Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Построение сопряженной физической и генетической карты генома цианобактерии SYNECHOCYSTIS SP. РСС 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Построение сопряженной физической и генетической карты генома цианобактерии SYNECHOCYSTIS SP. РСС 6803"

1 ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ. Н.И.ВАВИЛОВА

\ V

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 575.1:599.9

НАЩОКИНА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

ПОСТРОЕНИЕ СОПРЯЖЕННОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ И ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КАРТЫ ГЕНОМА ЦИАНОБАКТЕРИИ ВтСНОСУБПБ БР. РСС 6803

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание

ученой степени кандидата биологических наук

Москиа - 1996

- г -

Работа выполнена в лаборатории анализа генома Института Общей Генетики РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИШЬ:

доктор биологических наук, профессор Янковский Н.К.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук. проф. А.А.Прозоров доктор биологических наук, проф. Ю.Д.Цыганков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт Молекулярной Генетики РАН

Защита состоится" и« 1996 г. в_часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д002.49.01 при Институте Общей Генетики им Н.И. Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан" ^ " Д996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

ПОЛУХИНА Г.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Цианобактерии являются группой прокариот. , в которых процесс фотосинтеза и его генетический контроль наиболее близки к таковым в высших растениях [81атег, 1977]. Поэтому цианобактерии все чаще используют в качестве модельных систем для изучения функционирования фотосинтетичсского аппарата и генетического контроля фотосинтеза. Относительная простит организации этих бактерий и в тысячи раз меньший, чем у высших растений, размер генома сделали цианрбактерии гфивлекательным объектом для изучения процессов Фшсацш углерода, свето-регулкруемпй генной экспрессии и ряда других метаболических процессов, свойственных растительной клетке.

Исследование генетического контроля биологических процессов требует опережающего развития методов генетического анализа объекта. Одной из основ генетического анализа является возможность определения принадлежности мутаций к одному или разным генам, установление взаиморасположения и растояний между генами, т.е. доступность методов картирования геномов и наличие самой карта исследуемого генома. К началу данного исследования не были описаны карты генома цианобактерии БупесГюсузШ эр. РСС 6803, что определяет актуальность диссертационной работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание физико-генстической карты хромосомы цианобактерии БупескосузИз зр. РСС . 6803, представленной в виде групп космид известной локализации,в,бактериальном геноме и, в конечном счете, в виде контига космид - энциклопедии клонов.

Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи: конструирование космидной библиотеки ЗупесНосуБиё эр; РСС 6803; определение пригодности ' 'бйблйотбки; для конструирования энциклопедии клонов путем рёстрикциокного и гибридизационного анализа клонов; выявление групп космид, соответствующих макрорестрикционным фрагмента}.', хромосомы цианобактерии; выявление групп космид, соответствующих индивидуальным генам цианобактерии; построение энциклопедии клонов в области генома цианобактерии. соответствующей фрагменту М1и1-А и создание генетической карты этой области генома йупесНосузШ ер. РСС 6803.

Научная новизна и практическая значимость работы. В

результате проведенной работы впервые сконструирована и охарактеризована представительная космидная клонтека цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Показана пригодность этой клонотеки для получения физико-генетической карты генома Synechocistis sp. РСС 6803 представленной в виде энциклопедии клонов. Выявлены 40 групп космид библиотеки Synechocystis sp. РСС 6803, соответствующих макрорестрикционным фрагментам хромосомы цианобактерии. Эти группы представляют собой картирующую панель для локализации на физической карте цианобактерии клонированнных фрагментов ДНК. Выявлены и соотнесены с картированными макрорестрикционными фрагментами группы космид библиотеки Synechocystis sp. РСС 6803, соответствующие 44 генам и хромосомным маркерам цианобактерии, в том числе 22 генам, регулирующим процесс фотосинтеза. Данные группы космид являются удобным источником материала для поиска новых генов, функционально связанных с использованными генами-зондами. Создана энциклопедия клонов -физико-генетическая карта высокого разрешения, представленная в виде контига космид, покрывающая четверть от всей хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803. На карту нанесены 17 генов цианобактерии. Предложена принципиально новая схема генетического анализа мутаций цианобактерии, основанная на рекомбинационном анализе с помощью сформированной энциклопедии клонов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 141 стр. машинописного текста и состоит из 5 глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение и выводы. Список литературы, приведенный в конце диссертации включает 160 наименований. Работа содержит 15 рисунков и 8 таблиц.

Апробация работы. Основные положения работы бьши представлены на 8-м Международном симпозиуме по фототрофным прокариотам (сентябрь 1994, Милан, Италия), на 5-м Рабочем совещании по молекулярной биологии цианобактерий (июль 1995, Пасифик Гроув. США), на отчетной конфереции по ГНТП "Приоритетные направления генетики" (Москва, 1995), и семинаре "Общая и молекулярная генетика" ИОГен РАН.

Работа выполнена в рамках планов и при финансировании со стороны ГНТП РФ "Приоритетные направления генетики".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Конструирование и анализ космидной библиотеки

Spwchacystis sp. РСС 6803

Рекомбинантные молекулы сконструированы на основе вектора Lorist6 и содержат вставки ДНК среднего размера,^.39 т.п.н., полученные после частичного гидролиза цианобактериальной ДНК рестриктазсй Sau3AI. Рекомбинантные клоны получаля после упаковки лигированной смеси ДНК в частицы фага лямбда и отбора клонов-трансдуктантов на агаризованной срсдс LB с добавлением канамицина. Из 5 мкг фракционированных фрагментов хромосомы бактерии и 0,8 мкг дефосфорилированной ДНК вектора было получено около 3000 клонов-трансдуктантов. Для дальнейшей работы были отобраны 768 индивидуальных первичных клонов, которые перенесли для последующего хранения в лунки планшетов для иммуноанализа. Все клоны космидной библиотеки сданы на хранение в ВКМ ГНИИгенетика под номерами, используемыми в данной диссертационной работе.

Проверена стабильность структуры для двадцати случайно выбранных полноразмерных космидных клонов. Каждый клон последовательно пересевался 5 раз на твердой и жидкой среде с канамицином и сравнивались рестрикционные портреты космид до и после пересевов. Изменений в рестрикционных портретах космид не выявлено, т. е. основная часть клонов достаточно стабильна

Данные гибридизациокного анализа набора клонов космидной библиотеки генов наиболее информативны, если результаты гибридизации с каждым зондом можно учесть для каждого отдельного клона. Это в принципе возможно, если расположение клонов на фильтре в каадом из циклов гибридизаций остается постоянным. Упорядоченный высев клонов в виде панели позволяет воспроизвести относительное расположение клонов любое число раз. В панели каждый клон имеет свой номер (индекс). На одной панели размером 8x12 все 768 клонов нанесены в двойной повторности упорядоченными секторами, состоящими из 16 клонов. На рисунке 1 изображена схема расположения клонов на панели (рис.1 А), представляющая собой интерпретацию результатов гибридизации гена psbK с панелью клонов ( радиоавтограф представлен на рис.1 В). Каждая пара точек.

представляющая индивидуальный клон, имеет свое специфическое расположение внутри сектора. Например, внутри сектора В2 (выделен на рис. 1 рамкой и схематически изображен в увеличенном виде на рис. 2) выявляется одна пара сигналов, расположенных в верхнем левом и нижнем правом углу сектора, соответствующих клону В2 из планшета 1. Таким образом индекс данного клона, давшего положительный сигнал при гибридизации панели клонов с геном psbK -1В2.

Данная схема нанесения космидных клонов на фильтр позволяет легко дифференцировать позитивные сигналы от пятен на автографе, вызванных артефактами различного происхождения. При этом облегчается определение точных координат, и, следовательно, номера клона при визуальном учете данных.

С целью экспериментальной проверки расчетной представительности библиотеки цианобактерии была проведена гибридизация с двумя индивидуальными радиоактивными зондами на основе клонированных генов Synechocystis sp. РСС 6803 (гены psbK и psaFJ), которая выявила 9 и 7 положительных клонов, соответственно. Этот результат согласуется с расчетной емкостью библиотеки (8 эквивалентов генома). Рекомбинантные космиды из этих клонов анализировали с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindi II и BamHI. Космиды, перекрывающие один и тот же зонд, содержат ряд идентичных по размеру фрагментов ДНК, что подтверждает их соответствие единичному локусу в геноме Synechocystis sp.PCC 6803.

Анализ размера клонированных фрагментов ДНК, стабильности структуры клонов и представительности сконструированной библиотеки показал ее пригодность для создания физической карты цианобактерии Synechocystis sp.PCC 6803, представленной в виде космидного контига.

А.

1 2 14 5 6 7 В 9 10 11 12

к* ■■•« •«■• *М1 и*1 •**• («II !••• II 1« м^Д« к**

с ::!: НЦ

о

Е

' |Ш;!!; !;!= ;!1; !:;1!;!! ;;;! |Ш;!;! I!!! |||| Щ

Наш»» » А■ ■ рг* шел» «■•■ • • • • ■ и ■ ■ ■•■■ •■•>•

• ■«« ■«V • *рчш ••■« ■ ••« «•■• ««*• •••• •»»■ ■»»» ■■»•

В.

1 2 3 4 6___б 7 8 9 . 10 „11. 12

С °

1

3х

Рисунок 1. Л. Схематическое изображение радиоавтографа панели клоиов, приведенного на рнс. 1 В. Цифровые и буквенные обозначения соответствуют применяющимся па иммунологических планшетах- Жирные точки соответствуют положению позитивных клонов на панели. В. Радиоавтография палелн клонов, ирогибридизованпой с зондом рзЬК, иллюстрирующая наличие "координат сетки" негативных клонов и двойных сигналов со специфическим расположением точек от позитивных клоиов.

А

о ©О©

0©©О

Рисунок 2. Схематическое изображение сектора В2 радиоавтографа панели клонов, представленного на рис.1, йирной линией выделена пара сигналов, представляющих индивидуальный позитивный клон 1В2. Цифры (1-8) указывают номера планшетов, из которых высеваются клоны космидной библиотеки и проявляют схему двойного нанесения клонов.

2. Физическое картирование хромосомы цианобактерш БупесЬосузНз эр. РСС 6803 с помощью панели рекомбинантных космид

Использованы следующие три типа зондов. 1) Макро-рестрикционные фрагменты хромосомы (МРФ) цнанобактерии - для разбивки космид на группы, соответствующие МРФ и локализации этих групп на макрорестрикционной карте бактериальной хромосомы. 2) Фрагменты ДНК, клонированные в плазмидах н олигонуклеотиды. соответствующие известным генам цианобактерии - для выявления групп космид, перекрывающих индивидуальные гены. 3) Концевые участки вставок рекомбинантных космид (рнбопробы) - для установления перекрывания индивидуальных космид друг с другом и построения космидного контига.

2.1. Выявление групп космид. соответствующих

макрорестрикционным фрагментам хромосомы цианобактерии.

Полученные наш панели космидных клонов библиотеки цианобактерии были проанализированы путем гибридизации с зондами на основе Notl- и Afluí- макрорестрикционных фрагментов хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803 (данные получены совместно с д-ром Ю. В. Чуриным, Институт Генетики Берлинского Университета им. Гумбольдта, Германия). Очищенные препараты 12 й1и1-фрагментов и 14 WotI-фрагментов хромосомы цианобактерии использовали для гибридизации с панелями космидных клонов.

Данные гибридизационных экспериментов были проанализированы и соотнесены с физической картой генома цианобактерии [Churln, Y.N. et al., 1995] . Взаимное перекрывание Afluí- и Noti-фрагментов на физической, карте генома нашло свое отражение во взаимном перекрывании групп рекомбинантных космид, соответствующих этим фрагментам. Общее число групп космид составило 40. Космиды этих групп соотнесены с физической картой и статистически перекрывают в известной последовательности около 95% генома цианобактерии.

Для примера на рис. 3 приведены номера 203 космид, соответствующих МРФ ííluI-Á и 160 космид, соответствующих фрагментам NotI, расположенным внутри фрагмента Mlul-A. Протяженность МРФ Mlul-A составляет 870 т.п.н. В пределах этого фрагмента располагаются 6 сайтов узнавания NotI, которые делят его на 7 различных частей, для 6 из которых космидные группы определены. Сравнение группы клонов, гибридизующихся с Not I фрагментами хромосомы цианобактерии с группой клонов, гибридизующейся с соответствующим им aiuI-A фрагментом хромосомы показало, что 70% клонов, выявленых даже столь большим зондом, как МРФ Mlul-A, действительно соответствуют этому фрагменту.

Полученные данные о принадлежности космид определенным МРФ позволяют картировать индивидуальные гены на хромосоме цианобактерии с помощью созданной нами панели клонов. Для этого зонд, соответствующий картируемому гену, мы гибридизовапи на панель космидных клонов. Если при этом выявлялась группа космид, соответствующих одному МРФ, то из положения этой группы на макрорестрикционной карте хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803 определяется и положение исследуемого гена на этой карте (рис. 4).

1*1, 1В1, 101 зсэ* 1С5, 1С11, 1Г7 Ю5* 1А6 1В6, 1Н7

Ш7, 1ВЗ, 2X5 ЗС11 1В6, 2Л6, гее 1В7 1В10 1В11, 2*6

2В1* 2С5, 2X7 4811 2С7, 2011, 211 2ВЗ 1И7 2И6», ЗЛ7

ЗАЗ, 302, 306 517 2Е2, 2Н1, ЗЛ2* 2X6 2О10 4В11, 4СЗ

ЗЕ6, <А9, 4С5 6С2 зез, 301, 303 ЗА7 ЗА7 4Р4, 4В1

4Е8, 469, 4612 ссн 304, ЗП1, 307 368 ЗОН 4Я8, 6Л2

5С1, 504, 5РЗ 7X3 згао. 384, ЗН9 4ВЗ ЗЕЗ 6X3, 6X4

501, 562, 5И8 вез 4X8, 4С7, 4012 4ВЭ 4В9 6X8, 6В4

6X1, 6Р1, 6X2, 6Р5, 6X7 6Р10 4Р1, 5X6, 461, 5Л12, 4116 5В1 406 4Н11 5С9 5 КЗ 602, 6X2 6X3, 6Е4

«из. 6НЭ, 7ХЭ звэ. 5В10, 5С12 5Р6 № 6Н8, 763

7 а. 7ег, 802 5ЕЗ, «А2, 6ЛЗ 5Н12 6X8* 7113, 8X10

806, 8Н1 6Р7, 6Г12, без 6Л5 6В12 867, 868

6612, 706, 7Е9 6Р4 762 8X8, 8В12

7Н8, 807, 8011 7611 764 •

8Е6, вГ6, 8Р10 7С2 7611

861, 869, 8611 863 863

8612

мрф ыоа а г е о XI т н

размер. | 418 |12 | 218 | 57 Ц8 ^ 38 | 164

МРФ Ши} А

размер, 870

ТЛ.В.

1В7, 1С5, 1С11 ,101, 105, 107, Ю12 1Е10 ,1Е11 ,1Е12 ,1Р5, 1Р7, 168,

1В6, 1К7, 1Нв, 1Н9, 11111,2X1, 2X5, 2X6, гъ\. 2В2, 2ВЗ, 2В6, 2В11,

2С4, 2С5, 2С6, 2С7, 2С11,2С12,2Е1, 2Е2, 2X5, 2Еб, 2Е12,2Р8, 267,

268, 2610 ,2В1, гнб. 3X1, 3X2, 3*3, 3X6, 3X7, 3X12 ,ЗВ5, ЗВ7, ЗВ9,

ЗВ11 ,ЗСЗ, ЗС4, зсэ. зсн.зог. 303, 304, 308, 3X2, ЗЕ5, ЗЕ6, зп,

зга. ЗПО.ЗШ.ЗОб, ЗБ8, 3610 ,3114, ЗН7, зто ,4X1, 4X2, 4*8, 4X9,

4ВЗ, 4В6, 4В9, 4811 ,4С4, 4С5, 4С7, 4С9, 4С12 ,406, 408, 409, 4012,

«Е2, 4Е8, 4П, 4Р2, 4Р4, 466, 469, 4Н1, 4Н6, 4И8, 4И11 ,5X6, 5X12,

5В1, 5С1, 5С4, 5С10 ,5С11,5С12 504, 508, 5ЕЗ, 5Е6, 5Е7, 5К8, 5Е12,

5», зге. 561, ЗН5, 5Н8, 5В12,6Х2, 6X3, 6X4, 6*5, 6X8, 6ВЗ, 6В4,

6В10 6С2, 6СЗ, 6С6, 6С10,6С11,602, 6011 6Е1, 6Е2, 6ЕЗ, 6Е4, 6X6,

6В7, 6Е11 ,6Р1, 6Р2, 6РЗ, 6Р4, 6Р5, 6Р7, 6Р8, 6*10 ,6Р12 663, 664,

667, 668, 6612 6Я5, 6В7, 6В8, 6Н10 7X1, 7X5, 7X9, 7В5, 7В12.7С1,

7С2, 7СЭ, 706, 7X7, 789, 7РЗ, 7Г7, 762, 763, 765, 7611 7ВЗ, 7В8,

■по, 7Н12 ,8X2, 8X3, ВВ5, 8СЗ, 802, 806; 807, 8011,8Е10,8Р5, 8Е10,

863, 864, 867, аса. 8611,8В8, 8Я12

Рисунок 3. Карта №>г1-фрагментов ДНК в области ММ-А фрагмента хромосомы ЗупесИосучИз зр. РСС 6803 и схемы 1рупп косыид, выявляемых, каждым из указанных МРФ фрагментов. Знаком * выделены космиды, использованные в качестве стартовых для шагания с помощью рибопроб.

Меченый зонд гасА. * *

Гибридизация с панелью клонов выявляет 5 космпд

1

4 космиды (*) из этих 5 принадлежат группе N011-Е.

1СЬ, 1С11,1П, 1Н6, 2А6, 2С6, 2С7, 2011, 2Е1, 2Е2,

2К14 ЗА2*,ЗСЗ, 301, ЗБЗ, 304* Зт Ю1, ЗОЮ ЗН4,

ЗН9, 4АЗ, 4С7, 4Б12 «И, 4Н6, 5А6, 5А1-2 5В1,

5В9, 5В10,5С12 5ЕЗ, 6А2, 6ЛЗ, №7, 6Г12' , 6СЗ 6012,

70бг 7Е9, 7Н9, 8Б7, 8М.1 8Е6, 8Рб, 8Е10, 801, 8С9,

яси 8Р12

5 космид (@) из 8, выявленных

зондом рзаР! принадлежат группе ШЛ-А

1А1, 1В1, 101

Ю7, 1Н8, 2А5

. 2В1, 2С5, 2Е7

ЗАЗ, 302, ЗИ6

ЗЕ6, 4А9, 4С5

4Е8, 4С9, 4Э12

5С1, 5Б4, 5РЗ@

501, 502, 5118

6Е16 6Е2, 6Е7

6К1, 6Р5@ 6Р10

6Н5, 6НЭ, 7А9

7С10 7628 8В2

806 8Н1

4 космиды (#) из 10, выявленных зондом тШ> принадлежат группе ЫоЛ-Н

1Н1, 1Н7

1М.И, 2 А6

2Н6, ЗА7

4011, 4СЗ

4Е4, 4Н1

4Н8, 6А2

6АЗ, 6А4

6А8, 6В4

602, 6Е2

БЕЗ, 6Е4

6Н8, 7вЗ

7НЗ, ВЕ10#

807, 8йЗ#

8Н8, 8Н12#

Фрагмент

макрорестрикционной карты по рестриктазам М1и1 и

Рисунок 4. Схема определения позиции исследуемого гена на

макрорестрикциошгой карте хромосомы Syner.hnr.yslU ¡р. РСС 6803 путем гибридизации зонда, соответствующего картируемому гепу, с паиелыо клопов этой цнанобаетсрин. Обведены группы космид, соответствующие единичным МРФ. Знаками * и # обозначены космиды, выявляемые ДНК зондами р.мП, мсА и гкЖ), соответственно.

До нашей работы единственно доступным для цианобактерии методом картирования клонированных генов на хромосоме являлось картирование с помощью гибридизации по Саузерну с МРФ фрагментами, разделенными пульсэлектрофорезом. Созданая нами справочная библиотека и панель клонов делают теперь более простым, точным и доступным процесс физического картирования клонированных генов на хромосоме цианобактерии.

2.2. Выявление групп космид. соответствующих индивидуальным генам цианобактерии.

На данном этапе работы мы располагали набором из зондов, соответствующих 32 генам Synechocystis sp. РСС 6803. Из них 29 зондов представляли собой рекомбинантные плазмиды. содержащие клонированные фрагменты хромосомы этой бактерии. Остальные 3 использованных нами зонда представляли собой олигонуклеотиды.

ДНК зондов использовали для гибридизации с панелями космидных клонов. В результате нами было выявлено 32 группы космид, соответствующих различным генам (табл. 1).

Кроме получения собственных гибридизационных данных на панелях клонов мы реализовали преимущества справочной библиотеки для объединения усилий различных лабораторий в картировании генома исследуемой цианобактерии. Для этого 25 панелей клонов, готовых для гибридизации, были предоставлены по запросу в 17 зарубежных лабораторий, заинтересованных в получении от нас космидных клонов, содержащих исследуемые ими индивидуальные гены. В результате такого сотрудничества мы получили данные о гибридизации 12 различных зондов с нашими панелями клонов. Эти данные представлены в таблице 2.

Кластерная организация функционально родственных генов, характерная для бактерий, делает представленные группы космид удобным источником генов, функционально связанных с геном-зондом. Это. в частности, позволит исследовать области космид. содержащих гены, контролирующие фотосинтез, для обнаружения новых генов, вовлеченных в этот процесс.

Таким образом, результаты, полученные нами в данном и предыдущем разделе работы, создают основу для построения единого контига космид, перекрывающего всю хромосому цианобактерии, и получения генетической карты Synechocystis sp. РСС 6803 на основе этого контига.

Таблица 1. Космиды, содержащие индивидуальные гены и анонимные фрагменты ДНК цианобактерии БулесЬюсузЫз зр. РСС 6803, выявленные в собственных экспериментах.

(Буква "с" рядом с индексом клона означает слабый сигнал.)

Ген Функция мгт Выявленные космиды

кол-во номера

яг иг Т суШ грП десатураэа иир-лигаэа цитохром тмпа С5&3 риОосомный белок 1,9 Ш и! -А 12 1В4, Ю11,2Б1.2С4 4С9,408,4Е2,6С10 7Н12,7Н5,8А2,8С4

ан устойчивость к дяфунону ШМ-Ь/ коа-к 7 2П,2Н1,4В2,«03 5012,5НЗ,СВ7

устойчивость г динасе Су иа-у Ко11-Е 9 1Г2,206,1В5,4С7 4Н6,Б012,6АЗ,6А9 8Г8,8в12,8Н12

инициация синтеза ДЯК М1Ш-А 2 6А8,6Н9

раИС реакционный центр фотосистемы XI К1и1-<3 11 1В2,1А1с,2С2,2012 2НЗ,4В6с,4в12с,4Н4, 5СЗ,5П,8А10

раЬА2 01-0елох фотосистемы II(ОВ-свяэыва-юиий оелок) Ми!-А 9 Ш0,2В11,267,2И1, 4А6,€Е9,6Н2,8ВБ, 8Г9

165КЫА рибосомальная РНК А?о£1-В и 101,2М.2В11,2(37, 2Н10,4В6,4С11,604, 6Е2,ЙП0,8В9

да^С фунгиия неизвестна М1и1-А/ ЫоП-Ь 17 1511,2А1,ЗС<>, ЗС11, 305,3с32,4л3,4в11 6С4,6С11,6012,6КБ, 6?9,6<59,6Н8,7С1, 8СЗ

трансальдолаэа М1и1-С 12 1В6.2СЭ,307,3141, 41)11, 6В5, 6Е10.7А11, 7Э9, 766,7в12,8Р12

р<1з десатура-эа, устойчивость к норфлуроэону М1Щ- А/ М-1 9 181,1В7,2А1,2В5, 2а9,Эв11,4Н8,6А4, 6Н9

вtpC АТФаэа М1и1-е 8 1А6,1В10,2010, ЗОН ЗЕЗ,5Е9,6В12

глпП гглЛ рибосомкые белки mvl-w 8 1С10,2Е9,ЗА10,405, 4110,032,К;5,7А6

ре И цитохром с553 И! 111-0/ ИоП-Я 3 т,2С1,2Г11

гЬс 1,3 рибулоэо- бифосфат карбоксилаэа (2 субъедииицы) ЯМ-В/ N011-К 3 4АЗ, 6Н8,8Н11

оюпз ген ,гомологичный гену ОИУ1б8 хлоропластной ДНК высших растений Ши1-А/ 4 ЫП,7С5,ТС12,804

рэаО субъединица II реакционного центра фотосистемы I №>М-В 14 Шс,1АЗ,1В1с,4Вб, 4В11,4СЗс, 4012,4Н8, 504,5011,5Е12с,6А4с, 6ПЗ,7с1с

ndiB №Ш(Р)Н-яласто-хинон оксиредук-таэа MIuI-A/ Wotl-H 10 1H11,2B2,2C12,3A12 6F3,6G7,«ill,8E10, 8G8.8H12

ORF324 ген ' гомологичный гену ОВОДЭ хлоропластной ДНК высших растений Mlu1-Т/ Motl-F 1A1,1A11,3B2,6B6

ndbAIGE КАО (?) Н-пластохи-нон оксиредуктаэа wzm-н/ Jfotl-Q 3 4C8,6B9,7C11

ndbl СуОъединица ЫАШ-дегидрогенаэы KIuI-В/ Kotl-G 3 4B8,6B9,6H11

ndhCKJ суОъединица КАШ дегидрогенааы - . MIuI-А/ WotI-A 6 1Б7,1012, 4B6,4G9 6C6.6F1

ndhE субъединица НАШ дегидрогенаэы MIuI-A/ . «0 tf-E 16 1CS,1F7,1B6,2A6, 2С7,2Е2,303.3Г11, 4C7,5I3,«2,6F7, 7D6,7H9,8i6,8F10

0RF1S4 ген * гомологичный гену ОВР184 хлоропластной ДНК высших растений Mlul-C/ №>tI-R 3 3E3,SC9,7G2

psiA3 белок 0 фотосистем! 1 (ОВ-свяэывакций белок) не определен 2 2B11,2G7

petB pete компоненты комплекса цитохрома Ь6-£ MIuI-А/ JGuI-D 2 3D5.3F2

peffl Ферредоксин-НАДФ редуктааа MZuI-B/ №>£1-в 3 1Г4,21П0,6Е5

atpC CCpB УОК1 АТФ синтетаэа С-концевая процес-сирующая 'протеаэа Miul-C/ ifotl-R/ №>tX-XY 10 1A6,1B10,2D10,3DS, 3E3,3E6c,3E7c,3F2, 5C9,7G4

ZKf глюкозо-6-де ридро-генаеа ACIuI-A/ MZuI-D 3 2D10,3DS,3r2,

petCA белки - компоненты комплекса цитохро-ма Ь6-Г Jilul-A 8 2B2,2C12,3D5,3I2, 5K1,6C2,6D11,8S10

■tciB метаболизм неорганического углерода и глюкозы Miul-A 10 105,2БЗ,2Ео,3D6, 4B2,4DS,4D6,7C2 7E2,7S11

Л£сА контроль азотного метаболизма MIuI-A/ Hotl-E 5 1D2,2H1,3A2,3D4, ОП2

nJ/J нитрогеназа Mlul-Tl Natl-T 4 1G1,3A12,4A10,8D9

Таблица 2. Космиды, содержащие индивидуальные гены и анонимные фрагменте: ДНК цианобакте- рии Synechocyзtis зр. РСС 6803,

выявленные на наших панелях клонов в партнерских лабораториях.

Гон Функция МРФ Выявленные госмиды JlaQopaTopüa-napTHep

кол-во номера

сохВАС суОъединица II ИТО.ЧРОМОКСИДЭЭЫ Mlul-F 9 1D5,2£8,3E7, 4AS, 4G2.E.DH, 6II9,7G2,8A12 Scti/nntterer, Vienna, Austria

rnh РЯКаэа II MluI-F2 №>tI-AA 6 2C1,4G7,4H12 5A5.5A7, 5Ffl, --"-

desD десатурэза дельта - 6 itotl-H 4 1E9,2G11,3E11 5H6 Murata, Okazaki, Japan

CTJvT ГСЫ ,ГОМОЛОГИЧНЫЙ Г^НУ ОКг нлоропластной ДНК высших растений MiUi-A 6 »C4, 409, iCll,CF8 ll^rjfinann iL, Inst-fur Botanik, Rostock, Germany.

psaFJ су&ъединица фотосистемы I Miul-A 8 5E12,5F3,6B4, 6S1,6F4,6FS, 7C1.7G2 -"-

stpA повышенная соле-устойчивость mui-в/ m-uI-F S 1A1,4BU,6H6, 7A12,8C2 -"-

pmal АТФаза Р-ткпа (гомол. эукаркоти-ческой Са++АТФазе) J«ul-A 4 4H6,5B1,6A9, 7G3 Geisler M., Heinrich Heine Univeraitat, Düsseldorf, Germany

ldpT светоэависимэя протонлорофиллид родуктаэа A'JuI-Sl Wo£I-C б 2E4c,2F6c, 3F2c, 4D2c,4D5 7010c Griffiths V.T. Univers. of Bristol ; dptm. of Biochenastry England

ЬохН двунаправленная дегмдрогеназа Mlul-A б 3C11,5E7,6F1, 7C1,3A3,8C3 0.Schmitz Bioljn University of Cologne, Ge rmarsy

hnpL гидроренаэа Mlul-A 3 1D1,2A1.6G2 _"_

b-PHY Ь - фикоцианин MZuI-Fl 14 1A1,1B1,1B7C, 2A1,2E9,3B2, 3D6c,3F2c, 4B11,SA1,SA5, iF5,6FX0c,6H9 lab of Dr.N.H. Hann; University of Warwick, dept. of Biologoeal, Warwick, UK

jip белок, индуцируемый джасмонатом MJuI-A/ iCuI-D S 1E12,2A3,2H12 4E8, БАЮ IC.Vorosi Inst.of Plant B1ology, Veinberg

2.3. Построение контига космид на участке генома цианобактерии. соответствующей фрагменту Aflul-A.

Возможность построения протяженого контига с использованием космидной библиотеки генов Synechocystis sp. РСС 6803 была продемонстрирована в области хромосомы, содержащейся в фрагменте Мtul-A (размер 870 т.п.н.). Из 200 клонов, соответствующих фрагменту Mlul-A (см. рис.3). 75 клонов были использованы для получения концевых рибозондов с последующей гибридизацией их с панелью космидных клонов. Для 40 космид из этих 75 рибопробы получали к каждому из двух концов вставки. В 35 случаях зонды получали только к одному из двух концов космиды. Таким образом общее число рибопроб составило 115.

Из общей выборки космидных клонов, гибридизующихся с Mlul-A фрагментом хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803 были отобраны несколько клонов в качестве стартовых для шагания по хромосоме. Эти клоны относились к шести из семи разных фрагментов NotI. расположенных внутри фрагмента Jflul-A (см. рис. 3). Т. обр. рост контигов осуществлялся одновременно с 6 независимых точек в обе стороны от каждой стартовой точки.

Результаты гибридизации каждого зонда относительно каждого клона заносились в базу данных и обрабатывались с помощью компьютерной программы Contlg, созданной А.Григорьевым и А. Мироновым (ГосНИИГенетика) в рамках ГНТП "Геном человека". Программа предсказывает порядок перекрывания рекомбинантных молекул и длину перекрытого контигом участка картируемого генома.

В результате обработки данных по 93 информативным гибридизациям панели клонов с индивидуальными рибозондами было получено 2 контига ( рис. 5). Первый контиг начинается с клона 2G7 и обрывается на космидном клоне 6А8. Второй контиг начинается от клона 8G3, который гибридизуется только "на себя", т.е. фланкирует брешь с другой стороны . Этот контиг заканчивается клоном 2Н6. Брб-конец которого гибридизуется с космидными клонами, гомологичными Jflul-D фрагменту хромосомы, граничащему с Mlul-A Фрагментом.

Из 115 использованных зондов 18 вероятно попадают в повтор, выявляя в общей сложности космиды из 45 локусов в геноме. Четко регистрируемое количество позитивных сигналов в панели при этом

превышает среднее число клонов, соответствующих зонду уникальной локализации в хромосоме. В 9 случаях количество позитивных

сигналов превышало среднее (~iO космид) примерно в 2 раза, в 6 случаях - в 3 раза и в 3 случаях - более чем в 3 раза.

3. Создание генетической карты области генома Synechocystis sp. РСС 6803 на основе физической карты Mlul-A фрагмента, представленной в виде контига космид.

Используя данные гибридизаций панели клонов с зондами на основе клонированных генов Synechocystis sp. РСС 6803 (см. табл. 1 и 2) мы расташш 17 генов на коитиге космид в пределах Etui-к фрагмента хромосомы цианобактерии (табл. 3, рис.5)

Таким образом, последовательность генов в хромосоме, т. е. генетическая карта была установлена нами без применения методов генетического анализа, которые требовали бы разработки систем скрещивания, получения коллекции мутантов и определения частот генетических рекомбинаций для установления последовательности генов в хромосоме. Заметим, что порядок следования вдоль хромосомы для некоторых из этих генов (например, petCA и ic/G; psbA2 , desk, psaFG и atpBE и др.) установлен только на основе созданного нами контига. На ПФГЭ-карте их последовательность не выявляется, т.к. они принадлежат к одним и тем же МРФ-фрагментам хромосомной ДНК.

Параллельно с нашей работой группой Kotani [ Kotanl et al., 1995J была сконструирована космидная библиотека и построен контиг, на основе которого, как и в данной работе, создана генетическая карта Syncchocystis sp. РСС 6803. За одним исключением порядок расположения генов на участке хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803, соответствующем фрагменту Ulul-A, в двух независимо полученных картах совпадает , что указывает на достоверность структуры каждой из этих карт.

И в нашей работе, и в работе Kotani с соавт. выявлена единичная брешь в контиге, перекрывающем Mtul-A фрагмент хромосомы цианобактерии (обозначена DEL на рис. 5). Эта брешь в космидном контиге также имеет определенное положение на карте: в обоих случаях она локализована на картах между генами icfG и dnaA. Возможно выявленная брешь соответствует неклонируемой в Б.соU области хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803.

М1иА суЫ ргаО ЬохН. ВарС

ПМ?,Г£Я ( р5£Л/

р$М2 Офф | | а!р8£

М1иА М1иО

<Г°

Рисунок 5. Схема взаимного расположения космидных клонов в контиге, перекрывающем М1и-А район физической карты ЗупесЬосузйз 5р. РСС 6803. Стрелками указаны сайты узнавания N011 и М1и1; пунктирными стрелками - локализация индивидуальных генов. Жирные полоски - минимальный набор космид, перекрывающий М1и-А район; тонкие полоски - полный Космидный контиг, в ' котором стрелками указаны концы космид, использовавшиеся в качестве зондов.

Таблица 3. Номера космид, выявляемых зондами, полученными на основе клонированных генов БупесНосузНз эр. РСС 6803,

определяющие положение этих генов на контиге космидных клонов.

1 Ген 1 1 1 Космиды « 1 8 Ген 1 1 \ в .... 1 Косшды

1 пйЛО ! К 1 1Н11;2В2;2С12;ЗА12| тЛск 1 Ю2;1Н1;ЗА2;304;

1 6РЗ;6М1:6С7;8Е10; В 1 6Р12

1 8С8; 8Н12 1 1

I » » дарС 1 1ГП'; 2А1; 305; ЗС2;

реЮА I 2В2;2С12;ЗБ5; ЗР2 1 1 ЗС9; ЗС11; 4АЗ; 4В11;

1 5Е1;6С2;6011;8Е10 5 1 6С4; 6012; 6Р5; 6Р9;

1 II 1 .6Н8;6С11; «59:701;

гсЯЗ 1 Ю5; 2ВЗ; 2Е6; 306; 1 1 8СЗ

1 4В2; 405; 406; 7С2 1 1

1 7Е2;7С11 » аЬрВЕ 1 ЗС9;ЗС11;5Е7;6С11;

1 к 1 6Р1;6Р5; 7С1; 8АЗ; 8С2

йпак 1 6А8;6Н9 а 1

1 1 НохН 1 5РЗ;5Е12;6Е1;6Р5;

рЗэ 1 1В1; 1В7; 2В5; 2Е9; 1 1 ЗС11;6С11:4В11;7С11

1 2А1; ЗИ1; 4Н8; 6А4; I 1 8СЗ; 8АЗ; 5Е7

1 6Н9 1 1

1 8 psaFJ 1 1В7; Ю5; 2ВЗ;2Е6;

рш1 1 206; 2Е7; 4В5; 4012; 1 1 2С7; 4ВЗ; 4В8; 4В9;

1 4Н6; БАЮ; 5В1;5Е2; 1 1 4С8; 406; 5Е12; 5РЗ;

1 1 6А9; 6Р2; 703; 8Р8 1 в 1 | 6Р5; 7С2; 7С11

1 йгё 1 1Г2; 2Б6; 4В5;4С7; а 1 1 рзаС 1 1АЗ; 4В6; 4В11;4С12;

1 4Н6; 5012; 6АЗ; 6А9; 1 1 4Н8;504;5Ш1;6Н9

1 8Р8;8С12;8Н12 I 1

1 1 ¿едА 1 1В4; ЮН; 2В1; 2С4;

пбШ 1 1С5; 1Р7; 1Н6; 2С7; I 1 4С9; 408; 4Е2; 6С10;

I 2Е2; 2А6; 303; ЗРИ; 8 1 7С5;7Н12; 8А2; 8С4

1 4С7; 5ЕЗ;6А2; 6Р7; 5 1

1 706; 7Н9; 8Р6; 8Е10 1 рзЬА2 1 Ю10; 2В11;2С7;2Е11

1 1 1 4А6; 6Е6; 6Н2; 8В5; 8В9

ОШ 73 1 5И;7С5;7С12;8С4 1 1

Положение всех генов, картированных нами на космидном коктиге, перекрывающем фрагмент Mtul-A хромосомы Synechocystis sp. PCG 6803, было определено нами независимо от других исследователей. Причем положение четырех генов ( hoxH. 0KF173, gaрС, drg) определено до настоящего времени лишь в нашей работе.

В картированной наш области положение одного из генов, ndhD, значительно отличается от такового на карте Kotani с соавт. В нашем случае этот ген локализован в составе фрагмента Mtul-A между геном petCA и границей Jflul-A и Mlul-D фрагментов хромосомы цианобактерии. : Зонд, полученный на основе гена ndhD, выявляет 10 космид на панели клонов, 9 из которых по результатам гибридизации с МРФ однозначно отнесены к фрагменту ifluI-A и. кроме того, выявляются единой группой на контиге космидных клонов. Таким образом, использованный нами зонд не содержит последовательностей, гомологичных разным участкам хромосомы цианобактерии. В работе [Kotani et al., 1995] этот ген отнесен к фрагменту Mlul-О. Этот участок находится в другой четверти хромосомы Synechocystis sp. PCO 6803.

Различия в положении гена ndhD на карте могут быть объяснены причинами . биологического характера или различиями в деталях использованной нами экспериментальной процедуры картирования данного гена. . Если считать, что положение гена ndhD в обоих работах определено корректно, это означает, что использованный нами штамм отличается от японского по своей генетической структуре. Различное положение данного гена может указывать на наличие хромосомной перестройки, различающей два штамма. Эта перестройка может быть либо транслокацией, либо инверсией. Ген ndhD является фланговым маркером построенной нами карты, поэтому выбор между двумя возможными типами перестроек может быть сделан только на основании дальнейших экспериментов по картированию.

Т. обр., мы сконструировали совмещенную физическую и генетическую карту протяженностью около 900 т.п.н. в области, соответствующей фрагменту Mlul-A хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803. Компьютерная обработка данных позволила однозначно расставить на карте 93 зонда, соответствующих концам космид. Следовательно, среднее расстояние между этими концами составляет около 10 т.п.н.. Эта величина, являющаяся разрешающей способностью карты, достигнута нами на 1/4 части всей хромосомы бактерии и

примерно соответствует размеру бактериального оперона [Албертс и др., 19941.

4. Перспективы применения энциклопедии клонов для

молекулярно-генетическнх исследований цианобактерии.

Одноклеточные цианобактерии отличаются природной

компетентностью клеток и для них разработана методика спот-трансформации на плотной среде по механизму рекомбинационного спасения маркера [Сг1дог1еуа. 8Псз1асоу. 1982]. Для этого достаточно нанести на газон цианобактерии, несущих условно летальную мутацию и высеянных в непермиссивных условиях, ДНК из шташа дикого типа. В результате гомологичной рекомбинации в зоне нанесения ДНК возникают бактерии-трансформанты, которые образуют колонии или пятно роста на фоне практически отсутствующего роста бактерий в газоне.

Феномен спот-трансформации, в сочетании с доступностью энциклопедии генов как инструмента исследований, открывает принципиально новые возможности для картирования {^охарактеризованных и вновь выделяемых мутаций цианобактерии. Схема картирования должна заключаться в следующем. На газон мутантных цианобактерии, высеянных в селективных условиях, добавляются образцы ДНК рекомбинантных космид, которые ранее уже картированы и перекрывают каждую точку бактериального генома. В частности, какие-то из космид энциклопедии будут перекрывать мутацию,и в точке нанесения этого образца на газоне бактерий будут появляться трансформанты. Трансформация будет наблюдаться только космидой определенного номера и следовательно определенного положения на карте. При этом возможно различение фенотипически идентичных мутаций (например, по фотосинтезу), если они будут приписаны разным участкам карты. Если мутация выявляется в той же области карты, в которой содержится известный ген с данным мутантным фенотипом, то при этом можно будет приписать мутацию определенному гену. Разрешающая способность построенной наш физической карты на основе космид составляет около 10 т.п.н., и именно с такой точностью можно будет картировать любую мутацию на хромосоме цианобактерии. Если в данной области карты ранее не выявлялись гены с данным мутантным фенотипом, то это будет указывать на обнаружение нового гена.

Процедура картирования мутации в принципе может сводиться

всего лишь к однократному нанесению образцов ДНК от каждого клона энциклопедии репликатором на газон цианобактерии. Т. обр. может возникнуть методика массового анализа коллекций фенотипически идентичных, мутантов, не требующая ни традиционных методов генетического анализа, ни процедуры клонирования для характеристики мутации. Увеличение количества анализируемых мутантов может, позволить выявить те новые гены, мутации в которых возникав относительно редко, например, в силу малого размера мишени (мутации в цис-специфических регуляторных участках) или в силу сайт-специфичности (например, при плейотропном эффекте большинства мутаций в данном гене, приводящем к летальности, не снимаемой специфическими пермиссивными условиями).

Таким образом, создание и анализ энциклопедии клонов может стать общепринятым этапом генетического анализа, направленного на поиск новых генов, установление функциональных связей мевду ними и, в целом, на структурно-функциональную характеристику генома.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструирована и охарактеризована представительная космидная клонотека генома цианобактерии Synechocystis sp. РСС

6803. Рекомбинантные ко'смиды поддерживаются в клетках Е. coli и

► i >/

несут вставки со средним размером 39 т.п.н. в составе вектора Loristß. Общее количество индивидуально сохраняемых клонов совтаагает .7.68, что соответствует 8 эквивалентам генома . цианобактерии. Показана стабильность структуры рекомбинантных , космид и .пригодность клонотеки для создания физико-генетической карты генома Synechocystis sp. РСС 6803, представленной в виде . энциклопедии клонов.

2. Выявлены 40 групп космид клонотеки Synechocystis sp. РСС 6803. соответствующих макрорестрикционным фрагментам хромосомы цианобактерии по рестриктазам Mlul и Notl. Последовательность этих, .групп является одной из форм физической карты генома цианобактерии и одновременно является картирующей панелью для локализации на этой карте клонированных фрагментов ДНК.

3. Выявлены и соотнесены с картированными макрорестрикционными фрагментами группы космид библиотеки Synechocystis sp. РСС 6803, соответствующие 44 генам и

хромосомным маркерам цианобактерии. в том числе 22 генам, контролирующим процесс фотосинтеза. Даные группы космид являются удобным источником материала для поиска новых генов. Функционально связанных с использованными генами-зондами.

4. Создана энциклопедия клонов - физико-генетическая карта высокого разрешения, представленная в виде контига космид. покрывающая четверть от всей хромосомы Synechocystis sp. РСС 6803, соответствующей рестрикционному фрагменту äluI-A. Карта представлена в виде контига из 25 космид, со средним расстоянием между маркерами равным 10 т.п.н. На карту нанесены 17 генов цианобактерии, для которых определено следующее расположение на хромосоме: psbÂ2, desA, 0RF173, psaD, psaFJ, hoz H, gcpC, atpEE. gapC, nicA, ndhH. drg, pml. pds. dnak, ic/G, petCA, ndJiD.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1) V. Shestopaiov. 0. Naschoklna, S. Shestakov. N.Yankovsky. Physical mapping of Synechocystis sp. 6803 genome. 8th

International Synposium on Phototrophic Procariotes. Sept 1994, Milano, Italy.

2) Конструирование космидной библиотеки генов цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. В.И.Шестопалов, О.О.Нащо кина,

С.В.Шестаков, Н.К.Янковский. Генетика (1994) т.30, #4, с.452-455

3) Shestakov S., Shestopalov V., Naschoklna 0., Churin Y., Putivetz 0., Borner T., Yarikovsky N. Genetic mapping of the chromosome of Synechocystis sp. PCC6803. Abstracts of the Fith Cyanobacterial molecular biology workshop. Pacific Grove, CA, USA, July 1995, pl29.

4) Конструирование упорядоченной библиотеки генов цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Шестопалов В.И.. Нащокина 0.0.. Чудинов 0. С., Борбиев Т. Э., Чурин Ю. Н., Шестаков С. В.. Янковский Н.К. Генетика (1996), в печати