Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сообщества цианобактерий в биопленках и планктоне литоральной зоны озера Байкал

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Сообщества цианобактерий в биопленках и планктоне литоральной зоны озера Байкал"

На правах рукописи

У«"

ГЛАДКИХ Анна Сергеевна

СООБЩЕСТВА ЦИАНОБАКТЕРИИ В БИОПЛЕНКАХ И ПЛАНКТОНЕ ЛИТОРАЛЬНОЙ ЗОНЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ

03.02.08-экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о'.;;.: —?

Иркутск-2012

005016891

Работа выполнена в отделе микробиологии ЛИН СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Белых Ольга Ивановна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чхенкели Вера Александровна

доктор биологических наук, профессор Бузолева Любовь Степановна

Ведущая организация: Сибирский федеральный университет

Защита диссертации состоится 25 мая 2012 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: 666003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. профессора М.М. Кожова (ауд. 219).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: 664003, г. Иркутск, бульвар Гагарина, 24.

Отзывы просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, биолого-почвенный факультет. Тел./факс: (3952) 241855; e-mail: dissovet07@gmail.com.

Автореферат разослан 24 апреля 2012 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, к.б.н., доцент

А.А. Приставка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цианобактерии — фотоавтотрофные прокариоты, населяющие различные экологические ниши: от арктических озер до термальных источников. В водных экосистемах они создают первичную продукцию и являются существенным ресурсом в пищевых цепях, входя в состав как планктонных, так и бентосных сообществ. Важная экологическая роль цианобактерии обуславливается их уникальной способностью к фиксации молекулярного азота атмосферы. В результате биологической азотфиксации до 60% атмосферного азота может связываться и выделяться в воду в виде аммонийных солей (Howarth et al., 1988; Костяев, 2001).

Озеро Байкал - древнейшее и самое глубокое пресноводное озеро в мире. Цианобактерии в Байкале играют значительную роль, их вклад в первичную продукцию в летний период достигает 60-90% (Вотинцев и др., 1972; Бондаренко, Гусельникова, 1989). Изучение видового состава и динамики нанопланктонных цианобактерии с помощью световой микроскопии имеет многолетнюю историю (Поповская, 1991; Бондаренко, 1995). Недавно комплексом методов проведено исследование пикопланктонных цианобактерии (Belykh, Sorokovikova, 2003; Тихонова, 2006; Белых и др., 2011). Зона литорали занимает около 14% от общей площади Байкала, однако процессы, протекающие в прибрежье, играют важную роль и оказывают влияние на биоту всего озера (Колокольцева, 1968; Фиалков, 1983). Цианобактерии оз. Байкал, входящие в состав мейо- и макрофитобентоса (колонии размером 0,5 мм и более), изучены в работах Л. Ижболдиной (Ижболдина, 1990, 2007). Однако цианобактерии, формирующие микроскопические колонии, не были охвачены данными исследованиями.

В последнее десятилетие такое экологическое явление как «цветение» водоемов, обусловленное массовым развитием цианобактерий, стало объектом пристального изучения. Во время «цветения» не только снижается качество воды, но и нередко синтезируются цианотоксины, которые представляют угрозу для жизни и здоровья человека и животных (Chorus, Bartram, 1999). В связи с усиливающейся антропогенной нагрузкой в туристско-рекреационных зонах оз. Байкал возникла необходимость оценить потенциальную опасность развития токсичных «цветений» в регионе.

В настоящее время для изучения биоразнообразия и особенностей функционирования сообществ выработан новый перспективный подход -метагеномный анализ на основании данных пиросеквенирования. Во многих странах мира активно проводятся широкомасштабные метагеномные исследования микроорганизмов различных биотопов (Breitbart et al., 2004; Venter et al., 2004; DeLong et al., 2006; Sogin et al., 2006; Rusch et al, 2007; и др.), в России это направление только начинает развиваться.

Цель и задачи. Целью работы было изучить состав, генетическое разнообразие и структуру сообществ цианобактерий в планктоне и

биопленках, формирующихся на различных субстратах в литоральной зоне оз. Байкал, а также определить их способность к азотфиксации и токсичность.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав и роль цианобактерий в сообществах биопленок, формирующихся на разных субстратах в литоральной зоне оз. Байкал, используя методы световой и электронной микроскопии.

2. Изучить генетическое разнообразие и провести сравнительный анализ сообществ цианобактерий из биопленок и планктона на основе последовательностей гена 16S рРНК, полученных различными методами: пиросеквенированием и секвенированием по Сэнгеру.

3. Выявить азотфиксирующие виды цианобактерий в сообществах биопленок и планктона на основе последовательностей гена нитрогеназы nlfН.

4. Выявить токсиногенные виды цианобактерий в биопленках и планктоне с помощью набора праймеров к домену аминотрансферазы (AMT) тсуЕ-гена и определить методом иммуноферментного анализа (ИФА) содержание в воде микроцистинов — основных токсинов цианобактерий.

Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика сообществ цианобактерий из биопленок литоральной зоны оз. Байкал методами микроскопии, метагеномного анализа, клонирования и секвенирования. Показана структурообразующая роль цианобактерий в составе биопленок. Обнаружено, что видовой состав сообществ цианобактерий в биопленках зависит от типа субстрата. Дана оценка генетического разнообразия цианобактерий на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК как в биопленках, так и в планктоне. Впервые определены генотипы азотфиксирующих цианобактерий. Описано 12 новых для Байкала видов цианобактерий, проведена ревизия таксономического состава планктонных и бентосных цианобактерий оз. Байкал на основании современного подхода в систематике и последовательностей гена 16S рРНК. Выявлены потенциально токсичные цианобактерии в оз. Байкал и водохранилищах Иркутской области с использованием генетических маркеров. Впервые методом ИФА установлено наличие микроцистинов в Усть-Илимском водохранилище.

Теоретическая и практическая значимость полученных результатов. Результаты диссертационной работы расширяют представления о составе сообществ цианобактерий оз. Байкал. Методом пиросеквенирования получено более 30 тыс. нуклеотидных последовательностей. Созданная база данных имеет практическое значение для обнаружения и выделения организмов, обладающих потенциально новыми свойствами для использования в биотехнологии. Полученные и внесенные в мировую базу данных GenBank последовательности генов цианобактерий могут бьггь использованы при разработке групп- и видоспецифичных зондов для гибридизации. Разработан и апробирован

метод детекции генов синтеза микроцистинов. С помощью выбранного генетического маркера можно определять потенциальную токсичность у широкого ряда цианобактерий. Апробирован метод выявления и определения концентрации микроцистинов в воде с помощью ИФА. Используемый комплекс методов может быть рекомендован для проведения мониторинга водоемов, водоохранных мероприятий и оценки качества питьевой воды. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сообщества цианобактерий в биопленках и планктоне оз. Байкал характеризуются высоким таксономическим и генетическим разнообразием. В составе биопленок цианобактерии отвечают за формирование их структуры.

2. В составе как бентосных, так и планктонных сообществ оз. Байкал развиваются цианобактерии, способные к азотфиксации.

3. Генетическая идентификация потенциально токсичных видов на основе анализа последовательностей маркерных генов синтеза микроцистинов оптимальна для экспресс-мониторинга олиготрофных водоемов. При наличии токсиногенных цианобактерий целесообразно использование иммуноферментного анализа для определения концентрации микроцистинов в пробах воды.

Апробацпя работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на всероссийской научной конференции «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006), международном научном семинаре «Новые технологии в интегративной биологии и медицине» (Таиланд, 2006), молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), международной молодежной конференции «Экология 2007» (Архангельск, 2007), международной научно-практической конференции «Современные проблемы водохранилищ и их водосборов» (Пермь, 2007), «Ежегодных научно-теоретических конференциях аспирантов и студентов» (Иркутск, 2006, 2007), международном симпозиуме «Экология» (Болгария, 2007), V конференции молодых ученых СО РАН (Новосибирск, 2007), II и III байкальских микробиологических симпозиумах (Иркутск, 2007, 2011), III и IV международных научных конференциях «Озерные экосистемы: биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды» (Белоруссия, 2007, 2011), III и IV международных конференциях молодых ученых (Украина, 2007, 2011), съезде микробиологического общества Великобритании (Великобритания, 2008), X съезде гидробиологического общества РАН (Владивосток, 2009), V международном симпозиуме по древним озерам (Македония, 2009), международной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 2010), международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2011), европейском конгрессе микробиологов «РЕМ8, 2011» (Швейцария, 2011).

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований автора, выполненных согласно планам НИР в отделе микробиологии ЛИН СО РАН в рамках базовых проектов. Фактические данные получены автором при его непосредственном участии в экспедиционных и лабораторных работах, включая анализ и обобщение полученных результатов. Работа по определению содержания микроцистинов выполнена на базе Сахалинского НИИ рыбного хозяйства и океанографии (г. Южно-Сахалинск).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 155 страницах, содержит 11 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 278 источников, из которых 50 на русском языке и 228 на иностранных языках.

Благодарности. Выражаю искреннюю признательность научному руководителю к.б.н. Ольге Ивановне Белых. Благодарю к.б.н. Е.Г. Сороковикову, к.б.н. И.В. Тихонову, д.б.н. Т.И. Земскую, к.б.н. Т.В. Бутину, д.б.н. O.A. Тимошкина, к.г.-м.н. А.Н. Сутурина, Т.А. Могильникову, С.А. Потапова за ценные советы, рекомендации и помощь при написании диссертации. Выражаю благодарность сотрудникам отдела микробиологии и отдельно зав. отделом к.б.н. В.В. Парфеновой за помощь в организации работы, предоставление реактивов и консультации, а также сотрудникам приборных центров «Электронная микроскопия», «Секвенирование» и водолазной группе лаборатории ихтиологии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В обзоре литературы дана общая характеристика цианобактерий, рассмотрены современные подходы к их систематике. Приведены литературные данные по видовому составу, численности и распределению нанопланктонных цианобактерий в оз. Байкал. Дана общая характеристика микробных биопленок. Проведен анализ молекулярных методов, применяемых для изучения сообществ цианобактерий. Рассмотрены история и методы изучения процессов азотфиксации в водоемах. Отдельный раздел посвящен токсичности цианобактерий и механизму синтеза микроцистинов.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Объектами исследования являлись сообщества нанопланктонных цианобактерий, развивающиеся в прибрежных биотопах оз. Байкал, а также сообщества цианобактерий в составе биопленок, формирующихся на горных породах, наиболее распространенных в береговой зоне озера.

Планктонные пробы отбирали в 2005-2010 гг. с помощью системы батометров SBE-32 (Carousel Water Sampler, Sea Bird Electronics Inc., США), сетями Апштейна и Джеди по всей акватории оз. Байкал, а также в

6

водохранилищах р. Ангара (рис. 1). Биопленки снимали с поверхностей пластин из мрамора, гранита, амфиболита и нержавеющей стали в апреле 2011 г. Пластины были помещены на дно озера на глубину 7 м в районе м. Березовый (Южный Байкал) в 2005 г. (Тимошкин и др., 2009). В качестве контроля использовали залегающие рядом с пластинами необработанные камни (плагиограниты). Всего в ходе исследования было отобрано и обработано 178 проб. Микроскопическое наблюдение проводили с помощью светового микроскопа Axio Imager (Zeiss, Германия). Таксономическое положение цианобактерий идентифицировали по определителям (Komárek, Anagnostidis, 1999, 2005; Komárek, Hauer, 2011). Для оценки степени видового сходства использовали коэффициент Серенсена. Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) пробы фиксировали глутаральдегидом и дегидратировали в спиртах восходящей концентрации. После сушки в критической точке (Balzers CPD 030 Critical Point Dryer, Bal-Тес AG, Лихтенштейн) образцы помещали на столики, напыляли золотом в установке Balzers SCD 004 и исследовали в микроскопе Quanta 200 (FEI Co., США).

ДНК из образцов выделяли реагентами «ДНК-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). ПЦР проводили на приборе «Бис» (Россия), используя пары праймеров, комплементарные участкам генов 16S рРНК, nifA и AMT домена mcyE-гена. Трансформацию и клонирование осуществляли по стандартным методикам (Sambrook et al., 1989). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов проводили на секвенаторе Beckman CEQ 8800 (Beckman Coulter Inc., США). При помощи пакета программ MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011) полученные последовательности выравнивали, производили расчет генетических дистанций и филогенетические реконструкции на основе последовательностей гена 16S рРНК и AMT домена гена тсуЕ. Филогенетическую реконструкцию на основе нуклеотидных последовательностей гена nifA проводили байесовским методом с помощью программы MrBayes 3.1.2 (Roriquist, Huelsenbeck, 2003). Пиросеквенирование фрагментов гена 16S рРНК произведено компанией ChunLab Inc. (Респ. Корея, г. Сеул) на приборе 454 Genome Sequencer FLX Titanium (Roche, Швейцария). Метагеномный анализ, расчет коэффициентов

Рис. 1. Карта-схема станций отбора проб:» - города, А- станции отбора проб.

видового разнообразия АСЕ и Chaol проводили с помощью пакетов программ Mothur 1.23.1 (Schloss et al., 2009) и Pyrosequencing pipeline (http://pyro.cme.msu.edu). Нуклеотидные последовательности (157 штук) депонированы в GenBank под номерами EU031808, JF739283-88, JF781282-98, JN887825—77, JQ068804-06, JQ685757-81, JQ700509-59. Последовательности, полученные методом пиросеквенирования (более 30 тыс.), помещены в базу данных ChunLab Inc. Концентрацию микроцистинов определяли методом ИФА с помощью набора «Microcystes ADDA-ELISA» (Abraxis Bioscience Inc., США). Статистическая обработка данных произведена с использованием программ RID A SOFT Win («Стайлаб», Россия) и Microsoft Excel 2010 для Windows (Корп. Microsoft, США).

Глава 3. Видовой состав и роль цианобактерий в биопленках различных субстратов озера Байкал

Видовой состав цианобактерий-обрастателей пяти различных субстратов включал 16 видов, принадлежащих порядкам Chroococcales, Oscillatoriales и Nostocales. Десять из них ранее не приводились в списках бентосных и планктонных цианобактерий оз. Байкал. Большинство отмеченных видов -представители бентоса, главным образом, эпилиты и эпифиты.

Сообщества цианобактерий активно развивались на мраморе, биопленки других субстратов отличались меньшим обилием цианобактерий. В обрастаниях каменистых субстратов можно выделить два доминирующих комплекса видов: «ривулариевый», образованный Rivularia rufescens с видами-спутниками, поселяющимися в ее колониях — Leptolyngbya rivulariarum и Schizothrix rivulariarum, и «толипотриксовый», состоящий из Tolypothrix limbata и вида-эпифита на его нитях - Leibleinia epiphytica (рис. 2а-в). «Ривулариевый» комплекс развивался на мраморе, граните, амфиболите и контрольном субстрате (плагиограните), «толипотриксовый» — на мраморе и контрольном субстрате.

Видовой состав цианобактерий-эпилитов на экспериментальных пластинах, экспонированных при одинаковых гидрофизических и гидрохимических условиях (глубина, температура, рН, освещенность, концентрация биогенных элементов в воде), был обусловлен свойствами субстратов, на которых развивались биопленки. Ранее было показано, что геологический тип пород (петрографический состав, физические свойства) может оказывать влияние на биоразнообразие и продукционные характеристики зоо- и микробиобентоса (Timoshkin et al., 2003). Предпочтение цианобактериями мрамора другим породам может быть связано с высоким содержанием кальция в его составе. Активно развивающийся на мраморе «ривулариевый» комплекс представлен кальцефильными видами. Также большое значение для гидробионтов имеют физические свойства субстрата. В ряду горных пород мрамор-гранит-амфиболит, расположенных по убыванию видового разнообразия цианобактерий, наибольшей пористостью отличается мрамор, наименьшей —

амфиболит, что подтверждает значимость данного фактора для цианобактерий-эпилитов. Наличие пор и микротрещин облегчает бактериальную адсорбцию и способствует заселению субстрата микроорганизмами (Парфенова и др., 2008; Типо.чИкт е/ а/., 2003).

а 1

в

Рис. 2. Доминирующие виды цианобактерий в составе обрастаний: а - колония Я. ги/еясет, б — К. ги/евсет, Б. пш1апагит (стрелка), в - Т. ИтЪсНа, г -С. Утаи, Н. рияШа (стрелка). А, в - световая микроскопия; б - СЭМ; г - флуоресцентная микроскопия.

В обрастаниях стальных пластин развивался комплекс видов с доминированием СИатаезгрИоп /шсш и Не1его1е1ЬШта ртШа (рис. 2г), нехарактерный для каменистых субстратов. Цианобактерии-обрастатели нержавеющей стали отличались малыми размерами клеток и наличием слизистых чехлов и псевдовлагалищ. Данные морфологические особенности позволили им прикрепиться к гладкому, химически инертному субстрату и колонизировать его, получая биогенные элементы только из окружающей водной среды, без дополнительного их притока из субстрата.

На основании данных световой и электронной микроскопии показано, что цианобактерии составляли основную массу обрастаний естественных и искусственного субстратов. Так, на каменистых субстратах колонии Я. ги/еясет располагались плотными подушками из слипшихся тяжей,

формируя, таким образом, трехмерный каркас биопленки (рис, 3). Более мелкие по размеру гетеротрофные бактерии и диатомовые водоросли локализовались между трихомами цианобактерий или на поверхности их колоний. На стальных пластинах архитектуру биопленок определяли коккоидные цианобактерии рода СЬатаез^рИоп и нитчатая Н. ршШа. Вырабатываемый цианобактериями полисахаридный матрикс и их трихомы составляли основу биопленок, выполняя структурообразующую, адгезивную и защитную функции.

Рис. 3. Структура биопленки мрамора: а - общий вид обрастания, б - трихомы Я ги/еэсет с погруженными в их матрикс диатомовыми водорослями и гетеротрофными бактериями. СЭМ.

Глава 4. Генетическое разнообразие цианобактерий в биопленках и планктоне литоральной зоны озера Байкал

В составе сообществ биопленок в различных соотношениях доминировали три бактериальные филы: СуапоЬас1епа, Рго1еоЪас1епа и Вас1его1с1е1е8. Фила СуапоЬайепа являлась самой многочисленной на мраморе и стальной пластине; на граните, амфиболите и контрольном субстрате - третья по численности (рис. 4).

Цианобактерии в обрастаниях каменистых субстратов были в основном представлены видами порядков НовШсакБ и ОБсШаЬпакв. На мраморе доля М^осакв составляла 80,8%, ОвсШайпакв - 18,0%, на граните - 51,1% и 43,4%, на амфиболите - 37,4% и 54,9%, на контрольном субстрате - 32,6% и 66,4%, соответственно. На стальной пластине преобладали представители порядка СЬгоососсакв (54,1%), несколько меньше было ОвсШаитакз (42,7%) и минимальное количество -1Яо81:оса1е8 (3,1%).

По количеству выявленных филотипов и расчетным значениям видового богатства наиболее разнообразным было цианобактериальное сообщество на мраморе (35 филотипов) (табл. 1). Сообщества гранита и амфиболита были менее богаты (21 и 28 филотипов, соответственно). Минимальное видовое разнообразие выявлено на контрольном субстрате (20 филотипов). Цианобактериальное сообщество стальной пластины, как и сообщество мрамора, отличалось значительным видовым разнообразием:

выявлено 30 филотипов, при этом коэффициенты видового богатства были высокими.

100%

80%

60%

40%

20%

■ СуапоЬайепа Ц Вайегс^еэ |Ц РкйеоЬа^епа 0 АсИпоЬас1епа □ Другие

Рис. 4. Метагеномный анализ сообществ биопленок и придонной воды из литоральной зоны оз. Байкал на основании последовательностей фрагмента гена 16Б рРНК.

297

640

Мрамор Гранит

Амфиболит Контрольный Сталь субстрат

Придонная вода

Таким образом, учитывая данные микроскопии и метагеномного анализа, в условиях литорали оз. Байкал мрамор является наиболее благоприятным естественным субстратом для развития цианобактерий. Минимальное количество филотипов на контрольном субстрате и максимальное по сравнению с другими субстратами количество видов, выявленное с помощью световой микроскопии (12 видов), обусловлено равномерностью распределения видов в сообществе. Биопленка контрольного субстрата имела более длительный срок экспозиции по сравнению с биопленками экспериментальных пластин и являлась сбалансированной по видовому составу и функциональному распределению членов сообщества.

По составу доминирующих таксонов сообщества цианобактерий каменистых субстратов были сходны между собой и резко отличались от сообщества стальной пластины. С помощью метагеномного анализа на мраморе, граните, амфиболите и контрольном субстрате выявлено доминирование филотипа Кыи1апа Бр. (ЫовЬсакз). Среди ОвсШаШпа^,

11

доминирующих на амфиболите и контрольном субстрате, зарегистрирован филотип РзеиЛапаЬаепа, найденный и при микроскопическом наблюдении биопленок. Среди СЬтоососсакв методами пиросеквенирования и микроскопии на граните, амфиболите и контрольном субстрате выявлен филотип СИатаезгрИоп. На всех каменистых субстратах присутствовали ОзсПЫопа йр., Ытпо1кгЫ ер., СеШегтета саго11потт и филотипы порядка Р1еигосар8а1с.ч. Наблюдаемые различия видового состава сообществ цианобактерий каменистых субстратов обусловлены минорными филотипами, представленными в сообществах несколькими последовательностями. На стальной пластине преобладали филотипы рода Скатаезгркоп (СЬгоососсаЬз) и ЕБ580987 (ОвсПЫопакз). Уникальный филотип ЕБ580987 может являться видом Н. ртШа, найденным в большом количестве при микроскопии биопленок искусственного субстрата.

Таблица 1

Показатели видового богатства и разнообразия для сообществ цианобактерий оз. Байкал по данным пиросеквенирования

Субстрат/проба Общее кол-во последовательностей Кол-во уникальных последовательностей Кол-во филоти-пов Коэфф. АСЕ Коэфф. СЬаоІ

мрамор 5726 1803 35 258 125

гранит 640 265 21 22 22

амфиболит 297 120 28 34 41'

контрольный субстрат 970 396 20 27 20

стальная пластина 2194 749 30 153 111

придонная вода 128 62 18 35 28

В придонной воде в отличие от биопленок доминировали представители фил Вас1его1<Зе1е8, АсйпоЬайепа и Рго1еоЬас1епа, доля СуапоЬайепа составляла менее 3% (рис. 4). Цианобактерии в основном были представлены мелкоклеточными видами порядка СЬгоососса1ез.

Параллельно с пиросеквенированием была создана библиотека генов 168 рРНК цианобактерий из биопленок и планктона прибрежных биотопов оз. Байкал. В литорали озера доминировали нанопланктонные Ыо§(оса1с5 (55%), представленные родами Аркатютепоп, О о I к к оърегт ит и Тпскогтш, и пикопланктонные цианобактерии порядка СЬгоососса1ез (45%). На филогенетическом древе полученные последовательности вместе с последовательностями из базы данных ОспВапк формировали устойчивые родовые кластеры с высокими значениями статистической поддержки (80100%).

Известно, что на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК цианобактерии группируются друг с другом по сходным экологическим условиям обитания (Ernst et al., 2003). Планктонные цианобактерии из оз. Байкал группировались с представителями из пресных водоемов Европы, Америки и Японии. Цианобактерии-обрастатели кластеризовались с последовательностями из биопленок аналогичных субстратов (например, Chamaesiphori), пресных водохранилищ (Pseudanabaena), либо формировали отдельные ветви (Calothrix, Leptolyngbya, Prochlorothrix). На основании BLAST-анализа в сочетании с филогенетическим анализом из биопленок гранита и стальной пластины были получены последовательности нового для Байкала рода Prochlorothrix, хотя данные пиросеквенирования позволяли говорить только о наличии соответствующего семейства (Prochlorothrichaceae).

Следует отметить, что последовательности гена 16S рРНК, полученные при анализе библиотек клонов, дополняют результаты метагеномного анализа. Массив данных пиросеквенирования несравнимо больше и включает в себя почти всю выборку, полученную в результате секвенирования по Сэнгеру. Метагеномный анализ позволяет охарактеризовать значительную часть или все сообщество и оценить его видовое и генетическое разнообразие.

Глава 5. Азотфиксирующие цианобактерии в озере Байкал

В оз. Байкал ежегодно в августе-сентябре отмечаются периоды, когда содержание азота в фотическом слое воды приближается к аналитическому нулю (Вотинцев и др., 1975; Домышева, 2001). При этом наблюдается высокая численность цианобактерий и водорослей (Белых и др., 2007). В такие периоды значимую роль в функционировании экосистемы приобретают азотфиксирующие цианобактерии.

В ходе работы были изучены морфологические особенности штаммов из коллекции байкальских цианобактерий. На основании размеров клеток, морфологии трихомов, наличия и расположения акинет и гетероцист девять из них были идентифицированы как азотфиксирующий вид Trichormus variabilis. Определение последовательностей гена 16S рРНК подтвердило таксономическую принадлежность штаммов к роду Trichormus. Данный род и вид ранее не были описаны для оз. Байкал.

Поиск и исследование разнообразия азотфиксирующих цианобактерий в оз. Байкал проводили с помощью анализа маркерного гена нитрогеназы nifH. Многочисленные исследования различных водоемов показали, что амплификация гена nifii очень удобна для выявления азотфиксирующих видов (Olson et al., 1999; Zani et al., 2000; Zehr et al., 2001; Steppe et al., 2002; и др.). Из проб, отобранных в заливах и прибрежных участках трех котловин, было получено 45 последовательностей фрагмента гена нитрогеназы. Последовательности из Среднего и Северного Байкала входили в кластер родов Anabaena/Aphanizomenon, последовательности из Южного Байкала

принадлежали родам АпаЪаепа, N05100 и Тпскогтт и были гетерогенно распределены на филогенетическом древе (рис. 5).

«I-м«иЮ611.Л1||Т171.01.1Г1|ки|

-МоЛос/юрт, ц>. ыт. *»3557, Лда«

ТЬ^роеубгпойПМ 1п<|17. иРвгЗ$51. Ивд» 1- 7!

г клом ЮЕ ЩЛМПТГ, п Е|Ьп

\ Алабаапа Кк РСС 7130. .105111 *-Лла6ммф.А2.АГ124377

«лоимр». ГИЧТИ.оа- ЬаАия

..,

|_>

То/уровгЬ Ьпиа 1пй1 в, ,Ю24в570. Икдаа - длабаала «Р- 1.-31,ии4»

а Юв Л1667661, ш. Мм

]

АпжЬэвп»

Лм6ааиаф.СН1,00294216,рисааоагала,Китай

АлаЬаапа <5>|Цаяд1.......... «МгашШи ЫИЕ2, АУ461 «16, р.Начс, США

И10ИЮВЦЛЧ71Я,«1.1ГММ||

*и6а|па(ЗОааяцраяяара»0<|*|аа|>»ЩВ< В 1615.00429641, точа». И^м ни ЮС14, ЛМСТД ц В|||И вмн ЮС 15, ямпч п. ЕаЯш

РСС7122, АУ221613, пруя,Анпмя I Дркмкомям (31) —Алабаала акЯса РАСНВ-Ч «. 00294216, щп> пап», Ккт»ГП

-цтпммщкм. АпаЪаепа

1 юцлыав. «агор». тб5173,гоаа. Китай I

- ияа»1, МвШТ4. «■ Га*|Ш —

- клан ст 1, ЛИ1757, а Байкал

--яви ЮС1?, Л1867>76, о*. Байон

МоМос со**пп ЙС, Кв31в72, етаро. США МЬШС тюсоюч ЦТАО, 00445450. р. Мотто. Пчядппа ■■■рта. Еогтарна N№3, АУ461417, р.Наус, США

_- нааутыт*. I»—Ааа 1цят, ЕГ=406200, мин. источммк, США

ЮБ1,ЛМЩм.Б|Аш) •а (ТпсПотл) щ. СН1,00294216, рисоаоа пом, Катай г Апаааала (гюютя) мДЫЬ АТСС29413. ивЮи 1г алой ЮС 1Х ЛЯ*7«72. о. Какая ЛАпайааяа(1Нс*опица)а«йаа. 134679. сшЛиоиттнаймага ** 1>Мщаиа чаг>м> »»Г «7И. ЛЧ7666.0»- Ва»мп1

----- II' П|---1--ПЧ1ТЩ. III ГШИП

ТНИчшааиаНа—ВКСбГЦЕЦбЭТбС«, тимьян 71 > Иппиаа ит кЫ» ИНГ >611. ЛИРЮТ, о». Еайаав Т1II»«■ аии«а|1аЫ»»»Г61ИТ. МИЛII.«а.Дайнап ТНсЬоГтЦЗ

.............. И4С 16611, J06IHm.aa.lil» щщ

Л1г1и I ■ ущЛЬЯв ВАС 6617, Х|661Л11, а*. Иайим

ТМеА,

ВАС 6*6«, «66X761. аа.Байам>

N№1, АГ461415, р. Маус. США ~

I-.Яшааапцц»*! ф. ИНЕ1, АГ461415, р Маус. <

■дЬт-таурамчааш» итсхвш. ооя1бв1

I-5----» «ласта,

I. Иша |

иг пюнЮС12,,М667671,аз.Бяйтп

йрйап^цааяа» (4), Га^раСМг (18)

Бакгарии

— Аю**вс#гс*тоооссип|СОМСС1.17«, ЕЦ6933Э6 1-ЛЮЫжЫ «Иа|ап|«1 М11579

Рис. 5. Филогенетическое древо, построенное на основе фрагментов гена ит/Н байесовским методом. Нуклеотидные последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом. В скобках указано количество последовательностей, в узлах ветвления - апостериорные вероятности. Масштаб соответствует 4 нуклеотидным заменам на каждые 10 нуклеотидов. Обозначения: мр - мрамор, ст - сталь, ЮБ - Южный Байкал.

Таким образом, на основании сравнительного и филогенетического анализа последовательности гена и//Н из планктона озера были отнесены к следующим родам: АпаЪаепа, АрИатготепоп, N05100 и Тпскогтт. Представители этих родов характеризуются не только способностью к

14

азотфиксации, которая дает им конкурентное преимущество в период недостатка азота, но и наличием газовых вакуолей, что обеспечивает их плавучесть. В период летнего прогрева воды в прибрежных участках озера наблюдаются оптимальные условия для массового развития цианобактерий.

Из биопленок мрамора, контрольного субстрата и стальной пластины было получено 20 последовательностей гена niJH. На основании сравнительного и филогенетического анализа они были отнесены к родам Anabaena, Nostoc и Tolypothrix.

Таким образом, в оз. Байкал азотфиксирующие гетероцистные цианобактерии порядка Nostocales обнаружены в составе как планктонных, так и бентосных сообществ, отмечено их высокое видовое и генетическое разнообразие.

Глава 6. Выявление токсичных цианобактерий в озере Байкал и водохранилищах Иркутской области

Микроцистины - это циклические гептапептиды, обладающие гепатотоксичным и канцерогенным действием. Они синтезируются микроцистин-синтетазой, которая кодируется кластером генов (mcyA-i). На основе последовательностей /ясу-генов были разработаны праймеры для поиска токсичных представителей.

Выявление генотипов токсичных цианобактерий в водоемах Байкальского региона проводили с помощью набора праймеров, специфичных АМТ-домену /исуЕ-гена. Положительный результат в ПЦР-анализе был получен для проб, отобранных в августе 2010 г. в Баргузинском заливе и заливе Куркут (пролив Малое Море). Пробы, отобранные в Братском и Усть-Илимском водохранилищах, давали положительный результат ПЦР во все годы исследования (2005-2010 гг.). Следует отметить, что за весь период мониторинга планктона оз. Байкал на наличие генов синтеза микроцистинов (с 2005 г.) положительный результат получен впервые. В биопленках токсиногенные цианобактерии не обнаружены. Сравнительный и филогенетический анализ полученных последовательностей АМТ-домена тсуЕ-гена показал, что в планктоне оз. Байкал, Братского и Усть-Илимского водохранилищ присутствовали цианобактерии родов Anabaena и Microcystis, содержащие гены синтеза микроцистинов. Представители этих родов часто становятся причиной токсичных «цветений», они известны как основные продуценты микроцистинов в пресных водоемах. Показано, что эвтрофирование водоемов способствует массовому развитию токсичных видов (Chorus, Bartram, 1999). Содержание органических веществ и биогенов в водохранилищах ангарского каскада в несколько раз превышает ПДК вследствие сбросов промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод (Кудринская, Морева, 2004). В Малом Море и Баргузинском заливе в летний период отмечены высокие значения содержания хлорофилла а и биомассы фитопланктона, характерные для мезотрофных водоемов (Белых и др., 2007).

Содержание микроцистинов в воде определяли методом ИФА. В оз. Байкал в исследуемый период микроцистины не обнаружены. В Усть-Илимском водохранилище летом 2010 г. концентрация микроцистинов в воде составила 0,25±0,02 мкг/л, что не превышает ПДК, установленную Всемирной организацией здравоохранения.

Присутствие токсичных генотипов в озере Байкал вызывает большое опасение. Недавно зарегистрирован факт токсичного «цветения» в оз. Котокель, расположенном в 2 км от оз. Байкал и связанном с ним посредством рек (Ве1укЬ е1 а!., 2011). Прямая водная связь между озерами Котокель и Байкал представляет определенную угрозу для глубочайшего пресноводного озера мира. Полученные данные говорят о необходимости продолжения мониторинга токсичных цианобактерий в водоемах региона и выработки мер по предупреждению отравлений микроцистинами.

ВЫВОДЫ

1. в составе цианобактериальных сообществ биопленок литоральной зоны озера Байкал по данным микроскопии определено 16 видов цианобактерий, принадлежащих к 12 родам, 3 порядкам. На мраморе обнаружено 11 видов (9 родов, 3 порядка), на граните 6 видов (5 родов, 3 порядка), на амфиболите 5 видов (4 рода, 3 порядка), на нержавеющей стали 6 видов (5 родов, 3 порядка), на естественном субстрате (контроль) 12 видов (10 родов, 3 порядка). На основе анализа видового состава, морфологии, ультраструктуры клеток и строения биопленок показано, что сообщества цианобактерий в обрастаниях выполняют фототрофную, азотфиксирующую, структурообразующую, адгезивную и защитную функции.

2. В биопленках каменистых субстратов озера Байкал доминируют цианобактерии порядков Ыов^юакз и ОБсШаШпакБ, которые образуют два комплекса видов: «ривулариевый», представленный колониями Ш\и1апа ги/еясепэ с видами-спутниками Leptolyngbya гпиЫггагит и БсЫгоЛгЬс гюи1апагит и «толипотриксовый» - колонии То1уро(Иг1х ИтЬаШ с видом-спутником ЬеШеМа ер1рЬуйса. «Ривулариевый» комплекс развивается на мраморе, граните, амфиболите и плагиограните, «толипотриксовый» - на мраморе и плагиограните. В обрастаниях искусственного субстрата доминируют цианобактерии порядков СЬгоососсакБ и ОБсШаШпа^Б, представленные видами СЪатаемрИоп /шси.ч, Ск subglobosus и Не1его1еШеШа ртШа.

3. Фила СуапоЬайепа, наряду с Рго1еоЬас1епа и Ва^егтнёйез доминирует в составе микробных сообществ биопленок озера Байкал по данным метагеномного анализа. Доля цианобактерий варьирует в зависимости от типа субстрата: цианобактерии преобладают на мраморе и нержавеющей стали (46% и 41%, соответственно) и являются третьей филой на контрольном субстрате (22%), граните (18%) и амфиболите (8%).

Наибольшее видовое разнообразие (по количеству филотипов) определено на мраморе и искусственном субстрате, наименьшее — на граните и контрольном субстрате. В придонной воде, где преобладают Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria, Cyanobacteria является минорной филой

(3%).

4. Сообщества нанопланктонных цианобактерий в прибрежных биотопах озера Байкал в летний период характеризуются значительным генетическим разнообразием с доминированием представителей порядка Nostocales (рода АпаЪаепа, Aphanizomenon, Dolichospermum, Nostoc, Trichormus).

5. Показано генетическое разнообразие азотфиксирующих цианобактерий в сообществах биопленок и планктона литорали озера Байкал. В биопленках азотфиксирующие цианобактерии представлены родами Anabaena, Calothrix, Nostoc, Rivularia и Tolypothrix, в планктоне - Anabaena, Aphanizomenon, Dolichospermum, Nostoc и Trichormus. Выявлен новый для Байкала азотфиксирующий род Trichormus, представленный видом Trichormus variabilis. Описана его морфология и определены последовательности фрагментов генов 16S рРНК и ni/H девяти штаммов.

6. В Малом Море и Баргузинском заливе, Усть-Илимском и Братском водохранилищах выявлены цианобактерии родов Anabaena и Microcystis, содержащие гены, кодирующие синтез микроцистинов. В биопленках токсиногенные виды отсутствуют. Иммуноферментный анализ планктонных проб в исследуемый период не выявил микроцистины В 03. Байкал, в Усть-Илимском водохранилище концентрация микроцистинов составила 0,25±0,02 мкг/л, что ниже порога, установленного ВОЗ для питьевой воды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК:

1. Азотфиксирующая цианобактерия Trichormus variabilis в фитопланктоне озера Байкал / А.С. Гладких, О.И. Белых, И.В. Клименков, И.В. Тихонова // Микробиология. - 2008. - Т. 77. -№ 6. - С. 814-822.

2. Анализ цианобактерий озера Байкал и Усть-Илимского водохранилища на наличие гена синтеза микроцистина / И.В. Тихонова, О.И. Белых, Г.В. Помазкина, А.С. Гладких // Доклады Академии наук. - 2006. - Т. 409. - № З.-С. 1-3.

3. Выявление потенциально токсичных цианобактерий в питьевой воде с помощью полимеразной цепной реакции / И.В. Тихонова, А.С. Гладких, О.И. Белых, Е.Г. Сороковикова // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2006. - Т. 2. - № 48. - С. 202-205.

4. Выявление токсичных Microcystis в озере Котокельское (Бурятия) / О.И. Белых, И.В. Тихонова, Е.Г. Сороковикова, А.С. Гладких, Ок.В. Калюжная // Вестник Томского государственного университета. - 2010. - № 330. — С. 172-175.

5. Метагеномный анализ сообществ микроорганизмов из озера Байкал / A.C. Гладких, О.И. Белых, О.В. Левина, В.В. Парфенова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 4/1. - № 38. - С. 76-77.

6. Ecological development and genetic diversity of Microcystis aeruginosa from artificial reservoir in Russia / N.A. Gaevsky, V.l. Kolmakov, O.I. Belykh, I.V. Tikhonova, Y. Joung, T.-S. Ahn, V.A. Nabatova, A.S. Gladkikh // Journal of Microbiology. - 2011. - V. 49. - № 5. - P. 714-720.

Статьи в сборниках:

7. Выявление потенциально токсичных цианобактерий в озере Байкал и водохранилищах байкальского региона с помощью молекулярно-биологических методов / И.В. Тихонова, A.C. Гладких, Е.Г. Сороковикова, О.И. Белых // Ecology. Scientific Articles. Bulgaria: ScienceBg Publishing, 2007. - Т. 1. - C. 99-106.

8. Обнаружение токсичных цианобактерий в хозяйственно важных водоемах Сибири, Белоруссии и Украины / Е.Г. Сороковикова, О.В. Калюжная, И.В. Тихонова, A.C. Гладких, С.А. Потапов, О.И. Белых // Сборник статей молодых ученых Иркутского научного центра Сибирского отделения РАН. - Иркутск: Изд-во Института географии им. Б.В. Сочавы СО РАН, 2011 -С. 34-36.

Методические пособия:

9. Руководство по определению биомассы видов планктона пелагиали озера Байкал / О.И. Белых, А.Ю. Бессудова, A.C. Гладких, А.Е. Кузьмина, Г.В. Помазкина, Г.И. Поповская, Е.Г. Сороковикова, И.В. Тихонова, М.В. Усольцева // Методическое пособие. - Иркутск: Изд-во ИГУ, 2011. - 51 с.

Материалы конференций:

10.Белых О.И. Выявление генов синтеза токсинов у цианобактерий озера Байкал и водоемов Байкальского региона / О.И. Белых, Е.Г. Сороковикова, A.C. Гладких // Новые технологии в интегративной биологии и медицине: материалы межд. науч. междисципл. семинара. Патгайя, 2006. - С. 11-12.

И.Выявление генетических маркеров токсичных цианобактерий в озере Байкал и водохранилищах Иркутской области: молекулярно-биологический подход к оценке качества воды / О.И. Белых, И.В. Тихонова, A.C. Гладких, Г.В. Помазкина // Озерные экосистемы: Биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды: материалы III междунар. науч. конф. Минск-Нарочь, 2007. - С. 305-306.

12.Выявление генов синтеза токсинов цианобактерий из водоемов Иркутского региона / A.C. Гладких, И.В. Тихонова, О.И. Белых, Г.В. Помазкина // Экология 2007: материалы междунар. молод, конф. Архангельск, 2007. - С. 158-159.

13.Вьіявление генов синтеза токсинов цианобактерий в водоемах Иркутского региона / О.И. Белых, A.C. Гладких, И.В. Тихонова, Г.В. Помазкина // Современные проблемы водохранилищ и их водосборов: материалы междунар. науч.-практич. конф. Пермь, 2007. - Т. 2. - С. 204-207.

14.Выявление генов синтеза цианобактериальных токсинов в различных

водоемах России: молекулярно-биологический подход к оценке качества воды / О.И. Белых, A.C. Гладких, И.В. Тихонова, O.A. Дмитриева // МатериалыXсъезда гидробиол. об-ва РАН. Владивосток, 2009. - С. 39-40.

15.Выявление токсичных цианобактерий в водоемах Байкальского региона / О.И. Белых, Е.Г. Сороковикова, И.В. Тихонова, A.C. Гладких, С.А. Потапов // Озерные экосистемы: биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды: материалы IV междунар. науч. конф. Минск-Нарочь, 2011. - С. 158.

16.Вьіявление токсичных цианобактерий в озере Байкал и водохранилищах Иркутской области / A.C. Гладких, О.И. Белых, И.В. Тихонова, Г.В. Помазкина, Е.Г. Сороковикова // Биоразнообразие экосистем внутренней Азии: материалы всерос. науч. конф. Улан-Удэ, 2006. - Т. 2. — С. 31-32.

17.Гладких A.C. Выявление токсичного вида цианобактерий Microcystis aeruginosa в Берешском водохранилище / A.C. Гладких, О.И. Белых, И.В. Тихонова // Проблемы молекулярной и клеточной биологии: сборник материалов молод, науч.-методич. конф. Томск, 2007.- С. 57—58.

18.Гладки* A.C. Молекулярно-биологические методы в изучении цианобактерий озера Байкал и водохранилищ / A.C. Гладких, И.В. Тихонова, О.И. Белых // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ: материалы II Байкальского микробиол. симпозиума с междунар. участием. Иркутск, 2007. - С. 50-51.

19.Гладких A.C. Цианобактерии озера Байкал и водохранилищ Иркутской области: видовой состав и выявление токсичных видов / A.C. Гладких, О.И. Белых, И.В. Тихонова // Ежегодная науч.-теоретич. конф. аспирантов и студентов ИГУ: Вестник Иркутского ун-та. Иркутск, 2007. - С. 11-12.

20.Исследование микробных сообществ в планктоне и биопленках озера Байкал методом пиросеквенирования / В.В. Парфенова, О.И. Белых, A.C. Гладких, Т.Я. Косторнова, М.Ю. Суслова // Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний: материалы междунар. конф. Улан-Удэ - Улан-Батор, 2011. - С. 142-143.

21.Сороковикова Е.Г. Выявление генов синтеза токсинов у цианобактерий Байкальского региона/Е.Г. Сороковикова, И.В. Тихонова, A.C. Гладких // V конф. мол. уч. СО РАН, посвященная М.А. Лаврентьеву. Сборник статей. Новосибирск, 2007. — С. 168-170.

22.Токсичные цианобактерии оз. Байкал и водоемов Байкальского региона / A.C. Гладких, О.И. Белых, И.В. Тихонова, Е.Г. Сороковикова, С.А. Потапов // Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах: материалы III Байкальского микробиол. симпозиума. Иркутск, 2011. - С. 39-41.

23.Analysis of cyanobacterial community of artificial substrate biofilm and plankton in Lake Baikal / O.I. Belykh, A.S. Gladkikh, E.G. Sorokovikova, I.V. Tikhonova, V.V. Parfenova // Abstracts of the 4th congress of the European microbiologists, FEMS 2011. Geneva, 2011. -P. 1038.

24.Belykh O.I. Detection of microcystin synthetase genes in the different water basins of Russia / O.I. Belykh, A.S. Gladkikh, I.V. Tikhonova / Abstracts of

the 5th international symposium Speciation in Ancient Lakes, SIAL V. Ohrid, 2009.-P. 9-10.

25.Gladkikh A. Detection of microcystin synthetase genes in cyanobacteria from Lake Baikal and water reservoirs of East Siberia / A. Gladkikh, I. Tikhonova, O. Belykh // Society for general microbiology meeting: abstracts of spring meeting. Edinburgh, 2008. - P. 65.

26.Gladkikh A. Test of presents toxic cyanobacteria in lake Baikal and water reservoirs of region / A. Gladkikh, I. Tikhonova, O. Belykh // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution: abstracts of the III international young scientists conference. Odesa, 2007. - P. 187-188.

27.Detection of toxic cyanobacteria in Lake Baikal and water bodies of the region / O.I. Belykh, E.G. Sorokovikova, I.V. Tikhonova, A.S. Gladkikh, S.A. Potapov // Abstracts of the 4th congress of the European microbiologists, FEMS 2011. Geneva, 2011.-P. 949.

28.Toxic cyanobacteria in water bodies of Baikal region (East Siberia, Russia) / A.S. Gladkikh, O.I. Belykh, E.G. Sorokovikova, I.V. Tikhonova, S.A. Potapov // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution: abstracts of the IV international young scientists conference. Odesa, 2011. - P. 212-213.

Подписано к печати 20.04.2012 г. Формат 60*84/16. Объем 1,2 дл. Тираж 150 экз. Заказ № 553. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гладких, Анна Сергеевна, Иркутск

61 12-3/1232

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЛИМНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ГЛАДКИХ Анна Сергеевна

СООБЩЕСТВА ЦИАНОБАКТЕРИЙ В БИОПЛЕНКАХ И ПЛАНКТОНЕ ЛИТОРАЛЬНОЙ ЗОНЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ

03.02.08-экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Белых О.И.

Иркутск, 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................12

1.1. Общая характеристика цианобактерий.......................................12

1.2. Различные подходы к систематике цианобактерий...................13

1.3. Планктонные цианобактерии озера Байкал................................16

1.4. Общая характеристика биопленок...............................................20

1.5. Применение молекулярных методов для изучения биоразнообразия цианобактерий.....................................................................23

1.6. Метагеномный анализ...................................................................26

1.7. Процессы азотфиксации в водоемах, применение молекулярных методов для выявления азотфиксирующих видов...............30

1.8. Токсичные цианобактерии...........................................................35

Заключение по обзору литературы........................................................39

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................42

2.1. Объекты исследования..................................................................42

2.2. Методы исследования...................................................................47

2.2.1. Световая, эпифлуоресцентная и сканирующая электронная микроскопия...................................................................................................47

2.2.2. Молекулярные методы..............................................................48

2.2.3. Секвенирование и филогенетический анализ.........................52

2.2.4. Пиросеквенирование и метагеномный анализ.......................54

2.2.5. Определение содержания и концентраций микроцистинов .55

ГЛАВА 3. ВИДОВОЙ СОСТАВ И РОЛЬ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В БИОПЛЕНКАХ РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТОВ ОЗЕРА БАЙКАЛ..................57

3.1. Видовой состав цианобактерий в биопленках различных субстратов .........................................................................................................57

3.2. Роль цианобактерий в формировании структуры биопленок... 67

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В БИОПЛЕНКАХ И ПЛАНКТОНЕ ЛИТОРАЛЬНОЙ ЗОНЫ ОЗЕРА БАЙКАЛ ..................................................................................................................................70

4.1. Генетическое разнообразие цианобактерий в биопленках и придонной воде..................................................................................................70

4.2. Генетическое разнообразие цианобактерий в составе планктона. Филогенетический анализ.............................................................85

ГЛАВА 5. АЗОТФИКСИРУЮЩИЕ ЦИАНОБАКТЕРИИ В ОЗЕРЕ БАЙКАЛ ..................................................................................................................................93

5.1. Характеристика азотфиксирующей цианобактерии Trichormus variabilis из озера Байкал..................................................................................93

5.2. Генетическое разнообразие азотфиксирующих цианобактерий в биопленках и планктоне...............................................................................96

ГЛАВА 6. ВЫЯВЛЕНИЕ ТОКСИЧНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В ОЗЕРЕ БАЙКАЛ И ВОДОХРАНИЛИЩАХ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ....................106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................113

ВЫВОДЫ.............................................................................................................117

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................119

ПРИЛОЖЕНИЕ 1................................................................................................149

ПРИЛОЖЕНИЕ 2................................................................................................150

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ацил-КоА - ацил-коэнзим А AMT - аминотрансфераза БД - база данных

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДГГЭ - денатурирующий градиентный гель-электрофорез

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

K2+G - двухпараметрическая модель Кимуры с учетом гамма-распределения Оз. - озеро

ОП - оптическая плотность

п. н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

СМ - световая микроскопия

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТЕ-буфер - буфер трис-ЭДТА

трис-НС1 - трис-оксиметиламинометана гидрохлорид

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭФМ - эпифлуоресцентная микроскопия

MOPS - 3-(1Ч-морфолино)пропансульфоновая кислота

RDP, MG-RAST, VAMPS - общедоступные онлайн-серверы для анализа

метагеномных данных

BaBarg - Баргузинский залив, озеро Байкал

ВАС - Baikal algae collection - коллекция цианобактерий и водорослей ЛИН СО РАН

Bbiofilm - биопленка литоральной зоны озера Байкал

BR, Bratsk - Братское водохранилище

Chiv - Чивыркуйский залив, озеро Байкал

D - прибрежная зона мыса Давша, озеро Байкал

Kur - залив Куркут, пролив Малое море, озеро Байкал

NB - прибрежная зона вблизи г. Северобайкальск

SB - Южный Байкал

U-Ilim - Усть-Илимское водохранилище

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Цианобактерии - фотоавтотрофные прокариоты, населяющие различные экологические ниши: от арктических озер до термальных источников. В водных экосистемах они создают первичную продукцию и являются существенным ресурсом в пищевых цепях, входя в состав как планктонных, так и бентосных сообществ. Важная экологическая роль цианобактерий обуславливается их уникальной способностью к фиксации молекулярного азота атмосферы. В результате биологической азотфиксации до 60% атмосферного азота может связываться и выделяться в воду в виде аммонийных солей [26, 189].

Озеро Байкал - древнейшее и самое глубокое пресноводное озеро в мире. Цианобактерии в Байкале играют значительную роль, их вклад в первичную продукцию в летний период достигает 60-90% [12, 4]. Изучение видового состава и динамики нанопланктонных цианобактерий с помощью световой микроскопии имеет многолетнюю историю [39, 5]. Недавно комплексом методов проведено исследование пикопланктонных цианобактерий [47, 35, 64]. Зона литорали занимает около 14% от общей площади Байкала, однако процессы, протекающие в прибрежье, играют важную роль и оказывают влияние на биоту всего озера [23, 48]. Цианобактерии оз. Байкал, входящие в состав мейо- и макрофитобентоса (колонии размером 0,5 мм и более), изучены в работах Л. Ижболдиной [20, 19]. Однако цианобактерии, формирующие микроскопические колонии, не были охвачены данными исследованиями.

В последнее десятилетие такое экологическое явление как «цветение» водоемов, обусловленное массовым развитием цианобактерий, стало объектом пристального изучения. Во время «цветения» не только снижается качество воды, но и нередко синтезируются цианотоксины, которые представляют угрозу для жизни и здоровья человека и животных [88]. В связи с усиливающейся антропогенной нагрузкой в туристско-

рекреационных зонах оз. Байкал возникла необходимость оценить потенциальную опасность развития токсичных «цветений» в регионе.

В настоящее время для изучения биоразнообразия и особенностей функционирования сообществ выработан новый перспективный подход -метагеномный анализ на основании данных пиросеквенирования. Во многих странах мира активно проводятся широкомасштабные метагеномные исследования микроорганизмов различных биотопов [106, 116, 89, 171, 252], в России это направление только начинает развиваться.

Цель и задачи. Целью работы было изучить состав, генетическое разнообразие и структуру сообществ цианобактерий в планктоне и биопленках, формирующихся на различных субстратах в литоральной зоне оз. Байкал, а также определить их способность к азотфиксации и токсичность.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить таксономический состав и роль цианобактерий в сообществах биопленок, формирующихся на разных субстратах в литоральной зоне оз. Байкал, используя методы световой и электронной микроскопии.

2. Изучить генетическое разнообразие и провести сравнительный анализ сообществ цианобактерий из биопленок и планктона на основе последовательностей гена 16S рРНК, полученных различными методами: пиросеквенированием и секвенированием по Сэнгеру.

3. Выявить азотфиксирующие виды цианобактерий в сообществах биопленок и планктона на основе последовательностей гена нитрогеназы nifii.

4. Выявить токсиногенные виды цианобактерий в биопленках и планктоне с помощью набора праймеров к домену аминотрансферазы (AMT) тсуЕ-гена и определить методом иммуноферментного анализа (ИФА) содержание в воде микроцистинов - основных токсинов цианобактерий.

Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика сообществ цианобактерий из биопленок литоральной зоны оз. Байкал

методами микроскопии, метагеномного анализа, клонирования и секвенирования. Показана структурообразующая роль цианобактерий в составе биопленок. Обнаружено, что видовой состав сообществ цианобактерий в биопленках зависит от типа субстрата. Дана оценка генетического разнообразия цианобактерий на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК как в биопленках, так и в планктоне. Впервые определены генотипы азотфиксирующих цианобактерий. Описано 12 новых для Байкала видов цианобактерий, проведена ревизия таксономического состава планктонных и бентосных цианобактерий оз. Байкал на основании современного подхода в систематике и последовательностей гена 16S рРНК. Выявлены потенциально токсичные цианобактерии в оз. Байкал и водохранилищах Иркутской области с использованием генетических маркеров. Впервые методом ИФА установлено наличие микроцистинов в Усть-Илимском водохранилище.

Степень обоснованности и достоверности полученных научных результатов подтверждена использованием в качестве теоретической и методической базы трудов отечественных и зарубежных исследователей, а также воспроизводимостью полученных данных. В исследовании использованы современные методы и подходы с отработанными методиками: электронная микроскопия, выделение ДНК, амплификация со специфичными праймерами, лигирование, трансформация, секвенирование и метагеномный анализ. Полученные нуклеотидные последовательности (157 шт.) зарегистрированы в международной БД GenBank. Анализ последовательностей выполнен с помощью онлайн-серверов и стандартных пакетов программ для работы с последовательностями: BLAST, RDP, Mothur версия 1.23.1, Mega версия 5.05, MrBayes версия 3.1.2. Полученные в работе данные корректно соотносятся с результатами других авторов.

Теоретическая и практическая значимость полученных результатов. Результаты диссертационной работы расширяют представления о составе сообществ цианобактерий оз. Байкал. Методом

пиросеквенирования получено более 30 тыс. нуклеотидных последовательностей. Созданная база данных имеет практическое значение для обнаружения и выделения организмов, обладающих потенциально новыми свойствами для использования в биотехнологии. Полученные и внесенные в мировую базу данных ОепВапк последовательности генов цианобактерий могут быть использованы при разработке групп- и видоспецифичных зондов для гибридизации. Разработан и апробирован метод детекции генов синтеза микроцистинов. С помощью выбранного генетического маркера можно определять потенциальную токсичность у широкого ряда цианобактерий. Апробирован метод выявления и определения концентрации микроцистинов в воде с помощью ИФА. Используемый комплекс методов может быть рекомендован для проведения мониторинга водоемов, водоохранных мероприятий и оценки качества питьевой воды. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сообщества цианобактерий в биопленках и планктоне оз. Байкал характеризуются высоким таксономическим и генетическим разнообразием. В составе биопленок цианобактерии отвечают за формирование их структуры.

2. В составе как бентосных, так и планктонных сообществ оз. Байкал развиваются цианобактерии, способные к азотфиксации.

3. Генетическая идентификация потенциально токсичных видов на основе анализа последовательностей маркерных генов синтеза микроцистинов оптимальна для экспресс-мониторинга олиготрофных водоемов. При наличии токсиногенных цианобактерий целесообразно использование иммуноферментного анализа для определения концентрации микроцистинов в пробах воды.

Реализация и внедрение результатов исследования. Теоретические положения и результаты исследования использованы при подготовке научных отчетов по базовому бюджетному проекту ЛИН СО РАН VI.51.L9. «Особенности формирования и жизненная стратегия микробного сообщества

и вирусов в биопленках в оз. Байкал»; а также грантам РФФИ 05-04-97222-р_байкал_а, 09-04-90420 Укр_ф_а, 10-04-01613-а и 11-04-92220 Монг_а.

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований автора, выполненных согласно планам научно-исследовательских работ в отделе микробиологии ЛИН СО РАН в рамках базовых проектов. Фактические данные получены автором при его непосредственном участии в экспедиционных и лабораторных работах, включая анализ и обобщение полученных результатов. Работа по определению содержания микроцистинов выполнена на базе Сахалинского НИИ рыбного хозяйства и океанографии (г. Южно-Сахалинск).

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на всероссийской научной конференции «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006), международном научном семинаре «Новые технологии в интегративной биологии и медицине» (Таиланд, 2006), молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), международной молодежной конференции «Экология 2007» (Архангельск, 2007), международной научно-практической конференции «Современные проблемы водохранилищ и их водосборов» (Пермь, 2007), «Ежегодных научно-теоретических конференциях аспирантов и студентов» (Иркутск, 2006, 2007), международном симпозиуме «Экология» (Болгария, 2007), V конференции молодых ученых СО РАН (Новосибирск, 2007), II и III байкальских микробиологических симпозиумах (Иркутск, 2007, 2011), III и IV международных научных конференциях «Озерные экосистемы: биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды» (Белоруссия, 2007, 2011), III и IV международных конференциях молодых ученых (Украина, 2007, 2011), съезде микробиологического общества Великобритании (Великобритания, 2008), X съезде гидробиологического общества РАН (Владивосток, 2009), V международном симпозиуме по древним озерам (Македония, 2009), международной конференции

«Проблемы экологии» (Иркутск, 2010), международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2011), европейском конгрессе микробиологов «FEMS, 2011» (Швейцария, 2011).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 28 научных работ, из них 6 - статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных действующим списком ВАК, 2 - статьи в сборниках, 1 - методическое пособие, 19 - тезисы конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 155 страницах, содержит И таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 278 источников, из которых 50 на русском языке и 228 на иностранных языках.

Благодарности. Выражаю искреннюю признательность научному руководителю к.б.н. Ольге Ивановне Белых. Благодарю к.б.н. Е.Г. Сороковикову, к.б.н. И.В. Тихонову, д.б.н. Т.И. Земскую, к.б.н. Т.В. Бутину, д.б.н. O.A. Тимошкина, к.г.-м.н. А.Н. Сутурина, Т.А. Могильникову, С.А. Потапова за ценные советы, рекомендации и помощь при написании диссертации. Выражаю благодарность сотрудникам отдела микробиологии и отдельно зав. отделом к.б.н. В.В. Парфеновой за помощь в организации работы, предоставление реактивов и консультации, а также сотрудникам приборных центров «Электронная микроскопия», «Секвенирование» и группе водолазных исследований и подводного мониторинга лаборатории ихтиологии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика цианобактерий

Цианобактерии - обширная, наиболее богатая формами и самая распространенная в природе группа прокариот. По числу родов цианобактерий занимают четвертое место среди бактерий, включая в себя в настоящее время около 2 тыс. видов. В морфологическом отношении это очень разнообразная группа микроорганизмов, представленная одноклеточными, колониальными и нитчатыми формами.

Цианобактерии являются древнейшими фотосинтезирующими организмами на планете, возраст которых по разным оценкам составляет от 3 до 3,5 млрд лет. Будучи оксигенными фототрофами, цианобактерии сформировали кислородную атмосферу и, таким образом, сыграли важную роль в эволюции жизни на Земле [227]. Большое значение они имеют и в функционировании современной биосферы, участвуя в круговороте биогенных элементов.

Цианобактерии раньше называли сине-зелеными водоро