Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктура азотфиксирующей ткани корневых клубеньков симбиотических мутантов гороха (Pisum sativum L. )

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктура азотфиксирующей ткани корневых клубеньков симбиотических мутантов гороха (Pisum sativum L. )"

На правах рукописи УДК: 576.7:631.528:633.358

(к

БОЛОБОЛОВА ЕЛЕНА УСТИНОВНА

УЛЬТРАСТРУКТУРА АЗОТФИКСИРУЮЩЕЙ ТКАНИ КОРНЕВЫХ КЛУБЕНЬКОВ СИМБИОТИЧЕСКИХ МУТАНТОВ ГОРОХА (Pisum

sativum L.)

Гистология, цитология, клеточная биология - 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 2003

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Н.Б. Рубцов

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.П. Гончаров

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук A.M. Гусаченко

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск.

Ведущее учреждение: Центральный сибирский ботанический сад

СО РАН, г. Новосибирск.

Защита диссертации состоится " 1'3 " НОЛ^Я. 2003г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (3832)331278; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

-Ю- окял^я

Автореферат разослан ". 1U" UKIJiOp-Ч 2003г.

Ученый сектетарь диссертационного совета, доктор биологических наук Груздев А.Д.

So оз -А

Актуальность проблемы. Биологическая азотфиксация является одним из глобальных процессов, обеспечивающих возможность существования современных форм жизни на Земле. Усвоение значительной части атмосферного азота обеспечивается симбиозами бактерий рода Rhizobium с высшими растениями из семейства Fabaceae Lindl. (Newton, 1994). Формирование симбиоза контролируется генами обоих партнеров, связанных сложными регуляторными взаимодействиями (Проворов, 1996а, б; Gresshoff, 1985). Роль бобового растения в формировании симбиоза остается относительно слабо изученной. Установлено, что гены растения определяют способность к образованию клубеньков, их число на растение, клеточную и внутриклеточную организацию азотфиксирующей ткани (Caetano-Anolles, Gresshoff, 1991). Эффективное изучение образования и функционирования симбиоза требует проведения комплексных исследований с использованием широкого набора современных методов- анализа и созданием модельных систем. В настоящее время получена коллекция мутантов гороха, характеризующихся измененным типом формирования симбиоза с клубеньковыми бактериями (Tsyganov et al., 1998). Изучение эффекта симбиотических мутаций позволило разделить развитие симбиоза на ряд отдельных этапов, каждый из которых контролируется несколькими генами растения. Создана классификация мутантов по стадиям развития симбиоза, но к настоящему времени она является не полной (Борисов и др., 1998; Morzhina et al., 2000). Получение индуцированных мутантов и изучение фенотипического проявления мутаций в данное время остается актуальной задачей.

Изучение бобово-ризобиального симбиоза имеет большое практическое значение, т.к. ряд бобовых, например, соя, люцерна, горох относятся к числу важных сельскохозяйственных культур. Повышение эффективности азотфиксации у растений ряда сельскохозяйственных культур существенно для обогащения почв "биологическим" азотом. Одним из путей повышения такой эффективности является создание и использование доноров

для проведения селекции бобовых по этому признаку ^егпег, 1995; Сидорова и др., 20016). Некоторые симбиотические мутанты гороха могут рассматриваться в качестве таких потенциальных доноров. Однако, полноценная оценка перспективности их использования возможна только при выяснении механизмов проявления конкретных мутаций с учетом плейотропных эффектов, которые могут проявляться на разных уровнях и этапах формирования растений. Нередко они приводят к изменению морфологии растения, структуры клубенька, количества зараженных клеток в клубеньке, ультраструктуры азотфиксирующей ткани (Борисов и др., 1998; Сидорова, Шумный, 19996).

В ИЦиГ СО РАН под руководством д.б.н. К.К.Сидоровой создана уникальная коллекция симбиотических мутантов гороха (Сидорова, Шумный, 19996). Актуальным продолжением этих исследований является детальное изучение влияния мутаций на формирование азотфиксирующей ткани в корневых клубеньках симбиотических мутантов гороха и изучение влияния морфологических особенностей формирования

бактероидсодержащей ткани на эффективность азотфиксации.

Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования было изучение взаимосвязи между ультраструктурной организацией клубеньков и эффективностью азотфиксации. Для достижения этой цели использовали электронно-микроскопический и морфометрический анализ азотфиксирующей ткани клубеньков различных сортов и симбиотических мутантов гороха.

Задачи настоящего исследования состояли в следующем:

1. Изучить ультраструктуру бактероидсодержащей ткани из разных зон клубенька у мутантов гороха, различающихся по активности азотфиксации: К287 с неэффективными клубеньками, К15а со слабой азотфиксацией, суперклубеньковых мутантов поёЗ, К11а, К22а, К301.

2. Провести сравнительный анализ ультраструктурной организации бактероидсодержащей ткани у суперклубеньковых мутантов и исходных

сортов гороха, а также бактероидсодержащей ткани устойчивых к нитратам суперклубеньковых мутантов (nodi, nod4, nod6) и сорта Торсдаг (Nod5), имеющих разный генетический контроль регуляции клубенькообразования.

3. Сравнить изменения морфологической организации бактероидсодержащей ткани у сортов гороха и их мутантов под действием полных норм азота.

4. Провести выборочный статистический анализ участков ткани из средней части зоны азотфиксации у сортов и симбиотических мутантов и оценить различия между эффективным и неэффективным симбиозом.

Научная новизна и практическая ценность. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание взаимосвязи между эффективностью азотфиксации и ультраструктурной организацией клубенька. В результате проведенных исследований было показано, что у сортов и их мутантов, образовавших эффективные клубеньки, развитие и ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани не имели структурных нарушений. С помощью структурного анализа процесса развития симбиоза у сортов и мутантов, образовавших неэффективные клубеньки и клубеньки с пониженным уровнем азотфиксации, были выявлены стадии модификации формирования бактероидсодержащей ткани и структурные отклонения в организации зрелой бактероидсодержащей ткани. Показано, что у мутанта с неэффективными клубеньками была нарушена стадия дифференцировки бактероидов (стадия Bad). У мутанта со слабоэффективными клубеньками структурные изменения организации ткани выявлены на стадии поддержания структурно-функциональной стабильности клубеньков (стадия Nop). Впервые показано сходство в организации ультраструктуры клубеньков у форм с разным генетическим контролем нодуляции, но одинаково устойчивых к нитратам (сорт Торсдаг (Nod5) и суперклубеньковые мутанты {nodi, nod4, nod6)).

Изучение влияния ультраструктурной организации

бактероидсодержащей ткани клубенька на эффективность азотфиксации имеет важное значение для оценки азотфиксирующей способности бобовых культур. На основе изученных симбиотических мутантов была предложена модель для определения эффективности бобово-ризобиального симбиоза в полевых и вегетационных опытах (Сидорова и др., 2001а). Изучение симбиотических мутантов играет важную роль в создании доноров для селекции.

Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН 1999, XVIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000). Основные материалы опубликованы в 6-ти печатных работах в отечественных журналах и сборниках.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, полученных результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 149 источников. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, иллюстрирована 13 сводными рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материал для исследования любезно предоставлен д.б.н. К.К.Сидоровой. В работе были использованы сорта и симбиотические мутанты гороха.

Сорта гороха. Сорта Рамонский 77 и Рондо характеризуются образованием среднего числа клубеньков (100-150 на растение), чувствительностью к нитратам, т.е. при выращивании растений на фоне полной дозы нитратов наблюдается снижение уровня азотфиксации. Сорт Торсдаг характеризуется обильным клубенькообразованием (200-250 клубеньков на растение), высокой азотфиксацией, устойчивостью к нитратам.

Интенсивность клубенькообразования и устойчивость к нитратам контролируются геном Nod5 (Сидорова, Шумный, 1997).

Мутанты. Мутант К287 получен из сорта Рамонский 77 (Сидорова, Ужинцева, 1992), характеризуется отсутствием нитрогеназной активности в клубеньках. Мутант К 15а получен из сорта Рондо, характеризуется пониженным уровнем азотфиксации. Суперклубеньковые мутанты: мутант К301 (nod4) получен из сорта Рамонский 77 (Сидорова, Ужинцева, 1992); мутант nod3 (nodi) получен из сорта Рондо (Jacobsen 1984); мутант Klla (nod3) получен из сорта Рондо (Сидорова и др., 20016); мутант К22а (nod6) получен из сорта Рондо (Сидорова и др., 20016). Все суперклубеньковые мутанты характеризуются образованием большого числа клубеньков на корнях (более 1000 на растение), высоким уровнем азотфиксации, устойчивостью к нитратам.

Растения выращивались в гидропонной теплице, используя два варианта минерального питания: с полной нормой азота в форме нитратов и без азота. Проростки растений инокулировали бактериями Rhizobium leguminosarum, штамм 250а. Клубеньки для исследования брали в начале цветения, по 1 экземпляру одинакового размера от 5 растений. Образцы ткани выделяли из разных зон клубенька по его продольной оси. Проводилась двойная фиксация образцов ткани в растворах глутарового альдегида и четырехокиси осмия по методике (Сидорова и др., 1995). Зафиксированные образцы обезвоживали и заключали в эпоксидную смолу Аралдит. На полутонких срезах, которые окрашивали в растворе метиленового синего (Warmke, Sheu-Ling, 1976), под световым микроскопом выбирали зоны клеток для электронно-микроскопического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца (Reynolds, 1963) и анализировали с помощью электронного микроскопа JEM-100 (Jeol, Япония).

Морфометрический анализ образцов из средней части клубенька проводили как описано ранее (Болоболова и др., 1998). Обработка

полученных данных проводилась с помощью программы "Statistica for Windows".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Формирование азотфиксирующей (бактероидсодержащей) ткани в клубеньке проходит через несколько стадий. Из инфекционных нитей «

бактерии попадают в цитоплазму клубеньковых клеток посредством эндоцитоза. Каждая бактерия заключается в мембранную оболочку,

<

называемую перибактероидной мембраной (ПБМ). Бактериальная клетка, окруженная перибактероидной мембраной, называется симбиосомой. Пространство между перибактероидной мембраной и бактериальной клеткой называется перибакгероидным пространством (ПБП). В цитоплазме клетки бактерии размножаются и дифференцируются в специальную азотфиксирующую форму - бактероид. В процессе дифференцировки бактерии увеличиваются в несколько раз в объеме, приобретают неправильную форму. В клубеньке гороха каждой стадии развития азотфиксирующей ткани соответствует своя зона клеток. В работе изучалась ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани из разных зон клубенька - зоны заражения, зоны дифференцировки бактероидов, зоны азотфиксации. Для выявления эффекта симбиотических мутаций был сделан сравнительный ультраструктурный анализ бактероидсодержащей ткани мутанта и родительского сорта.

Формирование бактероидсодержащей ткани сортов гороха. У сортов Рамонский 77 и Рондо на среде без азота формирование симбиоза произошло без структурных нарушений, ультраструктурная организация зрелой бактероидсодержащей ткани была подобна ткани, характерной для эффективных клубеньков гороха. Строение ткани показано на примере сорта Рамонский 77 (рис. 1). В средней части зоны азотфиксации зараженные клетки были заполнены симбиосомами, состоящими из одного

морфологически дифференцированного бактероида, окруженного перибактероидной мембраной. Бактероиды имели дисперсный матрикс (рис. 1, А). На среде с азотом у сортов Рамонский 77 и Рондо в процессе развития бакгероидсодержащей ткани возникли сходные ультраструктурные нарушения. Под действием экзогенного азота сформировались аномальные симбиосомы, содержащие по несколько морфологически недифференцированных бактероидов, окруженных общей перибактероидной мембраной. Бактероиды имели крупные включения в матриксе. Симбиосомы быстро деградировали, в средней части зоны азотфиксации перибактероидные мембраны были разрушены (рис.1, Б). Нарушение развития симбиоза под действием нитратов произошло на стадии дифференцировки бактероидов.

Рис.1. Бактероидсодержащая ткань из средней части зоны азотфиксации клубеньков гороха сорта Рамонский 77 на среде без азота (А) и с азотом (Б), бк-бактероид, пбп-перибактероидное пространство. Масштабная линейка - 1 мкм.

У сорта Торсдаг на среде с азотом и без азота формирование азотфшссирующей ткани произошло без ультраструктурных нарушений. Образование ткани, имеющей структуру, характерную для эффективного симбиоза гороха, объясняет способность сорта Торсдаг фиксировать азот на среде с нитратами.

Формирование бактероидсодержащей ткани мутанта К287. У мутанта на среде с азотом и без азота были сходные структурные нарушения в процессе развития бактероидсодержащей ткани. Мутант характеризовался образованием аномальных симбиосом, содержащих по несколько бактероидов каждая, отсутствием дифференцировки бактероидов (рис.2). В варианте с азотом симбиосомы быстро деградировали в зоне азотфиксации.

t

Нарушение развития симбиоза под действием мутации произошло на стадии выхода бактерий из инфекционных нитей и дифференцировки бактероидов. Мутант имеет фенотип Bad". Действие мутации проявилось раньше, чем i

действие азота у исходного сорта Рамонский 77.

Рис.2. Бакгероидсодержащая ткань клубеньков гороха мутанта К287 при выращивании на среде без азота. А-зона заражения; Б-средняя часть зоны азотфиксации; б-бакгерия, бк-бактероид, ин-инфекционная нить, пбм-перибактероидная мембрана, пбп-перибактероидное пространство. Масштабная линейка - 1 мкм.

Формирование бактероидсодержащей ткани мутанта К 15а. В варианте без азота ультраструктурные различия строения бактероидсодержащей ткани мутанта и сорта Рондо были видны в зоне азотфиксации. У мутанта симбиосомы лежали разреженно в цитоплазме клубеньковой клетки, большая часть бактероидов имели крупные округлые включения в матриксе (рис.3, А), что свидетельствует о снижении азотфиксирующей активности симбиосом и

бакгероидсодержащей ткани. Действие мутации К 15а проявилось после дифференцировки бактероидов на стадии функционирования симбиоза. В варианте с азотом у мутанта К 15а были такие же нарушения развития бакгероидсодержащей ткани, как у сорта Рондо (рис.3, Б). Следовательно, действие азота на формирование азотфиксирующей ткани проявилось раньше, чем действие мутации К 15а. Мутант является чувствительным к нитратам.

Рис.3. Бактероидсодержащая гкань из средней части зоны азотфиксации клубеньков гороха мутанта К 15а на среде без азота (А) и с азотом (Б), бк-бактероид, лбп-перибактероидное пространство, ц-цитоплазма. Масштабная линейка -1 мкм.

Формирование бактероидсодержащей ткани суперклубеньковых мутантов поаЗ (поЛЗ). К11а (пойЗ\ К301 (пос14). К22а (пос16\. У всех суперклубеньковых мутантов на среде с азотом и без азота к началу цветения на корнях были клубеньки двух типов - мелкие белые и розовые среднего размера. Белые клубеньки характеризовались образованием аномальных симбиосом и отсутствием дифференцировки бактероидов. Исходя из размера, цвета и ультраструктурной организации, можно предположить, что мелкие клубеньки являлись недоразвитыми и неэффективными. В розовых клубеньках всех суперклубеньковых мутантов на среде с азотом и без него развитие симбиоза прошло без нарушений. Основное различие организации бакгероидсодержащей ткани суперклубеньковых мутантов и исходных

сортов выявилось при выращивании растений на разных вариантах питания. На среде с азотом у мутантов образовалась нормальная ткань, у исходных сортов бакгероидсодержащая ткань имела структурные нарушения. Можно сделать вывод, что суперклубеньковые мутации, блокируя ранние механизмы регуляции числа закладок клубеньков и нитратного ингибирования азотфиксации, не нарушают развитие азотфиксирующей ткани. ^

Сравнение организации бактероидсодержащей ткани у суперклубеньковых мутантов и сорта Торсдаг. имеющих разный 1

генетический контроль регуляции клубенькообразования. Сорт Торсдаг л

(Nod5) и суперклубеньковые мутанты nod3 (nod3), Klla (nodi), K301 (nod4), K22a (nodd) характеризуются нарушением ранних регуляторных механизмов клубенькообразования, контролируемых генами группы nod. На основе генетических исследований, был сделан вывод, что у сорта Торсдаг и суперклубеньковых мутантов nod3 (nod3) и К301 (nod4) функционируют две независимые ранние регуляторные системы, контролирующие клубенькообразование (число, размер клубеньков, их расположение на корневой системе) (Сидорова, Шумный, 19996). Различия в регуляторных j

системах, контролирующих клубенькообразование, не повлияли на :

формирование симбиоза, но, определили структурные различия клубеньков, в J

том числе, предположительно, строение зоны азотфиксации в клубеньке. |

Действие полных доз нитратов на формирование клубеньковой |

бактероидсодержащей ткани. В нашей работе эффект нитратов на i

формирование ткани у чувствительных к азоту линий Рамонский 77, Рондо и 1

мутанта К 15а проявился на стадии дифференцировки бактероидов, нитраты *

ускорили процесс деградации симбиосом у неэффективного мутанта К287 и в белых клубеньках суперклубеньковых мутантов. ^

Морфометрический анализ ультраструкгурной организации I

бактероидсодержащей ткани. Анализировалась зрелая бакгероидсодержащая i

ткань из средней части клубенька (табл.1). Для анализа были выбраны

Таблица 1

Результаты морфометрического анализа инфицированных клубеньковых клеток у сортов и мутантов гороха

Варианты опытов Фенотип Объем, отн. ед.,

бактероидов ПБП цитоплазмы

Торсдаг + азот по(!+ йх+п& 0.71±0.012* 0.098+0.008* 0.192±0.009*

Торсдаг ПОсТ ЙХ+П15 0.611±0.011 0.125±0.006 0.264±0.012

Рондо + азот посГ йх' 0.42±0.012* 0.04+0.005* 0.53±0.013*

Рондо ПО(1+ йх+ 0.72+0.010 0.11+0.007 0.17±0.008

поёЗ + азот пск!++ йх^в 0.72±0.010* 0.075+0.006* 0.206+0.008

пос13 поё" ЙХ+Ш5 0.666+0.011 0.118±0.009 0.216+0.009

К22а + азот П0(1++ ЙХ+п1$ 0.601±0.013 0.131+0.011* 0.268+0.010*

К22а ПО<1++ ЙХ+1Ц8 0.607±0.014 0.084±0.009 0.308+0.013

К11а+ азот пост ЙХ^ 0.690±0.011* 0.150±0.008* 0.161±0.008*

К11а пск!++ йх+п1з 0.611+0.012 0.118±0.008 0.272±0.010

К15а + азот поё+ йх" 0.473+0.012* 0.000±0.000* 0.526±0.012*

К15а посГ йх+/" 0.423±0.012 0.119Ю.007 0.457±0.013

Рамон. 77+ азот по<1+ йх' 0.350+0.010* 0.009+0.002* 0.641±0.010*

Рамон. 77 пос1+ йх+ 0.663±0.011 0.115±0.007 0.222+0.009

К301 + азот поё++ йх+п1в 0.634±0.009* 0.094±0.007 0.271±0.007*

К301 поё++ йх+Шз 0.692±0.011 0.108±0.008 0.200±0.008

К287 + азот П0(1+ йх" 0.461+0.011* 0.006±0.001* 0.532+0.011*

К287 по<1+ йх' 0.328±0.011 0.561±0.011 0.11010.007

»Показатели линии, выращенной на среде с азотом и без азота, достоверно различаются с вероятностью > 0.95

Примечание. - Обозначение фенотипических характеристик: поё+йх+ - нодуляция есть, азотфиксация есть; посГйх" - нодуляция есть, азотфиксации нет; посГйх+/" -нодуляция есть, азотфиксация слабая; посГПх^Ыз - нодуляция есть, азотфиксация есть, нитрат-устойчивый симбиоз; пос^Ах^э - суперклубеньковый, нитрат-устойчивый, азотфиксация есть.

следующие параметры: относительный объем бактероидов в 1

цитоплазматическом компартменте зараженной клетки, относительный объем перибактероидного пространства, относительный объем цитоплазмы растительной клетки. Выбранные параметры отражают представительство обоих партнеров симбиоза в клетке клубенька. У всех сортов и мутантов, !

образовавших неэффективные симбиозы, величина относительного объема бактероидов была значительно ниже, чем в эффективных симбиозах, что говорит о снижении присутствия микросимбионта в неэффективных симбиозах. Во всех эффективных симбиозах наблюдалось сходство ультраструктуры зрелой бактероидсодержащей ткани. Сходство ультраструктуры отразилось в сходстве значений параметров. Самой большой была доля объема, занимаемая бактероидами, она составляла 6070%. Остальная часть приходилась на перибакгероидное пространство и | цитоплазму клетки. Полученные параметры отражают стабильность эффективной симбиотической системы. У всех линий были достоверные ; различия по большинству параметров у растений, выращенных на среде с , нитратами и без нитратов. У чувствительных к нитратам сортов и мутантов это были различия между эффективными и неэффективными симбиозами, у ! устойчивых к нитратам сортов и мутантов такие различия были

I

незначительны.

I

Связь ультраструктурной организации азотфиксирующей ткани с эффективностью азотфиксации. В нашей работе представлены мутанты, различающиеся по эффективности азотфиксации: мутант с неэффективными клубеньками (К287); мутант со слабоэффективными клубеньками (К 15а); »

группа суперклубеньковых мутантов, считающихся суперпродуцентами по активности азотфиксации (Сидорова, Шумный, 1998). Во всех ^

неэффективных клубеньках - у мутанта К287 и в белых клубеньках 1

суперклубеньковых мутантов на среде с нитратами и без нитратов, у мутанта К15а, сортов Рондо и Рамонский 77 на среде с нитратами структурные

Таблица 2

Нарушения структуры симбиосом у сортов и мутантов гороха

Варианты опытов Зона заражения Зона дифференцировки Зона азотфиксации (средняя часть)

Рамонский 77 + азот нарушений нет симбиосомы состоят из нескольких бактероидов, дифференцировка бактероидов отсутствует, бактероиды содержат включения перибакгероидные мембраны разрушены, бактероиды имеют включения, бактероиды деградируют

Рондо + азот нарушений нет подобно Рамонскому 77 подобно Рамонскому 77

К301 (белые клубеньки) нарушений нет симбиосомы состоят из неск. бактероидов, дифференцировка бактероидов отсутствует симбиосомы состоят из неск. бактероидов, бактероиды имеют включения

К301 + азот (белые клубеньки) нарушений нет симбиосомы состоят из неск. бактероидов, дифференцировка бактероидов отсутствует ПБМ, в основном, разрушены, бактероиды имеют включения, деградируют

К287 симбиосомы состоят из неск. бактерий симбиосомы состоят из неск. бактероидов, дифференцировка бактероидов отсутствует симбиосомы состоят из неск. бактероидов, бактероиды имеют включения

К287 + азот симбиосомы состоят из неск. бактерий симбиосомы состоят из неск. бактероидов, дифференцировка бактероидов отсутствует ПБМ, в основном, разрушены, бактероиды имеют включения, деградируют

К15а нарушений нет нарушений нет бактероиды имеют включения

К15а + азот нарушений нет симбиосомы состоят из неск. бактероидов, дифференцировка бактероидов отсутствует ПБМ, в основном, разрушены, бактероиды имеют включения, деградируют

нарушения произошли на ранней стадии развития азотфиксирующей ткани (табл. 2). Во всех случаях были выявлены сходные аномалии развития симбиотических структур. У мутанта со сниженным уровнем азотфиксации К 15а были выявлены небольшие различия строения бактероидсодержащей ткани по сравнению с исходным сортом: накопление включений в матриксе бактероидов и уменьшение размеров пространства, занимаемого микросимбионтом в клетках макросимбионта. Эти признаки могут служить показателями снижения азотфиксирующей активности симбиоза.

Суперклубеньковые мутанты характеризуются тем, что активность азотфиксации на одно растение у них значительно превышает исходные сорта, а активность удельной азотфиксации (на один клубенек) ниже, чем у исходных сортов (Сидорова, Шумный, 1998). Мы показали, что снижение удельной активности азотфиксации у мутантов не является следствием нарушения развития азотфиксирующей ткани в розовых клубеньках. Это снижение можно объяснить, с одной стороны, вероятным уменьшением количества азотфиксирующей ткани в клубеньке из-за уменьшения размеров клубеньков, с другой стороны, присутствием на растении одновременно клубеньков, различающихся по ультраструктурной организации: розовых (эффективных) и белых (предположительно неэффективных).

Таким образом, у изученных мутантов и сортов гороха нами показано, что образование неэффективных и слабоэффективного симбиозов было связано с ультраструктурными изменениями азотфиксирующей ткани. Снижение удельной азотфиксирующей активности суперклубеньковых мутантов могло быть следствием структурного изменения клубеньков и присутствия на одном растении клубеньков, различающихся по эффективности азотфиксации.

выводы

1. Выявлены отклонения в формировании бактероидсодержащей ткани у мутантов с неэффективными (К287) и слабоэффективными (К 15а) клубеньками: показана стадио-специфичность проявления мутаций (мутант К287 - стадия заражения, мутант К15а - стадия азотфиксации), найдены различия в ультраструктурной организации зрелой азотфиксирующей ткани этих мутантов и их исходных сортов.

2. Показано, что различие ультраструктурной организации азотфиксирующей ткани у суперклубеньковых мутантов пос13, К11а, К22а,

с

КЗ 01 и исходных сортов Рамонский 77 и Рондо проявилось при выращивании на среде с нитратами, при выращивании на среде без нитратов различия в строении ткани отсутствовали.

3. Показано отсутствие различий в строении бактероидсодержащей ткани у устойчивых к нитратам суперклубеньковых мутантов (пос13, пой4, пойб) и сорта Торсдаг (№ос15), имеющих разный генетический контроль регуляции клубенькообразования.

4. Обнаружено, что у сортов и мутантов, не устойчивых к нитратам, под воздействием нитрата произошли ультраструктурные нарушения формирования бактероидсодержащей ткани на ранней стадии развития симбиоза.

5. Установлено, что у всех сортов и мутантов, образовавших неэффективные симбиозы, доля объема, занимаемая бактероидами в цитоплазматическом компартменте зараженных клеток, была значительно меньше, чем в эффективных симбиозах.

6. В результате изучения сортов и мутантов с различным типом

*

генетического контроля было показано, что образование неэффективных и слабоэффективного симбиозов было связано с ультраструкгурными

<Г1 изменениями азотфиксирующей ткани. Снижение удельной

азотфиксирующей активности суперклубеньковых мутантов могло быть следствием структурного изменения клубеньков и присутствия на одном растении клубеньков, различающихся по эффективности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Болоболова Е.У., Губанова Н.В., Байбородин С.И., Сидорова К.К., Шумный В.К. Ультраструктурные особенности строения корневых клубеньков симбиотических суперклубеньковых мутантов гороха Pisum sativum L. // Цитология. 1998. Т.40. №10. С.844-848. i

2. Сидорова К.К., Шумный В.К., Байбородин С.И., Власова Е.Ю., Мищенко Т.М., Болоболова Е.У., Гляненко М.Н., Зимина М.Н., Новикова Т.И., Жанаева Т.А. Исследование генетических, цитологических и физиологических основ симбиотической азотфиксации // Интеграционные 1 программы фундаментальных исследований. Новосибирск, 1998. С.435-

440.

3. Болоболова Е.У., Байбородин С.И. Электронно-микроскопическое изучение бактероидсодержащей ткани корневых клубеньков у форм гороха (Pisum sativum L.), различающихся по азотфиксации. Тезисы докладов XVIII Российской конференции по электронной микроскопии. Черноголовка, 2000. С.211.

4. Болоболова Е.У., Байбородин С.И., Сидорова К.К. Ультраструктура бактероидсодержащей ткани линий гороха Pisum sativum L., имеющих разные регуляторные механизмы клубенькообразования // Цитология. | 2000. Т.42. №11. С.1033-1036.

5. Болоболова Е.У., Губанова Н.В., Сидорова К.К. Ультраструктурные особенности строения корневых клубеньков симбиотических \ суперклубеньковых мутантов гороха Pisum sativum L. // Сб. научн. тр. j Новосибирск: Изд-во ИЦиГ СО РАН, 2000. С.201-204. *

6. Сидорова К.К., Шумный В.К., Болоболова Е.У. О возможности использования линий гороха, маркированных геном Nods, в качестве доноров в селекции на повышение азотфиксации. ДАН. 2001. Т.377. N6. С.847-849.

Подписано к печати 26.03.2003г.

Формат бумаги 60 х 90. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 92

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

2¿doj-/1

M 16273

»

?

t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Болоболова, Елена Устиновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Гены бактерий, участвующие в клубенькообразовании.

1.2. Основные подходы изучения генетического контроля развития и функционирования симбиоза у растений.

1.3. Основные этапы развития симбиоза.

1.4. Функционирование клубенька.

1.5. Организация азотфиксирующих клубеньков.

1.5.1. Морфология и организация азотфиксирующих клубеньков.

1.5.2. Строение недетерминированного клубенька.

1.5.3. Эффективные и неэффективные клубеньки. р 1.6. Генетический контроль симбиотических признаков у бобовых.

1.6.1. Межвидовой и межсортовой полиморфизм по клубенькообразованию и азотфиксации.

1.6.2. Получение индуцированных мутантов бобовых.

1.6.3. Особенности проявления симбиотических генов.

1.6.4. Индуцированные мутанты бобовых.

1.6.5. Мутанты гороха.

1.7. Основные регуляторные системы, контролирующие формирование бобово-ризобиального симбиоза.

1.7.1. Эволюция специфичности образования бобово-ризобиального симбиоза.

1.7.2. Нитратное ингибирование клубенькообразования у бобовых

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ультраструктура азотфиксирующей ткани корневых клубеньков симбиотических мутантов гороха (Pisum sativum L. )"

Актуальность проблемы. Биологическая азотфиксация является одним из глобальных процессов, обеспечивающих возможность существования современных форм жизни на Земле. Усвоение значительной части атмосферного азота обеспечивается симбиозами бактерий рода Rhizobium с высшими растениями из семейства Fabaceae Lindl. (Newton, 1994). Возникновение и последующее развитие такого бобово-ризобиального симбиоза является результатом сопряженной эволюции клубеньковых бактерий и бобовых растений (Проворов, 19966). Формирование бобово-ризобиального симбиоза тесно связано со многими фундаментальными процессами жизнедеятельности растений цитодифференцировкой и органогенезом, азотным и углеродным обменом, защитой от патогенов и регуляцией развития. В настоящее время показано, что формирование симбиоза, определяющее азотфиксирующую активность, контролируется генами обоих партнеров, в отношении которых обнаружены сложные регуляторные взаимодействия (Проворов, 1996а, 19966; Gresshoff, 1985). Это позволяет рассматривать симбиоз бактерий рода Rhizobium с высшими растениями из семейства Fabaceae Lindl. как биологическое сообщество, обладающее единой системой регуляции на генном уровне (Тихонович, Проворов, 1998; Gresshoff, Caetano-Anolles, 1992). Однако до недавнего времени при изучении симбиотической азотфиксации основное внимание исследователей уделялось микросимбионту, т.е. клубеньковым бактериям (Fisher, 1994). Если результаты молекулярно-генетического анализа открыли возможности генно-инженерного конструирования перспективных штаммов бактерий, то роль бобового растения в формировании симбиоза остается относительно слабо изученной. Установлено, что гены растения оказывают воздействие на основные события в процессе формирования и функционирования симбиоза, определяют способность к образованию клубеньков, их число на растение, клеточную и внутриклеточную организацию азотфиксирующей ткани (Caetano-Anolles, Gresshoff, 1991).

Эффективное изучение образования и функционирования симбиоза требует проведения комплексных исследований, затрагивающих самые разные стороны формирования симбиоза, включая биохимические, молекулярно-биологические, генетические и морфологические аспекты. Проведение таких исследований возможно лишь при использовании широкого набора современных методов анализа и создании модельных систем для изучения особенностей формирования и функционирования эффективного симбиоза. В настоящее время получена коллекция мутантов гороха, характеризующихся измененным типом формирования симбиоза с клубеньковыми бактериями (Tsyganov, et al., 1998). Эти мутанты были успешно использованы для идентификации генов растений, ответственных за формирование и развитие симбиоза. Показано, что развитие симбиоза представляет собой многоступенчатый процесс, во время которого у растения происходит сложная цепь морфогенетических и биохимических изменений. Изучение эффекта симбиотических мутаций позволило разделить процесс развития симбиоза на несколько отдельных этапов, каждый из которых контролируется одним или несколькими генами растения (Tikhonovich et al., 1995). Создана классификация мутантов, основанная на структурном анализе процесса формирования симбиоза (Борисов и др., 1998; Morzhina et al., 2000).

Однако, несмотря на то, что бобово-ризобиальный симбиоз является удобной моделью для изучения процесса азотфиксации, генетики симбиоза, механизмов взаимодействия высших растений с микроорганизмами (Werner, 1992; Тихонович, Проворов, 1998), особенности морфогенеза азотфиксирующей ткани и генетический контроль этого процесса до настоящего времени остаются еще недостаточно изученными. Неполной остается классификация симбиотических мутантов, для части мутаций слабо изучены их фенотипические проявления, точно не выявлены симбиотические стадии, которые они модифицируют (Борисов и др., 1998). Следовательно, получение индуцированных мутантов и изучение фенотипического проявления мутаций и в настоящее время остается актуальной задачей.

Следует отметить, что изучение бобово-ризобиального симбиоза имеет и большое практическое значение, т.к. ряд бобовых, например, соя, люцерна, горох, арахис, относятся к числу важных сельскохозяйственных культур. Повышение эффективности азотфиксации у растений ряда сельскохозяйственных культур существенно для обогащения почв "биологическим" азотом. Одним из путей повышения такой эффективности является создание и использование доноров для проведения селекции бобовых по этому признаку (Werner, 1995; Сидорова и др., 20016). Некоторые симбиотические мутанты гороха могут рассматриваться в качестве таких потенциальных доноров. Однако, полноценная оценка перспективности их использования возможна только при выяснении механизмов проявления конкретных мутаций с учетом плейотропных эффектов, которые могут проявляться на разных уровнях и этапах формирования растений. Нередко они приводят к изменению морфологии растений, структуры клубенька (количество зараженных клеток в клубеньке), ультраструктуры азотфиксирующей ткани (Борисов и др., 1998; Сидорова, Шумный, 19996).

В ИЦиГ СО РАН создана уникальная коллекция симбиотических мутантов гороха (Сидорова, Шумный, 19996). Логичным и актуальным продолжением этих исследований является детальное изучение влияния мутаций на формирование азотфиксирующей ткани в корневых клубеньках симбиотических мутантов гороха и изучение влияния морфологических особенностей формирования бактероидсодержащей ткани на эффективность азотфиксации.

Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования было изучение взаимосвязи между ультраструктурной организацией клубеньков и эффективностью азотфиксации. Для достижения этой цели использовали электронно-микроскопический и морфометрический анализ азотфиксирующей ткани клубеньков различных сортов и симбиотических мутантов гороха.

Задачи настоящего исследования состояли в следующем:

1. Изучить ультраструктуру бактероидсодержащей ткани из разных зон клубенька у мутантов гороха, различающихся по активности азотфиксации: К287 с неэффективными клубеньками, К15а со слабой азотфиксацией, суперклубеньковых мутантов nod3, К1 la, К22а, К301.

2. Провести сравнительный анализ ультраструктурной организации бактероидсодержащей ткани у суперклубеньковых мутантов и исходных сортов гороха, а также бактероидсодержащей ткани устойчивых к нитратам суперклубеньковых мутантов (nod3, nod4, nod6) и сорта Торсдаг (Nod5), ^ имеющих разный генетический контроль регуляции клубенькообразования.

3. Сравнить изменения морфологической организации бактероидсодержащей ткани у сортов гороха и их мутантов под действием полных норм азота.

4. Провести статистический анализ участков ткани из средней части зоны азотфиксации у сортов и симбиотических мутантов и оценить различия между эффективным и неэффективным симбиозом.

Научная новизна и практическая ценность. Полученные результаты ® вносят существенный вклад в понимание взаимосвязи между эффективностью азотфиксации и улыраструктурной организацией клубенька. В результате проведенных исследований было показано, что у сортов и их мутантов, образовавших эффективные клубеньки, развитие и ультраструктурная организация бактероидсодержащей ткани не имели структурных нарушений. С помощью структурного анализа процесса развития симбиоза у сортов и мутантов, образовавших неэффективные клубеньки и клубеньки с пониженным уровнем )■ азотфиксации, были выявлены стадии модификации формирования бактероидсодержащей ткани и структурные отклонения в организации зрелой азотфиксирующей ткани. У мутанта с неэффективными клубеньками была нарушена стадия Bad (дифференцировка бактероидов), у мутанта со слабоэффективными клубеньками структурные изменения организации ткани выявлены на стадии Nop (поддержание структурно-функциональной стабильности клубеньков). Впервые показано сходство в организации ультраструктуры клубеньков у форм с разным генетическим контролем нодуляции, но одинаково устойчивых к нитратам (сорт Торсдаг (Nod5) и суперклубеньковые мутанты (nod3, nod4, nod6).

Изучение влияния ультраструктурной организации бактероидсодержащей ткани клубенька на эффективность азотфиксации имеет важное значение для оценки и повышения азотфиксирующей способности бобовых культур. На основе изученных симбиотических мутантов была предложена модель для определения эффективности бобово-ризобиального симбиоза в полевых и вегетационных опытах (Сидорова и др., 2001а). Изучение симбиотических мутантов играет важную роль в создании доноров для селекции.

Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на: Отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (Новосибирск, 1999),

XVIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000).

Основные материалы опубликованы в б'гти печатных работах в отечественных журналах и сборниках.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, полученных результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 149 источников, в том числе 114 на иностранных языках. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, иллюстрирована 13 сводными рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Болоболова, Елена Устиновна

ВЫВОДЫ

1. Выявлены отклонения в формировании бактероидсодержащей ткани у мутантов с неэффективными (К287) и слабоэффективными (К15а) клубеньками: показана стадио-специфичность проявления мутаций (мутант К287 - стадия заражения, мутант К 15а - стадия азотфиксации), найдены различия в ультраструктурной организации зрелой азотфиксирующей ткани этих мутантов и их исходных сортов.

2. Показано, что различие ультраструктурной организации азотфиксирующей ткани у суперклубеньковых мутантов nod3, Klla, К22а, КЗ01 и исходных сортов Рамонский 77 и Рондо проявилось при выращивании на среде с нитратами, при выращивании на среде без нитратов различия в строении ткани отсутствовали.

3. Показано отсутствие различий в строении бактероидсодержащей ткани у устойчивых к нитратам суперклубеньковых мутантов (nod3, nod4, nod6) и сорта Торсдаг (Nod5), имеющих разный генетический контроль регуляции клубенькообразования.

4. Обнаружено, что у сортов и мутантов, не устойчивых к нитратам, под воздействием нитрата произошли ультраструктурные нарушения формирования бактероидсодержащей ткани на ранней стадии развития симбиоза.

5. Установлено, что у всех сортов и мутантов, образовавших неэффективные симбиозы, доля объема, занимаемая бактероидами в цитоплазматическом компартменте зараженных клеток, была значительно меньше, чем в эффективных симбиозах.

6. В результате изучения сортов и мутантов с различным типом генетического контроля было показано, что образование неэффективных и слабоэффективного симбиозов было связано с ультраструктурными изменениями азотфиксирующей ткани. Снижение удельной азотфиксирующей активности суперклубеньковых мутантов могло быть следствием структурного изменения клубеньков и присутствия на одном растении клубеньков, различающихся по эффективности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе созданной в Институте цитологии и генетики СО РАН коллекции симбиотических мутантов и сортов гороха проведена работа по изучению влияния ультраструктурной организации бактероидсодержащей ткани корневых клубеньков на эффективность азотфиксации. Проведенные в работе исследования позволяют углубить понимание взаимосвязи между эффективностью азотфиксации и ультраструктурной организацией корневого клубенька гороха. В работе были использованы сорта и симбиотические мутанты, различающиеся по эффективности азотфиксации: мутант с неэффективными клубеньками, мутант со слабоэффективными клубеньками, суперклубеньковые мутанты, сорта, различающиеся по устойчивости к нитратам. Во всех случаях, когда образовались неэффективные и слабоэффективные симбиозы, были найдены ультраструктурные отклонения в организации бактероидсодержащей ткани. В результате проведенных исследований были описаны следующие ультратруктурные особенности бактероидсодержащей ткани, характерные для неэффектиных клубеньков: редукция количества и размеров бактероидов, наличие нескольких бактероидов в перибактероидном пространстве, нарушение целостности перибактероидных мембран, присутствие гранул запасного вещества в матриксе бактероидов, быстрая деградация бактероидов. С помощью морфометрического анализа установлено, что у всех сортов и мутантов, образовавших неэффективные симбиозы, доля объема, занимаемая бактероидами в цитоплазматическом компартменте зараженных клеток, была значительно меньше, чем в эффективных симбиозах. Полученные данные хорошо согласуются с данными других авторов (Моржина и др., 1991, Андреева и др., 1992, Romanov et al., 1995 Borisov et al., 1997; Tsyganov et al., 1998; Morzhina et al., 2000). У мутантов была показана стадио-специфичность проявления мутаций. У мутанта с неэффективными клубеньками (К287) была нарушены раннии стадии развития симбиоза - стадии заражения и дифференцировки бактероидов. У мутанта со слабоэффективными клубеньками действие мутации проявилось на стадии азотфиксации. Согласно разработанной классификации (Борисов, Проворов и др., 1998) действие мутации К287 проявилось на стадиях Ваг эндоцитоз бактерий в цитоплазму растительной клетки) и Bad (дифференцировка бактероидов), мутации К 15а на стадии Nop (поддержание структурно-функциональной стабильности клубеньков). На основе изученных симбиотических мутантов была предложена модель для определения эффективности бобово-ризобиального симбиоза в полевых и вегетационных опытах (Сидорова и др., 2001а).

Суперклубеньковые мутации бобовых представляют особую группу среди симбиотических мутаций. Они затрагивают ранние регуляторные механизмы клубенькообразования: механизм регуляции количества образующихся клубеньков и механизм нитратного ингибирования клубенькообразования и азотфиксации. Регуляторные механизмы были созданы в процессе совместной эволюции растений и бактерий и направлены на создание оптимального баланса между потраченными ресурсами и полученным продуктом. У суперклубеньковых мутантов данные механизмы работают с низкой эффективностью. Мутанты характеризуются длительным периодом клубенькообразования, формированием огромного количества мелких клубеньков, устойчивостью к нитратам. Следствием формирования повышенного количества клубеньков является снижение урожайности растений. Можно сказать, что у суперклубеньковых мутантов тип отношений с бактериями сдвигается от симбиотического к паразитическому. Анализ строения бактероидсодержащей ткани показал, что ее формирование происходило нормально, без отклонений. Следовательно эффект суперклубеньковых мутаций не затронул непосредственно развития бактероидсодержащей ткани. В нашем эксперименте к началу цветения (периоду активной азотфиксации) часть клубеньков имели розовую окраску, а часть клубеньков были мельче по размеру и имели белый цвет. Розовые клубеньки содержали нормальную бактероидсодержащую ткань, а белые клубеньки содержали бактероидсодержащую ткань, характерную для неэффективного симбиоза гороха. Следовательно, к периоду цветения у суперклубеньковых мутантов часть клубеньков были эффективными, а часть неэффективными, и это, вероятно, могло быть следствием формирования повышенного числа клубеньков. Дальнейшее изучение суперклубеньковых мутантов поможет понять основу механизмов, по которым строятся взаимовыгодные отношения между растением и бактерией. С практической точки зрения эти знания важны для создания эффективных микробно-растительных сообществ - агробиоценозов.

Исследование механизма нитратного ингибирования у бобовых является одним из направлений изучения бобово-ризобиального симбиоза. К настоящему времени показано, что растение играет основную роль в регуляции клубенькообразования и азотфиксации в присутствии нитратов, найдены различия по чувствительности к нитратам между видами, сортами и линиями внутри видов (Carrol, Mathews, 1990). Выращивание растений на двух вариантах питания дало нам возможность сравнить влияние нитратов на формирование азотфиксирующей ткани у использованных в работе сортов и мутантов. Было показано, что у сортов и мутантов, не устойчивых к нитратам, под их воздействием произошли ультраструктурные нарушения формирования бактероидсодержащей ткани на ранней стадии развития симбиоза, стадии дифференцировки бактероидов. В неэффективных клубеньках (мутант К287, белые клубеньки у суперклубеньковых мутантов), нитраты ускорили процесс деградации азотфиксирующей ткани. Следовательно, действие нитратов не только нарушает развитие симбиоза, но и увеличивает скорость процессов деградации бактероидсодержащей ткани в клубеньке.

К настоящему времени с помощью структурного и ультраструктурного анализа клубеньковой ткани различающихся по эффективности азотфиксации сортов и мутантов гороха определены основные типы структурных нарушений, происходящих на разных стадиях развития симбиоза. Полученные результаты позволяют проводить оценку симбиотической эффективности при исследовании новых симбиотических мутантов, разных сочетаний эукариота и прокариота, а также при исследовании влияния различных факторов среды на развитие симбиоза, что является важным для создания высокоэффективных симбиотических систем.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Болоболова, Елена Устиновна, Новосибирск

1. Андреева И.Н., Козлова Г.И., Мандхан К., Измайлов С.Ф. Структурныеособенности различающихся по эффективности азотфиксации клубеньков бобовых // Физиология растений. 1992. Т.39. С.314-324.

2. Андреева И.Н., Кожаринова Г.М., Измайлов С.Ф. Структурные особенностимитохондрий корневых клубеньков бобовых // Физиология растений. 1995. Т.42. С.218-226.

3. Болоболова Е.У., Байбородин С.И., Сидорова К.К. // Ультраструктурабактероидсодержащей ткани линий гороха Pisum sativum L., имеющих разные регуляторные механизмы клубенькообразования // Цитология. 2000а. Т.42. С.1033-1036.

4. Болоболова Е.У., Губанова Н.В., Сидорова К.К. Ультраструктурныеособенности строения корневых клубеньков симбиотических суперклубеньковых мутантов гороха Pisum sativum L. // Отчетная сессия ИИЦиГ СО РАН / Сб. научн. тр. Новосибирск, 20006. С.201-204.

5. Борисов А.Ю., Проворов Н.А., Тихонович И.А., Цыганов В.Е. Генетическийконтроль взаимодействия бобовых растений с клубеньковыми бактериями // Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. Санкт-Петербург: Наука, 1998. С.8-62.

6. Гордиенко Н.Я., Майстренко Г.Г. Структурная основа развития симбиозов иих функционирование // Биологическая фиксация азота. Новосибирск: Наука, 1991. С.64-94.

7. Груздев А.Д., Христолюбова Н.Б., Шилов А.Г., Киселева Е.В., Мельников

8. В.А Применение стереологических методов в цитологии. Новосибирск: Изд-во ИциГ СО АН СССР, 1974. 80 с.

9. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии. Санкт-Петербург: Наука, 1994. 399 с.

10. Моржина Е.В., Борисова А.Ю., Куликова А.О., Лебский В.К. Ультраструктурный анализ эффективных и неэффективных клубеньков гороха // Цитология. 1991. Т.ЗЗ. С.3-7.

11. Проворов Н.А. Эволюция генетических систем симбиоза у клубеньковых бактерий // Генетика. 1996а. Т.32. С. 1029-1040.

12. Проворов Н.А. Коэволюция бобовых растений и клубеньковых бактерий: таксономические и генетические аспекты // Журнал общей биологии. 19966. Т.57. С.52-77.

13. Сидорова К.К. Генетические аспекты симбиотической азотфиксации //

14. Биологическая фиксация азота. Новосибирск: Наука, 1991. С.6-22. П.Сидорова К.К., Ужинцева Л.П. Использование мутантов для выявления генов, контролирующих симбиотические признаки у гороха // Генетика. 1992. Т.28. С.144-151.

15. Сидорова К.К., Ужинцева Л.П. Локализация мутантного гена nod4,контролирующего супернодуляцию у гороха // ДАН. 1994. Т.336. С.847-849.

16. Сидорова К.К., Шумный В.К. Новый ген гороха (Pisum sativum L.) Nod5-nod5,контролирующий нодуляцию // ДАН. 1997. Т.353. С.703-704.

17. Сидорова К.К., Шумный В.К., Власова Е.Ю. Исследование симбиотическихмутантов гороха // Генетика. 1997. Т.ЗЗ. С.656-659.

18. Сидорова К.К., Шумный В.К. Исследование суперклубеньковых мутантовгороха (Pisum sativum L.) // Генетика. 1998. Т.34. С. 1452-1454.

19. Сидорова К.К., Шумный В.К. Генетика симбиотической азотфиксации иосновы селекции для самоопыляющихся бобовых культур (на примере Pisum sativum L.) // Генетика. 1999а. Т.35. С.1550-1557.

20. Сидорова К.К., Шумный В.К. Генетическая роль бобового растения в симбиотической азотфиксации (на примере Pisum sativum) II Сибирский экологический журнал. 19996. Т.6. С.281-288.

21. Сидорова К.К., Гордиенко Н.Я., Новикова Т.И. Ультраструктура корневыхклубеньков симбиотических мутантов гороха Pisum sativum II Цитология. 1995. Т.37. С.849-852.

22. Сидорова К.К., Назарюк В.М., Шумный В.К., Кленова М.И. Новая модельдля определения эффективности бобово-ризобиального симбиоза // ДАН. 2001а. Т.380. С.283-285.

23. Сидорова К.К., Шумный В.К., Болоболова Е.У. О возможностииспользования линий гороха, маркированных геном Nods, в качестве доноров в селекции на повышение азотфиксации // ДАН. 20016. Т.377. С.847-849.

24. Сидорова К.К., Шумный В.К., Мищенко Т.М. Хромосомная локализациягена Nod5, контролирующего нодуляцию у гороха (Pisum sativum L.) // ДАН. 1999. Т.367. С. 851-852.

25. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Взаимодействие микроорганизмов ирастений: фундаментальные и прикладные аспекты // Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. Санкт-Петербург: Наука, 1998. С. 176-189.

26. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация // М.: Изд-во МГУ, 1986. 131 с.

27. Федорова М.Ю., Моржина Е.В., Филатов А.А., Лебский В. К., Тихонович

28. И.А. Влияние бактериальных и растительных мутаций, блокирующих симбиотическую азотфиксацию, на активность аспартатаминотрансферазыв клубеньках гороха {Pisum sativum L.) // Физиология растений. 1995. T.42. C.227-234.

29. Чесноков B.A., Базырина Е.Н. 1957. Выращивание растений без почвы наискусственных средах//Вестн. с.-х. науки. 1957. Т.4. С. 121-128. 32.Чундерова А. И. О генетике бобово-ризобиального симбиоза // С.-х. биология. 1981. Т.16. С.402-406.

30. Шильникова В.К. Ультраструктурная организация клубеньковых бактерий клевера и люцерны в условиях чистой культуры и симбиоза // Новое в изучении биологической фиксации азота. М., 1971. С.50-53.

31. Шильникова В.К. Цитоморфология и цитохимия клубеньковых бактерий вонтогенезе клубеньков разных видов бобовых культур // Изв. ТСХА. 1974. С.3-13.

32. Шумный В.К., Сидорова К.К., Клевенская И.Л., Родынюк И.С., Майстренко

33. Г.Г., Гордиенко Н.Я., Степаненко И.Ю., Сметанин Н.И., Артамонова B.C., Косинова Л.Ю., Новикова Т.И., Столярова С.Н., Аветисов Л.А. Биологическая фиксация азота. Новосибирск: Наука, 1991. 271 с.

34. Appleby С.А. Leghemoglobin and Rhizobium respiration // Annu. Rev. Plant

35. Physiol. 1984. V.35. P.443-478.

36. Appels M.A., Haaker H. Identification of cytoplasmic nodule-associated forms ofmalate dehydrogenase involved in the symbiosis between Rhizobium leguminosarum and Pisum sativum II Eur. J. Biochem. 1988. V.171. P.515-522.

37. Basset В., Goodman R.N., Novacky A. Ultrastructure of soybean nodules: Releaseof rhizobia from hte infection thread // Can. J. Microbiol. 1977. V.23. P.573-582.

38. Becana M., Sprent J.I. Nitrogen fixation and nitrate reduction in the root nodules of legumes // Phisiol. Plant. 1987 V.70. P.757-765.

39. Bergersen F.J. Anatomy and structure of nodules // Root nodules of legumes: structure and function. New York, 1982. P.23-50.

40. Bladergroen M.R., Spaink H.P. Genes and signal molecules involved in the Rhizobia-Leguminoseae symbiosis // Current Opinion in Plant Biology. 1998. V.l. P.353-359.

41. Borisov A.Y., Morzhina E.V., Kulikova O.A., Tchetkova S.A., Lebsky V.K.,

42. Tikhonovich I.A. New symbiotic mutants of pea (Pisum sativum L.) affecting either nodule initiation or symbiosome development // Symbiosis. 1992. V.14. P.297-313.

43. Brewin N.J. Development of the legume root nodule // Annu. Rev. Cell Biol. 1991. Y.7. P191-226.

44. Caetano-Annolles G., Gresshoff P.M. Plant genetic control of nodulation // Annu.

45. Rev. Microbiol. 1991. V.45. P.345-382.

46. Carroll B.J., Mathews A. 1990. Nitrate ingibition of nodulation in legumes //

47. Molecular Biology of Symbiotic Nitrogen Fixation. Boca-Raton, 1990. P. 159180.

48. Cullimore J.V., Bennett M.J. The molecular biology and biochemistry of plant glutamine syntase from root nodules of Phaseolus vulgaris L. and other legumes //Plant Physiol. 1988. V.132. P.387-393.

49. Dart P.J., Mercer F.V. Fine structure of bacteroids in root nodules of Vignasinesis, Acacia longifolia, Viminaria juncea and Lupinus angustifolius II J. Bacteriol. 1966. V.91. P.1314-1319.

50. Day D.A., Lambers H., Bateman J., Carrol B.J., Gresshoff P.M. Growthcomparisons of a supernodulating soybean (Glycine max) mutant and its wildtype parent // Physiol. Plant. 1986. V.68. P.375-382.

51. Denison R.F., Harter B.L. Nitrate effects on nodule oxygen permiability and leghemoglobin // Plant Physiol. 1995. V.107. P.1355-1364.

52. Deroche M.-E., Carrayol E. Nodule phosphoenolpyruvate carboxylase: a review // Physiol. Plant. 1988. V.74. P.775-782.

53. Due G., Messager A. Mutagenesis of pea {Pisum sativum L.) and the isolation ofmutants for nodulation and nitrogen fixation // Plant Sci. 1989. V.60. P.207-213.

54. Fisher H.-M. Genetic regulation of nitrogen fixation in Rhizobia II Microbiol. Rev.1994. V.58. N.3. P.352-386.

55. Fortin M.G., Morrison N.A., Verma D.P.S. Nodulin-26, a peribacteroid membrane nodulin is expressed independently of the development of the peribacteroid compartment // Nucl. Acids Res. 1987. V.15. P.813-824.

56. Ehrhardt D.W., Atkinson E.M., Long S.R. Depolarisation of alfalfa root hair membrane potential by Rhizobium meliloti Nod factors // Science. 1992. V.256. P.998-1000.

57. Engvild K.J. Nodulation and nitrogen fixation mutants of pea {Pisum sativum) II Theor. Appl. Genet. 1987. V.74. P.711-713.

58. Fedorova M., van de Mortel J., Matsumoto P.A., Cho J., Town C.D., VandenBosch K.A., Gantt J.S., Vance C.P. Genome-wide identification of nodule-specific transcripts in the model legume Medicago truncatula II Plant Physiol. 2002. V.130. P. 519-537.

59. Feenstra W.J., Jacobsen E. Isolation of a nitrate reductase deficient mutant of Pisum sativum by means of selection for chlorate resistance // Theor. Appl. Genet. 1980. V.58. P.39-45.

60. Fortin M.G., Zechelowska M., Verma D.P.S. Specific targeting of membrane nodulins to the bacteroid-enclosing compartment in soybean nodules // EMBO J. 1985. V.4. P.3041-3046.

61. Gelin O., Blixt S. 1964. Root nodulation in peas // Agri. Hort. Genet. 1964. V.22.1. P.149-159.

62. Gibson A.H., Harper J.E. Nitrate effect on nodulation of soybean by Rhizobium japonicum И Crop Sci. 1985. V.25. P. 497-507.

63. Gloudemans Т., Bisseling T. Plant gene expression in early stages of Rhizobiumlegume symbiosis // Plant Sci. 1989. V.65. P. 1-14.

64. Gordienko N.J., Novicova T.I., Sidorova K.K. Ultrastructural analysis of root nodules of pea mutants grown in the presence of nitrate // Abstract volume 10th International Congress of Nitrogen Fixation. Saint-Petersburg, 1995. P.288.

65. Gresshoff P.M., Day D.A., Delves A.C., Delves A.C., Mathews A.P., Olsson J.E.,

66. Price G.D., Shuller K.A., Carroll B.J. Plant host genetics of nodulation and symbiotic nitrogen fixation in pea and soybean // Nitrogen fixation research progress. Dordrecht, 1985. P.19-25.

67. Gresshoff P.M., Krotzky A. Mathews A., Day D.A., Schuller K.A., Olsson J.,

68. Delves A.C., Carrol В.J. Suppression of the symbiotic supernodulation symptons of soybean // Plant Physiol. 1988. V.132. P.417-425.

69. Gresshoff P.M., Caetano-Anolles G. Systemic regulation of nodulation in legumes

70. Plant Biotechnology Development. Boca Raton, 1992. P.87-100.

71. Guinell F.C., LaRue T.A. Light microscopy study of nodule initiation in Pisum sativum L., cv. Sparkle and in its low-nodulating mutant E2 (sym-5) II Plant Physiol. 1991. V.97. P. 1206-1211.

72. Hardarson G., Zapata F., Danso S.K.A. Effect of plant genotype and nitrogen fertilizer on symbiotic nitrogen fixation by soybean cultivars // Plant and Soil. 1984. V.82. P.397-405.

73. Heidstra R., Geurts R., Franssen H., Spaink H.P., van Kammen A., Bisseling T. Root hair deformation activity of nodulation factors and their fate on Vicia sativa II Plant Physiol. 1994. V.105. P.787-797.

74. Hinson K. Nodulation responces from nitrogen applied to soybean half-root systems // Agron. J. 1975. V.67. P.799-804.

75. Hirsch A.M., Lum M.R., Downie J.A. What makes the Rhizobia-legume symbiosis so special? // Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 1484-1492.

76. Holl F.B. Host plant control of the inheritence of dinitrogen fixation in the Pisum-Rhizobium symbiosis // Euphytica. 1975. P.24. P.767-770.

77. Houwaard F. Influence of ammonium and nitrate nitrogen on nitrogenase activity of pea plants as affected by light intrnsity and sugar addition // Plant and Soil. 1980. V.50. P.271-282.

78. Jacobsen E., Nijdan H.A. A mutant showing efficient nodulation in the presence of nitrate // Pisum Newsletter. 1983. V.15. P.31-32.

79. Jacobsen E. Futher characterisation of mutant nod3, highly nodulating in the presence of nitrate // Pisum Newsletter. 1984. V.16. P.23-24.

80. Jensen F. H. Variation in nodulation capacity of pea varieties // Pisum Newsletter.1986.V.18. P.30-31.

81. Kawashima K., Suganuma N., Tamaoki M., Kouchi H. Two types of pea leghemoglobin genes showing different 02- binding affinities and distinct patterns of spatial expression in nodules 1 // Plant Physiol. 2001. V.125. P. 641651.

82. Kijne J.W. The fine structure of pea root nodules. 1.Vacuolar changes after endocytotic host cell infection by Rhizobium leguminosarum II Physiol. Plant Pathol. 1975a. V.5. P.75-79.

83. Kijne J.W. The fine structure of pea root nodules. 2.Senescens and disintegration of the bacteroid tissue // Physiol. Plant Pathol. 19756. V.7, P.17-21.

84. Kijne J.W. The Rhizobium infection process // Biological Nitrogen Fixation. New York, 1992. P.349-398.

85. Kneen B.E., LaRue T.A. Additional mutants defective in nodulation // Pisum Newsletter. 1986. V.18. P.33.

86. Kneen B.E., LaRue T.A., Hirsch A.M., Smith C.A., Weeden N.F. Sym 13-a gene conditioning ineffective nodulation in Pisum sativum II Plant Physiol. 1990. V.94. P.899-905.

87. Komina O., Zhou Y., Sarath G., Chollet R. In vivo and in vitro phosphorylation of membrane and soluble forms of soybean nodule sucrose synthase // Plant Physiol. 2002. V.129. P.1664-1673.

88. Lie T.A. Temperature-dependent root-nodule formation in pea cv. Iran // Plant and

89. Soil. 1971. V.82. P.751-752.

90. Lie T.A., Timmermans P.C.J.M. Host-genetic control of nitrogen fixation in thelegame-Rhizobium symbiosis: complication in the genetic analyses due to maternal effects // Plant and Soil. 1983. V.75. P.449-453.

91. Lin J., Walsh K.B., Canvin D.T., Layzell D.B. Structural and physiological basesfor effectivity of soybean nodules formed by fast-growing and slow-growing bacteria // Can. J. Bot. 1988. V.66. P.526-534.

92. Long S.R. Genes and signals in the Rhizobium-legamQ symbiosis // Plant Physiol.2001. V. 125. P. 69-72

93. Lugtenberg B.J.J., Bloemberg G.V., van Brussel A.A.N., Kijne J.E., Thomas-Oates H.P., Spaink H.P. Signals involved in nodulation and nitrogen fixation // Nitrogen fixation: fundamentals and application. Netherland, 1995. P.37-49.

94. McNeil D.L., Carroll B.J., Gresshoff P.M. The nitrogen fixation capacity ofbacteroids extracted from soybean nodules inhibited by nitrate, ammonia or dark treatment// Symbiotic nitrogen fixation. 1984. V.l. P.79-85.

95. Mellor R.B., Christensen T.M.I.E., Werner D. Choline kinase II is present only in nodules that synthesize stable peribacteroid membranes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V.83. P.659-663.

96. Minchin F.R., Becana M., Sprent J.I. Short-term ingibition of legume N2 fixation by nitrate. II. Nitrate effects on nodule oxygen diffusion // Planta. 1989. V.l80. P.46-52.

97. Morey K.J., Ortega J.L., Sengupta-Gopalan C. Cytosolic glutamine synthetase in soybean is encoded by a multigene family, and the members are regulated in an organ-specific and developmental mannerl // Plant Physiol. 2002. V.128. P. 182193.

98. Morzhina E.V., Tsyganov V.E. Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A.

99. Four developmental stages identified by genetic dissection of pea (Pisum sativum L.) root nodule morphogesis // Plant Sci. 2000. V.l55. P.75-83.

100. Mylona P., Pawlowski K., Bisseling T. Symbiotic nitrogen fixation // Plant Cell. 1995. V.7. P.869-885.

101. Nap J.P., Bisseling T. Developmental biology of a plant-prokaryote symbiosis: The legume root nodule // Science. 1990. V.250. P.948-954.

102. Nelson R.S., Ryan S.A., Harper J.E. Soybean mutants lacking constitutive nitratereductase activity. I. Selection and initial plant characterization // Plant Physiol. 1983. V.72.P.503-511.

103. Newcomb W. Nodule morphogenesis and differentiation // International Review of Cytology. New York London, 1981. Supplement 13. P.247-297.

104. Newton W.E. Nitrogen fixation: some perspectives and prospects // Proc. 1st European Nitrogen Fixation Conference. Szeged, 1994. P. 1-6.

105. Novak K., Pesina K., Nebesarova J., Skrdleta V., Lisa L., Nasinec V. Symbiotic tissue degradation pattern in the ineffective nodules of three nodulation mutants of pea СPisum sativum L.) // Ann.of Bot. 1995. V.76. P.303-313.

106. Pate J.S. Nodulation studies in legumes. I. The synchronization of host and symbiotic development in the field pea, Pisum arvense L. // Austral. J. Biol. Sci. 1958. V.ll.P.366-381.

107. Pate J.S., Atkins C.A. Nitrogen uptake, transport and utilization // Nitrogen fixation. New York, 1983. V.3. P.245-298.

108. Park S.J., Buttery B.R. Inheritance of nitrate-tolerant supernodulation in EMS induced mutants of common bean (Phaseolus vulgaris L.) // J. Hered. 1989. V.80. P.486-488.

109. Penmetsa R.V., Cook D.R. A legume ethylene-intensitive mutant hyper-infected by its Rhizobial symbiont // Science. 1997. V.275. P.527-530.

110. Perret X., Freiberg C., Rosenthal A., Broughton W.J., Fellay R. High-resolution transcriptional analysis of the symbiotic plasmid of Rhizobium sp. NGR234 // Mol. Microbiol. 1999. V.32. P.415-425.

111. Perret X., Staehelin С., Broughton W.J. Molecular basis of symbiotic promiscuity // Microbiol, and Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. P. 180-201.

112. Planque K., Kennedy I.R., de Vries G.E., Quispel A., van Brussel A.A.N. Location of nitrogenase and ammonia-assimilatory ensymes in bacteroids of Rhizobium leguminosarum and Rhizobium lupini II J. Gen. Microbiol. 1977. V.102. P.95-104.

113. Postma J.G., Jacobsen E., Feenstra W.J. Three pea mutants with an altered nodulation studied by genetic analysis and grafting // Plant Physiol. 1988. V.132. P.424-430.

114. Postma J.G., Jager D., Jacobsen E., Feenstra W.J. 1990. Studies on a non-fixing mutant of pea (Pisum sativum L.) I. Phenotypical description and bacteroid activity//Plant Sci. 1990. V.68. P.151-161.

115. Ratajczak L., Ratajczak W., Koronarik D. Detection of nodule-specific forms of malatr dehydrogenase from root nodules of Lupinus luteus II Biochem. and Biophys. Pflanz. 1989. V.184. P.243-248.

116. Reynolds E.S. The use of lead cytrate at a high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // J. Cell Biology. 1963. V.17. P.208-212.

117. Robertson J.G., Farden K.J.F. Ultrastructure and metabolism of the developing legume root nodule // Biochem. of Plants. 1980. V.5. P.85-113.

118. Rosendahl L., Vance C.P., Miller C.P., Jacobsen E. Nodule physiology of a supernodulating pea mutant // Physiol. Plant. 1989. V.77. P.606-612.

119. Roth L.T., Stacey G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodules: the symbiosom membrane comes from three sources // Eur. J. Cell Biol. 1989. V.49. P. 13-23.

120. Sagan M., Huguet Т., Barker D., Due G. Characterization of two classes of non-fixing mutants of pea {Pisum sativum L.) I I Plant Sci. 1993. V.95. P.55-56.

121. Sagan M., Huguet Т., Due G. Phenotipic characterization and classification of nodulation mutants of pea {Pisum sativum L.) // Plant Sci. 1994. V.100. P. 59-70.

122. Sagan M., Due G. Sym-28 and Sym-29, two new genes involved in regulation of nodulation in pea {Pisum sativum L.) // Symbiosis. 1996. V.20. P.229-245.

123. Scheres В., van Engelen F., van den Knaap E., van de Weil C., van Kammen A., Bisseling T. Sequential induction of nodulin gene expression in the developing pea nodule // Plant Cell. 1990. V.2. P.687-700.

124. Sengupta-Gopalan C., Pitas J.W., Thompson D.V., Hoffmann L.M. Expression of host genes during root nodule development in soybeans // Mol. Gen. Genet. 1986. V.203. P.410-420.

125. Shaw V.K., Brill W.J. Isolation of an iron-molybdenum cofactor from nitrogenase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V74. P3249-3253.

126. Schneider A., Walker S.A., Sagan M., Due G., Ellis T.H.N., Downie J.A. Mapping of the nodulation loci sym9 and symlO of pea (Pisum sativum L.) // Theor. Appl. Genet. 2002. V.104. P. 1312-1316.

127. Schultze M., Kondorosi A. Regulation of symbiotic root nodule development // Annu. Rev. Genet. 1998. V.32. P.33-57.

128. Snapp S.S., Vance C.P. Asparagine biosynthesis in alfalfa {Medicago Sativa L.) root nodules // Plant Physiol. 1986. V.82. P.390-395.

129. Stougaard J. Update on nodule development // Plant Physiol. 2000. V.124. P. 531-540.

130. Suganuma N., Tamaoki M., Kouchi H. Expression of noduline genes in plant-determined ineffective nodules of pea // Plant Mol. Biol. 1995. V.28. P.1027-1038.

131. Tingey S.V., Walker E.L., Coruzzi G.M. Glutamine syntase genes of pea encode distinct polypeptides which are differentially expressed in leaves, roots and nodules // EMBO J. 1987. V.6. P. 1-9.

132. Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Rosov S.M., Tikhonovich I.A. New symbiotic mutants of pea obtained after mutagenesis of laboratory line SCE // Pisum Genetics. 1994. V.26. P.36-37.

133. Tsyganov V.E., Morzhina E.V., Stefanov S.Y., Borisov A. Y., Lebsky V.K., Tikhonovich I.A. The pea {Pisum sativum L.) genes sym33 and sym40 control infection thread formation and root nodule functioning // Mol. Gen. Genet. 1998. V.259. P.491-503.

134. Van de Wiel C., Scheres В., Franssen H., van Lierop M.J., van Lammeren A., van Kammen A., Bisseling T. The early nodulin transcript ENOD2 is located in the nodule parenchyma (inner cortex) of pea and soybean root nodules // EMBO J. 1990. V.9. P.1-7.

135. Van Kammen A. Suggested nomenclature for plant genes involved in nodulation and symbiosis // Plant Mol. Biol. Rep. 1984. V.2. P.43-45.

136. Van Rhijn P., Fujishige N.A., Lim P.O., Hirsch A.M. Sugar-binding activity of pea lectin enhances heterologous infection of transgenic alfalfa plants by Rhizobium leguminosarum biovar viciael II Plant Physiol. 2001. V.126. P.133-144.

137. Varkonyi-Gasic E., White D.W.R. The White clover enod40 gene family. Expression patterns of two types of genes indicate a role in vascular function // Plant Physiol. 2002. V.129. P.l 107-1118.

138. Vasse J., de Billy F., Camut S., Truchet G. Correlation between ultrastructural differentiation of bacteroids and nitrogen fixation in alfalfa nodules // J. Bacteriol. 1990. V.172. P.4295-4306.

139. Wais R.J., Keating D.H., Long S.R. Structure-function analysis of Nod factor-induced root hair calcium spiking in Rhizobium-legumQ symbiosis // Plant Physiol. 2002. V.129. P. 211-224.

140. Warmke H.E., Sheu-Ling J.L. Improved staining procedures for semithin epoxy sections of plant tissues // Stain Technology. 1976. V.51. P. 179-187.

141. WeedenN.F., Ellis T.H.N., Timmerman-Vaughan G.M., Swiecicki W.K., Rozov S.M., Berdnikov V.A. A consensus linkage map for Pisum sativum II Pisum Genetics. 1998. V.30. P. 1-4.

142. Werner D. Physiology of nitrogen-fixing legume nodules: compartments and functions // Biological Nitrogen Fixation. New-York-London, 1992. P.399-431.

143. Werner D. Ecology and agricultural applications of nitrogen-fixing systems: crop and sciences involved // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Proc. of the 10th Intern. Congr. on Nitrogen Fixation. Dordrecht, 1995. P.621-623.

144. Witty J.F., Minchin F.R., Skot L., Sheely J.E. Nitrogen fixation and oxygen in legume root nodules // Oxford Surv. Plant Cell Biol. 1986. V.3. P.275-315.

145. Young J.P.W. Linkage of sym-2, the symbiotic specificity locus of Pisum sativum И J. Hered. 1985. V.76. P.207-208.

146. Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН.

147. Автор выражает признательность сотрудникам лаборатории и института за помощь и поддержку на всех этапах выполения работы.