Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функционирование и структурная организация генов устойчивости и биосинтеза хлортетрациклина

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Функционирование и структурная организация генов устойчивости и биосинтеза хлортетрациклина"

? я • я

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ИСАЕВА Любовь Михаиловна

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ И БИОСИНТЕЗА ХЛОРТЕТРАЦИКЛИНА

Специальность 03.00.15 — Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — )991

Работа выполнена в лаборатории генетики актнномицетов и актинофагов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор

Н. Д. ЛОМОВСКАЯ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат биологических наук

С. В. КАМЕНЕВА

А. В. ОРЕХОВ

Ведущее учреждение: Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков Минмедпром СССР.

Защита диссертации состоится « » мая 1991 года в : . часов на заседании Специализированного ученого совета Д.09Я.ОД.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545. Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ-генетика.

Автореферат разослан « , » апреля 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного ученого совета, кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

. ВВЕЛЕНИЗ

I

:туалъность те?.1«. Лктиномицеты широко используются в мкйгоо.'ю-гической промышленности как продуценты антибиотиков, ^грконтакг. епаратов и других биологически активных ЕешестЕ. Изучение ггне-:ческих особенностей актпномицетных штаммов является веяным зт1-м на пути создания ноеых высокоактивных штаммов-продуцентов, иболее ваяно и представляется кнфор?лацля о структуре я Зункцискг-вании генов, контролерустих этапы биосинтеза антибиотиков, Бол:.~ е методические возможности возникли в связи с открытием того кта, что гекы, контролирующие биосинтез практически есйа лссле-емых антибиотиков, тесно сцеплены между собой'и с генами резис-чтности и составляют единый кластер. Это позволяет осуществлять энирование протяженных Фрагментов ЛНК, содержащих Есе гена био-1теза данного антибиотика, с последующим изучением структуры, /знизации и регуляции Санкционирования генов биосинтеза в ссстз-кластеров. Рольшую роль в изучении генов биосинтеза играьт гень* гойчивости к аутогенным антибиотикам. Это срязано с Еоз.та.тдсстьй юльзования селективного, давления при клонировании этих генов :стэ с тенет биосинтеза на протяженных фрагментах ДКК. Зто в |Ю очередь открывает возможности конструирования высокопродуктлв-: штатов с помощью генной инженерш.. ' - • Объектами данной работы являются штаммы <51гер1с:лусе.5 еигеоТз--аэ , которые широко используются в СССР, и ряде других стран ачестве продуцентов .хлортетрашшшнз. Хлор тетрациклин применяет-в ветеренарии и как основа для получения полусинтетических гетре— лияов для медицины. С использованием штаммов.', _S.aareotsci.ervs эльно изучен путь биосинтеза хлортетрациклина,изолирозаан л рактеризоЕанк ферменты, участвующие в этоу процессе. Генетическое чение' этих ттзшов было ограничена получением мутаций с нзруы?.н-бяоеинтезом хлортетрашшлгша в сеязй с методическими трудностей >тн с ними кзк с геаетическш,-л. объектами.; Еаедренке метегов- геплж шерии в генетику-актинсмлцетов открыла воЕые возможности ?ля гения генетического- контроля биосинтеза .хлортетрациклина, относя- ; юя к многочисленной группе тетрациклкновых антибиотиков,' кстоьхе :олкаот широко использоваться в гетеренарш я медицине. _

..работа и за тати исследования.-.-: йалыо- работы являлось г.ек е?й-ц-:'> а молекуляряо-генетическое изучение итэммов. Хайгео(есгеаз,;; .

функционирования генов, участЕуших в биосинтезе хлортетрагшклкна Б соответствии с этой целью задачами работы являлось:

- генетическая характеристике детерминантов устойчивости к аутог ному антибиотику хлортетрациклину к ряду других антибиотиков у ит Г.СЕ о .aareoi aclens ;

- молекулярное клонирование генов устойчивости к хлортетрациклин;

- сравнительный рестрккционный англиз фрагментов ДНК. несущих те: резистентности к хлортетрапиклину, у двух дивергентных линий селек - штаммов vS.eureoíaclens 5-888 и 5-197 - продуцентов хлортетра^ циклина; /

- изучение функционирования и организации генов устойчивости а биосинтеза хлортетрациклинэ.

Натчнвя ногизна результатов. Клонирован протяженный фрагмент J¡KK штамма S.aureofacleas -S-I97 / 21 т.п.н./.несущий ген уст< ч:1гости к хлортетрациклину, обозначенный как ctrA. Изучено функшн кнгоЕвние гена ctrA в штаммах 5treptoayces и Escherichia colt., Показана корреляция между протяженностью делений в клонированных, фрагментах JHK. примыкающих к гену ctrA, и уровнями экспрессии reí ctrA в штаммах 5treptomyces и Esch.erlch.i.8 coli.

Установлена гомология генов ctrA квух дивергентных линий селе! ции штаммов 5.aureofaclens 5 -888 и 5-197. В клонированном фр менте ЛНК штамг.и- 5 -888 идентифицирована инвертированная последовательность JHK размером около 4 т.п.н., примыкающая к гену с£гд. Е процессе субклонирования гене ctrA определены вероятные границы значимой области гена. • •

Б составе клонированного протяженного /21 т.п.н./ фрагмента ДН S.aureofaciens , несушего ген ctrA, идентифицированы и локализов нн структурные гены, участгушие в ранних'этапах биосинтеза хлорте рацкклине, а также ген-регулятор. Эти данные указывают на локализа цию геноЕ резистентности и биосинтеза хлортетраниклина в составе е. кого кластера. Сравнительный анализ структур кластеров генов биоси теза полккетинных антибиотиков хлортетрапиклина, окситетрэгиклина, гктинородина указывает не сходстео в расположении идентифицированы генов, контролирующих ранние этапы биосинтеза.

Для дальнейшего использования штаммов S .aureofaclens в каче< решшкентоЕ изолированной .ИНК разработаны методы получения и рёгеш цли протопластов этих штаммов.

При сравнительном генетическом изучении промышленного штамма o.aureoiecíens /5-755/ TE-SS3§7. к его более про;?:кткиьк мутанта

187 и .5-197 в отношении Зункгионирования гена т£г , сбеспечивззкзе- • индуцибельную устойчивость штамма одновременно к хлортетрзсикли:-;" лакролидным антибиотикам, показано, что у этих мутантов ген п(г ззжэется конститутивно. Генетические даяние указывают, что клоня-занний нами ген тлеет с^нкеии гена т1г . Продемонстрирована змсянсстъ использования клонированного гена círA в качестве зонда з поиска гт^г-подобных генсЕ 31гер1отусез .Шг-подобные гены сбна- ;

?ены 2 штатах Л.Ктозиэ, 5. ¿моЬпс ТНЕ4 и 3.уиг^аосКго-.гю^епе^'

гдлсяена гипотеза эволюционной рели тТл—подобных генов.

•тт-г— пгяктнтескяя зн^чжлссть пзботы я практическое использован/*? г-г---енчкх зезультатсв. Получен штамм 3 .аигеотассепз 3-137 с ¡или по сравнению со штаммами З.аигео^эсиепз Ь-755 и ¿¡-187 техне-■ическимк свойствами. Уровень накопления антибиотика для итакла :57 на 12% превышает продуктивность птамма 5-137 и на 42;5 выше !вня антибиотической активности штамма 5-755, используемого в нас-слее время в промышленности. Штамм 3-197 характеризуется высоким ¡Вием накопления антибиотика, повышенной стабильностью по признаку " ■ибиотикообразоЕзкия, способность*) использовать более широким, чем • :там.:оэ -3-755 и ^-187 спектр источников углеводоЕ. Это расширяв? нежность применения штамма на заводах в различных регионах. Еысс-; уровень образования регенерирующих протопластов делает штамм более перспективным для генно-инженерных работ, направленных на ьнекшее повышение продуктивности штамма.

разработанные в работе методы образования и регенерации протоплас-

для промышленных штаммов 0-755, 5-187 и 5-137 продемонстрировала :

»ложность использования метода протоплэстирования в селекции на

ышенке продуктивности штаммов Л.аигео[ас1-еп5.

Осуществленное в данной работе клонирование гена устойчивости к

□тетрациклину с {г А и ряда генов биосинтеза хлортетрациклина з ссс-

э протяженного /21 т.п.н./ фрагмента ДНК, результаты по изучения

¡'«туры, Функционирования и ззаимодеиствия данных генсз могут слу- .

з реальной основой для использования методов генной инженерии з

зкиии штаммов Я.аигео1ас1епз. При этом для создания новых гнбрпд-

антибиотикез з качестве штаммов-реципиентов изолированных генов

•т быть использоеяны продуценты других*поликетидных антибиотиков.

'льтэты, полеченные при изучении организации и функционирования

)в биосинтеза хлортетрапиклиаз, могут быть использсвакн и при изу-

и других прозу центов полякетидных антибиотиков, а том числе и :ацяклинового ряда.

Y ' i- '

Структура г.sботы. - Диссертация состоит из введения, обзора литературы» материалов и методов, результатов экспериментов,обсул дения, выводов и списка литературы. Библиография Еключает в себя 126 литературных .источников. ■ Апробация. Результаты работы докладывались на семинарах *:збс тории генетики, актиномицетов и актино^гов ВНИЛгенетика, объедине ном семинаре отдела прикладной и молекулярной генетики ЕНИИгекетг 25 января 1991 г.. Международном симпозиуме по генетике стрептош toe /ГДР,Зр^урт,1990/, 7-мой национальной конференции по произЕов ству и использованию антибиотиков /Еолгария,Разград,1990/, 7-мом Международном сшшозиуме по метаболизму и энзимологии нуклеиновых кислот, включая генную и белковую инженерию /Чехословакия,Смолени Кастл,1990/, Международном симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии /США, 1990/, 6-ом Международном симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов /франция,Страссбург, 1990/.

МАТЕРИ АЛЫ Y'« м Е ТОЛЫ •'.

Бектетальина штаммы. J. В работе использовали актиномицетные шта>. S .aureofacietiö S-755, S.aureofacietis-187, продуцирующие хлортет! циклен, и шташ Escherichia coll TGI из коллекции ВЕШгенетика, г таксе шташ S. vúidacKromo^^S Tu.494 ЛЬШеЬеп. W. ei al ,1988/, Штамм 3.tivul¿mTK64 любезно предоставлен проф . Д.А. Хопвудом/Аш гтамм S .runcius любезно предоставлен доктором Я.Пигац/СФРЮгослави^ шталм S.aureoiacLens $-197 получен в процессе выполнения работы. Плязмиды..' Б работе-использовали плазмиды актиномицетов р13702 /Kot} Е. et si.,1983/, pVG520 /Сезонов Г .В. и др., 1990/ и плазмзд* pVG530,pVG53I,pVG532,pVG533, полученные выданной работе; а также плазмиды E.colí. JÜCI9 /коллекция ЕНШгенетика/, „р132345,р132346, pIC2334,pFHI00, лабезно предостевлешше проф. Д.А. Хопвудом /Англ и плезмады pVG540,pVG543,pVG545, полученные в.процессе настоящей ра Сведи и условия вынашивания.' Для выращивания штаммов Slreptom использоевли агаризованные питательные среды: СР6 /Ломовская В.Д. пр., 1971/ для штагатов S.iivLiöiis; ТКБ4 и S.vlrtdocWomo^rtes Tu494; CPI2 /Чиненова. Т.А. и др.,1990/ для штадаов S.aureoiaciens ; СРЗ. /Pí-gaiS Л. et al.,1982/ для штамма 3Ут\.osus. Для изучения детер нангов устойчивости к антибиотикам использовали минимальные среды ММ /Hopwood.Ъ.А. ét. al. ,1985/ для turemos- 5. iivüfehS ТК64 и S .vir

ronuo£en.es T\i494; ГИЛ /ЧиненоЕа Т.А. и .др.,1920/ для штатов aurecrfaciens и среду СРЗ для штамма S.riraosus . Для регенерации протопластов штэммое S. iwixUtvi ТХ64 и o.vtrtdo-ло<^№Ти494 использовали среду RZ^E /OkanisKi. М. et al. ,1984/.Для генерации протопластоЕ штаммов 5.auveo{aciev\S использовали эду L!4 /Reuri.es J.P. et al.,1988/.

Для выделения шгазкидной ДНК ку ль туры выращивали в жидкой среде 3 /м$Цта",Ш/.

Штаммы E.colu выращивали на твердой питательной среде L,а в качес ! жидкой среды использовали ее неегаризоранный аналог. 'оды исследования. Получение, регенерацию и трансформацию ^пластов штакмов .S.tivicians ТК64 и S.viruiockromo^enes Tu494 пройти по стандартным методикам /Eii>b M.J. el al.,1978; Thompson. C.l al.,1982/. Для трансформации штэммое E.coll использовали метод ышевой обработки клеток /Ьа^еИ. Я . et al.,1979/. Выделение тотальной ДНК и плазмидной ДНК осуществляли по стандарт-методикам Мармура и Еирнбойм-Доли /HopwooA "t) .А. et al.,1985/. Рестрикпионные эндонуклеазы й ДНК-полянуклеотидлигазу фага Т4 эльзовали в условиях, рекомендованных изготовителями /Ребентш Е\. ¿генетика/.

^ибркдизацкт ДНК проводили по методу Саузерна /SoulKenv Е.М.,1975/ 1ение метки осуществляли методом ник-трансляции /Маниатис Т. и др.,

¡табяльность наследования рекомбинэнтных плазмид в штаммах Strep-•ces определяли по числу клонов в популяции, сохранивших устойчн-ъ к антибиотику после вырашивания одной генерации штампа е несе-'крных условиях.

рорень устойчивости штаилмов к антибиотикам определяли по о$$эктиб и -рассеЕа культуры - отношение титра клеток нэ селективной среде, ржашей антибиотики в различной концентрации, к титру клеток на е без антибиотика.

пя определения ин-уыибельного типа устойчивости- споровую суспеы.лв ла в разведениях наносили на поверхность чашки Петри со средой, эжзщей антибиотик, используемый в качестве инлуктора. Через 24 Iна агар наносили слой полужидкой сретде, содержащей антибиотик в нтрзшшх, необходимых 'пдя создания селективных условий, 0 наличии цин судили по возрастанию эффективности рассева культуры в при-еии инпукторэ.

тибиотичесяуо активность штаммов -S.aureofaciens оценивали в :се ферментации /ИсзеЕа ЛЛ1. и др.,1990/.

г*

о.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

I. Характеристика штаммов Sirevtonrvces aareofaciens.

В работе исследовали следующие шташк-прояуьенты хлортетрацик-ляпа: штамм -S.aureofaciens те-сзоф^ /S-755/,который е настояща* время применяется в СССР е качестве промышленного продуцента ;шта.\г S.eureofacLsnS 5-187, полеченный во ЕШ№ен:тяка как мутант штамм* 5-755, характеризующийся больней устойчивостью к высоким лозам сос с таенного антибиотика хлор тетрациклина; штамм «S.sureolacierisS-l перченный е данной работе как мутант штата S-187 способный рз; есться на средах с повышенным содержанием сахарозы. На рис.1 преде таЕлены гистограммы изменчивости вариантов штаммов ^-187 и Л'—19*; в отношении'признака антибиотикосбразоьания. Как видно из рисунка популяция штамма ¿-197 отличается более узкил спектром изменчивое и более высоким уровнем активности. Показано, что штамм 3-197 по сравнению со шташамн 5 -755 и 5-18-7 способен использовать, более широкий спектр источников углеводов без снижения уровня антибиотнч кой активности, характеризуется поьыпеиной стабильностью по призна: антибкотикообразования и сокращенным Бременем выращивания.посевноп материала на агаризованных средах.

Исследуемые штаммы' $.aureofaciens были получены'в результате большого числа последовательных мутагенных обработок. Это снижает эффективность получения на их основе более продуктивных штаммов. Представляло интерес выяснение вопроса о влиянии на антибиотическую активность штаммов «Siaureofaciens процесса протопластщювания. Кроме' того, .разработка методов образования и регенерации протопластов е применении к конкретным штаммам Sifeptcniyces - необходимый этап для использования в их селекции методов генной инженерии.

Использование методик, предлагаемых рядом авторов для модельных я некоторых промышленных-штаммов, в том числе S.aureofacLens и S.r'imosus /продуцент родственного хлортетрапиклину антибиотика j оксятетрашислина/ оказалось неприемлемым для штаммов-продуцентов хлортетргцякляна, исследованных в данной работе. Установлено также, что мицелий штаммов 5 -755 и .S -187, выращенных в - условиях используемых для стандартно!с штамма 5 . tivii • isr 66, значительно более устойчив к действии лизопаш.

Максимальное число регенерирующих протопластов /' 1*10"- 1*106 прс тапластов/мл / у штаммов 5-755 и 5-187 формировалось при вырашиг2Н> биомассы в течение 20 часов в трштон-соеЕой среде без глшина с псс

.1

Изменчивость штэммое S.aureoiaciепь S-I87 /А./ и -S-197/Б./ по признаку антибнотикообразоЕвняя до еэ и после EZ3 енетзапии протопластов. !7о оси абсцисс-антибиотичесяая активность иантов в %' от активности контроля; по оси ординат - частота ветрености вариантов с данным уровнем антибиотикообразования, в /о.

сушим пересевом мицелия на ту же среду с 1% глшшяа а инкубацией 'ечение 20 часов. У штамма S-I97 для получения протопластов опти-гьной являлась "переходная" стация между экспоненциальным и стэ-жэрным ростом культуры, которая наступала через 20 часов роста гьтуры на триптон-соевой среде с 0,8^ глицина. Уровень образования, 'енерировавших протопластов при этом составлял 1*10® - I-Ю^про- ; ¡ластов/мл. Кроме того, высокий уровень образования протопластов г: ¡тэмма Л-197 также достигался при выращивании культуры в' течение г; часов на триптон-соевой среде с 1% глицина. Следует отметить,что г. [ аналогичных способах вырзщюания штаммов 5-755 и $-187 уровень-!азования протопластов составлял меньше 1-10* протопластов/мл.

Значительную трудность представлял подбор агаризованных сред :: г регенерации протопластов. Наиболее енсокий уровень регенерации : (тошгзстов был достигнут на среде М4 с. увеличенным по сравнению со :дой количеством сахарозы. - / :

Оптимальная температура Екрашивания мицелия, формирования и реге- : 1ацки протопластов составляла 22'С. Высев протопластов проводили ¡ерхнш агаризоЕанный слой /0,5%/ регенерационзой среды. Известно, что некоторые штаммы Streptomyces синтезируют диффун- : 1УЕЕЦИЙ ингибитор, подавляющий регенерацию протопластов при густом •_• :еве. Оказалось, что штаммы 5-187 и Л-197 такне обладают ауто-кбиру кизил регенерацию протопластов эффектом. При высеве на чашку ря ГО® - Ю® протопластов эффективность регенерация снижалась в г раз по сравнению с ЕысеЕом менее 1С3 протопластов. Этот эффект рудяяет осуществление процесса трансформации.

Таким образом, разработаны условия для-формирования и регенерг пии протопластов промышленного штамма S —755 и его мутантов- S -167 ; 5-197 .Следует отметить, что штамм 3-197, полученный в данной ра-ооте, характеризуется еысоким уровнем образования регенерирующих протопластов, который составлял I08 - Ю9'протопластов/мл., что на три порядка превышает максимальное число регенерировавших протопластов штаммов 8-755 и 5-187. Данное свойство штамма S-I97 дает дополнительные возможности для начала работ с использованием протопла< тсн высокоактивных ктгммов.

Антибиотическая активность кленов штаммов S -187 и 5 -197,noj чэнных при моноспосовом рассеве колонии регенерировавших протопласте изменялась е широких пределах. Ка рпс.1 представлены гистограммы антибиотической активности исходных штаммов и вариантов после регенс рации протопластов. Наблюдается еысокэя изменчивость обоих штаммов после протонласткроЕзния по признаку антибиотикообразоЕания. Антибис тическая активность составляла у разных вариантов этих штаммов от до 1АС% от активности исходных ш та шов.

Таким образом, пропесс протопластироьания увеличивает нестабиль ность по признаку энтибиотикообразования у шташоЕ-продудеитоз хлор-тетрациклина и приводит к появлению как неактивных, так и более акта икх по сравнению с исходным штаммом вариантов. Из представительной выборки клонов.полученных после протопластироЕаккя и регенерации клеток штаммов S-I87 и -S-I97, были отобраны варианты, сохраняющие более высокии уровень антибиотической активности по сравнению с исходными штаммами. Представляется.что метод протоплесткрования является перспективным для поиска более актирных вариантов у штаммов прошедших длительную селекцию, для которых традиционные методы поЕышеши активности с помощью, мутагенов являются малоэффективными.

2. Генетическая характеристика детерминантов устойчивости к хлортетрг пиклпну и макролидным антибиотикам у штаммов b.aureofacien.3 .

В результате проведенных в нашей лаборатории генетических иссле-

дований детерминантов устойчивости к ряду антибиотиков штамма S.aurec

Isciens 5-755 был идентифицирован гек/ы/ mir »функционирование коте

рого/ux/ обеспечивает индупибельную резке - нтность штамма одновреме^

но к собственному' антибиотику хлортетраии:^ику л ряду макролядных аш

биотипов при использовании их в качестве индукторов/Чиненова Т.Д. я i

1930/..

Нтамм 3-187 получен как мутант штамма. • .3-755 устойчивый к хлор- 1 радлклину. мутантный штамм 5 -197 сохранил это свойство штамма -137. Нами показано,что штаммы <$-187 и 5-197 по сравнению со имом 3 -755 не только обладают высоким уровнем конститутивной зйчивостя к хлортетрадиклину, но и приобрели большую устойчивость • ритромицину и олеандомишну. Это дает основание предполагать,что ше штаммы являются конститутивны?«! мутантами по гену/ам/ тАг . ■ ;тстг.ие у шташов 3-167 и 3-197 феномена индукции резистентнос-з присутствии индукторов хлортетрациклина, эритромицина и олеан-щлнг к более еысоким концентрациям этих антибиотиков поцтЕержда-гипотезу о конститутивном выражении геноЕ глЬг у этих штаммоЕ.

Лолекулятшое клонирование л изучение Функционисреэния детерми-зантоЕ устойчивости к хлортетрапияляну штсммоа 3.аигеоТас1е;\ч.

Сравнительный анализ уровней резистентности исходного штамма зигес(зс^епэ $-755 и его мутанта 3-197 показывает,что мутант-штамм характеризуется конститутивным уровнем устойчивости к (тетрациклину и макролидным антибиотикам. Источником хромосомной для клонирования детерминанта резистентности к хлортетрадиклину сил штаым 5-15?.

Молекулярное клонирование и субклонирование детерминанта устоичи-

'и к хлортетраииклину .■ С использованием плазмидного вектора '02 в решшиентиом штамме S .^ivudáViS ТКБ4 осуществлено клонироЕа- ' из штамма-продуцента .5-197 B^lll-фрагмента ДНК размером 21 т. Гибридная плазмида названа pVG530. .

Сеойстго плззмйды- pVG530 образовывать делеционные Еарианты при сформации штамма . S.íivtftans ТК64 использовали для субклон яров аяия рминанта устойчивости к хлортетрапикливу. Из трех трансформантов Ctcf? S.twLctahs ТКВ4 выделены плазмилы, обозначенные pYG55I, 32, pVG533 и способные при трансформации в штамм S.Uvúiaws ТКЕ4 звать ему устойчивость к хлортетрашшлину и тиострептону. Электро-тический анализ рекоибшактных плаз мл д pVG53I, jVG532 и pV*G533 суши наличие вставок фрагментов ДНК размером 6,6;-6,4 и 2,2 т.п. эотЕетственно. Построены рестрикпиояные карты плазмиды pV"G530 с газованием ресгриктаз BemHI, Kpnl, p$tl. SacI и ее дзлеш-

с вариантов - шгазмид pVS53I. pVG532, pVG533 с использованием .иктаз BÜÜI. ЕссЩ, BstEir,..H¿wiin» MIur,SacIrSvtxal, FvuII, •» ¿PaI- btl, Kpn.1 /рис.2/. ;

10.

S.rlmosüs

А

Bg nSm

—IL!

/

Bs u Sm

t kb

ScuSA/3

В

Sm |

BgHSSm Bs U А В

\Y~-—Ht

S.aureofactens

pVG533

A\ ßs | и | BgHSSm BtUÄ U—U

i« к p„\

D

er.Utflf ^

oirA

cfrA

BgHSSm Bs UA Sm В 4

pVGSSl [НУ "1 И .

UP КHs3

£ pVGSJf Bg ^SSm Bsuf Sm в л

111M-4---1 I 1

^Hi'l | ■

. Bs H £ TV ——"

f B.VG53Q ■ •

' I' ' r? ' 1 , I ,______

' »- l Jl -TT

»TT1

s* B, *

II I 1.11 n

«**?Ä . к,к, p, .

"ггГ,

P.K«

Bs» 1 kb

Рис.2 Рестригажонные карты фрагментов ДНК с геном <Arl -

S.Umosus / А. - OhmtWl ei al.,I985; Б. - Butler et аI., 1989 / и клонированных фрагментов JDHK хромосомы шташа •S.aureofaclens 5-19? с детерминантами устойчивости к хлортетра-циклину в составе швзиидн pVG530 /Т ./ неё дел еционных. вариантов - шгазмщ pYG533 /С./,рУб532 /О./, pVG53I /В./. Стрелкой обозначен район локализации гена ctrA.B-BamHI.M-MIuI.A-Ара I, Es -BstEII .E-EcoKI.H-Hi-ndlll, Bg-E#! II ,Srn -Sträl.S-SacI ,P-Pst I, K-Kpn I ,Pv -Pvu II.

д.

>

». р.

в.

/•** I щгцЯпюу*!* !

ват - э{*}<кт:!£иость распена.

тетрациклину, сохраняется легая часть клонированного Вс^П-фраг-мента ГНК между и ЕгяШХд сайтами. Этот фрагмент размером

2,2 т.п.н. клонирован в составе плазмиды рУв533. При этом оказалось, что плазмида рУ5533 обеспечивает штамму ЙЛсЯсЬпз ТК64 уровень устойчивости к хлортетрациклину, превышающий уровень устойчивости штамма, несущего векторную плазмиду рП702. Таким образом, ген.обеспечиЕащий устойчивость к хлортетрациклину, субклонирован на фрагменте ГНК размером 2,2 т.п.н. в составе плазмиды рУС533. ' • . •

При дальнейшем исследовании гибридных плазмид, содержащих вставки фрагментов ЛНК 3.зигео?ас1.е1г5 5-197 различного молекулярного размера оказалось, что они обеспечивают штамму $. ti.vi.ddn3 ТК64 разные уровни устойчивости к хлортетрациклину /рис.3/. Самый высокий уровень устойчивости к хлортетрациклину, сравнимый с уровнем устойчивости штамма $,аигео1ас1епа 5-197, зафиксирован у штамма ТКБ4, несущего плазмиду рУв530. Самый низкий

уровень устойчивости к хлортетрациклину у штамма ЗДтАао-з ТК64, . несущего плазмиду рУ(3533 с наименьшим по размеру клонированным фрагментом /2.2 т.п.н./. Плазмиды рУС532 я рУб531, имеющие сходные клонированные последовательности ДНК размером 6,4 и 6,6 т.п.н., соответственно,придают штамму БДи/иЬиз ТКБ4 промежуточную устой-

" • I2' . •

чивость к хлортетрациклину. Учитывая одинаковую копииность плазм pVG53I, pVG532, PVG533; пониженную копийность исходной плазмиды pYG53n, а так же данные рестрикхшонного анализа, позволившие лок лизовать детерминант устойчивости к хлортетращклияу и районы ра положения делеций,видно, что делегирование участков ЛНК справа о B^II-PvuII - фрагмента ДНК S.aureoíacteas S-I97, влияет на ф ционироЕание детерминанта, определявшего устойчивость штамма-реи ента к хлортетрациклину-.-. .'•"• .' . ' .• •'•

Паралельно с нашими исследованиями были отклонироьаны ген S.sureoíacleus/Reúnes З.Р. et al.,1988/ и гены устойчивости к р венному хлортетрациклину антибиотику окситетрадиклину otr А и oír S.vi-nwsus /Batler M.J.et аI,, 1989/ в составе кластера генов б синтеза окситетрадиклина. .Показано, что рестримционные карты ген ctrB и otrB сходны. Сравнение рестрикционных карт фрагментов в с ве плазмяд pV*G53I, pVG532, pVG533.обнаружило, их сходство с геном oír A S.rlwosus ..Это выражалось в идентичном взаимном располож сайтов BaraHI,SniaI,ApaI,MIuI,BitEII ; в значимой области гена otrA районе ЛНК в составе плазмяд pVG53I, pVG532,pVG533, где локализ детерминант устойчивости к хлортетращцодшу. Это позволяет преда гать, что клонированный в.данной работе детерминант устойчивости хлортетрацикли;'" •S.auveofaciens S-197 имеет сходстео с геном < и обозначен нами как ген ctrA. Отличием в карте рестрикции генов otr А и ctrA является присутствие сайта Pvu II в гене ctrA.

Анализ рестрикционных карт областей, примыкающих.к гену сЬ S.auveoíaclens и otrA S.viroosus . позеолил обнаружить сходство р< рикционных карт B^tlI-Smal фрагментов, пртшкавдих слева к генам cb A S.aureoWlens S-I97 и otr A S.timóos .которое Еыражает в присутствии идентично расположенных'сайтов B$II,Hi.n.dIII,SacI,í:

Сравнение размеров фрагментов хромосом штаммов S.awreoíac и S.rürosus .несуших гены ctrA и otrА,соответственно, проводш с помощью ЛНК-ЛНК гибридизации. На рисунке 4 видно, что субклонир ный ген ctrA гибридизуется с фрагментом ЛНК BamHI' S.aureo^aciení $-755 размером около 6,6 т.п.н. и фрагментом ЛНК BamHI-E<#II раз

_ _ 'О

ром 2,8 т.п.н. размеры данных, фрагментов ЛЕК идентичны размерам, читанным на основании построенных нами рестрикционных карт /рис.!

Особый интерес представляли данные ДНК-ЛНК гибридизации генг сиг А с хромосомной ДНК штамма S .runosus*. Показано, что ген ctrA имеет в геноме штамма S.Hmosus ; гомологичные последовательное! ДНК, локализование на ВагВДрагмевте ДНК размера.: 8,0 т.п.н. и

этШ-Вс^П-^рагменте ДНК размером 3,2 т.п.н. Важно отметить, что эн oírА в геноме штамма S.rimosus локализован в составе клснкро-внных фрагментов ЛНК BamHI и BamHI-B^ClI аналогичного размера рис.5/. Таким образом, показано, что клонированный нами ген ctrA .aureoíaciews имеет высокую степень гомологии с геном otrA S.ri-3SUS . Это находит подтверждение и в обнаруженном нами ранее схоцст-s рестршшионных карт этих генов. При этом оказалось, что фрагменты ÎK BamHI и В8тН1-Б£$И S.aureoîaciens .несущие гены сЬгА.несколь-з меньше по размеру, чем соответствуйте им фрагменты хромосомы зтН1 и BamHI-Bc^II S.rlmosuí» . несущие гены otrÁ /рис.4/.

,2 Сравнительная характеристика детерминантов устойчивости к юртетрапиклину штаммов S.aureofaciens S-197 и S -888, пред-, 'авляших дивергентные линии селекции. . Ранее в нашей лабора->рии было проведено клонирование детерминанта устойчивости к хлор-!трациклину /CtcR / из штамма . S.aureoraciens Ь-888 в составе фраг-!нта BatnHI размером 6,6 т.п.н. Рекомбинантная плазмида была обогнана pVG520. На основании рестрикционного анализа, предполагалось одство клонированного детерминанта устойчивости с геном ot^A-rtmosus . При сравнении рестрикционных карт клонированного фраг-нта ДНК штамма S-888 и Фрагмента ДНК, примыкавшего к гену oír А • rlmosus. слева, была обнаружена область ДНК в которой имеется про-вополояный порядок расположения сайтов узнавания для рестриктаз tll-EcoRI- SacI-EcoRI. На основании этого было выдвинуто предполо-аие об инверсии последовательности, примыкашей слева к гену ctrA сравнению с таковой в штамме S.rirriosits /Сезонов Г.В. и др.,1990/.

Рис.4 Авторадиограыма ДНК-ДНК гибридизации зонда - гена clrA в составе плазмиды E.colL pVG543 - с хромосомной ДНК штаммов S .Vimosus .обработанной рестриктззами BawHI и B£?.II совместно /I/ и Banffll /2/ и S .aure-oîaciens S-755,обработанной рестрик-тгзами BamHI а В fil совместно /3/ и BarcHI /4/. На дорожке 5 - ДНК íara i , обработанная рестриктазой HlrvdlII -

3

т.п.н.

23,1 9,4

6,6

4,4

2,3 2,0

6 9 CS С tgMSSm .«.И Д >

_U_ I otrA

ш

Л • *»l I Sm

PVQ520

SmHMíC 3 С А Ш _!,.

^—4—«— I tírA

тН

j I II-

гтппрпдл n ii'

ер л Alt л rvs s Smp S

Sm

pVCS3T

3

cirA

SvasHSSm Яг U Á 3 t кH3j

1ИИ-4-Ц— i i ,, j| I [

li

I

M t tr Sm Sm

I kb С

1_I

Тис.5 Вгетрчшионные карты BanHI-iparuenros ДНК втаююв S. RiMJSUS с геном oirA (А) я

S. AUR£CFACIE.4S 883 с геном otrA (В) (jjYCSZO); В<}Ш-фрагмента ДНК ¡¡шиша

S. AUREOTACIEMSS_<97 с геном еЬ-А «Л (pVG53I). A-Apal.B-BamHI.Bs-Sst EU.U-ífluI, E-EcoEX.K-Hindll i,B^-Ecl Il.Sm-ünal, S -SacI.P-Psil.K-Kpnl.ft-PYuII

Подтверждение этих предположений требовало уточнения структуры клонированного фрагмента ЛНК в составе плазмшда pVG520. *

Нами построена рестрикционная карта Ба\-лН1-фрагмецта плазмид pVG520 для рестриктаз MIuI,Apal.BstEII,Simal /рис.5/. Сравнение рестрикционных карт этого фрагмента EamHI и субклонироЕзнного г ctrA из штамма S-I97 обнаружило■их сходстео, которое Еырзжалос: присутствии идентично расположенных сайтов BawHI,Apal,MIuI.BstE области гена сirА штамма• S-I97 и правой части ВатН1-фрагмента , штамма 5-888. Таким образом, подтверждено предположение о лока. дии в правой части BaftHI-фрагмента ЛНК штамма 5-888 детерминан устойчивости к хлортетрациклину гена cirA. Следует отметить нал. сайтов SacI и Pstl в области гена ctrA шташа $-888 а их. отс; вие в соответствующем; районе гена ctrA штамма 5-197, а так же i ветстЕие в расположении сайтов PvuII aStoal.

Показано, что фрагменты БатЯЕ штаммов S-888 и 5-197, hi ' шие ген cirA, имеют одинаковый размер 6,6 т.п.н. Однако, внутри дого из фрагментов.обнаружены различия в расположении сайтов peí ции, указывающие на их структурные различия. Помимо сходства peí ционных карт и гомолог:*'/ ЛНК фрагментов, несущих ген círА, обна] но сходство рестривдн:7 > карт а гомология ДНК фрагментов Bc^-i;

rial расположенных слега от гена ctrA. Фрагмент Bç$II-Sm.aI в таве плазмиды pVG520 удален от гена ctrA на растояние 3,2 т.п.н., да как идентичный фрагмент Bç$II-S>msI в составе плазмиды pVG53I осредстЕенно примыкает к гену etг А. При этом фрагмент Bç^II-Svaal змиды pVG520 имеет инвертированное положение саитов узнавания для триктаз B^II-BstEII-Hlndlll-Svaal по отношен™ к положению этих тов'в фрагменте B^lll-Smal плазмиды pVG53I /рис.5/. ' Сравнительный анализ рестрикционных карт фрагмента EamHI плазми-pVG520 и последовательности ДНК S-tLmosus расположенной перед ом otvA в составе ЕатНЬ-фрэгмента указывает на наличие области : размером около 4,0 т.п.н., примыкающей слева к гену cbrA в которое ядок расположения сайтов узнавания рестриктаз EcoRI-SacI-EcoRI-II-Huvdni-Sfaal инвертирован.

Таким образом, подтверждено предположение о существовании инвер-: в фрагменте JHK, клонированном из штамма S.aureoîaclens S -888 сравнению с таковым из штамма S.aureoiacieus S-197.

Экспрессия гена ctrA ' S.aureo?acteos S-197 в клетках berlcKia coll. • С целью изучения экспрессии детерминанта ойчивости к хлортетрациклину гена clrA в клетках Е. colt на осно-репликона векторной плазмиды-pllCI9 сконструированы гибридные плазЫ pVG540, pVG543 и pVG54o. При этом плазмида pVG540 несет клони-анный B^II-фрагмент ЯНК штамма S.aureoiaci.etvs $ -197 размером О т.п.н. pVG543 представляет собой бирепликонную плазмиду s состав которой входят pUCI9 и pVG533. pVG545 получена как делецйонный вант плазмиды pVC540 после частичной рестрикции по сайтам Kprvl. Показано, что введение плазмиды pVG543 в клетки штамма E.coIl не приводит к изменению устойчивости этого штамма к хлортетрецик-у. 1Гтаммы E.colt TGI, несущие плазмиды pVG540 и pVG545, характерная повышенной устойчивостью'к хлортетрациклину.

Таким образом, ген сÏYA S.aureoîaclens S -197 не транскрибирует-в клетках E.coll с собственного промотора в составе фрагмента ЛНК uveobetefts рззмером 2,2 т.п.н. Однако, при введении гена ctrA в тки E.coll в составе более длинных-/ 21 и 16 т.п.н./ фрагментов

S.aureoîaciens , наблюдается его экспрессия. Следовательно справа гена ctrA лежит промоторная последоЕательность/и/ Streptomyces , :обная/ые/ функционировать в клетках E.colî, и влиять на транскрип-гена ctrA.

3.4 Идентификация гена raí г_5.aureo\ac'ienS

Проявление фенотипа TTUcR, обусловленное функционирование гена/ов/ rn.tr .выражается в одновременной устойчивости штамма к хлортетрациклину и макролидным антибиотикам. В связи с этим представлялось необходимым выяснение Еопроса о том не имеет ли клонированный ген сЪ"А функции гена . Получены данные о приобрете нии штаммами S.llvudans ТКБ4. и S .vlridochrcrno^cnes 1U494, несущи ми плазмиды серии pVG520 с геном clrA, одновременной устойчивости к хлортетраииклику, эритромицину и олеандомицшу, заставляющие пре полагать, что ген с\гА имеет функции гена wtr /рис.3/.

4. Использование метода УНК-ЛНК гибридизации для поиска генов, подобных mU- . у штаммов рода 'bfcV'epiom.vces .

Как уже упоминалось, у штаммовS.aureolaclens обнаружен феномен одновременной инпуцибельной резистентности к хлортетрацикш и макролидным антибиотикам, а также идентифицирован ген/ы/ п\Ъг / п.2,3.4/. Представляло интерес выяснение вопроса о-распространена tftir -подобных генов среди штаммов рода Strepíoroyces.

В качестве объектов исследования были выбраны три штамма:

5.vírnosus :. - продуцент близкородственного хлортетрациклину антиб* ткка окситетраадклина; стандартный штамм S.íivtdans. ТКБ4 и штамм S .viirídocWoroo^ents . 1\х494 - продуцент антибиотика биалафоса. Есе три штамма отличались низким природным уровнем устойчивости к эрдт-poMinyiHy и олеандомищшу . Штаммы 5. tlví-dans -ТКБ4 и S .viridochrcn cenes Tu494 характеризовались также и низким уровнем резистентности к хлортетрациклину. . '. * • .

... Для всех трех штаммов было показано,что устойчивость к хлор-■ тпацикдину,'эритромицину-и олеанцомиСину индуцируется при использ« eáffiz в качестве индуктора не только того антибиотика, резистентной

Рте. 6 Эхэогеням «пукни* jctomuocm ■ U4 глортетрашилш! (5 «г/и») * м*-I ролиаыа eai»<í«OT*«su:(E4 аритроиюод . (20 ют/ш) « (В.) олееаклшии/ ' (ico икг/ил) г гйш> s.tul¿bw ткба. Ш^гтори: X - «HUjrrop otcjícujet; 2 -ьгсртетриаиит (0,1 мхг/iu); 3 - эрятро-\ ucia (0,1 исг/м}; < - олеан поикала (0,3 к кг/ил); 5 - твое треотоа (0,1 ют/м) По оса ерлляя* - wjíe«тиност» pícceít.

горому индуцируется, но л Есех перечисленных антибиотиков .6/. При этом были отмечены следующие закономерности: в резуль-пндукпии возникали только фенотипически резистентные варианты; злее эффективным индуктором являлся тот антибиотик резистент-j к которому индуцируется; увеличение концентрация в среде ин-зра приводило к снижению уровня кндуцлбельнск устойчивости; . 5яотик тиострептон, неотнссящякся к поликегидным антибиотикам, злялся индуктором устойчивости к хлортетрациклину, эритрсмици-ги олеаняомпцину, что указывало на специфичность ЕзаимодеистЕия длинных антибиотиков и хлортетрапиклина с детерминантами устои-:тл изученных штатов.

с

Эти данные указывают на присутствие в геноме штаммов О .Vtmcais, Idato Т1(Р4 я S.virÜocKrcmo^uts Ta4S4 детерминантов устойчивости зртетрапиклину, эритромицину и олеанлсмицину, (¡ункцпонируюжлх 5яо гену/ам/ mtv 3.aarsoiacüeas . Возможно,что vair-подсб-'ены широко распространены среди штаммов рода Sbr ep'taryces. Низкий природный урогень устойчивости штаммов 5. li.vi.dan'> ТК64 , vindocurcmoQCvve'i Ta4S4 к хлортетраскклину, отсутствие инпупа-loü устойчивости к хлортетрапикляну при дозе индуктора в среде, шзицей 0,5 мкг/'мл, дают возможность использовать данные штаммы гестве штам-.-ов-реципиентоЕ" для молекулярного клонирования генов :чивостя к хлортетрагиклкну не только с конститутивным, но и с ибел&ным типами экспрессии.

'зк уже упоминалось, изучение санкционирования клонированного cir А заставляет предполагать, что он шест функции гена m'tr зло основание для использования гена cirA в качестве меченного для поиска генов подобных vntr -в хромосомах штаммов S.tirnosui, Celans ТК64 и S.vlridocbrovT.o^ewes Т«424. При использовании в гве зонда плазмиды pVc543, несущей ген сtri % .аигеотас\ель 7, гены, гомологичные гену cir.4,были обнаружены у всех трех зв ъЬгерижусес,, имехщих фенотип Ul'tcR. При этом го.мологич-зследовательностя локатизовагш у штамма $.n.vncsu«} в составе штов EamHI и Ee-nHI-EqiII размером около 8,0 л 3,2 т.п.н.,ссот-?енно, идентичным по размерам тем, в которых локализован ген Таким образом, у штамма S.rirncius функции гена mir ,па-видн-несет гея cir Л, имещяй сходную рестрякцпопнув карту к внсскул ib гомологии с геном с[)гА. 'Гомологичные гену cir Л соследсвзт^ль-лояэлязоЕааы в составе фрагментов ЕапШ а Е£?Л1 размером 2*4 л

3,0 т.п.несоответственно, у штамма S.itvicWj ТК64, а также в BsmHI я стух BjlH фрагментах ДШ штамма S ■ vindv<\\rorf1Cv\ev,e<> Tu' размером около 5,0; 6,0 я 3,6 т.п.н., соответственно. Интенсивно* положительного ответа при гибридизации IHK зонда с хромосомами штаммов S.UvtctaiVi TKF4 и S .NÜrl<focWcnft0^e*iftTu494 указывает на слабую гомологию генов vrtr этих птаммоЕ и гена ctrA.

Данные ЛИК-ДНК гибридизации о локализации гомологичных гещ ctrA генов в хромосомах штатов S.rlroosu'ä . S.UvicWv» ТК64 и S.YulclocWowo^eniis Tu4S4-на Ec^II- и ВэтН1-фрагментгх определе! ного размера дают основания для клонирования этих геноЕ в составе данных фрагментов ГНК к подтвердивши их функций как генов nvtr .

5. Изучение организации кластера генов биосинтеза хлоцтетгацикли

Клонирование генов устойчивости и биосинтеза антибиотиков в в слило показать, что у Есех изученных штаммов ген/ы/ устойчивости Физически сцеплены с генами биосинтеза, образуя единый кластер ге !? ряде случаев, в том числе и в случае кластера геноЕ биосинтезе оксг.тетрэциклинэ,' гены устойчивости фланкируют кластер генов бйос теза. Представлялось интересным провести анализ клонированных обл тей, прилегающих к гену ctrA, на наличие генов биосинтеза.

Возможность идентификации фрагментов JüHK с генами биосинтез; хлортетрацпклина исследовали, используя в качестве меченых зондов гены actl, actlll, actVil и аetil в составе плазмид E.coli рП234! PICJ234?, pFMIOO кр132334, соответственно. Гея actll является по: тквно действующим регуляторнкм геном, тогда как остальные.перечиез вые гены кодируют синтезы, участвующие в биосинтезе поликетидного антибиотика аитинородина на ранних■этапах. Они могут быть кепользе Еаны как универсальные гибридизапионные зонды для идентификации kj теров генов биосинтеза у продуцентов поликетидных антибиотиков. Ге длззцкю меченого зонде проводила с . плазмидами Slreptotr^ces pI37C2,pYG520, pYG530 и ее целеционными вариантами. pVG533 и pYG53I слот-тесте, а также методом. Саузерн-гябрлдизации с плазмицой pVG5 обработанной рестриктезой Kpnl и ллззмидой pYG520, обработанной ре тгиктазой Fstl. Летально'данные ЛНК-ШК гибридизации обсуждены в диссертационной работе.

Показано, -что в плазмиде pYG520, несушей ген ctrA и примыкавд; к нему слева инвертированную последовательность ЛКК штамма $.аип ■ticiens $ -8SS, нет генов, гомологичных генам a'ctl, actll, actlü

itVII.

Сумарные данные о структуре кластера генов биосинтеза хлортет-[клина, полученные в данной работе, представлены на рис.7.

гомологичные геном actl, actlll и actVH, обнаружены нами в !ой частя фрагмента BollI S.aureoiacienb на значительном [еняи от гена ctrA, расположенного в лзеом конце фрагмента SqiJll, 1йал;гзог:аны б последовательности acini, actl и ectYII. Интересно тять, что в геноме итамма S.fuwjsus гены, гомологичные генам !, act.HI, actVlI также локализованы в Прагой части кластера в биосинтеза окситетрапиклянэ на большом удалении от гена сЪ~Л, логичного гену ctrA > и тесно примыкают к гену otvE, фланкирус-кластер генов биосиктвза окситетрациклина справа. Однако сле-отметкть другой порядок расположения изучаемых генов, а тленно II, actVII, acil, по сравнению с таковым в хромосоме S.aureo-ens . В тоже Еремя, порядок расположения данных генов в хрсмосс-3 .aureotaciens , а именно acllll, actl, actvil, совпадает с их жением в кластере геноЕ биосинтеза поликетидного антиолотика нороцинэ в штамме 3 .coellcolor АЗ/2/. Полученные нами данные •кают на то, что гены биосинтеза хлортетрапиклина у атзммя reoiacCeris образуют кластер подобный кластеру генсв биосинтеза гетрапиклина S-rurosu^ •

Важно отметить, что в кластере генов биосинтеза хлортетрациклина за от гена с\г& нами локализован ген, гомологичный регуляторнсму actll. В доступной нам литературе отсутствуют данные о наличии , гомологичного гену actII, в составе кластера генов биосинтеза тетрациклина. •

i

I

26 т.п.н. VI

В.

JUL

в, ,в

В2'

2"? т.п.н. otr А

II

._, I т.пл

^ m i vn IV В. ? ■ ■

TIT v VIТ I о1

. ИГ.г-ГГЯ . SE3J №HK53B5E3 -

2 s ' eg s ]

21 т.п.н.

cV А . П

.. Si Вз Si Pe • Ц

К5 кт к8

гаа^йч

S« Рц ' С-.

I VII

Pi-ic.7 Рестрикционные карты кластеров генов биосинтеза актино] дина S.coelicolor АЗ/2/ /A./ZMalpartida F. et-al,198i окситетрацшшша S.riwosus /E.//Butler et а1,1989/ и часз кластера генов биосинтеза хлортетрациклина S .aureotaci-ew«. /В. указанием районов локализации генов биосинтеза актинорояина /а acxll, actIII, acilV, sctv , actvi, actvil /, генов биосинтеза окситетрациклина, гомологичных генам actl, actlll, aclv , actv /Б./ , генов биосинтеза хлортетрациклина, гомологичных генам а actll, actlll, adVII /В./, -а также генов устойчивости к оксит рациклшу Mr A, oWb/ и хлортетрациклину Mr А/. j?-Baii,HI, S- SacI, Бо-В^II, K-Kpnl, P-Fstl ■ + - ген, гомологичный гену actlll, расположен в "области ЖК, ЯяанкироЕанной слева сайтом Kpnlg, размером около 6,6 т.п.н.

А

вывода

Проведено сравнительное генетическое изучение штамма 5 .eure-отас\.еу\ь Т&-633£7 / S-755/ и его мутантов в отношении функ-онирования гена/ов/ ут^г , обеспечивающего ияяуцибельнув устои-еость к эндогенному антибиотику хлортетрациклину и экзогенным кролидным антибиотикам. Показано,что мутанты ¿-187 и 5-157 ест конститутивный уровень устойчивости одновременно к хлортет-анкляну и макролидным антибиотикам. р

Клонирован протяженный фрагмент ДНК хромосомы S.aureovacienS S-I97 размером 21,0 т.п.н., несущий детерминант устойчивости ¡слортетрациклшу ген cirA. '''..• Субклонирован ген сЬ~А в составе фрагмента ЛНК размером 2,2 т. п.н.,показана его экспрессия в реципвентных штатах Strepto-зе5 и в EscUevLclvCa coll . 3 опытах по ДНК-ЛНК гибридизации и при сравнении карт рестрикции установлена гомология генов ehr А двух дивергентных линий селек- . :i S.auceoiaclens S-I97 и . S-888 а хена ota А ' 5 .Vtwosvte' . клонированном фрагменте ДНК штамма $-888 идентифицирована иивер-? размером около 4,0 т.п.н.,-примыкающая к гену cVr А. Показано, что клонированный ген cilrA : S.aureo?acie^S имеет

■ функции гена wir . Генетические данные и результаты ДИК-ЛНК 5ридизации с использованием в качестве зонда гена cWi указывают присутствие генов, гомологичных гену тлЬг , в штаммах S.Vi.'mo^ , .UvÜavvb ТКБ4 и S-.vlYi(JocV>romo^fnöTu494. .' ■ '

■ Данные экспериментов по ДНК-ШК гибридизации с использованием

е качестве зондое ранних генов биосинтеза поликетидного антибио-:з актинородина actl, set III .aciYll, кодирующих поликетидсинтазы, ■акже гена-регулятора . аetil . позволили идентифицировать и лока-овггь гомологичные гены в составе клонированного .протяженного т.п.н./ Фрагмента ДНК S .aureofacienvS-197, несущего ген cirA. ■данные укззыеь.от на локализацию идентифицированных генов резис-тлости и биосинтеза хлортетрациклина е составе единого кластера, рннтельный анализ структур кластеров геноЕ биосинтеза поликетид-антибиотиков хлортетрациклина, окситетрацикляна и актинородина зывает на сходстго е расположении изученных генов, контролирующих, яие этапы, биосинтеза. "

7. Получен штамм-продуцент хлортетрациклина 3.аигеотас\ еу\в 8-197, характеризующийся по сраЕнению со штаммами $-755 и 5-187 повышенным урогнем накопления антибиотика, повышенной стабильностью по признаку антнбиотикообразоЕания, расширенны.! спектром утилизации углеводов. -■

£. Разработаны методы образования и регенерации протопластов для штаммов-продуцентов хлортетрагиклина 5.аигеотассегл ¿-755, 5-187 И 5-197.

/

'СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации •

Исаева Л. М. , Воейкова Т. А. Разработка системы протопластирования у штаммов Streptomyces aureofaciens -продуцентов хлортетрацикли-на. Антибиотики и химиотерапия, 1990, т. 35, N12, 25-29. Исаева JL М. , Воейкова Т. А. , Косова С. И., Емельянова JL К. , Ломовс-кая К Д. Штамм Streptomyces aureofaciens -продуцент хлортетра-циклина. Заявка в СССР N 4826516 от 17.05.90. Положительное решение 19.02.91.

Сезонов Г.Е, Исаева- Л. М., Ломовская Н. Л- Молекулярное клонирование гена резистентности к хдортетрациклину из штамма - продуцента Streptomyces aureofaciens. Антибиотики и химиотерапия, 1990, т. 35, N12, 7-11.

Isayeva L. f.i , Voeykova Т. А. Formation and regeneration of protoplasts from industrial' producers of Chlortetracycline Streptomyces aureofaciens as • a step in • selection for high-yielding strains. Intern. Symp. Genetics a Product Formation in Streptomyces, 1990, Erfurt, German Democratic Republic, Abstr., 11.

Isayeva L. M. , Voeykova T. A. Comparative molecular-genetic characterisation of Streptomyces aureofaciens strains - the producers of Chlortetracycline. 7th Nat. Conference on Production and Using of Antibiotics, 1990, Razgrad, Bulgaria, 60. - .

Isayeva L. M. , Voeykova T. A. Determinants of resistance to Chlortetracycline: genetic characterization and peculiarities of expression. 7th Intern. Symp. on metabolism and enzymology of nucleic acids, including gene and protein engineering. 1990, Smclenice Castle, Czechoslovakia, Abstr. 11«

Lomovskaya N. D. , Emelyanova L. K. , Isayeva L.M. , Klochkova 0. A. Mkrtunuan N. hl , Sezonov G. Y. Genetic characterization, cloning and effect on Chlortetracycline biosynthesis of tetracycline resistance determinants. Intern. Symp. Genetics a. Product Formation in Streptomyces, 1990, Erfurt, German Democratic

- zk-

Republic, Abstr. , L6. '

8. Lorovskaya N. D. , Isayeva L. M. . Klochkova 0. A., Biryukova I.V. Chinenova T-A. , Voeykova T. A. , Emelyanova L. K. , Sezonov -G. V Genetical characterization and -identification of Stresptcmyce aureofaciens resistance determinants. 7th Nat. Conference o Production and Using of Antibiotics,.. 1990,. Basgrad,-Bulgaria,- S

9. Lomovskaya N. D. , Sezonov G. V. , Isayeva L. M. , Chinenova T. A Genetic characterization and cloning of genes fo. ehlortetracycline resistance in Streptomyces aureofacien: strains. In: Proceedings of Intern. Symp. Genetics a. Prcdud Formation m Streptomyces, 1990, Erfurt, German Democrat i< Republic, in press. .

10. Lomovskaya N. D., Isayeva L. M., . Sezonov G. V. , Chinenova T. A. , Voeykova T. A., Klochkova 0. A. , Biryukova I.V., Emelyanova L. K. Streptomyces aureofaciens strains - the producers oi chlortetracycline: genetic , characterization and cloning oi

• determinants for resistance to antibiotics. In: , 'Genetic engineering of antibiotic producers. Moscow, 1991, in press.

11. Lomovskaya N. D. , Sezonov G. V. , Chinenova T. A. , Isayeva L. M. , Vceykova T. A. Characterization and cloning of Streptomyces aureofaciens resistance determinants. UCLA Symp. on Molecular and Cellular Biology, J. Cell.' Biochemistry, 1990, 118...

12. Lomovskaya N. D. , Sezondv G. V., Chinenova T. A., Isayeva L. M. , . Voeykova , I. A.'.' Characterization and ■cloning of Streptomyces

aureofaciens nttr. gene(s) for irailtipie .inducible resistance - to aaacrolides and1,';chlortetracycline.. 6th- Int. Symp.-. on Genet. Industr. " Microorg. ; August, 1990, Strasburg, France, 93.

13. Sezonov G. V. „•:';■ Isayeva L. M. ,. \ Lomovskaya N. D. : Cloning of antibiotic resistance determinants in Streptomyces aureofaciens

. strains - ths producers of chlortetracycline.- 7th -Nat. Conference ' cn ' Production and Using of / Antibiotics, 1990, Rasgred, Bulgaria,"58»: — . ~ ''.. ...',.. v "■■■_":