Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ генов, контролирующих образование азотфиксирующих клубеньков у бактерий Rhizobium leguminosarum VF39

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ генов, контролирующих образование азотфиксирующих клубеньков у бактерий Rhizobium leguminosarum VF39"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК: 579. 25:579.222

САДЫКОВ МАРАТ РАФАЭЛЬЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ОБРАЗОВАНИЕ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ КЛУБЕНЬКОВ У БАКТЕРИЙ ДАкоЬшт /ецит/по^агит УЕ39

03.00.03 - Молекуляоная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории структурно-функционального анал! генетических систем микроорганизмов Института биохимии и физиолог микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук

Т.В. Ивашина

кандидат биологических наук В.Н. Ксензенко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор C.B. Каменева доктор биологических наук, профессор Н.И. Матвиенко

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится "2.^" 1998 г. в /0 час. на заседаш

Специализированного ученого совета Д.053.05.70 при Московском государственнс университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГ' Биологический факультет, лабораторный корпус А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

В.Н. Каграманов

Актуальность темы. Азотфиксирующий симбиоз клубеньковых бактерий с юбовымн растениями является удобной моделью для изучения различных .аспектов ;заимодействия про- и э>карнотических организмов, таких как специфическое узнавание имбионтов, индукция и морфогенез клубенька, и, наконец, фиксация молекулярного азота. ]рименение современных методов молекулярной биологии и генетики позволило сгановить, что в основе симбиотических взаимоотношений лежит обмен сигналами между имбионтами, приводящий к координированной экспрессии целого ряда генов как у астений гак и у микроорганизмов. К первым сигнальным факторам относят актериальные липохнтоолигосахариды (Ncd-факторы) и растительные флавоноиды. 1менно их синтез определяет специфичность взаимодействия и индукцию ифференцировки растительных клетокна ранних этапе,х симбиоза.

К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал, видетельствуюший о том, что в процессе формирования сгмбиотических систем частвуют различные классы полисахаридов ризобий. Особая роль в этом процессе i водится кислым экзополисахарпдам (ЭПС). Предполагается, что они могут пособствовать прикреплению ризобиальных клеюк к поверхности корневого волоска, частвовать в образовании матрикса инфекционных нитей, предохранять бактерии от пцитных реакций растения-хозяина и физиологического стресса, обуславливать тецифпчность взаимодействия микро- и мгкросимбионюв. Более гого, пзкомолекулярные фракции ЭПС, по-видимому, можно рассматривать как сигнальные акторы, обеспечивающие успешную инвазию клубеньков бактериями и развитие ютфиксирующпх бактероидов. Необходимо отметить, что имеющаяся в настоящее время [формация о роли ЭПС в симбиозе базируется в основном на изучении симбиогичепсоп ютемы Sinorhizobium meliloti - Medicago sativa. Данные о генетическом контрол; юсинтеза ЭПС у других ризобий весьма малочисленны и фрагментарны. Однако в >следнее время появляется все больше сведений о том, что закономерности, выведенное i основании изучения только указанной модельной системы, не носят универсальною [рактера. Следует также отметшь, что даже в случае симбиоза S. mclüoti u М. sativa пекулярные механизмы специфичности и сигналннга с участием ЭПС далеки от своего 1яспения.

Данная работа посвящена изучению генетического контроля биосинтеза ЭПС у убеньковых бактерий Rhizobium leguminosantm. Выбор этого объекта исследований был ¡условлен следующими обстоятельствами. Во-первых, данный вид ризобий является асспческим объектом, на котором были получены основные результаты, касающиеся >лекулярных механизмов формирования симбиоза. Во-вторых, как и в случае S. meliloti,

образование клубеньков на растениях идет по недетерминированному типу и, ка] полагают, зависит от синтеза ЭПС. Кроме того, нарушения в синтезе ЭПС у выбранноп нами штамма R. /. bv. viciae VF39 по-разному влияют на характер взаимодействия i растениями-хозяевами. Следовательно, данный объект является удобньш для изучен!! вопросов, связанных участием ЭПС в детерминации специфичности симбиоза.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось идентификация i проведение детального структурно-функционального анализа генов, контролирующи: биосинтез ЭПС у R. I. bv. viciae VF39. Исходя из этого, в работе последовательно ставилис: следующие конкретные задачи:

1) Локализовать и клонировать область генома штамма R. I. bv. viciae VF39 содержащую генетический локус биосинтеза ЭПС.

2) Определить нукпеотидную последовательность генов биосинтез; экзополисахарида и изучить экспрессию индивидуальных генов в клетках Е. coli.

3) Изучить влияние мутаций в индивидуальных генах pss на продукцию кислоп экзополисахарида у R. I. bv. viciae VF39.

4) Клонировать и определить нуклеотидную последовательность гена pssB R. I. bv viciae VF39.

5) Изучить роль гена pssli в свободноживутцих клетках ризобий и в процесс' формирования симбиоза.

Научная новизна работы. Полученные в ходе данной работы результаты нося' приоритетный характер. Идентифицирован новый кластер генов биосинтез; экзополисахарида у R. I. bv. viciae и определена их нуклеотидная последовательность. Н; основании выявленной гомологии белковых продуктов pss-генов с непроцессивным1 гликозилтрансферазами, а также фенотипического проявления мутаций, подтверждеш участие семи из идентифицированных генов в биосинтезе ЭПС. Клонирован i секвенирован ген pss В R. I. bv. viciae. Показано, что продукт этого гена может быть отнесе! к семейству белков про- и эукариотического происхождения, гомологичны: инозитолмонофосфатазе млекопитающих. Получены экспериментальные доказательств; того, что ген pssB не участвует в процессе биосинтеза ЭПС, как ранее предполагалоа Бортакуром и соавт. (Borthakur et al., 1988), а представляет собой неидентифицнрованньп ранее fix-ген.

Практическое значение работы. Настоящая работа относится к числ; фундаментальных исследований. Однако, учитывая тот факт, что использовани! клубеньковых бактерий в практике сельского хозяйства является экологически чистьм i высокоэффективным способом внесения азота в почву, понимание молекулярные

?хапизмов функционирования азотфиксирующих симбиотических систем может юсобствовать конструированию хозяйственно-полезных штаммов клубеньковых жтерий, в частности, штаммов с повышенной конкурентоспособностью и расширенным >угом инфицируемых бобовых. В связи с этим, особое значение для разработки методов шструирования приобретают исследования по изучению генетического контроля юсинтеза различных классов полисахаридов у ризобий, а также выяснению их истинной >ли в формировании азотфиксирующего симбиоза.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на :ждународных и Всероссийских конференциях: 1st European Nitrogen Fixation Conference id Workshop on "Safe application of genetically modified microorganisms in the environment" ^егед, Венгрия, 1994 г.), 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995 г.), lh International Congress on Nitrogen Fixation (Санкт-Петербург, 1995 г.), "Биосинтез и :градация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты" (Пущино, >95 г.), 2nd European Nitrogen Fixation Conference and NATO Advanced Research Workshop Jiological fixation of nitrogen for ecology and sustainable agriculture" (Познань, Польша, 1996 ), втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997 г.), П открытой городской !учной конференции молодых ученых г. Пущино (Пущино, 1997 г.), а также на ежегодной ;ссии Ученого Совета ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, посвященной подведению итогов жкурса научных работ (Пущино, 1996 г.).

Публикации. Основное содержание работы изложено в пяти статьях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, атериалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка ¡пользованной литературы. Диссертация изложена на страницах машинописного

:кста, содержит рисунков, таблиц и два приложения. Список цитируемой

1тературы включает источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Клонирование, определение и анализ нуклеотидной последовательности генов биосинтеза экзополисахарида.

К началу данной работы в лаборатории структурно-функционального анализа нетических систем микроорганизмов методом "случайного" мутагенеза с использованием >анспозона Тп5 был получен набор мутантов R. !. bv. viciae VF39 с нарушенным синтезом мтсахарида. В отличие от штамма дикого типа, эффективно инокулирующего растения V. itiva, V. faba и Pisum sativum, два мутанта (Muc2 и Мисб) характеризовались полным

нарушением процесса нодуляцнн в симбиозе с V. faba (фенотип Muc~Nod"), но сохранял] способность инокулпровать V. sativa (Muc'Nod*).

На первом этапе работы с целью идентификации генов биосинтеза ЭПС тотальнун ДНК, выделенную из мутантных штаммов, гидролизовали эндонуклеазой рестрикцш ВатНI и полученные фрагменты клонировали в векторе pBluescript П KS. Рекомбинанть селектировали по устойчивости к ампициллину и капамицину для отбора клонов содержащих участок транспозона TnJ с прилегающими к нему последовательностям! геномной ДНК. Полученные рекомбшюнтные нлазмиды pVF/Muc2 и pVF/Muc( использовали в качестве ДНК-зондов в экспериментах по блот-гибрндизации с тотально! ДНК штамма \Т39 дикого типа, гидролизованной различными рестриктазами. Был< показано, чго инсершш Тп5 в случае обоих мутантов расположены в пределах ВатШ фрагмента размером 6,2 т.п н. Идентифицированный фрагмент был клонирован в вектор< pBldesciipt 11 KS и обеих ориентациях. Частичное секвенирование участков ДНК прилегающих к инсерциям транспозона, и последующий компьютерный анашг нуклеотидной последовательности позволили идентифицировать две ОРС (обозначены Kai гены pssE и pssD), продукты которых обнаруживали гомологию с рядол ьтикозилграпсфераз. Характер расположения этих ОРС указывал на то, что сш представляют собой дистальиую часть более протяженного кластера генов. Поэтому, i дальнейшей работе было проведено клонирование и секвенирование участков ДНК расположенных проксимально по отношению к генам pssE и pssD. В результате был,-определена нуклеотндная последовательность ХМ-ММ-фрагмента ДНК длиной 7181 п.н. (GenBank Accession number AF028810). Компьютерный анализ этой последовательности выявил дополнительно (к двум отмеченным ранее) еще шесть ОРС, обозначенных как гены pssС, F, G, Н, I и orfiS (рис. 1). Потенциальные стартовые кодоны трансляции ОРС были локализованы на основании наличия последовательности Шайна-Дальгарно, а также по результатам экспрессии генов pss в системе промотор/РНК-полимераза фага Т7. Сведения о всех обнаруженных и секвенированной области ОРС приведены в табл. 1. Во всех случаях на каноническом расстоянии перед потенциальными инициирующими кодонами трансляции обнаружены сайты связывания с рибосомой. Наблюдается перекрывание терминирующих и инициирующих кодонов трансляции в парах генов pssG-pssF, pssF-pssC, и pssD-pssE, чго может свидетельствовать о сопряженной трансляции соответствующих ОРС. Межгенные области длиной 83 п.н., 171 п.н., 82 п.н. и 209 п.н. обнаружены соответственно между orfS н pssl,pssl и pssH,/MíH и pssG, а также pssC и pssD. Однако нам не удалось выявить в указанных областях потенциальных промоторов и терминаторов транскрипции, что может свидетельствовать в пользу считывания всех генов кластера в

= - > Я >

т: чз ~ ей р£ 02

и i n io^-; ' со

I \ ! / / II/ !

-I orfS p\\I —I pssG pssF риС —| риГ^рюЕ^-

Рис. 1. Организация генов биосинтеза ЭПС у К. I. Ьу. \4ciae УР39. В верхней части рисунка приведена рестрикционная карта Л7ю1-ЛЛгЛ-фрагмента ДНК. Расположение генов и их направление транскрипции отмечено стрелками. Инсерции транспозона Тп5 и Кшк-кассеты отмечены соответственно как Д и I.

виде единого транскрипта. Следует отметить, что полицистронная организация генов, участвующих в биосинтезе полисахаридов, характерна для многих микроорганизмов, например, ехо- и егр-генов S. meliloti (Glucksmann et al., 1993; Becker et al., 1997), с/и-генов Streptococcus pneumoniae (Kolkman et al., 1997), gum-генов Xanthomonas campestris (Harding et al., 1995) и, по-видимому, огражает необходимость их координированной экспрессии в чоде биосинтеза полимера.

2. Локализации кластера генов pss у R. I. bv. viciae VF39.

Посколгку штамм R. I. bv. viciae VF39 содержит плазмиды [шесть плазмид с молекулярными массами 150, 220, 275, 330, 500 и 600 т.п.н. (Hynes, McGregor, 1990)], тредставлялось целесообразным выяснить, какую локализацию, плазмидную или <ромосомную, имеет идентифицированный нами кластер /и$-генов. Локализацию троводили с помощью блот-гибриднзации. Как видно из рис. 2, с ДНК-зондом пбридизуется фрагментированная хромосомная ДНК. В то же время, мы не наблюдали ибридизации ни с одной из плазмид данного штамма. Аналогичные результаты были юлучены в экспериментах, в которых в качестве ДНК-зонда была использована ¡лазмидная ДНК, содержащая ранее идентифицированный в нашей лаборатории ген ¡иосинтеза экзополисахарида pssA (данные не приведены). На основании полученных >езультатов может быть сделан вывод о том, что в отличие от S. meliloti (Long et al., 1988; jlazebrook, Walker, 1989) и Rhizobium sp. S-2 (Pandya, Desai, 1998), гены биосинтеза ЭПС у i. I. bv. viciae VF39 расположены на бактериальной хромосоме.

Таблица 1. Результаты компьютерного анализа ОРС, обнаруженных в нуклеотидной последовательности (н.п.) А7ю1-М.'и1-фрагмента ДНК Я. 1. Ьу. утае \Т39.

ОРС Предполагаемый сайт связывания с рибосомой1 Расположение в н.п. Длина (в а.к.) М, (в кДа)

начало2 конец3

orfS ATCAGGAGGTAATTCGATCACA 97 915 273 31,0

pss I CAAGAGGGTTGATAACTGATGTCG 1002 1943 314 35,6

pssll TCCGGAGCATCACATGAGC 2118 3083 322 36,0

pssG GTCAGGAGGCGAGTGGGT 3169(3118) ' 4149 327 36,:

pssF CGCAGGAGGTCGTGCATTGAAT 4149(3501) 5030 294 32,1

pss С TGCGGAGAGGACAGTCATGAAT 5030 6007 326 37,1

pss D TATAGGAGATGCCTGTTTATGACT 6220(6148) 6675 152 16,4

pss£ CGCAGGAGCTGTCCTTTGATC 6675(6624) 7148 158 17,4

' - сайты связывания с рибосомой подчеркнуты, стартовые кодоны выделены жирным шрифтом. 3 - положение кодона инициации трансляции в н.п. указано на основании наличия расположенного на каноническом расстоянии сайта связывания с рибосомой, а также результатов по экспрессии генов в клетках Е. coli (см. рис. 3); в скобках указано положение первого в ОРС инициирующего кодона ATG или GTG.

3 - указано положение З'-концевого нуклеотидного остатка в ОРС без учета терминирующего кодона.

3. Экспрессия генов pss в клетках Е. coli.

Для подтверждения кодирующих свойств обнаруженных ОРС были проведены эксперименты по экспрессии генов pss в клетках Е. coli в системе "промотор/РНК-полимераза фага Т7". В опытах использовали набор рекомбинантных плазмид, сконструированных на основе транскрипционного вектора рТ7-5 и содержащих фрагменты ДНК с индивидуальными /uj-генами. В результате была обнаружена экспрессия всех идентифицированных ОРС (рис. 3). Молекулярные массы синтезируемых белков оказались близкими к расчетным (табл. 1), что свидетельствует в пользу правильности локализации инициирующих кодонов трансляции в ОРС. Обращает на себя внимание относительно

P>3 А

"<вВЯ| Рис. 2. Локализация кластера генов

биосинтеза экзополисахарнда у Л. / Ьу. \iciae \Т39. Клетки бактерий лизировалн в лунках 0,6 % агарозного геля, содержащего 0,05% ДДС-Ыа. и полученные лизаты разделяли электрофорезом в течение 6 часов при 4°С и напряженности поля 5 В/см. (Л). ДНК переносили из геля на нейлоновые |ЯЯ| фильтры, гибридизовали с '"Р-меченнон

плазмидной ДНК, содержащей клонированные гены/изЕ и /мЮ, и фильтры радиоавтографировалн (Б). Стрелками указано положение плазмпд (а. Ь. с. с1, е и 0 и хромосомной ДНК (х).

1 2 3 4 5 6 7 8 9

PsbC PssII PssG Pssl PssF ORF8

кДа 43.0

30.0

Pssl: PssD

20.1

14.4

Рис. 3. Экспрессия генов pssl, H, G. F, C. D. E и orfS в системе "промотор PHK-полимераза фага Т7". Белки, кодируемые генами orf8. pssl. 11(1), orfB (2), pssll (3), pssG (4). pssF (5), pssF, С (6), pssC, D. E (7), /«sD (8) и pssE (9). разделяли электрофорезом в 15% ПААГе, содержащем 0,1 % ДДС-Na с последующей радноавтографией геля. Положения белковых маркеров указаны стрелками в правой части рисунка.

высокий уровень экспрессии всех pss-телов, что указывает на эффективное использование белоксинтезирующим аппаратом Е. coli трансляционных сигналов ризобиальных генов.

При этом следует огметигь. что экспрессия дмсталыю расположенного гена в паре взаимоперекрывающихся генов pssO-pssli зависела от трансляции проксимально расположенного гена.

4. Компьютерный поиск белков, гомологичных продуктам ргс-генов.

Сравнение аминокислотных последовательностей продуктов /Ms-генов с базами данных белков (SwissProt/PIR/GenPept) выявило наличие гомологии с гликозил-трансферазами из различных источников для семи из восьми идентифицированных в данной работе генов (табл. 2). В случае продукта orfS достоверной гомологии с какими-либо известными белками обнаружено не было. Следует отметить, что гены pssC, pssD и pssE R. /. bv. viciae VF39 имеют свои аналоги в штаммах R. I. bv. trifolii и R. I. bv. phaseoli (Van Workum et al., 1997; GenBank Accession numbers: AF014054, Y12758). Высокий уровень гомологии и даже идентичность продуктов соответствующих генов в указанных бактериях была вполне предсказуема, поскольку все они синтезируют экзополисахарид, не отличающийся по своей структуре.

Известно, что по крайней мере у ризобий гликозилтрансферазы, участвующие в едином пути биосинтеза ЭПС, в основном высокоспецифичны и имеют довольно низкий уровень гомологии аминокислотных последовательностей. В этой связи следует отметить, что нами был выявлен достаточно высокий уровень гомологии аминокислотных последовательностей PssI и PssG (67%), а также гомология между PssG и PssH (28%) и PssH и PssI (31%). Эти данные могут свидетельствовать в пользу того, что отдельные ферменты пути биосинтеза ЭПС у R. Icguminosarum по-видимому не обладают строгой специфичностью, и, следовательно, могут быть взаимозаменяемыми, как, например, было предположено в случае гликозилтрансфераз ЕхоО и ExoU S. meliloti (Glucksmann et al., 1993).

Как видно из табл. 2, продукты /Mi-генов обнаруживают довольно низкий уровень гомологии с другими известными гликозилтрансферазами. Однако множественное выравнивание их аминокислотных последовательностей позволяет выделить консервативный домен (рис. 4), характерный для непроцессивньгх гликозилтрансфераз, которые переносят остатки Сахаров с а-нуклеозиддифосфатсахаров на соответствующие акцепторы с образованием р-гликозидной связи (Saxena et al., 1995). Интересно отметить, что положение консервативных участков у белков практически совпадает, что, возможно, связано с их функциональной значимостью, и позволяет предположить, что аналогичную функцию выполняют и продукты исследованных нами генов.

Таблица 2. Результаты поиска белков, гомологичных продуктам генов pss.

Продукт Гомологичный Организм Гомология Функция гомологичного белка Ссылка

гена pss белок %

PssE EpsF Lactococcus lactis cremoris 27 гликозилтрансфераза (Van Kranenburg et al., 1997)

PssD SpsK Sphingomonas S88 32 гликозилтрансфераза (Yamazaki et al., 1996)

PssC ExoM S. meliloti 27 [}-1 Д-глюкозилтрансЪераза (Glucksmarm et al., 1993)

PssF SpsA Synechocystis sp. 32 участие в биосинтезе спорового полисахарида (Kaneko et al., 1996)

PssG PssI R. 1. bv. viciae VF39 67 гликозилтрансфераза данная работа

PssH R. 1. bv. viciae VF39 28 гликозилтрансфераза данная работа

ExoM S. meliloti 21 /}-1,4-глюкозилтрансфераза (Glucksmdnn et al., 1993)

PssH PssI R. 1. bv.viciae VF39 31 гликозилтрансфераза данная работа

MigA Pseudomonas aeruginosa 19 гликозилтрансфераза (Wang et al., 1996)

PssI ExoM S. meliloti 19 Р-1,4-глюкозилтрансфераза (Glucksmann et al., 1993)

1 - Уровень гомологии в % идентичных аминокислот в последовательностях белков при их оптимальном выравнивании.

р с; с р

PSSE PSSG PSSH Р S S I Ел ОМ ЕХОО Ел О U EXOV

Консенсус

VD S Г)

G

LD D

Р L

Рис. 4. Множественное выравнивание гомологичных участков в аминокислотных последовательностях белков PssC, PssF, PssG, PssH и PssI из R. I. bv. viciae VF39 и гликозилтрансфераз ExoM, ExoO, ExoU и ExoW из S. meliloti. Выравнивание проводили с помощью пакета программ "GeneBee" (Бродский и др., 1.991). Идентичные аминокислоты представлены на черном фоне, однотипные - на сером. В нижней части рисунка приведены консервативные аминокислоты, представленные более чем в 2/3 белков.

Особо следует остановиться на характеристике продуктов генов pssЕ и pssD. Их аминокислотные последовательности гомологичны соответственно гликозилтрансферазе Cpsl4F и галактозилтрансферазе CpsMG, участвующим в синтезе капсульного полисахарида у S. pneumoniae (Kolkman et al., 1997). Кроме того, PssD гомологичен N-концевому участку гликозилтрансферазы SpsK Sphingomonas S88, a PssE - С-концевой последовательности этого же белка (Yamazaki et al., 1996). Указанная гомология обнаруживается не только при сравнении аминокислотных последовательностей, но также и при анализе профилей гидрофобности указанных белков. Таким образом, можно полагать, что у разных организмов гликозилтрансфераза, выполняющая одну и ту же функцию, может существовать либо в виде единого полипептида, либо состоять из двух различных субъединиц. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что PssD и PssE, также как и Cpsl4F и Cpsl4G, представляют собой небольшие белки с молекулярными массами в пределах 16-17 кДа, тогда как подавляющее большинство идентифицированных к настоящему времени гликозилтрансфераз имеют большие размеры. Интересно также отметить, что гены pssD и pssE, как и cps\AV и cps 14G, перекрываются соответственно своими кодонами терминации и инициации трансляции. Часто такое расположение генов характерно в случае кодирования различных субъединиц одного и того же фермента. Дополнительными свидетельствами в пользу предположения о гетеросубъединичной организации гликозилтрансферазы PssD/PssE могут служить данные

о характере экспрессии соответствующих генов в клетках Е. coli (см. выше), а также эксперименты по комплементации мутаций в гене 5/мК Sphingomonas S88 плазмидой, содержащей гены pssD и pssE из R. I. bv. trifolii (Pollock et al., 1998).

В настоящее время полагают, что биосинтез ЭПС у ризобий происходит на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны с участием большого количества белков, объединенных в единый мультиферментный комплекс (Glucksmann et al., 1993). В подтверждение этому для целого ряда гликозилтрансфераз биосинтеза ризобиальных ЭПС была показана их внутримембранная локализация. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей продуктов pis-генов R. I. bv. viciae VF39 также выявил наличие потенциальных трансмембранных доменов у некоторых из них: двух в случае PssD и по одному - у PssC, PssG и PssH.

5. Введение мутаций в геныpss и тестирование мутантных штаммов на способность синтезировать ЭПС.

Как указывалось выше, инсерции транспозона TnJ у мутантов Мис2 и Мисб были локализованы соответственно в генах pssE и pssD. Мутантные по генам pssC, Е, G, Н и I штаммы получали методом интерпозонного мутагенеза. На первой стадии Ктк-кассету встраивали in vitro в уникальные сайты эндонуклеаз рестрикции, локализованные в последовательностях указанных /ил-генов. Источником кассеты служила плазмида pUC4K. Положение Ктк-кассеты в генах pss указано на рис. 1. На следующей стадии фрагменты ДНК, содержащие мутантные аллели генов, были клонированы в мобилизуемой плазмиде pJQ200KS (GmR), неспособной реплицироваться в клетках ризобий (Quandt, Hynes, 1993). Наличие в векторе гена sacB Bacillus subtilis позволяло проводить (на средах с сахарозой) прямую селекцию клонов, возникающих в результате гомологичной рекомбинации. Факт замещения дикой копии гена на его мутантный аллель подтверждали блот-гибридизацией. Количественный анализ синтезируемого мутантными штаммами ЭПС показал, что мутация в гене pssI приводит к снижению синтеза полимера до 44% от уровня штамма дикого типа, в гене püH - до 70%, в гене pssG - до 83%, в гене pssF - до 51% и, наконец, в гене pssC - до 38%. В случае мутантов PssE::Tn5 и PssD::Tn5 синтез ЭПС практически отсутствовал.

Показано, что ЭПС R. 1. bv. viciae VF39 построен из октасахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из 5 молекул глюкозы, 1 молекулы галактозы и 2 молекул глюкуроновой кислоты, соединенных между собой ß-1-4, ß-1-З и а-1-6- гликозидными связями. Изучение путей биосинтеза бактериальных ЭПС, в частности, сукциногликана у S. meliloti, свидетельствует о том, что в ходе синтеза повторяющегося полимерного звена присоединение каждого сахарного остатка катализируется специфической

гликозилтрансферазой (Glucksmann et al., 1993; Reuber, Walker, 1993). Поэтому, можно предположить, что в случае R. I. bv. viciae VF39 в синтезе октасахарида участвует по крайней мере 8 гликозилтрансфераз. Ранее в нашей лаборатории бьи идентифицирован ген pss A (Ivashina et al., 1994), который, как полагают, кодирует изопренил-фосфатглюкозилтрансферазу, т.е. фермент, ответственный за присоединение первого остатка глюкозы к липидному носителю (Van Workum et al., 1997). В настоящей работе нами было идентифицировано еще 7 генов, предположительно кодирующих глнкозилтрансферазы. Таким образом, можно сделать вывод о том, что нами идентифицированы практически все гены, продукты которых необходимы для синтеза повторящейся единицы полисахарида.

6. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена /шВ.

Сравнение нуклеотидной последовательности гена pssk из штамма VF39 с компьютерными базами данных (GenBank/EMBL/DDBJ) позволило выявить его гомологи у нескольких видов ризобий. В штамме R. I. bv. phaseoli 8002 Бортакуром с соавт. (Borthakur et al., 1988) проксимально по отношению к гену pssA был локализован генpssB, мутации в котором нарушали синтез ЭПС. Первоначально ген pssA из VF39 был клонирован в виде EcoRI-фрагмента длиной 3,4 т.п.н. (Ivashina et al., 1994). Определение его нуклеотидной последовательности показало, что на расстоянии 458 п.н. от гена pssA расположена ОРС, практически идентичная гену pssB R. I. bv. phaseoli. В результате анализа этой последовательности был сделан вывод о том, что в клонированном fcoRI-фрагменте содержится только лишь 3'-концевая часть гена рмВ. В дальнейших экспериментах с помощью блот-гибридизации были идентифицированы рестрикционные фрагменты ДНК, взаимоперекрывающиеся с £соШ-фрагментом. Одни из них, icoRV-фрагмент длиной 1,6 т.п.н., был клонирован в векторе pBluescript KS (плазмида pVF25) и секвенирован (рис. 5). Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности (GenBank Accession number L48S04) выявил наличие ОРС (¿wsB) длиной 287 кодонов, что соответствует белку с молекулярной массой 30,6 кДа. В результате сравнения аминокислотной последовательности PssB с базами данных белковых последовательностей обнаружено его сходство с семейством белков, гомологичных инозитолмонофосфатазе, являющейся ключевым ферментом вторичной сигнальной системы млекопитающих (Neuwald et al., 1991). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей этого семейства белков позволило выявить три консервативных домена (рис. 6). Вопрос о том, какую роль отмеченные мотивы играют в функционировании выявленных белков остается открытым. Однако существует предположение, что в инозитолмонофосфатазе домены II и

Sac]

I pssB I , pss A -^-

"t t t

Km 1 Km 2 Km 3

.S'o'l Ico RI Su! I £coRI

CTG GTC GAC CCT CTC GAC GGC ACC CGT GAA ITC GTC GAC GGA CGA CAG GAA TTC ЛСС I.eu Val Asp Pro I.cu Asp Gly Thr Arg Glu Phe Val Asp Gly Arg Gin Glu Phe Thr

Рис. 5. Физическая карта £соКУ-5ас1-фра|мента ДНК R. 1. bv. viciae VF39, содержащего гены pssA и pssB. Положения инссрций кассеты Кш" в гене pssB отмечены как Kml, Km2 и КтЗ. В нижней части рисунка приведен участок иуклеотидной последовательности между сайтами рестрикции SalI и EcoRl, а также соответствующая ему аминокислотная последовательность белка.

III выполняют роль участков связывания с инозитолфосфатами или ионами лития (Bone et al., 1992).

7. Изучение функций генаpssВ.

Наиболее высокий уровень гомологии (40°,о) белка I'ssB обнаружен с продуктом гена amtA(cviQ) Е. coli. Данные о функции этого белка противоречивы. Согласно Фабини с соавт. (Fabiny et al., 1991) AmtA(CysQ) является цитоплазматическим компонентом системы транспорта аммония. В более поздней работе, однако, было показано, что мутации в гене amtA(cysQ) приводят к ауксозрофности по цистеину, проявляющейся только при аэробном росте бактерий (Neuwald et al., 1992). Для выяснения функциональной гомологии белков PssB и AmtA(CysQ) были проведены эксперименты по комплементации мутации в гене amlA(cysQ) рекомбинантной плазмидой pVF25, содержащей клонированный ген pss В. Как видно in рис. 7, введение эгой плазмиды в мутантные клетки Е. coli AJ2653aw;/A::Tn/0 приводило к восстановлению способное!и бактерий к росту на минимальных средах. Эти данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере в клетках Е. coli, продукты генов pss В и am!A (cnQ) взаимозаменяемы.

В дальнейших экспериментах был проведен мутагенез гена /«sB in vitro. При этом использовались два подхода. Во-первых, в различные участки кодирующей последовательности гена pss В была встроена Ктк-кассета (рис. 5, мутации Kml-Km3). Во-вторых, были получены делецпи, затрагивающие область второго консервативного домена, но не приводящие к сдвигу рамки считывания (делеции Sail и fcoRI-фрагментов, что

PssB 55

AmtA 35

IMP 41

Qa-X 61

SuhB 38

QutG 49

Hal2 43

М отни I - -Alt

RTLT] KM LI "is IKE К AF

A SjLl

ЁХЁВДодш

pyfaqTs дРш

SHSF1G

KaAiNTRraasHDFgG IDT^RiCsmQHTglT кр? AIQ T КПЭА HKFJjG

INAI KsKFtaflDKESSoa^

зэ: э ;э s

PssB 102 AmtA 81 IMP 88

Qa-X SuhB QutG

113

82 9S

Hal2 141

QASIlVTEi i0I0QE[ BL^VQEJ i0i{2le[

Phc. 6. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков PssB из R. I. bv. viciae VF39, AmtA(CysQ) из E. coli (Fabiny et al., 1991; Neuwald et al., 1992), инозитолыонофосфатазы (IMP) из клеток мозга быка (Neuwald et al., 1991), Qa-x из Neurospora crassa (Geever et al., 1989), SuhB из E. coli (Yano et al., 1990), QutG из Aspergillus nidulans (Hawkins et al., 1988), Hal2 из Saccharomyces cerevisiae (Glaser et al., 1993). Множественное выравнивание проводили как указано в подписи к рис. 4. Идентичные аминокислоты представлены на черном фоне, однотипные - на сером.

соответствует делециям аминокислот в положениях 104-113 и 112-118 последовательности белка РэзВ). Показано, что плазмиды, содержащие мутантные аллели гена pssй, не способны восстанавливать фенотип СузО+ у штамма А.12653а/л/А::Тп10. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о правомочности вывода о функциональной гомологии белков РзэВ и АгЩА^уйО), а также подтверждают значимость выявленных консервативных доменов белка ГЧзВ для обеспечения его функции.

Наибольший интерес представлял вопрос о том, какую роль выполняет продукт гена /а«В в клетках Д. /. Ьу. \nciae \Т39. С целью выяснения этого вопроса были сконструированы мутанты \Ф39, содержащие инсерции Кшк-кассеты в разных участках гена /ш'В (см. рис. 5). Полученные мутанты прежде всего проверяли на способность к росту

время, ч

Рис. 7. Комплементация мутации в гене amtA(cysQ) Е. coli. Рост бактерий Е. coli AJ2653am/A::Tn 10 (.), AJ2653ow/A::Tnl0/pVF25 (*), АJ2653omiA: :Tn 10/pJH 1А (D) в минимальной жидкой среде М9. (+) -рост штамма со// AJ2653nm/A::Tnl 0 в среде М9 с добавлением цистеина (20 мкг/мл).

на минимальных средах. Оказалось, что в отличие от CysQ -мутантов coli, PssB -мутанты VF39 сохраняли прототрофность. Количество синтезируемого экзополисахарида у них не отличалось от штамма дикого типа. Это обстоятельство не согласуется с данными Бортакура с соавт. (Borthakur et al., 1988). Для выяснения возникшего противоречия нами был секвенирован участок ДНК штамма R. I. bv. phaseoli 8002/мзВ::То5 (любезно предоставлен д-м А. Джонстоном, Великобритания), прилегающий к иисерции транспозона. Оказалось, что авторами цитируемой выше работы была допущена ошибка, и инсерция транспозона на самом деле расположена не в гене pssTl, а в гене pssA, контролирующим, как было сказано выше, процесс биосинтеза ЭПС.

Нами были также проведены эксперименты по проверке гипотезы об участии гена риВ в процессе активного транспорта аммония, о наличии которого судили по включению неметаболизируемого клетками [|4С]-метиламингидрохлорида. В результате было показано, что уровень включения иСНзКНз* в мутантные по гену pssB клетки не отличается от штамма дикого типа. Более того, добавление в реакционную смесь ионов N11-Г приводило к резкому снижению включения метиламингидрохлорида. На основании этих экспериментов можно сделать вывод о том, что продукт гена pssl) не участвует в транспорте аммония по крайней мере в клетках свободноживущих ризобий.

Изучение симбиотических свойств мутантных по гену pssB штаммов R. I. bv. viciae показало, что все три мутанта образуют клубеньки на корнях V. faba и V. sativa. Однако анализ клубеньков на способность фиксировать азот, проведенный по методу восстановления ацетилена, показал, что инсерция Ктк-кассеты в центральную часть гена pssQ (рис. 5; мутация pssB-Kml) не влияла на эффективность азотфиксации, тогда как введение ее в дистальную часть гена (мутации /MsB-Km2 и pssB-KmJ) приводило к

фенотипу Fix". Наблюдаемые отличия в проявлении мутаций в разных участках гена могут свидетельствовать о его дифференциальной экспрессии в клетках R. I. bv. viciae VF39. контролируемой на уровне транскрипции либо трансляции.

Обобщая информацию, полученную в результате проведенных экспериментов и анашза литературы, однозначно говорить о механизмах действия продукта гена pssß в настоящее время не представляется возможным. Можно лишь констатировать тот факт, что ген pssB относится к ранее непдентифицированным fix-генам и является ризобиальным гомологом гена c>'jQ Е. coli.

ВЫВОДЫ

1. Идентифицирован новый кластер генов, контролирующих биосинтез кислого ткзополнсахарнда у штамма Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39, и показана его хромосомная локализация.

2. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК длиной 7181 п.н. из области генов биосинтеза экзополисахарида. В секвенировапном участке локализованы восемь 01крытых рамок считывания, обозначенных как гены/wsE, D, С, F, G, Н, 1 и orfS. Изучена экспрессия всехрм-генов в клетках Е. coli.

3. На основании сравнения с банками данных аминокислотных последовательностей, а также изучения биосинтеза экзополисахарида у мутантов выдвинуто предположение о том, что продукты всех идентифицированных /m-генов являются гликозилтрансферазами.

4. Клонирован и секвенирован ген рмВ R. 1. bv. viciae VF39. продукт которого отнесен к семейству белков, гомологичных инозитолмонофосфатазе млекопитающих.

5. Показана функциональная взаимозаменяемость белков PssB R. I. bv. viciae VF39 и AmtA(CysQ) Е. coli.

6. Показано, что мутации в гене /шВ не влияют на продукцию экзополисахарида у R. I. bv, viciae VF39, но нарушают симбиотическую фиксацию молекулярного азота.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ksenzenko V.N., Ivashina T.V., Sadykhov M.R., Chatuev B.M., Khmelnitsky M.I., Kanapin

A.A., Shlyapnikov M.G. A role of the Rhizobium leguminosarum bv. viciae pss\ and pssA genes in nitrogen fixing symbiosis. // Proceedings- of the 1st European Nitrogen Fixation Conference and the Workshop on "Safe Application of Genetically Modified Microorganisms in the Environment". Kiss G. В., Endre G., eds. Officina Press, Szeged, Hungary, 1994. P. 142146.

2. Ivashina Т., Sadykov M., Chatuev В., Dmitriev V., Suzina N., Duda V., Ksenzenko V. Molecular genetic analysis of Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 pss genes. // Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture. Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Tikhonovich I., Provorov N., Romanov V., Newton W.,eds. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, 1995. V. 27. P. 404.

3. Ивашина T.B., Садыков M.P., Чатуев Б.М., Канапин A.A., Шляпников М.Г., Ксензенко

B.Н. Продукт гена pssB Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 участвует в симбиотнческой фиксации молекулярного азота. //Доклады РАН. 1996. Т. 350. С. 712715.

4. Садыков М.Р. Ивашина Т.В. Ксензенко В.Н. Идентификация и анализ генов биосинтеза экзополисахарида Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39. II Сборник трудов П-й городской научной конференции молодых ученых г. Пущино. Пущино. 1997. С. 24-29.

5. Садыков М.Р., Ивашина Т.В., Канапин A.A., Шляпников М.Г., Ксензенко В.Н. Структурно-функциональная организация генов биосинтеза экзополисахарида у Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39. II Молекулярная биология. 1998. Т. 32. С. 797804.

6. Ивашина Т.В., Садыков М.Р., Чатуев Б.М., Канапин A.A., Ксензенко В.Н. Структура и функции генов биосинтеза экзополисахарида Rhizobium leguminosarum bv. viciae. II Тезисы 9-го Баховского коллоквиума по азотфнксации. Пущино. 1995. С. 18.

7. Ивашина Т.В., Садыков М.Р., Чатуев Б.М., Дмитриев В.В., Шляпников М.Г., Ксензенко В.Н. Роль полисахаридов Rhizobium leguminosarum bv. viciae в азотфиксирующем симбиозе. // Тезисы конференции "Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты". Пущино. 1995. С. 21.

8. Ivashina Т, Sadykov М., Senchenkova S., Shashkov A., Shibaev V., Ksenzenko V. Exo genes of Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39. II Abstracts of the 2nd European Nitrogen Fixation Conference and NATO Advanced Research Workshop "Biological Fixation of

Nitrogen for Ecology and Sustainable Agriculture". Wojtowic J., Strepkowska J., Szlagowsl

A., eds. Scientific Publishers OWN, Poznan, Poland, 1996. P. 127.

9. Дружинина Т.Н., Калинчук H.A., Шибаев B.H., Ивашина Т.В., Садыков М.Р., Ксензень

B.Н. Биосинтез кислого экзополисахарида Rhizobium \eguminosarum bv. viciae VF3' образование липидсвязанных Сахаров, возможных предшественников полисахарида-.

Научное издание Автореферат Садыкова М.Р.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции OK-OOS—93, том 2, 953000 - киши и брошюры.

14.09.98 г. 3. 81211'. Т. 100 яз. Усл.псч.л. 1,0. Отпечатана с оригинала-макета в Отделе паучпо-техническоп информации ИФПЬ РАН. 142292, г. Нунцию Московской обл., проспект Науки, ,'i. Ol ITH ИФПК РАН.