Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пигмент - белковые взаимодействия в фотосинтетическом реакционном центре пурпурных бактерий

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пигмент - белковые взаимодействия в фотосинтетическом реакционном центре пурпурных бактерий"

На правах рукописи

У

ВАСИЛЬЕВА ЛЮДМИЛА ГРИГОРЬЕВНА

ПИГМЕНТ - БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОМ РЕАКЦИОННОМ ЦЕНТРЕ ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ

03.01.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

~ I СЕН 2015

Пущино - 2015

005561939

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Научный консультант:

доктор биологических наук, академик РАН Шувалов Владимир Анатольевич

Официальные оппоненты:

Юрина Надежда Петровна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, заведующая лабораторией биоэнергетики

Стадничук Игорь Николаевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Рукавцова Елена Борисовна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН)

Защита состоится 25 ноября 2015 года в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе ИФПБ РАН по адресу. 142290, г. Пущино Московской области, ул. Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФПБ РАН (http://www.ibbp.psn.ru)

Автореферат разослан «¿у» августа 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Фотосинтез является глобальным биологическим процессом превращения солнечной энергии в энергию химических связей и одним из основных факторов, ответственных за поддержание жизни на Земле. Процесс фотосинтеза в клетках растений, водорослей и фототрофных бактерий начинается с поглощения квантов света в светособирающих комплексах с последующей передачей энергии возбуждения на реакционные центры (РЦ). В результате серии сверх-быстрых реакций переноса электрона в РЦ происходит первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с квантовой эффективностью, близкой к 100%. Такая высокая эффективность улавливания и передачи световой энергии без разрушения молекул, включенных в этот процесс, и без нежелательных побочных реакций достигается путем тонкой регулировки свойств кофакторов через их взаимодействия друг с другом и с окружающим белком. В связи с этим исследование пигмент-белковых взаимодействий в бактериальных РЦ фотосинтеза является актуальной задачей, направленной на выяснение детальных механизмов первичного преобразования световой энергии.

РЦ пурпурных бактерий относительно просто организованы и стабильны, известна пространственная структура этих комплексов с высоким разрешением. Бактериальные РЦ многие годы служат моделью для исследования направления и скоростей первичного фотопереноса электрона, а также изучения механизмов его отдельных стадий. В настоящее время особое внимание уделяется конформационным изменениям белка РЦ в процессе фотохимического разделения заряда, в значительной степени определяющим эффективность этого процесса. Перспективным подходом для изучения взаимодействий кофакторов РЦ с их белковым окружением является использование сайт-направленного мутагенеза в сочетании с современными биохимическими, спектральными и кристаллографическими методами. Определение структуры модифицированных РЦ необходимо для корректной оценки изменений белкового окружения кофакторов, происходящих в результате аминокислотных замещений и оказывающих влияние на свойства и функциональную активность РЦ. Данная работа посвящена созданию системы для направленного мутагенеза РЦ пурпурной бактерии Rhodobacíer (Rba.) sphaeroides и изучению влияния отдельных аминокислотных остатков и участков полипептидов РЦ, находящихся в непосредственной близости от молекул бактериохлорофиллов, на оптические, фотохимические и другие свойства РЦ, их пигментный состав и пигмент-белковые взаимодействия, а также получению кристаллов и расшифровке пространственной структуры природных и мутантных РЦ методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением. Кроме того, в данной работе представлен вектор для гетерологической экспрессии генов, имеющий потенциал для использования в биотехнологии. Цели и задачи исследования

Целью работы было создание генетической системы для мутагенеза и экспрессии реакционного центра Rba. sphaeroides in vivo и исследование влияния ближайшего белкового окружения бактериохлорофиллов на пигмент-белковые взаимодействия, на свойства и фотохимическую активность этого комплекса.

В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Провести анализ последовательности ДНК р«/-оперона из пурпурной бактерии Rba. sphaeroides штамм RV в сравнении с puf-оперонами других известных штаммов.

2. Создать серию плазмидных векторов для внесения направленных мутаций в L и М белковые субъединицы реакционного центра Rba. sphaeroides и дальнейшей экспрессии мутантных комплексов ш vivo.

3. Сконструировать экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе puf-промотора и протестировать его в периодических и непрерывных условиях культивирования Rba. sphaeroides.

4. Путем комбинации разных родительских штаммов Rba. sphaeroides и плазмид для комплементации получить рекомбинантные штаммы с фенотипами РЦ+ССК1+ССК2+, РЦ+ССК1+ССК2- и РЦ+ССК1ССК2".

5. Исследовать особенности координирования центрального атома магния мономерных бактериохлорофиллов со стороны белка с помощью аминокислотных замещений H(L153)L, H(L153)Y, H(L153)C, H(L153)M, H(M182)L, H(M182)L+ H(L153)Y, H(M 182)L+I(L 177)H.

6. Исследовать влияние белкового окружения димера БХл Р на свойства первичного донора электрона, пигмент - белковые взаимодействия и стабильность комплекса, используя широкий спектр подходов, включая кристаллизацию РЦ.

7. Исследовать возможность смещения гистидиновых лигандов каждого из бактериохлорофиллов димера на один виток a-спирали белка и влияние этого переноса на свойства первичного донора электрона.

Научная новизна работы

Впервые получены и охарактеризованы РЦ Rba. sphaeroides с одиночными, и двойными аминокислотными замещениями в L- и М-субъединицах: I(M206)H, I(L177)H, H(L173)L+I(L177)H, H(L173)L+I(L177)T, I(M206)H+H(M202)L, H(M182)L+I(L177)H, H(L153)M, H(L153)Y, а также с заменами фрагментов М-субъединицы вблизи димера БХл на симметричные им фрагменты из L-субъединицы. Получена новая информация о влиянии ряда консервативных аминокислотных остатков из белкового окружения бактериохлорофиллов на оптические свойства этих кофакторов, на пигментный состав, стабильность и фотохимическую активность РЦ. Получены мутантные РЦ с пигмент-белковыми взаимодействиями, нетипичными для бактериальных фотосинтетических комплексов.

Впервые показана возможность смещения гистидиновых лигандов бактериохлорофиллов специальной пары с позиций L173 (лиганд Ра) и М202 (лиганд Рв) на позиции L177 и М206, соответственно. Показано, что в спектре поглощения РЦ H(L173)L+I(L177)H наблюдается беспрецедентный 46 нм коротковолновый сдвиг Qy полосы поглощения первичного донора электрона, свидетельствующий о значительном изменении экситонного взаимодействия внутри димера БХл.

Проведено исследование свойств РЦ с аминокислотными замещениями изолейцинов нагистидины в симметричных позициях L177 и М206. Впервые установлено, что аминокислотное замещение 1(И77)Н влияет на координирование центрального атома магния двух ближайших бактериохлорофиллов: БХл Вв становится 6-координированным, а координирование БХл Ра со стороны белка значительно усиливается. Проведен анализ

причин различного влияния этих замещений на свойства ближайших БХл и пигмент-белковые взаимодействия.

Получены экспериментальные доказательства того, что мутация 1(Ь177)Н приводит к прочному ковалентному связыванию БХл Ра с Ь -субъединицей. Исследована природа и проанализированы возможные причины нового вида взаимодействия БХл с белком. Впервые получена пространственная структура мутантного РЦ 1(1Л77)Н с разрешением 2.5 А. На основе рентгеноструктурных данных построена молекулярная модель, показывающая, что в мутантном РЦ возникает новая цепочка га координационной, водородной и ковалентной связей, соединяющих бактериохлорофиллы Вв и Ра. Обнаружено, что электронные плотности С2-метильной группы первого кольца БХл Рд и азота имидазольной группы объединены, что указывает на вовлеченность этих групп в образование ковалентной связи. Предложена химическая реакция, которая могла привести к ковалентной связи между белком и БХл.

Впервые установлено, что в РЦ с двойным замещением Н(М182)Ь+1(1Л77)Н координирование атома магния БХл Вв осуществляется с Р-стороны макроцикла. Модель р-координирования, построенная на основе кристаллической структуры РЦ 1(Ы77)Н предполагает участие в качестве лиганда молекулы воды, обнаруженной в структуре и связанной водородной связью с остатком гистидина Ы77.

Впервые показано, что в мутантном РЦ Н(Ь153)У отсутствует мономерный бактериохлорофилл активной цепи переноса электрона. В этом РЦ наблюдается значительное замедление скорости переноса электрона и снижение квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами Р+<Зд' до 7%.

Сконструирован новый экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе сильного и хорошо регулируемого р»/"-промотора из НЬа. ¡ркаегогЛез КУ и показано, что использование непрерывного культивирования рекомбинантного штамма может многократно повысить выход экспрессируемого белка. Научная и практическая значимость

Сконструирована генетическая система для направленного мутагенеза, позволяющая вносить направленные контролируемые аминокислотные замещения в Ь- и М-субъединицы реакционного центра НЬа. !рИаего!с1ез, а также в а- и р-субъединицы корового светособирающего комплекса, ССК1. В рамках данной системы можно получать рекомбинантные штаммы КЬа. зрИаего^с/ез с разными сочетаниями фотосинтетических комплексов РЦ, ССК1 и ССК2. Штамм с фенотипом РЦ+ССКГССК2" позволяет исследовать свойства нестабильных мутантных РЦ без их выделения га мембран. В работе получено более 15 мутантных РЦ с аминокислотными замещениями вблизи бактериохлорофиллов. Получены новые данные о влиянии ряда консервативных аминокислотных остатков из белкового окружения бактериохлорофиллов на оптические и окислительно-восстановительные свойства этих кофакторов, а также на пигментный состав и фотохимическую активность РЦ. Получен мутантный РЦ Н(Ы73)Ь+1(Ы77)Н, в оптическом спектре которого наблюдается коротковолновый сдвиг Оу полосы поглощения первичного донора электрона на 46 нм, свидетельствующий об изменениях экситонных взаимодействий внутри димера БХл. Муташные РЦ с замещениями в позициях Н(М202)Ь, Н(Ы73)Ь, Н(1Л73)Ь+1(1Л77)Н были использованы для получения приоритетной информации о ранних стадиях процессов преобразования световой энергии

в энергию состояний с разделенными зарядами. Впервые показано, что в мутантном РЦ Н(1Л53)У отсутствует первичный акцептор электрона, мономерный бактериохлорофилл активной цепи. В этом РЦ наблюдается значительное замедление скорости переноса электрона и снижение на порядок квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами Р+С2а". В РЦ с двойным замещением Н(1Л53)У+Н(М182)Ь наряду с потерей БХл ВА происходит замена БХл Вв на БФео Фв, что приводит к переносу электрона с Р* в неактивную В-цепь на Фв и полному блокированию переноса электрона в А-цепь. Установлено, что одиночное замещение 1(Ы77)Н приводит к коваленгному связыванию БХл Ра с Ь -субъединицей. С помощью ряда биохимических подходов и анализа кристаллической структуры РЦ 1(Ь177)Н исследована природа и возможные причины возникновения нового взаимодействия, установлены боковые группы, участвовавшие в реакции. Предложен механизм химической реакции, в результате которой образовалась ковалентная связь БХл с белком. Исследованы участки РЦ, критичные для стабильного функционирования комплекса, что представляет интерес для практических задач использования РЦ. Сконструирован и протестирован новый вектор для гетерологической экспрессии генов в пурпурных бактериях. Полученные экспериментальные данные имеют приоритетный характер, находятся в русле мировых исследований и вносят существенный вклад в решение фундаментальных задач, связанных с исследованием механизмов преобразования световой энергии при фотосинтезе. Созданная в работе генетическая система для направленного мутагенеза пигмент-белковых комплексов пурпурных бактерий может найти применение при моделировании живых систем и создании преобразователей солнечной энергии. Вектор для гетерологической экспрессии имеет потенциал для использования в биотехнологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1) На основе /з«/-оперона НЬа. зрИаего/Лех штамм IIV получена серия плазмидных векторов для внесения направленных мутаций в Ь я М белковые субъединицы реакционного центра и в а- и р-субъединицы светособирающего комплекса ССК1. Получены рекомбинантные штаммы ИЬа. ар1таег&с1ез, экспрессирующие фотосинтетические комплексы в следующих сочетаниях: РЦ+ ССК1+ ССК2+, РЦ+ ССК1+ССК2\ РЦ+ ССК1 • ССК2".

2) Сконструирован и протестирован экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе р«/-промотора. Максимальный 700-кратный уровень индукции ри/-промотора в новом экспрессионном векторе для ЯЬа. зркаего^ск! может быть достигнут при переходе из аэробных хемогетеротофных условий выращивания клеток к анаэробным фототрофным условиям. Время гетерологической экспрессии гена люциферазы под контролем ры/-промотора многократно повышается при переходе от периодического к непрерывному культивированию рекомбинантного штамма

3) Внесено более 15 направленных аминокислотных замещений в Ь- и М-субъединицы реакционного центра вблизи молекул БХл. С помощью направленных мутаций показано, что закономерности координирования центрального атома М£2+ в бактериальном реакционном центре не являются строгими. Ряд мутантных РЦ обладают уникальными свойствами и представляют

интерес для исследования пигмент-белковых взаимодействий, а также механизмов первичных процессов фотосинтеза.

4) Гистидиновые лиганды бактериохлорофиллов специальной пары могут быть перемещены с позиций L173 (лиганд Ра) и М202 (лиганд Рв) на позиции L177 и М206, соответственно. Такое перемещение лигандов в РЦ H(M202)L+I(M206)H и H(L173)L+I(L177)H приводит к значительным коротковолновым сдвигам Qy полосы поглощения первичного донора электрона, что свидетельствует об изменении экситонного взаимодействия внутри димера БХл.

5) Путем модификации белкового окружения мономерного БХл Вв возможно провести замещение этого БХл на БФео в РЦ H(M182)L, получить альтернативное лигандирование БХл Вв с p-стороны макроцикла в РЦ I(L177)H+H(M182)L или его б-координирование в РЦ I(L177)H. В случае с мономерным БХл активной цепи Вд возможна лишь замена лиганда с гистидина на цистеин или метионин. При замещении гистидина L153 на лейцин происходит значительная дестабилизация РЦ, а в случае замещения его на тирозин в РЦ H(L153)Y не происходит встраивания БХл Вд в комплекс РЦ.

6) Одиночное аминокислотное замещение I(L177)H приводит к 6-координированию БХл Вв и ковалентной связи между БХл Рд и L-субъединицей РЦ. Согласно кристаллической структуре РЦ I(L177)H, полученной с разрешением 2.5 Á, в мутантном РЦ образуется цепочка новых связей, соединяющих атом магния БХл Вв, молекулу воды с Р-стороны БХл Вв и имидазольное кольцо гистидина L177. Благодаря этой цепочке связей обеспечивается шестое координирование атома магния Вв. В структуре РЦ I(L177)H электронные плотности имидазольного кольца гистидина L177 и метальной группы первого кольца БХл Рд объединены, что согласуется с образованием ковалентной связи между ними. По аналогии с гистидил-флавинами, предложена реакция ковалентного взаимодействия этих групп с участием молекулы кислорода и образованием гистидил-БХл.

Апробация результатов.

Материалы диссертации были представлены на Ежегодной конференции японского биотехнологического общества (Япония, 1998), 10-м Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (Испания, 2000), Международной научной конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие» (Пущино, 2001), XVII Путинских чтениях по фотосинтезу (Пущино, 2002), Международной конференции "Фотосинтез и урожай" (Киев, 2002), 11-м Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (Япония, 2003), 6-й Международной конференции по морской биотехнологии (Япония, 2003), Международной конференции по первичным процессам фотосинтеза (Пущино, 2004), 29-м Конгрессе ФЭБС (Польша, 2004), 13-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Канада, 2004), 3-м съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу "Преобразование энергии света при фотосинтезе" (2005), Международном биофизическом конгрессе (Франция, 2005), XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе (Пущино, 2005), Международной конференции «Фотосинтез в постгеномную эру» (Пущино, 2006), Международном

конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Япония, 2006), Международном симпозиуме по фотосинтетическим прокариотам (Франция, 2006), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Япония, 2007), Европейской биоэнергетической конференции (Ирландия, 2008), Международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2008), Гордоновских чтениях по фотосинтезу (США, 2008), Конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), XIII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009), 15-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Китай, 2010), Международной конференции "Исследование фотосинтеза для устойчивого развития" (Азербайджан, 2011 и Пущино, 2014), VI и VII съездах Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011 и 2014), Международной конференции по тетрапиррольным фоторецепторам фотосинтетических организмов (Китай, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ (17 статей в реферируемых журналах, 2 обзора, 5 глав в книгах и сборниках и 15 тезисов докладов). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы работы изложены на 146 страницах машинописного текста, включая 58 рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 236 библиографических ссылок.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследований, разработке подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций совместно с соавторами. Результаты, обсуждаемые в работе, были получены либо лично автором, либо руководимыми им аспирантами.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному консультанту Шувалову В.А. и коллегам, участвовавшим в проведении исследований и/или обсуждении результатов: Фуфиной Т.Ю., Леоновой М.М., Хмельницкой Т.И., Хатыпову P.A., Хмельницкому А.Ю., Шкуропатову А.Я., Забелину A.A., Каминской О.П., Шкуропатовой В.А., Христину A.M., Цыганкову A.A., Проскурякову И.И., Яковлеву А.Г., Габдулхакову А.Г. (ИБ РАН), Хреновой М.Г. (Химфак МГУ), а также Волщуковой Т.С., помогавшей в проведении исследований. Работа финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований, грантами Президента РФ, Программой Президиума РАН МКБ, государственными контрактами с Минобрнауки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении формулируется актуальность темы, цель диссертационной работы, ее научная новизна, научная и практическая значимость, перечислены поставленные задачи, приводятся основные защищаемые положения.

ГЛАВА 1 содержит аналитический обзор экспериментальных и теоретических работ, касающихся исследований фотохимического разделения заряда в бактериальных реакционных центрах. В обзоре рассматриваются работы, посвященные исследованию состава и структуры бактериального реакционного центра, изучению путей, скорости и механизмов первичного переноса электрона на отдельных этапах этого процесса, а также известные генетические модификации белкового окружения кофакторов. Отдельное

8

внимание уделено организации генов, ответственных за фотосинтез, существующим системам для направленного мутагенеза фотосинтетических комплексов и экспрессионным векторам для пурпурных бактерий.

В ГЛАВЕ 2 дано описание использованных методов и объектов исследований.

Микроорганизмы н культивирование. В данной работе использованы Rba. sphaeroides штаммы RV (дикий тип), ÄLM1 (фенотип РЦ'ССКГ) и DD13 (фенотип РЦ" ССКГ ССК2"), Е. coli штаммы DH5a, JM109 и S17-1. Е. coli выращивали на среде LB при 37"С. Для поддержания плазмид в ростовую среду добавляли ампициллин (100 мкг/мл), канамицин или тетрациклин (10 мкг/мл). Рекомбинантные штаммы Rba. sphaeroides выращивали в полу-аэробных условиях в темноте при 34'С на минеральной среде Хатнера, содержащей сукцинат, в присутствии тетрациклина (1 мкг/мл), канамицина (5 мкг/мл) и стрептомицина (5 мкг/мл). Для непрерывного культивирования рекомбинантного штамма Rba. sphaeroides (pPluc-2) использовали фотобиореактор с рабочим объемом 1 л. Культуру продували аргоном (30 мл/мин). Интенсивность света ламп накаливания измеряли на внешней стороне водной рубашки биореактора, используя фотометр «LI-COR» модель LI-250 с пирометром (LI-COR, Inc., Lincoln, NE). Величину pH в непрерывной культуре поддерживали в пределах 6,8 - 7,1 путем автоматического добавления 0,5 M NaOH. Концентрацию клеточной массы определяли по оптической плотности культуральной суспензии при 660 нм или по удельному сухому весу клеток. Плазмидную ДНК из Е. coli выделяли с помощью набора Wisard Plus Clean up System (Promega). Для проверки нативности плазмид в рекомбинантных штаммах Rba. sphaeroides выделяли тотальную ДНК, трансформировали ей Е. coli, из штамма-трансформанта выделяли плазмиду для последующего анализа. Расщепление ДНК проводили с помощью эндонуклеаз рестрикции (Toyobo, Promega, Amersham, Сибензим, MBI Fermentas). Фрагменты ДНК выделяли из геля с использованием набора Wisard SV Gel Gel and PCR Clean up system (Promega). Перенос плазмид в клетки Е. coli проводили с помощью теплового шока при 42° С или путем электропорации на приборе MicroPulser (BioRad, США). Компетентные клетки готовили путем многократного промывания в CaClj. Электрокомпетентные кетки готовили путем многократного промывания в 10% глицерине (рекоментации производителя прибора, BioRad, США). Коньюгативный перенос плазмид в Rba. sphaeroides проводили путем двуродигельского скрещивания с использованием штамма Е. coli S17-1. Праймеры для ПЦР составляли на основе известных последовательностей pujA,B,L,M и X генов с помощью программы GeneRunner. Олигонуклеотиды заказывали в фирмах Синтол и Евроген, Москва. Определение нуклеотидной последовательности ДНК по Сэнгеру проводили на автоматических секвенаторах, используя набор Taq Dye Deoxy™ Terminator Cycle Sequensing Kit (The Perkin Elmer Co., USA) или заказывали в фирмах Синтол и Евроген. Для анализа последовательностей использовали программы DNAsis и Chromas. Реакционная смесь для ПЦР содержала 5'- и З'-концевой праймеры, ДНК матрицу, смесь из четырех дезоксинуклеозидгрифосфатов, ПЦР буфер, Tag или др. полимеразу, MgCI2 и DMSO. Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью ПЦР методом перекрывающихся фрагментов ДНК. Изменения нуклеотидных последовательностей вносились в состав 5'- и З'-концевых праймеров для ПЦР. Бесклеточный экстракт Rba.

sphaeroides получали после разрушения клеток на ультразвуковом дезинтеграторе. Неразрушенные клетки и частицы клеток удаляли центрифугированием. Измерение люциферазной активности проводили в бесклеточном экстракте при помощи набора Luciferase Assay System, Promega. Эмиссию фотонов в образце измеряли автоматически с помощью люминометра в течение 3 мин. Для выделения реакционных центров бесклеточный экстракт Rba. sphaeroides центрифугировали при при 45000 об/мин, чтобы осадить хроматофоры. Экстрагирование РЦ из мембран проводили путем инкубирования хроматофоров в 20 мМ Трис-HCl буфере рН 8,0, содержащем 120 мМ NaCl и 0,5% ЛДАО, в течение 30 мин. Затем концентрацию ЛДАО повышали до 0,7% и инкубировали еще 30 мин. Обработанные хроматофоры центрифугировали при 45000 об/мин, 60 мин. Очистку РЦ проводили с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ 52- и ЕМД-целлюлозе. Промывку колонок производили 20 мМ Трис-HCl буфером рН 8,0, 0,1% ЛДАО с постепенным повышением концентрации NaCl от 60 до 150 мМ. РЦ элюировали 200 мМ NaCl в 20 мМ Трис-HCl буфере рН 8,0 с 0,1% ЛДАО. Экстракцию пигментов из РЦ, осажденных 26 % сульфатом аммония, проводили смесью ацетон-метанол (7:2). Денатурирующий электрофорез белков проводили в 18% полиакриламидном геле в присутствии 6 М раствора мочевины, 0,1% ДСН или в геле с линейным градиентом концентрации 10-20%. Для калибровки использовали стандартные наборы низко- или высокомолекулярных белков фирмы «BioRad» (США). Для Вестерн-блот анализа белки переносили из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану Clear-blot (АТТО Co., Japan). Мембрану блокировали буфером 20 мМ Трис-HCl, 140 мМ NaCl, содержащим 5% сухого молока, в течение 60 мин при 37° С и затем промывали и инкубировали с первичными антителами к люциферазе (США). Связывающую способность антител определяли с помощью набора Peroxidase Substrate Kit ТМВ (США), используя пероксидазный коньюгат с антителами к иммуноглобулину G кролика в качестве вторичного антитела. Обработку РЦ NaBH4 поводили в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0/ 0,1% Тритон Х-100. К образцу РЦ добавляли NaBH4 до достижения рН раствора больше 10. Инкубировали 16 часов при 20°С и затем проводили диализ в течение суток при 4 °С против того же буфера. После диализа РЦ очищали на колонке с ДЭАЭ целлюлозой. Электрохимический потенциал пары Р/Р+ измеряли с помощью платинового электрода путем титрования РЦ феррицианидом натрия или аскорбатом натрия, измеряя спектры поглощения после каждого добавления титранга. Результаты обрабатывали при помощи программы Origin с использованием уравнения Нернста. Спектры поглощения при комнатной температуре и 90 К измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1601PC. Дифференциальные (свет-мннус-темнота) спектры измеряли с использованием подсветки образца лампой накаливания и скрещенных светофильтров СЗС-22 и КС-15. Кинетику и спектры фотоиндуцированных изменений поглощения ДА в миллисекундном диапазоне измеряли на однолучевом дифференциальном спектрофотометре с фосфороскопом. Кристаллы РЦ выращивали методом диффузии паров в висящей или сидящей капле при 16° С. Раствор белка (10 мг/мл) в 1 М калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 3,5% 1,2,3-гептантриол, 2% диоксан, 0,1% ЛДАО уравновешивали против 1,5 М калий-фосфатного буфера, рН 7,4. Кристаллы призматической формы появлялись после 3-4 недель. Визуально размер кристаллов определяли с помощью бинокулярного микроскопа, а их рассеивающую способность - на лабораторном источнике

рентгеновского излучения в Институте белка, г. Пушино. Сбор дифракционных данных с кристаллов проводили после их замораживания в струе жидкого азота. Перед замораживанием кристаллы выдерживали в 25% этиленгликоле. Дифракционные наборы данных с кристаллов РЦ дикого типа и мутантного РЦ I(L177)H были получены на рабочей станции Х13 синхротрона DESY (Германия). В качестве детектора использовался MAR CCD. Расшифровка трехмерной структуры РЦ проводилось методом молекулярного замещения с использованием атомных координат для РЦ F(M197)R, полученных из базы данных Protein Data Bank (PDB ID 1E6D). Автоматическое уточнение структур проводилось в программных комплексах ССР4 и Phénix. Ручная правка моделей происходила в графическом комплексе Coot. Моделирование аминокислотных замещении и рисунки были сделаны с использованием программы PyMol.

ГЛАВА 3 посвящена созданию генетических конструкций на основе ри/-оиеропа Rba. sphaeroides.

Плазмиды для направленного мутагенеза L- и М-субъединнц реакционного центра

В puf-оперон (puf: photosynthetic unit function) входят гены pufL и pufM, кодирующие L и M субъединицы РЦ, а также гены pufA и pufB, кодирующие а- и ß-полипептиды светособирающей антенны CCKI. EcoRl-EcoRV фрагмент ДНК размером 4900 пар оснований (п.о.), содержащий полный puf-oперон из Rba. sphaeroides штамм RV, был изолирован из плазмиды pRVB2, предоставленной лабораторией Джуна Мияке, Тсукуба, Япония. (Рис. 1).

Фрагмент ДНК (4900 п о.), несущий puf-onqpoii, был выщеплен из плазмиды pRVB2 и затем клонирован в pUC-18 по сайтам EcoRl и EcoRV. Полученная плазмида -pUC-4.9 (Рис. 1). Специфичность клонированного фрагмента была подтверждена блоттингом ДНК по Саузерну, в качестве пробы был использован меченый 32Р Sall-Xhol ПЦР-фрагмент puf-оперона из Rba. sphaeroides. Был сделан рестрикционный анализ и определена нуклеотидная последовательность ДНК puf-оперона из Rba. sphaeroides RV. Анализ последовательности ДНК показал, что в гене pufL присутствует один Kpnl сайт рестрикции, в отличие от /л</-оцсронов штаммов 2.4.1. и NCIB 8253 Rba.sphaeroides, содержащих два Kpnl сайта. Это позволило использовать Sall-Kpnl фрагмент ДНК (440 п о.) для внесения мутаций в ген pufL. Для мутагенеза гена pufM в составе pUC-4,9 был использован фрагмент ДНК Xhol- Xhol, 1700 п о. (Рис. 1) или фрагмент Ncol-Xhol (490 п.о., плазмида pUCA3', Рис. 1). Размер puf-фрагмента ДНК был оптимизирован до 4500 и.о., для мутагенеза и экспрессии РЦ in vivo был использован EcoRI-SphI фрагмент (Рис. 1, плазмида риСДЗ'). С целью экспрессш1 РЦ в отсутствии светособирающей антенны ССК1 из puf-оперона в составе плазмиды pUCA3' были удалены гены pufliA (Рис. 1, плазмида pUC-4D). Затем ры/^фрагмипы ДНК, полученные путем расщепления эндонуклеазами рестрикции EcoRl-EcoRV (из pUC-4,9) или EcoRl-HindIII (из pUCA3' или pUC-4D) были клонированы в шаттл-вектор pRK-415 по тем же сайтам. В результате были получены плазмиды pRK-puf, pRKEH и pREHDl, содержащие полный или редуцированный puf-оперон дикого типа. В дальнейшем эти плазмиды были использованы для комплементации рк/-днфицитных штаммов Rba. sphaeroides.

1БЙЖ п о.

¡>

к

й

pUC-4 9 4900 п.о.

I ¡ i ——■ -г" t..........——"—™ 500 п.о.

Í2 IX I » I L ~1 I «8 [|~0~| РиГ■ промотор

рц ССК1

- • - - -

5 £ ? о о ñ Й. иЁЗ

cu,? " z к а а. а ш

г ф <п г х

pUC-J >

фр j i ! I I j

4500 П.О.

pUC-40 ФР

4200 п.о.

■С (П -в й. '/> ш

■i—1 i i-Н-I

И

РЦ

Рисунок 1. Puf-оперон Rba. sphaeroides штамм RV: конструирование плазмид для мутагенеза L- и М-субъединиц реакционного центра. Стрелкой показано место puf -промотора и направление транскрипции. *- уникальные сайты рестрикции.

В данной работе в системе для направленного мутагенеза РЦ был использован puf-оперон из Rba. sphaeroides штамма RV, в последовательности ДНК которого обнаружен ряд отличий от последовательностей ри/оперонов из штаммов NC1B 8253 и 2.4.1., описанных ранее. Преимущество использованного нами ри/фрагмента ДНК заключается в его небольшом размере и в наличии нескольких уникальных сайтов рестрикции по всей протяженности фрагмента, что позволяет вносить направленные изменения в любой участок puf-оперона. Для оптимизации выделения и очистки нестабильных мутантных РЦ в последовательность гена pufM перед стоп кодоном была внесена вставка из шести кодонов CAT (Гис-таг) и освоен метод высокоселективной очистки РЦ, содержащего Гис-таг, с помощью металл-аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе.

Экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе /»«/-промотора

Участок ри/-оперона, содержащий промотор, был использован для конструирования нового, хорошо регулируемого экспрессионного вектора для пурпурных бактерий. Фрагмент ДНК размером 1200 п.о., содержащий puf-промотор, гены pu/QK, последовательность Шайна-Дальгарно и стартовый кодон гена pufb, был амплифицирован с помощью ПЦР и клонирован по сайтам EcoRl (природный) и BamHl (создан с помощью ПЦР) в Bluescript SK(-). Из полученной плазмиды Blue-LPP фрагмент ДНК, содержащий

рг^промотор вместе с рядом уникальных сайтов рестрикции, был вышеплен по сайтам •рестрикции Kpnl и SacI и затем переклонирован по тем же сайтам в плазмиду pRK.M-Tl (производная плазмиды pRKM-415, содержащая терминатор транскрипции). Итоговая плазмида получила название pLP-1.2 (Рис. 2). Для оценки эффективности ри/-промотора был сконструирован фьюжен с маркерным геном люциферазы светлячка (lue). С помощью конъюгации вектор pPLuc-2 (Рис. 2) был перенесен в Rba. sphaeroides RV.

Рисунок 2. Экспрессионный вектор на основе ри/"-промотора. РР - промотор, Т -терминатор транскрипции, Luc - маркерный ген люциферазы. Показаны уникальные сайты рестрикции.

ГЛАВА 4 посвящена получению и характеристике рекомбинантных штаммов Rba. sphaeroides, а также тестированию нового экспрессионного вектора для пурпурных бактерий.

Получение и фенотипы рекомбинантных штаммов

Система для направленного мутагенеза РЦ и ССК1 состоит из puf-дефицитного штамма Rba. sphaeroides, а также из плазмиды для генетической комплементации (Рис. 3). В работе были использованы штаммы ALM1 и DD13, предоставленные Дж. Феером из Калифорнийского университета в Сан-Диего и М. Джоунсом из Университета г. Бристоль, Великобритания. В качестве плазмид для комплементации были использованы производные вектора pRK-415, содержащие полный или редуцированный ри/^оперон дикого типа (для экспрессии РЦ псевдо-дикого типа in vivo) или puf-oaepou, несущий мутации (для экспресии мутантных РЦ).

Рекомбинантные штаммы Rba. sphaeroides с различными фенотипами были получены путем комбинирования разных родительских штаммов Rba. sphaeroides и плазмид для комплементации (Рис. 4). Получены клетки Rba. sphaeroides, фотосинтетические мембраны которых содержали три (RC+CCK1+CCK2+), два (RC ССК1 ССК2") или только один БХл-содержащий фотосинтетический комплекс, РЦ (RC+CCK1"CCK2"). Последний вариант предоставляет возможность исследовать

.. ГСП iUAOGATAGCATCCiCTCATAi «i. i

нестабильные мутантные РЦ в составе хроматофоров без выделения их из мембран. Спектры поглощения хроматофоров полученных штаммов представлены на рисунке 5.

Рисунок 3. Генетическая система для мутагенеза реакционного центра и ССК1 из Rba. sphaeroides.

Рисунок 4. Схема получения рекомбинантных штаммов Rba. sphaeroides с различными фенотипами.

Дпнна волны нги

Рисунок 5. Спектры поглощения хроматофоров рекомбинантных штаммов Лба. зрИаггоШея, содержащих РЦ, ССК1 и ССК2 (1), РЦ и ССК1 (2) или один РЦ (3).

Тестирование экспрессионного вектора в периодических и непрерывных условиях культивирования ЯЬа. ьрИпегогйеь.

Экспрессию люциферазы под контролем /?и/-промотора оценивали по биолюминесценции бесклеточного экстракта из рекомбинантного штамма ЯЬа. $рУшего1^1е$ (рР1_ис-2), а также с помощью Вестерн-блот анализа. При выращивании этого штамма на свету в аэробных условиях люциферазная активность в бесклеточном экстракте составляла 30 ед. на мг белка, и Вестерн-блотинг показывал следовой уровень экспрессии белка люциферазы (Рис. 6, лунка 3), что свидетельствовало о значительной репрессии /т/промотора в присутствии кислорода. При выращивании рекомбинантного штамма на свету (30 Вт/м2, анаэробно) уровень экспрессии люциферазного белка значительно возрастал (Рис. 6, лунка 2), а люциферазная активность в бесклеточном экстракте составляла 2,2 х 104 ед. на мг белка. Таким образом, для нового экспрессионного вектора была показана возможность стимулирования экспрессии ри/-промотора более чем в 700 раз. Во время фотогетеротрофного роста рекомбинантного штамма ИЬа. ьрИаего1с!ез (рРЬис-2) (200 Вт/м2) уровень активности люциферазы повышался с начала до середины логарифмической фазы роста и затем быстро снижался. Время экспрессии люциферазы составляло 7 часов. Максимальный уровень экспрессии люциферазы в данных условиях был ниже, чем при выращивании клеток в периодической культуре при низкой интенсивности света (Рис. 6, лунка 1).

Рисунок 6. Оценка количества люциферазного белка с помощью Вестерн-блот анализа. 1 - ЯЬа. ¿ркаегоШея (рРЬис-2), анаэробные фототрофные условия, 200 Вт/м2; 2 - то же, 30 Вт/м2; 3 - то же, в присутствии кислорода; 4 - контроль, КЪа. $рУ1аего\с1е$ (рРКМ-415); 5 -контроль, люцифераза, 1 нг.

Для оптимизации условий экспрессии люциферазы под контролем ри/-промотора было использовано непрерывное культивирование рекомбинантного штамма КЬа. $ркаего1с1е$ (рРЬис-2) в фотогетеротрофных условиях в биореакторе в режиме хемостата. Освещение культуры варьировали за счет изменения концентрации биомассы при различных скоростях протока или за счет изменения интенсивности подаваемого света (Таблица 1). Было показано, что, в отличие от периодической культуры, клетки рекомбинантного штамма проявляли стабильную люциферазную активность в течение всего периода непрерывного культивирования. Максимальный для данных условий уровень люциферазной активности, который составил 950 ед. на мг белка, наблюдали при освещении 600 Вт/м2 и скорости протока 0,186 /час.

Таблица 1. Экспрессия люциферазы при непрерывном культивировании

ЯЪа.$ркаего{<1е$ (рРЬис-2)

Скорость протока, час"1 Интенсивность света, Вт/м" Сухой вес клеток, г / л Активность люциферазы, ед./ мг белка

0,046 200 1,8 230

0,087 200 1,0 670

0,137 200 0,5 510

0,186 600 1,0 950

0,268 600 0,5 510

Показано, что максимальный уровень экспрессии люциферазы в непрерывных условиях был значительно ниже, чем в периодической культуре. Однако, учитывая высокую концентрацию клеток в биореакторе и практически неограниченное время

экспрессии рг/^промотора в этих условиях, с помощью непрерывного культивирования можно значительно повысить конечный выход экспрессируемого продукта.

ГЛАВА 5 посвящена исследованию влияния белкового окружения димера БХл Р на свойства первичного донора электрона.

Влияние аминокислотного замещения Ие-Шз в симметричных позициях 1Л77 и

Изолейцины в симметричных позициях 1.177 и М206 в РЦ ЯЬа. $ркаего1йез располагаются вблизи димера БХл Р и вблизи мономерных БХл Вв (позиция 1Л77) или ВА (позиция М206). В спектре поглощения РЦ дикого типа в области <Зу-переходов максимум полосы <3у Р расположен при 866 нм, полосы поглощения БХл Вд и Вв - при 804 нм, а полоса поглощения БФео На и Нв имеет максимум при 760 нм (Рис. 7). В области (Эх-переходов наблюдаются полоса поглощения молекул БХл с максимумом при 598 нм и полоса поглощения молекул БФео с максимумом при 531 нм. а так же полосы поглощения каротиноидов вблизи 500 нм. В спектрах поглощения мутантных РЦ 1(М206)Н и 1(1_177)Н в области Оу-переходов наблюдаются сходные смешения максимума полосы Р от 866 до 856 нм в РЦ 1(М206)Н и до 847 нм в РЦ 1(1_177)Н со значительной потерей дипольной силы перехода. Для РЦ 1(М206)Н отмечается длинноволновый сдвиг полосы поглощения мономерных БХл от 804 нм до 809 нм, а для РЦ 1(1Л77)Н - уменьшение амплитуды полосы поглощения мономерных БХл с максимумом 807 нм.

Длина волны, нм

Рисунок 7. Спектры поглощения РЦ дикого типа (1) и мутантных РЦ 1(М206)Н (2) и 1(1Л77)Н (3), измеренные при комнатной температуре.

Показано, что оба мутантных РЦ являются фотохимически активными. Квантовый выход разделения зарядов Р+(Эд" в РЦ 1(М206)Н составил 25%, а в РЦ 1(1Л77)Н он был близок к единице, как и в РЦ дикого типа. Пигментный анализ показал, что молярное соотношение БХл/БФео в ацетон-метанольном (7:2) экстракте из РЦ дикого типа и РЦ 1(М206)Н составило 1.99±0.01 (4 молекулы БХл и 2 молекулы БФео на 1 РЦ). В экстракте из РЦ 1(1Л77)Н молярное соотношение БХл/БФео составило 1.55±0.05, что указывало на отсутствие одной молекулы БХл.

М206.

С

ем

Изучение прочного связывания БХл с белком в РД I(L177)H.

Результаты пигментого анализа РЦ 1(L177)H, казалось, противоречили спектральным данным. В спектрах поглощения РЦ I(L177)H, измеренных при 10 К, в Qy области прослеживались полосы поглощения, характерные для всех четырех бактериохлорофиллов РЦ (Рис. 8). Полосы поглощения мономерных БХл Вд и Вв располагались при 803 и 817 нм. Полоса поглощения димера БХл Р была сдвинута в коротковолновую область и располагалась при 880 нм. Было показано, что после экстрагирования пигментов смесью ацетон - метанол (7:2) денатурированный осадок РЦ дикого типа был окрашен в белый цвет, в то время как осадок РЦ I(L177)H имел сине-зеленую окраску, характерную для БХл. При обработке осадка 1 М HCl, он приобретал бурую окраску, характерную для БФео, но прочное связывание пигмента с осадком сохранялось. В спектре поглощения растворенного сине-зеленого белка РЦ I(L177)H отмечались полосы поглощения с максимумами при 804 нм и 601 нм, характерные для поглощения БХл в белке. При pH 2 наблюдался коротковолновый сдвиг максимумов обеих полос поглощения до 772 и 540 нм, отражающий превращение БХл в БФео. Путем сравнения амплитуд Qx полос в спектре мутантного РЦ до и после экстрагирования пигментов было количественно определено, что в РЦ I(L177)H одна молекула БХл прочно связана с белком.

Рисунок 8. Спектры поглощения РЦ дикого типа (пунктирная линия) и 1(]_177)Н (сплошная линия), измеренные при 10 К. На вставке область 550-700 нм и полоса Ох БХл.

На рисунке 9 показан результат электрофореза РЦ в 18% ПААГ в денатурирующих условиях в присутствии 6М мочевины и 0.1% ДСН. Основные пигменты РЦ (каротиноид, БФео, феофитинизированный БХл) двигались в геле отдельно от белковых субъединиц и были видны до окрашивания геля как коричневая полоса на уровне 5 кДа. В образце РЦ 1(Ы77)Н наблюдалась дополнительная полоса, окрашенная в зеленый цвет, которая двигалась на уровне Ь-субъединицы РЦ. Согласно спектру поглощения пигмента, измеренному в геле, эта полоса принадлежит БХл (левый верхний спектр), причем в денатурирующих условиях электрофореза лигандирование этого БХл сохранялось. С

803

400 500 600 700 800 900 1 000

Длина волны, нм

помощью ДСН ПААГ было показано, что 1) один из БХл в РЦ 1(1Л77)Н связан с ]_-субъединицей ковалентной связью; 2) наблюдается усиление координирования атома М§2+ этого БХл.

SOS PAGE 10-15% kDa До окрашивания после окрашивания

fC

(v.

VJ ос

% I

% S

<-J CL

•О CL

H M L

Рисунок 9. Электрофорез РЦ в 18% ПААГ в присутствии 6М мочевины и 0.1% ДСН до и после окрашивания кумасси. Спектры поглощения пигментов (показаны слева) измерялись без выделения образцов из геля.

В Qx области спектра поглощения РЦ 1(L177)H (Рис. 8) отмечалось уменьшение амплитуды полосы при 597 нм и исчезновение плеча с максимумом при 605 нм, а также появление новой широкой полосы с максимумом при 638 нм. Известно, что длинноволновый сдвиг Qx полосы поглощения БХл свидетельствует о повышении степени координированное™ атома Mg2+. Место мутации I(L177)H находится вблизи двух БХл, Ра и Вв. Для выяснения, какой из БХл в результате мутации стал 6-координирован и для установления взаимосвязи этого явления с обнаруженной ковалентной связью БХл -белок, были получены мугантные РЦ с двойными аминокислотными замещениями, одно из которых - I(L177)H. Целью второго замещения была замена гистидинового лиганда БХл РА (His L173) или БХл Вв (His Ml82) на лейцин, что обычно приводит к превращению БХл в БФео.

Показано, что ни в одном РЦ с двойными мутациями превращения бактериохлорофиллов РА или Вв в БФео не происходят (Рис. 10 А и Б). Пигментный анализ РЦ выявил, что в I(L177)H+H(L173)L исчезает ковалентная связь БХл РА с белком, но сохраняется лигандирование этого БХл. В РЦ 1(L177)H+H(M182)L остается ковалентная связь БХл с белком, и БХл в сайте Вв также сохраняется не смотря на то, что лейцин не способен выполнять роль лиганда. В спектре поглощения этого РЦ исчезает полоса 638 нм, указывающая на 6-координирование БХл (Рис. 10Б). Эти данные свидетельствуют о том, что замещение I(L177)H повышает степень координированности

19

атома магния БХл Вв. Таким образом, одиночное замещение 1(Ь177)Н повлияло на лигандирование сразу двух ближайших к месту мутации бактерохлорофиллов, Рд и Вв, приведя к 6-координированию последнего.

Рисунок 10. Спектры поглощения РЦ дикого типа (1) и мутантных РЦ I(L177)H (2), I(L177)H+H(L173)L (3), H(M182)L+I(L177)H (4), измеренные при 90 К (А). На рисунке Б справа показана полоса Qx БХл. На вставке - вторая производная спектров.

Пространственная структура РЦ I(L177)H

Были получены кристаллы РЦ дикого типа и мутантного РЦ 1(L177)H и методом рентгеноструктурного анализа расшифрована пространственная структура этих комплексов с разрешением 2.5 А (Рис. 11). Определение структуры РЦ проводилось А.Г. Габдулхаковым в Институте Белка РАН. В качестве модели для сравнения были использованы координаты атомов кристаллической структуры РЦ F(M197)R (PDB ID 1E6D). Показано, что в структуре РЦ I(L177)H имидазольная группа His L177 направлена в сторону БХл Вв и приближена к метальной группе первого кольца БХл Рд на 2.0+0.27 А. Обнаружена электронная плотность с p-стороны макроцикла БХл Вв, в которую может быть вписана небольшая молекула (например - молекула воды).

На основе полученной структуры РЦ I(L177)H была построена модель пигмент-белковых взаимодействий вблизи БХл Рд и Вв (Рис. 12). Согласно этой модели молекула воды с p-стороны макроцикла Вв участвует в образовании шестой координационной связи с атомом магния этого БХл. Таким образом, структурные данные согласуются со спектральными данными и подтверждают, что БХл Вв в РЦ I(L177)H 6-координирован.

Предложенная модель предусматривает также, что молекула воды связана водородной связью с имидазолом Шз-1_177, поскольку для закрепления полярной воды в гидрофобном окружении мембранного белка необходимо образование более одной устойчивой связи с соседними молекулами.

Рисунок 11. Структура мутантного РЦ 1(1Л77)Н с разрешением 2.5 А.

Из модели также следует, что ЫЕ2 атом азота имидазольной группы Н1в-1Л77 участвует в координировании атома магния БХл Вв, а N01 атом азота имидазола располагается на расстоянии 2.0 А от С2-метильной группы БХл РА и, по-видимому, участвует в ковалентном связывании с этой группой. Известно, что длина химической связи близка к Вандерваальсову радиусу атома, и для связи С-Ы составляет 1.4-1.5 А. Однако необходимо учитывать, что определение структуры мутантного РЦ проводилось методом молекулярного замещения с использованием атомных координат РЦ с известной структурой, не имеющего мутации в сайте 1.177. В связи с этим ожидаемый уровень ошибки структуры вблизи места мутации, по-видимому, в несколько раз больше, чем общий уровень ошибки при данном разрешении.

ТИг-1_178

Рисунок 12. Модель пигмент-белковых взаимодействий в РЦ 1(1_177)Н, построенная на основе структуры комплекса с разрешением 2.5 А. Цифрами показаны расстояния между атомами.

Предполагаемая природа ковалентной связи БХл РА и Ь-субъединицы в РЦ 1(1Л77)Н

Подтверждением потенциальной реакционной способности С2-метильной группы БХл (Хл) может служить тот факт, что в структуре недавно открытого хлорофилла / вместо С2-метильной группы присутствует С2-формильная. Известно также, что среди флавин-содержащих белков широко распространены гистидил-флавины, в которых С8-метильная группа изоаллоксазинового гетероцикла флавина ковалентно связана с атомом азота имидазольного цикла гистидинового остатка. Автор благодарен к.ф-м.н. Марии Григорьевне Хреновой, сотруднице химического факультета МГУ, за подсказанную мысль, что природа ковалентной связи в гистидил-флавинах и в РЦ 1(Т177)Н может быть сходна. В том и в другом случае в реакцию вступают азот имидазола гистидина и метильная группа, связанная с сопряженной л-системой. По аналогии с гистидил-флавинами можно предположить, что в результате мутации в РЦ 1(1Л77)Н образуется гистидил-БХл (Рис. 13).

0

1

С2Н,3

Рисунок 13. Схема образования гистидил-БХл в РЦ I(L177)H. Плоскость макроцикла БХл Вв расположена перпендикулярно взгляду, показана как отрезок с атомом Mg2+ в центре.

Предполагаемая реакция:

His L177-H + Н3С- BChl РА + 02 = His 1Л77--Н2С-БХл + Н20.

Эта химическая реакция предполагает участие молекулярного кислорода. Данное условие выполнялось в наших экспериментах, поскольку мутантные РЦ выращивались полуаэробно в темноте. По-видимому, как и в флавин-содержащих белках, в РЦ I(L177)H имеет место автокаталитический процесс образования ковалентной связи пигмент-белок.

Замена и смешение гистидиновых лнгандов бактериохлорофиллов димера Р

В РЦ пурпурных бактерий координирование атома бактериохдорофиллов со стороны белка осуществляется через остаток гистидина. При замещении гистидинового лиганда любого из БХл специальной пары на лейцин в сайте связывания этого БХл обнаруживается БФео. В РЦ Н(Ь173)Ь первичный донор электрона представлен гетеродимером БХл:БФео. В спектре поглощения этого РЦ наблюдается значительное снижение максимума полосы Оу Р при 865 нм и уменьшение поглощения в Ох области поглощения БХл. Окислительно-восстановительные свойства БХл и Бфео различаются, поэтому Ет Р/Р+ гетеродимерной спецпары в РЦ ИЬа ,чр1тегоа1е$ на 140-160 мэВ более положителен, чем потенциал гомодимера Р. Показано, что в присутствии мутации 1Л77 образования гетеродимера в РЦ 1(Ы77)Н+Н(Ь173)Ь не происходит, и специальная пара остается гомодимером БХл. В РЦ этого двойного мутанта состав пигментов и величина среднеточечного потенциала Р/Р+ такие же, как в РЦ дикого типа. Однако спектральные свойства мутантного РЦ изменяются существенно. В спектре РЦ 1([.177)ПН1(Ы73)[. полоса У у Р представлена плечом на длинноволновом склоне полосы при 804 нм (Рисунок 10, спектр 3). Максимум этой полосы С^у Р, определенный с помощью второй производной спектра, находится при 842 нм. Сдвиг полосы Оу Р в коротковолновую область на 46 нм не имеет аналогов среди изученных бактериальных мутантных РЦ и указывает на структурные изменения в молекуле димера БХл. В области (Эх-переходов изменений не обнаружено, что согласуется с остальными результатами и указывает на то, что состав пигментов в этом мутантном РЦ не изменился. По данным фемтосекундной спектроскопии время жизни состояния Р* в РЦ 1(1Л77)Н+Н(1Л73)1. увеличилось вдвое, а квантовый выход разделения зарядов Р+НА" снизился на 10 % по сравнению с аналогичными показателями для РЦ дикого типа. Таким образом, структурные изменения в димере БХл повлияли также и на функциональную активность комплекса.

Анализ полученных результатов и литературных данных позволил предположить, что наиболее вероятным лигандом атома Mg2+ БХл РА в РЦ 1(Ы77)Н+Н(Ы73)1. является остаток 1113-1.177. В структуре РЦ 1(1Л77)Н, полученной с разрешением 2.5 А, имидазольная группа Шя-[.177 направлена в сторону от центра БХл РА (Рис. 14 А). На основе этой структуры была предложена модель пигмент-белковых взаимодействий, согласно которой в РЦ 1(Ы77)Н+Н(Ь173)Ь происходит переориентация имидазольной группы Шэ-1Л77 в сторону центрального атома Mg2+ БХл РА (Рис. 14 Б). В пользу этого предположения свидетельствуют следующие экспериментальные данные: в отличие от РЦ 1(1.177)11 дипольная сила полосы С>у Р, а также величина Еш Р/Р+ в РЦ двойного мутанта восстанавливаются до величин, характерных для РЦ дикого типа. Кроме того, ковалентная связь БХл РА с Ь-субъедшпщей, обнаруженная в РЦ 1(1Л77)Н, исчезает в РЦ 1(1.177)11+11(1.173)1.. Согласно модели, расстояние от атома азота имидазола до атома Mg2+ БХл РА составляет 3.29 А, что превышает расстояния, типичные для координационных связей в бактериальных РЦ (2.3-2.6 А). Однако существенный коротковолновый сдвиг полосы СЬ" Р указывает на вероятность смещения плоскостей макроциклов специальной пары относительно друт друга, что может способствовать оптимизации расстояния от азота имидазола Н15-1Л77 до атома Mg2+ БХл РА. В модели структуры РЦ 1(Ь177)Н+Н(Ы73)Ь (Рис. 14 Б) имидазольная группа располагается под острым углом к плоскости макроцикла, что считается неоптимальным для лнгандов в

бактериальных РЦ. Однако в литературе описаны примеры подобных случаев расположения лигандов в РЦ с мутациями, приводившими к встраиванию БХл в сайт связывания БФео На-

Н|'1173 1-6111173

Рисунок 14. Фрагмент структуры РЦ 1(Ь177)Н с разрешением 2.5 А (А) и моделирование ориентации гистидина 1.177 в РЦ с двойными замещениями 1(Ы77)Н+Н(1Л73)Ь (Б).

Со стороны БХл Рв было сделано аналогичное двойное замещение в симметричных позициях - 1(М206)Н+Н(М202)Ь и показано, что в РЦ 1(М206)Н+Н(М202)Ь, так же как и в РЦ 1(1Л77)Н+Н(1_173)Ц сохраняется лигандирование БХл специальной пары Рв- В спектре поглощения РЦ этого двойного мутанта наблюдается коротковолновый сдвиг максимума полосы Р на 23 нм, - не такой значительный, как в случае с РЦ 1(1Л77)Н+Н(Ы73)Ь (46 нм). В РЦ 1(М206)Н+Н(М202)Ь роль лиганда БХл Рв, по-видимому, выполняет гисгидин М206. Возможно, посредником в этом взаимодействии выступает молекула воды. Таким образом, с обеих сторон специальной пары Р допустимо перемещение лигандов БХл на один виток а-спирали, что существенно влияет на спектральные свойства первичного донора электрона, и по-видимому, приводит к изменению взаимодействий между молекулами БХл димера. Заметим, что одновременное внесение четырех аминокислотных замещений 1(1Л77)Н+НДЛ73)Ь и 1(М206)Н+Н(М202)Ь дестабилизирует РЦ настолько, что его не удается выделить из мембран даже с помощью афинной хроматографии на №-Ь1ТА агарозе.

Выяснение причин разных последствий одинаковых симметричных мутаций

Как упоминалось выше, аминокислотное замещение изолейцина на гистидин вблизи димера БХл в двух симметричных позициях - М206 и 1.177, по-разному влияет на свойства и стабильность РЦ. Мутация 1(Ы77)Н приводит к появлению ковапентной связи БХл РА с Ь-субъединицей, а также к 6-координированию БХл Вв, в то время как в РЦ 1(М206)Н подобных изменений пигмент-белковых взаимодействий обнаружено не было. Снижение стабильности РЦ было более выражено в случае РЦ 1(М206)Н, и удельный выход этих РЦ при очистке из мембран был на порядок ниже, чем выход РЦ 1(Ы77)Н. Известно, что высококонсервативные аминокислотные последовательности трансмембранных а-спиралей Ь- и М- субъединиц по обе стороны молекулы Р имеют

низкую степень гомологии. Для повышения сходства белкового окружения БХл Рв и Ва с окружением молекул Ра и Вв были проведены аминокислотные замены в коротком, М203-М206, и более протяженном, М203-М212, участках трансмембранной а-спирали М-субъединицы на симметричные им участки Ь-субъединицы из РЦ 1(И77)Н. Показано, эти замещения не приводили в воспроизведению пигмент-белковых взаимодействий, обнаруженных в РЦ 1(1Л77)Н. Напротив, наблюдалась последовательная дестабилизация мутантных РЦ и нарушение их сборки в мембране. Причина разных последствий одинаковых замещений в симметричных положениях М206 и 1_177 в РЦ ЯЬа. sphaeroid.es может быть связана с наличием вблизи БХл ВА сайта связывания гликолипида. Считается, что гликолипид создает гидрофобное окружение для БХл Вд, а также стабилизирует структуру РЦ в участке соединения двух субъединиц. В структуре РЦ 1(И77)Н в сайте связывания гликолипида обнаружена молекула ЛДАО (Рис. 15), что случается при утере поверхностных липидов во время очистки комплексов. Внесение полярного остатка Н15-М206, вероятно, препятствует связыванию гликолипида и, как следствие, дестабилизирует РЦ.

Рисунок 15. Структура РЦ 1(1Л77)Н вблизи молекул бактериохлорофиллов, разрешение 2.9 А (РОВ Ш 1Е60).

ГЛАВА 6 посвящена исследованию особенностей лигандирования мономерных бактериохлорофиллов Вд и Вв. Мономерные БХл Вд и Вв располагаются в РЦ симметрично друг другу, но их роли в функционировании комплекса различны. БХл Вд -первичный акцептор электрона от Р*. БХл Вв - посредник при переносе энергии триплетных состояний от первичного донора электрона на каротиноид. Свойства мономерных БХл, как и БХл димера, в значительной степени определяются их белковым

окружением. При замене HÍS-M182, лигаида БХл Вв, на Leu, в сайте связывания этого БХл появляется БФео Фц.

Перенос лиганда БХл Ввс a-стороны макроцикла на ß-сторону

В РЦ I(L177)H одиночная мутация привела к 6-координированию БХл Вв (Глава 5). С целью изучения влиянии замещения I(L177)H на свойства Вв был получен РЦ H(M182)L+ I(L177)H. В спектре поглощения РЦ H(M182)L+I(L177)H, измеренном при 90 К, амплитуда полосы Qy Р при 888 нм снижается в 2,8 раза по сравнению с аналогичной полосой в спектре РЦ дикого типа (Рис. 10, спектр 4). Наблюдается расщепление полосы Qy В на две полосы с максимумами при 805 и 819 нм. В области Qx-переходов БХл на коротковолновой стороне полосы при 698 нм появляется новое плечо с максимумом при 590 нм. Полоса при 638 нм, появляющаяся в спектре РЦ I(L177)H и характерная для 6-координированного БХл Вв, в спектре РЦ двойного мутанта исчезает. Появления новых полос поглощения БФео в спектре мутантного РЦ H(M182)L+I(L177)H не обнаружено. Пигментный анализ показал, что соотношение БХл:БФео в ацетон-метанольном экстракте из РЦ H(M182)L+I(L177)H составляет 1,5±0,1. Осадок белка после экстрагирования пигментов остается окрашенным в сине-зеленый цвет, и в спектре поглощения этого осадка наблюдаются полосы при 601 нм и 804 нм, характерные для БХл, ассоциированного с белком.

Полученные данные свидетельствуют о том, что, как и в РЦ I(L177)H, в РЦ H(M182)L+i(L177)H происходит ковалентное связывание БХл РА с L-субъединицей. Таким образом, в присутствии замещения I(L177)H мутация H(M182)L не приводит к появлению БФео Фв в белковом сайте связывания Вв. Лигандирование БХл в РЦ H(M182)L+I(L177)H сохраняется и осуществляется с ß-стороны через молекулу воды, о чем свидетельствует структура РЦ I(L177)H, полученная с разрешением 2.5 А. Новая молекула воды, появившаяся с ß-стороны макроцикла БХл Вв, по-видимому, не только образует координационную связь с атомом Mg2+ БХл Вв, но также связана водородной связью с остатком гистидина L177 (Рис. 12). Таким образом, показано, что степень координированное™ атома Mg2+ БХл Вв и сторона расположения лиганда этого БХл в бактериальном РЦ могут быть изменены без значительного влияния на фотохимическую активность комплекса.

Замещение гистидинового лиганда БХл Вд на цистеин, метиоиин, лейцин и тирозин

Гистидин LI53 является природным лигандом БХл Вд. Были получены четыре мутантных штамма Rba. sphaeroides с аминокислотными заменами гистидина LI53 РЦ на цистеин, метионин, лейцин и тирозин. Из клеток мутантных штаммов Rba. sphaeroides H(L153)C и H(L153)M были выделены стабильные реакционные центры и показано, что появление метионина или цистеина на месте гистидина LI53 не оказывает существенного влияния на спектральные свойства и фотохимическую активность РЦ. РЦ с аминокислотными замещениями H(L153)L и H(L153)Y отличались повышенной чувствительностью к присутствию детергентов, поэтому их свойства изучали в составе безантенных хроматофоров, в которых РЦ был единственным БХл-содержащим фотосинтетическим комплексом. Показано, что РЦ H(L153)L и H(L153)Y обладают фотохимической активностью. Активность РЦ H(L153)L была сравнима с таковой РЦ дикого типа, и это позволило предположить, что при замещении гистидина LI53 на

лейцин пигментный состав РЦ Н(1Л53)Ь ДЬа. зркаего1ие5 не меняется. Спектральная гетерогенность РЦ Н(1Л53)Ь в составе мембран не позволила детально исследовать их свойства. В низкотемпературном спектре поглощения связанного с мембранами РЦ Н(Ы53)У (Рис. 16) наблюдался коротковолновый сдвиг полосы поглощения первичного донора электрона от 891 нм до 866 нм. Полоса В сдвигалась в длинноволновую область до 812 нм и значительно уменьшалась по амплитуде. Вторые производные спектров поглощения хроматофоров указывали на то, что поглощение мономерного БХл Вд в спектре мутанта Н(1Л53)У полностью отсутствует (Рис. 16 Б).

При объединении мутации Н(Ь153)У с замещением Н(М182)Ь, в результате которого БХл Вв замещался на БФео, был получен РЦ Н(1Л53)У+Н(М182)Ь. В спектре поглощения мембрансвязанных РЦ Н(Ы53)У+Н(М182)Ь (Рис. 16 В) в области поглощения мономерных БХл вблизи 800 нм максимумы поглощения отсутствовали, но появлялась новая полоса поглощения с максимумом при 785 нм, принадлежащая молекуле БФео Фв неактивной цепи кофакторов. Отсутствие полосы Цу В в длинноволновой области спектра поглощения РЦ Н(Ы53)У+Н(М182)Ь подтверждает, что РЦ Н(Ы53)У не содержит БХл Вд. В РЦ Н(1Л53)У+Н(М182)Ь наблюдался перенос электрона с Р* в неактивную В-цепь на Фв и полное блокирование переноса электрона по А-цепи.

600 700 800 900 1000

756 812

Длина волны, нм

Рисунок 16. Спектры поглощения безантенных хроматофоров (/) дикого типа (А), мутантов Н(1Л53)У (Б) и Н(Ы53)У+Н(М182)Ь (В), измеренные при 90 К, и вторые производные спектров поглощения (*50) (2).

Таким образом, в реакционных центрах H(L153)Y молекула БХл В а не встраивается в структуру мутантных реакционных центров. Заслуживает внимания тот факт, что мутантные РЦ H(L153)Y, лишенные первичного акцептора электрона от Р*, БХл Вд, сохраняют способность к разделению зарядов на свету, хотя и значительно менее эффективному, чем РЦ дикого типа.

В заключении сформулирован общий итог работы, определяющий ее место в общемировых исследованиях по данной тематике. В фотосинтетических реакционных центрах бактерий и эукариот осуществляется важнейший этап фотосинтеза - первичное преобразование световой энергии в энергию разделенных зарядов с квантовой эффективностью, близкой к 100%. Такая высокая квантовая эффективность достигается благодаря тонкой регулировке свойств кофакторов переноса электрона через их взаимодействия с окружающим белком. РЦ Rba. sphaeroides состоит их трех субъединиц и десяти кофакторов, образующих две цепи переноса электрона - активную и неактивную. Взаимодействия первичного донора электрона, димера БХл, и ближайшего акцептора электрона, мономерного БХл ВА, с окружающими их аминокислотными остатками определяют такие важные параметры для первичного фотопереноса электрона как величина Ет Р/Р+, уровни свободной энергии состояний Р* и Р+ВА" , экситонные взаимодействия внутри димера БХл, квантовый выход разделения заряда, стабильность РЦ. Использование спектральных методов в сочетании с молекулярно-биологическими и биохимическими подходами, а также с анализом структуры РЦ, дает возможность получения информации о механизмах и взаимодействиях, обеспечивающих высокую эффективность функционирования РЦ. В представленной работе была сконструирована серия плазмид для направленного мутагенеза РЦ Rba. sphaeroides и экспрессии мутантных комплексов in vivo. Использованный фрагмент ДНК, содержащий puf-оперон Rba. sphaeroides RV, отличается от двух ранее опубликованных аналогов небольшим размером и большим количеством уникальных сайтов рестрикции дня манипулирования ДНК. На основе системы для направленного мутагенеза было получено более пятнадцати мутантных штаммов Rba. sphaeroides с замещениями в L- и М-субъединицах реакционного центра вблизи всех четырех молекул БХл. Известно, что в бактериальных фотосинтетических РЦ атомы Mg2+ бактериохлорофиллов всегда 5-координированы, а лигандами для БХл всегда служат остатки гистидинов, расположенные перпендикулярно плоскости макроцикла с его а—стороны. С помощью мутантных РЦ было показано, что это правило не является строгим. Впервые продемонстрирована возможность переноса гистидиновых лигандов БХл Ра и Рв на один виток белковой а-спирапи, что предполагает их расположение под острым углом к плоскостям макроциклов димера БХл. На примере БХл Ва было показано, что наряду с гистидином остатки метионина и цистеина также могут координировать атом Mg2+ БХл, и фотохимическая активность РЦ при этом остается на высоком уровне. Впервые показано, что одиночное замещение I(L177)H приводит к 6-координированию БХл Вв, а двойное замещение H(M182)L+ I(L177)H - к р-лигандированию этого БХл. Показано, что, несмотря на относительную стабильность и пластичность бактериальных РЦ, в структуре этого комплекса существуют «тонкие места», чувствительные к генетическим модификациям. Например, замещение 1(М206)Н, в отличие от такого же симметричного замещения I(L177)H, приводит к значительному

снижению удельного выхода этого РЦ при очистке, по-видимому, связанному с нарушением его сборки в мембране. Анализ пространственной структуры РЦ позволил предположить, что внесение His М206 нарушает ионные взаимодействия полярной части гликолипида с поверхностью комплекса вблизи места мутации. Также показано, что у трех БХл из четырех можно замеспгть гистидиновый лиганд на остаток лейцина, что приводит к появлению БФео в сайтах связывания БХл. Однако в случае БХл ВА такая замена приводит к дестабилизации РЦ даже в составе мембран, что, очевидно, связано с нарушением системы водородных связей гистидинового лиганда с соседними аминокислотными остатками. Замена гистидинового лиганда БХл Ва на тирозин приводит к тому, что этот хромофор не встраивается в структуру комплекса, и перенос электрона по активной цепи кофакторов блокируется на -90%. Исследование участков РЦ, критичных для стабильного функционирования комплекса, важно для практических задач использования РЦ при конструировании искусственных сенсорных или энергозапасающих систем.

В данной работе впервые показано, что одиночное аминокислотное замещение I(L177)H приводит к появлению нетипичной, ковалентной, связи БХл с белком, а также влияет на координирование атомов магния сразу двух БХл - Рд и Вв. Пространственная структура РЦ I(L177)H, полученная с разрешением 2.5 А показала, что вблизи места мутации появляется цепь новых взаимодействий, соединяющая эти два бактериохлорофилла. Эта цепь состоит из б-й координационной связи атома Mg2+ БХл Вв с молекулой воды с p-стороны макроцикла, из водородной связи этой воды с NE2 атомом азота имидазольной группы His L177 и ковалентной связи между ND1 атомом азота имидазола и С2-метильной группой первого пиррольного кольца БХл Рд (Рис. 12). Предполагается, что p-координирование БХл Вв является предпосылкой для образование ковалентной связи БХл РА с белком, что подтверждается присутствием этой связи не только в РЦ I(L177)H, но также в РЦ I(L177)H+H(M182)L. Известно, что имидазол в нейтральном состоянии характеризуется значительным дипольным моментом, наибольшим среди полярных групп аминокислот. Очевидно, вовлечение ND1 атома азота в координационную связь с атомом Mg2+ БХл Вв через воду смещает электронную плотность в имидазольном кольце, повышая его реакционноспособность. По аналогии с гистидил-флавинами, предложена реакция образования ковалентной связи пигмент-белок, предполагающая участие молекулы кислорода.

В данной работе сконструирован новый экспрессионный вектор на основе сильного и хорошо регулируемого рн/-промотора из Rba. sphaeroides. Вектор протестирован на примере экспрессии гена люциферазы в периодической и проточной культуре. При непрерывном культивировании время гетерологической экспрессии может быть значительно увеличено, что обеспечит возможность наращивания объема экспрессируемого продукта. Полученный экспрессионный вектор может послужить основой для дальнейшего создания рекомбинантных фототрофных микроорганизмов -продуцентов практически полезных соединений.

В настоящее время активно развивается молекулярная биоэлектроника, ведутся исследования, направленные на создание наноразмерных структур с использованием электрон-проводящих пептидов и фотосенсорных мембранных белков. В связи с этим представляется необходимым дальнейшее исследование механизмов первичного

разделения зарядов в фотосинтетических РЦ бактерий и растений и изучение факторов, определяющих высокую эффективность данного процесса.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1) Определена последовательность ДНК puf- оперона из пурпурной бактерии Rba. sphaeroides RV, проведен ее анализ в сравнении с /ш/-оперонами других известных штаммов. Сконструирована серия плазмидных векторов для мутагенеза реакционного цетра и светособирающей антенны ССК1 пурпурной бактерии Rba. sphaeroides и дальнейшей экспрессии мутантных комплексов in vivo.

2) Путем сочетания различных родительских штаммов Rba. sphaeroides и плазмид для комплементации получены рекомбинантные штаммы со следующими фенотипами: РЦ+ССК1+ССК2\ РЦ+ССК1+ССК2", РЦ+ССК1'ССК2'. Рекомбииантный штамм, в хроматофорах которого реакционный центр является единственным БХл-содержащим комплексом, позволяет изучать нестабильные мутантные комплексы без их выделения из мембран.

3) Сконструирован новый экспрессионный вектор на основе сильного, хорошо регулируемого ры/-промотора для гетерологической экспрессии генов в пурпурных бактериях. Исследована эффективность экспрессии гена люциферазы в периодических и непрерывных условиях культивирования. Показано, что при непрерывном культивировании рекомбинантного штамма в фотогетеротрофных условиях экспрессия люциферазы не ограничена по времени, что дает возможность многократно увеличить выход продукта экспрессии.

4) Получено более 15 мутантных реакционных центров Rba. sphaeroides с одиночными, двойными и более протяженными направленными аминокислотными замещениями вблизи сайтов связывания молекул бактериохлорофиллов Ра, Рв, Ва и Вв.

5) Показано, что закономерности координирования атома Mg2+ БХл в бактериальных реакционных центрах не являются строгими. Гистидины, лигандирующие бактериохлорофиллы димера P, могут быть перемещены на один виток белковой спирали. Такое перемещение лигандов приводит к коротковолновому сдвигу полосы Qy Р на 46 нм в РЦ H(L 173)L+I(L 177)Н и на 24 нм в РЦ H(M202)L+I(M206)H, что свидетельствует о значительном изменении экситонного взаимодействия между бактериохлорофиллами димера Р.

6) Показано, что одиночное аминокислотное замещение изолейцина L177 на гистидин приводит к 6-координированию БХл Вв и образованию ковалентной связи между БХл Ра и L-субъединицей РЦ. Аналогичное замещение в симметричной позиции М206, напротив, дестабилизирует РЦ и снижает его удельный выход при очистке, что, по-видимому, объясняется нарушением связывания гликолипида на поверхности РЦ вблизи места мутации.

7) Кристаллическая структура РЦ I(L177)H, полученная с разрешением 2.5 А, свидетельствует о появлении молекулы воды с [i-стороны БХл Вв, которая, очевидно, служит шестым лигандом атома Mg2+ этой молекулы. Полученная структура предполагает образование новых координационной, водородной и ковалентной связей, соединяющих БХл Вв и БХл РА через молекулу воды и остаток гистидина L177.

8) Объединенные электронные плотности имидазольной группы гистидина L177 и метальной группы первого пиррольного кольца БХл Рд свидетельствуют о вовлеченности этих групп в ковалентную связь в РЦ I(L177)H. Предполагается, что новое химическое взаимодействие между БХл и белком происходит по механизму, показанному ранее для флавин-содержащих белков, и требующему присутствия кислорода.

9) Показано, что путем внесения аминокислотных замещений в белковое окружение мономерного БХл Вв можно заменить БХл на БФео в РЦ H(M182)L, переместить лиганд БХл Вв с a-стороны макроцикла на ß-сторону в РЦ I(L177)H+H(M182)L, создать шестую координационную связь с атомом Mg2+ в РЦ I(L177)H.

10) Модификация белкового окружения мономерного БХл Вд дает возможность замены гистидинового лиганда на цистеин или метионин без потери фотохимической активности РЦ. Замещение лиганда БХл Вд на лейцин приводит к значительной дестабилизации РЦ H(L153)L, но не к замене БХл на БФео. После замены гистидина L153 на тирозин бактериохлорофилл Вд не встраивается в РЦ H(L153)Y. Это приводит к снижению квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами P+Qa" до 7%.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи в рецензируемых научных журналах:

1. Vasilyeva L., Miyake М., Nakamura С., Nakada Е., Tsygankov A., Asada Y., Miyake J. (1999) Expression of luciferase gene under control of the p«/-promoter from Rhodobacter sphaeroides. Applied Biochem. Biotechnol., 77-79, 337-345.

2. Васильева Л.Г., Болгарина Т.И., Хатыпов P.A., Шкуропатов А.Я., Мияке Д., Шувалов В.А. (2001) Замещение валина - 157 на тирозин в L-субъединице реакционного центра Rhodobacter sphaeroides. ДАН, 376, 826-829.

3. Yakovlev A.G., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya., Bolgarina T.I., Shkuropatova V.

A. and Shuvalov V.A. (2003) Mechanism of charge separation and stabilization of separated charges in reaction centers of Chloroflexus aurantiacus and of YM210W(L) mutants of Rhodobacter sphaeroides excited by 20 fs pulses at 90 K. J. Phys. Chem. A, 107, 8330-8338.

4. Болгарина Т.И., Хатыпов P.A., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А.

(2004) Замещение изолейцина М206 на гистидин в реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides приводит к изменению структуры молекулы бактериохлорофилла специальной пары,ДАН, 394, 2, 1-4.

5. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Болгарина Т.И., Шкуропатова

B.А., Долгова Т.А., Шувалов В.А. (2004) Механизм разделения зарядов и их стабилизации в бактериальных реакционных центрах, Биофизика, 49, 199-211.

6. Yakovlev A.G., Jones M.R., Potter J.A., Fyfe P.K., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya., and Shuvalov V.A. (2005) Primary charge separation between P and BA: electron-transfer pathways in native and mutant GM203L bacterial reaction centers. Chem. Phys. 319 (1-3), 297307.

7. Хатыпов P.A., Васильева Л.Г., Фуфина Т.Ю., Болгарина Т.И., Шувалов В.А.

(2005) Влияние замещения изолейцина LI77 на гистидин на пигментный состав и

свойства реакционных центров пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 70, 11, 1527-1533.

8. Yakovlev A G., Shkuropatova T.A., Vasilieva L.G., Shkuropatov A.Ya., Gast P., and Shuvalov V.A. (2006) Vibrational coherence in bacterial reaction centers with genetically modified B-branch pigment composition. BBA, 1757, 5-6, 369-379.

9. Fufina T.Y., Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2007) Substitution of isoleucine L177 by histidine in Rhodobacter sphaeroides reaction center results in the covalent binding of Pa bacteriochlorophyll to the L subunit. FEBS Lett., 581, 30, 5769-5773.

10. Хатыпов Р.А., Хмельницкий А.Ю., Леонова M M., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. (2008) Первичные процессы разделения зарядов в реакционных центрах мутантов L153HY и L153HY+M182HL Rhodobacter sphaeroides. ДАН, 422, 6, 835.

11. Леонова М.М., Васильева Л.Г., Хатыпов Р.А., Бойченко В.А., Шувалов В.А. (2009) Свойства мутантных реакционных центров Rhodobacter sphaeroides с аминокислотными замещениями гистидина L153, лигандирующего центральный магний бактериохлорофилла ВА. Биохимия, 74 (4), 558-567.

12. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Шувалов В.А. (2009) Первичные процессы разделения зарядов в реакционных центрах мутантов YM210L/FM197Y и YM210L Rhodobacter sphaeroides. Биохимия, 74(11), 1479-1487.

13. Фуфина Т.Ю., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. (2010) Исследование стабильности мутантного фотосинтетического реакционного центра Rba. sphaeroides I(L177)H и определение местоположения бактериохлорофилла, ковалентно связанного с белком. Биохимия, 75 (2), 256-264.

14. Яковлев А.Г., Васильева Л.Г., Шкуропатов А.Я., Хмельницкая Т.И., Шкуропатова В.А., Шувалов В.А. (2010) Первичный перенос электрона в реакционных центрах мутантов YM210L и YM210L/HL168L Rhodobacter sphaeroides. Биохимия,75, 944953.

15. Khatypov R.A., Khmelnitskiy A.Yu., Khristin A.M., Fufina T.Yu., Vasilieva L.G. and Shuvalov V.A. (2012) Primary charge separation within Р870* in WT and in heterodimer mutant in femtosecond time domain. BBA, 1817 (8), 1392-1398.

16. Vasilieva L.G., Fufina T.Y., Gabdulkhakov A G., Leonova M.M., Khatypov R.A., and Shuvalov V.A. (2012) The site-directed mutation I(L177)H in Rba. sphaeroides reaction center affects coordination of Pa and BB bacteriochlorophylls. BBA, 1817 (8), 1407-1417.

17. Васильева Л.Г., Фуфина Т.Ю., Габдулхаков А.Г., Шувалов В.А. (2015) Разные последствия одинаковых симметричных мутаций вблизи димера БХл в реакционном центре Rhodobacter sphaeroides, Биохимия, 80 (6), 767-764.

Обзоры:

18. Khatypov R.A., Khmelnitskiy A.Yu., Leonova M.M., Vasilieva L.G. and Shuvalov V.A. (2008) Primary light-energy conversion in tetrameric chlorophyll structure of photosystem II and bacterial reaction centers: I. A rewiew. Photosynth. Research, 98 (1-3), 81-94.

19. Леонова M.M., Фуфина Т.Ю., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. (2011) Структурно-функциональные исследования бактериальных фотосинтетических реакционных центров, Успехи биологической химии, 51, 193-232.

Главы в книгах и сборниках:

20. Shuvalov V.A., Yakovlev A.G., Vasilieva L.G. and Shkuropatov A.Ya. (2006) Primary charge separation between P700* and primary electron acceptor complex A-Ao: comparison with bacterial reaction centers, In Advances in Phot, and Respiration (Golbeck Ed.), Series: Photosystem I: light drived plastocyanine: Fd-oxydoreductase, Kluwer Acad. Publ., 24, 716.

21. Фуфина Т.Ю., Леонова M.M., Васильева Л.Г., Шувалов В.А. (2009) Роль направленного мутагенеза в исследовании бактериальных фотосинтетических реакционных центров, Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Принципы зеленой химии и органический синтез», Ярославль, с. 117-123.

22. Fufina T.Y., Vasilieva L.G., Khatypov R.A., Shuvalov V.A. (2013) Spectral properties of the Rhodobacter sphaeroides mutant photo-reaction center with double amino acid substitution I(L177)H+H(L173)L. In: Photosynthesis Research for Food, Fuel and the Future, Advanced Topics in Science and Technology in China, 46-49.

23. Yakovlev A G., Vasilieva L.G., Khmelnitskaya T.I., Shkuropatova V.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2013) Coherent electron transfer in reaction centers of YM210L and YM210L/HL168L mutants of Rba. sphaeroides. In: Photosynthesis Research for Food, Fuel and the Future, Advanced Topics in Science and Technology in China, 91-94.

24. Леонова M.M., Фуфина Т.Ю., Шувалов В.А., Васильева Л.Г. (2014) Исследование пигмент-белковых взаимодействий в фотосинтетическом реакционном центре пурпурных бактерий. Глава в кн.: Современные проблемы фотосинтеза. Том. 1 // Аллахвердиев С.И., Рубин А.Б., Шувалов В.А. (ред.), Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований, 157-196.

Тезисы докладов:

25. Vasilyeva L., Miyake М., Nakada Е., Asada Y., Miyake J. (1998) A novel expression vector based on puf promoter from Rhodobacter sphaeroides, Book of abstracts, Ann. Conference of Japanese Biotechnol. Society, Kyoto, Japan, 161.

26. Васильева Л.Г., Цыганков A.A., Шувалов В.А. (2001) Экспрессионный вектор для пурпурных бактерий на основе /«//-промотора из Rhodobacter sphaeroides, Сборн. Матер. Междун. научн. конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие», Пущино, 34.

27. Vasilyeva L.G., Bolgarina T.I., Khatypov R.A., Khmelnitsky A.Y., Voitcekh O.O., Shkuropatov A.Y., Shuvalov V.A. (2002) Site-directed mutagenesis of the reaction centre from Rhodobacter sphaeroides, XVII Pushchino Readings in Photosynthesis, Book of abstracts, 41.

28. Vasilyeva L. (2003) Genetic engineering of bacterial photosynthetic complexes with relation to photo-biotechnology, 6th International Marine Biotechnology Conference, Chiba, Japan, Book of abstracts, 15.

29. Vasilyeva L.G., Bolgarina T.I., Khatypov R.A., Shkuropatov A. Ya. and V.A. Shuvalov (2004) Effects of site-directed mutations in the vicinity of P and В on spectral and photochemical properties of the reaction centre from Rhodobacter sphaeroide, 29lh FEBS Congress, Warsaw, Poland, Book of abstracts, 61.

30. Васильева Л.Г., Хатыпов P.A., Фуфина Т.Ю., Болгарина Т.И., Шувалов В.А. (2005) Пигментный состав и свойства мутантных реакционных центров пурпурной бактерии

Rhodobacter sphaeroides с замещением I(L177)H, XVIII Путинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Тез. докладов, 11.

31. Vasilieva L. G., Fufina T.Y., Leonova М.М., Khatypov R. A., Shkuropatov A. Ya., Shuvalov V. A. (2006) Spectral properties of bacterial reaction centers with amino acid substitutions near P and В molecules, 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11Л FAOBMB Congress, Kyoto, Japan, 1P-A-302 abstract.

32. Vasilyeva L. G., Fufina T. Y., Leonova M.M., Khatypov R. A., Zabelin A.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V. A. (2006) Properties of bacterial reaction centers with amino acid substitutions near P and В molecules, 12111 International Symposium on Phototrophic Prokaryotes, Pau, France, Book of abstracts, 78.

33. Vasilieva L.G., Fufina T.Y., Khatypov R. A., Ivan I. Proskuryakov I. I., Zabelin A. A., Shkuropatov A. Ya., Shuvalov V. A. (2007) Properties of Rhodobacter sphaeroides mutant I(L177)H reaction center, 7th International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors in Photosynthetic Organisms, Kyoto, Japan, Book of abstracts, 93

34. Vasilieva L.G., Fufina T.Y., Khatypov R. A., Shuvalov V.A. (2008) Properties of Rhodobacter sphaeroides mutant I(L177)H reaction center, 5й съезд Российского фотобиологического сообщества и Международная конференция «Преобразование света при фотосинтезе», Пущино, Сборник тезисов, 46.

35. Vasilieva L.G., Fufina T.Y., Khatypov R.A., Shkuropatov A.Ya., Shuvalov V.A. (2008) Substitution of lie L177 by His in Rhodobacter sphaeroides reaction center results in the covalent binding of a BChl molecule to the L subunit, Gordon Reseach Conference on Photosynthesis, Mount Holyoke College, South Hadley, MA, USA.

36. Vasilieva L.G., Fufina T. Y„ Khatypov R. A., Shuvalov V.A. (2009) Properties of Rhodobacter sphaeroides mutant I(L177)H reaction center, XIII European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, Palermo, Italy, 193.

37. Vasilieva L.G., Fufina T.Y., Khatypov R. A., Shuvalov V. A. (2011) Properties of Rhodobacter sphaeroides mutant reaction centers with amino acid substitutions near bacteriochlorophylls, Book of abstracts of International Meeting "Photosynthesis Research for Sustainability", Baku, Azerbaijan, 56.

38. Васильева Л.Г., Фуфина Т.Ю., Леонова M.M., Хатыпов Р.А., Шувалов В.А. (2011) мутантные реакционные центры Rhodobacter sphaeroides с модифицированным белковым окружением бактериохлорофштлов, Сборник тезисов VI съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, Россия, 11.

39. Vasilieva L.G., Fufina T.Y., Gabdulkhakov A. G., Leonova M. M., Khatypov R. A., Shuvalov V. A. (2013) Site-directed mutation I(L177)H in Rba. sphaeroides reaction center results in covalent BChl-protein binding and affects coordination of two bacteriochlorophylls, Book of abstracts of International conference on Tetrapyrrole photoreceptors of photosynthetic organisms, Wuhan, China, 23.

40. Васильева Л.Г., Фуфина Ф.Ю., Леонова M.M., Габдулхаков А.Г., Хатыпов Р.А., Шувалов В.А. (2014) Исследование пигмент-белковых взаимодействий в бактериальном реакционном центре, Сборник тезисов VII съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, Россия, 13.

Подписано в печать:

19.08.2015

Заказ № 10898 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru