Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и изучение гена, контролирующего устойчивость к неполным гербицидам у цианобактерий Syhechocystis Sp. 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и изучение гена, контролирующего устойчивость к неполным гербицидам у цианобактерий Syhechocystis Sp. 6803"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ Ш.Н.И.ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК: 582.232.7: 577.113: 579.254: 632.954

ЧЕСНШЧЕНЕ ЭГЛЕ АЙТАНОВНА 1

У1СШР0ВШШЗ И ИЗУЧЕНИЕ ГЕЛЛ, КОНЕРОЛИРУШДЕРО УСТОЙЧИВОСТЬ к ЕПОЛЫШ ГЕГБЩ0ДМ1 У ЦШ10ШСТЕШ1 ¡ШШЯЮсЬиЗ БР. 6803.

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени . кандидата биологических наук

МОСКВА - 1392

Работа вшхояиглш па кефэдрэ гепатита! и сэдокцин Бцологачэског ^«культе-га Московского государстшшого университета имев Ы.В.Ломоносова.

ИШШЙ РЛГОВОДИ'РЕЛЪ;

дохстор биологические паук, профессор, члэн-корр. РАК EECTAIiGB C.B.

ОФЯЩШГЫШ ОПЛОШЕН:

доктор биологических паук А.А.Пропоров кандидат биологических nays: В.M.Андрианов ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ :

ИтшершА центр "Вииашгвнарщ" РАН

Эаадата сосголтся "-" - 1992 г. в - ча

па заседании специализированного Ученого совета ДС02.49.01 Ияствдутз общей генетики им. II. И. Баташова РАН (117809, ГСГ Москва, В-333, ул. Губкина, 3).

О диссертаций мото ознакомится в библиотеке Института о* генетики ш. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан -" - 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук • Г.Н.Полух

Актуальность пробяены. В настоящее время при создана« новых гербицвдных препаратов, применяема в сельском хозяйстве, большое внимание удбляатся вопросам токсикологической и экологической безопасности. В связи с этим, особое значение приобретают исследования, направленные па выяснение природа мишеней действия гербицидов в растительной клетке, на расшифровку молекулярных и генетических механизмов устойчивости к гербицидам, на "конструирование" гербицидов с заданным типом биологического действия. С другой сторона, гербицида, которые действуют в растительной клетке на определенную молекулярную мишень - важный инструмент при изучении механизма обмена веществ и гормональной регуляции метаболизма в растении. Поэтому, понимание молекулярного механизма действия гербицидов может быть чрезвычайно полезным при прогнозирования их биологической активности, а также при поправленном создании ' резистентных к гербицидам сельскохозяйственных растений методами генной инженерии. Существенный ислад в разработку этих проблем вносит использование подходов п методов молекулярной генетики, с помощью которых можно выделять а анализировать гены, ответственные за резистентность к различна гербицидам, в том числе действующим и на аппарат фотосинтеза. Однако, клонирование таких генов из растений яв-чется трудной задачей, гтребующей длительных и сложных экспериментов. Удобными в генетическом отношении- объектами для решения таких задач могут служить цианобактерии, обладающие, как и растения, оксигешшгл фотосинтезом. Более того, большинство' гербицидов, шгибирупцих процессы и пути, свойственные только растениям (фотосинтез, биосинтез хлорофилла, биосинтез незаменимых аминокислот), . являются летальными соединениями и для цианобактерий.'

В работах, проведенных с цианобактериями, была изучена природа резистентности к диурону - гербициду класса за* -¡ценных фенилмочевш, ингибирукщему активность фотосистемы II. Было установлено, что резистентность к диурону определяется мутациями в гене раЪА, приводящими к утрате способности белка D1 фотосистема II связывать гербицид (Molden, Haeelkorn, 1935;- Robinson et al., 1987; Gleiter et al., 1990).

К числу гербицидов - "нэклассических" ингибиторов фотосинтеза относятся диносеб (6-(сек-бутил)-214-диниг50фенол) и ДНОК (4,6-данитро-орто- крьзол), нитрофенолы соединею.:, блокирующие

транспорт электронов и фотофосфорилированив. Сведения о природэ мишеней действия фенолышх гербщдадов противоречивы, а механизмы развития резистентности растений к этщ агентам па изучены.

У цианобактерии БупеоЗюоувив езоз были получены мутанты, устойчивые к дщгосэбу и показана возможность передачи етого признака путем генетической трансформации (Кокварова, Шестаков, 19ЭО). Это открывает возмошюсти для клонирования гена, определяющего устойчивость цианоОактерий к данному классу гербицидов. Изучение этого гена и его продукта позволит подучить важную информацию о механизмах фичэтокснческого действия даносеба и расширит перспективы генно-здатерных работ по созданию трансгенных сельскохозяйственных растений, устойчивых к гербицидам.

Цель работа. Работа посвящеп клонированию и изучению гена, определяющего устойчивость цианобактерии БупеоЬооуеНе бзоз к фенольным гербицидам- даносебу и ДНОК. В задачу исследования входило:

1. Выделение гена, контролирующего устойчивость к фэнолышм гербицидам из геномного банка резистентных мутантов цианобактерии.

2. Определение нуклеотидной последовательности этого гена.

3. Молекулярно-генетический анализ гена; локализация п идентификация мутаций, приводящих к развитию устойчивости к диносебу и ДНон.

. 4. Изучение генетических и биохимических механизмов, обуславливающих устойчивость к фенольным гербицидам у цианобактерий.

Научная новизна н практическая ценность работа. Выделен новый, ранее неизвестный тёп <3г§~, контролирующий'' устойчивость цианобактерии Булеоиосуоив 6803 к даносебу и ДНОК -, гербицидам класса нитрофенолов. Определена нуклеотидная последовательность гена и его мутантных копий; установлено, что ген <3г& кодирует белок с молекулярной массой 23,7 кДа. Устойчивость мутантов , цианобактерии к даносебу и ДНОК обусловлена отсутствием ективйасти этого белка. Таким образом, развитие резистентности к этим гербицидам отличается по своему молекулярному механизму от резистентности к гербицидам типа диурона, которые взаимодействуют с белком фигосистемы II. полученные результаты по-новому освещают проблему действия на фотосинтезируицие организма гербицидов - ингибиторов фотосинтеза.

г

Клонированный ГВЦ может быть использован как зо^д для выявления гомологичных генов у растений, в качества генетического маркера в векторах для цианобшгаорий и растений, а также для создания гешю-инжецерных конструкций с целью получения трансгогашх растений, устойчивых к гербицидам, применяемым в сельском Х03ЯЙСТЕВ.

Объем к структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного молекулярным механизмам действия гербицидов, описания материалов и методов исследования, излокепия результатов и их обсуждения, выводов и'списка цитируемой литература. Работа изложена на'108 стр. машинописного текста и содержит 18 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 211 наименований.

Содержание работа

Материяли н методы Штаммы. В работе использовали бактериологически чистую культуру Synechooystis вр. PCO G8Q3 из коллекции Пастеровского института (Франция). НГ-ипдуцировашшэ устойчивые к диносебу мутанты Synechooystis 6803 Dln2, Din7, Din9 получены на кафеле гвпетики и селекции ЮТ 0./ Кокшаровой (Кокшарова, Шестаков, 1990); спонтанный: мутант DinE4 отобран в данной работе. К^ганти обладали повышенной устойчивостью й фенольному гербициду диносебу (6-(сек-бутил)- 2,4-данитрофенолу) - до ОД мМ в плотной среда, до 0,07 мМ в жидкой среде, в то время как порог устойчивости к диносебу для штамма дикого nina - 0,007 мМ»

В работе использованы штаммы Е. ooli JM522 и Р678-54 из коллекции кафедры генетики и селекции МГУ. Шгазмиды, использованные в работе, представлены в таблице

Культуру SyneoJiooystis G803 выращивали в модифицированной среде "С" (Столетов и др., 1965) в люминостате при 30°С и 2000 jl . Для выращивания BinR мутантов в среду добавляли селективныы агенты в концентрациях: дшюсеб - 0,06 мМ; ДНОК - 0,1 мМ; метрояздвзол -0,02 ММ. Инсерционше и делеционные мутанты Syneohooyatis 6803.. содержащие ген устойчивости к канамицину, выращивали в присутствии 30 мкг/мл канамицина.

Клетки E.ooli выращивали в среде LB (Миллер, 1976). Антибиотики добавляли в концентрациях: ампициллин - 50 мкг/мл, канамицин - 50 икг/mj хлорамфеникол - мкг/гал.

Таблица I. Плазмиды, использованные в работе

Плазыиде Описание Ссылка

РКК223-3 pü0i9 pU04K U13tg130 U13tg131 pBln2* ,pDin7i pDin9*,pDinE4* pWT6803* ApR, tao, 4,585 t.h.h. apk , 2,686 T.H.H. apr, kmr 4,1 T.h.h. 7,265 T.H.H. 7,265 Т.П.Н. ApR, производные puci9, содержат 4,7 т.д.н. Hindlll фрагмент хромосомной ДНК соответствующих мутантов Арн, производная ри019, содержит 4,7 т.п. . Hindlll фрагмент хромосомной ДНК штамма дикого тина Broaius, 1984 Vieira, Messing, 1982 Vieira, Hessing, 1982 Kieng et al., 1983 Kieng et al., 1983 Настоящая работа Настоящая работа

* - производные данных плазмид описаны в тексте. Трансформацию цианобактерий проводили по стандартной методике (Grigorieva, Sheatakov, 1982). При трансформации на устойчивость к гербицидам стерильные нитроцеллюлозныэ фильтры ("Hiliipore" НА, 0,45 мкн) раскладывали на чашку, содержащую агаризованную среду "С". На каждый фильтр наносили по 60 нкл культуры компетентных клеток, плотностью 4x10е клеток/мл, и донорную ДНК в концентрации 1-3 мкг на фильтр. Чашку инкубировали 18-20 часов на свету, затем фильтры переносили на чашку с агаризованной средой "С", содержащей гербициды в свлекиш; х концентрациях. Чашки, помещали в лшиностат, колонии'трансформантов появлялись через 7 суток.

Хромосомную ДНК Syneohooyßtis 6803 выделяли но описанной методике с модификациями (Van den Hondel, 1980). 1

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. ooli, трансформацию клеток E.ooli, а также электрофорез ДНК в горизонтальном • агарозном геле проводили по стандартным методикам (Ыаниатис в др., 1984). ДНК из агарозных гелэй алшровали по описанной методике . (Zhu. et al.,1985; Дрейпер и др., 1991).

Перенос ДНК с агарозных гелей на нейлоновые фильтры ("Sigma", oharge modified) осуществляли по«Саузерну (Ыаниатис в др., 1984). ДНК-зонд мэтили методом статистической гексануклеотидной затравки

w

t

при помощи большого фрагмента ДНК полимэразы I (фрагмента Иванова) (Feinberg, Yogeletein, 1984). ДНК-ДНК гибридизацию и гибридизацию In situ бактераалышх колоний на штроцедголозшх фильтрах ("МИИрогэ" НА,. 0,45 мкм) проводили по стандартной методике (Маппатис и др., 1934). В качестве гибриднзационных зондов для идентификации генов фотосинтеза на фрагментах ДНК Synechooystis 6803 использовали клонированные гены циакобакторий, водорослей и растений, контролирующие скптез компонентов CGI и ФСП (табл. 2) из коллекции кафедры генетики и селекции МГУ.

Таблица 2. Клонированные геш ФСГ и ФОН.

ген Источник Фрагмент

ФОТОСИО" psb AI рзЬ В рзй CD рзЬ ЕР рзЪ G psb Н рзЬ I psb К рзЪ 0 ФОТОСИС' рза А рза В + гйс L раа С ressa II Syneohooystia sp.PCO 6714 Synechocystis sp.PCO 6803 Syneohooy3tia вр.РСО 6303 Synechooyatis sp.PCO 6803 SyneoliooyBtis sp.PCO 6803 Synecliooy3tiB sp.PCO o803 рожь (Seoale sp. ) Syneohooyatia вр.РСО 6803 Syneohocystis вр.РСО 6803 сема I ' ChlatnydomonaB reinhardii Chlamydomonas reinhardii OhlemydomonaB reinhardii 2,0 Т.П.Н. Hindlll-EooHI 2,6 Г.П.Н. Hindlll-BaoiHI 1,6 Т.П.Н. HinOIII-Xbal 2,2 Т.П.Я. Hlndlll- jtooRI 1,8 Т.П.Н. Hindlll-Smal 0,18 T.n.H. Xhol-Sall 0,6 Т.П.Н. BamHI 2,6 Т.П.Н. Hindlll-EooRI 0,94 Т.П.Н. Dral-Xbal * 6,5 T.n.H. EooRI 5,8 T.n.Hi EooRI 1,0 T.n.H. EooRI

Для определения первичной нухлеогидной последовательности необходимый фрагмент ДНК клонировали в составе фаговых векторов MI3 серии tg. Реакции секвенирования проводили методом терминирования синтеза цепи на одноцепочечной ДНК - матрица в присутствии дидезонсину..леотидов (Sanger et al.f 1977, Tabor et al., 1937).

Получение мини-клеток штамма E.coli P678-54 и трансляцию продуктов, кодируемых лазмидой, проводили по стандартной методике (Хеймс, Хиггинс, 1987). Электрофорез ь ПААГ-ДСН проводили по

методике, описанной ранее (Harnes, 1981).

Активность фиксации С02 измеряли по включению радиоактивной метки из NaH14co3 клетками, выращенными на свету в присутствии или в отсутствии гербицидов. Измерение .светозависимого выделения и поглощения кислорода проводили при помощи электрода Кларка на полярографе ЕР-7 при температуре 25°С. Фотоиндуцированныэ \ изменения быстрой флуоресцонции хлорофилла а (переменную флуоресценцию) измеряли при помощи двухлучевого флуоршетра по методу Лядского и др. (1987).

Для хроматографического анализа 3-4 суточную культуру клеток дикого тина и мутанта Dln2/Ins2, содержащего инсерцшо в гене órg, сгущали до плотности 5x109 клеток/мл и инкубировали в присутствии диносеба или ДНОК (концентрация'гербицидов -100 ыкМ) в течение 48 часов в люминостате. Клетки осаждали центрифугированием, а культуральную жидкость упаривали п;и помощи вакуумного испарителя. Осадок рэ суспендировали в 20 мкл метанола и наносили на пластинки для тонкослойной хроматографии ("siluioi", Чехословакия). В качестве подвижной фазы использовали смесь бутанол:вода:метанол (4:2:2). Хроматограмму высушивали и фотографировали' в ультрафиолетовом свете.

Результаты и обсуждение

I. Клонирование и ыолеку'лярно-генетический анализ гена, контролирующего устойчивость к диносебу у ' цаанобактерии SynechocystiB 6803.

I.I. Клонирование фрагиепта хроыосошюй ДНК DlnR иутанта SynechocystiD 6803, опре,г чяидего устойчивость к дшюсебу. При клонировании фрагмента ДНК, определяющего устойчивость к диносебу, была применена стратегия "обогащенной полосы". Хромосомную ДНК мутантов Din2, Din7, Din9, Din£4 обрабатывали вндонуклеазами рестрикции Hindin, EooRl и Xbai до полного гидролиза. Продукты рестрикции фракционировали в 0,6л геле легкоплавкой агарозы, вырезали полосы геля, содержащие фрагменты ДНК размером 9-20 т.п.н, 6-9 т.п.н., 4-6 т.п.н, и 2-4 т.л.н., плавили их при 70°С и использовали в опытах по трансформации клеток итамма дикого типа SynechocystiB 6803. Максимальной эффективностью трансформации клеток штамма дикого типа по признаку устойчивости к диносебу (2-6 х Ю-6 на клетку) обладали Hindin фрагменты размером 4-6 т.п.н.,

и EooRi п Xbai фрагмента размером 9-20 т.п.н., незавт.-шо от штамма-донора ДНК.

nindlll фрагменты хромосомной ДНК мутанта Din7 величиной 46 т.п.н. использовали для конструировашя мини-банка ДНК на осново плазмида рОС19 и клонирования гена, определящего устойлвость к диносебу. Было отобрано 600 клонов Е. ооН, содержащих рэкомбинаятане плазмида с хромосомной ДНК мутанта Din7. В опытах по трансформации цианобактэрии па устойчивость к диносебу из банка ДНК была выявлена плазмида pDln7, содержащая 4,7 т.п.н. Hindin фрагмент хромосомной ДНК мутанта Din7 и трансформирующая штамм дикого типа Synechooyetie 6803 на устойчивость к диносебу. Рестрикциопная карта Hindin фрагмента приведена на рис. I.

Для более точной локализации мутация, определяющей устойчивость к диносебу, был получен ряд производных плазмида pDin7 (рис, I) и изучена их способность трансформировать клетки штамма дикого типа SynechooyatiB 6803 по признаку устойчивости. На основании полученных результатов мутация, определяющая устойчивость к диносебу в птакмэ díi»7, бнла локализована на 1,2 т.п.н. Hlndlll-Bglll фрагменте плазмида pBHS(Dln7) (Ри . I).

1.2.Клонирование фрагментов ДНК, гомологичных плазиадо pDlW, из хромосомы птахаха дикого .ила я DinR цутсптов SynechocystlB 6803. Хромосомнуп ДНК мутантов Din2, Din9, EinE4 и штамма дикого типа Syneohooystia 6803 обрабатывали рестриктазой HlnOIII до полного гидролиза. Рестрикционные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в агарозном геле и элшровали зоны, примерно соответствующие по размеру 4,7 т.п.н. Для Каждого штамма - донора ДНК были сконструированы мини-банки (200-300 клонов) алюированпой ДНК на основе векторной плазмида рШ319. Hindill-Bglll фрагмент (1,2 т.п.н.) из плазмида pDin7 использовали в качестве зонда для скрининга полученных мини-банков методом гибридизации колоний in situ. Из колоний, дающих положительный гибридизационный ~игнал, были изолированы плазмида, гомологичные pDin7. Рекомбинантнне плазмида, содержащие гомологичные pDin7 фрагменты хромосомной ДНК DinR мутантов и хромосомной ДНК штамма дикого типа, полностью совпадали по рестрикционной карте с плазмидой pDín7. Плазмида рМл2, pDin9, pDinE4, содержащие фрагменты ДНК соответствующих мутантов, трансформировали клетки штамма дикого типа Syñeohooyetie 6803 на устойчивость к диносебу. Плазмида ,рТО6803, содержащая гомологичный фрагмент хромосомы штамма г"«эго 'типа на обладала

DlnR

DlnR

DlnS

Dins

pDlnr

BI Hill

SI SI Bgll SI SI Pel BI Hill

I [ 1„,J,. 1. J.I л

1.0 . 2.0 3.0 4.0 4.7

pEHS(Dln7) Hill Bgll

pSm(Dln7) SI SI

pHIL(Dln7) Bgll Hill

Hill p Bgll Din

I_I

1.2 т.п.н.

Рис. I. Рестрикционнвя карта фрагмента ДНК мутанта Dln7. клонированного в состава плазмвды pDin7 и локализация мутации, определящей устойчивость к диносебу.

Сокращения: BI. - Вь,.й1, Bgll - Bglll, Hill - HlnOIII, Pel -Petl, SI - Sroal. DlnR - устойчивость к диносебу, Dlns -чувствительность к диносебу.

способностью трансформировать клетки штамма дикого типа на устойчивость к этому гербициду.

1.3. Картирование мутаций, приводящих к устойчивости к диносебу на олазывдах рВН8(01п7), рВНЗ(Лл9), рВИБ(Ю1п2). В целях более точного .картирования мутации, приводящей к устойчивости к диносебу; из ь.,азшды рВШ(Б1п7) был получен ряд дэлецноншх производных, которые проверяли на способность трансформировать клетки штамма дикого типа по признаку устойчивости к диносебу.

pBHS(Din7)

Sin

HI!

Hiril

HII BI j SI t 1 I

SI

Bgll

Din"

0,5

Ш1 plllnc ЯП

1.0 1.2

Din"

mu

pBH(DlnT)

SI

DIO

BI

pBB(DlnT)

Bgll

J,

Din

Din

Hill I_

Din

SI

pSSI

SI J

SI

J,

Bgll

470 П.Н.

Рис. 2. Локализация мутации устойчивости к диносебу на 470 п.н. фрагменте плазмида pBH(Dln7).

Сокращения: BI - BamHI, Bgll - BglII, HUI - HlndlII, HII -HlncII, SI - Smal. DínB -устойчивость к диносебу, Din" -чувствительность к диносебу.

о

Производные плазмида и результаты трансформации приведены на рис. 2, из которого видно, что мутация локализована в Н1п<1111-5та1 фраз'мэнте плазмида рвн(01п7), величиной 470 п$р нуклеотвдов.

Аналогичные деле! :онные производныр 1ыли получ( ы для плазмид рВ1п2. и рМл9. В случае плазмида рЪшЭ, мутация., ' определяющая

' устойчивость мутанта Din9 к диносебу, была картирована на Hindlll-Smal фрагменте плазмида pBH(Din9) длиной 470 п.н., а в случае плазмиды pDin2, мутация была локализована на BamHI-BglII фрагменте плазмида pBB(Din2) длиной 870 п.н.

1.4. Гибридизация фрагмента ДНК. определяющего устойчивость к диносебу, с клонированными генаыи фотосинтеза. В целях идентификации генов на клонированных из клеток DinR мутантов фрагментах ДНК, были проведены аксперименты по блот - гибридизации этих фрагментов с известными генами, контролирующими синтез белков фотосистем I и II. Список клонированных генов ФС1 и ФСП,

' использованных в опытах по блот - гибридизации, приведен в таблице 2. В качестве гибридазационного зонда в опытах использовали 1,2 т.п.н. Hindlil-Bglll фрагмент хромосомы мутанта Dln7 из плазмида pBHS(Din7). Было показано, что Hindlll-BglII фрагмент плазмиды pBHS(rin7) не гибридизуется ни с одним из проверенных генов фотосинтеза.

1.5. Делециошшй анализ Jparueiria ДНК, определяющего устойчивость к диносебу. О целью выявления функции продукта гена, определяющего устойчивость к гербициду, а так* же для определения границ гена, был проведен делеционный и инсерционный анализ плазмид рИб803 и pDin7. Путем встраивания кассеты устойчивости к канамицину (KmR) из плазмиды pU04K в различные участки цианобактериальной ДНК в составе плазмид pBHS(WT6803) и pBHS(Dln7), было получено по несколько делеционных и инсерционных производных этих плазмид (рис. 3). Делеционными и инсерционными вариантами плазмид pBHS(WT6803) и pBHS(Din7), несущими маркер KmR, трансформировали клетки штамма дикого типа Syneohooyetis 6803 по признаку устойчивости к лнамицину. Даже при длительных пассажах КтЕ-трансформантов на все более увеличивающиеся концентрации канамицина (до 60 мкг/мл) они сохраняли способность к росту на минимальной среде в фотоавтотрофных условиях, т.е. инсерции и делеции не затрагивают гены, ответственные за фотосинтез и другие функции, жизненно важные для цианобактерий.

Делеции Hinoil фрагмента размером 342 п.н. (Sell) и Smal фрагмента размером 250 п.н. (Del2), а также инсерция KmR- кассеты в сайт BamHl (ins 2), независимо от того, были ли они получены на плазмидах, содержащих хромосомную ДНК дикого типа или DinR мутёнта, приводили к образованию устойчивых к диносебу трансформантов (рис. 3). Это позволяет предполагать, что признак

А.

Del 1

Del 2

0.5 т.п.н.

1.0 1.2

Б.

Производные плазмид pBHS(WT6803) и pBHS(pDin7)

Фенотип трансформантов

Ina 1 Ins 2 Ins 3 Del 1 Del 2

XnF , DinS

Km

Din

, DlnS

Km

Din

Кп^ , DlnR

Рис. 3. Делециошше и инсерционные производные плазмид . pBHS(Dln7) И pBHS(WT6803) (А) и фенотипы трансформантов Syneohooystis 6803 (Б).

Сокращения: BI - BamHI, Bgll - BglII, HUI - HlndlII, HII -HlncII, SI - Smal.Ins 1, Ins 2 - инсерции, Del 1, Del 2 - делении.

DlnR обусловлен инактивацией исследуемого гена и, следовательно, все анализируемые нами мутации, обуславливающие устойчивость к диносебу, приводят к образованию функционально неактивного белка -продукта данного гена. По результатам далеционного анализа

тт

АЛ

определены условные границы DinR гена, который находится в 1,2 т.п.н. Híndlll-Bglll участке ДНК хромосомы Sjmeohooystie 6803 в составе плагмада рТО (6803).. •■•,'"

1.6. Секвенироваше мутанта копий гена,, определяющего устойчивость цианобактерии Synecfcocystie 6803 к даносебу. Определена последовательность нуклеотидов HindIIl-BglII фрагмента длиной 1,2 т.п.н. из плазмиды pBHS(WT6803), содержащей DinR локус хромосомной ДНК штамма. дикого тша, а также последовательность нуклеотидов Hindlll-Smai фрагментов, размером 470 п.н., из шгазмвд pBH(Din7), рвн(Din9), содержащих мутентные участки хромосомной ДНК соответствующих Din-мутантов.

В установленной последовательности обнаружена одна открытая рамка считывания 0RP21 о, длиной 830 п.н., кодирующая полшептвд размером 210 аминокислотных остатков. Границы 0KF210 согласуются о данными делеционного анализа. Сравнительный анализ пуклеотидвых последовательностей генов из клеток rinR мутантов и штата дикого типа показал, что все мутации находятся в пределах 0ЯР2Ю И являются мутациями типа замены нуклеотида. У мутанта Din7 обнаружена трансвврсия I -» А в 45 кодоне, приводящая к замене лойцина-45 в штамме дикого типа на гистидан-45 в мутанте, а у мутанта Din9 обнаружена транзиция А Г в 7 кодона, приводящая к замене изолейцина-7 на валин-7 (Рис. 4 ).

Перед кодирующей частью 0RF21O обнаружены последовательности, хорошо соответствующие консенсус - последовательностям промоторов, характерных для цианобактерий (см. таблицу 3) (Bryant, частное сообщение).

Таблица 3. Сравнение промоторой области 0KF210 с консенсус -последовательностями промоторов, характерных для цианобактерий.

Консенсус - промотор 5 'TTGIAA }¡16 TATCAT N12 • 3 ATO

Промотор 0KP210 5 TTCTCC H16 TATCAT N12 » 3 ATG

■> ■ ИЛИ

5 íccm N12 ГАТСАТ' N13 3 ATG

Ген 0RP210, мутации в котором определяют резистентность i дздособу, был обозначен drg (dinoseb resistanoe gene).

pBHS (1ST6803 )

raí

Hill i

LJ

T

. ни

BI

SI

О I ] 0.5

Din9 Dln7

L

si

Bgll I

та GAO CCI? ATT TAC CAA 5 Aap Ala Ile Туг Gin 9

1.0 1.2

ТО АТС CAA СТТ ÎGG CGA 43 Ile Gin Leu. Trp Arg 47

Dln9 GAO GOT GTT TAG CAA 5 Aap Ala Val Туг Gin 9

Din7 АТС CAA САГ TGG CGA 43 Ile Gin Hi3 Игр Arg 47

Рис. 4. Мутации, определяющие устойчивость к диносебу у мутантов В1п7 и Din9-

Сокращения: BI - BanHI, Bgll - Bglll, Hill - HindIIIv НИ -HlncII, SI - Smal. Din7, Dln9 - DinK мутанты, WT - щтаим дикого типа Syneohooystis 6803.

1.7. Коипьгтершй анализ нуклеотпдной последовательности гена drg. Нуклеотидаую последовательность 0RF210 сравнивали' с банками ' данных GenBank R 62.0 И ИШЬ 21.0 Nucleotide Sequence Data Bank (март 1991 года). Анализ проводили при помощи пакета- программ DNASIS, версия 6.0. В ходе этого сравнения существенной гомологии между известными последовательностями и последовательностью 0RF210 обнаружено не было. По-видимому, ген ärg является новым, ранее не клонированным геном. Нуклеотидная последовательность гена drg и предсказанная по ней аминокислотная последовательность продукта этого гена приведены на рис. 5. По данным компьютерного анализа, ген drg мохет кодировать белок с молекулярной массой 23,703 кДа.

1.8. Трансляция продукта гена drg в шшиклетках E.coll. Для исследования экспрессии гена drg ' в E.coii, Hindin фрагмент величиной 4,7 т.п.н. из плазмида рибвоз,- клонировали в составе

123 алСТ2СТСТТСТССТААТСАМетССГАССТАТСАтаОСТААААСЛСМТСаЛСАССТТТ 182

К D Т Р 4

183 GACGGTATTTACGAACGGCCATGCGTTAAGCATTTTGACGCTGACCATCGTTTAAOGCCO 242 5DAIYQRRSVKHFDPDHRLTA 24

243 GAAGAAGAAAGAAAGTTGCACGAAGCGGCCATCCAAGCTCCCACTAGTTTTAACATCOAA 302 25SEERKLHEAAXQAP T SPNXQ 44

303 CTTTGGCGATTCTTGÍTCA'M!CGGGATCCCCAACTGCGGOAAACCATCCGGGAAAAATA!r 362 45LWR.?LTIRDPQbRQTIREKY 64

363 GGCAATCAGGCCCAAATGACCGACGCTTCCCTGTTAATTTTGGTAGCGGCGGATGTTAAC 422 65 GNOAQUIDASIiXILTAADVíI 84

423 GCT'íGGGATAJUGACCCCGCCCGTTAOTGGCGCAATGCCCCCCGGGAAGTGGGGAATTAT 482 85 AWDKDPARY?/RNA P REVANY104

483 CTTGTTGGGGCCATCGCCTCTTTCTATGGTGGCAAACCACAGMGCAACGGGATGAAGCO 542 105LVGAIASPYG0XPQ1QRDEA124

543 CAACGGCCCAOTGCCAÜ'GGCCAa'GCAAAAmCAa'GTTGCCGGCOAAGCCOATGGGCTAT 602 125QRSICIÍANQNI.JÍLAAKAMGY144

603 GATAGCTGTCCCATGATCGGOTÍMGACCTCCAAAAGGTAGCCGAGTTGGTCAAAIETACCC 662 145D£CPüXGyDX,QKVAELVKLPl64

663 GCTGACTATGCCAraGGCCCCATGGTGGCGATCGGTAAACGCACCGAAOATGCCCCGGGO 722 165 A D Y A I G P líVA I GKRTEDA PG 184

723 AAMGGCGGTCAAACTCCCCTGGAAGAATTCCTCTGGGAAAACTCCMTGCCTAACTAAO 782 185 К RR S NSP G R I P LG К L L С LTK 204

783 GTTTGGO'GOTAGCAATPTAGTGTTGAGTGGOTAAM'GOÍGAACCCGCTCCGACTCCCAT 842 205 V W С Ъ А I

Рис. 5. Нуклеотидк^г. и аминокислотная последовательности гена ürg. Предполагаемая промоторная область подчеркнута.

вектора экспрессии рКК223-3 таким образом, чтобы' транскрипция 0РЛ?2Ю происходила с гас-промотора вектора, и исследовали

продукты, кодируемые данным фрагментом ДНК, в системе мини-клеток Е.ооП. При трансляции клонированного фрагмента ДНК, образуется Солок с молек} ..ярной массой около 23 кДа, что соответствует молекулярной массе белка, кодируемого геном предсказанной по нуклеотидной последовательности этого гена.

1.9. Гибридиз'тая гена Сге с ДНК высших растений. К.ыя ;этзр1шй анализ последовательности гена бг^ не выявил гомологии с хлоропласгной ДНК и известными генами растений. С

целью поиска в' генома высших растений гена, гомологичного erg, бия а проведена блот-птбридизация Hindlll-Egill фрагмента плазмиды рБПЗ(БВД) с - ДНК уссурийской груши (?yi-ra sp.) и томата (lyoopersioum зр.). Тотальные препарата ДНК Pyrxm Sp. и i^rooperBicun sp. расщепляли рестриктазами Hindin, ВапШ или SooRi и'фракционировали в агарозном геле. В качестве гибридизанионного зонда использовал! Hindili-Bglll фрагмент плазмиды pBHS (Din7) размером 1,2 т.п.п. В гибридизационшп. экспериментах исследуемый фрагмент давал положительные сигналы с тотальной ДНК уссурийской груши и томата. Таким образом, фрагмент ДНК Syneohocystis баоз. несупдай ген drg, имеет гомологи» с ДНК растений. Так как компьютерный анализ не' выявил гомологии гена, ärg с хлоропластным геномом, полная нуклеотидная последовательность которого уке известна, можно предположить, что ген úrg млеет гомологию с последовательностями ядерной ДНК высших растений.

2. Исследование рож: продукта гена arg в метаболгаме цианобактерии Synechocystis 6803.

2.1. Перекрестная устойчивость BinR мутантов к другим герб1щвдаи и ипгибитораы. Все DlnE мутанты не имели перекрестной устойчивости к ингибитору фотосистемы II, гербициду класса замещенных фенилмочевин, диурону (3-(3,4-дихлорофенил)-I,1-диметилмочевине). Помимо устойчивости к диносебу, все DinH мутанты обладал!! устойчивостью к. другому гербициду класса нигрофенолов, ДНОК (4,6 - динитро-орто-крезолу) - до 0,25 мМ в плотной среде, до 0.15 мМ в жидкой среде, и к клеточному ингибитору класса имвдззолов, метронидазолу (2-метил- 5-нитро-1-имидазолэтанолу) - до 0,2 míí в плотной! среде, до 0,1 мМ в иидкой ервде. Порога устойчивости шташа> дикого типа для ДНОК - 0,01 мМ и 0,001 мМ - для метровидазола, В- опытах по трансформации было показано, что плазмида pDinTV j>BHS(Din7), pBJí(Din7), передающие признак устойчивости к диносебу,. трансформируют. клетки штамма дикого типа' на устойчивость к ДНОК и метронидазолу. Все делеции и инсерцаи в гене> ärg также приводили'- к множественной перекрестной устойчивости а диносебу, ДНОК ir- метронидазолу. Более того, Б.Барцевичем, (каф.. генетики ИГУ)- было-показаночто устойчивость к метронидазолу- независимо полученных HdR мутантов цианобактерии Syneohooystls. 680> токе- определяется* мутациями в гене úrg. Следовательно.,, резистентность- к всем' трем' агентам у цианобактерии SyneohooystÍ3 6803 определяется' одним: и тем же геном.

тч

2.2. Исследование влияния дккосеба, ДКОК и цетрохшдазола па клетки мутантов ' и дикого типа Synechocystis 6803. С целью выявления возможного участия продукта гена drg в процессах фотосинтеза, измеряли фотоиндуцированное внделенио кислорода в реакции Хиллз, характеризующее активность ОСИ, и' снимали спектра переменной флуоресценции хлорофилла а меток штамма дикого типа, мутантов . 3in2, Din? и мутанта Din2/Ins2, содержащего кпактквированний кнсерцей ген úrg. Показано, что спектральные характеристики мутантов и кнсерционного мутанта незначительно отличаются от дикого типа, и что все мутанты■обладают активностью фотосистемы II.

Действие гербицидов, миивныэ которых являются . белки, определящие фотосинтез, мозшо выявить при высева клеток итамма дикого тша на среда, содержащие глюкозу и гербицид. Гербициды, ингиоирущие ФСИ, не оказывают'токсического воздействия на клетки шташа джого типа в условиях фотогетаротрофцого роста • в присутствии глюкозы (Ashton et al., 1937). Мутанты Din2, Din7, Din9, итамм дикого типа Synechocystis 6803, a таккз -мутшт SK4, дефектный по фотосистеме II (отсутствует белок СР47, продукт гена рзЬВ (Ennakova et al, 1992)), высевали на среда, содержащие диносеб, ДКОК или метронидазол и глвкозу, а тш£ se на среды, содержащие диносеб, ДНОК или метронидазол и рад соединений, являющихся потенциальными источниками углерода в условиях фотосинтеза. Результаты представлены в таблице 5, из которой видно, что клетки дикого типа и мутанта SK4 не способны расти на глюкозч в присутствии гербицидов, то есть, мшень» для диносеба, ДКОК и мэтронидазо:':.. в пределах исследуемых концентраций этих соединений, является не только фотосистема II.. Однако, штамм дикого типа растет в присутствии диносеба или ДКОК на средах, содержащих ацетат, малат, оксало-ацетат, глиоксилат или фумарат. Снятие токсического действия диносеба добавлением ряда соединений, участвующих в цикле трикарбоновых кислот, позволяет полагать, что диносеб может влиять на метаболизм углерода в клетке.

Исследовано влияние диносеба на ассимиляцию *4С02 клетками штамма ди::ого типа и мутанта Din2. Для предотвращения гибели ¡•ил о ток штамма дикого типа, в одной серии опытов в среду добавляли малат. Было показано, что диносеб в течение нескольких минут почти полностью подавл. т ассимиляцию 14С02 клетками дикого типа, как в присутствии, так и в отсутствии малата, и незначительно подавляет

JL S/

Таблица 5. Рост клеток мутантов и штамма дикого типа БупеоЬооувив 6803 в присутствии гербицидов и разных источников углерода (+ : рост, - : отсутствие роста, +- : слабый рост).

Источник - гербицид + диносеб + метронидазол

углерода дикий Din2 SK4 дикий Din2 SK4 дикий Din2 SK4

тип тип тип

Без источника + + - - ■ + - - + -

углерода

Глюкоза ■V + + ■ь - - + -

Пируват 4- + - - * - - + -

Ацетат + + - + - - +

Оксало- + + - + + - - + -

ацетат

Малат + + - + + - - + -

Глиоксилат + + - + - - + -

Фумарат + + - +- + - - + -

Сукцинат + + - - + - - + -

ассимиляции углекислота в клетках мутанта Ип2 (см. рис. 7). Следовательно, диносеб и ДКОК могут влиять на какие - то этапы ассимиляции С02 в клетках Syneohooystis 6803.

2.3. Возможный механизм развития шюжестЕеннсй устойчивости цианобактерии Synechocystis 6803 к диносебу, ДНОК и метрокидазоду. В ряде работ приводятся данные о том, что нельзя получить трансформантов Syneohooystis 6803 по рецессивным признакам в первом поколении, так как в метке всегда присутствует несколько доминантных копий генов дикого типа. Это подтверждают опыты по конструированию . инсерционных мутантов, дефектных по генам фотосистемы II, гену, кодирующему большую суъедшшцу RuBisCo, и гесА гену (Williams, 1988; Murphy et al., 1990; Pierce et al.', 1989). Во всех случаях после трансформации полученные клоны с Km? инсерцией обладали фенотипом дикого типа. Только длительные пассахи в условиях, не требующих активности белков - продуктов инактивируемнх генов, приводили к проявлению рецессивного фенотипа в случае, если потеря копии гена дикого типа не была детальна для клеток. Поскольку по нашим данным признак DinR проявляется при--

I, ггип

Рис. 7. Фиксация 14С02 клетками штамма дикого типа и мутанта Ы.п2. Л: бо; добавления малата; Б: в присутствии малата. ▼ -клетки ита!лма дикого типа, @ - клетки мутанта Б1п2. Черные фигуры - без добавления диносеба, белые фигуры - в присутствии диносеба.

та

инактивация гена <3гц, и ген йг& представлен в генома ЗупесЛссуз^в 6803 единственной копией, шзшо предположитьчто трансформация меток дикого типа на устойчивость к диносебу кожет происходить по-рецессивному признаку. Для того, чтобы проявилась устойчивость к диносебу, продует гена йгд долкен отсутствовать ;ипг. бить, неактаттш, то ость, в клетка не доданы присутствовать неыутантшо копия гена Возникает вопрос, каким образом происходит

трансформация клеток штамма дикого типа го этому признаку.

Опыта по гибридизации .фрагмента ДНК, содержащего ген вгз, с хромосомной ДНК атамма дикого типа и с хромосомной ДНК грансформантоб, ■ содеряспзгх касерциа в ВатЕГ сайге гена <3г&., показали, что в хромосокаоЗ ДНК шсэрцконных мутантов имеется * только инсерцией инактявированнкй ген, Эти данные, допускают возможность трансформации клеток зупеонооузив баоз по рецессивному признаку я получение устойчивых к диносебу трансформантов. ,

Ввиду того, что мнолюственная устойчивость к диносебу, днок и метронидазолу определяется отсутствием активного. продукта гона с1гв, возмозшо , что эти соединения являются субстратам;! для белка, кодируемого геном drg, и метаболизирувтея при помощи- этого белка до соединений, токсичных для клетки. В пользу этой гипотезы есть несколько доводов. Во - первых, нат сведений о возможной природе мишени для метровидазола, видимо метронвдазол ингибирует- в- клетке другие процессы, чем даносеб и ДНОК. Во - вторых, дкносеб й ДНОК, по всей видимости, ингибируит пути ассимиляции углекислоты, ферменты которых необходимы для обеспечения жизнедеятельности клетки.'Поэтому, маловероятно, что устойчивость к гербициду могла бы определяться отсутствием форманта - мишени, не пркйодя при этом к возникновения ауксотрофности или латали. В - третьих,.. токая гипотеза хороио бы объяснила противоречия в биояаютешбн- допзых о молекулярном механизме действия фэнолькых гербицидов.-

Чтобы выяснить, модифицируются ли диносеб и ДНОК клеткада штамма дикого типа Зупео1гооузй1з баоз, была провожена тонкослойна^, хроматография культуральных Жидкостей клеток штамма косого типа-и мутанта Ыт^г/Тпвг,. инкубироватшх в присутсгвий дкнссеба алл ДНОК'. Было показано, что в культуральной мдкостй клетбк штамма дикого типа появляется дополнительное соединение, в то время как хроматограммы гербицида, инкубированного в среде без клеток- и' культуральная вдцкость клеток инсёрционного мутанта- с-

то

л «/

янакттированнны геном ärg нэ отличаются друг от друга'. Следовательно, в штамме докого тала дкносеб и ШОК подвергаются модификации под воздействием продукта гена ürg, образующиеся метаболиты могут бить токсичными для клетки.

ВЫВОДЯ

I .Клонирован фрагмент хромосомной ДНК дианобактерии SyncоЬосузtie*6803. трансформирующий клетки птамма дшсого.типа к устойчивости к двум гербицидам класса штрофенолбв. .

Z. В составе фрагмента идентифицирован ' новый,. ранее неизвестный ген tírg, определяющий множественную устойчивость MnR мутантов цианобактэрии' Syneohocyctis 6803 к нитрофонольшш гербицидам диносебу, ДНОК и ингибитору метронидазолу.

3. Определена нуклэотидная последовательность ärg гена из хромосош штамма дикого типа.

4. Методом колзкулярно-генатического анализа локализованы мутации, .определяющие устойчивость к гербицидам. Клонированы и ссквенированы фрагменты ärg некоторых DinR мутантов, определена молекулярная природа генетических товреадешй.

5. Резистентность Syneohooystis 6803 к диносебу и ДНОК обусловлена отсутствием активного белка - продукта гена ürg.

6. Ген ärg имеет гомологии с ДКЕС. внсшах растений а представлен в геноме Syneohooystis 6803 еданотвэнной кошэй.

7. Уженью для, доносеба является .не только фотосистема II. Показано, что диносеб подавляет ассимиляции [14C02'J в клетках штамма дикого типа s^ieciiocyetis 6803 и незначительно влияет на поглощение [14со23 в клетках Din.R мутантов.

8. Предложен возможный механизм развития устойчивости к диносебу, ДНОК и .метронидазолу.' В клетках штамма дшсого типа диносеб и ДНОК подвергаются модификации под воздействием продукта гена úrg-, по- видимому, образующиеся метаболиты токсичны для клетки.

Список работ, опубликованных по тема диссертации

I. Ческазиченэ Э.А., Еланская И.В. Выделение фрагмента хромосомной ДНК, определяющего устойчивость цианобактерии s.vnechocyetis к диносебу.- Материалы vil Всесоюзного

"Молекулярные механизмы генетических процессов", Москва,

1990, стр. 129.- /

2. Еланская И.В., Ермакова С.Ю., Станбэкова Р.Е., Гадягиез Л.Г., Броуя М.Н., Карбышева Е.А., 'Шахпабатян Л.Г., Ческавпчене З.Л.,- Шестаков С.В. . Молекулярно' - генетический анализ генов гаютрэлфующих синтез . компонентов CSCII з цианобакторик SyneohooystiB бзоз.- Материалы международной конференции "Фотосинтез и фотобяотэхнолопш", Пущияо, 1991, стр. 81.

3. Elanskaya I., Cliesnavichiene. Е., Siiestakor S. "Cloning of the gens involved in reeistan.ce to phenolio lierbicide dinoseb in the oyanobacterium Syneoliooystie PCC 6803".- In: Abstr. VIX Int. Symp. on Photosynthotio. Prokaryotes, Amherst, Massachusetts, USA,

1991, p. I9A.

9T +