Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы и генетический контроль устойчивости к солевому стрессу у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карандашова, Инга Вадимовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Распространенность цианобактерий и их способность к акклиматизации.

1.2.0смопротекторы.

1.2.1. Участие осмопротекторов в солеадаптации.

1.2.2. Осмопротекторы у цианобактерий и других организмов.

1.2.3. Транспорт осмопротекторов.

1.2.4. Биосинтез осмопротекторов.

1.3. Ионный транспорт в условиях солевого стресса.

1.3.1. Изменения концентрации неорганических ионов.

1.3.2. Механизмы ионного транспорта.

1.3.2.1. Выведение ионов Na+.

1.3.2.2. Системы транспорта калия.

1.4. Сенсоры и регуляторы осмотических и ионных изменений.

1.5. Солеиндуцируемые изменения экспрессии генов: синтез стрессовых белков.

1.6. Влияние солевого стресса на фотосинтез.

1.7. Солеиндуцируемые изменения мембранной структуры.

1.8. Воздействие солевого стресса на метаболизм азота.

1.9. Основные процессы солеадаптации.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Среды и культивирование микроорганизмов.

2.3. Трансформация бактериальных клеток.

2.4. Молекулярное клонирование.

2.4.1. Эксперименты с ДНК.

2.4.2. Клонирование фрагментов ДНК, несущих ген устойчивости к Km, из солечувствительных мутантов Synechocystis 6803.

2.4.3. Конструирование инсерционных мутантов Synechocystis 6803.

2.5. Изучение экспрессии генов.

2.5.1. Northem-блот гибридизация.

2.5.2. Метод ОТ-ПЦР.

2.6. Измерение содержания гликозилглицерина.

2.7. Измерение На7Н+-антипортерной активности в клетках Synechocystis 6803.

2.8. Измерение содержания ионов натрия и калия в растущих клетках Synechocystis 6803.

2.9. Определение скорости поглощения калия.

2.10. Компьютерное обеспечение.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Идентификация генов, контролирующих устойчивость к солевому стрессу, с использованием солечувствительных мутантов цианобактерии Synechocystis

3.1.1. Идентификация мутаций у ГР-мутантов.

3.1.2. Идентификация мутаций у ГТ+-мутантов.

3.1.2.1. Мутант 7.

3.1.2.2. Мутант 45.

3.1.2.3. Мутант 117.

3.1.2.4. Мутант 13.

3.1.3. Физиологические характеристики мутантов.

3.1.4. Обсуждение.

3.2. Функциональный анализ генов, кодирующих Na+/H+-ангипортеры у цианобактерии Synechocystis 6803.

3.2.1. Конструирование инсерционных мутантов.

3.2.2. Сегрегация мутаций в генах, кодирующих Na+/H+-антипортеры.

3.2.3. Физиолого-биохимические характеристики мутантов с нарушением генов, кодирующих Ш+/Н+-антипортеры.

3.2.4. Анализ экспрессии Ма+/Н+-антипортерных генов.

3.2.5. Обсуждение.

3.3. Участие систем транспорта К+ в солеадаптации клеток Synechocystis 6803.

3.3.1. Конструирование инсерционных мутантов.

3.3.2. Устойчивость мутантов к солевому и осмотическому стрессу.

3.3.3. Поглощение калия клетками Synechocystis 6803.

3.3.4. Обсуждение.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы и генетический контроль устойчивости к солевому стрессу у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803"

Засоленность почв - один из основных факторов, отрицательно влияющих на рост и развитие растений. Детальное изучение процесса адаптации к солевому стрессу является важной фундаментальной задачей биологии и имеет большое практическое значение в связи с проблемой повышения продуктивности сельскохозяйственных культур.

Изучение молекулярных механизмов и генетического контроля соле-устойчивости у растений имеет определенные методические ограничения, обусловленные особенностями этих организмов как объектов молекулярной генетики. Удобной моделью для молекулярно-генетического изучения процесса солеадаптации у фотосинтезирующих организмов являются одноклеточные цианобактерии (Bohnert et al., 2001). Уникальной особенностью циа-нобактерий являются сочетание свойств прокариотических организмов со способностью к оксигенному фотосинтезу. Согласно эндосимбиотической теории, хлоропласты высших растений и цианобактерии имеют общих предшественников (Torrecilla et al., 2001). Преимуществами ряда штаммов циано-бактерий как объектов молекулярной генетики являются простота культивирования, способность к генетической трансформации и наличие систем клонирования и молекулярного анализа генов. К тому же, в отличие от растений, цианобактерии способны адаптироваться к высоким концентрациям соли: они обитают в морской воде, и даже в гиперсоленой воде Мертвого моря, где концентрация NaCl превышает 3 М (Margheri et al., 1999).

Объектом исследования в данной работе является фотогетеротрофная пресноводная цианобактерия Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis 6803), которая относится к группе умеренно солеустойчивых цианобактерий, выдерживающих до 1,2 М NaCl (Reed & Stewart, 1985). Для этого организма разработаны методы молекулярно-генетического анализа и установлена полная нуклеотидная последовательность генома (Kaneko et al., 1996).

При повышении концентрации соли в среде клетки цианобактерий, как и других организмов, испытывают сразу два типа стрессовых воздействий. Во-первых, уменьшается водный потенциал, что приводит к быстрой потере клетками воды, и, как следствие, к осмотическому стрессу. Во-вторых, в среде повышаются концентрации неорганических ионов, особенно Na+ и С1", что приводит к ионному стрессу.

К началу наших исследований было установлено, что основную роль в процессе солеадаптации клеток Synechocystis 6803, играет накопление осмо-протектора - гликозилглицерина (ГГ) (Hagemann & Erdmann, 1997). Роль других систем, в том числе, систем ионного транспорта, в адаптивном ответе клеток Synechocystis 6803 на солевой стресс была практически не изучена.

Диссертация посвящена изучению молекулярных механизмов и генетического контроля процессов, обеспечивающих устойчивость к солевому стрессу клеток цианобактерии Synechocystis 6803.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) идентифицировать гены, ответственные за солечувствительность 11 мутантов Synechocystis 6803, полученных методом случайного встраивания гена канамицин-резистентности;

2) с помощью направленной инактивации генов, кодирующих Na+/H+-антипортеры, изучить роль Ма+/Н+-антипортеров в солеадаптации клеток Synechocystis 6803;

3) сконструировать инсерционные мутанты Synechocystis 6803 по генам, кодирующим субъединицы К+ -транспортирующих систем, и изучить роль систем поглощения К+ в ответе клеток Synechocystis 6803 на солевой и осмотический стресс.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Карандашова, Инга Вадимовна

выводы

1. Клонированы и идентифицированы гены, ответственные за солечувствительность мутантов цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, полученных методом случайного инсерционного мутагенеза. Повышенная чувствительность мутантов к NaCl определяется нарушением генов stpA и ggpS, кодирующих ферменты биосинтеза осмопротектора гликозилглицерина, гена gcp, кодирующего сиалогликопротеазу, а также генов sir1087 и sir1799, кодирующих белки с неизвестной функцией.

2. Изучена роль Na+/H+ антипортеров в адаптивном ответе клеток Synechocystis sp. РСС 6803 на солевой стресс и изменение рН среды. Na+/H+ антипортер NhaS3 необходим для жизнедеятельности клеток Synechocystis sp. РСС 6803 в оптимальных условиях культивирования. Мутанты по гену nhaS3 нежизнеспособны. Мутации в генах nhaSI, nhaS4 и nhaSS, кодирующих Na+/H+ антипортеры, не влияют на солеустойчивость, Na+/H+ антипортерную активность и внутриклеточное содержание ионов Na+ в клетках цианобактерии.

3. Гены nhaSI, nhaS3, nhaS4 и nhaS5, кодирующие Na+/H+ антипортеры Synechocystis sp. РСС 6803, экспрессируются на низком уровне. В отсутствие двух или трех Na+/H+ антипортеров экспрессия оставшихся антипортерных генов индуцируется в процессе адаптации клеток цианобактерии к повышенным концентрациям NaCl и щелочным рН.

4. Изучена роль систем транспорта К+ в ответе на солевой стресс у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Показано, что повышенная чувствительность к солевому и осмотическому стрессу мутанта по гену ntpJ, кодирующему субъединицу KtrAB системы, связана с нарушением поглощения К+.

103

5. Мутации в генах kdpA и slr0773, кодирующих, соответственно, субъединицу К+-АТФазы и гомолог К+-транспортирующей субъединицы TrkA, не влияют на устойчивость клеток цианобактерии к солевому и осмотическому стрессу.

6. Установлено, что KtrAB является единственной Na -зависимой К+-поглощающей системой у Synechocystis sp. РСС 6803, обеспечивающей быстрое поглощение К+ клетками в ответ на солевой и осмотический стресс.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карандашова, Инга Вадимовна, Москва

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

2. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.

3. Alexeyev М. F., Shokolenko I.N., Croughan Т.Р. Improved antibiotic-resistance gene cassettes and omega elements for Escherichia coli vector construction and in vitro deletion/insertion mutagenesis // Gene. -1995. Vol. 160. -P. 63-67.

4. Alge D., Peschek G.A. Characterization of a cta/CDE operon-like genomic region encoding subunits I-III of the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 //Biochem. Molec. Biol. Int. 1993. - Vol. 29. -P. 511-525.

5. Allakhverdiev S.I., Nishiyama Y., Suzuki I., Tasaka Y., Murata N. Genetic engineering of the unsaturation of fatty acids in membrane lipids alters the tolerance of Synechocystis to sail stress // PNAS. 1999. - Vol. 96.-P. 58625867.

6. Allakhverdiev S.I., Sakamoto A., Nishiyama Y., Murata N. Inactivation of photosystems I and II in response to osmotic stress in Synechococcus. Contribution of water channels // Plant Physiol. 2000a. -Vol. 122.-P. 12011208.

7. Allakhverdiev S.I., Sakamoto A., Nishiyama Y., Inaba M., Murata N. NaCl-induced inactivation of photosystems I and II in Synechococcus sp. // Plant Physiol. 20006 -Vol. 123.-P. 1047-1056.

8. Allakhverdiev S.I., Kinoshita M., Inaba M., Suzuki I., Murata N. Unsaturated fatty acids in membrane lipids protect the photosynthetic machinery against salt-induced damage in Synechococcus // Plant Physiol. 2001. -Vol. 125.-P. 1842-1853.

9. Apte S.K., Reddy B.R., Thomas J. Relationship between sodium influx and salt tolerance of nitrogen-fixing cyanobacteria // Appl. Environ. Microbiol. -1987.-Vol. 53.-P. 1934-1939.

10. Apte S.K., Bhagwat A. Salinity-stress-induced proteins in two nitrogen-fixinf Anabaena strains differentially to salt //J. Bacterial. 1989. -Vol. 171. -P. 909-915.

11. Apte S.K., Haselkorn R. Cloning of salinity stress-induced genes from the salt-tolerant nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena torulosa // Plant Molec. Biol. 1990. -Vol. 15.-P. 723-733.

12. Bakker E.P., Harold F.M. Energy coupling to potassium transport in Streptococcus faecalis II J. Biol. Chem. I980.-Vo! 225.-P. 433-440.

13. Blomberg A. Metabolic surprises in Saccharomyces cerevisiae during adaptation to saline conditions: questions, some answers and a model 11 FEMS Microbiol. Lett. 2000. -Vol. 182. -P. 1-8.

14. Blumwald E., Tel-Or E. Osmoregulation and cell composition in salt-adaptation of Nostoc muscorum // Arch. Microbiol. 1982. -Vol. 132. - P. 168-172.

15. Blumwald E., Melhorn R., Packer L. Ionic osmoregulation during salt adaptation of the cyanobacterium Synechocystis 6311 I I Plant Physiol. 1983. -Vol. 73.-P. 77-380.

16. Blumwald E., Wolosin J.M., Packer L. Na+/H+ exchange in the cyanobacterium Synechococcus 6311 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984. -Vol. 122.-P. 452-459.

17. Blumwald E., Aharon G., Apse M.P. Sodium transport in plant cells // Bio-chim. Biophys. Acta 2000. - Vol. 1465. - P. 140-151.

18. Borowitzka L.J., Demmerle S., Mackay M.A., Norton R.S. Carbon-13 nuclear magnetic resonance study of osmoregulation in a blue-green alga // Science 1980. - Vol. 210. - P. 650-651.

19. Bremer E., Kramer R. Coping with osmotic challenges: osmoregulation through accumulation and release of compatible solutes in bacteria // In: Storz G., Hengge-Aronis R. (eds.), Bacterial stress responses. ASM Press, Washington, D.C. 2000. - P. 79-97.

20. Buck D.P., Smith G.D. Evidence for NaTH^ electrogenic antiporter in an alkaliphilic cyanobacterium Synechocystis // FEMS Microbiol. Lett 1995. -Vol. 128. -P. 315-320.

21. Chang A.C.Y., Cohen S.N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the pl5A cryptic miniplas-mid // J. Bacteriol. 1978. - Vol. 134. -P. 1141-1156.

22. Chow C.W. Regulation and intracellular localization of the epithelial iso-forms of the Na+/H+-exchangers NHE2 and NHE3 // Clin. Invest. Med. -1999.-Vol. 22.-P. 195-206.

23. Collins J.F., Honda Т., Knobel S., Bulus N.M., Conary J., DuBois R., Ghis-han F.K. Molecular cloning, sequencing, tissue distribution, and functional expression of a Na+/H+ exchanger (NHE-2) // PNAS 1993. - Vol. 90. - P. 3938-3942.

24. Csonka L.N., Hanson A. Prokaryotic osmoregulation: genetics and physiology // Annu. Rev. Microbiol. -1991. Vol. 45. - P. 569-606.

25. Csonka L.N., Epstein W. Osmoregulation // In: Neidhardt FC et al. (eds.), Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology. ASM-Press, Washington. 1996. - P. 1210-1223.

26. Deshnium P., Los D.A., Hayashi H., Mustardy L., Murata N. Transformation of Synechococcus with a gene for choline oxidase enhances tolerance to salt stress // Plant Mol. Biol. 1995. - Vol. 29 - P. 897-907.

27. Dibrov P.A. The role of sodium ion transport in Escherichia coli energetics // Biochim. Biophys. Acta -1991. Vol. 1056. - P. 209-224.

28. Dimroth P. Sodium ion transport decarboxylases and other aspects of sodium ion cycling in bacteria // Microbiol. Rev. 1987. - Vol. 51. - P. 320340.

29. Dimroth P. Mechanisms of sodium transport in bacteria // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1990. - Vol. 326. - P. 465-477.

30. Dosch D.C., Helmer G.L., Sutton S.H., Salvacion F.F., Epstein W. Genetic analysis of potassium transport loci in Escherichia coli: evidence for three constitutive systems mediating uptake potassium // J. Bacteriol. 1991. -Vol. 173.-P. 687-696.

31. Erdmann N., Berg C., Hagemann M. Missing salt adaptation of Microcystis firma (cyanobacterium) in the dark // Arch. Hydrobiol. 1989. - Vol. 114.-P. 521-530.

32. Erdmann N., Fulda S., Hagemann M. 1992 Glucosylglycerol accumulation during salt acclimation of two unicellular cyanobacteria // J. Gen. Microbiol. 1989.-Vol. 138.-P. 363-368.

33. Epstein W. Kdp, a bacterial P-type ATPase whose expression and activity are regulated by turgor pressure // Acta Physiol. Scand. Suppl. 1992. - Vol. 607.-P. 193-199.

34. Espie G.S., Miller A.G., Canvin D.T. Characterization of the Na+-requirement in cyanobacterial photosynthesis //Plant Physiol. 1988. - Vol. 88. -P. 757-763.

35. Fernandes T.A., Iyer V., Apte S .K. Differential responses of nitrogen-fixing cyanobacteria to salinity and osmotic stresses // Appl. Environ. Microbiol. -1993. Vol. 59. -P. 899-904.

36. Fernandez V.E., Avendano M.C. Sodium-stimulation of phosphate uptake in cyanobacterium Anabaena PCC 7119 // Plant Cell Physiol. 1993. - Vol. 34. -P. 201-207.

37. Fulda S., Hagemann M. Salt treatment induces accumulation of flavodoxin in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // J. Plant Physiol. -1995. Vol. 146. - P. 520-526.

38. Fulda S., Huang F., Nilsson F., Hagemann M., Norling B. Proteomics of Synechocystis sp. strain PCC 6803: identification of periplasmic proteins in cells grown at low and high salt concentrations // Eur. J. Biochem. 2000. -Vol. 267. - P. 5900-5907.

39. Gabbay-Azaria R., Tel-Or E. Mechanisms of salt tolerance in cyanobacteria // In: Gresshoff P.M. (ed.), Plant responses to the environment. CRC Press, Boca Raton. 1993. - P. 123-132.

40. Gimmler H. Primary sodium plasma membrane ATPases in salt-tolerant algae: facts and fictions // J. Exp. Botany 2000. - Vol. 51. - P. 1171-1178.

41. Grigorieva G., Shestakov S.V. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // FEMS Microbiol. Lett. Vol. 13. - P. 367370.

42. Grinstein S., Rotin D., Mason MJ. Na+/H+ exchange and growth factor-induced cytosolic pH changes. Role in cellular proliferation // Biochem. Bio-phys. Acta 1989. - Vol. 988. - P. 73-97.

43. Goddijn O.J.M., van Dun K. Trehalose metabolism in plants // Trends Plant Sci. 1999. - Vol. 4.-P. 315-319.

44. Hagemann M., Wolfel L., Kriiger B. Alterations of protein synthesis in the cyanobacterium Synechocystis spec. PCC 6803 after a salt shock // J. Gen. Microbiol. 1990. - Vol. 136. - P. 1393-1399.

45. Hagemann M., Zuther E.1992 Selection and characterization of mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 unable to tolerate high salt concentrations // Arch. Microbiol. 1990. - Vol. 158. - P. 429-434.

46. Hagemann M., Golldack D., Biggins J., ErdmannN. Salt-dependent protein phosphorylation in the cyanobacterium Synechocystis PCC 6803 // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - Vol. 113. - P. 205-210.

47. Hagemann M., Erdmann N. Activation and pathway of glucosylglycerol biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // Microbiol. 1994. - Vol. 140. - P. 1427-1431.

48. Hagemann M., Erdmann N. Enviromental stresses // In: Rai A.K. (ed), Cyanobacterial nitrogen metabolism and enviromental biotechnology. Springer, Heidelberg & Narosa Publ. House, New Dehli. 1997. -P. 156221.

49. Hagemann M., Richter S., Mikkat S. The ggtA gene encodes a subunit of the transport system for the osmoprotective compound glycosylglycerol in Synechocystis sp. strain PCC 6803 // J. Bacteriol. 1997a. - Vol. 179. - P. 714-720.

50. Halfter U., Ishitani M., Zhu J.-K. The arabidopsis SOS2 protein kinase physically interacts with and is activated by the calcium-binding protein SOS3 // PNAS. 2000. - Vol. 97. - P. 3735-3740.

51. Hansel A., Schmid A., Tadros M.H., Jurgens U.J. Isolation and characterization of porin from the outer membrane of Synechococcus PCC 6301 // Arch. Microbiol. 1994. - Vol. 161. - P. 163-167.

52. Hare P.D., Cress W.A., van Staden J. Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress // Plant Cell Environ. 1998. - Vol. 21. - P. 535553.

53. Harold F.M., Papineau D. Cation transport and electrogenesis in Streptococcus faecalis. II. Proton and sodium extrusion // J. Membr. Biol. 1972. -Vol. 8. - P. 45-62.

54. Harrison-McMonagle P., DenissovaN., Martinez-Hackert E., Ebright R.H., Stock A.M. Orientation of OmpR monomers within an OmpR:DNA complex determined by DNA affinity cleaving // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 285. -P. 555-566.

55. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.-K., Bohnert H.J. 2000 Plant cellular and molecular responses to high salinity // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. - Vol. 51. - P. 463-499.

56. Hershkovitz N., Oren A., Post A., Cohen Y. Induction of water-stress proteins in cyanobacteria exposed to matric- or osmotic-water stress // FEMS Microbiol. Lett. -1991. Vol. 83. - P. 169-172.

57. Holmes D.S., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids // Anal. Biochem. -1981. Vol. 114. - P. 193-197.

58. Huber S.C., Huber J.L. Role of sucrose-phosphate synthase in sucrose metabolism in leaves // Plant Physiol. 1992. - Vol. 99. - P. 1275-1278.

59. Inaba M., Sakamoto A., Murata N. Functional expression in Escherichia coli of low-affinity and high-affinity Na+(Li+)/H+ antiporters of Synechocystis // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 1376-1384.

60. Iyer V., Fernandes Т., Apte S.K. A role for osmotic stress-induced proteins in the osmotolerance of a nitrogen-fixing cyanobacterium, Anabaena sp. strainL-31 //J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - P. 5868-5870.

61. Jeanjean R., Onana В., Peschek G.A., Joset F. Mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 impaired in respiration and unable to tolerate high salt concentrations // FEMS Microbiol. Lett. 1990. - Vol. 68. -P. 125-130.

62. Jeanjean R., Matthijs H.C.P., Onana В., Havaux M., Joset F. Exposure of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to salt stress induced concerted changes in respiration and photosynthesis // Plant Cell Physiol. -1993.-Vol. 34.-P. 1073-1079.

63. Joset F., Jeanjean R., Hagemann M. Dynamics of the response of cyanobacteria to salt stress: deciphering the molecular events // Physiol. Plant 1996. -Vol. 96. - P. 738-744.

64. Jung К., Tjaden В., Altendorf К. Purification, reconstitution, and characterization of KdpD, the turgor sensor of Escherichia coli II J. Biol. Chem. -1997. Vol. 272. - P. 10847-10852.

65. Kakinuma Y. Inorganic cation transport and energy transduction in Entero-coccus hirae and other streptococci // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1021-1042.

66. Kanesaki Y., Suzuki I., Allakhverdiev S.I., Mikami K., Murata N. Salt stress and hyperosmotic stress regulate the expression of different sets of genes in Synechocystis sp. PCC 6803 // Biochem. Biophis. Res. Commun. 2002. -Vol. 290. - P. 339-348.

67. Kaplan A., Volokita M., Zenvirth D., Reinhold L. An essential role for sodium in the bicarbonate transporting system of the cyanobacterium Anabaena variabilis 11FEBS Lett. 1984. - Vol. 176. - P. 166-168.

68. Kawano M., Abuki R., Igarashi K., Kakinuma Y. Evidence for influx via the Ntp J protein of the Ktrll K+ uptake system in Enterococcus hirae И J. Bacterid. 2000. - Vol. 182. - P. 2507-2512.

69. Kempf В., Bremer E. Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress responses to high-osmolality environments // Arch. Microbiol. -1998.-Vol. 170.-P. 319-330.

70. Krulwich T.A. Na+/H+ antiporters // Biochim. Biophys. Acta 1983. - Vol. 726. - P. 245-264.

71. Labarre J., Chauvat F., Thuriaux P. Insertional mutagenesis by random cloning of antibiotic resistance genes into the genome of the cyanobacterium Synechocystis strain PCC 6803 // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171. - P. 34493457.

72. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing //In: Stackebrandt E. and Goodfellow M. (eds.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Chichester, United Kingdom. -1991. P. 115-175.

73. Lu C., Vonshak A. Effects of salinity stress on photosystem II function in cyanobacterial Spirulinaplatensis II Physiol. Plant. 2002. - Vol. 114. - P. 405413.

74. Mackay M., Norton R.S., Borowitzka L. Marine blue-green algae have a unique osmoregulatory system //Mar. Biol. 1984. - Vol. 73. - P. 301-307.

75. Mackay M., Norton R.S. 13C nuclear magnetic resonance study of biosynthesis of glucosylglycerol by cyanobacterium under osmotic stress // J. Gen. Microbiol. 1987. - Vol. 130. -P. 2177-2191.

76. Margheri M.C., Bosco M., Giovanneti L., Ventura S. Assessment of the genetic diversity of halotolerant coccoid cyanobacteria using amplified 16S rDNA restriction analysis // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 173. - P. 9-16.

77. Marin K., Zuther E., Kerstan Т., Kunert A., Hagemann M. The ggpS gene from Synechocystis sp. strain PCC 6803 encoding glucosylglycerol-phosphate synthase is involved in osmolyte synthesis I I J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - P. 4843-4849.

78. Marsalek В., Zahradnickova H., Hronkova M. Extracellular abscisic acid produced by cyanobacteria under salt stress // Plant Physiol. 1992. - Vol. 139.- P. 506-508.

79. Mead D.A., Szczesna-Skorupa E., Kemper B. Single-stranded DNA 'blue' T7 promoter plasmids: a versatile tandem promoter system for cloning and protein engineering//Protein Eng. 1986. - Vol. 1. - P. 67-74.

80. Mikkat S., Milkowski C., Hagemann M. A putative Na+/H+ antiporter encoded by sll0273 of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 is essential for growth at high Na+/K+ ratios I I Plant Cell Environ. 2000. - Vol. 23. - P549-559.

81. Miller A.G., Turpin D.H., Canvin D.T. Na+ requirement for growth, photo-sithesis, and pH regulation in the alkalotolerant cyanobacterium Synechococcus liopoliensis И J. Bacteriol. 1984. - Vol. 159. - P. 100-106.

82. Mizuno Т., Mizushima S. Signal transduction and gene regulation through the phosphorylation of two regulatory components: the molecular basis for the osmotic regulation of the porin genes // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4. -P. 1077-1082.

83. Mohammad F.A.A., Reed R.H., Stewart W.D.P. The halophilic cyanobacterium Synechocystis DUN 52 and its osmotic responses I IFEMS Microbiol. Lett.- 1983.-Vol. 16.-P. 287-290.

84. Molitor V., Erber W., Peschek G.A. Increased levels of cytochrome-oxidase and sodium-proton antiporter in the plasma-membrane of Anacystis nidulans after growth in sodium-enriched media // FEBS Lett. 1986. - Vol. 204. -P. 251256.

85. Molitor V., Kunter O., Sleytr U.B., Peschek G.A. The ultrastructure of plasma and thylacoid membrane vesicles from the fresh water cyanobacterium Anacystis nidulans adapted to salinity // Protoplasma 1990. - Vol. 157. - P. 112-119.

86. Moore D.J., Reed R.H., Stewart W.D.P. Responses of cyanobacteria to low level osmotic stress: Implications for the use of buffers // J. Gen. Microbiol. -1985. Vol. 131. - P. 1267-1272.

87. Nakamura Т., Matsuba Y., Yamamuro N., Booth I.R., Unemoto T. Cloning and sequencing of a K+ transport gene (trkA) from the marine bacterium Vibrio alginolyticus II Biochim. Biophys. Acta 1994. - Vol. 1219. - P. 701-705.

88. Nakamura Т., Yuda R., Unemoto Т., Bakker E.P. KtrAB, a new type of bacteril K+-uptake system from Vibrio alginolyticus II J. Bacteriol. 1998. -Vol. 180. - P. 3491-3494.

89. Nass R., Cunningham K.W., Rao R. Intracellular sequestration of sodium by a novel Na+/H+ exchanger in yeast is enhanced by mutations in the plasma membrane H+-ATPase//J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 26145-26152.

90. Nitschmann W.H., Packer L. NMR studies on Na+ transport in Synechococcus PCC 6311 I I Arch. Biochem. Biophys. 1992. - Vol. 294. - P. 347-352.

91. Niu X., Bressan R.A., Hasegawa P.M., Pardo J.M. Ion homeostasis in NaCl stress environments //Plant Physiol. 1995. - Vol. 109. - P. 735-742.

92. Niven G.W., Kerby N.W., Rowell P., Reed R.H., Stewart W.D.P. The effects of salt on nitrogen-fixation and ammonium assimilation in Anabaena variabilis // Br. Phycol. J. 1987. - Vol. 22. - P. 411-416.

93. Numata M., Petressa K., Lake N., Orlowski J. Identification of mitochondrial Na+/H+exchanger//J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. -P. 6951-6959.

94. Orlowski J., Grinstein S. Na+/H+ exchangers of mammalian cells // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 22373-22376.

95. Padan E., Vitteboro A. Cation transport of cyanobacteria // In: Packer L. and Glazer A. (eds.), Methods in enzymology. Academic Press, San Diego. -1988. Vol. 167. - P. 561-571.

96. Padan E., Schuldiner S. Na+/H+ antiporters, molecular devices that couple the Na+ and H+ circulation in cells // J. Bioenerg. Biomem. 1993. - Vol. 25. -P. 647-669.

97. Padan E., Venturi M., Gerchman Y., Dover N. Na+/H+ antiporters // Biochem. Biophys. Acta 2001. - Vol. 1505. - P. 144-157.

98. Paschinger H. DCCD induced sodium uptake by Anacystis nidulans И Arch. Microbiol. 1977. - Vol. 113. -P. 285-291.

99. Poolman В., Glaasker E. Regulation of compatible solute accumulation in bacteria//Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 397-407.

100. Polarek J.W., Williams G., Epstein W. The products of kdpDE operon are required for expression of the Kdp ATPase of the Escherichia coli II J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - P. 2145-2151.

101. Puppe W., Zimmann P., Jung K., Altendorf K. Characterization of truncated forms of the KdpD protein, the sensor kinase of the K+-translocating Kdpsystem of the Escherichia coli II Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 2502725034.

102. Record M.T. jr., Courtenay E.S., Cayley D.S., Guttmann H.J. Responses of E.coli to osmotic stress: large changes in amounts of cytoplasmic solutes and water//TIBS 1998. - Vol. 23. - P. 143-148.

103. Reed R.H., Stewart W.D.P. Physiological response of Rivularia atra to salinity: Osmotic adjustment in hyposaline media // New Phytol. 1983. - Vol. 95.-P. 595-603.

104. Reed R.H., Stewart W.D.P. Osmotic adjustment and organic solute accumulation in unicellular cyanobacteria from freshwater and marine habitats // Mar. Biol. 1985. - Vol. 88. - P. 1-9.

105. Reed R.H., Borovitzka L.J., Mackay M.A., Chudek J.A., Foster R., Warr S.R.C., Moore D.J., Stewart W.D.P. Organic solute accumulation in osmotically stressed cyanobacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1986a. - Vol. 39. - P. 51-56.

106. Reed R.H., Stewart W.D.P. The responses of cyanobacteria to salt stress // In: Rogers L .J., Gallon J.R. (eds.), Biochemistry of the algae and cyanobacteria. Clarendon Press, Oxford, UK. 1988. - P. 217-231.

107. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacte-ria// J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol. 111. - P. 1-61.

108. Ritchie R.J. Sodium transport and the origin of the membrane potential in the cyanobacterium Synechocystis R-2 (Anacystis nidulans) PCC 7942 // Plant Physiol. 1992. - Vol. 139. - P. 320-330.

109. Ritchie R.J. Bioenergetics of membrane transport in Synechococcus R-2 (Anacystis nidulans, S. leopoliensis) И Can. J. Botany 1998. - Vol. 76. - P. 1127-1145.

110. Sakamoto A., Murata N. The role of glycine betaine in the protection of plants from stress: clues from transgenic plants // Plant Cell Environ. 2002. -Vol. 25. - P. 163-171.

111. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N. Y, 1989.

112. Schachtman D., Liu W. Molecular pieces to the puzzle of the interaction between potassium and sodium uptake in plants // Trends Plant Sci. 1999. -Vol. 4.-P. 281-287.

113. Schlosser A., Meldorf M., Stumpe S., Bakker E.P., Epstein W. TrkH and its homolog, TrkG, determine the specificity and kinetics of cation transport by Trk system of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 19081910.

114. Schoor A., Erdmann N, Effmert U., Mikkat S. Determination of the cyanobacterial osmolyte glucosylglycerol by high-performance liquid chromatography //J. Chromatogr A. 1995. - Vol. 704. - P. 89-97.

115. Schubert H., Hagemann M. Salt effect on 77K fluorescence and photosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 I I FEMS Microbiol. Lett. 1990. - Vol. 71. - P. 169-172.

116. Schubert H., Fulda S., Hagemann M. Effects of adaptation to different salt concentrations on photosynthesis and pigmentation of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 //J. Plant Physiol. 1993. - Vol. 142. - P. 291-295.

117. Serrano R., Rodriguez-Navarro A. Ion homeostasis during salt stress in plants // Curr.Opin.Cell Biol. 2001. - Vol. 13. - P. 399-404.

118. Shibata M., Katoh H., Sonoda M., Ohkawa H., Shimoyama M., Fukuzawa H., Kaplan A., Ogawa T. Genes essential to sodium-dependent bicarbonate transport in cyanobacteria // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 1865818664.

119. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Gene expression and signal transduction in water-stress response // Plant Physiol. 1997. -Vol. 115. - P. 327334.

120. Silver J. Inverse polymerase chain raction // In: McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R. (eds.), PCR a practical approach. The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. -1991. - P. 137-146.

121. Sinha R.P., Hader D.-P. Response of a rice field cyanobacterium Ana-baena sp. to physiological stressors I I Environ. Exp. Botany. 1996. - Vol. 36. -P. 147-155.

122. Smirnoff N. Plant resistance to environmental stress // Curr. Opin. Biotech. 1998.-Vol. 9.-P. 214-219.

123. Straus N.A. Iron deprivation: physiology and gene regulation // In: Bryant D.A. (ed.), Molecular biology of cyanobacteria. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 1994. - P. 731-750.

124. Takase К., Kakinuma S., Ymato I., Kohishi K., Igarashi K., Kakinuma Y. Sequencing and characterization of the ntp gene cluster for Na' -translocating ATPase in Enterococcus hirae // J. Biol. Chem 1994. - Vol. 269. - P. 1103711044.

125. Tel-Or E. Response of N2-fixing cyanobacteria to salt stress // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 40. - P. 689-693.

126. Tel-Or E., Spath S., Packer L., Mehlhorn R.J. Carbon-13 NMR studies of salt shock-induced carbohydrate turnover in the marine cyanobacterium Ag-menellum quadruplicatum II Plant Physiol. 1986. - Vol. 82. - P. 646-652.

127. Thomas S.P., Apte S.K. Sodium requirement and metabolism in nitrogen-fixing cyanobacteria // J. Biosci. 1984. - Vol. 6. - P. 771-794.

128. Utsugi J., Inaba K., Kuroda Т., Tsuda M., Tsuchiya T. Cloning and sequencing of a novel Na+/H+ antiporter gene from Pseudomonas aeruginosa // Biochim. Biophys. Acta 1998. -Vol. 1398. - P. 330-334.

129. Verbruggen N., Villarroel R., van Montagu M. Osmoregulation of a pyr-roline-5-carboxylate reductase in Arabidopsis thaliana //Plant Physiol. 1993. -Vol. 103. - P. 771-781.

130. Vieira J., Messing J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for the insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers // Gene- 1982.-Vol. 19.-P. 259.

131. Vinnemeier J., Kunert A., Hagemann M. Transcriptional analysis of the isiAB operon in salt-stressed cells of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 169. - P. 323-330.

132. Vinnemeier J., Hagemann M. Identification of salt-regulated genes in the genome of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by subtrac-tive RNA hybridization // Arch. Microbiol. 1999. - Vol. 172. - P. 377-386.

133. Waditee R., Hibino Т., Nakamura Т., Incharoensakdi A., Takabe T. Over-expression of a Na+/H+ antiporter confers salt tolerance on a freshwater cyanobacterium, making it capable of growth in sea water // PNAS. 2002. - Vol. 99. -P. 4109-4114.

134. Wang Z., Orlowski J., Shull G.E. Primary structure and functional expression of a novel gastrointestinal isoform of the rat Na+/H+ exchanger // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 11925-11928.

135. Warr S.R.C., Reed R.H., Stewart W.D.P. Carbohydrate accumulation in osmoticcally stressed cyanobacteria (blue-green algae): interactions of temperature and salinity // New Phytol. 1985. - Vol. 100. - P. 285-292.

136. Welsh D.T., Herbert R.A. Osmotically induced intracellular trehalose, but not glycine betaine accumulation promotes desiccation tolerance in Escherichia coli IIFEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 174. - P. 57-63.

137. Wood J.M. Osmosensing by bacteria: signals and membrane-based sensors //Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. - Vol. 63. - P. 230-262.

138. Xiong L., Zhu J.-K. Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress //Plant Cell Environ. 2002. - Vol. 25. - P. 131-139.

139. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequence of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene 1985. - Vol. 33. - P. 103-119.

140. Zhu В., Su J., Chang M., Verma D.P.S., Fan Y.-L., Wu R. Overexpression of a AJ-pyrroline-5-carboxyIate synthetase gene and analysis of tolerance to water- and salt-stress in transgenic rice // Plant Sci. 1998. - Vol. 139. - P. 41-48.

141. Zhu J.-K., Liu J., Xiong L. Genetic analysis of salt tolerance in Arabidop-sis: evidence for a critical role of potassium nutrition // Plant Cell 1998. - Vol. 10. -P. 1181-1191.

142. Zhu J.-K. Plant salt tolerance // Trends Plant Sci. 2001. - Vol. 6. - P. 6671.

143. Хочется поблагодарить моих родных за помощь и поддержку, которую они оказывали при выполнении и написании этой работы.