Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирующих устойчивость к гербициду параквату у цианобактерии SYNECHOCYSTIS sp. PCC 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирующих устойчивость к гербициду параквату у цианобактерии SYNECHOCYSTIS sp. PCC 6803"

российская академия наук Г 5 ОД институт общей генетики им.н.и.вавилова

1 ИЮН 1997

р На правах рукописи

УДК: 575.224.2: 632.95.025.8: 582.232.7

О 1 КиЯ!

сидорук константин васильевич

КЛОНИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ К ГЕРБИЦИДУ ПАРАКВАТУ У 1ШАН0БАКТЕРИИ

ЗУИЕСНОСУЗПБ зр. РСС 6803

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва - 1997

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН и на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук,

профессор, член-корр. РАН С.В.Шестаков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, В.А.Тарасов

доктор биологических наук, профессор, Ю.Т.Дьяков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

РО /V) сд. О.

Защита состоится "——" - 1997 г. в - часов

на заседании специализированного Ученого совета Д002.49.01 при

Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул. Губкина, 3).

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

. /В апредч Автореферат разослан "-" -- 1997г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

Актуальность проблемы. В связи с широким применением в сельском хозяйстве гербицидов - химических средств защита растений от сорняков - большое значение приобретают работы, направленные на исследование молекулярных механизмов их действия. Клонирование и молекулярный анализ генов, контролирующих устойчивость к гербицидам, является эффективным подходом для решения целого ряда прикладных и фундаментальных научных задач, таких как: изучение клеточных мишеней, на которые действуют гербициды; оценка экологической безопасности применяемых препаратов; целенаправленное создание гербицидов с заданным типом биологической активности, получение трансгенных с/х культур, устойчивых к гербицидам и др.

Исследование этих проблем на высших растениях затруднительно из-за сложности молекулярно-генетического анализа этих объектов. Удобной моделью для изучения генетического контроля устойчивости к гербицидам могут служить одноклеточные цианобактерии. Их фотосинтетический аппарат, многие метаболические системы и, как следствие, мишени действия гербицидов в значительной степени сходны с таковыми у высших растений. Прокариотический тип строения клетки цианобакте-рий, их способность к генетической трансформации, относительная простота получения мутантов позволяют клонировать и изучать гены устойчивости к гербицидам.

Из клеток цианобактерий клонированы гены устойчивости к триа-зиновым гербицидам (Golden, Haselkorn 1985; Gingrich et al., 1988); к нитрофенольным гербицидам - иоксинилу и диносебу (Ajlani et al., 1989; Чеснавичене и др. 1994); к обесцвечивающим гербицидам -норфлуразону и дифунону (Chamovitz et al., 1990, 1991; Барцевич, Иестаков 1993).

В последние годы особое внимание уделяется изучению гербицидов - индукторов окислительного стресса, таких как паракват, ами-грол и т.п. Окислительный стресс возникает в результате образования активных форм кислорода вследствие "незаконного" переноса электро-îob от электрон-транспортных цепей на кислород. Активные формы отслорода разрушают клеточные мембраны, ДНК и белки, что приводит с гибели клеток. В защите клетки участвуют различные ферменты, шактивирующие токсичные радикалы, в том числе, супероксид дис-яутаза, аскорбат пероксидаза, глутатион редуктаза и др. (Bowler ît al.,1992). Под действием параквата в клетках E.coli синтезируйся более восьмидесяти различных белков, функции которых в боль-шнстве случаев неизвестны (Jean et al., 1990). Обнаружены гены ¡oxR, oxyR и др., принимащие участие в регуляции этого процесса

- -t _

(ГаЫ. а1., 1994; Ко1г et а1., 1996). Гербицид паракват■ингиби-рует транспорт электронов на уровне фотосистемы I (ТгеЬе1; 1987), однако, о механизмах развития резистентности 'к.этому гербициду известно еще очень мало. .. • •

Цель работы. Данная работа посвящена клонированию и молекулярному анализу генов устойчивости к гербициду параквату у цианобакте-рии БупесЬосузив ер. рсс 6803. Основные задачи исследования:-

1. Получение паракват-резистентных. мутантов ЗупесЬосувиз 6803.

2. Клонирование и идентификация генов, контролирующих устойчивость к параквату.

3. Определение молекулярной природы мутации, обуславливающей устойчивость к параквату.

Научная новизна и практическая ценность работы. Клонирован ген ргчН, определяющий устойчивость к параквату у цианобакте-рий. Ген р^И кодирует белок, гомологичный регуляторам .транскрипции tetR-ceмeйcтвa. Идентифицирована миссенс-мутация, -отвечающая за устойчивость к параквату и показано, что инсерционная инактивация гена ргчИ приводит к паракват-резистентности. Исследование систем, регулируемых геном ргдИ, открывает новые перспективы для создания сельскохозяйственных культур, устойчивых к окислительному стрессу.

Идентифицирован новый ген - с-ЬрВ, кодирующий неизвестную ранее протеазу, принадлежащую к семейству карбоксил-терминальных процес-сируших протеаз. Показано, что функция бежа (ПрВ тличается от функций"других протеаз этого семейства. Инсерционные мутанты по гену сЬрВ устойчивы к параквату и ингибитору сериновых протеаз -фенилметилсульфонил фториду, чувствительны к мембранотропным агентам - диметилсульфоксиду и новокаину, а также к глицерину. Полученные данные указывают на возможную роль (Прв-белка в функционировании клеточных мембран.

Результаты данной работы доложены на III Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1995г., а также на конференции "Автотрофные микроорганизмы". Москва, 1996г. ■

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит семь разделов: 1) введение. 2) обзор литературы, посвященный главным образом молекулярным механизмам действия гербицидов, з) материалы и методы, 4) результаты и обсуждение. 5) заключение, 6) выводы. 7) список литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает наименований, в т.ч. на иностранных языках.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Мутанты 5упес1юсувив вр. РСС 6803, устойчивые к параквату.

1.1 Отбор паракват-резистентных мутантов.

В результате селекции на твердых средах, содержащих гербицид, зтобрано 28 спонтанных мутантов, обладающих стабильной устойчивостью к параквату в концентрациях от 10 до 40 мкг/мл, что в 2-8 эаз превышает устойчивость штамма дикого типа БупесЬосузНБ 6803.

Для клонирования генов были Еыбраны те мутанты, хромосомная ЩК которых трансформирует штамм дикого типа к паракват-резистент-юсти. Частота трансформации для мутантов Ргя18, Ргч20

I Ргд23 составляет приблизительно 10"5 - 10"в трансформантов на юципиентную клетку.

1.2 Определение устойчивости паракват-резистентных мутантов к

другим гербицидах и ингибиторам.

Действие параквата на клетки растений обусловлено образованием 1ктивных форм кислорода и развитием окислительного стресса. Такое :е действие оказывают многие природные стрессовые факторы, такие :ак нарушение водного и температурного режима, патогены, ядохимика-н и т.п. Паракват-резистентные мутанты высших растений одновремен-о устойчивы к засухе, высокой интенсивности света, переохлаждению, зону, а также ко многим гербицидам (атразину, дифениловым эфирам

Таблица I. Чувствительность паракват - резистентных мутантов

к различным гербицидам и ингибиторам.

селективный агент Минимальная ингибируицая концентрация (мкг/мл).

Д.т. Рщ1 РГ(}18 Ргдго Р^23

паракват 5 15 30 30 20 25

диурон 1 * * * * *

метронидазол 70 * * * * *

БССБ 15 * * * 45 *

анитрол 10 * * * * *

* - чувствительность мутанта к данному веществу совпадает с гвствительностью штамма дикого типа. ОСОБ - дициклогексилкарбодиимид.

и др.). Их устойчивость обусловлена увеличением активности ферментов, обезвреживающих активные формы кислорода и токсичные радикалы.

Проверка паракват-резистентных мутантов Synechocystis 6803 на устойчивость к некоторым гербицидам и ингибиторам" (Табл.1) показала, что большинство мутантов устойчиво только к параквату. Мутант Prq20 устойчив еще и к ингибитору dccd (дициклогексилкарбо-диимид). Это дало возможность предположить, что механизмы развития устойчивости к параквату у данных мутантов отличны от тех, что выявлены у высших растений. Наличие у мутанта Prq20 перекрестной устойчивости к параквату (акцептору электронов) и dccd - ингибитору трансмембранного транспорта протонов - позволяет предположить, что такие мутации могут затрагивать гены, участвующие в регуляции электронного и протонного транспорта в фотосинтезирующих клетках. 2. Клонирование генов, контролирующие устойчивость к параквату у цианобактерии Synechocystis 6803.

2.1. Выделение фрагментов хромосомной ДНК мутанта Prq20, трансформирующих штамм дикого типа Synechocystis 6803 по признаку устойчивости к параквату.

Для клонирования фрагментов ДНК, содержащих гены, контролирующие устойчивость к параквату, применяли метод "обогащенной полосы". Фрагменты хромосомной ДНК мутанта Prqso, образующиеся при обработке рестриктазой Hindin, фракционировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Фракции, содержащие фрагменты размером 2-4.3т.п.н., 4.3-6.7 т.п.н., 6.7-9.3 т.п.н. и 9.3-23.1 т.п.н., элюировали раздельно и проверяли на способность трансформировать цианобактерии по признаку устойчивости к параквату. На основе фракции фрагментов ДНК (4.3-6.7т.п.н.) с наибольшей prqr- трансформирующей активностью была создана субгеномная библиотека, содержащая около 1000 рекомби-нантных клонов E.coli. В качестве вектора клонирования использовали плазмиду рисго. При скрининге клонотека была разделена на 40 груш по 20-30 клонов в каждой. Суммарную плазмидную ДНК из каждой группы клонов проверяли на способность трансформировать штамм дикого типа SynechocyBtis 6803 по признаку устойчивости к параквату. Из библиотеки были отобраны три клона, содержащие плазмиды pPRl, pPR2, pPR3. Плазмиды pPRl и pPR2 давали трансформацию на устойчивость к параквату с высокой частотой - 10"5, а рРйз - с существенно более низкой - ю"7 трансформантов на реципиентную клетку.

2.2. Рестрикционный и делеционный анализ фрагаентов ДНК, клонированных в составе плазмид pPR1, pPR2 и pPR3. Рестрикционный анализ показал, что в составе плазмид pPRl

- А -

и pFR2 клонирован один и тот же Hindin фрагмент размеров 6.7 т.п.н. Плазмида pPR3 содержит,, другой Hindin фрагмент размером 4.2 т.п.н. (Рис.1);

С целью более точной локализации мутации в пределах клонированных фрагментов были получены делеционные производные плазмид pPRl и pPR3, которые проверялись на способность трансформировать клетки цианобактерий к паракват-резистентности. Плазмида рР1Д5 и рР1Дб, являщиеся производными pPRl и имеющие область перекрывания 420 н.п, обладают способностью к трансформации. Значит мутация устойчивости к параквату локализована на Drai - Eco47IlI фрагменте размером 420 н.п. (РисЛА). Минимальным трнсформирующим фрагментом плазмида pPR3 является ее производная-рРЗДЗ, несущая Hindlll-Hincll фрагмент размером 690 н.п. (РисЛБ).

2.3. Клонирование фрагментов хромосомной ДНК штамма дикого типа Synechocystis 6803, гомологичных клонированным в составе плазмид pPR1 и pFR3.

При клонировании фрагментов хромосомной ДНК из штамма дикого типа использовали космидную геномную библиотеку Synechocystis 6803 (Шестопалов и др. 1994). Из нее были отобраны клоны, несущие космиды с фрагментами ДНК, гомологичными клонированным в составе плазмид pPRl и pPR3. Из космиды 1D12 выделен Hindin субфрагмент размером 6.7 т.п.н., гомологичный содержащемуся в плазмиде pPRl. Поскольку минимальный трансформирующий фрагмент плазмида pPR3 соответствовал крайнему участку исходно клонированного Hindin фрагмента хромосомы Synechocystis 6803, то сохранялась высокая вероятность того, что в нем содержится лишь часть исследуемого гена. О целью получения плазмида, содержащей полный ген, из космиды 1А6 клонировали 4.1 т.п.н. Kpnl субфрагмент, в котором Hihdin - Hincll участок размером 690 н.п. расположен в центре (Рис.2).

3. Молекулярный анализ гена устойчивости к параквату, клонированного в составе плазмида pPR1.

3.1. Секвенирование клонированных фрагментов ДНК и компьютерный анализ нуклеотидной последовательности гена, ответственного за резистентность к параквату.

Было осуществлено секЕенирование 1.3 т.п.н. ВаггЛГ - Sphl фрагмента плазмида pPWEl методом дидезокситерминирования по Сенгеру (Sauger et al., 1977). Компьютерный анализ его нуклеотидной последовательности выявил наличие открытой рамки считывания, состоящей J3 187 кодонов (0RF187). С целью идентификации мутации устойчивости < параквату секвенирован 42Q н.п. Drai - Есо47Ш фрагмент плазмида

Название плазмида

Рестрикционная карта

Способность к трансформации на устойчивость к параквату.

Hindlll BamHI

Eco47III Dral Smal Smal HlncII Dral

pPR1

Eco47III Ncol EcoRI HlncII EC047III SphI

Hindlll HlncII HlncII Dral BamHI Ncol

Ncol

HincII

бт.п.н.

Hindlll pPIД1 I-

РР1Д2

Hindlll

РР1ДЗ '-

pP1 Д4 pP1 Д5 рР1Дб

pP1 Д7

EC047III I_

BamHI

BamHI i_

EcoRI EcoRI

Hindlll

BamHI

_I

Eco47III —l

Dral

Dral

Dral Eco47III

T

Локализация нутации устойчивости к параквату.

Б.

Hindlll

Hindlll

pPR3

HincII HincII Kpnl BamHI EcoRI

HincII 1HincII HincII

Hindlll рРЗД1 I-

рРЗД2

Hindlll HincII рРЗДЗ I-1

t

2

Kpnl Kpnl

4т.П.Н.

Hindlll

Наименьший трансформирующий фрагмент.

Рис I. Рестрикционные карты и делеционный анализ фрагментов хромосомной ДНК мутанта Pгq20: А) клонированного в составе плазмида рРИ1, Б) клонированного в составе плазмиды рРИЗ.

pPRl. При сравнении его нуклеотидной последовательности с гсколт гичным участком из плазмиды pPWTl обнаружена мутация, представляющая собой трансверсию т •* А, приводящую к замене у белка, кодируемого 0rp187, гидрофобной аминокислоты лейцин в положении 17 на гидрофильную - глутамин (Рис.3).

3.2. Поиск гомологии 0RF187 с известными генами.

Проведено сравнение аминокислотной последовательности белка, кодируемого ORF187, с данными международного банка EMBL. Обнаружено, что 0KF187 секвенирована в составе фрагмента хромосомной ДНК Synechocystis зр. РСС 6803 размером 120 т.п.н., зарегистрированного в геномном банке Cyanobase под номером Ббоооз; 0RP187 соответствует гену в1г0895, кодирующему белок с неизвестной функцией (Kaneko et al., 1996). Аминокислотная последовательность N - терминального участка (около 90 аминокислот) белка, кодируемого 0RF187, имеет высокую степень гомологии с аминотерминальными последовательностями более чем тридцати различных прокариотических белков. Функции большинства из них неизвестны. Остальные являются регуляторами транскрипции: MtrR - репрессор гена mtrc, отвечающего за клеточную подвижность у Neisseria; GusR - репрессор gusRABC оперона у E.coli; Bm3R1 - репрессор гена цитохрома Р450Вт-3 У Bacillus megaterium и т.п. Степень гомологии составляет 25%-40% идентичности и 50%~70% сходства в области сравнения, протяженностью 50-90 а.к. (Рис.4).

Аминокислотную последовательность продукта orf187 сравнивали с консенсусными последовательностями различных функциональных сайтов белков по базе данных prosis. На N-терминальном участке 0rp187 обнаружены фрагменты, более чем на 80Ж совпадающие со специфическими последовательностями ДНК-связывающих доменов белков - регуляторов транскрипции семейств tetR, lysR и lacl, а также сайт фосфо-рилирования протеин киназы С. Блике к С-концу белка находится сайт гликозилирования (Рис.4).

Семейство tetR состоит главным образом из белков репрессоров, таких как: TetR-репрессор гена tetA, AcrR-репрессор оперона асгАВ, EnvR-penpeccop оперона асгЕР, CamD-penpeccop гена сатС и др. Все белки, имеющие протяженные участки гомологии с продуктом 0RF187, принадлежат к этому семейству. Консенсусная последовательность сайта связывания ДНК этих белков приведена на рис. 4: G-[LIWPYS]-x(2,3)-[TS]-[LIVMT]-x(2)-[LIVM]-x(5)-[LIVQS]-[STAGENQH]-x-[GPAR]-x-[LIVMFMFYST]- x-[HPY]-[PV]-x-[DNST]-K-x(2)-[blVM]. В квадратных скобках перечислены аминокислоты, каждая из которых может занимать указанную позицию, в фигурных - аминокислоты, недопустимые в данном

Плазыида pFR3

pUC20

HlncII HincII Hindlll HincII

Hinani Kpnl BamHI EcoRI HincII HincII

Плазыида pPWT3

HincII Bell

Kpnl

Eco47III

Hindlll

HincII HincII

HincII

Kpnl

püc20

'0 '1 '2 '3 '4 '5

Рис 2. Рестрикционые карты плазмид pPR3 и pPWT3.

6т.п.н.

Мутация устойчивости к параквату.

17 L _ Q

109 СТА > САА Ч

1 MVSGKRLRSKSIQPSQfblbTA 61 ATGGTTTCTGGAAAAAGGCTTCGTTCCAAGTCCATCCAACCCAGGCAACTACTAACTGCG

I_I

21 ANQVIVSQGVDALTLDAVAS 121 GCTAATCAAGTCATTGTTAGTCAAGGGGTGGACGCCCTCACCTTGGATGCGGTGGCTAGT

41 EAGVSKGGLLHYFPTKEALI 181 GAAGCAGGGGTGAGCAAAGGCGGATTGTTACACTACTTTCCCACCAAGGAGGCTTTAATT

61 AGMVQQALDRFVETLHQELA 241 GCGGGGATGGTTCAGCAGGCCCTAGACAGGTTTGTGGAAACATTGCATCAGGAACTTGGC

81 NDPAPDTPGHWVRAYIRASA 301 AATGATCCAGCCCCCGACACCCCAGGGCATTGGGTTAGGGCTTATATTCGAGCCTCAGCG

101 LDDQENYELHFNLLAANFTN 361 CTAGACGACCAGGAAMmTGAACTCCATTTCAATmCTGGCCGCAAACTTCAGCAAT

121 PELLAPMRHFWQECHGQIMA 421 CCTGAAmm^CCCGATGCGACAmmGCAAGAGTGGGAraiGCAGATTATGGGT

141 SGLDPAVATVIRLAMDGLWL 481 AGCGGGCTCGATCCGGCCGTAGCAACGGTGATTCGATTAGCTATGGACGGTCTTTGGTTA

161 THLHGFAPLEDPLRS QVIAT 541 ACCCACTTACACGGTTTTGCTCCCCTGGAAGACCCCCTGCGCTCCCAGGTCATTGCCACT

181 ALKLAQL»

601 GCTCTGAMCTGGCCCAGCTATAGTTTCCCAATTTTTCATCTTTTGCCGACGTTTGGCAA

Рис. 3. Нуклеотидная и 0RF187. Молекулярная природа

аминокислотная последовательность мутации устойчивости к параквату.

Сайт

фосфорилирования протеин киназы С

Сайты связывания ДНК белков-регуляторов: сек. lysR; сек. tetR; ceu. lacl

Мутация | LxdVAxxAxVSxxGLxxYc

L Q GVxxxTLxxVxxxxxVSxGxLfxYPsTKxxI

SxK LxxAAxxxxxSQxxaAxxLxxVAxxe

*

PrqR 1 MVSGKRTBSKSIQPSQbLTAANQVIVSQGVDALTLDAVASEAGVSKGGIiLHYFPTOEALI

GusR MtrR

MiDMQmCffTmmiAAIffilPSMGFHSASMKAICIBCAISPGTLYHHPISKEAbl

MRKTKTmtfTKEHIffiAAICTFYI^Gm

Сайт

гликозилирования

NxTx

PrqR 61 AGMVQQAIJ)RFVEmQniANDPAPira)GHWmY:^

GusR 60 QAIILQDQERALARFREPIEGIHFVDYMVES...

• • t •

MtrR 59 DAbFQRICDDIEN...

Рис 4. Сравнение аминокислотной последовательности аминотерми-нального участка белка-продукта гена р^ с И-концевыми доменами белков-регуляторов транскрипции: СивИ и мггИ. : - идентичные аминокислоты. . - взаимозаменяемые аминокислоты, х - в данном положении допустима любая аминокислота. » - мутация устойчивости к параквату.

- Э

положении. Буква "х" обозначает, что на этом месте может находиться любая аминокислота. Гомология 0RF187 с данной последовательностью составляет 95.4%. Несмотря на отсутствие у продукта 0RP187 протяженных участков гомологии с белками семейств lysR и lacl, степень сходства с консервативными мотивами их сайтов связывания с ДНК достаточно высока - 86.3% и 83.4% соответствен) (Рис.4). Эти сведения позволяют предположить, что ORF187 кодирует белок - регулятор транскрипции, скорее всего репрессор. Так как мутация в ом1187 определяет устойчивость к параквату, этому гену дано название prqR (prq-паракват, R-регуляция резистентности). Аминокислотная замена Leu 17 -» Gin находится в белке PrqR в консервативной области:сайта связывания ДНК, что указывает на возможную связь функции ДНК-белкового взаимодействия с развитием устойчивости'к параквату. '

3.4. Инсерционный мутагенез гена prqR.

В целях изучения функции гена prqR, были выделены мутанты, с геном, инактивированным с помощью инсерционного мутагенеза (Рис.5).

На основе вектора pUC20 была создана плазмида рРК1, содержащая 570 н.п. Dral-Ncol субфрагмент плазмида pPWTl с включенной кассетой с геном устойчивости к канамицину из плазмиды pUC4K. Клетки штамма дикого типа цианобактерий трансформировали пла-змидой рРК1 по признаку устойчивости к канамицину. В результате гомологичной рекомбинации между плазмидой рРК1 и хромосомной ДНК Synechocystis 6803 происходит замещение аллеля дикого типа гена prqR мутантным аллелем. Для получения гомозиготных мутантов проводили отбор сегрегантов путем последовательных пересевов инсерционных мутантов на средах, содержащих повышающиеся концентрации канамицина. О полной сегрегации судили с помощью Саузерн-блот гибридизации расщепленной рестриктазой Hpai хромосомной ДНК инсерционных мутантов с зондом, представляющим собой 1.3 т.п.н. фрагмент плазмиды pPWTi. Были выявлены гомозиготные инсерционные мутанты, в клетках которых все копии гена prqR содержат вставку кассеты с геном Кшг.

Фенотип инсерционных мутантов совпадал, с фенотипом мутанта Prq20. Эти мутанты обладают повышенной устойчивостью и к параквату и к DCCD (Табл.2)

На основании этих данных можно сделать следующие вывода: устойчивость к параквату является следствием утраты .активности бежа PrqR; аминокислотная замена 1еи17 Gin приводит к инактивации PrqR-бежа; клетки цианобактерий, лишенные PrqR-бежа, сохраняют жизнеспособность.

Sinai

Dral

Eco47III

Ncol Eco47III HincII SphI

prqR

Ball

0RF461

Dral

Sali HncII

Pstl

//////////////,

KmT////;

v////////

Pstl Sali HincII

Кассета с Кшг- геном из плазмида pUC4K

Есоч/47111 HinxcII

Pstl

I

ec0v/47iii HincII н1лсП

Pstl

PrqR

ffi

KnF/

ffi

Ncoll EC047III

X

"1-1 I-1-1 г

~Л-г

1-1-1-1-1-1--1-г

1000 н.п.

Рис. 5. Получение инсерционного мутанта Synechocystis 6803 с инактивированным геном prqR.

4. Молекулярный анализ гена, контролирующего устойчивость к параквату, клонированного в составе плазмида pPR3. 4.1. Определение нуклеотидной последовательности гена, клонированного в составе плазмида pPR3

Секвенирование 2.4 т.п.н. Hindi фрагмента плазмида рРтаз выявило в нем наличие открытой рамки считывания 0rf462 (Рис.6), а также участки двух других открытых рамок считывания.

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности ORP462 с последовательностями в международном банке EMBL показал, что ORP462 является новым геном, имеющим существенную гомологию с прокариоти-ческими и эукариотическими генами, кодирующими белки, принадлежащие к недавно открытому новому классу карбоксил-терминальных про-цессирующих протеаз. Выявлено два типа таких ферментов: протеазы, ctpA, осуществлящие процессинг DI белка фотосистемы II, и протеазы Pre, участвующие в деградации укороченных белков и белков, поврежденных тепловым шоком. Белок, кодируемый 0RF462, имеет два консервативных мотива, необходимых для функционирования протеаз

1 ОТСОСССАТТаСАТССОАСтАСТАтОТСТОССТСССТТТаАССТАСССЯРСССТТСС

1 ИБРНЬЬСЬБРЬУААЬУРСЬС

61 АТС^стссссАттстстстасстсстсстссссттАстсотсссттсст

61 ЬСТАЬЙРАЬБАРЫУХНРВБР

121 ТТССССАСТССССТСАСССССаСССТСАССССТСССААССТСАТСААСССССАТАаТССТ

41 ТЬАТРКБКВБСУБВНУТЬЬЕ

181 АССТТСЮССАСГССССАА(К;АСАААСАТАСТССТСТАТСССАТААССТТАСССТССТССАА

61 НБРКАУУВЕУИОЬУЫООРУВ

241 ААТАСТССШтеСАСТКТССАТСАССТАШгСАОтаТСААТСАССААТТТСТТСАТ

81 КВРННБНИЬБКВОЕЬЬСКЫУ

301 ААОСАСТтАССАИССААСЖХгТТСТССАААССССАССААттССССССААТТАС

101 ОВЫАЕАУКЦ 1СК1ЬКБЬНБР

361 САСШТААШЖ;АСС(т!АСССАСШТТСХСССАТАТТСААССА1ТТСААТСАСССС

121 УТВРЬБРЕЕРА 1ЬББ(}ТБСЕ

421 ТАТАССССТТТТСТСТСТССССАССААТТТСССАТССТСАССАСТСАААСАТСАССССАА

141 ASGVGIRVI.MDKRSSDI.VVV

481 ОЗТТСС«ИМТАССААТСССССТСТТСАТ(К;АТАААССТАСТАОТСАТтаССТССТССТС

161 БУМКСТРАЬКАС1КРС

541 САТСТСАТСССКХ&САССССОССТТТСАААССАСССАТТСССССТССССАТСССАтТС

181 RINGQPAAI.MSI.EQA "Т~Е~"1" I О

601 СССАТСААТООССААССтеССССТТТСАТСТССТТССАССААСССАСАСАСССААТТСАА

201 СЕ1СТЕЬ5Ь0ЬБНРКБСУРБ

661 СССЮАСАТТтеСАСССМтАСССТССААСТТТССССССССААААССССТСИТТСАСТ

221 УТЬККЕЫ1Е1ВБУТУЫУКЕЕ

721 СТСАСССТСАААССАСААААТАТССАААТТСАТТСТСТСАССТАТААССТСААССААСАА

241 СЕЬКУСУ1КЬБЕРБЗНБАЕ0

781 ССССААТТАССССТСКХ;СТАОАТСССССТОСАТСААТТТАОСТСССАТТССССТСАССАС

261 НЕКА1ТЕЬЫКБК1БСУУЬ0Ь

841 АТССААААССССАИ:АСССААСТСААТААААСТСССАТТАСССССТАТОТССТАСАССТА

281 КСЫРС0ХЪЪББ1В1АКЬ1ЬЫ

901 СССЮТААСССАСтЖСТТСТТАСТТТССАаСАТТСАСАТТОССССТСТСТСССТСААС

301 КСЕ1УБТ1ВКЕ0СБННРБАН

961 ССКИК^АМТССТСАСТАСТАтАСССССССССАСССОАТССССАТТТТТСАСССААС

321 СНБЬТБЪРЬУУЬ ~7~1Г"Е" И Б А Б А

1021 СССАСААСТСТСАСССАТТТАСССТТАаТССТСтаССТТААТСАССССТСССССАСТССС

341 БЕ1ЬАСАЬКЕ()СКАТУУСТА

1081 АСТСАААТТО^СССССССАтАААСААСАСССААСССССАСССТССТСССТАСЖССТ

361 ТУСКСТУОБУЛТЬБ В~С"5~~С Ь А

1141 АСШТСККАМССТАСССТССМТСССТТМСАСТТТОТСССАССССТССОСТтаОССй

381 УТ1АИУУРРБСТВ1НККС1Б

1201 СТТАССАТТССТССТТАСТАТССССССАСТСССАСССАСАТТААТСОААААСССАТСАСТ

401 РБ1НЬБ1БНБТК1|(5Р11ЫВРЕ

1261 ССССАСАТТСАТТТССАТА!т!ССААССАТАССААССТАСАСТТТССТААССАСССАСАД

421 ЬМАТЕ1ВР0У0КА13УЬИ0Н

1321 ОтТССССАСССАСАтАТССССАСТАТСАССССССТАтСТСТСТТСССССААСАТ

441 КНБЬСЬРРАКВЬС I БЬЬЕРБ

1381 ССССАТАСССТСССССТССССССССССАААСАССТССССАТАСССТТАТТССАСОССАСТ

461 О Ь *

1421 саасттттсамттссссастаааасамтстсосасийтттсссаасссаосссттс

Рис. 6. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности 0ИР462. Подчеркнуты олигонуклеотидные повторы.

данного класса LDLRxNPGLLL (279-2Э9а.К. ) И ASASEILAGAL (339-349а.к. ). Аминокислота лейцин 345 вовлечена в активный протеолити-ческий центр (Pakrasi et.al., 1995). На основании этого анализа белок, кодируемый 0RF462, был отнесен к классу карбоксил-терминальных протеаз, а он?462 названа геном ctpB и зарегистрирована под индивидуальным номером Х96490 в международном генетическом банке емвь.

В 1996 г. стала известна нуклеотидная последовательность всего генома цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (Kaneko étal., 1996). Из анализа этого геномного банка (Cyanobase) следует, что у данного штамма имеется три сходных, но не идентичных гена: ctpA, ctpB и pre. Гомология CtpB и CtpA составляет 40.7% идентичности и 79.4% сходства на сравниваемых участках протяженностью 370 аминокислот. В отличие от CtpA у белка CtpB на N-конце отсутствует лидер-ный пептид, характерный для белков, транспортирующихся через мембрану тилакоидов. Гомология CtpB и Pre составляет 47.4% идентичности и 91.6% сходства на участке 382 аминокислот (Рис.7).

4.2. Изучение природа устойчивости к параквату, связанной с

плазмидой pPR3.

Минимальный трансформирующий Hindlli-Hincil фрагмент плазмида pPR3 (Рис.1Б) соответствует центральной области гена ctpB. В результате секвенирования 690 н.п. HindIII-HincII фрагмента плазмида рРНЗ мутацию устойчивости к параквату в 0КР462 идентифицировать не удалось. Причина, по которой плазмида рРЗДЗ трансформирует Synechocystis 6803 по признаку устойчивости к параквату, остается неясной. Возможно, при трансформации происходит инактивация гена ctpB в результате интеграции плазмиды рРЗДЗ в хромосому штамма дикого типа Synechocystys 6803 вследствие одного акта кроссинговера. (Рис.8) В таком случае в хромосоме могут образоваться две неполные копии 0RF462. Одна содержит N-терминальную и центральную область открытой рамки считывания, а другая - центральную и с-терминальную. Кроме того, ген ctpB содержит много олигонуклеотидных повторов (Рис.6): 2 разновидности десяти-нуклеотидных, 6 - девяти-нуклео-тидных и 15 - восъми-нуклеотидных совершенных прямых или инвертированных. В их числе - палиндромы ggcgatcgc, которые особенно часто встречаются в геноме цианобактерий. Известны -случаи их участия в хромосомных перестройках - делениях (Robinson et al., 1995). Обилие повторов на относительно коротком (1386 н.п.) фрагменте ДНК может способствовать неравному кроссинговеру между хромосомой и плазмидой рРЗДЗ в ходе трансформации, что может

ЗхрВ 1 MSPffliCnffLVAALVFGKKTAIJU'ARSAPNVINPDSPTMTPKDKDSGVSDNVTLI

Pre MLK(^LILGTTAIIJ.mAVTGVGLKLARSQGYi

• • • •

CtpA HGKRTRRPWAiipSliilGALiYKNTPSAL

CtpB 61 -NSPKAVVDEVWQLWQQFVDKD^iSl^jSKRQEII^RHYQDNAEAYRQIGRIIMILN Pre 38 -DOTmTOEWQmRri^ CtpA 32 FiEE^^iLQSffKLTOQSYLDEE^

CtpB 120 PYTRITjSPEEPAILSSLEQATEAIQGEIGTSQTSGEASGVGIRVLMDKRSSDLVVVDVM • •••••••• • » • •• •••« •••• • •••

Pre 97 PYTRiMSPDEroSWRE^ CtpA 92 PFTRliiiPEQTCN^

CtpB 180 GTPAIiKAGIRPGDRIVRINGQPAAIiiEbSLQLSRPKSGVF—SVTLKRENIEIDSVTYN1 Pre 157 DTPAYNAGILSKDviTKn^—¿YPLTRTbiEiHPVRAQ1

• •

CtpA 152 GSPAEEAGI^fflXlIMireVDTQTLKVSLEILS-AGTEVPQEFTLTRQLISLSPVAAQ:

i-1

CtpB 238 KEE—GE^VGYIRLDEFSSHSAEQMEKAITELNKSRISGYVLDLRGNPGGLLLSSIDL

Pre 214 mm-G-ARVGYiMijQPSAQASE^

• • • • t • til ••( *•••«« • i

CtpA 211 DDSroG-QSVGYiraS&SM^^

I_l

I-1

CtpB 296 RLWmGEIVSTIDRRGGDRHFSANGRSLTDLPLVVLVNERSASASEILAGALKEQGRA'. Pre 272 RiraEGGIVSTTOraGitfE^^ CtpA 271 i&*n>ESTi7YTVreQGT(^FTA^

I-1

CtpB 356 7VGTAmKGTV(^VNTLSDGSGMVTIARYYPPSGTDINi«GISPDIHIJ)ISNimaQI

Pre 332 HGTKijGKGLVQSVm^

• • ••••••• •• •• • • • i • « •• •• * * • •• ••

CtpA 331 LVGEKffGKGLi&iraii^

CtpB 416 RNDPEUiATEIDPQYQRAISVLRQHRHSLGLFPAKDLGIGLLEPSQL

• • ••• •• •••

Pre 392 QQNRi^GiliEDP^ARAYEvi^QVNIOTASK CtpA 391 TSPADVQYQAALDLLTGGVAIAHKSSSIPAM

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей С-терми-нальных протеаз CtpB, Pre и CtpA цианобактерии Synechocyetie 6803. Выделены консервативные последовательности в области активного центра.

: - идентичные аминокислоты; . - взаимозаменяемые аминокислоты.

Плазмида II рРЗДЗ I-> ctpB ^-1

Хромосома Synechocystis ctpB

6803 ^

pUC20

X .......................... Рекомбинация

ctpB ^ ~~ ctpB

X.

Рис. 8. Предполагаемый механизм инактивации гена ^рВ при трансформации штамма дикого типа БупесЬосувиз ер. РСС 6803 по признаку устойчивости к параквату.

привести к инактивации гена ctpB. У рассматриваемых в следующем разделе инсерционных мутантов по ORF462 было обнаружено повышение устойчивости к параквату, что согласуется с предположением о возможной инактивации гена ctpB при трансформации.

4.3. Инсерционный мутагенез гена ctpB.

Для изучения функций гена ctpB были созданы мутанты, у которых этот ген поврежден в результате введения кассеты с геном устойчивости к канамицину (Рис.9). Для инактивации гена ctpB были получены плазмиды рРК2 и рРКЗ, являющиеся производными плазмиды РРЗД4, содержащей 960 н.п. Hindlll - Hindi субфрагмент плазмиды pPWT3. При создании плазмиды рРК2, из рРЗД4 был вырезан 700 н.п. Ball фрагмент, кодирующий участок протеазы ctpB от Glyi84 до А423, (несущий активный центр фермента), а на его место встроена кассета с геном Ктг из плазмиды puc4k.

Для получения мутантов по гену ctpB штамм дикого типа Synechocystis 6803 трансформировали плазмидами рРК2 и рРКЗ по признаку устойчивости к канамицину. В целях сегрегации генов полученные ктг-трансформанты несколько раз- пересевали на средах, содержащих повышающиеся концентрации антибиотика. . Таким образом было получено 10 делеционных (ctpBKdel) и 5 инсерционных (ctpBins) независимых мутантов.

С помощью Саузерн-блот гибридизации хромосомной ДНК, расщепленной рестриктазой Hindi, с зондом, з качестве которого использовался 2 т.п.н. Hindi фрагмент плазмиды рРТОЗ, было показано, что у всех делеционных мутантов произошла полная сегрегация мутантного

А.

Kpnl

EC047III Bell

Kpn21

HindHI I Ball

Hpal

HlncII HincII EC01325 | Ball I SepI HincII

ctpB

0RF210

B.

Eco1325 Hpal/HincII

/-L-*-1-/-

Kpnl

Hindi

EC047III Bell

Kpn21

Hindlll

Hpal HincII

HincII

Ball EC01325 I Ball I Sspl HincII

ctpB

0RF210

PstI Sail

HincII

N PstI Sail

s/////////// tsF/////,-■//////

F

HincII

B^I

EC047III H^cII Bell Hindlll Kpn21I

PstI

ctpB

ffi

PstI

H^^cII

HincII SepI

///////////

Kltfv

X

0RP210

цаештаб

I—;—i—i—г

T-г

"1-1-1-1-г

"Г-1-1-1-1-

2т.п.н.

Рис. 9. Получение: А) инсерционных - CtpBins и Б) делеционных -CtpBKdel иутантов SynechocyBtiB 6803.

аллеля гена ctpB. Таким же образом полная сегрегация мутантнога аллеля гена ctpB.ßiua подтверждена и для инсерционных мутантов, хромосомную ДНК которых расщепляли рестриктазой KpnI. -* •••

Поскольку ген ctpB был идентифицирован во фрагменте ДНК, ответственном за признак устойчивости к параквату, все полученные делеционные и инсерционные мутанты проверялись"" на устойчивость к этому гербициду. Оказалось, что оба типа мутантов обладают повышенной устойчивостью к параквату, но уровни резистентости невелики: минимальная ингибирующая концентрация параквата составляет 7мкг/мл у делеционных мутантов и 10мкг/мл у инсерционйых по сравнению с 5мкг/мл гербицида для клеток штамма дикого типа. В этой связи необходимо отметить, что среди спонтанных паракват-резистентных мутантов, отобранных на агаризованной среде' с паракватом, большинство обладает только полутора-двухкратной устойчивостью к этому гербициду. Природа клеточных систем, участвующих в обеспечении такой устойчивости, в настоящее время неизвестна.''Не исключено, что некоторое повышение резистентности к параквату может быть побочным следствием изменений в процессах, связанных с функцией протеазы CtpB. Проверка инсерционных и делеционных мутантов по гену ctpB на устойчивость к ряду других- гербицидов и ингибиторов выявила у них наличие высокой устойчивости к фенилметилсульфонил фториду -- ингибитору сериновых протеаз (Табл. 2). Клетки делеционного ctpB - мутанта растут на твердой среде с ингибитором в концентрации 2,5 мкг/мл, инсерционного - 1.5 мкг/мл, тогда как пороговая концентрация этого ингибитора не превышает 0.1 мкг/мл для штамма дикого типа Synechocystis 6803- Поскольку CtpB не является типичной сериновой протеазой, можно предположить, что функция ctpB-белка связана с действием другой сериновой протеазы, участвующей в одной общей цепи протеолиза. 1 ''

Фенотипическое изучение мутантов по гену ctpB показало, что они отличаются от ctpA и pre - мутантов. Инсерционные мутанты Synechocystis 6803 по гену ctpA не' способны' к фотосинтезу й ' нуждаются для своего роста в глюкозе (Shestakov et al., 1994). Однако, как инсерционные так и делеционные" мутанты по гену ctpB нормально растут на свету в отсутствии глюкозы. Мутанты е.coli по гену pre обладают повышенной чувствительностью к температурному' ;й осмотическому шоку (Keiler et-ai:', 1996), но "ростовые характеристики мутантов по гену ctpB в условиях повышенной температуры или осмотического давления (NaCl, маннитол, сорбитол) не отличаются от таковых у штамма дикого типа Synechocystis 6803. Из вышеизложенного

Таблица 2. Свойства инсерционних мутантов.

селективный агент Минимальная ингибирущая концентрация.

Д.т. PrqRKins CtpBKlns

паракват (мкг/мл) 5 15 10

DCCD (мкг/мл) 15 30 *

ФМСФ (мкг/мл) 0,1 * 1.5

новокаин (мкг/мл) 100 * 40

ДМСО (мг/мл) 20 * 5

глицерин (мг/мл) 70 * 0,01

* - чувствительность мутанта к данному веществу совпадает с чувствительностью штамма дикого типа. ФМСФ - фенилметилсульфонил фторид; ДМСО - диметил сульфоксид.

следует, что функция ctpB отличается от функций других известных С-терминальных протеаз. Вместе с тем, инсерционные ctpB-мутанты обладают повышенной чувствительностью к глицерину и мембранотропным агентам (новокаин, диметил сульфоксид - табл.2), что указывает на возможную роль ctpB-белка в организации мембранных структур.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе получены новые сведения о возможных механизмах резистентности цианобактерий к гербицидам. Ранее сообщалось, что повышение устойчивости к параквату может быть обусловлено изменениями в фотосистеме I (Endo, Asada 1992) или в ферментативных системах, защищающих клетки от окислительного стресса (Bowler et al., 1992). У полученных нами мутантов Synechocystie баоз развитие резистентности к параквату, по-видимому, не связано с изменениями в этих системах. Результаты клонирования и молекулярного анализа генов, мутационная инактивация которых приводит к повышению устойчивости к параквату, свидетельствуют о существовании иных, ранее неизвестных механизмов резистентности, связанных с функциями белков, участвующих в протеолизе и в специфической регуляции транскрипции генов в фотосинтезирующих клетках.

выводы

1. Получены спонтанные мутанты цианобактэрии Synechocystis sp. FCC 6803,- устойчивые к гербициду параквату, в том числе мутант Prq20, устойчивый как к параквату, так и к дициклогексилкарбо-диимиду (DCCD) - ингибитору протонного транспорта. -

2. Клонированы два фрагмента хромосомной ДНК мутанта Prq20, трансформирующие штамм дикого типа Synechocystis ср. РОС 6803 по признаку устойчивости к параквату. В составе клонированных фрагментов ДНК идентифицированы гены prqR (0RF187) И ctpB (0RF462), контролирующие устойчивость к параквату.

3. Белок, продукт гена prqR, имеет гомологию с белками регуляторами транскрипции семейства tetR. В аминотерминальной области prqR белка обнаружены сайт связывания с ДНК и сайт фосфорилирова-ния, характерный для протеин киназы С. ,.

4. Установлена молекулярная природа, мутации устойчивости к параквату и DCCD в гене prqR. Это трансверсия А ■» т, приводящая к замене гидрофобной аминокислоты лейцин 17 на гидрофильную - глута-мин в высоко консервативной области сайта связывания с ДНК.

5. Получены инсерционные мутанты с инактивированным геном prqR. Они устойчивы к параквату и dccd, из чего следует, что устойчивость к параквату возникает в результате утраты функции гена prqR.

6. Ген ctpB кодирует белок, принадлежащий к недавно описанному новому классу карбоксил-терминальных процессирующих протеаз. Нукле-отидная последовательность гена ctpB зарегистрирована в международном банке EMBL под номером Х96490.

7. Инсерционные и делеционные мутанты по гену ctpB обладают повышенной- устойчивостью к параквату и ингибитору протеаз - фенил-метилсульфонил.фториду. Предполагается, что развитие устойчивости к параквату у этих мутантов может быть связано с изменениями в про-теолитической функции ctpB-белка.

Список публикаций

1. S.Shestakov, V.Bartsevich, I.Elanskaya, E.Chesnavichene, K.Sidoruk. Cloning and molecular analysis of genes involved in the resistance to some herbicides in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.// Abstr. VIII Int. Symp. on Phototrophic Prokaryotes. Urbino, Italy. 1994. P. 41a.

2. Шестаков C.B., Сидорук K.B., Чурин Ю.Н., Шахнабатян Л.Г. Выделеше генов устойчивости к гербицидам. Тезисы докладов V Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия". Москва, 1995г. стр. 105.

3. Сидорук К.В., Шестопалов В.И., Бабыкин М.М., Шестаков С.В., Клонирование и молекулярный анализ гена ctpB, кодирующего карбоксил-терминальную протеазу у цианобактерий. Тезисы конференции "Автотрофные микроорганизмы". Москва, 1996г. стр. 53.

4. S.Shestakov, К.Sidoгик, H.Pakrasi, R.Oelmuller, R.Herrmann Analysis of ctpA and ctpB genes encoding C-terminal processing proteases. // Abstr. German - Russian Cooperation in Biotechnology Workshop IV; Plant Molecular Biology, Genetics and Biotechnology. St. Petersburg, 1996. p.45.

5. Сидорук К. В., Шахнабатян Л. Г., Белавина Н. В., Эрнст А., Сталь Л., Галлон Д., Шестаков С. В. Мутанты одноклеточных цианобактерий, устойчивые к ингибиторам, индуцирующим окислительный стресс. Вестник МГУ, Серия 16, Биология. 1996, *4, стр. 43-49.

6. Sidoruk К., Shestopalov V., Babykin М., Shestakov S. Nucleotide sequence of a new member of the carboxyl-terminal processing proteaße family in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant. Physiol. 1996, v.111, p. 947.