на молекулу Фв за —3,5 пс с последующей рекомбинацией в основное состояние за 180 пс. Наблюдалось полное подавление переноса электрона в А-цепь в РЦ двойного мутанта.

В исследованиях реакционных центров с замещением тирозина L128 на гистидин, которое приводит к образованию водородной связи между аминокислотным остатком и БХл ВА, методом спектроскопии с фемтосекундным временным разрешением впервые наблюдался сдвиг полосы поглощения 1020 нм до 1035 нм, подтверждающий, что данная полоса принадлежит анион-радикалу первичного акцептора электрона Вд~.

Полученные данные о значимости первичного акцептора электрона и его ближайшего окружения для фотосинтетического электронного транспорта в бактериальных реакционных центрах важны с точки зрения разработки высокоэффективных искусственных систем для преобразования солнечной энергии.

Апробация работы

Основные положения работы изложены на: International Meeting "Photosynthesis in the post-genomic era: