Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробное сообщество биопленок на поверхности раздела фаз "вода-твердое тело" литоральной зоны оз. Байкал

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Микробное сообщество биопленок на поверхности раздела фаз "вода-твердое тело" литоральной зоны оз. Байкал"



На правах рукописи

МАЛЬНИК Валерий Васильевич

МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО БИОПЛЕНОК НА ПОВЕРХНОСТИ РАЗДЕЛА ФАЗ «ВОДА - ТВЕРДОЕ ТЕЛО» ЛИТОРАЛЬНОЙ ЗОНЫ

ОЗ. БАЙКАЛ

03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004601153

Улан-Удэ-2010

004601153

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Парфенова Валентина Владимировна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Бузолева Любовь Степановна кандидат биологических наук Дагурова Ольга Павловна Ведущая организация: Институт водных и экологических проблем ДВО РАН

Защита диссертации состоится « 23 » апреля 2010 г. в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 212.022.03 при Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24 а, конференц-зал. Факс: (3012)210588 E-mail: d21202203@mail.ru malnik80@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН и Бурятского государственного университета

Автореферат разослан « 22 » марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.А. Шорноева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Микробные сообщества - одни из наиболее значимых компонентов живого населения водоемов. Известно, что большая часть микроорганизмов образует биопленки, и более чем 99% всех микроорганизмов на Земле живут в таких агрегатах (Costerton et al.,1987). Ископаемые биопленки являются первыми записями жизни на Земле, датирующимися 3,5 млрд. лет назад (Schopf et al., 1983). Они представлены самой отдаленной наиболее успешной формой жизни при заселении почвы, осадков, минеральных и растительных поверхностей в природе, включая экстремальные местообитания, в том числе, такие как системы пор в ледниках, горячие источники, электроды и даже области, сильно облученные установками ядерной энергии (Satpathy, 1999).

Биопленки вовлекаются в биогеохимические пути круговорота углерода, азота, водорода, серы, фосфора и большей части металлов. Процессы самоочищения в природе совершаются также с участием биопленочных организмов, а биотехнология в очистке питьевой и сточных вод основывается на биопленках (Flemming, 2002). Но также они могут являться значительной помехой на искусственных структурах, таких как корабельные корпуса, гидроэлектрические трубопроводы, водные системы сетчатого строения и теплообменники (Marshall, 1992; Dworkin, 2006).

Изучение особенностей распространения биопленок в зависимости от локальных экологических условий (окружающая температура, наличие и доступность питательных веществ), определение таксономического разнообразия бактерий их сообщества вызывают интерес и привлекают внимание многих ученых. Актуальность и необходимость проведения исследований в данном направлении была оценена Европейским союзом микробиологов: на международном симпозиуме в рамках FEMS в 2009 году в Швеции был организован отдельный симпозиум ISME-FEMS Symposium - «Biofilms in Ecology and Medicine». Очевидно, что изучение разнообразия биопленочных микроорганизмов литоральной зоны оз. Байкал представляет несомненный

интерес для понимания механизмов функционирования экосистемы Байкала в целом.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - изучить количественный состав, морфологическое и таксономическое разнообразие микроорганизмов из сообщества биопленок литоральной зоны озера Байкал.

Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Исследовать количественный состав микроорганизмов, выделенных с биопленок каменных субстратов в мелководной литоральной зоне оз. Байкал.

2. Изучить морфологическое разнообразие микроорганизмов биопленочных образований на пластинках различного типа методами эпифлуоресцентной световой, а также сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.

3. Выделить микроорганизмы из биопленок на стальной пластине, граните, мраморе и амфиболите методами классической микробиологии и сформировать коллекцию чистых культур, а также исследовать способность заселения микроорганизмами искусственных субстратов.

4. Определить ферментативную активность, физиолого-биохимические свойства, таксономический статус до рода культивируемых микроорганизмов биопленок.

5. Провести исследование таксономического разнообразия некультивируемого микробного сообщества биопленок с использованием методов молекулярной биологии на основе филогенетического анализа.

Научная новизна работы. Впервые в озере Байкал было исследовано биопленочное сообщество микроорганизмов, развивающееся на поверхности раздела фаз «вода - твердое тело». Установлена избирательность заселения микроорганизмами различных субстратов, сделано предположение о возможной роли микроорганизмов в разрушении некоторых пород, типичных для литорали озера. Было показано, что микроорганизмы биопленок обладают достаточно высокой ферментативной активностью. Проведен количественный учет различных групп биопленочных бактерий в литоральной зоне оз. Байкал в районе пос. Большие Коты. Впервые для изучения биопленок озера Байкал использован

4

молекулярно-биологический подход. Сравнительный анализ генов рРНК позволил выявить в составе биопленок различные таксономические группы микроорганизмов. Получены данные по гену 16Б рРНК для микроорганизмов, входящих в состав биопленочных сообществ литоральной зоны оз. Байкал.

Практическая значимость работы Расширение сведений о составе биопленочных сообществ имеет большое практическое значение для обнаружения и выделения микроорганизмов, обладающих различной ферментативной активностью, а также для использования сформированной коллекции в биотехнологии. Полученные генетические данные, характеризующие разнообразие биопленочных сообществ оз. Байкал, позволяют сравнивать их с результатами исследования биопленок других пресноводных и соленых водоемов. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16Б рРНК культивируемых и некультивируемых бактерий, 10 из них зарегистрированы в международном ЕМВЬ-банке данных. Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности могут служить основой в конструировании зондов для гибридизации.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В литоральной зоне оз. Байкал на поверхности раздела фаз «вода - твердое тело» формируются специализированные микробные сообщества, входящие в состав биопленки.

2. Наличие разнообразных физиологических групп микроорганизмов, функционирующих в тесной связи друг с другом в биопленочных сообществах и обладающих широким спектром ферментативной активности, позволяет предполагать, что процессы деструкции органического вещества эффективно осуществляются биопленочными организмами.

3. В биопленочных сообществах литоральной зоны озера Байкал выявлены микроорганизмы различных филогенетических групп, большая часть которых представлена некультивируемыми формами.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены и обсуждены на следующих научных форумах: IV Верещагинской Байкальской Конференции, Иркутск, 2005; Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие Экосистем Внутренней Азии», Улан-Удэ, 2006; X Всероссийской научно-практической конференции «Научное Творчество Молодежи», Анжеро-Судженск, 2006; IX Съезде Гидробиологического общества РАН, Тольятти, 2006; VI международном симпозиуме «Terrestrial Environmental Changes In East Eurasia and Adjacent Areas», Иркутск-Листвянка, 2007; II Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ», Иркутск, 2007.

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 11 печатных работ, в том числе одна статья, рекомендованная ВАК, и две главы в коллективной монографии.

Структура и объем работы. Данная диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав по содержанию исследования, заключения и выводов, списка использованной литературы (31 отечественного и 152 зарубежных источников) и приложений. Объем работы составляет 145 страниц машинописного текста, включающего 6 таблиц, 32 рисунка и 5 приложений.

Благодарности. Автор выражает благодарность и искреннюю признательность за постоянную помощь и поддержку при выполнении работы научному руководителю - доценту, зав. лабораторией водной микробиологии к.б.н. Парфеновой В.В., зав. лабораторией биологии водных беспозвоночных д.б.н. Тимошкину О.А., зав. лабораторией биогеохимии к.г-м.н. Сутурину А.Н., к.г-м.н. Бойко С.М., к.б.н. Ковадло А.С., к.б.н. Перетолчиной Т.Е., к.б.н. Кулаковой Н.В., д.б.н. Мизандронцеву И.Б., д.б.н. Беликову С.И., Старостину В.Ф., Егорову В.И. и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии Лимнологического института.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект исследования

Объектом исследования являлись биопленочные сообщества микроорганизмов, обитающие на каменистых грунтах, а также микроорганизмы, заселяющие амфиболитные, гранитные, мраморные и стальные пластины, погруженные в литоральной зоне озера Байкал. В работах многих авторов биопленки определяются как скопления микроорганизмов и их связанных внеклеточных продуктов на поверхности раздела фаз, типично прикрепленных к неживой или живой поверхности фауеу, 2000). Биопленки могут формироваться на твердо-жидкой, твердо-воздушной и жидко-воздушной поверхностях раздела фаз (Р1етгшг^, 2002). Особенность биопленок заключается в том, что организмы внедряются в матрикс микробного происхождения, состоящий из внеклеточных полимерных веществ (ВПВ). ВПВ содержат, главным образом, полисахариды и белки, которые формируют гидрогелевые матриксы (\Vingender е1 а!., 1999).

Материалы и методы исследований

С 2005 по 2009 год было отобрано и исследовано около 60 сезонных проб, взятых в районе междисциплинарного полигона у м. Березовый на Южном Байкале и в районе п. Большие Коты в период экспедиций, организованных ЛИН СО РАН. Эти пробы брались с установленных на дне литорали озера пластинок из нержавеющей стали, а также гранита, мрамора, амфиболита и неопределенных по минералогическому составу камней, выстилающих литоральную зону оз. Байкал.

Использовали стандартные в водной микробиологии методы культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах. Для этого готовили серию разведений из природных образцов и засевали методом прямого глубинного посева (Родина, 1965). Затем проводили отбор доминирующих колоний, пересев на пробирки со скошенным агаром и идентификацию микроорганизмов до рода с

помощью физиолого-биохимических тестов (на оксидазу, каталазную активность, желатиназу, фосфатазу, на среде Хью и Лейвсона и др.).

В работе были использованы методы сканирующей (Marshall, 1986b), трансмиссионной (Marshall, 1986b) и эпифлуоресцентной микроскопии (Zvyagintsev, 1962).

Применяли две методики выделения ДНК из биопленок (Шубенкова, 2005; Грачев, 2006). Трансформацию проводили согласно описанному ранее методу (Sambrook et al., 1989). При использовании набора CloneJET™ PCR Cloning Kit учитывались все выросшие на LB-среде колонии, которые, как предполагалось, содержали фрагменты гена 16S рРНК. Для сравнительного анализа полученных нуклеотидных последовательностей с известными в GenBank использовали пакет программ BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.eov).

Нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК выравнивали с помощью ClustalW (Thompson et al., 1994) и оптимизировали вручную, используя программу BioEdit (Hall, 1999).

Филогенетическое древо строили методом максимального правдоподобия (Maximum Likelihood, ML) (Felsenstein, 1981), с помощью программы Phyml (Bevan et al., 2005). Достоверность топологии древа оценивали с помощью непараметрического бутстрэпа. Для оценки генетических дистанций использовали модель нуклеотидных замен HKY (Hasegawa et al., 1985). Модель замен выбирали согласно jModelTest (Posada, 2008).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Микробиологическая характеристика биопленок с природного каменного субстрата

Микроорганизмы в силу своего предпочтения прикрепленного образа жизни обеспечивают себе более благоприятные условия жизнедеятельности, участвуя в трансформации органического материала, осевшего на дно озера. В этом процессе участвуют все известные группы бактерий: сапрофита, дрожжи, грибы,

актиномицеты, а также физиологические группы бактерий, участвующие в круговороте углерода, азота и фосфора (рис. 1 А, 1 Б).

Для поиска и количественной оценки вышеперечисленных бактерий проведен количественный и качественный анализ микробного сообщества биопленок, сформированных на каменном субстрате прибрежной зоны озера в районе Южного Байкала от п. Черная до п. Большие Коты в летнее время (Таблица 1).

А Б

Рис. 1. Биопленочные микроорганизмы с природного каменного субстрата (А) и культивируемые на питательной среде (Б).

Анализ культивируемого микробного сообщества биопленок на каменном природном субстрате показал, что это сообщество состоит из большого разнообразия групп бактерий, а численность каждой из этих групп составляет тысячи и сотни тысяч КОЕ/см2 площади камня. Скорее всего, формирование микробного сообщества биопленок на природном субстрате зависит от минералогического состава поднятого каменного субстрата, от количества осевшего органического материала, от влияния гидрологических условий в мелководной зоне и некоторых других причин.

Таблица 1.

Количественные характеристики микроорганизмов (тыс. КОЕ/см2), обнаруженных на поднятых камнях в районе от п. Черная до п. Большие Коты.

Глубина Сапрофит Дрожжи Грибы и актиномицегы Амилолити-ческие Фосфор-мобилизующие Фосфат-растворяющие

Падь Черная

1 2 102 4 919 290 526

2 50 1480 0 628 104 236

3 15 94 5 25 4 2.4

500м от пади Черная

0.5 12 0 1.5 1.4 4.6 0

1 0.2 10 1.5 557 0 0

1.8 3 0 0 680 0 0

3.2 160 94 2 219 0 0

1000м от пади Черная

0.5 0.1 27 2.5 679 263 377

1 3.5 91 4 325 157 250

2 24.2 33 0.5 15.2 157 2.4

3 1.7 22 0 сп.р 0 314

1500м от пади Черная

0.5 2.6 3 2.5 244 204 110

1 0.4 6 6.5 0 100 31.4

2 1.3 36.4 0 49 100 31.4

3 0.3 35.5 11 1570 0 0

2000м от пади Черная

0.5 2.3 8 6.5 1624 0 0

1 0.2 117 2.5 0 0 0

2 0.2 14.7 5 2747 0 0

3 2.4 7.9 0.5 357 0 0

2500м от пади Черная

0.5 36 6 2 2.5 0.25 0

1 0.3 0.6 6.5 118 98 103

2 22 7.5 4 , 11.7 9.3 8.5

3000м от пади Черная

0.5 38 5 1 785 102 ЧО ос 1

1 0.2 10 0.5 188 0 0

3 193 2 3 157 0 0

2. Сравнительная характеристика микробного сообщества биопленок, сформированных на стальной пластине и пластинах различного минералогического состава

Как было упомянуто в работе, количественный состав различных групп микроорганизмов на каменном субстрате различался. Мы предположили, что

это может зависеть и от состава субстрата, на котором идет формирование биопленки.

Прямое наблюдение биопленок с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показало, что все три типа исследованных пластинок, заселяются различными группами микроорганизмов: на мраморе доминируют крупные палочки (рис. 1аА), на граните - палочки крупные и более мелкого размера и кокки (рис. liB), на амфиболите - палочки и крупные кокковидные клетки (рис. 1аВ)

А Б В

Рис. 1а. Морфологическое разнообразие микроорганизмов на различных субстратах, выявленное методом сканирующей электронной микроскопии: А - на мраморе, Б - на граните, В - на амфиболите.

Микроорганизмы, которые прикреплялись к стальной пластине, по морфологической составляющей были более разнообразными, нежели на пластинах упомянутых выше субстратов (рис. 2). Это палочки разной длины и размеров, в том числе прямые и изогнутые, кокковые формы, а также спириллы.

Кроме того, для описания морфологической структуры микроорганизмов использовали метод трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Биопленка, сформированная на стальной пластине, показала большое морфологическое разнообразие микроорганизмов - палочки различной морфологической структуры, кокковидные клетки, простекобактерии и т.д. (рис.

Также производился подсчет общей численности микроорганизмов на 1 см2 стальной пластины, снятой вблизи берега у поселка Б. Коты. Численность составила 420 тыс. клеток.

Рис. 2. Морфологическое разнообразие микроорганизмов биопленки со стальной пластины (СЭМ)

Рис. 3. Клетки биопленочных микроорганизмов, обнаруженных на стальной пластине (ТЭМ)

Для изучения морфологического разнообразия культивируемых микроорганизмов также использовали метод эпифлуоресцентной микроскопии (рис. 4).

А Б В

Рис. 4. Морфологическое разнообразие культивируемого микробного сообщества на различных субстратах, выявленное методом эпифлуоресцентной микроскопии: А - на граните, Б - на мраморе, В - на амфиболите.

На мраморе морфологическое разнообразие культивируемого микробного сообщества представлено одними палочковидными формами микроорганизмов различного размера (рис. 4Б). На граните и на амфиболите это были как палочковидные, так и кокковидные формы бактерий, причем на амфиболите кокковых форм было больше (рис. 4 А; В).

3. Физиолого-биохимическая активность и таксономический состав культивируемых микроорганизмов, изолированных из биопленок

Нами были изолированы колонии доминирующих микроорганизмов, которые выросли на разных питательных средах: наибольшее разнообразие выявлено на мраморе и стальной пластине - 50 и 58 различных штаммов, соответственно, с гранитной пластины было выделено 30, с амфиболитной - всего 9 штаммов. Изучение ферментативной активности изолированных штаммов показало, что микроорганизмы проявили все тестируемые активности (рис. 5).

У выделенных культур микроорганизмов из биопленки с гранитной пластины большая часть штаммов обладала амилазной и лецитиназной активностью. Выделенные штаммы с мраморной пластины чаще всего обладали лецитиназной и протеазной активностью. У микроорганизмов, выделенных со

стальной пластины, большая часть штаммов обладала амилазными и липазными активностями. У микроорганизмов, выделенных с биопленки амфиболита, ферментативные активности были развиты довольно слабо (у культур проявлялась активность не более 1 фермента).

фосфатаза протеаза желатиназа липаза амилаза лецитиназа □ стальная пластина □ мрамор □ амфиболит □ гранит

Рис. 5. Ферментативная активность культивируемых микроорганизмов, изолированных из биопленок с различных пластин (по оси У - процент культур, из общего числа выделенных, обладающих той или иной ферментативной активностью).

Было проведено исследование по сравнению активностей микроорганизмов, ведущих планктонный образ жизни и прикрепленных в биопленке, образованной на стальной пластине. Определялись такие группы микроорганизмов как сапрофиты и олиготрофы, психрофилы, амилолитики, силикатрастворяющие бактерии, аммонификаторы, а также протеолитики (рис. 6).

□ аммонификаторы Псапрофиты □ олиготрофы □ психрофилы ■ амилолитики в силикатные впротеопитми

95 »

(В аммонификаторы в сапрофиты 0 олиготрофы опсикрофилы □ силикатные в протеолитики

Рис. 6. Соотношение различных групп микроорганизмов в планктоне (КОЕ/мл) и биопленке (КОЕЮ2/см2).

14

Анализ результатов показал, что в составе биопленки активно развиваются все исследованные физиологические группы микроорганизмов. Они присутствуют и в бактериопланктоне, но в очень малом количестве. Выявлено, что как в биопленочной, так и в планктонной пробе, преобладающими были сапрофитные и амилолитические микроорганизмы. В обоих случаях значительная часть выявленных микроорганизмов относилась к олиготрофам.

Определение таксономического состава изолированных бактерий до рода проводили по следующим признакам: окраска колоний и флуоресценция, морфологическое строение клетки, окраска по Граму, подвижность, определение оксидации и ферментации на среде Хью и Лейвсона, спорообразование, оксидазная, каталазная и протеолитическая (разжижение желатины) активность. Идентификацию проводили по морфологическим и физиолого-биохимическим признакам штаммов с использованием определителя Берджи (Хоулт и др., 1997).

В ходе проведенных тестов в биопленках на пластинках было идентифицировано 5 доминирующих родов микроорганизмов: Pseudomonas, Flavobacterium, Methylobacterium, Alcaligenes, Aureobacterium, а дополнительные исследования позволили выявить представителей рода Streptococcus и Bacillus.

4. Формирование биопленки в условиях лабораторного эксперимента

Биопленки выращивали на покровных микроскопических стеклах (18 мм х 18 мм), прикрепленных к предметным. Стекла во время эксперимента находились в вертикальном положении; перед анализом их промывали стерильной водой для удаления случайно осевших клеток. В качестве источника микроорганизмов для образования биопленки использовали байкальскую воду, отобранную в литоральной зоне озера. Для того чтобы выявить влияние различных факторов на формирование биопленки, были созданы различные условия культивирования: 1 вариант - байкальская вода и 0.01 % пептона и 0.01 % дрожжевого экстракта; 2 вариант - байкальская вода и 0.1 % пептона и 0.1 % дрожжевого экстракта, 3 вариант — байкальская вода без добавления питательных компонентов. В качестве отрицательного контроля использовали стерильную воду, а положительным

15

контролем служила монокультура бактерий рода Саи1оЬас1ег, которые способны формировать биопленки. Биопленки выращивали при температуре 22°С на свету.

По полученным данным установлено, что при отсутствии питательных веществ биопленка образуется достаточно долго и структура ее оказывается неплотной, внеклеточных полимерных веществ в ней мало. При добавлении небольших (олиготрофных) концентраций питательных веществ биопленка развивается более быстрыми темпами - наряду с одиночными клетками образуются микроколонии (рис. 7 А), а затем формируется зрелая биопленка с внеклеточным полимерным матриксом (рис. 7Б). При добавлении значимых концентраций питательных веществ уже на пятые сутки образуется зрелая биопленка, к 10 суткам таковая структура начинает деградировать - часть клеток попадает в жидкую среду, отделяясь от биопленки.

А Б

Рис. 7. Формирование биопленки после 10 дней культивирования (СЭМ)

Необходимо отметить, что при добавлении 0.01 % пептона и 0.01 % дрожжевого экстракта к байкальской воде формирование зрелой биопленки происходило лишь на 8-10 сутки, а в случае отсутствия дополнительных питательных веществ к исходу 10 суток формировались лишь небольшие микроколонии. В целом это исследование позволило визуализировать нативную структуру сформированной биопленки и проследить этапы ее формирования, а также деградацию. Таким образом, использование покровных стекол вполне применимо к исследованию биопленочных организмов оз. Байкал в естественных условиях обитания.

5. Определение таксономического состава биопленок литоральной зоны озера Байкал по последовательностям гена 16S рРНК

В результате амплификации и секвенирования были определены фрагменты нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК для 20 клонов. Длина полученных фрагментов составила 850 п.о. На основе девяти выделенных последовательностей было построено филогенетическое древо (рис. 8).

На филогенетическом древе видно, что анализируемые микроорганизмы распределились по восьми кластерам и объединились с бактериями, принадлежащими родам Geobacillus, Bacteroidetes, Flavobacterium, Rhodobacter, Rubrilalea; при этом все значимые узлы имеют высокие бутстрэп-поддержки. Полученные последовательности относятся к различным филогенетическим группам: Sphingobacteria, Flavobacteria, Bacilli, Verrucomicrobiae, a-Proteobacteria и ß-Proteobacteria. Следует отметить, что среди биопленочных микроорганизмов оз. Байкал присутствовали представители групп ß-Proteobacteria, Cyanobacteria, Flavobacteria, Bacilli и Verrucomicrobiae, отмеченные также в составе пикопланктона оз. Байкал. Было обнаружено, что 7 определенных последовательностей принадлежали к группе Sphingobacteria, что составило 37% от общего числа полученных последовательностей. Среди биопленочных микроорганизмов оз. Байкал молекулярными методами не были выявлены последовательности таких групп микроорганизмов как Planctomyces, Holophaga, Nitrospira, 5-Proteobacteria и Actinobacteria, обнаруженных ранее в воде.

0.05

aJ^rEmfic 2!_f- Unci, J Emricic

Li-3-4'

AI %Bactcmii

ID. M

Uncultured bacterium FJ6I2I88.I 'Emticicia ghtsengMt AB245370.1 '3-44

100

100

брЛкЛго/rf««I trnlerium AY689608.1

•2-гз

• Bacterium ebne CiQ111645Л лл 1_Г Bacterium clone EUI04080.1 w 94*Bactemuleia bacterium EF020Ö03.I ftawbaaerlun sp. AM934644.1

megrim sp. AM934674.1

Flavobacterlum sp. GQ28752S.1

Jm C.

In

99_1Fl

' PL

53

Nitrospira bacterium GQ468S08.' NUmspira sp. FJ529322.I 74ГЗ-26

inn 7}\Geobitclllm sleamthermophiha EU652090.1

Vм--KeobaciUus stearothermopMia FJ54S759.1

1Gmhacillus steamthermophiha EU381194.1 —Claxtridiaceae bacterium FN557300.1

Alphapmteabacterut bacterium CU9I6788.1 EU8M588

я

a

p Atpttapnoteabacter vRhottobittiersn. Et 1J2-7

97*-2-21

100

'Alpha prweabactermm CQ35I055.! Alpha pmleobacleritm C3Q351088.1 _r3-37

^ Alpha proteohacMrium GQ406145.I Beta pmteobactertum GQ350968.1 \Beia prvteobacterium GQ351010.1 Beta nrotcobaetmum GQ351054.1 Methylophiitts яр. GO 175365.1 •Л:оштт sp. GU056304.I Dcchlowntoms sp. GU056289.1 100 p-3-6

Betaprotnabacterium EUI80538.I Zaogbea resiniphila GQ916516.1 -liahbactcmiaaceae bacterium FJ93I099.1 2-17

XS

О >■

О

u i.

а

о.

cL

' ' Rubritcilea sp GQ421123.1. ■ Piancfomycere GQ351072.1

"Phycbphacra mihvnrn AB474364.1

-PUmaamycete GQ350177.I

- Ethiomictvbia bacletium EF454709.2

Aädobacterium sp. EU4098J2.1

Рис. 8. Филогенетическое древо, построенное методом максимального правдоподобия, для некультивируемых байкальских бактерий и их ближайших родственников из банка данных. Размер выровненных последовательностей составил 850 п.н. Приведены значения бутстрэпа больше 50%.

ВЫВОДЫ

1. Со стальной пластинки, гранита, мрамора и амфиболита было выделено 150 чистых культур микроорганизмов и изучены их физиологические активности. Идентифицированы пять доминирующих родов микроорганизмов, обитающих на стальной пластине, которая была погружена в литорапьной зоне озера Байкал на полигоне у м. Березовый: Pseudomonas, Flavobacterium, Methylobacterium, Alcaligenes и Aureobaclerium.

2. Установлено, что микроорганизмы биопленок растворяют соединения кремния, обладают протеолитической, фосфатазной и амилолитической активностью; тем самым они могут активно участвовать в деструкции органического материала, поступающего на дно озера, способствуя круговороту основных биогенных элементов в экосистеме Байкала.

3. При исследовании биообрастаний в лабораторных условиях было показано, что водные микроорганизмы литоральной зоны оз. Байкал были способны формировать биопленку, причем скорость образования биопленки и ее структура зависели от концентрации питательных веществ, добавленных в воду.

4. Определена численность основных групп микроорганизмов (бактерии, дрожжи, грибы, актиномицеты) с камней, выстилающих литоральную зону (от 0.1 до 2747 тыс, КОЕ/см2), а также посчитана общая численность бактерий на 1см2 стальной пластины (420 тыс. клеток). С помощью методов сканирующей, трансмиссионной и эпифлуоресцентной микроскопии показано большое морфологическое разнообразие микроорганизмов, обитающих в биопленках.

5. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, клонированных из природных биопленочных образцов озера Байкал, выявил широкое разнообразие микроорганизмов, входящих в состав биопленки. Среди них отмечены следующие таксономические группы: сфингобактерии (7), альфа протеобактерии (3), цианобактерии (3), веррукомикробии (2), бациллы (1), гамма протеобактерии (1), флавобактерии (1) и бета протеобактерии (1).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статья:

1, Парфенова В.В., Мальник В.В., Бойко С.М., Шевелева Н.Г., Логачева Н.Ф.,

Евстигнеева Т.Д., Сутурин А.Н., Тимошкин O.A. Сообщества гидробионтов,

развивающиеся на поверхности раздела фаз: вода - горные породы в озере Байкал //Экология. 2008. №3. С. 211-216. Главы в коллективной монографии:

2. Тимошкин O.A., Сутурин А.Н, Вада Э., Коултер Дж., Бойко С.М., Бондаренко H.A., Евстигнеева Т.Д., Зайцева Е.П., Иванов В.Г., Кравцова Л.С., Куликова H.H., Логачева Н.Ф., Мальник В.В. и др. Насколько реалистично создание универсальной концепции (схемы) слежения за состоянием экосистем? Ландшафтно-экологические исследования на озере Байкал как возможная модель // VI ч., гл 1., С 705-708. В кн.: Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна: В 2 томах. - Новосибирск: Наука, 2009. - Т. II: Водоемы и водотоки юга Восточной Сибири и Северной Монголии, кн. 1/ O.A. Тимошкин, В.И. Провиз, Т.Я. Ситникова и др. - 980 е.,[17,2л.] вкл. - (Справочники и определители по фауне и флоре озера Байкал).

3. Мальник В.В., Тимошкин O.A., Бойко С.М. Предварительные сведения о качественных и количественных характеристиках микробиофлоры, ассоциированной в развитии с подводными лишайниками и корковыми губками сем. Lubomirskiidae, населяющими геологические породы разного типа // VI ч., гл 12., С. 888-891. В кн.: Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна: В 2 томах. - Новосибирск: Наука, 2009. - Т. II: Водоемы и водотоки юга Восточной Сибири и Северной Монголии, кн. 1/ O.A. Тимошкин, В.И. Провиз, Т.Я. Ситникова и др. - 980 е.,[17,2л.] вкл. - (Справочники и определители по фауне и флоре озера Байкал)

Тезисы:

4. Timoshkin O.A., Suturin A.N., Kravtsova L.S., Kulikova N.N., Mal'nik V.V., Sitnikova T.Ya, Obolkina L.A., Sheveleva N.G., Rozhkova N.A. et. al. Biodiversity, productivity of shallow-water zoobenthos of Lake Baikal and the main factors, which determine them // Abstract Volume. 6 International Symposium on terrestrial environmental changes in East Eurasia and adjacent areas AASA board meeting, Irkutsk-Listvyanka, Russia, August 24-28, 2007. Book of abstracts. P. 74-75.

5. Mal'nik V.V., Timoshkin O.A., Gabaev I.I., Parfenova V.V., Boiko S.M., Sheveleva N.G., Logacheva N.F., Evstigneeva T.D. and Suturin A.N. The communities of hydrocoles developing on surfaces of granite, marble and amphibolite in shallow zone of the Lake Baikal // Abstract Volume. 6 International Symposium on terrestrial environmental changes in East Eurasia and adjacent areas AASA board meeting, Irkutsk-Listvyanka, Russia, August 24-28, 2007. Book of abstracts. P. 49.

6. Мальник B.B., Габаев И.И., Парфенова B.B. Разнообразие микроорганизмов, входящих в состав биопленок оз. Байкал на основе данных молекулярного анализа // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ. Материалы 2-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием. Иркутск, 10-15 сентября, 2007. Тезисы. С. 152-153.

7. Мальник В.В. Микробные сообщества, обитающие на границе раздела фаз вода - твердое тело // Биоразнообразие Экосистем Внутренней Азии. Тезисы Всероссийской конференции с международным участием. Улан-Удэ, 5-10 сентября, 2006. Тезисы. С. 60.

8. Мальник В.В. Микроорганизмы, заселяющие субстраты из горных пород на границе вода - донные осадки оз. Байкал // Научное Творчество Молодежи. Материалы X Всероссийской научно-практической конференции. Издательство Томского университета, 21-22 апреля, 2006. Тезисы. С. 53.

9. Парфенова В.В., Павлова О.Н., Белькова H.JI., Теркина И.А., Суслова М.Ю., Мальник В.В. Биоразнообразие и функциональная активность микробного сообщества оз. Байкал // IX Съезд Гидробиологического общества РАН. Тезисы докладов. Тольятти, 18-22 сентября, 2006. Тезисы. Т. 2. С. 83.

10. Мальник В.В., Парфенова В.В. Агрегированные сообщества микроорганизмов в водной толще озера Байкал // Четвертая Верещагинская Байкальская Конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений. Иркутск, 26 сентября - 1 октября, 2005. Тезисы. С. 120-121.

11. Тимошкин O.A., Сутурин А.Н., Кравцова Л.С., Куликова H.H., Мальник В.В., Парфенова В.В. и др. Краткие результаты междисциплинарных исследований, проведенных на полигоне Березовый (Южный Байкал) за период 2000 - 2007 гг. с

21

акцентом на разнообразие, продуктивность бентоса мелководной зоны озера и основные факторы их определяющие // Развитие жизни в процессе абиотических изменений на Земле. Доклады Научно-Практической Конференции. П. Листвянка Иркутской области, 18-20 марта, 2008. Новосибирск. Издательство СО РАН. С. 344-357.

Подписано к печати 19.03.2010 г. Формат 60*84/16. Объем 1.4 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 473. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мальник, Валерий Васильевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Общая характеристика биопленок.

1.2. Распространение биопленок в природе и в живых организмах.

1.3. Структура и функционирование биопленок.

1.4. Стадии биопленочного развития.

1.5. Роль поверхностно-прикрепленных бактерий в выветривании горных пород.

1.6. Методы изучения прикрепленных прокариотов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. Объект, материалы и методы исследования.

2.1. Объект и место исследования.

2.2. Отбор природных образцов для исследования.

2.3. Методы культивирования организмов и состав используемых сред.

2.4. Сканирующая электронная микроскопия.

2.5. Трансмиссионная электронная микроскопия.

2.6. Эпифлуоресцентная микроскопия.

2.7. Методы молекулярной биологии.

2.8. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. Морфологическое и таксономическое разнообразие, физиологические активности и количественные характеристики исследуемых микроорганизмов.

3.1. Микробиологическая характеристика биопленок с природного каменного субстрата.

3.2. Сравнительная характеристика микробного сообщества биопленок, сформированных на стальной пластине и пластинах различного минералогического состава.

3.3. Физиолого-биохимическая активность и таксономический состав культивируемых микроорганизмов, выделенных из биопленок.

ГЛАВА 4. Формирование биопленки в условиях лабораторного эксперимента.

ГЛАВА 5. Определение таксономического состава биопленок литоральной зоны озера Байкал методами молекулярной биологии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробное сообщество биопленок на поверхности раздела фаз "вода-твердое тело" литоральной зоны оз. Байкал"

В озере Байкал при участии микроорганизмов постоянно идут процессы деструкции органического вещества автохтонного и аллохтонного происхождения. В результате непрерывно поддерживаются процессы биопродукции и интенсивного самоочищения водоема. Участие в них любой физиологической группы микроорганизмов и каждой бактерии неотделимо друг от друга и протекает в комплексе. Для того чтобы лучше понять структуру и функционирование микробного сообщества озера Байкал, необходимо исследовать роль как отдельно взятых его представителей, так и агрегированных комплексов микроорганизмов. В аспекте этой проблемы представляет большой интерес изучение биопленок, которые широко распространены в природе. В их состав могут входить грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Известно, что большая часть микроорганизмов образует биопленки, и более чем 99% всех микроорганизмов на Земле живут в таких агрегатах (Costerton et al.,1987).

Биопленки могут возникать на твердо-жидкой, твердо-воздушной и жидко-воздушной поверхностях раздела фаз. Особенность, которую они все имеют, заключается в том, что организмы внедряются в матрикс микробного происхождения, состоящий из внеклеточных полимерных веществ (ВПВ). ВПВ содержат, главным образом, полисахариды и белки, которые формируют гидрогелевые матриксы (Wingender et al., 1999). Ископаемые биопленки являются первыми записями жизни на Земле, датирующимися 3,5 млрд. лет назад (Schopf et al., 1983) и представлены самой отдаленной наиболее успешной формой жизни при заселении почвы, осадков, минеральных и растительных поверхностей в природе, включая экстремальные местообитания, такие как системы пор в ледниках, горячие источники, электроды и даже области, сильно облученные установками ядерной энергии (Satpathy, 1999).

Жизнь, внедренная в матрикс внеклеточных полимерных веществ, привносит важные преимущества для биопленочных организмов. Они могут поддерживать стабильные размещения действующих совместно микроконсорций различных видов и, таким образом, регулировать деградацию сложных субстратов (Wimpenny, 2000). Матрикс может отделять питательные вещества от окружающей среды и являться частью общей микробной стратегии для выживания в олиготрофных условиях (Decho, 1990, 2000).

Однако биопленки могут возникать в неподходящее время и в месте, в котором бы нам не хотелось, чтобы они появились. Таким образом, они могут вызывать биообрастание. В таких случаях два аспекта биопленок приобретают особенную важность: 1) механическая стабильность матрикса, потому что ее приходится преодолевать при процессе очистки и 2) повышенная устойчивость биопленочных микроорганизмов к биоцидам, которая может быть на 2 или 3 порядка выше, чем таковая взвешенных клеток (Flemming, 2002).

Наше восприятие бактерий как одноклеточных форм жизни глубоко укореняется в парадигму чистой культуры. Так как бактерии могут, в строгом смысле, разбавляться до одиночной клетки и изучаться в жидкой культуре, этот способ действия был разработан и использован в изучении многих бактериальных активностей. Хотя этот традиционный путь культивирования бактерий в жидкой среде способствовал изучению микробного патогенеза и осведомлению относительно некоторых из удивительных граней микробной физиологии, чисто культурный планктонный рост встречается редко, когда бактерии существуют в природе. Например, микробиологи, изучающие окружающую среду, долго признавали, что сложные бактериальные сообщества являются ответственными за движущий биогеохимический цикл, который сохраняет биосферу (Makin, 1996). До недавнего времени недостаток методов для изучения этих сообществ in situ затруднял подробные анализы. К счастью, последние успехи в микроскопии и молекулярных технологиях сделали возможным исследовать такие сообщества in situ очень подробно и без склонности к жидкой культуре. Непосредственным наблюдением широкого множества естественных местообитаний установлено, что большинство микробов продолжают существовать прикрепленными к поверхностям в пределах структурированной биопленочной экосистемы, а не как свободно-плавающие организмы (Costerton, 1995). Кроме того, становится ясным, что эти природные скопления бактерий внутри биопленочного матрикса функционируют как согласованно действующий консорциум до некоторой степени относительно сложным и упорядоченным способом (Caldwell, 1995; Costerton, 1995). Следовательно, хотя микроорганизмы могут иметь независимое планктонное существование, взаимозависимый жизненный стиль, в котором они функционируют как неотъемлемая часть популяции или сообщества, также является возможным и является, по сути, более типичным.

Что же из себя представляет бактериальное сообщество? С экологической перспективы популяции бактерий возникают от индивидуальных клеток, а метаболически сходные популяции (сульфат- и сероредуцирующие бактерии) составляют группировки, которые называются гильдии. Наборы гильдий (ферментативные, сульфат- и сероредуцирующие, метаногенные бактерии), проводящие межклеточные физиологические процессы, образуют микробные сообщества. По существу, биопленки представляют взаимозависимую сообщество-основанную жизнь. Биопленки могут создаваться из популяции, которая развилась из одиночного вида, или из сообщества, произошедшего от многочисленных микробных видов, и они могут образовываться на огромном множестве неживых и живых поверхностей. В данной работе биопленки широко определяются как скопления микроорганизмов и их связанных внеклеточных продуктов на поверхности раздела фаз и типично прикрепленных к неживой или живой поверхности (Davey, 2000).

Характеристика микробных сообществ долгое время была основана на получении чистых культур с последующим анализом морфологических, физиологических и биохимических особенностей организмов. Это связано с тем, что малые размеры и крайне ограниченный набор морфологических признаков затрудняет идентификацию микроорганизмов в природных образцах. К тому же для многих экосистем показано, что культивируется лишь малая доля всех микроорганизмов. Очевидно, что представление о составе микробных сообществ, основанное только на изучении культур, может быть далеко неполным. Кроме того, систематика микроорганизмов, построенная на морфологических и физиологических критериях, не всегда отражает эволюционное родство. Использование молекулярно-филогенетических методов вызвало настоящую революцию в микробиологии: сравнительный анализ последовательностей информационных макромолекул, и в первую очередь информационных РНК и их генов, позволил создать естественную систематику микроорганизмов. Развитие экспериментальных методов молекулярной биологии и молекулярной филогении сделало возможным изучение микроорганизмов в их природных нишах, причем предметом исследования в этом случае становятся молекулы, выделенные из природных образцов, а не сами организмы. Таким образом, молекулярный подход открыл новый этап в изучении экологии микроорганизмов, позволяя наиболее точно определять состав микробных сообществ. В последнее время сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей нашел широкое применение для изучения микроорганизмов в самых разных экосистемах, в том числе и в биопленочных сообществах.

Изучением различного рода биопленок занимаются многие иностранные и российские ученые. Это Davey М.Е., O'Toole G., Stoodley P., Davies D.G., Costerton J.W., Kierek-Pearson K., Jefferson К. K., Riccard A. H., Flemming H.-C., Melo L.F., Marshall K.C., Романова Ю.М., Могильная О. А. и другие (Davey, 2000; Kierek-Pearson, 2005; Jefferson, 2004; Marshall, 1992; Stoodley et al., 2002; Flemming, 2002; Melo, 1997; Costerton, 1995; O'Toole, 2000; Davies, 1993; Rickard et al., 2003; Романова, 2006; Могильная, 2007).

Цель данной диссертационной работы - изучить количественный состав, морфологическое и таксономическое разнообразие микроорганизмов из сообщества биопленок литоральной зоны озера Байкал.

Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Исследовать количественный состав микроорганизмов, выделенных с биопленок каменных субстратов в мелководной литоральной зоне оз. Байкал.

2. Изучить морфологическое разнообразие микроорганизмов биопленочных образований на пластинках различного типа методами эпифлуоресцентной световой, а также сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.

3. Выделить микроорганизмы из биопленок на стальной пластине, граните, мраморе и амфиболите методами классической микробиологии и сформировать коллекцию чистых культур, а также исследовать способность заселения микроорганизмами искусственных субстратов.

4. Определить ферментативную активность, физиолого-биохимические свойства, таксономический статус до рода культивируемых микроорганизмов биопленок.

5. Провести исследование таксономического разнообразия некультивируемого микробного сообщества биопленок с использованием методов молекулярной биологии на основе филогенетического анализа.

Положения защиты диссертации:

1. В литоральной зоне оз. Байкал на поверхности раздела фаз «вода - твердое тело» формируются специализированные микробные сообщества, входящие в состав биопленки.

2. Наличие разнообразных физиологических групп микроорганизмов, функционирующих в тесной связи друг с другом в биопленочных сообществах и обладающих широким спектром ферментативной активности, позволяет предполагать, что процессы деструкции органического вещества эффективно осуществляются биопленочными организмами. 3. В биопленочных сообществах литоральной зоны озера Байкал обитают представители различных филогенетических групп, большая часть которых представлена некультивируемыми формами.

Научная новизна работы

Впервые в озере Байкал было исследовано биопленочное сообщество микроорганизмов, развивающееся на поверхности раздела фаз «вода — твердое тело». Установлена избирательность заселения микроорганизмами различных субстратов, сделано предположение о возможной роли микроорганизмов в разрушении пород, типичных для литорали озера. Было показано, что микроорганизмы биопленок обладают достаточно высокой ферментативной активностью. Проведен количественный учет различных групп биопленочных бактерий в литоральной зоне оз. Байкал в районе пос. Большие Коты. Впервые для изучения биопленок озера Байкал использован молекулярно-биологический подход. Сравнительный анализ генов рРНК позволил выявить в составе биопленок различные таксономические группы микроорганизмов. Получены данные по гену 16S рРНК и гроС для микроорганизмов, входящих в состав биопленочных сообществ литоральной зоны оз. Байкал.

Практическая значимость работы

Расширение сведений о составе биопленочных сообществ имеет большое практическое значение для обнаружения и выделения микроорганизмов, обладающих различными ферментативными активностями, а также для использования сформированной коллекции в биотехнологии. Полученные генетические данные, характеризующие разнообразие биопленочных сообществ оз. Байкал, позволяют сравнивать их с результатами исследования биопленок других пресноводных и соленых водоемов. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК культивируемых и некультивируемых бактерий, 10 из них зарегистрированы в международном EMBL-банке данных и им присвоены соответствующие номера. Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности могут служить основой в конструировании зондов для гибридизации.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований представлены и обсуждены на следующих научных форумах: IV Верещагинской Байкальской Конференции, Иркутск, 2005; Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие Экосистем Внутренней Азии», Улан-Удэ, 2006; X Всероссийской научно-практической конференции «Научное Творчество Молодежи», Анжеро-Судженск, 2006; IX Съезде Гидробиологического общества РАН, Тольятти, 2006; VI международном симпозиуме «Terrestrial Environmental Changes In East Eurasia and Adjacent Areas», Иркутск-Листвянка, 2007; II Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ», Иркутск, 2007.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе одна статья, рекомендованная ВАК, и две главы в коллективной монографии.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Мальник, Валерий Васильевич

выводы

1. Со стальной пластинки, гранита, мрамора и амфиболита было выделено 150 чистых культур микроорганизмов и изучены их физиологические активности. Идентифицированы пять доминирующих родов микроорганизмов, обитающих на стальной пластине, которая была погружена в литоральной зоне озера Байкал на полигоне у м. Березовый: Pseudomonas, Flavobacterium, Methylobacterium, Alcaligenes и Aureobacterium.

2. Установлено, что микроорганизмы биопленок растворяют соединения кремния, обладают протеолитической, фосфатазной и амилолитической активностью; тем самым они могут активно участвовать в деструкции органического материала, поступающего на дно озера, способствуя круговороту основных биогенных элементов в экосистеме Байкала.

3. При исследовании биообрастаний в лабораторных условиях было показано, что микроорганизмы литоральной зоны оз. Байкал были способны формировать биопленку, причем скорость образования биопленки и ее структура зависели от концентрации питательных веществ, добавленных в воду.

4. Определена численность основных групп микроорганизмов (бактерии, дрожжи, грибы, актиномицеты) с камней, выстилающих литоральную зону (от 0.1 до 2747 тыс. КОЕ/см2), а также посчитана общая численность бактерий на 1см стальной пластины (420 тыс. клеток). С помощью методов сканирующей, трансмиссионной и эпифлуоресцентной микроскопии показано большое морфологическое разнообразие микроорганизмов, обитающих в биопленках.

5. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, клонированных из природных биопленочных образцов озера Байкал, выявил широкое разнообразие микроорганизмов, входящих в состав биопленки. Среди них отмечены следующие таксономические группы: сфингобактерии (7), альфа протеобактерии (3), цианобактерии (3), веррукомикробии (2), бациллы (1), гамма протеобактерии флавобактерии (1) и бета протеобактерии (1).

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает благодарность и искреннюю признательность за постоянную помощь и поддержку при выполнении работы научному руководителю — доценту, зав. лабораторией водной микробиологии к.б.н. Парфеновой В.В., зав. лабораторией биологии водных беспозвоночных д.б.н. Тимошкину О.А., зав. лабораторией биогеохимии к.г-м.н. Сутурину А.Н., к.г-м.н. Бойко С.М., к.б.н. Ковадло А.С., к.б.н. Перетолчиной Т.Е., к.б.н. Кулаковой Н.В., д.б.н. Мизандронцеву И.Б., д.б.н. Беликову С.И., Старостину В.Ф., Егорову В.И. и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии Лимнологического института.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы проводили комплексное исследование биопленок литоральной зоны озера Байкал, начиная от выделения биопленочных микроорганизмов методами классической микробиологии и определения их до рода и кончая использованием методов молекулярной биологии и филогении.

В начале работы исследовали каменный материал, которым выстлана литоральная зона оз. Байкал. Затем было проведено исследование с контрастными горными породами, также свойственными литорали озера Байкал, и с пластинкой из нержавеющей стали.

Итак, анализ культивируемого микробного сообщества биопленок на каменном природном субстрате показал, что это сообщество состоит из большого разнообразия групп бактерий, численность каждой из них составляет тысячи и сотни тысяч КОЕ/см площади камня. Распределение различных групп микроорганизмов на каменном субстрате неравномерно и скорее всего зависит от минералогического состава поднятого каменного субстрата, от количества осевшего органического материала и от влияния гидрологических условий в мелководной зоне.

В результате дальнейшей работы было выяснено, что на поверхности горных пород формируются сообщества, способные ускорять процесс выветривания, о котором сказано выше. В мелководной зоне озера Байкал происходит сложное взаимодействие каменных субстратов и байкальской воды при активном участии бентосных гидробионтов. Разрушение горных пород - процесс в большей степени химический. Он совершается под воздействием байкальской воды и растворенных в ней газов, но его интенсивность определяется не только физико-химическими параметрами водной среды (Т, рН, Eh), но и химическим составом и структурой разрушаемых минералов, а также результатами активной жизнедеятельности бентосных гидробионтов (включая микробные сообщества).

В результате данной исследовательской работы были выделены колонии доминирующих микроорганизмов с использованием различных по составу питательных сред. С мрамора мы выделили 50 различных штаммов, с гранита — 30, а с амфиболита всего лишь 9. Годом позднее были выделены 58 культур микроорганизмов со стальной пластинки. При исследовании ферментативных активностей было выяснено, что на граните у большей части выделенных культур микроорганизмов проявлялась амилазная и лецитиназная активность, на мраморе у выделенных штаммов чаще всего проявлялась лецитиназная и желатиназная активность. У микробов, выделенных с амфиболита, ферментативные активности были развиты довольно слабо. У микроорганизмов, выделенных со стальной пластины, большая часть штаммов обладала амилазными и липазными активностями. Что касается горных пород, то в целом исследуемое биологическое сообщество предпочитало заселять мрамор и гранит, нежели амфиболит. Мы предполагаем, что причиной этого является как структура горных пород, так и их химический состав. Макро- и микроэлементы амфиболитов, по-видимому, менее доступны для гидробионтов из-за массивности и слабой пористости пород. Гранит и мрамор по структуре более пористые, что облегчает бактериальную адсорбцию. Это подтверждается тем, что более крупные по размерам палочки и кокки достаточно хорошо развивались на данных субстратах. Наращивая свою биомассу, бактерии создают условия для развития других групп организмов.

Мы также выявляли физиологический потенциал микроорганизмов биопленки, образованной на стальной пластине, установленной у пирса в поселке Б. Коты. По предыдущим наблюдениям выяснилось, что байкальская биопленка имеет сложновидовой состав микроорганизмов, водорослей, простейших (Парфенова и др., 2008). Поэтому было сделано предположение, что в биопленку должны входить представители различных физиологических групп микроорганизмов, которые бы осуществляли трансформацию различных соединений углерода, азота и фосфора. При анализе полученных данных оказалось, что в биопленочной пробе присутствовало достаточно большое количество микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью, а также были выявлены силикатрастворяющие бактерии. Было обнаружено, что как на каменном субстрате, так и на стальной пластине амилолитические бактерии заметно доминировали над другими группами бактерий. Процесс денитрификации наблюдался как у тех, так и у других микроорганизмов. Мы обнаружили, что микроорганизмы биопленки способны также проводить обе стадии процесса нитрификации более активно, нежели планктонные. Было выявлено, что микроорганизмы биопленок трансформировали нерастворимые неорганические соединения фосфора, а также отсоединяли фосфатную группу от органических молекул. Также были подтверждены целлюлазные активности микроорганизмов, выделенных из биопленки в опыте на среде Гетчинсона. Анализ результатов показал, что в составе биопленки активно развиваются все исследованные физиологические группы микроорганизмов. Они присутствуют и в бактериопланктоне, но в очень малом количестве. Выявлено, что как в биопленочной, так и в планктонной пробе, преобладающими были сапрофитные и амилолитические микроорганизмы. В обоих случаях значительная часть выявленных микроорганизмов относилась к олиготрофам.

В работе был поставлен эксперимент по обрастанию покровных стекол микроорганизмами из воды литоральной части оз. Байкал в лабораторных условиях. Именно по этому эксперименту мы можем судить о количестве микроорганизмов в локальном месте Байкала, следовательно, и о возможности поступления органических веществ в то или иное место акватории оз. Байкал, в том числе и загрязнителей. По имеющимся данным можно сказать, что при отсутствии питательных веществ биопленка образуется достаточно долго, и структура ее оказывается не плотной, внеклеточных полимерных веществ в ней мало. При добавлении небольших (олиготрофных) концентраций питательных веществ биопленка развивается более быстрыми темпами - наряду с одиночными клетками образуются микроколонии (на 5 сутки), а затем формируется зрелая биопленка с внеклеточным полимерным матриксом. При добавлении богатых концентраций питательных веществ уже на пятые сутки образуется зрелая биопленка, к 10 суткам таковая структура начинает деградировать - часть клеток попадает в жидкую среду, отделяясь от биопленки.

Благодаря данным сканирующей, трансмиссионной и эпифлуоресцентной микроскопии мы выявили, что биопленка представлена разнообразными морфологическими формами от кокковидных клеток до извитых спирохет. С помощью трансмиссионной микроскопии удалось показать, что значительная часть клеток, входящая в состав биопленки, имеет жгутики.

Также проводили количественный учет КОЕ микроорганизмов на разных средах при исследовании гранитных пластин, камня, поверхностных и глубинных проб воды в точках, где были погружены эти пластины.

Кроме того, впервые для озера Байкал были представлены данные по численности микроорганизмов в биопленке со стальной пластины. Подсчет показал, что численность микроорганизмов составила 420 тыс. кл. на 1 см2.

В молекулярной части исследований пользовались методами амплификации, трансформации и клонирования. Было опробовано два метода для выделения суммарной ДНК из образцов биопленок, оба из которых оказались действенными. Но надо заметить, что амплификация с ДНК, выделенной модифицированным СТАВ- методом, позволила получить большее количество ПЦР-продукта в сравнении с использованием ДНК, экстрагированной фенол-хлороформом.

Также в своей работе мы проводили подбор праймеров для гена гроС, анализируя структуры этого гена у разных групп микроорганизмов (Flavobacteria, Cyanobacteria, Sphingobacteria и.т.д.). Амплификация и клонирование фрагмента гена гроС из суммарной ДНК не вызывали особых проблем. По-видимому, используемые для амплификации фрагмента гроСгена праймеры достаточно универсальны, так как с их помощью нам удалось получить достаточно широкий набор различающихся структур. При сравнении полученных гроС последовательностей с гомологичными структурами из банка данных степень сходства последовательностей не превышала 90%. Это не позволило нам определить родовую принадлежность исследованных клонов. Следовательно, хотя разрешающая способность последовательностей гена гроС выше по сравнению с геном 16S рРНК, использование гена гроС как маркера для изучения структуры биопленочного сообщества оз. Байкал в настоящее время затруднено отсутствием данных по гену гроС для близкородственных микроорганизмов. В дальнейшем эта задача может быть решена при определении последовательностей гроС-гена у чистых культур байкальских микроорганизмов, а также при расширении банка данных по последовательностям этого гена, чему в данное время способствуют темпы по осваиванию полногеномного секвенирования у микроорганизмов.

Полученные при секвенировании последовательности для двух разных генов мы сравнивали с аналогичными последовательностями, присутствующими в базах данных. Для того чтобы определить филогенетическое положение выделенных из биопленки микроорганизмов, было построено филогенетическое дерево по гену 16S рРНК. Использованные для построения этого дерева последовательности относились к 6 различным филогенетическим группам: Sphingobacteria, Flavobacteria, Bacilli, Verrucomicrobiae, a-Proteobacteria и (3-Proteobacteria. Эти микроорганизмы разделились на филогенетическом дереве по восьми кластерам. Важно отметить, что среди биопленочных микроорганизмов оз. Байкал присутствовали представители групп P-Proteobacteria, Cyanobacteria, Flavobacteria, Bacilli и Verrucomicrobiae, выявленные также в составе пикопланктона оз. Байкал. Кроме того, обнаружено, что 7 из 19 секвенированных последовательностей (37%) принадлежали к группе Sphingobacteria.

Известно, что доля культивируемых гетеротрофных бактерий в озере Байкал составляет всего 0.01 - 0.2% (Лаптева, 1990). Поэтому чтобы оценить широту разнообразия микроорганизмов в биопленках в дальнейшей работе считаем целесообразным использовать методы молекулярно-генетического и филогенетического анализа, которые составляют, как представляется, более предпочтительный подход в исследованиях, аналогичных нашему, по сравнению с методами классической микробиологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мальник, Валерий Васильевич, Улан-Удэ

1. Агафонов Б.П. Разрастающийся Байкал // ДАН. 2002. - т. 382(4). - С. 540 - 542.

2. Белькова Н.Л., Парфенова В.В., Суслова М.Ю., Ан Т.С., Тазаки К. Биоразнообразие и активность микробного сообщества горячего источника Котельниковский (оз. Байкал) // Известия РАН (серия биологическая) 2005. -т. 32(6).-С. 664-671.

3. Белькова Н.Л., Денисова Л.Я., Манакова Е.Н., Зайчиков Е.Ф., Грачев М.А. Видовое разнообразие глубоководных микроорганизмов озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК // Докл. РАН 1996. -т.348(5). — С. 692-695.

4. Белякова Р.Н. Синезеленые водоросли в обрастаниях естественных субстратов залива Восток Японского моря, 1975. Обрастания в Японском и Охотском морях. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 92-107с.

5. Вернадский В.И. Химическое строение Биосферы Земли и ее окружения, 2001. М.: Наука, 376 с.

6. Вотинцев К. К. Гидрохимия озера Байкал. М., 1961. - 310 с.

7. Вотинцев К. К., Мещерякова А. И., Поповская Г. И. Круговорот органического вещества в озере Байкал. Н.: Наука, 1975. - 190 с.

8. Галазий Г. И. Байкал в вопросах и ответах. И.: Вост.-Сиб. кн. изд-во, 1987.-384 с.

9. Горбенко А.Ю., Дзюбан А.Н. О возможности количественного учета олигокарбофильного (олиготрофного) бактериопланктона на богатой питательной среде //Микробиология 1992. - т. 61(3). - С. 531-532.

10. Грачев М.А., Кузнецова С.Ю., Щербакова Т.А. Метод выделения высокоочищенной ДНК для использования в полимеразной цепной реакции // Молекулярная биология 2006. - т. 40(1). - С. 180-183.

11. Добровольский Г.Д. Структурно-функциональная роль почв и почвенной биоты в биосфере. М.: Наука, 2003.

12. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии: учебное пособие. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1976. 307с.

13. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1983. 215с.

14. Калугина-Гутник А.А. Фитобентос Черного моря, 1975. — К.: Наукова Думка. 248 с.

15. Кожов М. М. Биология озера Байкал. М.: АН СССР, 1962. - 316 с.

16. Кожов М. М. Очерки по байкаловедению. И.: Вост.-Сиб. кн. изд-во, 1972. - 254 с.

17. Короновский Н.В., Якушова А.Ф. Основы геологии, 1991.М.: Высшая школа. 414 с.

18. Кузнецов С.И., Иванов М.В., Ляликова Н.Н. Введение в геологическую микробиологию, 1962. Изд-во Академии Наук СССР. М. 239 с.

19. Кузнецов С.И., Романенко В.И. Микробиологическое изучение внутренних водоемов, 1963. Изд-во Академии Наук СССР. Ленинград. 130 с.

20. Лаптева Н. А. Видовая характеристика гетеротрофных бактерий в озере Байкал // Микробиология 1990. - т. 59. - С. 499-506.

21. Мильчакова Н.А., Неврова Е.Л., Евстигнеева И.К. Фитоперифитон бетонного субстрата в Черном море (Украина), 2002. Альгология. 12: 96-110 с.

22. Миронов А. А., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине, 1994. Санкт-Петербург: «Наука». 400с.

23. Могильная О.А., Попова Л.Ю. Электронно-микроскопическое исследование биопленок бинарного бактериального сообщества // Микробиология 2007.-Т. 76(2). - С. 279-281.

24. Родина А.Г. Методы водной микробиологии. Практическое руководство. Изд-во «Наука», Москва-Ленинград, 1965, 363с.

25. Романенко В.И., Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов. Лабораторное руководство. Изд-во «Наука», Ленинград, 1974, 194с.

26. Романова Ю.М., Смирнова Т.А., Андреев А.Л., Ильина Т.С., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Образование биопленок пример «социального» поведения бактерий // Микробиология - 2006. - т.75(4). - С. 556-561.

27. Семенова Е.А., Кузнеделов К.Д. Изучение видового разнообразия пикопланктона озера Байкал путем сравнительного анализа 5'-концевых участков генов 16S рРНК // Молекуляр. биология 1998. - т. 32(6). - С. 895901.

28. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. и др. Определитель бактерий Берджи, 1997. В 2-х т. М.: Мир. 800 с.

29. Яхонтова Л.К., Зверева В.П. Основы минералогии гипергенеза, 2000. Учеб. пособие. Владивосток: Дальнаука. 331 с.

30. Allison D. G., Ruiz В., SanJose С., Jaspe A. and Gilbert P. Extracellular products as mediators of the formation and detachment of Pseudomonas fluorescens biofilms // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 167. - P. 179-184.

31. Archibald L. K. and Gaynes R. P. Hospital acquired infections in the Unated States: the importance of interhospital comparisons // Nosocomial Infect. -1997.-V. 11.-P. 245-255.

32. Bahr M., Hobbie J. E., Sogin M. L. Bacterial diversity in an arctic lake: a freshwater SARI 1 cluster // Aquat. Microb. Ecol. 1996. - V. 11. - P. 271-277.

33. Bazylinski D. A. Structure and function of the bacterial magnetosome // ASM News -1995.-V. 61. P. 337-343.

34. Belykh О. I., Sorokovikova E. G. Autotrophic picoplankton in Lake Baikal: abundance, dynamics, and distribution //

35. Aquatic Ecosystems Health & Management 2003. - V. 3. - P. 251-261.

36. Bevan R.B., Lang B.F., and Bryant D. Calculating the Evolutionary Rates of Different Genes: A Fast, Accurate Estimator with Applications to Maximum Likelihood Phylogenetic Analysis // Systematic Biology 2005. - V. 54(6). - P. 900-915.

37. Bott T. L. and Brock T.D. Growth and metabolism of periphytic bacteria: Metodology // Limnol. Oceanogr. 1970. - V. 15. - P. 333-342.

38. Bowden G. H. W. and Li Y. H. Nutritional influences on biofilm development // Adv. Dent. Res.-1997. V. 11. - P. 81-99.

39. Boyd A. and Chakrabarty A. M. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysacharide // J. Ind. Microbial. 1995. - V. 15. - P. 162-168.

40. Boyd A. and Chakabarty A. M. Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa II Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 23552359.

41. Bright J. J., and Fletcher M. Amino acid assimilation and electron transport system activity in attached and free-living marine bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1983. -V. 45. - P. 818-825.

42. Brock T. D. Microbial growth rates in nature // Bacteriol. Rev. 1971. - V. 35.-P. 39-58.

43. Brooks W., Demuth D. R., Gil S. and Lamont R.J. Identification of a Streptococcus gordonii SspB domain that mediates adhesion to Porphyromonas gingivalis // Infect. Immun. 1997. - V. 65. - P. 3753-3758.

44. Caldwell D. E. and Germida J.J. Evaluation of difference imagery for visualizing and quantitating microbial growth // Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31.-P. 35-44.

45. Caldwell D. E. Cultivation and study of biofilm communities. In Lappin Scott H. M and Costerton J. W (ed.), Microbial biofilms // University Press, Cambridge, U.K.-1995.-P. 64-79.

46. Caldwell D. E., Atuku E., Wilkie D. C., Wivcharuk K. P., Karthiken S., Korber D. R., Schmid D. F., Wolfaardt G. M. Germ theory vs. community theory in understanding and controlling the proliferation of biofilms // Adv. Dent. Res.1997.-V. 11.-P. 4-13.

47. Characklis W.G. Biofilm development and destruction // Electric Power Research Institute, U.S. Report 902-1 (September 1980), 1980.

48. Characklis W.G. Microbial fouling. In: Characklis W.G., Marshall K.C. (eds) Biofilms. Wiley, New York, 1990. P. 523-584.

49. Cochran W. L., Suh S. J., McFeters G. A. and Stewart P.S. Role of RpoS and Alg T in Pseudomonas aeruginosa biofilm resistance to hydrogen peroxide and monochloramine // J. Appl. Microbiol. 2000. - V. 88. - P. 546-553.

50. Collins F. S. Cystic fibrosis: molecular biology and therapeutic implications // Science 1992. - V. 256. - P. 774-779.

51. Cook G. S., Costerton J. W. and Lamont R. J. Biofilm formation by Porphyromonas gingivalis and Streptococcus gordonii II J. Periodont. Res. —1998.-V. 33.-P. 323-327.

52. Costerton J.W., Cheng K.J., Geesey G.G., Ladd T.I., Nickel J.G., Dasgupta M, and Marrie T.J. Bacterial biofilms in nature and disease // Annu. Rev. Microbiol. 1987. - V. 41. - P. 435 - 464.

53. Costerton J. W. Overview of microbial biofilms // J. Ind. Microbiol. 1995. -V. 15.-P. 137-140.

54. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R. and Lappin-Scott H. M. Microbial biofilms // Annu. Rev. Microbial. 1995. - V. 49. - P. 711745.

55. Costerton J. W., Stewart P. S. and Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistant infections // Science. 1999. - V. 284. - P. 318-322.

56. Danese P. N., Pratt L. A., Dove S. and Kolter R. The outermembrane protein, Ag43, mediates cell-to-cell interactions in E. coli biofilms // Mol. Microbiol. — 2000.-V. 37.-P. 424-432.

57. Danese P. N., Pratt L. A. and Kolter R. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture // J. Bacteriol. -2000. — V. 182.-P. 3593-3596.

58. Davey M. E. and O'Toole G. A. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics // Microbiology and Molecular Biology Reviews 2000, V. 64(4).-P. 847-867.

59. Davies D. G. and Geesey G. G. Regulation of the alginate biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 860-867.

60. Davies D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski В. H., Costerton J. W. and Greenberg E. P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. 1998. - V. 280. - P. 295-298.

61. De Beer D. and Stoodley P. Relation between the structure of an aerobic biofilm and mass transport phenomena // Water Sci. Technol. 1995. - V. 32. - P. 11-18.

62. De Beer D., Stoodley P. and Lewandowski. Effects of biofilm structures on oxygen distributioin and mass transport // Biotechnol. Bioeng. — 1994. V. 43.— P. 1131-1138.

63. De Beer D. and Stoodley P. Microbial biofilms // Applied microbiology. -2006.-V. l.-P. 1-50.

64. De Boer W., Klein Gunnewick R. J. A., Veenhuis M., Bock E. and Laanbroeck H. J. Nitrification at low pH by aggregated chemolithotrophic bacteria //Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - P. 3600-3604.

65. Delong E. F., Wickham G. S., Pace N. R. Phylogenetic strains: Ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells // Science. 1989. - V. 243.-P. 1360-1363.

66. Dewanti R. and Wong A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli 0157:H7 // Int. J. Food Microbiol. 1995. - V. 26. -P. 147-164.

67. Dingman J. R., Rayner M. G., Mishra S., Zhang Y., Ehrlich M. D., Post J. C. and Ehrlich G. D. Correlation between presence of viable bacteria and presence of endotoxin in middle-ear effusions // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 34173419.

68. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - V. 15. - P. 167-193.

69. Doyle R. J. (ed.) Methods in enzymology // Academic Press, New York, N.Y. 1999.

70. Duxbuiy T. A microperfusion chamber for studying the growth of bacterial cells // J. Appl. Bacteriol. 1977. - V. 42. - P. 247-251.

71. Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H. and Stackebrandt E. Microbial biofilms // Springer-Verlag 2006. - V. 1.

72. Edwards K. J., Bond P. L., Gihring Т. M. and Banfield J. An archaeal iron-oxidizing extreme acidophile important in acid mine drainage // Science 2000. -V. 287.-P. 1796-1799.

73. Elder M. J., Stapleton F., Evans E. and Dart J. K. G. Biofilm-related infections in ophthalmology // Eye 1995. - V. 9. - P. 102-109.

74. Entcheva-Dimitrov P., Spormann A.M. Dynamics and Control of Biofilms of the Oligotrophic Bacterium Caulobacter crescentus // Journal of Bacteriology -2004. -V. 186(24). P. 8254-8266.

75. Ehrlich F. G. Geomicrobial Interactions with Silicon // Chem. Geol. 1996. -V. 132.-P. 217-239.

76. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach // J. Mol. Evol. 1981. - V. 17. - P. 368-376.

77. Flemming H.C. Biofouling in water systems — cases, causes and countermeasures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 59. - P. 629 - 640.

78. Fletcher J., Nair S., Poole S., Henderson B. and Wilson M. C. Cytokine degradation by biofilms of Porphyromonas gingivalis // Curr. Microbiol. 1998. -V. 36.-P. 216-219.

79. Fletcher M. Attachment of Pseudomonas fluorescence to glass and influence of electrolytes on bacterium substratum separation distance // J. Bacteriol. 1988. -V. 170.-P. 2027-2030.

80. Fletcher M. Bacterial attachment in aquatic environments: a diversity of surfaces and adhesion strategies, p. 1-24. In M. Fletcher (ed), Bacterial adhesion: molecular and ecological diversity. John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y. -1996.

81. Fletcher M. and Pringle J. H. Influence of substratum hydration and absorbed macromolecules on bacterial attachment to surfaces // Appl. Environ. Microbiol. -1986.-V. 51.-P. 1321-1325.

82. Fletcher M. A microautoradiographic study of the activity of attached and free-living bacteria // Arch. Microbiol. 1979. - V. 122. - P. 271-274.

83. Gacesa P. Bacterial alginate biosynthesis — recent progress and future prospects // Microbiology 1998. - V. 144. - P. 1133-1143.

84. Garrett E. S., Perlegas D. and Wozniak D. J. Negative control of flagellum synthesis in Pseudomonas aeruginosa is modulated by the alternative sigma factor AlgT (AlgU) // J. Bacteriol. 1999. -V. 181. -P. 7401-7404.

85. Genevaux P., Bauda P., DuBow M. S. and Oudega B. Identification of TnlO insertions in the rfaG, rfaP and galU genes involved in lipopolysaccharide core biosynthesis that affect Escherichia coli adhesion // Arch. Microbiol. 1999. - V. 172.-P. 1-8.

86. Genevaux P., Muller S. and Bauda P. A rapid screening procedure to identify mini-TnlO insertion mutants of Escherichia coli K-12 with altered adhesion properties // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 142. - P. 27-30.

87. Go van J.R.W. and Deretic V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia II Microbiol. Rev. -1996.-V. 60.-P. 539-574.

88. Guckert J. В., Antworth С. В., Nichols P. D., and White D. C. Phospholipid, ester-linked fatty acid profiles as reproducible assays for changes in prokaryotic community structure of estuarine sediments // FEMS Microbiol. Ecol. 1985. -V.31.-P. 147-158.

89. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucl. Acids. Symp. Ser. 1999. - V. 41.-P. 95-98.

90. Harris P. J. Micro-organisms in surface films from soil crumbs // Soil Biol. Biochem. 1972. -V. 4. - P. 105-106.

91. Hasegawa M., Kishino H., and Yano T. // J. Mol Evol. 1985. - V. 22. - P. 160-174.

92. Heilmann C., Gerke C., Perdreau-Remington F. and Gotz F. Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation I I Infect. Immun. 1996. - V. 64. - P. 277-282.

93. Heilmann C. and Gotz C. Further characterization of Staphylococcus epidermidis transposon mutants deficient in primary attachment or intercellular adhesion // Zentvalbl. Bacteriol. 1998. - V. 287. - P. 69-83.

94. Henrichsen J. Bacterial surface translocation: a survey and a classification // Microbial. Rev. 1972. - V. 36. - P. 478-503.

95. Herrington D. A., Hall R. H., Losonsky G., Mekalanos J. J., Taylor R. K. and Levin M. M. Toxin, toxin-coregulated pilus, and the toxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans // J. Exp. Med. 1988. - V. 168. - P. 1487-1492.

96. Hirsch P. and Conti S.F. Biology of Budding Bacteria. Growth and Nutrition of Hyphomicrobium spp. // Archiv fur Microbiologic 1964. - V. 48. - P. 358367.

97. Hobbie J. E., Daley R. J., and Jasper S. Use of Nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy // Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 33. -P. 1225-1228.

98. Jackson D. W., Suzuki K., Oakford L., Simecka J. W., Hart M. E. and Romeo T. Biofilm formation and dispersal under the influence of the global regulator CsrA of Escherichia coli II J. Bacteriol. 2002b. - V. 184. - P. 290-301.

99. Kaplan J. В., Meyenhofer M. F. and Fine D. H. Biofilm growth and detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans II J. Bacteriol. 2003a. - V. 185.-P. 1399-1404.

100. Kaplan J. В., Ragunath C., Ramasubbu N. and Fine D. H. Detachment of Actinobacillus actinomycetemcomitans biofilm cells by an endogenous beta-hexosaminidase activity // J. Bacteriol. 2003b. - V. 185. - P. 4693-4698.

101. Kierek K. and Watnick P. I. The Vibrio cholerae 0139 O-antigen polysaccharide is essential for Ca2+-dependent biofilm development in sea water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003b. - V. 100. - P. 14357-14362.

102. Kierek-Pearson K. and Karatan E. Biofilm development in bacteria // Advances in applied microbiology 2005. - V. 57. - P. 79-111.

103. MacLeod F. A., Guiot S. R. and Costerton J. W. Layered structure of bacterial aggregates produced in an upflow anaerobic sludge bed and filter reactor // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 1598-1607.

104. Madigan M. Т., Martinko J. M. and Parker J. Microbial ecology, p. 532-605. In Brock biology of microorganisms, 8th ed. Prentice Hall, Inc., Upper Saddle River, N. J., 1997.

105. Mai-Prochnow A., Evans F., Dalisay-Saludes D., Stelzer S., Egan S., James S., Webb J.S. and Kjelleberg S. Biofilm development and cell death in the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata II Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - P. 3232-3238.

106. Makin S. A. and Beveridge T. G. The influence of A-band and B-band lipopolysaccharide on the surface characteristics and adhesion of Pseudomonas aeruginosa to surfaces // Microbiology 1996. - V. 142. - P. 299-307.

107. Marshall K. C.5 Stout R., Mitchell R. Mechanism of the initial events in the sorption of marine bacteria to surfaces // J. Gen. Microbiol. 1971a. - V. 68. - P. 337-348.

108. Marshall К. C., Stout R., Mitchell R. Selective sorption of bacteria from seawater//Can. J. Microbiol. 1971b. - Y.17. - P. 1413-1416.

109. Marshall К. C. Microscopic methods for the study of bacterial behavior at inert surfaces // J. Microbiol. Methods 1986. - V. 4. - P. 217-227.

110. Massol-Deya A. A., Whallon J., Hickey R. F. and Tiedje J. M. Channel structure in aerobic biofilms of fixed film reactors treating contaminated groundwater // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 769-777.

111. McCarter L., Hilmen M. and Silverman M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus // Cell 1988. - V. 54. - P. 345-351.

112. McCarter L. and Silverman M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus II Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 1057-1062.

113. Mclnerney M. J. Transient and persistant associations among prokaryotes, p. 293-338. In J. S. Poindexter and E. R. Leadbetter (ed.), Bacteria in nature, vol. 2. Plenum Publishing Corp., New York, N.Y., 1986.

114. McLaughlin-Borlace L., Stapleton F., Matheson M. and Dart J. K. G. Bacterial biofilm on contact lenses and lens storgae cases in wearers with microbial keratitis // J. Appl. Microbiol. 1998. - V.84. - P. 827-838.

115. Melo L.F., Bott T.R. Biofouling in water systems // Exp. Therm. Fluid. Sci. -1997.-V.14. P. 375-381.

116. Mizunoe Y., Wai S. N., Takade A. and Yoshida S. I. Isolation and characterization of rugose form of Vibrio cholerae 0139 strain МОЮ // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 958-963.

117. Moriarty D. J. W. Improved method using muramic acid to estimate biomass of bacteria in sediments // Oecologia 1977. - V. 26. - P. 317-323.

118. Moriarty D. J. W. Measurement of bacterial growth rates in aquatic systems from rates of nucleic acid synthesis // Adv. Microb. Ecol. 1986. - V. 9. - P. 245292.

119. Nickel J. C., Downey J. A. and Costerton J. W. Ultrastructural study of microbiologic colonization of urinary catheters // Urology 1989. - V. 34. - P. 284-291.

120. Nyvad B. and Kilian M. Comparison of the initial streptococcal microflora on dental enamel in caries-active and in caries-inactive individuals // Caries Res. -1990.-V. 24.-P. 267-272.

121. O'Toole G. A. and Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30.-P. 295-304.

122. O'Toole G. A. and Kolter R. The initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis // Mol. Microbiol. 1998. - V. 28. - P. 449-461.

123. Overmann J. and Pfennig N. Buoyancy regulation and aggregate formation in Amoebobacter purpureus from Mahoney lake I I FEMS Microbiol. Ecol. 1992. — V. 101.-P. 67-79.

124. Pace N. R., Stahl D. A., Lane D. J., and Olsen G. J. The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequences // Adv. Microb. Ecol. 1986. -V. 9.-P. 1-55.

125. Paerl H. W. and Priscu J. C. Microbial phototrophic, heterotrophic, and diazotrophic activities associated with aggregates in the permanent ice cover of Lake Bonney // Antarctica. Microb. Ecol. 1998. - V. 36. - P. 221-230.

126. Perfil'ev B.V. and Gabe D. R. Capillary methods of investigating microorganisms (translated from Russian by J. M. Shewan) // Univ. of Toronto Press, Toronto, 1969.

127. Pier G. Pseudomonas aeruginosa: a key problem in cystic fibrosis // ASM News 1998. - V. 64. - P. 339-347.

128. Pike R. N., Potempa J., MaGraw W., Coetzer Т. H. T. and Travis J. Characterization of the binding activities of proteinase-adhesin complexes from Porphyromonas gingivalis II J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 2876-2882.

129. Posada D. jModelTest: Phylogenetic Model Averaging // Molecular Biology and Evolution 2008. - V. 25. - P. 1253-1256.

130. Poulsen L. К., Ballard G. and Stahl D. A. Use of rRNA fluorescence in situ hybridization for measuring the activity of single cells in young and established biofilms // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 1354-1360.

131. Pratt L. A. and Kolter R. Genetic analyses of Escherichia coli biofilm formation: defining the roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili // Mol. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 285-294.

132. Ramsing N. В., Ferris M. J. and Ward D. M. Highly ordered vertical structure of Synechococcus populations within the 1-millimeter-thick photic zone of a hot spring cyanobacterial mat // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 10381049.

133. Razzell W.E., Trussell P.C. Isolation and properties of an iron-oxidizing Thiobacillus // J. Bacteriology. 1963. - V. 85(3). - P. 595 - 603.

134. Revsbech N. P., and J0rgensen B.B. Microelectrodes: their use in microbial ecology // Adv. Microb. Ecol. 1986. - V. 9. - P. 252-293.

135. Rickard A.H., Leach S.A., Hall L. S., Buswell С. M., High N. J., and Handley P. S. Phylogenetic relationships and coagregation ability of freshwater biofilm bacteria // Applied and Environmental Microbiology 2002. - V. 68(7). - P. 3644-3650.

136. Rickard A.H., McBain A.J., Ledder R. G., Handley P. S., Gilbert P. Coaggregation between freshwater bacteria within biofilm and planktonic communities // FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V. 220. - P. 133-140.

137. Ross P., Mayer R. and Benziman M. Cellulose biosynthesis and function in bacteria // Microbiol. Rev. 1991. - V. 55. - P. 35-58.

138. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory Manual // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Vol. 1,2,3.

139. Sauer K., Camper A.K., Ehrlich G.D., Costerton J. W. and Davies D.G. Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 1140-1154.

140. Schink В. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - V. 61. - P. 262-280.

141. Schuler D. and Frankel R. B. Bacterial magnetosomes: microbiology, biomineralization and biotechnological applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 52. - P. 464-473.

142. Skerman V. B. D. A new type of micromanipulator and microforge // J. Gen. Microbiol. 1968. -V. 54. - P. 287-297.

143. Staley J. T. Growth race of algae determined in situ using an immersed microscope//J. Phycol. 1971. -V. 7. - P. 13-17.

144. Stanley P. M. Factors affecting the irreversible attachment of Pseudomonas aeruginosa to stainless steel // Can. J. Microbial. 1983. - V. 29. - P. 1493-1499.

145. Stoodley P., Boyle J. D., Dodds I. and Lappin-Scott H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure // J. Appl. Microbiol. Symp. Ser. 1998.-V. 85.-P. 19-28.

146. Stoodley P., DeBeer D. and Lewandowski Z. Liquid flow in biofilm systems // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 2711-2716.

147. Stoodley P., Sauer K., Davies D.G., and Costerton J.W. Biofilms as complex differentiated communities // Annu. Rev. Microbiol. 2002. - V. 56. - P. 187209.

148. Suturin A.N., Timoshkin O.A., Paradina L.F., Kravtsova L.S., Rozhkova N.A., Kulikova N.N., Saibatalova Ye. V., Semiturkina N.A. Biogeochemical Processes on the Stony Littoral Unlimited Element and Nutrient Source for Baikal

149. Ecosystem // Berliner Palaeobiologische Abhandlungen. Berlin. 2003. - V. 4. -P. 129-139.

150. Thelin К. H. and Taylor R. K. Toxin-coregulated pilus, but not mannose-sensitive hemagglutinin, is required for colonization by Vibrio cholerae Ol El Tor biotype and 0139 strains // Infect. Immun. 1996. - V. 64. - P. 2853-2856.

151. Toledo G., and Palenik B. Synechococcus diversity in the California Current as seen by RNA polymerase (rpoCl) gene sequences of isolated strains // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 4298-4303.

152. Tolker-Nielsen Т., Brinch U.C., Ragas P.C., Andersen J.B., Jacobsen C.S. and Molin S. Development and dynamics of Pseudomonas sp. biofilms // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 6482-6489.

153. Wang J., Lory S., Ramphal R. and Jin S. Isolation and characterization of Pseudomonas aeruginosa genes inducible by respiratory mucus derived from cystic fibrosis patients // Mol. Microbiol. 1996. - V. 22. - P. 1005-1012.

154. Ward D. M., Ferris M. J., Nold C. and Bateson M. M. A natural view of microbial biodiversity within hot spring cyanobacterial mat communities // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62. - P. 1353-1370.

155. Watnick P. I., Fullner K. J. and Kolter R. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol. — 1999.-V. 181.-P. 3606-3609.

156. Watnick P. I. and Kolter R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm I I Mol. Microbiol. 1999. - V. 34. - P. 586-595.

157. Webb J.S., Thompson L.S., James S., Charlton Т., Tolker-Nielsen Т., Koch В., Givskov M. and Kjelleberg S. Cell death in Pseudomonas aeruginosa in biofilm development // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P. 4585-4592.

158. Weller R., and Ward D. M. Selective recovery of 16SrRNA sequences from natural microbial communities in the form of cDNA // Appl. Environ. Microbiol. -1989.-V. 55.-P. 1818-1822.

159. Williams V. and Fletcher M. Pseudomonas fluorescens adhesion and transport through porous media are affected by lipopolysaccharide composition // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 100-104.

160. Wimpenny J. W. T. and Colasanti R. A unifying hypothesis for the structure of microbial biofilms based on cellular automaton models // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. - V. 22. - P. 1-16.

161. Wingender J., Neu Т., Flemming H-C. What are bacterial extracellular polymer substances? In: Wingender J., Neu Т., Flemming H-C (eds) Bacterial extracellular polymer substances. Springer, Berlin Heidelberg New York, 1999. -P. 1-19.

162. Zvyagintsev D. G. Adsorption of microorganisms by soil particles // Soviet Soil Sci.-1962.-P. 140-144.