Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ кластера генов, контролирующих устойчивость к метилвиологену и фототаксис цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803
ВАК РФ 03.00.15, Генетика
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ кластера генов, контролирующих устойчивость к метилвиологену и фототаксис цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803"
На правах рукописи
Кирик Инесса Анатольевна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛАСТЕРА ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ УСТОЙЧИВОСТЬ
К МЕТИЛВИОЛОГЕНУ И ФОТОТАКСИС ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCYSTIS SP. РСС 6803
Специальность 03.00.15 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2006
Работа выполнена на кафедре генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат биологических наук
Бабыкин Михаил Михайлович
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук кандидат биологических наук
Лось Дмитрий Анатольевич Полуэктова Елена Ульриховна
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095) 132-89-62.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д. 3.
Автореферат разослан « »_2006 г.
Защита диссертации состоится «_».
2006г. в_ч. на заседании
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук
Г.Н. Полухина
jUz<?£ А
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Процессы аэробного дыхания и оксигенного
фотосинтеза сопряжены с образованием активных форм кислорода (АФК), таких
как синглетный кислород, анион-радикал супероксида (02"~)> пероксид водорода и
гидроксильный радикал. Эти токсичные соединения способны индуцировать в
клетке окислительный стресс (ОС), повреждая нуклеиновые кислоты, белки и
мембраны. У фотосинтезирующих организмов образование 02-~ происходит в
основном за счет прямого восстановления кислорода фотосистемой I. Мощным
ингибитором роста фотосинтезирующих организмов на свету является гербицид
паракват, или метилвиологен (MV), способный эффективно акцептировать
электроны от фотосистемы I и восстанавливать кислород до Ог". Образование
АФК может также стимулироваться различными факторами внешней среды, в
частности, повышенным освещением, экстремальной температурой, а также
нарушением водного и солевого режимов. Цианобактерии и растения обладают
эффективными механизмами адаптации к изменению интенсивности света,
которые позволяют оптимизировать фотосинтез и ограничить повреждения,
связанные с фотоокислением. Одним из таких механизмов является фототаксис
цианобактерий и хлоропластов растений, положительный - к свету, и
отрицательный - от света высокой интенсивности.
С помощью геномного анализа и современных методов биоинформатики у
модельной цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis)
установлено наличие не менее 15 генов, кодирующих белки с антиоксидантными
функциями. Вместе с тем выявлено около 150 регуляторных генов; почти половина
из них кодирует транскрипционные регуляторы, у большинства из которых
функции предполагаемы или неизвестны (CyanoBase Website). Значительная часть
регуляторных генов (80 генов) представляет двухкомпонентные системы, которые
в клетках прокариот контролируют различные адаптивные ответы, такие как
хемотаксис, осморегуляцшо, споруляцию, развитие компетентности при
трансформации, патогенность, вирулентность и др. В последние годы
представления о координированной экспрессии генов фотосинтезирующих
организмов в ответ на стрессовые воздействия существенно расширились
благодаря использованию метода ДНК-микрочипов (микроэррэй-анализ
транскрипции ДНК), позволяющего оценить степень активации или репрессии всех
генов организма. С помощью данного подхода исследованы глобальные изменения
экспрессии генов Synechocystis при солевом, гиперосмотическом и холодовом
шоке, при адаптации клеток к высокой интенсивности света и обработке их MV и
пероксидом водорода. В результате выявлены целые ансамбли генов,
специфически реагирующие на различные стрессовые воздействия. В связи с этим
, ¡¡РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ
1 БИБЛИОТЕКА
С.-Петербург
__оэ ?ПГ)6ЯКт в'ФЪ
идентификация функций генов, вовлеченных в регуляцию работы систем жизнеобеспечения, в том числе защитных, у цианобактерий, является актуальной задачей современной генетики.
В нашей лаборатории показано, что в контроль устойчивости клеток Зуяее/госу^гй к индуктору ОС МУ вовлечен ген ргдЛ, кодирующий регулятор транскрипции семейства ТеШ (Бабыкин и др., 2003). Этот ген негативно контролирует оперон ргдЛ-ргдА, в котором ген ргдА кодирует белок с предполагаемой функцией №7МУ-антипортера. Более того, выявлено индуцируемое МУ усиление авторепрессии гена ргдЯ, сопряженное с существенным повышением транскрипции других генов с защитными функциями: зос1В, кодирующего супероксиддисмутазу, и пшА, кодирующего предполагаемый белок-транспортер токсичных соединений (Нефедова и др., 2003). В данной работе нами показано, что мутация в гене ргдК обуславливает отрицательный фототаксис клеток, независимый от интенсивности света. Таким образом, ген ргдЯ вовлечен в контроль систем адаптивного ответа цианобактерий на ОС и изменения интенсивности света.
Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение механизмов генетической регуляции защитных систем цианобактерий с участием гена ргдК и генов, входящих с ним в один кластер. Для достижения указанной цели решали следующие задачи:
1. Молскулярно-генетический анализ авторегуляторной функции гена ргдК с помощью сайт-направленного мутагенеза и генов-репортеров.
2. Выявление стрессового фактора или возможного индуктора, стимулирующего экспрессию оперона ргдЯ-ргдА, истинная защитная роль которого в клетках цианобактерий требует выяснения.
3. Анализ методом ДНК-микрочипов изменений в тотальном профиле транскрипции у мутантов с нарушенной функцией ргдЯ для обнаружения новых генов, экспрессия которых контролируется геном ргдК.
4. Функциональный анализ генов, входящих в один кластер с геном ргдЛ (¡110887, з110886 и ргдА), для установления их роли в регуляции фототаксиса у цианобактерий.
Научная новизна. Получены новые данные о регуляторной функции гена ргдЯ и характере экспрессии оперона ргдЯ-ргдА, вовлеченного в контроль устойчивости клеток к индуктору ОС МУ. Выявлено, что репрессорная функция белка Р^К обеспечивается как Ы-концевым ДПК-связывающим доменом, так и С-концевым доменом. Установлено, что ген ргдА может транскрибироваться как с промотора оперона ргдК-ргдА, так и с собственного конститутивного промотора.
Впервые показано, что солевой стресс на ранней стадии развития стимулирует в клетках цианобактерий существенное повышение экспрессии оперона ргдЯ-ргдА. Это указывает на защитную роль белка РщА при адаптации клеток к солевому стрессу.
Впервые установлено участие генов ргдЯ и 5110886 в контроле фототаксиса цианобактерий. Также впервые показано, что ген ргдК вовлечен в регуляцию экспрессии генов, продукты которых необходимы для функционирования пилей, обеспечивающих подвижность клеток.
Впервые для изучения поверхностных структур клеток цианобактерий был использован новый метод атомно-силовой микроскопии, имеющей ряд существенных преимуществ по сравнению с традиционной электронной микроскопией. Этот метод позволяет эффективно выявлять изменения в морфологии пилей, обеспечивающих подвижность цианобактерий.
Научно-практическая значимость работы. Данные, полученные в работе, значительно дополняют сведения о системах устойчивости клеток фотосинтезирующих организмов к окислительному и другим видам стресса. Выявленные новые механизмы генетического контроля устойчивости клеток к стрессовым воздействиям могут служить основой для разработки практических подходов к конструированию трансгенных растений с повышенной резистентностью к неблагоприятным факторам внешней среды.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены: на международном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Москва, 2001 г.); на III Съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров ВОГиС (Москва, 2004 г.); на всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005 г.); на семинаре кафедры генетики МГУ (протокол № 04-06, 2006 г.); на межлабораторном семинаре "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" (ИОГен им. Н.И. Вавилова, 2006 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на ДО страницах, состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы» и «Результаты и обсуждение», заключения, выводов, списка литературы, включающего 194 источника, и _1_ приложения. Работа содержит 27 рисунков и 7_ таблиц.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Российского фонда фундаментальных исследований (№99-04-48291, №01-04-48081, №02-04-48398, 0504-49371) и ФЦП «Ведущие научные школы» (№00-15-97791; №4202.2006.4).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Питательные среды и культивирование микроорганизмов. Клетки E.coli инкубировали при 37°С в жидкой или плотной (1,5% агара) среде LB (Миллер, 1976).
Клетки Synechocystis выращивали как в жидкой, так и агаризованной (1% агар Difco) среде BG11 (Ripka et а!., 1979) при температуре 34°С и интенсивности света широкого спектра около 75 мкмоль фотонов-м"2-с_|. Клоны-трансформанты Synechocystis отбирали на BG11-агаре, содержащем MV (3 мкг/мл), Km (10 мкг/мл) или Gm (2 мкг/мл), а трансконъюганты - на среде с Gm (2 мкг/мл) или Sm (1 мкг/мл). Для выполнения условий, эквивалентных тем, что обеспечивают свето-активируемый гетеротрофный рост (LAHG) цианобактерий, клетки инкубировали в жидкой или агризованной среде в присутствии 5 мМ глюкозы и при постоянной освещенности 0,25 мкмоль фотонов'м"2*с"' (Kong et al., 2004). В тестах на подвижность клеток Synechocystis (фототаксис) использовали агаризованную среду BG11 (0.8% агар Difco), содержащую 5 шМ глюкозу.
Трансформацию клеток проводили стандартными методами. Клетки Е. coli трансформировали, как описано у (Манниатис и др., 1984), а клетки Synechocystis в логарифмической фазе роста смешивали с ДНК, инкубировали 20 час в стандартных условиях и высевали на селективные среды.
Обработка ДНК ферментами. Рестрикционный анализ и конструирование рекомбинантных ДНК проводили стандартными методами (Манниатис и др., 1984).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР использовали для амплификации и клонирования участков хромосомы, сайт-направленного мутагенеза и анализа сегрегации мутантных копий гена с делецией или инсерцией в клетках Synechocystis (имеет до 12 копий хромосомы на клетку; Labarre et al., 1989).
Сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР проводили с использованием набора "Quick-Change Site-Directed Mutagenesis Kit" фирмы "Stratagene" согласно прилагаемой инструкции.
Определение последовательности нуклеотндов в ДНК выполняли сотрудники группы автоматического секвенирования Центра коллективного пользования при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.
Получение специфических ДНК-зондов и Нозерн-блот-гибридизацию проводили по стандартным методикам (Манниатис и др., 1984).
Анализ профилей транскрипции в клетках Synechocystis с помощью ДНК-микрочипов проводили как описано в работах (Inaba et al., 2003; Suzuki et al., 2001).
Атомно-спловая микроскопия. Анализ поверхностных структур клеток проводили с помощью атомно-силового микроскопа Nanoscope Illa (Digital Instruments, USA) в контактном и полуконтакгаом режимах сканирования. Анализ изображений клеток и их поверхностных структур осуществляли с помощью программы ФемтоСкан Онлайн (Filonov et al., 2001).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ С-концевой участок необходим для функционирования белка PrqR в качестве репрессора транскрипции
Ранее было установлено, что ген prqR контролирует устойчивость к MV клеток Synechocysíis, негативно регулируя транскрипцию оперона prqR-prqA (Бабыкин и др., 2003; Нефедова и др., 2003). Репрессорная функция белка PrqR согласуется с наличием в его N-концевом участке ДНК-связывающего домена, характерного для белков-репрессоров семейства TetR. Известно, что система teíR-tetA, контролирующая устойчивость к тетрациклину (Тс) у грамотрицательных бактерий, индуцируется антибиотиком. В результате взаимодействия с Тс белок TetR инактивируется, что приводит к дерепрессии гена tetR и гена tetA, кодирующего Н+/Тс-антипортер (Hillen, Berens, 1994). Однако MV, развитие устойчивости к которому связано с функцией гена prqA, не индуцирует экспрессию оперона prqR-prqA, а, напротив, даже усиливает авторепрессорную активность белка PrqR в клетках штамма ДТ Synechocysíis (Бабыкин и др., 2003). Таким образом, для выяснения истинной клеточной функции оперона prqR-prqA важно идентифицировать природу индуктора, стимулирующего и экспрессию этого оперона, и повышение соответствующей устойчивости у цианобакггерий. Между тем не меньшее значение может иметь информация о молекулярных механизмах репрессорной активности белка PrqR. С этой целью авторегуляторную функцию гена prqR исследовали с помощью сайт-направленного мутагенеза и генетического анализа взаимодействия аллелей с использованием рекомбинантных плазмид и генов-репортеров.
Поскольку MV, генератор супероксида, модулирует авторегуляторную функцию гена prqR (Бабыкин и др., 2003), нельзя было исключать, что белок PrqR является редокс-чувствительным регулятором транскрипции. Этот белок содержит единственный остаток цистеина, Cys-134 (С 134), расположенный в С-концевом участке. Было предположено, что С134 - редокс-чувствительный центр, при окислении которого между двумя молекулами белка PrqR образуется дисульфидная связь, инициирующая димеризацию и активацию белка PrqR в качестве репрессора транскрипции. Для выяснения функциональной значимости
остатка С134 в С-концевом участке белка РгцЯ с помощью сайт-направленного мутагенеза заменили цистеин на серин (С 1348). Чтобы определить участвует ли С-концевой домен белка РгцЯ в обеспечении функции репрессора транскрипции, в ген ргцК ДТ ввели мутацию С134й, вызывающую сдвиг рамки считывания, начиная с нуклеотида 400 в кодирующей области гена. Для решения этих задач использовали рекомбинантную плазмиду pW6 на основе вектора рТ218Я, в составе которой клонировали 5атН1-5р/г1-фрагмент (1,3 т.п.н.) хромосомы штамма ДТ БупесИосузШ, содержащий ген ргдЯ и начальный участок гена рщА (рис. 1). Ген ргдЯ с мутацией Ы7(3 из генома устойчивого к МУ мутанта ?щ20 клонировали аналогичным образом в составе рекомбинантной плазмиды рР7 (рис. 1).
fs М гч
, II
SU08S6
Uii
. fM-
ж
ж
XX
— I - pW6
\1_П _ pKW6 [-cat ], Acat н. pdKW6 - W.'S[-cai-oacCll
C1MS
t
-СГ J - pcs1
P> -|j - pKCSI [-cut 1, Л c ol -> pdKCSI
- RCS1 l-cal-aacCJ]
_ pCS3
- pKCS3[-cat ], ¿cot -> pdKCS3
- RCi3[-cal-aacCl]
"Ufsjj \—П - p№7 [<at 1, bcrt -> pdKPT
■ rvrl-eai-wcCl] ^ >—J " W>'6d yal-aacCJ]
ь4
RNml-cataacCl}
Рис. 1. Физическая карта участка хромосомы Synechocystis, содержащего гены sU0886, prqR и prqA. Показаны фрагменты ДНК, клонированные в составе рекомбинантных плазмвд на основе векторов pTZ18R (р-производные), рКК232-8 (рК- и pdK-производные) и R30 (R-производные); квадратные скобки обозначают транскрипционное слияние клонированного фрагмента с беспромоторным геном-репортером cat, одиночным или объединенным с маркерным геном aacCl. Р -предполагаемый промотор оперона prqR-prqA. C134fs, C134S и L17Q - точечные мутации в гене prqR. Закрашенная часть гена prqR за мутацией C134fs обозначает измененный участок кодирующей последовательности. Выделена область субклонирования для введения сайт-направленных мутаций в ген prqR-, загнутая стрелка с пунктиром указывает район контрольного определения последовательностей нуклеотидов в плазмидах pCSl и pCS3.
£со47Ш-фрагменты (313 п.н.) плазмид, прошводных pW6, полученных при сайт-направленном мутагенезе гена prqR, клонировали в вектор pTZlSR и секвенировали с полным перекрыванием в обоих направлениях. После идентификации ожидаемых мутаций, С134Гз или C134S, эти же фрагменты встроили в плазмиду p\V6 с замещением ее £со47П1-фрагмента. Таким способом получили рекомбинантные плазмиды pCSl и pCS3, содержащие ген prqR с мутациями C134fs и C134S (рис. 1).
Плазмида pCSl (с prqRC134fs) проявила такую же, как у плазмиды рР7 (с prqRL17Q), способность трансформировать клетки штамма ДТ Synechocystis по признаку повышенной устойчивости к MV. Плазмида pCS3 (с prqRC134S), напротив, такой способностью не обладала, как и исходная плазмида pW6 с клонированным в ней геном prqR ДТ. Таким образом, по результатам определения трансформирующей активности рекомбинантных плазмид можно заключить, что мутант Synechocystis с prqRC!3/s фенотипически не отличается от штамма Prq20 с мутацией prqRL17Q, приводящей к выраженному нарушению авторегуляторной функции гена prqR (Бабыкин и др., 2003). Полученные данные свидетельствуют о том, что репрессорная активность белка PrqR связана с функционированием не только N-концевого ДНК-связывающего домена, но и С-концевого участка. Системы анализа экспрессии и взаимодействия аллелей гена prqR Характер экспрессии аллелей гена prqR (ген ДТ и его мутантные производные) изучали с помощью транскрипционных слияний с беспромоторным геном-репортером cat в составе рекомбинантных плазмид, сконструированных на основе двух векторов клонирования промоторов рКК232-8 и R30. Копии дикого и мутантных аллелей гена prqR вместе с оперонным промотором и началом гена prqA клонировали в составе ZfamHI-SpM-фрагментов (1.3 т.п.н.), донорами которых служили соответствующие р-производные, полученные на основе вектора pTZ18R (рис. 1). Для проверки наличия собственного промотора у гена prqA сконструировали на основе вектора R30 рекомбинантные плазмиды RW6d и RNM1, содержащие разные субфрагменты pW6: Dral-Sphl (0,76 т.п.н.) и Hincll-Sphl (0,25 т.п.н.) (рис. 1).
В данной работе определяли влияние на экспрессию аллеля prqR в R-плазмиде другого аллеля в составе плазмиды на основе вектора рКК232-8, у которого делегирован /4>и11-фрагмент размером 1,28 т.п.н. (рс1К-производные), содержащий ген cat.
Обладая репликоном RSF1010, плазмида R30 и ее производные способны автономно реплицироваться в клетках цианобактерии. В неселективных условиях роста клетки Synechocystis стабильно наследуют 5-10 копий R-плазмиды в автономном состоянии на одну хромосому. При анализе взаимодействия аллелей
гена prqR в клетках Synechocystis транскрипционную активность аллеля в составе R-плазмиды оценивали по экспрессии гена-репортера cat, а характер экспрессии хромосомных копий гена prqR (шт-амм ДТ или мутант Prq20) - по активности гена prqA, измеряемой уровнем устойчивости клеток к MV,
Результаты проведенного исследования показали, что аллели prqR ДТ и prqRC134S, prqRLHQ и prqRC13/s, а также делеционные производные гена prqR в плазмидах RNM1 и RW6d составляют пары с идентичным характером поведения при равных уровнях экспрессии (в границах доверительных интервалов). Вместе с тем каждый аллель гена prqR экспрессируется с одинаковой эффективностью в составе рекомбинантных плазмид на основе рКК232-8 и R30. Поэтому для каждой группы равноценных вариантов гена prqR представлены результаты анализа одного варианта в качестве типичного представителя всей группы.
Негативная авторегуляция гена prqR в клетках Е, coli
Результаты измерения уровней чувствительности/устойчивости к Cm одноплазмидных штаммов E.coli, содержащих транскрипционные слияния различных вариантов гена prqR с геном-репортером cat, показали, что ген prqR экспрессируется и авторегулируется в гетерологичной системе. Клетки штаммов, содержащих рекомбинантные плазмиды RW6 или pKW6 с геном prqR ДТ, значительно более устойчивы к антибиотику, чем клетки исходного бесплазмидного штамма и штаммов с плазмидами R30 или рКК232-8 (контроль). В 3-4 раза более высоким уровнем устойчивости к Cm обладают штаммы, несущие плазмиды RP7 (или рКР7) и RCS1 (или pKCSl) с мутантными аллелями prqRL17Q и prqRC13<?s, которые характеризуются, соответственно, повреждениями ДНК-связывающего и С-концевого доменов белка-репрессора PrqR. Обе мутации приводят к дерепрессии гена prqR в клетках Synechocystis. Следовательно, более низкий уровень устойчивости к Cm у штаммов Е. coli, содержащих плазмиды с геном prqR ДТ, чем у штаммов, несущих мутантные аллели, свидетельствует о проявлении авторепрессорной функции белка PrqR в гетерологичной системе. Одинаковый уровень экспрессии у аллеля prqRC134S и гена ДТ в составе плазмид RCS3/pKCS3 и RW6/pKW6 указывает на то, что замена C134S в С-концевом домене белка PrqR не оказывает существенного влияния на его активность.
Одинаковое поведение гена prqR в составе двух совместимых векторных плазмид позволило адекватно оценить характер взаимодействий между его аллелями. С этой целью были измерены уровни устойчивости к Cm штаммов Е. coli с R-плазмидами в компаундах с pdK-производными (рис. 2). Экспрессия мутантных аллелей prqRL17Q и prqRC13/s в плазмидах RP7 и RCS1 не изменяется в присутствии их собственных экстракопий (pdKP7/pdKCSl), но полностью подавляется (до уровня экспрессии гена prqR ДТ) в присутствии дополнительных
аллелей ДТ или prqRC134S в составе производных pdKW6/pdKCS3 (рис. 2). Следовательно, в клетках Е. coli ген prqR ДТ полностью доминирует над своими мутантными аллелями, то есть белок PrqR проявляет свойства транс-действующего репрессора транскрипции. Ни один из аллелей гена prqR в транс-положении не влияет на экспрессию его делеционных производных в составе рекомбинантных плазмид RNM1 и RW6d (рис. 2). Следовательно, дополнительный промотор гена prqA, как и предполагалось ранее (Бабыкин и др., 2003), является слабым конститутивным промотором, не регулируемым белком PrqR. Полученные данные позволяют заключить, что в клетках Е. coli ген prqR подвержен специфической авторегуляции, обусловленной связыванием белка PrqR с операторными участками в области рг^К-промотора.
Таким образом, результаты генетического анализа взаимодействия аллелей гена prqR служат прямым доказательством наличия авторепрессорной функции у белка PrqR. В гетерологичной системе, в клетках Е. coli, ген prqR ДТ подавляет (транс-активность) дерепрессированную транскрипцию его мутантных аллелей. Данные, полученные при изучении экспрессии делеционных производных гена prqR, показывают, что внутри оперона prqR-prqA находится дополнительный конститутивный промотор, с которого может экспрессироваться ген prqA, контролирующий устойчивость клеток Synechocystis к MV.
E.coll
Ст.,
§200. р
J160-
3120-
40-
л. •
-ь
RW6 или RCS3
п
RP7 или RCS1
RNM1 или
RW«a
Q-+pdK23, контроль □-+pdKW6 или pdKCS3 Q-+pdKP7 или pdKCSl
Рис. 2. Уровни чувствительности к Cm (400 мкг/диск) (зоны подавления роста клеток вокруг бумажных дисков с антибиотиком) двухплазмидных штаммов E.coli, содержащих рекомбинантную плазмиду R-серии совместно с рекомбинантной плазмидой на основе вектора рКК232-8 с делецией гена cat, pdK23 (pdK-производные). В составе плазмид клонированы аллели гена prqR - ДТ (RW6, pdKW6), prqRCmS (RCS3, pdKCS3), prqRL17Q (RP7, pdKP7) и prqRC134fs (RCS1, pdKCSl), а также делеционные производные гена prqR (RNM1 и RW6d).
Цис-домннантиый характер проявления мутантного аллеля praRL17Q
в клетках Svnechocvstis
Как видно из рис. За, в клетках трансконъюгантов штаммов ДТ и Prq20 Synechocystis уровни транскрипционной активности плазмидных аллелей prqR ДТ (RW6) и prqRC134S (RCS3), а также делеционных вариантов гена prqR (RNM1 и RW6d) практически не отличаются от уровня фоновой экспрессии гена-репортера cat (R30, контроль). Вместе с тем в клетках мутанта Prq20 содержащиеся в плазмидах RP7 и RCS1 мутантные аллели prqRLHQ и prqRCB<fs дерепрессированы, о чем свидетельствует высокий уровень устойчивости к Сш соответствующих трансконъюгантов (рис. За). Следовательно, в клетках обоих штаммов Synechocystis транскрипция плазмидных аллелей prqR ДТ и prqRC134S специфически репрессирована, а ген-репортер cat, как и в случае делеционных производных гена prqR (RNM1 и RW6d), скорее всего, экспрессируется с конститутивного промотора гена prqA. В клетках штамма ДТ транскрипционная активность мутантных аллелей в составе рекомбинантных плазмид частично подавляется, не достигая уровня репрессии гена ДТ (RW6) (рис. За). Полудоминантный характер поведения плазмидных копий мутантных аллелей гена prqR может быть обусловлен тем, что они численно превосходят хромосомные копии гена ДТ (до 10 плазмид на одну хромосому). Однако, с другой стороны, мутантный хромосомный аллель prqRLl7Q полностью доминирует над локализованными в плазмидах RW6 и RCS3 аллелями ДТ, несмотря на их численное превосходство. Этот вывод следует из результатов определения транскрипционной активности аллелей гена prqR в хромосоме по проявлению признака устойчивости клеток к MV (репортер - ген prqA-, рис. 36). На дерепрессированную экспрессию мутантного аллеля prqRL17Q в хромосоме у трансконъюгантов штамма Prq20 (высокий уровень устойчивости к MV) не оказывают подавляющего действия ни аллель ДТ, ни все производные гена prqR, введенные в клетку на автономных плазмидах. Практически не подвержена воздействию плазмидных аллелей экспрессия гена prqR в хромосоме штамма ДТ (низкий уровень устойчивости к MV).
Сохранение функциональной активности плазмидных аллелей гена prqR ДТ в трансконъюгантах мутанта Prq20 было подтверждено обратным переносом плазмид RW6 и RCS3 в клетки Е. coli, где вновь проявилась авторегулируемая экспрессия гена prqR. Следовательно, в клетках мутанта Prq20 Synechocystis аллели prqR, клонированные в составе плазмид RW6 и RCS3, негативно контролируют собственную транскрипцию, но не действуют на мутантный аллель prqRL17Q, локализованный в хромосоме. Эти данные свидетельствуют о возможности цис-действующей авторегуляции гена prqR у цианобактерии Synechocystis.
(Г $1600-
el
51200-
и 4Q0-8
гЗД' й
R30 кощроль
2000-
ÍT
g1В00-
400-
W.
R30 коотроль
RW6 или RCS5
[плшмцда-са<]
г£
i-
RP7 или RCS1
RNM1
или RW6d
[хромосома-ргф4]
RW6 или RCS3
КР7 или КСв1
RNM1
или RW6d
□ •шгаммДТ □-мугшггРгд20
Рис. 3. Уровни чувствительности трансконыогантов БупескосузШ штамма ДТ и мутанта Рщ20 к Ст (а) и МУ (б). Экспрессию производных гена ргцВ. в составе автономных плазмид оценивали по активности гена устойчивости к Сш [плазмида-ся/], а экспрессию дикого и мутантного аллелей ргдЛ, локализованных в хромосоме штамма ДТ и мутанта Рщ20 - по активности гена устойчивости к МУ [хромосома-/»^]. Контрольные штаммы содержали плазмиду ЯЗО. Доза Сш - 400 мкг/диск; МУ - 20 мкг/диск.
Согласно полученным данным, ни характер, ни уровень репрессорной активности белка Ргч11 не определяются редокс-чувствительным остатком цистеина. Следовательно, стимулируемое МУ усиление авторепрессии гена ргцЯ в клетках ЕупескосуЕ^ (Бабыкин и др., 2003), скорее всего, не связано с модификацией белка РгцЯ в результате его окисления. Между тем мутация сдвига рамки считывания С134й в гене ргдЯ нарушает его авторегуляцию и приводит к повышению резистентности клеток к МУ за счет дерепрессии оперона рщВ.-рщА. Эти данные свидетельствуют об участии С-концевого домена в функционировании
белка PrqR в качестве репрессора транскрипции. При изучении характера взаимодействий между аллелями гена prqR в клетках Synechocystis выявлена цис-действующая авторепрессия гена prqR ДТ в составе автономной плазмиды. Возможно, у цианобактерий повышение авторепрессии гена prqR в условиях ОС связано не с активацией белка PrqR, как такового, а со стимуляцией его цис-активности. Усиление негативной авторегуляции гена prqR in cis должно приводить к сниженшо внутриклеточной концентрации свободного трансактивного белка-репрессора PrqR, и, вследствие этого, к дерепрессии негативно регулируемых белком PrqR генов, к которым могут относиться и гены защитных функций.
Оперон prqR-prqA вовлечен в адаптивный ответ клеток
на солевой стресс
У мутанта Prq20 Synechocystis, характеризующегося дерепрессией оперона prqR-prqA и повышенной устойчивостью к MV, не удалось выявить перекрестной устойчивости к другим ингибиторам роста клеток, несмотря на испытание широкого спектра антибиотиков, индукторов ОС и различных токсичных соединений. Был только обнаружен в 1,5-2 раза повышенный уровень резистентности к куменгидропероксиду, стимулирующему перекисное окисление липидов (Нефедова, 2004). Исследования с помощью ДНК-микрочипов профилей транскрипции в клетках Synechocystis выявили существенное стимулирующее действие на экспрессию гена prqR солевого стресса (Marin et al., 2004; Shoumskaya et al., 2005) и обработки клеток бензилалкоголем, повышающим текучесть мембран (Inaba et al., 2003). По имеющимся сведениям наиболее ярко выраженный стимулирующий эффект на экспрессию гена prqR в клетках штамма ДТ оказывает солевой стресс (NaCl в концентрации 4%). Содержание транскриптов этого гена повышалось в 45 раз после 30 мин стресса и через два часа снижалось до начального уровня (Marin et ai, 2004). Вместе с тем на основании данных, полученных с помощью ДНК-микроэррэй анализа, нельзя было однозначно заключить, что NaCl или бензилалкоголь могут играть роль индуктора оперона prqR-prqA, поскольку отсутствовали какие-либо указания на повышение экспрессии гена prqA (Inaba et al., 2003; Marin et al., 2004; Shoumskaya et al., 2005).
Нами были воспроизведены условия воздействия солевым стрессом на клетки штамма ДТ Synechocystis и с помощью Нозерн блот-гибридизации выявлена существенная индукция генов оперона prqR-prqA (рис. 4). Согласно результатам денситометрического анализа сигналов гибридизации на радиоавтографах содержание транскриптов гена prqR возрастает при солевом стрессе примерно в 40 раз, а гена prqA - в 20 раз. Наличие общего для prqR и prqA транскрипта размером около 2,1 т.н., перекрывающего оба гена и соответствующего двухцистронной
мРНК ргдЯ-ргдА, указывает на координированную индукцию этих генов с общего оперонного промотора в стрессовых условиях.
а. - + б. - +
-«-2.1 -<-2.1
lié -•-1.3 lftib\ -+-L6
prqR ЯК -«-0.8 prqA
щ -<»-0.3
гпрВ ттт гпрВ ЩЩ
prqR prqA slr0897
OOEZ >
<[ |<Л 564 138« П.н.
stl0887 SU0886
Рис. 4. Содержание транскриптов генов prqR (а) и prqA (б) в клетках штамма ДТ Synechocystis без обработки NaCl (—) и после 30 мин инкубации в присутствии 4% NaCl (+). Стрелками справа указаны основные транскрипты генов в т.н. Уровни мРНК гена гпрВ приведены в качестве контроля равных количеств тотальной РНК в пробах. Внизу представлена карта участка хромосомы, содержащего оперон prqR-prqA, с указанием размера генов.
Как было отмечено, три работы (из одной лаборатории) свидетельствуют об индукции солевым стрессом и бензилалкоголем экспрессии гена prqR, однако не содержат каких-либо указаний на дерепрессию гена prqA (Inaba et al, 2003; Marin et al., 2004; Shoumskaya et al, 2005). Эти сведения не согласуются с нашими данными о координированной транскрипции генов prqR и prqA в составе одного оперона. Не исключено, что у варианта штамма ДТ, использованного в упомянутых исследованиях, экспрессия prqA в составе оперона нарушена спонтанной мутацией или инсерцией мобильного элемента, тогда как наш вариант штамма ДТ содержит интактный оперон prqR-prqA. Вероятно, по этой причине именно нам, а не другим авторам, удалось выявить индукцию данного оперона при солевом стрессе. Поскольку мутант Prq20 с дерепрессированным геном prqA не проявляет повышенной устойчивости к NaCl, можно заключить, что непосредственно белок PrqA не отвечает за резистентность цианобактерий к солевому стрессу. Тем не менее, нельзя при этом исключать защитную роль транзитной индукции оперона prqR-prqA. Возможно, белок PrqA, являющийся предполагаемым Ыа^-зависимым антипортером (Нефедова и др., 2003), способен секвестрировать Na+ и тем самым защищать клетки от цитотоксического действия этих ионов (на ранней стадии солевого стресса).
Поскольку белок PrqA относится к транспортерам множественной лекарственной устойчивости (CyanoBase Website), и показано его участие в защите клеток от MV, было бы неправомерным считать связывание ионов Na+ основной предполагаемой функцией этого белка. Вместе с тем факт дерепрессии оперона prqR-prqA при солевом шоке (и, возможно, при обработке клеток бензилалкоголем) может свидетельствовать об образовании в клетке некого токсичного соединения, которое должно быть индуктором репрессора PrqR и в то же время субстратом для антипортерной активности белка PrqA. Это неизвестное соединение и следует идентифицировать в качестве истинного индуктора оперона prqR-prqA.
В настоящее время у бактерий хорошо изучено более 80 TetR/AcrR-систем устойчивости с участием белков-транспортеров с различным механизмом действия (Ramos et al., 2005), причем участие антипортеров семейства MATE (Multidrug and toxic compounds extrusion) в работе таких систем показано, по-видимому, впервые на примере белка PrqA. Активное изучение белков семейства МАТЕ начато сравнительно недавно, и функции многих из них еще неизвестны. Однако установлено, например, участие белков этого семейства в детоксикации ионов переходных металлов и защите от антибиотиков, синтезируемых в природных сообществах микроорганизмов (Li et al., 2002; Burse et al., 2004).
Плейотропный характер мутации praRLI7Q: повышенная устойчивость клеток к MV и отрицательный фототаксис, независимый от интенсивности света
Нами обнаружено, что наряду с повышенной устойчивостью к MV мутант Prq20 Synechocystis характеризуется отрицательным фототаксисом, не зависящим от интенсивности света. Для доказательства связи измененной подвижности клеток с нарушением гена prqR, а не какого-либо другого гена, клетки штамма ДТ трансформировали рекомбинантной плазмидой рР7, содержащей ген prqR с мутацией L17Q. Полученный таким способом устойчивый к MV мутант Pql7 не отличается (как и мутант Prq20) от штамма ДТ по основным физиологическим параметрам: светочувствительности, скорости роста и составу пигментов. Однако отрицательный фототаксис мутанта Pql7 (как и Prq20) проявляется уже при 10 мкмоль фотонов-м"2«с"', интенсивности света, близкой к пороговой для автотрофного роста клеток (рис. 5). Таким образом, ген prqR с миссенс-мутацией L17Q детерминирует конститутивно отрицательный фототаксис цианобактерий.
Рис. 5. Фототаксис клеток штамма ДТ и мутантов Рц17 и АргдЯ БупесИосузИз в ответ на облучение белым светом широкого спектра. Суспензии клеток наносили каплями на поверхность агаризованной среды и инкубировали 5 дней при одностороннем освещении (10 мкмоль фотонов-м"2»с-1). Стрелка указывает направление света, пунктир - исходное положение клеток.
Для выяснения роли в контроле фототаксиса гена ргцК и генов, входящих с ним в один кластер, провели их направленную инактивацию у штамма ДТ и мутанта Ря17 (рис. 6). Все полученные мутанты (как и Ря17) не отличались от штамма ДТ по светочувствительности, скорости роста и составу пигментов.
Рис. 6. Физическая карта участка хромосомы ЭупесИосуз^ с указанием мутаций в регуляторном гене ргцЯ и схемой инсерционной инактивации генов 8110887, ¡110886 и рщЛ, входящих в один кластер с геном ргцЯ..
Делеция огаК и инсерционная инактивация гена ргдА не влияют на Фототаксис
Не исключена возможность, что в высокой внутриклеточной концентрации мутантный белок РгцЯ с аминокислотной заменой Ы7С> проявляет регуляторную активность, причем с измененной специфичностью. В связи с этим был сконструирован мутант с практически полной делецией гена ргдЛ без нарушения рамки считывания - АргдВ. (рис. 6). Мутант АргдЯ сохраняет положительный фототаксис (рис. 5) и, более того, сходен со штаммом ДТ в том, что пороговые
интенсивности света для переключения положительного фототаксиса на отрицательный близки у обоих штаммов (в нашей лаборатории около 120 мкмоль фотонов-м'^с"1). Поскольку не исключалась возможность взаимосвязи измененного фототаксиса мутанта Ря17 со значительной дерепрессией гена ргдА, этот ген инакгавировали введением в начало кодирующей последовательности (в сайт 8рИ1) кассеты устойчивости к гентамицину (несет ген аасС1) (рис. 6). Клетки этого мутанта утратили резистентность к МУ, однако сохранили отрицательный фототаксис. Вместе с тем аналогичный инсерционный мутант, производный штамма ДТ, демонстрировал положительный фототаксис при повышенной чувствительности к МУ. Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что отрицательный фототаксис мутанта Рд17 связан с особым эффектом мутации ргдЯЫ72, но не с нарушением функции ргдЯ в целом, а также не с дерепрессией гена рщА.
В регуляцию фототаксиса вовлечен ген ж110886. контролирующий активируемый светом гетеротрофный рост клеток БупескосувИв Гены ргцЯ и 5110886 имеют общий межгенный участок ДНК (рис. 6), поэтому нельзя было исключать, что ргдЯ может регулировать экспрессию 5110886. Ген £110886 и следующий за ним по направлению транскрипции ген .у110887 были инактивированы в клетках штамма ДТ и мутанта Pql7. Установлено, что клетки мутантных штаммов с инактивированным геном $110886 нежизнеспособны в условиях активируемого светом гетеротрофного роста; при этом у мутанта 8186::Кт сохранился положительный фототаксис, а у двойного мутанта Ря17 8186::Кт подвижность полностью отсутствовала (рис. 7).
+
8186: :Кш Рд17 Рд17 518б::Кт
Рис. 7. Фототаксис клеток мутантов 818б::Кт, Ря17 и ?<{П 5186::Кт БупесИосузИв в ответ на облучение белым светом широкого спектра. Условия опыта и обозначения те же, что приведены под рис. 5.
Для доказательства того, что утрата клетками подвижности у мутанта Pql7 S186::Km связана с инсерцией в ген s110886, но не с полярной инактивацией гена sll0887, последний инактивировали у мутанта Pql7. Клетки двойного мутанта Pql7 S187::Km сохранили отрицательный фототаксис. Кроме того, чтобы проверить, не обусловлено ли нарушение подвижности с неизвестной случайной мутацией, клетки мутанта Pql7 S186::Km трансформировали ПЦР-фрагментом ДНК, содержащим интактный ген sll0886. Трансформанты, отобранные по способности расти в гетеротрофных условиях (при активации светом), приобретали подвижность и отрицательный фототаксис, свойственные мутанту Pql7.
В совокупности полученные данные доказывают участие гена sll0886 в контроле фототаксиса цианобактерий. Предполагается, что этот ген отвечает за передачу в клетке слабого светового (возможно, синей части спектра) сигнала гетеротрофного роста (Kong et al., 2003). Не исключено, что тот же сигнал воспринимается системой, обеспечивающей зависимую от света подвижность клеток, и ген sll0886 вовлечен одновременно в контроль активируемого светом гетеротрофного роста и контроль отрицательного фототаксиса клеток. Можно также полагать, что мутация prqRLUQ нарушает путь регуляции положительного фототаксиса, который, как известно, напрямую не связан с путем регуляции отрицательного фототаксиса (Bhaya et al., 2001а). Согласно данной гипотезе для полной утраты клетками подвижности необходима инактивация обоих путей регуляции фототаксиса, как это, возможно, и происходит в случае двойного мутанта Pql7 S186::Km. Для понимания истинных молекулярных механизмов регуляции фототаксиса с участием генов prqR и sll0886 требуются дополнительные исследования.
Изменения в регуляции генов, ответственных за функционирование пилей, у мутантов с нарушенной функцией гена prqR Нами в совместном исследовании с отделением регуляторной биологии Национального института фундаментальной биологии, Оказаки, Япония (руководитель отделения профессор Н. Мурата) с помощью метода ДНК-микрочипов был проведен сравнительный анализ тотальных профилей транскрипции в клетках, выращенных в стандартных условиях, у штамма ДТ и мутантов с нарушенной функцией гена prqR, Pql7 и ДprqR. Как следует из результатов микроэррэй-анализа, инактивация гена prqR приводит у обоих мутантов к одинаковому изменению экспрессии целого ряда генов. К их числу относятся ген prqA (повышение транскрипции), а также опероны pilA5-pilA6 (повышение транскрипции) и pilA9-pilA10-pilAll-slr2018 (понижение транскрипции), вовлеченные в контроль функционирования пилей, необходимых для подвижности цианобактерий (пили типа IV, Tfp). Вместе с тем у мутантов в 2
раза понижен уровень экспрессии гена эркА, который кодирует серин-треониновую протенкиназу эукариотического пша, отвечающую за фосфорилирование мембранных белков и регуляцию подвижности клеток (Кате! ег а1, 2001). Известным следствием инактивации генов рИА9 и зркА является утрата клетками подвижности (Шгауа е/ а/., 2001Ь; Кате1 ег а!., 2001; РатсЫап е/ а!., 2006). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ген ргцк вовлечен в регуляцию генов, ответственных за подвижность и фототаксис у цианобактерий: негативную регуляцию оперона рИА5-рНАб и позитивную - гена эркА и оперона рИА9-рИА10-рИА11-з1г2018. Наряду с этим ген ргдЛ может регулировать еще ряд генов, в основном с неизвестной функцией, причем по характеру изменений в экспрессии отдельных генов мутанты Pql7 и АргдЯ различаются. У мутанта Рц17, в отличие от мутанта ДрщЯ, в 2 раза повышена транскрипция гена б1г1071 и в 2 раза понижена транскрипция генов $1г1260 и рва]. Напротив, у мутанта ЬргцИ в 2,3 раза повышена экспрессия гена срсП и в 2 раза понижена экспрессия генов и
¡1г0442. Такое расхождение в спектрах транскрипционных изменений может объясняться проявлением мутантным белком регуляторной активности в клетках штамма Ря17. Не исключено, что один из генов (или более), экспрессия которого специфически изменена в клетках мутанта Ря17, контролирует у ЗупесИосузНз механизм переключения фототаксиса (с положительного на отрицательный).
С целыо подтверждения выявленных изменений в тотальном профиле
транскрипции уровень экспрессии генов рИА5, рИА9 и эркА исследовали с
помощью Нозерн-блот-анализа в клетках мутантов Pql7 и /\prqR, выращенных в
стандартных условиях. Относительное содержание мРНК анализируемых генов в
клетках мутантов соответствует тому, что было установлено с помощью
микроэррэй-анализа (рис. 8). Согласно результатам Нозерн-блот-гибридизации
транскрипция гена рИА5 (рис. 8я) действительно повышена (примерно в 4 раза) у
мутантов Ря17 и АргдЯ, тогда как транскрипция генов рИА9 (рис. 86) и яркЛ (рис.
8в) у мутантов понижена (примерно в 2,5 и 2 раза, соответственно) в сравнении со
штаммом ДТ. Следует также отметить полное совпадение данных об
относительном уровне транскрипции оперона ргдЯ-рщА в клетках штамма ДТ и
мутантов Рц17 и ДргцК, полученных с помощью микроэррэй-анализа и Нозерн-
блот-гибридизации. Для выяснения характера экспрессии оперона рИА1-рНА2 в
клетках штаммов Pql7 и ДрщК, а также в клетках двойного мутанта Pql7 818б::Кт,
клетки которого лишены подвижности, использовали Нозерн-блот-гибридизацию с
зондом к гену рИА1. Как следует из полученных данных, уровень транскрипции
гена рИА1 (и, очевидно, оперона рИА1-рИА2) одинаков в клетках мутантных
штаммов и штамма ДТ. Следовательно, мутации в генах ргдЯ и ¡110886 не влияют
18
на экспрессию гена pilAl, кодирующего основной компонент Tfp в клетках цианобактерий, а потому гены prqR и sll0886, очевидно, контролируют не биогенез Tip, а их функционирование при фототаксисе.
а.
ДТ Pq17 AprqR
р!1А5 V i —1.4 -1,0 —0,9 Slrl929Slrl931 slrl927 slrt.930 slrl932 DMXOD 458 пл. ^ pil45 81118
гпрВ
б.
рНА9
ДТ Pq17 AprqR
m I r
pqj i Ш ШШ
\ w Щ
-1,4 0,8
трВ
.410 pil.49 All
DDOO
Q 1142 пл. sl f 1924
в.
ДТ Pq17 AprqR
spkA Ш bm fi V. <—2,0 «-1,2 slrl705 ipk.4 D OK] S1L1573 ™йП? «111574
rnpB v. i/Jiwuwr-1 ^.rt.'-- .,
Рис. 8. Содержание транскриптов генов рИА5 (а), рИА9 (б) и зркА (в) в клетках штамма ДТ и мутантов Рц17 и ¡\prqR БутсИосувШ. Стрелками справа указаны основные транскрипты генов в т.н. В правой части рисунков приведены карты участков хромосомы, содержащих анализируемые гены с указанием их размера.
Гены prqR и sllOS86 контролируют функционирование толстых пилей,
но не их биогенез
Для того чтобы выяснить, участвуют ли гены prqR и sll0886 в контроле биогенеза пилей, был выполнен сравнительный анализ поверхностных структур клеток штамма ДТ и мутантов с нарушенной функцией указанных генов. В наших исследованиях впервые для цианобактерий был применен новый метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), которая имеет ряд существенных преимуществ по сравненшо с традиционной растровой и просвечивающей электронной микроскопией. У Synechocystis описаны пили двух морфотипов, толстые и тонкие. Нами показано, что метод АСМ позволяет легко различать на поверхности цианобактерий пили двух разных морфотипов и идентифицировать изменения в морфологии толстых пилей (Tfp), обеспечивающих подвижность клеток при фототаксисе.
Компьютерный анализ распределения пилей штамма ДТ по высоте над поверхностью носителя (поперечный размер, толщина, или диаметр, пиля) выявил наличие двух основных пиков со средними значениями высот 2.1±0.1 и 3.9±0.2 нм. Эти величины соответствуют диаметрам тонких и толстых пилей. В целом трудно оценить точно общее количество тонких пилей, выявляемых АСМ. По измерениям, выполненным на клетках штамма ДТ Synechocystis, длина тонких пилей достигает 2 мкм, при этом толстые пили в среднем сравнимы по длине с тонкими. Согласно нашим сведениям функция тонких пилей до сих пор не известна. Для достоверной интерпретации данных АСМ-анализа клеток мутантов Pql7 и Pql7 S186::Km был дополнительно сконструирован мутант PilAl::Km с инсерционной инактивацией генаpilAl; клетки такого мутанта не должны образовывать Tip.
Ни у подвижных клеток мутантов Pql7 и ДprqR, ни у неподвижных клеток двойного мутанта Pql7 S186::Km не выявлено отличий от клеток штамма ДТ в характере формирования и структуре Tfp (рис. 10). Эти данные подтверждают вывод о том, что гены prqR и sll0886 контролируют не биогенез пилей, а их функционирование, возможно, в системах восприятия и передачи светового сигнала при фототаксисе.
Рис. 9. Атомно-силовая микроскопия клеток штамма ДТ ЯупесИосузИз: (А) общий вид клетки; (Б) край клетки с толстыми пилями, ТГр (отдельные нити с изгибами), и тонкими пилями (в виде склеенных тонких нитей); (В) увеличенный участок изображения (Б) с тонкими пилями; (Г) увеличенный фрагмент изображения (В) с филаментами, выходящими из тонких пилей.
Рис. 10. Анализ с помощью атомно-силовой микроскопии морфологии пилей подвижных клеток мутантов Рд17 и ^ргдЯ, а также неподвижных клеток мутантов Рд17 8186::Кш и РПА1 ::Кт БупескосувИв. Стрелки указывают на толстые пили, ТГр.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методами молекулярной генетики и функциональной геномики исследован кластер генов ¿110887-з1Ю886-ргдЯ-ргдА цианобакгерии 8упесИосу$Из. Получена новая информация о регуляторной функции гена ргдЯ и характере экспрессии оперона рщК-рщА, вовлеченного в контроль устойчивости клеток к индуктору ОС МУ. Показано, что авторепрессия гена ргдЯ, стимулируемая МУ (Бабыкин и др., 2003), не связана с наличием редокс-чувствительного остатка цистеина в белке РгяЯ. Однако доминантный характер мутации в гене ргдК может свидетельствовать о наличии цис-действующей авторепрессии этого гена. Не исключено, что такой механизм авторегуляции гена ргдЯ обеспечивает эффективное подавление его транскрипции при ОС, индуцируемом МУ. Между тем установлено наличие дополнительного промотора, с которого осуществляется экспрессия гена ргдЛ, необходимая для поддержания конститутивной устойчивости клеток к МУ.
Важным условием выяснения природной функции оперона ргдЯ-ргдА у БупесИосуяШ является идентификация его клеточного индуктора. В данной работе показано, что в ответ на солевой стресс на ранней стадии его развития происходит существенное повышение экспрессии оперона ргдЯ-ргдА в целом, а не только гена рцЯ, как сообщалось ранее. Это позволяет полагать, что белок РщА, относящийся к недавно описанному семейству белков МАТЕ, которые широко представлены в клетках растений, играет защитную роль в системе адаптации клеток к солевому стрессу. Однако, несмотря на наличие новой информации об адаптивном характере экспрессии оперона рщК-рщА, его истинный внутриклеточный индуктор и, соответственно, его основная функция в клетках цианобактерий остаются неясными и требуют дальнейшего исследования. При этом согласно имеющимся сведениям о роли белков МАТЕ у бактерий и растений следует учитывать возможность вовлечения оперона ргдЯ-ргдА в контроль таких процессов, как нейтрализация ионов переходных металлов и защита от антибиотиков, синтезируемых в природных сообществах микроорганизмов.
Впервые выявлено участие генов ргдЯ и 5110886 в контроле фототаксиса цианобактерий, причем полученные в работе данные указывают на то, что эти гены вовлечены в два пути зависимой от света регуляции подвижности клеток. При этом не исключается, что ген я110886 вовлечен одновременно в контроль активируемого светом гетеротрофного роста и контроль отрицательного фототаксиса клеток. Вместе с тем установлено, что ген ргдЯ участвует в регуляции генов, продукты которых необходимы для функционирования пилей, обеспечивающих подвижность клеток: негативную регуляцию оперона рИА5-рИА6 и позитивную - гена эркА и оперона рИА9-рИА 10-рИА 1 ]-ь-1г2018.
При изучении поверхностных структур клеток цианобактерий был использован новый метод атомно-силовой микроскопии, имеющей ряд
существенных преимуществ по сравнению с традиционной растровой и просвечивающей электронной микроскопией. Данный метод успешно отработан в применении к различным штаммам Synechocystis и позволяет эффективно идентифицировать изменения в морфологии пилей, обеспечивающих подвижность клеток при фототаксисе. На основании результатов, полученных с помощью атомно-силовой микроскопии, подтвержден вывод о том, что гены prqR и s!l0886 контролируют не биогенез пилей, а их функционирование.
ВЫВОДЫ
У цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 исследовали кластер генов sll0886-prqR-prqA, в котором ген prqR негативно регулирует устойчивость клеток к индуктору окислительного стресса метилвиологену.
1. С помощью сайт-направленного мутагенеза и генетического анализа гена prqR установлено, что репрессорная функция белка PrqR обеспечивается как N-концевым ДНК-связывающим доменом, так и С-концсвым доменом. Единственный остаток цистеина в С-концевом домене не влияет на функциональную активность белка PrqR.
2. Показано, что ген prqA, продуктом которого является предполагаемый Иа^-зависимыЙ антипортер метилвиологена, может транскрибироваться как с промотора оперона prqR-prqA, так и с собственного конститутивного промотора. Также выявлена индукция оперона prqR-prqA при обработке клеток хлоридом натрия, что указывает на возможное участие белка PrqA в адаптации клеток к солевому стрессу.
3. Обнаружено участие гена prqR в контроле фототаксиса клеток Synechocystis. Мутация L17Q в этом гене приводит к переключению фототаксиса с положительного на отрицательный. Показано, что ген prqR вовлечен в регуляцию экспрессии оперонов, продукты которых необходимы для функционирования пилей, обеспечивающих подвижность клеток: негативную регуляцию оперона pilA5-pilA6 и позитивную - оперонаpilA9-pilAI0-pilAII-slr20I8, а также гена spkA.
4. С помощью инсерционного мутагенеза выявлено, что в контроль фототаксиса вовлечен также ген sll0886, контролирующий активируемый светом гетеротрофный рост клеток.
5. У мутантов по генам prqR и SÜ0886 не изменен биогенез пилей, что подтверждает участие этих генов в регуляции функционирования пилей, возможно, в системах восприятия и передачи светового сигнала при фототаксисе.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Кирик И.А. Дифференциальная авторепрессия регуляторного гена prqR, контролирующего устойчивость к параквату у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 II Сборник тезисов международного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология". Москва, 2001. С. 76-78.
2. Кряжов С.В., Кирик И.А. Два типа авторепрессии гена prqR, негативно контролирующего устойчивость к индуктору окислительного стресса параквату у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2002'\ Москва, 2002. С. 32-33.
3. Кирик И.А., Зинченко В.В., Бабыкин М.М. Мутационный анализ гена prqR, контролирующего устойчивость к метилвиологену // В приложении к журналу "Открытое образование": Материалы XI Международной конференции и Дискуссионного научного клуба "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии; IT + МЕ'2003", Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2003. С. 46-48.
4. Кирик И.А., Зинченко В.В., Шестаков С.В., Бабыкин М.М. Транс- и цис-действующая авторепрессия гена prqR у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 // Молекулярная биология, 2003. т. 37(6). С. 1035-1044.
5. Кирик И.А., Зинченко В.В., Шпилев А.В., Бабыкин М.М. Исследование авторепрессорной функции гена prqR с применением технологии рекомбинантных ДНК и молекулярного клонирования // Научные труды МБЦ МГУ (Международного учебно-научного биотехнологического центра Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова) / Ред. Кол.: С.В. Шестаков и др.-М.: МАКС Пресс, 2003. С. 7-11.
6. Кирик И.А., Зинченко В.В., Шестаков С.В., Бабыкин М.М. Механизмы авторепрессии гена prqR у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 // Материалы III съезда ВОГИС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития". Москва. 2004. т. 1. С. 338.
7. Dubrovin Е. V., Kirik I. A., Babykin М. М., Yaminsky I. V. Atomic force microscopy study of pili in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // From cells to proteins: imaging nature across dimensions/ V. Evangelista, Barsanti, L., Passarelli, V., and P. Gualtieri (Eds.). Series: NATO Security through Science Series. Sub-Series B: Physics and Biophysics, 2005. V. 3. p. 405-414.
8. Кирик И. А., Бабыкин M. M. Ген, контролирующий устойчивость к метилвиологену, вовлечен в регуляцию фототаксиса у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием "Автотрофные микроорганизмы". МАКС-ПРЕСС, Москва, 2005. С.41.
9. Babykin М.М., Kirik I.A., Nefedova L.N., Shestakov S.V. The prqR gene is involved in control of phototaxis in Synechocystis sp. PCC 6803 // International Meeting "Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems". Pushchino, Moscow Region, Russia. 2006. p. 233.
Напечатано о готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 06.10.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 691. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
¿/ГС??-
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кирик, Инесса Анатольевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ б
Гспстпчсскпй контроль п молекулярные механизмы адаптации фотоеннтезнругощнх организмов к стрессовым факторам
1. Окислительный стресс и антиоксидантпые системы защиты б
1.1. Условия развития окислительного стресса в клетках аэробных организмов б
1.2. Генетический контроль адаптивного ответа на окислительный стресс у энтеробактерий
1.3. Генетический контроль устойчивости к окислительному стрессу у растений
1.4. Системы адаптации к окислительному стрессу у циапобактернй
1.4.1. Изменения в тотальном профиле транскрипции у Synechocystis при гндропероксидпом стрессе
1.4.2. PerR регулоп Synechocystis
1.4.3. Изменения в тотальном профиле транскрипции в клетках Synechocystis под действием генератора суперокеида MV
1.4.4. Контроль устойчивости клеток Synechocystis к MV с участием регуляторного гена prqR и генов белков-транспортеров
2. Молекулярные механизмы адаптации цианобактерий к солевому и гиперосмотическому стрессу
2.1. Специфичность адаптивных ответов клеток Synechocystis па солевой и гиперосмотический стресс
2.2. Перекрывание адаптивных ответов на солевой и гиперосмотический стресс
2.3. Кинетика адаптивного ответа клеток Synechocystis на солевой стресс
2.4. Регуляция адаптивного ответа клеток на солевой и гиперосмотичеекий стресс
3. Механизмы адаптации клеток Synechocystis к холодовому стрессу
4. Системы адаптации фотоеинтезирующих организмов к световому стрессу
5. Генетический контроль фототаксиса и биогенеза пилей у Synechocystis 37 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2. Питательные среды и культивирование микроорганизмов
3. Определение содержания хлорофилла и каротииоидов в клетках цианобактерий
4. Трансформация клеток Е. coli и Synechocystis
5. Передача плазмид из Е. coli в Synechocystis с помощью конъюгации
6. Тест па чувствительность клеток к ингибиторам роста
7. Измерение активности р-галактозидазы в клетках Synechocystis
8. Выделение ДНК, определение числа копий плазмид в клетке
9. Обработка ДНК ферментами
10. Электрофорез ДНК в агарозном геле и выделение ДНК из геля
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
12. Сайт-паправлепиый мутагенез
13. Определение последовательности пуклеотидов в ДИК
14. Выделение РНК, электрофорез и перенос РНК из геля на нейлоновую мембрану
15. Получение специфических ДНК-зондов
16. Нозсрп-блот-гибридизация
17. Анализ профилей транскрипции в клетках Synechocystis с помощью ДНК-микрочипов
18. Атомио-силовая микроскопия 50 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ регуляторпой функции генаprqR с помощью сайт-паправлсппого мутагенеза и гепов-репортеров
1.1. С-копцевой участок необходим для функционирования белка PrqR в качестве репрессора транскрипции
1.2. Системы анализа экспрессии и взаимодействия аллелей генаprqR
1.3. Негативная авторегуляция гена prqR в клетках Е. coli
1.4. Z/мс-домииаптный характер проявления мутаптпого аллсля prqRL17Q в клетках Synechocystis
2. Оперон prqR-prqA вовлечен в адаптивный ответ клеток па солевой стресс
3. Плсйотроппый характер мутацииprqRLl7Q: повышенная устойчивость клеток к
MV и отрицательный фототаксис, независимый от интенсивности света
4. Делеция prqR и ипсерциоппая инактивация гена prqA не влияют па фототаксис
5. Зависимость подвижности клеток мутанта Pql7 от спектра света
6. В регуляцию фототаксиса вовлечен ген sll0886, контролирующий активируемый светом гетеротрофный рост клеток Synechocystis
7. Изменения в регуляции генов, ответственных за функционирование пилей, у мутантов с нарушенной функцией гена prqR
8. Анализ морфологии пилей, обеспечивающих подвижность клеток
Synechocystis, у мутантов с нарушенным или измененным фототаксисом
8.1. Сравнительный анализ пилей, формируемых подвижными и неподвижными клетками штаммов ДТ и ДТ-М Synechocystis
8.2. Гены prqR и sll0886 контролируют функционирование толстых пилей, по не их биогенез
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ кластера генов, контролирующих устойчивость к метилвиологену и фототаксис цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803"
Процессы аэробного дыхания и окспгешюго фотосинтеза сопряжены с образованием активных форм кислорода (АФК), таких как сииглетпый кислород, апноп-радикал супероксида (Ог--), пероксид водорода и гидроксильный радикал. Эти токсичные соединения способны индуцировать в клетке окислительный стресс (ОС), повреждая нуклеиновые кислоты, белки и мембраны (Farr, Kogoma, 1991). У фотосинтсзирующих организмов образование С>2Г происходит в основном за счет прямого восстановления кислорода фотосистемой I. Мощным ингибитором роста фотосинтсзирующих организмов па свету является гербицид паракваг, или метилвиологен (MV), способный эффективно акцептировать электроны от фотосистемы I и восстанавливать кислород до С^-- (Asada, 1994). Образование АФК может также стимулироваться различными факторами внешней среды, в частности, повышенным освещением, экстремальной температурой, а также нарушением водного и солевого режимов (Alscher et al, 1997; Gueta-Dahan et al., 1997). Циапобактсрии и растения обладают эффективными механизмами адаптации к изменению иптепснвиости света, которые позволяют оптимизировать фотосинтез и ограничить повреждения, связанные с фотоокислепием. Одним из таких механизмов является фототаксис циаиобактерий и хлоропластов растений, положительный - к свету, и отрицательный - от света высокой иптепснвиости (Kagawa, Wada, 1999; Castenholz, Garcia-Pichel, 2000).
С помощью геномного апалпза и современных методов биоипформатнки у модельной цпапобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis) установлено наличие не менее 15 генов, кодирующих белки е аитиоксидаптпыми функциями (CyanoBase Website). Вместе с тем выявлено около 150 регуляторных генов; почти половина из них кодирует транскрипционные регуляторы, у большинства из которых функции предполагаемы или неизвестны. Значительная часть регуляторных генов (80 генов) представляет двухкомпопентные системы, которые в клетках прокариот контролируют различные адаптивные ответы, такие как хемотаксис, осморегуляцию, азотный и фосфорный метаболизм, споруляцию, развитие компетентности при трансформации, патогеппость, вирулентность и др. (Durnford et al., 1997; Li, Sherman, 2000). В связи с этим идентификация функций генов, вовлеченных в регуляцию работы систем жизнеобеспечения, в том числе защитных, у циаиобактерий, является актуальной задачей современной генетики.
В последние годы представления о координированной экспрессии генов фотосиптезирующих организмов в ответ на стрессовые воздействия существенно расширились благодаря использованию метода ДНК-микрочипов (микроэррэй-апализ транскрипции ДНК), позволяющего оценить степень активации или репрессии всех генов организма. С помощью данного подхода исследованы глобальные изменения экспрессии генов Synechocystis при солевом, гнперосмотическом и холодовом шоке (Kanesaki el al., 2002; Suzuki et al., 2001; Inaba et al., 2003), при адаптации клеток к высокой интенсивности света (Hihara et al., 2001) и обработке их MV и пероксидом водорода (Kobayashi et al., 2004; Li et al., 2004). В результате выявлены целые ансамбли генов, специфически реагирующие па различные стрессовые воздействия.
В пашей лаборатории показано, что в контроль устойчивости клеток Synechocystis к индуктору ОС MV вовлечен геи prqR, кодирующий регулятор транскрипции семейства TetR (Бабыкин и др., 2003). Этот геи негативно контролирует оперой prqR-prqA, в котором геп prqA кодирует белок с предполагаемой функцией NaVMV-антипортера. Более того, выявлено индуцируемое MV усиление авторепрессии гепа prqR, сопряженное с существенным повышением транскрипции других генов с защитными функциями: soclB, кодирующего супероксиддисмутазу, и nivrA, кодирующего предполагаемый белок-транспортер токсичных соединений (Нефедова и др., 2003). В данной работе нами показано, что мутация в гене prqR обуславливает отрицательный фототаксис клеток, независимый от интенсивности света. Таким образом, геп prqR вовлечен в контроль систем адаптивного ответа цианобактерий на ОС и изменения интенсивности света.
С целыо изучения механизмов генетической регуляции защитных систем клетки с участием гена prqR и генов, входящих с ним в один кластер, были поставлены следующие основные задачи исследования:
1. Молекулярно-геиетический анализ авторегуляторной функции гена prqR с помощью сайт-иаправленного мутагенеза и генов-репортеров.
2. Выявление стрессового фактора или возможного индуктора, стимулирующего экспрессию оперопа prqR-prqA, истинная защитная роль которого в клетках цианобактерий требует выяснения.
3. Анализ методом ДНК-микрочипов изменений в тотальном профиле транскрипции у мутантов с нарушенной функцией prqR для обнаружения новых генов, экспрессия которых контролируется геном prqR.
4. Функциональный анализ генов, входящих в один кластер с геном prqR (sll0887, sll0886 и prqA), для установления их роли в регуляции фототаксиса у цианобактерий.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Генетический контроль и молекулярные механизмы адаптации фотоепптезпрующпх организмов к стрессовым факторам
1. Окислительным стресс п антпокепдантные системы защиты
Жизнедеятельность аэробных организмов сопряжена с постоянной угрозой окислительного стресса (ОС), представляющего комплексный токсический эффект активных форм кислорода (АФК), способных индуцировать различные повреждения в ДИК, PIIK, белках и мембранах. Образование АФК, таких как синглетный кислород, супероксид-радикал, псрскись водорода и гидроксильпый радикал, является неизбежным следствием аэробного метаболизма. Организмы, обладающие оксигенным фотосинтезом, подвержены сильному ОС, поскольку сами продуцируют кислород и восстановители в процессе фотосинтеза. Значительные количества АФК образуются также в ответ па действие различных факторов внешней среды. К факторам, индуцирующим ОС у растений, относятся, в частности, повышенное освещение, экстремальные температуры, а также изменения водного и солевого режимов (Alscher et al., 1997; Gueta-Dahan et al., 1997). Эти воздействия вызывают в клетках фотоеинтезирующих организмов дисбаланс в распределении энергии и электронов между двумя фотосистемами (Jeanjean et al., 1993; Murakami et al., 1997). Фотосенсибилизация клеток и повышение активности фотосистемы I, индуцируемые такими стрессовыми факторами, в совокупности с понижением уровня ассимиляции углекислого газа могут благоприятствовать фотовосстановлению кислорода с образованием АФК (Asada, 1994).
Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кирик, Инесса Анатольевна
ВЫВОДЫ
У цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 исследовали кластер генов sll0886-prqR-prqA, в котором ген prqR негативно регулирует устойчивость клеток к индуктору окислительного стресса метилвиологеиу.
1. С помощью сайт-направленного мутагенеза и генетического анализа гена prqR установлено, что репрессорпая функция белка PrqR обеспечивается как N-коицевым ДПК-связывающим доменом, так и С-концевым доменом. Единственный остаток цистеина в С-концевом домене не влияет па функциональную активность белка PrqR.
2. Показано, что геп prqA, продуктом которого является предполагаемый Na+-завпенмый антипортер метилвиологена, может транскрибироваться как с промотора оперона prqR-prqA, так и с собственного конститутивного промотора. Также выявлена индукция оперопа prqR-prqA при обработке клеток хлоридом натрия, что указывает на возможное участие белка PrqA в адаптации клеток к солевому стрессу.
3. Обнаружено участие гена prqR в контроле фототаксиса клеток Synechocystis. Мутация L17Q в этом гене приводит к переключению фототаксиса с положительного на отрицательный. Показано, что геп prqR вовлечен в регуляцию экспрессии оперопов, продукты которых необходимы для функционирования пилей, обеспечивающих подвижность клеток: негативную регуляцию оперопа pilA5-pilA6 и позитивную - оперона pilA9-pilA10-pilAll-slr2018, а также гена spkA.
4. С помощью ипссрциопиого мутагенеза выявлено, что в контроль фототаксиса вовлечен также геи sll0886, контролирующий активируемый светом гетеротрофный рост клеток.
5. У мутантов по генам prqR и sll0886 не изменен биогенез пилей, что подтверждает участие этих генов в регуляции функционирования пилей, возможно, в системах восприятия и передачи светового сигнала при фототаксисе.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методами молекулярной генетики и функциональной геномики исследован кластер генов sll0887-sll0886-prqR-prqA цианобактерии Synechocystis. Получена новая информация о регуляторной функции гена prqR и характере экспрессии оперона prcjR-prqA, вовлеченного в контроль устойчивости клеток к индуктору ОС MV. Показано, что авторепрессия гепа prqR, стимулируемая MV (Бабыкии и др., 2003), не связана е наличием редокс-чувствительпого остатка цистеииа в белке PrqR. Однако доминантный характер мутации в гене prqR может свидетельствовать о наличии цис-действующей авторепрессии этого гена. Не исключено, что такой механизм авторегуляции гена prqR обеспечивает эффективное подавление его транскрипции при ОС, индуцируемом MV. Между тем установлено наличие дополнительного промотора, с которого осуществляется экспрессия генаprqA, необходимая для поддержания конститутивной устойчивости клеток к MV.
Важным условием выяснения природной функции оперона prqR-prqA у Synechocystis является идентификация его клеточного индуктора. В данной работе показано, что в ответ на солевой стресс на ранней стадии его развития происходит существенное повышение экспрессии оперона prqR-prqA в целом, а пе только гена prqR, как сообщалось ранее. Это позволяет полагать, что белок PrqA, относящийся к недавно описанному семейству белков МАТЕ, которые широко представлены в клетках растений, играет защитную роль в системе адаптации клеток к солевому стрессу. Однако, несмотря па наличие повой информации об адаптивном характере экспрессии оперона prqR-prqA, его нстиипый внутриклеточный индуктор н, соответственно, его основная функция в клетках циаиобактерий остаются неясными и требуют дальнейшего исследования. При этом согласно имеющимся сведениям о роли белков МАТЕ у бактерий и растений следует учитывать возможность вовлечения оперона prqR-prqA в контроль таких процессов, как нейтрализация ионов переходных металлов и защита от антибиотиков, синтезируемых в природных сообществах микроорганизмов.
Впервые выявлено участие генов prqR и sll0886 в контроле фототаксиса циаиобактерий, причем полученные в работе данные указывают на то, что эти гепы вовлечены в два пути зависимой от света регуляции подвижности клеток. При этом не исключается, что геи sll0886 вовлечен одновременно в контроль активируемого светом гетеротрофного роста и контроль отрицательного фототаксиса клеток. Вместе с тем установлено, что геп prqR участвует в регуляции генов, продукты которых необходимы для функционирования пилей, обеспечивающих подвижность клеток: негативную регуляцию оперона pilA5-pilA6 и позитивную - гена spkA и оперона pilA9-pilA10-pilAll-slr2018.
При изучении поверхностных структур клеток цианобактерий был использован новый метод атомпо-енловой микроскопии, имеющей ряд существенных преимуществ по сравнению с традиционной растровой и просвечивающей электронной микроскопией. Данный метод успешно отработан в применении к различным штаммам Synechocystis и позволяет эффективно идентифицировать изменения в морфологии пилей, обеспечивающих подвижность клеток при фототаксисе. На основании результатов, полученных с помощью атомпо-силовой микроскопии, подтвержден вывод о том, что гены prqR и sll0886 контролируют пе биогенез пилей, а их функционирование.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кирик, Инесса Анатольевна, Москва
1. Бабыкин М.М., Сидорук КВ., Зинченко В.В., Нефедова Л.Н., Церфф Р., Шестаков С.В. Об участии регуляторного гена PrqR в развитии устойчивости к метилвиологену у циаиобактерии Synecliocystis sp. РСС 6803 // Генетика 2003. 39 (1): 18-24.
2. Владимиров IO.A. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал 2000. 12: 13-19.
3. Кирик И.А., Зинченко В.В., Шестаков С.В., Бабыкин М.М. Транс- и цис-действующая авторепрессия гена prqR у циаиобактерии Synecliocystis sp. РСС 6803 // Молекулярная биология 2003. 37 (6): 1035-1044.
4. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативпая модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал 1999. 1:2-7.
5. Манпиатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва, «Мир», 1984. 479.
6. Мичлер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва, «Мир», 1976. 440.
7. Нефедова Л.Н., Мельник В.А., Бабыкин М.М. Мутанты циаиобактерии Synecliocystis sp. РСС 6803 с ипсерциопиой инактивацией гена soclB, кодирующего Fe-супероксиддисмутазу // Генетика 2003. 39 (4): 478-482.
8. Aguilar P.S., Hernandez-Arriaga A.M., Cybulski L.E., Erazo А.С., de Metuloza D. Molecular basis of thermosensing: a two-component signal transduction thermometer in Bacillus subtilis II EMBO J. 2001. 20:1681-1691.
9. Alfonso M., Perewoska I., Constant S., Kirilovsky D. Redox control ofpsbA expression in cyanobacteria Synecliocystis strains //J. Photochem. Photobiol. Biol. 1999. 48: 104— 113.
10. Allakhverdiev S.I., Sakamoto A., Nishiyama Y., and Murata N. Inactivation of photosystems I and II in response to osmotic stress in Synechococcus. Contribution of water channels//Plant Physiol. 2000. 122: 1201-1208.
11. Allakhverdiev S.I., Sakamoto A., Nishiyama Y., Inaba M., and Murata N. Ionic and osmotic effects of NaCl-induced inactivation of photosystems I and II in Synechococcus sp. // Plant Physiol. 2000. 123: 1047-1056.
12. Allen R. Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants // Plant Physiol. 1995. 107 (4): 1049-54.
13. Alscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. Reactive oxygen species and antioxidants: relationships in green cclls // Physiol. Plant. 1997. 100: 224-233.
14. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller IV, Lipnian D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. 25 (17): 3389-402.
15. Anderson J.M. Photoregulation of the composition, function, and structure of thylakoid membranes // Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. 37: 93-136.
16. Asad N.R., Asad L.M., Silva А.В., Felzenszwalb I., Leitao A.C. Hydrogen peroxide effects in Escherichia coli cells // Acta Biochim. Pol. 1998. 45 (3): 677-90.
17. Asada K. Production and action of active oxygen species in photosynthetic tissues. In: C. Foyer, P. Mullineaux (eds). Causes of photooxidative stress and amelioration of defense systems in plants // CRC Press, Boca Raton, FL 1994. 77-104.
18. Ball L., Richard 0., Bechtolcl U., Penkett C., Reynolds //., Kular В., Creissen G., Karpinski S., Schuch IV., Mullineaux P. Changes in global gene expression in response to excess excitation energy in Arabidopsis thaliana II J. Exp. Bot. 2001. 52.
19. Beckmann M., Venkataraman S., Doktycz M., Nataro J., Sullivan C., Morrell-Falvey J., Allison D. Measuring cell surface elasticity on enteroaggregative Escherichia coli wild type and dispersin mutant by AFM // Ultramicroscopy. 2006 106 (8): 695-702.
20. Bhaya D., Bianco N., Bryant D., Grossman A.R. Type IV pilus biogenesis and motility in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 // Mol. Microbiol. 2000. 37: 941951.
21. Bhaya D., Takahashi A., Grossman A. Light regulation of Type IV pilus-dependent motility by ehemosensor-like elements in Synechocystis PCC 6803 // Proe. Natl. Acad. Sci. USA. 2001 a. 98: 7540-7545.
22. Bhaya D., Takahashi A., Shahi P., Grossman A. Novel motility mutants of Synechocystis strain PCC 6803 generated by in vitro transposon mutagenesis // J. Baeteriol. 2001 6. 183 (20): 6140-6143
23. Bhaya D., Watanabe N. Ogawa Т., Grossman A. The role of an alternate sigma factor in motility and pili formation in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96: 3188-3193.
24. Blokhina 0., Virolainen E., Fagerstedt K. Antioxidants, oxidative Damage and Oxygen Deprivation stress: a review // Annals of Botany 2003. 94: 179-194.
25. Bolshakova A., Kiselyova, 0., Filonov A., Frolova 0., Lyubchenko Yit., Yaminsky I. Comparative studies of bactcria with atomic force microscopy operating in different modes// Ultramicroscopy 2001. 86(1-2): 121-28
26. Borgnia M., Nielsen S., Engel A., Agre P. Cellular and molecular biology of the aquaporin water channels // Annu. Rev. Biochem. 1999. 68, 425-458.
27. Bowry V., Mohr D., Cleary J., Stocker R. Prevention of tocopherol-mediated peroxidation in ubiquinol-10-free human low density lipoprotein // J. Biol. Chem. 1995. 270(11): 5756-5763.
28. Boyd A., Kendall K, Simon M.I. Structure of the serine chemoreceptor in Escherichia coli II Nature 1983. 301: 623-626.
29. Browse J., Xin, Z. Temperature sensing and cold acclimation // Curr. Opin. Plant. Biol. 2001.4:241-246.
30. Bsat N. Herbig A., Casillas-Martinez L., Setlow P., Helmann J.D. Bacillus subtilis contains multiple Fur homologues: identification of the iron uptake (Fur) and peroxide regulon (PerR) repressors // Mol. Microbiol. 1998. 29 (1): 189-98.
31. Castenholz R., Garcia-Pichel F. Cyanobacterial responses to UV-radiation // The ecology of cyanobacteria. 2000. 591-611.
32. Chamot D„ Magee IV.C., Yu E., Owttrim G.W. A cold shock-induced cyanobacterial RNA helicase // J. Bacteriol. 1999. 181 (6): 1728-32.
33. Chen I, Dubnau D. DNA uptake during bacterial transformation // Nat. Rev. Microbiol. 2004. 2(3):241-249.
34. Choi J., Chung K, Moon Y., Kim C., Watanabe M., Song P., et al. Pliotomovement of the gliding cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // Photochem. Photobiol. 1999, 70: 95-102.
35. Csonka L. N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress // Microbiol. Rev. 1989. 53: 121-147.
36. Darzins A., Russell M. Molecular genetic analysis of type-IV pilus biogenesis and twitching motility using Pseiulomonas aeruginosa as a model system // Gene 1997. 192:109-115.
37. Delamarche C., Thomas D., Rolland J. P., Froger A., Gouranton J., Svelto M., Agre P., Calamita G. Visualization of AqpZmediated water permeability in Escherichia coli by cryoelectron microscopy//J. Bacteriol. 1999. 181: 4193-4197.
38. Dietz K., Ilorling F., Konig J., Baier M. The function of the chloroplast 2-cysteine peroxiredoxin in peroxide detoxification and its regulation // J. Exp. Bot. 2002. 53: 1321-1329.
39. Durnford D., Falkowski P. Chloroplast redox regulation of nuclear gene transcription during photoacclimation//Photosyn. Res. 1997, 53: 229-241.
40. Elanskaya /., Karandashova I., Bogachev A., Hagemann M. Physiological characterization of mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 affected in putative Nai/Hi antiporter encoding genes // Biochemistry 2002. 67: 432440.
41. Ernster L, Forsmark-Andree P. Ubiquinol: an endogenous antioxidant in aerobic organisms//Clin. Invest. 1993. 71: 60-65.
42. Escolar L., Perez-Martin J., De Lorenzo V. Opening the iron box: transcriptional metalloregulation by the Fur protein // J. Bacteriol. 1999. 181: 6223- 6229.
43. Farr S., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium //Microbiol. Rev. 1991. 55: 561-85.
44. Farewell A., Kvint K., Nystrom T. UspB, a new cts -regulated gene in Escherichia coli which is required for stationary-phase resistance to ethanol // J. Bacteriol. 1998. 180 (23): 6140-6147.
45. Filonov A.S., Gavrilko D.Yu., Yaminsky I.V. "FemtoScan" Software for Three-Dimensional Image Processing. // Moscow: Advanced Technologies Center, 2001.
46. Foyer C., Descourvieres P., Kunert K. Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants // Plant, Cell and Environment. 1994. 17: 507-523.
47. Foyer C., Lelandais M., Edwards E., Mullineaux P. The role of ascorbate in plants, interactions with photosynthesis and regulatory significance in active Oxygen/Oxidative stress and plant Metabolism // Plant Phys. 1991. 131-144.
48. Foyer C., Lelandais M„ Galap C., Kunnert K. Effects of elevated cytosolie glutatione reductase activity on the cellular glutatione pool and photosynthesis in leaves under normal and stress conditions // Plant Phys. 1991. 97: 863-872.
49. Gaballa A., Helmann J. Identification of a zinc-specific metalloregulatory protein, Zur, controlling zinc transport operons in Bacillus subtilis II J. Bacteriol. 1998. 180: 58155821.
50. Gaber A., Tamoib M., Takeda T, Nakano Y., Shigeoka S. NADPH-dependent glutathione peroxidase-like proteins (Gpx-1, Gpx-2) reduce unsaturated fatty acid hydroperoxides in Synechocystis PCC 6803 // FEBS Letters 2001. 499: 32-36.
51. Gebicki J.M., Bielski B.H.J. Comparison of the capacities of the perhydroxyl and superoxide radicals to initiate chain oxidation of linoleic acid // J. Am. Chem. Soc. 1981. 103: 7020-2.
52. Ghassemian M., Straus N. Fur regulates the expression of ironstress genes in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 // Microbiology. 1996. 142: 14691476.
53. Grace S„ Logan B. Acclimation of foliar antioxidant systems to growth irradiance in three broad-leaved evergreen species//Plant Physiol. 1996. 112: 1631-1640.
54. Gueta-Dahan Y., Yaniv Z., Zilinskas B.A., Ben-Hayyim G. Salt and oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt tolerance in citrus // Planta. 1997. 203: 460-469.
55. HciderD. Photosensory behavior in prokaryotes//Microbiol. Rev. 1987. 51: 1-21.
56. Hagemann M., Schoor A., Mikkat S., Effmert U., Zuther E., Marin K. Fulda cyanobacteria. // In A. Oren, Microbiology and biogeochemistry of hypersaline environments. CRC Press, Boca Raton, FL. 177-186
57. Ilalliwell В., Gutteridge J. Role of free radicals and catalytic metal ions in human desease: an overview//Methods Enzymol. 1990. 186: 1-85.
58. He Q., Dolganov N., Bjorkman O., Grossman A.R. The high light-inducible polypeptides in Synechocystis PCC 6803. Expression and function in high light // J Biol. Chem. 2001.276:306-314.
59. Ilengge-Aronis R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the cts (RpoS) subunit of RNA polymerase //Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 2002. 66 (3): 373-395
60. Herbig A., Helmann D. Roles of metal ions and hydrogen peroxide in modulating the interaction of the Bacillus subtilis PerR peroxide regulon repressor with operator DNA // Mol. Microbiol. 2001. 41: 849-859.
61. Hernandez J., Bes M., Filial M., Neira J., Peleato M. Biochemical analysis of the recombinant Fur (ferric uptake regulator) protein from Anabaena PCC 7119: factors affccting its oligomcrization state// Biochem. J. 2002. 366: 315-322.
62. Heymann J,В., Engel A. Aquaporins: phylogeny, structure, and physiology of water channels//News Physiol. Sci. 1999. 14: 187-193.
63. Ileymann J.В., Engel A. Structural clues in the sequences of the aquaporins // J. Mol. Biol. 2000. 295:1039-1053.
64. Ilihara Y., Kamei A., Kanehisa M., Kaplan А., и Ikeuchi M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light // The Plant Cell. 2001.13: 793-806.
65. Hillen IV., Berens C. Mechanisms underlying expression of TnlO encoded tetracycline resistance // Annu. Rev. Microbiol. 1994. 48: 345-69.
66. Hoffmann E.K., Dunham P.B. Membrane mechanisms and intracellular signalling in cell volume regulation//Int. Rev. Cytol. 1995. 161: 173-262.
67. Hofmann В., Hecht H., Flohe L. Peroxiredoxins // Biol. Chcm. 2002. 383: 347-364.
68. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids //Anal. Biochem. 1981. 114: 193-197.
69. Horsburgh M., Clements M., Crossley II, Ingham E., Foster S. PerR controls oxidative stress resistance and iron storage proteins and is required for virulence in Staphylococcus aureus // Infect. Immun. 2001. 69: 3744-3754.
70. Horsburgh M., Clements M., Crossley II., Ingham E., Foster S. PerR controls oxidative stress resistance and iron storage proteins and is required for virulence in Staphylococcus aureus II Infect. Immun. 2001. 69: 3744-3754.
71. Hoshi Т., Heinemann S. Regulation of ccll function by methionine oxidation and reduction // J. Physiol. 2001. 531: 1-11.
72. ImlayJ. Pathways of oxidative damage // Annu. Rev. Microbiol. 2003. 57: 395-418.
73. Inaba M., Sakamoto A., Murata N. Functional expression in Escherichia coli of low-affinity and high-affinity Nai(Lii)/Hi antiporters of Synechocystis И J. Bactcriol. 2001. 83: 1376-1384.
74. Inaba M., Suzuki I., Szalontai В., Kanesaki Y, Los D., Hayashi H., Murata N. Gene-engineered Rigidification of Membrane Lipids Enhances the Cold Inducibility of Gene
75. Expression in Synechocystis И The Journal of Biological Chemistry 2003. 278 (14): 12191-12198.
76. Itzhaki II, Naveh L., Lindahl M., Cook M., Adam Z. Identification and characterization of DegP, a serine protease associated with the luminal side of the thylakoid membrane //J. Biol. Chem. 1998. 273: 7094-7098.
77. Jeanjean R., Matthijs #., Onana В., Havaux M., Joset F. Exposure of cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 to salt stress induces concerted changes in respiration and photosynthesis // Plant Cell Physiol. 1993.34: 1073-1079.
78. Johansson I., Karlsson M., Johanson U., Larsson C., Kjellbom P. The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance // Biochimica et Biophysica Acta 2000. 1465: 324-342.
79. Kagawa Т., Wada M. Chloroplast-avoidance response induced by high-fluence blue light in prothallial cells of the fern Adiantum capillusveneris as analyzed by microbeam irradiation // Plant Physiol. 1999. 119: 917-923.
80. Kamei A., Yoshihara S., Yuasa Т., Geng X., Ikeuchi M. Biochemical and functional characterization of a eukaryotic-type protein kinase, spkB, in the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803 // Cur. Microbiol. 2003. 46: 296-301.
81. Kamei A., Yuasa Т., Orikawa K, GengX., Ikeuchi M. A eukaryotic-type protein kinase, SpkA, is required for normal motility of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 //J. Bacteriol. 2001. 183: 1505-1510.
82. Kamei A., Yuasa Т., Geng X., Ikeuchi M. Biochemical examination of the potential eukaryotic-type protein kinase genes in the complete genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // DNA Research. 2002. 9: 71-78
83. Kanervo E., Tasaka Y., Murata N. Aro E.-M. Membrane lipid unsaturation modulates processing of the photosystem II reaction-center protein D1 at low temperatures // Plant Physiol. 1997. 114: 841-849.
84. Kanesaki Y., Suzuki /., Allakhverdiev S., Mikami K., Murata N. Salt Stress and Hyperosmotic Stress Regulate the Expression of Different Sets of Genes in
85. Synecliocystis sp. РСС 6803 // Biochemical and Biophysical Research Communications 2002. 290: 339-348.
86. Karpinska В., Wingsle G., Karpinski S. Antagonistic cffccts of hydrogen peroxide and glutathione on acclimation to excess excitation energy in Arabidopsis IIIUBMB Life. 2000.50:21-26.
87. Kehres D„ Zaharik M., Finlay В., Maguire M. The NRAMP proteins of Salmonella typhimuriwn and Escherichia coli are sclectivc manganese transporters involved in the response to reactive oxygen // Mol. Microbiol. 2000. 36:1085-1100.
88. Kelly W.G., Dahnuis M.E., Hart G.W. RNA polymerase II is a glycoprotein. Modification of the COOH-tcrminal domain by O-GlcNAc // J. Biol. Chem. 1993. 268(14): 10416-24.
89. Kempf В., Bremer E. Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress response to high-osmolarity environments // Arch Microbiol 1998. 170: 319-330.
90. Kong R., Хи X., Ни Z. A TPR-family membrane protein gene is required for light-activatcd heterotrophic growth of the cyanobactcrium Synechocystis sp. PCC 6803 // FEMS Microbiol. Letters. 2003. 219: 75-79.
91. Kovtun Y., Chin IV., Tena G., Sheen J. Functional analysis of oxidative stress-activatcd mitogen-activated protein kinase cascade in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97: 2940-2945.
92. Kreppel L. K, Hart G. W. Regulation of a cytosolic and nuclear O-GlcNAc transferase. Role of the tctratricopcptide repeats // J. Biol. Chem. 1999. 274: 32015-23.
93. Kullik I., Stevens J., Toledano M., Storz G. Mutational analysis of the redox-sensitive transcriptional regulator OxyR: regions important for DNA binding and multimerization//J. Bacteriol. 1995. 177: 1285-1291.
94. Kullik I., Toledano M., Tartaglia L, Storz G. Mutational analysis of the rcdox-sensitivc transcriptional regulator OxyR: regions important for oxidation and transcriptional activation//J. Bacteriol. 1995. 177: 1275-1284.
95. Lauer P., Albertson N. Koomey M. Conservation of genes encoding components of a type IV pilus assembly-two-step protein export pathway in Neisseria gonorrhoeae II Mol. Microbiol. 1993.8:357-68.
96. Lee, I., Lin J., Hall H., Bearson В., Foster J. The stationary-phase sigma factor cts (RpoS) is required for a sustained acid tolerance response in virulent Salmonella typhimuriwn II Mol. Microbiol. 1995. 17:155-167.
97. Lewis K. Programmed death in bacteria // Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 2000. 64 (3): 503-514.
98. Li H., Sherman L. A redox-responsive regulator of photosynthesis gene expression in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 // J. Bacteriol. 2000. 182 (15): 4268-77.
99. Li 11., Singh A., Mclntyre L., Sherman L. Differential Gene Expression in Response to Hydrogen Peroxide and the Putative PerR Regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803//J. of Bacteriol. 2004. 3331-3345.
100. Li II., Singh A.K., Mclntyre M.M., Sherman L.A. Differential Gene Expression in Response to Hydrogen Peroxide and the Putative PerR Regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803 Hi. of Bacteriol. 2004. 186 (11): 3331-3345.
101. Liochev S., Hausladen A., Fridovich I. Nitroreduktase A is regulated as a member of the soxRS regulon of Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96: 35373539.
102. Lubas IF.A., Hanover J.A. Functional expression of O-linked GleNAc transferase. Domain structure and substrate specificity// J. Biol. Chem. 2000. 275(15): 10983-8.
103. Marin K„ Kanesaki Y., Los D., Murata N., Suzuki I., Hagemann M. Gene expression profiling reflects physiological processes in salt acclimation of Synechocystis sp. strain PCC 6803//Plant Physiol. 2004. 136: 1-11.
104. Mary I., Tu C-J., Grossman A., Vaulot D. Effects of high light on transcripts of stress-associated genes for the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 and Prochlorococcus MED4 and MIT9313 // Microbiol. 2004. 150: 1271-1281.
105. Mattick J., Whitchurch C., Aim R. The molecular genetics of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa II Gene. 1996. 179: 147-155.
106. May M., Vernoiix Т., Sanchez-Fernandez R., Van Montagu M., Inze D. Evidence for posttranseriptional activation of gamma-glutamylcysteine synthetase during plant stress responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. 95: 12049-12054.
107. Meikrantz W., Smith D.M., Sladicka M.M., Schlegel R.A. Nuclear localization of an 0-glycosylated protein phosphotyrosine phosphatase from human cells // J. Cell. Sci. 1991.98:303-307.
108. Mikami K, Kanesaki Y, Suzuki I., Murata N. The histidine kinase Hik33 perceives osmotic stress and cold stress in Synechocystis sp. PCC 6803 // Molecular Microbiology 2002. 46 (4): 905-915.
109. Mileykovskaya E„ Dowhan W. The Cpx twocomponent signal transduction pathway is activated in Escherichia coli mutant strains lacking phosphatidylethanolamine // J. Bacteriol. 1997. 179: 1029-1034.
110. Miyake C., Asada К Thylakoid bound ascorbate peroxidase in spinach chliroplasts and photoreduction of its primary oxidation product, monodehydroascorbate radicals in thylakoids // Plant Cell Physiol. 1992. 33: 541-553.
111. Morita Y., Kataoka A., Shiota S., Mizushimat Т., Tsuchiya T. NorM of Vibrio parahaemolyticus is an Na+-Driven Multidrug Efflux Pump // J. of Bacteriol. 2000. 182(23): 6694-6697.
112. Mulo P., Laakso S., Maenpaa P., Aro E. Stepwise photoinhibition of photosystem II. Studies with Synechocystis species PCC 6803 mutants with a modified D-E loop of the reaction center polypeptide D1 // Plant Physiol. 1998. 117: 483-490.
113. Murakami A., Kim S., Fujita J. Changes in photosystem stoiehiometry in response to environmental conditions for cell growth observed with the cyanophyte Synechocystis PCC 6714 // Plant Cell Physiol. 1997. 38: 392-397.
114. Murata N., Los D.A. Membrane fluidity and temperature perception // Plant Physiol. 1997.115: 875-879.
115. Murata N., Wada II. Acyl-lipid desaturases and their importance in the tolerance and acclimatization to cold ofcyanobacteria// Biochem. J. 1995. 308: 1-8.
116. Navarro F., Florencio F. The cyanobacterial thioredoxin gene is required for both photoautotrophic and heterotrophic growth // Plant Physiol. 1996. Ill: 1067-1075.
117. Neill S., Desikan II, Clarke A., Hurst R., Hancock J. Hydrogen Peroxide and Nitric Oxide as Signalling Molecules in Plants //J. Exp. Bot. 2001. 52.
118. Nover L., Scharf K. Heat stress proteins and transcription factors // Cell Mol. Life Sci. 1997. 53:80-103.
119. Nultsch W., Schuchart II., Koenig F. Effects of sodium azide on phototaxis of the blue-green alga Anabaena variabilis and consequences to the two-photoreceptor systems-hypothesis // Arch. Microbiol. 1983. 134: 33-37.
120. Nunez M., Martin M., Chan P., Duong L., Sinclhurakar A., Spain E. Atomic force microscopy of bacterial communities. // Methods Enzymol. 2005. 397:256-68.
121. Ohkawa H„ Pakrasi H.B., Ogawa T. Two types of functionally distinct NAD(H)P dehydrogenases in Synechocystis sp. strain PCC 6803 // J. Biol. Chem. 2000. 275: 31630-31634.
122. Ohkawa II., Price G.D., Badger M.R., Ogawa T. Mutation of rnlh genes leads to inhibition of CO2 uptake rather than HCO3 uptake in Synechocystis sp. PCC 6803 // J. Bactcriol. 2000. 182: 2591-2596.
123. Pastori G., Foyer C. Identifying Oxidative Stress Responsive Genes by Transposon Tagging//J. Exp. Bot. 2001. 52.
124. Patzer S., Hantke К The ZnuABC high-affinity zinc uptake system and its regulator Zur in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1998. 28: 1199-1210.
125. Perraud A.-L., Weiss V., Gross R. Signalling pathways in two-component phosphorelay systems//Trends Microbiol. 1999.7: 115-120.
126. Pfannschmidt Т., Nilsson A., Allen J. Photosynthetic control of chloroplast gene expression //Nature 1999. 397: 625-628.
127. PolleA., Chakrabarti К, Schumann W., Rennenberg H. Composition and properties of hydrogen peroxide decomposing systems in extracellular and total extracts from needles of Norway spruce (Picea abies L., karst) // Plant Physiol. 1990. 94: 312-319.
128. Pomposiello P., Demple B. Redox-operated genetic switches: the SoxR and SoxS transcription factors // Trends Biotechnol. 2001. 19: 109-114
129. Ramos J.L., Martinez-Bueno M., Molina-Henares A.J., Teran IV., Watanabe K., Zhang X., Gallegos M.T., Brennan R., Tobes R. The TetR family of transcriptional repressors II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005. 69 (2): 326-356.
130. Reason A.J., Morris H.R., Panico M., Marais R., Treisman R.H., Haltiwanger R.S., Ilart G.W., Kelly W.G., Dell A. Localization of O-GlcNAc modification on the serum response transcription factor//J. Biol. Chem. 1992. 267(24): 16911-21.
131. Reed R.H., Stewart W.D. Osmotic adjustment and organic solute accumulation in unicellular cyanobacteria from fresh water and marine habitats // Mar. Biol. 1985. 88: 1-9.
132. Repoila F., Gottesman S. Signal transduction cascade for regulation of rpoS: temperature regulation of dsrA //J. Bacteriol. 2001. 183:4012-4023.
133. Rice-Evans C., Miller N., Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds // Trends Plant Sci. 1997. 2: 152-159.
134. Rippka R., Deruelles I., Waterbury I., Herdman M., Stanier R. Genetic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1979. Ill: 1-61.
135. Ritz D., Beckwith J. Roles of thiol-redox pathways in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2001.55:21-48.
136. Ritz D., Patel 11., Doan В., Zheng M., Aslund F., Storz G., Beckwith J. Thioredoxin 2 is involved in the oxidative stress response in Escherichia coli II J. Biol. Chem. 2000. 275:2505-2512.
137. Roxas V., Smith J., Roger K, Allen E„ Allen R. Overexpression of glutathione S-transferase/glutathione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress//Nature Biotech. 1997. 15:988-991.
138. Sakamoto Т., Delgaizo V., Bryant D. Growth on Urea Can Trigger Death and peroxidation of the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002 // Applied and Environmental Microbiology 1998. 64 (7): 2361-2366.
139. Sakamoto Т., Murata N. Regulation of the desaturation of fatty acids and its role in tolerance to cold and salt stress // Curr Opin Microbiol 2002. 5: 206-210.
140. Sato N. Tachikawa Т., Wada A., Tanaka A. Temperature-dependent regulation of the ribosomal smallsubunit protein S21 in the cyanobacterium Anabaena variabilis M3 // J. Bacteriol. 1997. 179: 7063-7671.
141. Scheufler C., Brinker A., Bourenkov G., Pegoraro S., Moroder L., Bartunik H., Hartl F.U., Moarefi I. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine // Cell 2000. 101: 199-210.
142. Scholz P., llaring V., Wittmann-Liebold В., Ashman K, Bagdasarian M., Scherzinger E. Complete nucleotide sequence and gene organization of the broad-host-range plasmid RSF1010// Gene 1989. 75:271-288.
143. Schweizer II.P. Small broad-host-range gentamycin resistance gene cassettes for site-specific insertion and deletion mutagenesis//Bio.Techniq. 1993. 15: 831-833.
144. Sledjeski D., Gupta A., Gottesman S. The small RNA, DsrA, is essential for the low temperature expression of RpoS during exponential growth in E. coli II EMBO J. 1996. 15:3993-4000.
145. Semmler A., Whitchurch C., Mattick J. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa II Microbiol. 1999. 145:2863-73.
146. Shinagawa H. SOS response as an adaptive response to DNA damage in prokaryotes // EXS 1996. 77: 221-235
147. Singh A., Mclntyre L., Sherman L. Microarray analysis of the genomc-wide response to iron deficiency and iron reconstitution in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803//Plant Physiol. 2003. 132: 1825-1839.
148. Spormann A. Gliding motility in bacteria: Insights from studies of Myxococcus xanthus И Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. 63: 621-41.
149. Stadtman E.R. Oxidation of proteins by mixed-function oxidation systems: implication in protein turnover, aging and neutrophil function // Trends Biochem. Sci. 1986. 11: 11-12.
150. Stallkamp I., Dowhan W., Altenclorf K., Jung K. Negatively charged phospholipids influence the activity of the sensor kinase KdpD of Escherichia coli II Arch. Microbiol.1999. 172:259-302.
151. Storz G., Imlay J. Oxidative stress // Curr. Opin. Microbiol. 1999. 2: 188-194.
152. Storz G., Tartaglia L.A., Farr S.B., Ames B.N. Bacterial defenses against oxidative stress // Trends Genet. 1990. 6 (11): 363-8.
153. Strom A.R., Kaasen I. Trehalose metabolism in Escherichia coli: stress protection and stress regulation of gene expression // Mol. Microbiol. 1993. 8: 205-210.
154. Suzuki I., Kanesaki Y„ Mikami K„ Kanehisa M., Murata N. Cold-regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocystis // Mol. Microbiol. 2001. 40: 235244.
155. Takahama U., Oniki T. A peroxide/phenolics/ascorbate system can scavenge hydrogen peroxide in plant cells//Physiol. Plant. 1997. 101: 845-852.
156. Tichy M., Vermaas W. In vivo role of catalase-peroxidase in Synechocystis sp. strain PCC 6803 //J. Bacteriol. 1999. 181: 1875-82.
157. Torriani A. From cell membrane to nucleotides: the phosphate regulon in Escherichia coli II Bioassays 1990. 12: 371-376.
158. Tzamarias D., Struhl К Distinct TPR motifs of Cyc8 are involved in recruiting the Cyc8-Tupl corepressor complex to differentially regulated promoters // Genes Dev. 1995.9(7): 821-31.
159. Tit C-J, Shrager J., Burnap R., Postier В., Grossman A. Consequences of a Deletion in dspA on Transcript Accumulation in Synechocystis sp. Strain PCC6803 // J. Bacterid. 2004 186 (12): 3889-3902
160. Urao Т., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Two-component systems in plant signal transduction // Trends Plant Sci. 2000. 5: 67-74.
161. Vigh L., Maresca В., Harwood J.L. Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? // Trends Biochem Sci. 1998. 23 (10): 36974.
162. Visick J.E., Clarke S. Repair, refold, recycle: how bacteria can deal with spontaneous and environmental damage to proteins // Mol. Microbiol. 1995. 16: 835-845.
163. Wall D., Kaiser D. Type IV pili and cell motility//Mol. Microbiol. 1999. 32: 1-10.
164. Wanner B.L. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria // J. Cell Biochem. 1993. 51:47-54.
165. Wilde A., Fiedler В., Bonier T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light // Molecular Microbiology 2002. 44 (4): 981-988.
166. Wilkinson M.J., Northcote D.II. Plasma membrane ultrastructure during plasmolysis, isolation and wall regeneration: A freeze-fracture study // J. Cell Sci. 1980. 42: 401— 415.
167. Wing-On Ng., Grossman A., Bhaya D. Multiple Light Inputs Control Phototaxis in Synechocystis sp. Strain PCC6803 Hi. of Bacteriol. 2003. 1599-1607.
168. Wood J.M. Osmosensing by bacteria: signals and membrane-based sensors // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. 63: 230-262.
169. Wood Z„ Schroder E., Harris J., Poole L. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins// Trends Biochem. Sci. 2003. 28: 32-40.
170. Yamamoto II, Miyake C, Dietz K, Tomizawa K, Murata N„ Yokota A. Thioredoxin peroxidase in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // FEBS Letters 1999. 447: 269-273.
171. Youdericin P. Bacterial motility: Secretory secrets of gliding bacteria // Curr. Biol. 1998. 8: R408-411.
172. YousefN., Pistorius E., Michel K. Comparative analysis of UliA and isiA transcription under iron starvation and oxidative stress in Synechococcus elongatus PCC 7942 wild-type and selected mutants// Arch. Microbiol. 2003. 180: 471-483.
173. Zardoya R., Villalba S. A phylogenetic framework for the aquaporin family in eukaryotes // J. Mol. Evol. 2001. 52: 391-404.
174. Zhang A., Alluvia S., Tiwari A., Argaman L., Hengge-Aronis R., Storz G. The OxyS regulatory RNA represses rpoS translation and binds the Hfq (HF-I) protein // EMBO J. 1998.17:6061-6068.
175. Zheng M., Doan В., Schneider T.D., Storz G. OxyR and SoxRS regulation of fur И J. Bacteriol. 1999.181:4639-43.
176. Zheng M., Wang X., Templeton L., Smulski R., LaRossa A., Storz G. DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide//J. Bacteriol. 2001. 183: 4562-4570.110
-
Кирик, Инесса Анатольевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.15
- Генетический контроль деления, развития и метаболизма цианобактериальной клетки
- Клонирование и молекулярный анализ генов в клетках цианобактерий
- Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов устойчивости к индуктору окислительного стресса менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. штамм РСС 6803
- Молекулярные механизмы и генетический контроль устойчивости к солевому стрессу у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803
- Генетический контроль устойчивости к индуктору окислительного стресса метилвиологену у цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803
