Симбиотические свойства низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L

Аль-Мосава, Назели Перчевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Симбиотические свойства низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Симбиотические свойства низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L"

На правах рукописи АЛЬ-МОСАВА Назели Перчевна

.1 РГБ ОД

' * фез г:.:

СИМБИОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НИЗКОКРАХМАЛЬНЫХ МУТАНТОВ ГОРОХА PISUM SATIVUM L.

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук Г. Я. Жизневская; кандидат биологических наук Г. Ф. Хайлова.

Официальные опподенты; доктор биологических паук 3. Г. Евстигнеева; доктор биологических наук В. Б. Иванов. Ведущее учреждение — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова.

на заседании Диссертационного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растевий им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР

Защита состоится.

2000 г. в

РАН.

Автореферат разослан,

2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат биологических наук

№

М. И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время не вызывает сомнений то, что симбиотическая азотфиксация является эффективным и экологически чистым источником азота.

Тем не менее ни одна страна мира пока не может полностью отказаться от применения азотных удобрений, так как без них нельзя получать высокие урожаи, столь необходимые при непрерывном росте населения. Единственный выход из этого положения в будущем - это максимальное увеличение эффективности биологической фиксации азота.

Общие масштабы биологической азотфиксации на планете составляют 175-324 млн.т. азота в год и в целом даже превосходят вклад в сельское хозяйство химических азотных удобрений (Черемисов, 1985; Шлегель, 1987). Но на единицу площади уровень азотфиксации пока недостаточен для обеспечения необходимых урожаев.

В связи с этим, актуальной задачей является изучение взаимосвязи симбиотической азотфиксации с генетически измененным метаболизмом бобового растения, что позволит создать формы, максимально использующие скмбиотическин потенциал растения-хозяина и клубеньковых бактерий.

В настоящее время большое внимание уделяется исследованию физиологии и биохимии как природных генетически измененных форм бобовых растений, так и полученных с помощью направленного мутагенеза.

Ещё со времён Грегора Менделя (1865) было идентифицировано большое количество генетических вариантов у гороха. Первый признак, описанный Менделем (1865) - признак округлости или морщинистости семян гороха. Эта альтернативная морфология семян контролируется г (nigosus) (White, 1917) и rb (Kooistra, 1962) локусами, где рецессивные аллели, кроме образования морщинистых семян, имеют множество эффектов на развитие и состав семян, что включает снижение содержания крахмала и увеличение пропорции амилозы в крахмале.

Мутация в г локусе снижает содержание крахмала в семенах, по сравнению с обычным круглосемянным горохом, и увеличивает процент содержания амилозы в крахмале. Присутствие rb локуса, напротив, снижает содержание амилозы в крахмале. При этом, обе эти мутации снижают процент содержания крахмала в сухих зрелых семенах гороха и увеличивают содержание в них белка и жира.

Вполне вероятно, что содержание в семенах крахмала, богатого энергией запасного продукта, может влиять и на азотфиксирующий симбиоз растения-хозяина и клубеньковые бактерии. Однако, исследования в этом направлении нам не известны.

В настоящее время путь синтеза крахмала в зародышах гороха хорошо изучен (Denyer, Craig, Harrison, Wang, Hedley, Martin and Smith, 1995). Развивающийся зародыш получает углерод в виде сахарозы, которая

метаболизируется через гликолиз в цнтозоле клеток семядолей. Глюкозо-6-фосфат входит в лластиды - место синтеза крахмала (схема 1) - через специфический транслокатор и превращается в АДФ-глкжозу посредством работы ферментов фосфоглкжомутазы и АДФ-глкжозопирофосфорилазы. Включение глюкозильной части АДФ-глюкозы в крахмал катализируется крахмалсинтазой и образующиеся цепи молекул глюкозы ветвятся благодаря ферменту ветвления крахмала.

Различия в уровне и составе крахмала в семенах гороха побудили учёных исследовать ферменты биосинтеза крахмала. В результате, были идентифицированы биохимические основы мутаций на локусах г и rb. Мутации на г локусе ликвидируют одну из форм крахмалветвящего фермента (SBE 1), что приводит к меньшему содержанию крахмала и к менее высоковетвисгому крахмалу (Smith, 1988; Smith, Betty, Bedford, 19S9; Hedley et. al., 1986). Мутации в rb локусе резко снижают активность АДФ-глюкозопирофосфорилазы, что ведёт к более низкому темпу синтеза крахмала (Smith, Betty arid Bedford, 1989).

Схема 1

Биосинтез крахмала из сахарозы в формирующихся семенах гороха (Hedlev. Wang. 1993)

/Г)

L ¡срахмг-i

^ ' ь/а У

CuM/naja.

JSOf - z^f+o/cCßci

W)-----

/¡r/axjtosa..

СТ4/

Таким образом, в настоящее время хорошо известно влияние генов г и гЬ на развитие семян гороха и состав запасных продуктов в них. Однако, до сих пор неясно, как подобные изменения в генотипе семян бобовых культур отражаются на азотфиксирукмцем симбиозе гороха с клубеньковыми бактериями.

Суммируя вей выше изложенное, можно заключить, что актуальной задачей нашего времени является разработка теоретических и методических основ селекции бобовых культур lia повышение интенсивности симбиотической азотфиксации, что позволит создать формы растений, способные максимально использовать потенциан снмбиотического взаимодействия. Важна также проверка на интенсивность симбиотической азотфиксации генетически изменённых сортов (Venna, Delauney, 1996).

В нашей работе мы сделали попытку исследовать влияние генетических изменений растения-хозяина на азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae, на примере низкокрахмальных мутантов гороха.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению симбиотических свойств трех природных низкокрахмальных мутантов гороха. Цель её - выяснить, затрагивают ли изменения в локуезх морщинистости у семян гороха симбиотическую систему растения, а именно - определить способность клубеньков мутантных растений гороха к накоплению крахмала и выяснить, обладают ли такие клубеньки азотфиксирующей активностью. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Вырастить мутантные и контрольные растения (обычный круглосемянный горох) на безазотной питательной среде в условиях азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae.

2. Исследовать клубеньки природных морщинистых мутантов гороха на способность накапливать крахмал.

3. Провести наблюдения за ростом и развитием мутантных растений гороха в условиях азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae, в сравнении с обычным круглосемянным горохом.

4. Исследовать особенности формирования и строения симбиотической системы у мутантов в отличие от круглосемянного гороха.

5. Дать оценку азотфиксирующей активности клубеньков у низкокрахмальных мутантов гороха и эффективности работы симбиотической системы вцелом по конечному

результату т.е. по количеству белка, накопленного растениями за весь период вегетации.

Научная новизна работы. Впервые изучены симбиотические свойства трех природных низкокрахмальных мутантов гороха (rrrbrb, rrRbRb, RRrbrb) Pisnm sativum L., значительно различающихся количественным и качественным составом крахмала в семенах, в сравнении с обычным круглосемянным горохом (RRRbRb). В вегетационных опытах, по выращиванию мутантных и контрольных растений на безазотной питательной среде, продемонстрирована потенциальная возможность низкокрахмальных мутантов к формированию значительно более эффективной симбиотической системы, в отличие от

обычного гороха. Впервые, на примере накопления крахмала у клубеньков мутантов гороха, показано существование прямой зависимости между изменениями в генотипе семян и симбиотической системой бобовых растений. Клубеньки гороха накапливали крахмал прямо пропорционально тому количеству, которое содержали исходные семена, сохраняя при этом и качественный состав (соотношение амилозы и амилопектина) крахмала исходных семян. Результаты выращивания опытных растений как в благоприятных, так и в неблагоприятных для нормального развития и функционирования симбиотической системы условиях окружающей среды, явились хорошей иллюстрацией того, что крахмал в клубеньках не только является запасным питательным веществом, откладывающимся там тогда, когда приток Сахаров из надземной части растения превышает их расход на нужды симбиотической системы, но имеет первостепенное значение, как энергетический резерв для поддержания нормального уровня её функционирования во время неблагоприятного периода, т.е. служит гарантом стабильности симбиотической системы. Полученные результаты являются существенным вкладом а физиологию растений, так как, с одной стороны, служат дополнением к существующей картине о роли отложения в клубеньках крахмала, а, с другой стороны, определяют степень зависимости симбиотической си« ¿мы от генетических изменений, происходящих в семенах „ бобовых растений.

Практическая ценность работы. Изучение снмбиотических свойств подобных мутантов позволяет расширить возможности управления процессом биологической азотфиксации в целях повышения её интенсивности. Важным источником растительного белка были и остаются зернобобовые культуры. Привлекает внимание способность клубеньков низкокрахмальных мутантов более активно фиксировать атмосферный азот, в результате чего мутантные растения накапливают за период вегетации больше беяка, чем контрольные. Таким образом, низкокрахмальные мутанты гороха служат богатым источником экологически чистого и биологически полноценного белка.

Публикации н апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 3-ей Европейской конференции по зернобобовым культурам (Вапладолид, Испания, 1998), 3-ем международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и пе^гспекгивы их использования" (Пущино, 1999) и на 4-том съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999). По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Структура н объём диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на^Гстраницах машинописного текста, содержит^?таблиц,^рисунков. Список использованной литературы включаек*£Йнаименований, из которых^*иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследований. Исследовали симбиотические свойства трёх низкокрахмальных мутантов гороха, значительно различающихся по количеству и качеству крахмала в семенах. Семена низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L. были получены от доктора Клиффа Хедли из коллекции семян Джон Иннес Института (г. Норвич, Великобритания). В табл.1 приводится номер из коллекции, назвашие генотипа и название сорта, наиболее близкого к использованным линиям гороха (Smith, Betty, Bedford, 1989).

Таблица 1

Номер из коллекции Джон Иннес Института по изучению растений, Великобритания. Генотип Название сорта

Ji 1068 RRRbRb Birte

RrRbRb Kelvedon Wonder

Ji 1156 RRrbrb Minnesota

Ji 399 RRrbrb Early Sweet

Ji 2108 Rrrbrb Cennia

Ji 827 Rrrbrb Асе

Симбиотические свойства морщинистых мутантов сравнивали с обычным круглосемянным горохом (контроль). В табл. 2 дана генетическая характеристика и содержание основных запасных веществ в этих семенах. Мутантиые гены в двух локусах f и rb влияют на содержание и состав крахмала в семенах гороха (Hedley, Wang, 1993; Hedley, Wang, Morris, Bogracheva, 1997) и приводят к морщинистости семян. Присутствие мутации в г локусе снижает содержание крахмала в семенах до 36%, по сравнению с круглосемянным горохом (54%) и увеличивает процент содержания амилозы в крахмале до 65% (высокоамилозный мутант). Присутствие rb локуса снижает не только содержание крахмала до 35%, но и процент содержания амилозы в крахмале до 23% (низкоамилозный мутант). Двойная мутация в г и rb локусах (мутант rrrbrb) ведёт к ещё большему уменьшению (всего 24%) общего содержания крахмала в семенах. Семена всех трех мутантов имеют повышенное содержание белка и жира.

Таблица 2

Содержание запасных продуктов (% на сухое вещество) в семенах линий гороха.

различающихся по генам в локусе мопщинистости (ruEosus) (Hedley Wane. 1993)

Генотип % общего крахмала % ттози в крахмале % белка % липидов

RRRbRb 54.0 33.0 22.0 1.9

rrrbrb 24.0 49.0 28.0 5.1

rrRbRb 36.0 65.0 26.0 3.6

RRrbrb 35.0 23.0 27.0 4.5

Выращиианис растений круглосемянного и мугантних Горохов на симбнотнчсском ..ште. Растения выращивались tí водной и песчаной культурах, на безазотной питательно» среде Ли (Lee, 1969), в камере фитотрона ИФР РАН, в разное время года, при естественном освещении. В качестве микросимбионта использовалась культура клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae - штаммы 250a (из коллекции Института сельскохозяйственной микробиологии г Пушкин, С.Петербург) и А-1 (ВНИИ зернобобовых и крупяных культур, г Орел).Инокуляция бактериальной суспензией проводилась тогда, когда длина зародышевых корешков проросших семян достигала 2-2.5 см, из расчёта два пробирочных косяка на 4 сосуда. Растения гороха выращивались в стеклянных сосудах Вагнера на 2 л (водная культура) и в пластмассовых сосудах Митчерлиха на 5 кг песка (песчаная культура), до фазы бутонизации-начала цветения. В течение всего вегетационного периода вёлся дневник наблюдений: отмечалось время образования клубе!» кок на корнях, прохождения фаз развития растениями, измерялся рост растений, ежедневно регестрировалась дневная температура в камере фитотрона и общее состояние растений, а также их реакция на изменения температурного и светового режима. Перед посевом определялась всхожесть и масса 1 ООО семян у каждой новой партии.

Методика гчлучення препаратов клубеньков для световой микроскопии. Клубеньки отбирали в фазу 7-8 листьев и в фазу бутонизации-начала цветения у растений; фиксировали смесью: формалин-этанол(96%)-ледкная уксусная кислота, в соотношении 10:3:1 (фиксатор Бродского), в течение 1.5-2 часов. После фиксации материал промывали в 3-х сменах этилового спирта, для полного удаления фиксатора. Для проводки (т.е. обезвоживания) до парафина использовалась следующая батарея растворов: 1) 96%-ный этиловый спирт - I час, 2) абсолютный спирт (100%-ный) -1 - от 45мин до 1.5 ч, 3) 100%-ный этиловый спирт-2 - от 45мин до 1.5 ч, 4)100%-ный спирт-хлороформ (3:1) - от1.5 до 2 ч, 5) 100%-ный спирт-хлороформ (1:1) - от 1.5 до 2 ч, 6) 100%-ный спирт-хлороформ (1:3) - от 1.5 до 2 ч, 7) хлороформ-1 -от К5 до 2 ч, 8) хлороформ-2 - от 1.5 до 2 ч ( при комнатной температуре); 9) хлороформ-парафин ("каша") - 12 ч (на ночь), 10) парафин-хлороформ -(4:1) -сутки (открытый бюкс), 11) чистый парафин - 1 (сутки), 12) чистый парафин -2 (сутки), 13) парафин до полного исчезновения хлороформа (в термостате при 56"С).

Далее всё проводилось по общепринятой методике: изготавливались "парафиновые пряники", из которых клубеньки легко выплавлялись иголочкой при изготовлении парафиновых блоков методом закапывания по С.Г. Навашину. Микротомные срезы толщиной 7 мкм готовили на микротоме фирмы SME (Англия) и наклеивали на предметные стёкла.

Для окрашивания срезов использовался метод комбинированной окраски белков и углеводов двумя разными проционовыми красителями на одном препарате rio Иванову и Литинской (Иванов, Литинская, 1967): А) срезы

депарафинировали и доводили до воды в следующей последовательности: 1) -ксилол (1) - 15 мин, 2) ксилол (2) - 10-15 мин, 3) ксилол- 100%-ный спирт (1:1)-5 мин, 4) 100%-ный спирт - 15 мйн, 5)96%-ный спирт - 15 мин; Б) окрашивали 0.1%-ным раствором проционового ярко-синего RS в дистиллированной воде 1 ч при 56°С в термостате (красятся белковые компоненты) - 60 мг красителя на 60 мл НгО диет; В) тщательно промывали срезы дистиллированной водой; Г) окрашивали 0.1%-ным раствором проционового ярко-красного 2BS в 1%-ном растворе соды (Na2C03), в темноте 30-40 мин. при 18-20°С - 60 мг красителя на 60 мл 1%-ной соды (красятся углеводы); Д) промывали дистиллированной водой и давали стечь воде на фильтровальной бумаге; Е) заключали в канадский бальзам. Для чего препараты проводили через серию спиртов и ксилола в обратной последовательности по отношению к тому, как подготавливались парафиновые срезы для их окраски воднорастворимыми (проционовыми) красителями. Окрашенные препараты покрывали покровными стёклами, пока препараты ещё не высохли от ксилола, чтобы бальзам равномерно накрыл срезы.

Определение нитрогеназной активности в клубеньках гороха. Нитрогеназная активность в клубеньках гороха измерялась ацетиленовым методом, на цельных корневых системах, в фазу бутонизации-начала цветения растений, на хроматографе Crom-4 (Чехия). Интактные корневые системы помещались в стеклянные сосуды на 100-125 мл (сосуды Килнера); ацетилен вводили в каждую склянку газовым шприцом до концентрации, равной 10% её объёма (10 мл). Стеклянные сосуды инкубировались в термостате при 27°С в течение 1 часа. Измерение проводили в 8-ми кратной биологической и 3-х кратной аналитической повторное™. Нитрогеназная активность клубеньков выражалась в кМ СзН4, образующегося на единицу сырого веса отделённых клубеньков (г) за единицу времени (ч).

Определение белкового азота и белка в растениях гороха. Растения отбирались в фазу бутонизации-начала цветения и фиксировались в сушильном шкафу: 15 мин. при 105-110°С в крафт-бумаге, а затем на воздухе при 80°С. Белок осаждали сернокислой медью в щелочной среде (CuSCU • CuOH) на бумажном фильтре, осадок белка отмывали от небелковых и растворимых азотсодержащих соединений и высушивали в термостате при 60°С. Затем осадок белка вместе с фильтром переносили в колбы Кьельдаля и озоляли серной кислотой с последующим отгоном аммиака на аппарате микро-Къельдаля по общепринятой методике. Содержание белка получали умножением количества белкового азота на коэффициент 5.7.

Биохимическое исследование содержания крахмала в клубеньках. Клубеньки отбирали в фазу бутонизации-начала цветения и фиксировали текучим паром на водяной бане, с последующим досушиванием в сушильном шкафу при 40°С. Общее содержание крахмала в % определяли колориметрическим методом, по Рихтеру (Рихтер, Аугустат, Ширбаум, 1975). О качественном составе крахмала клубеньков (соотношение 2-х основных

фракций крахмала - амилозы и амилопекгина ) судили по окраске полисахарид-иод ного комплекса.

Опенка конечной эффективности симбиотичсской системы. Эффективность симбнотической системы оценивалась по количеству белка, накопленного растениями гороха за период вегетации от посева до начала цветения. Количество белка, накопленного растением за счёт биологической фиксации азота (мг на 1 растение), рассчитывалось как разность между содержанием белка в растении (мг на 1 растение) и содержанием белка в семенах, использованных для посева (мг на сухой вес семян).Поскольку опытные растения выращивались на безазотной питательной среде без стартовой дозы азота, то такая оценка является достоверной.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Крахмал в семемах н клубеньках круглосемянного гороха и гороха с • морщинистыми семенами.

Изучение структуры бактероидсодержащей ткани клубеньков на препаратах световой микроскопии. Бакгероидсодержащая ткань клубенька гороха состоит из инфицированных и неинфицированных клеток. Амилспласты - место отложения крахмала, находятся .в основном в неинфицированных клетках, которых в бактероидсодержащей ткани гороха достаточно много (табл.3). Много амилопластов н в клетках коры клубенька. В молодых инфицированных клетках также встречаются пластиды, но их.очень мало. Так как клубеньки гороха относятся к типу клубеньков с недетерминированным ростом, то под световым микроскопом кроме коры, бактероидсодержащей ткани и проводящей (сосудистой) системы клубенька,-хорошо видна постоянно действующая меристема.

Таблица 3

Характеристика структуры бактероидсодержащей ткани клубеньков низкокрахмальных мутантов гороха___; _ _

Вариант ■Средний сырой вес одного клубенька,. мг. Процент инфицир. и неинфицир. клеток, центральной ткани клубенька. Инф. Неинф. Среднее , • число пластид на одну неинф. клетку. ; Диаметр пластид, р. Содержание крахмала в пластидах.

Контроль штьяь 4.7 ±1.16 • 68 -±2(4. 32 10.0 ±0.53. +++

Мутант гггЬгЬ 5.3 ±0.85 58 ±0.8 41 ±0.8 8.9 ±0.45 6.11 ±0.33 +

Мутант ггШУ> 5.7 ± 0.72 65 ± 1.7 35 ± 1.6 10.5 ± 0.54 7.38 ±0.22 ++

Клубеньки контрольных и мугантных растений мало отличались по числу пластид в неинфицированных клетках бакгероидсодержащей ткани и соотношению инфицированных и неинфицированных клеток (табл.3). Пластиды клубеньков мугантных растений отличались от контрольных меньшим диаметром, особенно у двойного мутанта (птЬгЬ) - 6.11 микрон, против 10.0 микрон у круглосемянного гороха. Они также отличались по накоплению в них крахмала.

Накопление крахмала в клубеньках иизкокрахмальных мутантов гороха. Особое внимание в наших исследованиях уделено изучению клубеньков низкокрахмальных мутантов гороха на способность откладывать крахмал, в сравнении с клубеньками круглосемянного гороха. Как видно из таблицы 3, это единственное существенное различие между клубеньками. На препаратах для световой микроскопии синим цветом окрашены инфицированные клетки, а неинфицированные клетки выглядят белыми и в них хорошо видны окрашенные в красный цвет амилопласты. Окрашивание срезов клубеньков по методу Иванова и Литинской (Иванов, Литинская,1967), дало возможность судить об относительном количестве содержащегося в амилопластах крахмала, по интенсивности окраски пластвд. То есть, чем ярче (интенсивнее) окрашены амилопласты в красный цвет, тем больше в них содержание крахмала (качественная реакция на крахмал).

Амилопласты клубеньков круглосемянного. гороха были значительно крупнее (контроль, ЯВДМ&Ь) и окрашены в ярко-красный цвет, что свидетельствует, о том, что крахмала в них много. Резко контрастировал с контролем по этим показателям двойной мутант (гггЬгЬ). Пластиды в неинфицированных клетках этого мутанта были бледно окрашены и их цвет почти совпадал с окраской инфицированных клеток. Крахмала в них очень мало. Сами неинфицированные клетки здесь крупнее, имеют вытянутую форму, а пластиды мельче, чем в контроле. У высокоамиДозного мутанта (ггЛЬШ)) пластиды были мельче, чем в контроле, но крупнее чем у двойного мутанта и содержали определённое количество крахмала, о чём свидетельствовал их розовый цвет. Клубеньки низкоамилозного мутанта (ИЯгЬгЬ) по содержанию крахмала были близки к клубенькам высокоамилозного мутанта.

Таким образом, нами обнаружена прямая взаимосвязь между содержанием крахмала в семенах гороха и накоплением его клубеньками. Чем больше крахмала содержится в семенах, тем больше его накапливается в « клубеньках и наоборот.

Взаимосвязь между качественным составом крахмала семян и крахмала клубеньков мутантов гороха. Известно, что две основные фракции крахмала -амилоза и амилопектин - дают различную окраску с иодом. Растворы амилозы с иодом дают синюю окраску, а амилопектин, наоборот, придает полисахарид-иодному комплексу фиолетовую окраску. Во время определения содержания крахмала в клубеньках контрольных и мутантных растений гороха биохимическим методом, по Рихтеру (Рихтер, Аугустат, Ширбаум, 1975), полисахарид-иодный комплекс контрольных растений (ШШ>Ю>), двойного

мутанта (птЫЬ) и высокоамилозного мутанта (пИЬКЬ) окрашивался в синий цвет, а у низкоамклозного мутанта (ИЯгЬгЬ) - в фиолетовый цвет (табл.4). Значит, существует прямая зависимость не только между содержанием крахмала в семенах и накоплением его клубеньками, но и качественным его составом. Клубеньки мутантных Горохов не только содержали меньше крахмала, но и сохраняли тот же качественный его состав (соотношение амилозы и амилопектина), что и исходные семена.

Пока неизвестно, свойственна ли выявленная нами закономерность только данным мутантам гороха, данной культуре (гороху) в целом или является общей особенностью для всех бобовых культур.

Таблица 4

Содержание крахмала в клубеньках мутантных растений гороха в сравнении с ^углосемянным горохом__

Вариант (генотип) Содержание крахмала, % Окраска полисахаридиодного комплекса

Контроль 15% голубая

Мутант птЬгЬ следы голубая

Мутант пКЬИЬ следы голубая

Мутант ИКгЬгЬ следы фиолетовая

Р лет и развитие мутантных растений гороха, выпаженных на

' симбнотнческ'ом азоте.

Несмотря на то, что растения гороха выращивались в разное время года и, следовательно, в разных условиях, во всех проведённых нами опытах период от посева до фазы цветения имел одинаковую продолжительность, равную 45-47 дням. Весь период вегетации от посева до полной спелости зерна, продолжался в течение 73-х дней.

Прорастание и развитие проростков гороха до образования корневых клубеньков. Из литературных данных известно, что запасные вещества семядолей гороха могут обеспечивать жизнедеятельность зародышевого корешка и стебелька в течение 40-50 дней, т.е. в нашем случае до фазы образования у растений гороха 8-ми пар листьев. Семена низкокрахмальных мутантов гороха изначально имели повышенное содержание белка. Причем, процент содержания белка в них увеличивался по мере снижения содержания крахмала. »

Определение процента проросших семян и процента проростков, достигших фазы 2-х пар листьев, показало, что семена мутантных растений прорастали и развивались значительно лучше контрольных (табл.5). У контрольных растений процент проростков, достигших фазы 2-х пар листьев, составил всего 48%. В то же время, у двойного мутанта по г и гЬ локусам (птЬгЬ) этой фазы достигли 80% растений. Наблюдалась обратная корреляция между содержанием крахмала в семенах и количеством нормально развитых проростков.

Таблица 5

Способность семян контрольных и мутаитных растений гороха к прораспити".. последующим нормальным развотиетпроростков

Вариант

Содержание крахмала, % на сух. вес семян.

Процент проросших семян, %.

Процент проростков, достигшие фазы 2-х пар листьеп,

Всс ЮООссмян, г (исходных).

Контроль ЯККЬКЬ

179.5

Мутант птЬгЬ

123.7

Муганг ггИЬЮ?

179.0

Мутант ККгЬгЬ

140.8

По степени развития корневой системы растения, особенно в первый период его жизни, можно судить о жизнеспособности растения в целом. В наших опытах (табл. 6), зародышевые корешки мутантных растений развивались быстрее и достигали большей длины за разные промежутки времени, чем у контрольных растений. И снова отмечена обратная корреляция между содержанием в семенах крахмала и длиной корешков у 5-ти дневных проростков гороха.

Таблица 6

Дпииа корешков у 5-ти дневных проростков гороха

Вариант (генотип) Длина корешков, мм

Контроль Ц]Щ>Ш> 19.7 ±1.7

Мутант птЬгЬ 24.6 ±1.6

Мутант ггКЬКЬ 21.6 ±2.4

Мутант ГШгЬгЬ 23.8 ± 1.8

В условиях наших опытов, когда растения гороха выращивались на безазотной питательной среде, их рост и развитие до формирования на корнях клубеньков находились в значительной зависимости от количества и состава запасённых в семенах веществ, особенно белка. Как отмечалось выше, низкокрахмальные мутанты гороха имели повышенное содержание белка в семенах. Существующая прямая пропорциональная зависимость между развитием проростков гороха и содержанием в семенах белка, служит ещё одним доказательством правильности гипотезы о том, что симбиотизирующне бобовые растения имеют период {^-лимитированного (ограниченного доступом азота) роста, перед тем, как накопят достаточное количество азота и станут С-лимитированными.

Внешнне особенности формирования симбиотической системы у мутантов. Изучение строения корневой системы мутантов гороха, в связи с образованием на корнях клубеньков показало, что мутантам свойственно, при большей азотфиксирутощсй активности, формировать меньшее число клубеньков, более крупных размеров. Корневая система мутантов менее

разветвлённая (степень разветвления корневых систем: Щ1ШэДЬ > ггЛЬИ» > КкгЬгЬ > птЬгЬ), чем у контрольных растений. Известно, что когда растения испытывают дефицит азота или других необходимых элементов, они формируют большее количество корней, как бы пытаясь этим улучшить условия усвоения этих элементов (Панников, Павлов, 1982). То, что мутанты формируют меньшее количество корней, особенно в нижележащих слоях субстрата (чем ниже, тем меньше разветвлений), говорит о том, что они, возможно, не испытывают недостатка в азоте, а если и испытывают, то явно в меньшей степени, чем контрольные растения. Наименее была разветвлена корневая система двойного мутанта (птЬгЬ), который, как будет показано в дальнейшем, обладает наибольшей азотфиксирующей активностью,..

Основная масса клубеньков у мутантов, как и у контрольных растений, формировалась на боковых корнях, но у мутантов птЬгЬ и ггШ)ЯЬ клубеньки формируются также и на глубоко расположенных в почве боковых корнях. Имеются литературные данные о том, что формирование клубеньков на боковых корнях и более глубоко расположенных боковых корнях, обычно происходящее позже» чем формирование клубеньков на главном корне, имеет существенное значение ;%ЯГ>. ЩК^лпдмго". Ьрояшгения азотфнксации

Развитие симбиотнческой системы мугантных и контрольных растений гороха. Мушггные растения имели больший сырой вес корней, при меньшей их длине по сравнению с контрольными. Корни контрольных растений имели большее число клубеньков, но клубеньки были мелкие в основной своей массе. Ряд распределения клубеньков по массе будет выглядеть так; птЬгЬ > ЯКгЬгЬ > ггЯЬЯЬ > ЛЯШИ) (табл. 7).

Таблица 7

Строение корневой системы растений гороха (апрель-май. 1999. фаза начала цветения)_• __.;. ■..:.'........ .. " ■• .

Вариант (генотип). Сырой вес корневой системы одного растения, г. Длина главного корня, см. " Суммарный сырой вес ■ клубеньков на 1 растение, мг. Число клубеньков на корнях 1 растения, • шт. Средний сырой вес одного клубенька, мг.

Контроль ИИКЬКЬ 1.27 ±0.16 25.6 ±3.23 435 ±28.8 31» ±26.6 1.41 ±0.16

Мутшгг' птЬгЬ 1.47 ±0.11 23.1 ± 1.62 340 ±25.8 ; 143 ±13.8 2.52 ±0.27

Мутант ггИЬИЬ 1.59 ±0.14 24.6 ±1.21 442 ±33.8 249 ±24.1 1.85 ±0.15

Мутант ЯЬЬгЬ 1.42 ±0.12 24.4 ±1.59 332 ± 18.7 156 ±18.5 2.36 ± 0.30

Накопление сухого вещества контрольными и мутантными растениями гороха. Количество сухого вещества, накопленного растением до фазы

цветения, служит в наших опытах одним из косвенных показателей эффективности симбиоза. Как видно на рисунке 1, мутантные растения накопили значительно больше сухого вещества во всех органах и в растении в целом. Среди мутантов наибольшее количество сухого вещества накопил двойной мутант (гтгЬгЬ), а меньшее - низкоамилозный мутант (Ш1гЬгЬ).

Рисунок I

¡2 & 2*200

—Контрольные растения ЯКНЬЯЬ

иМутант Р.ПгЬгЬ

Корни

Клубеньки Вс£ распине

Рисунок 1. Накоплениесухого вещества растениями мг на сухой средний вес одного растения (фаза начала пвктшш}.

Влияние условий окружающей среды на рост и формирование симбиотической системы мутантных растений гороха. По литературным • источникам, прорастание семян гороха возможно при +1-2"С, но при такой - низкой температуре оно длится 12-14 дней. При температуре +8-10°С семена полностью прорастают за 4-6 дней. Оптимальная температура для роста и развития гороха+18-25°С.

Выращивание опытных растений в разное время года и, соответственно, в разных условиях температурного режима н естественного освещения показало, что мутантные растения, обладающие более высоким потенциалом к формированию эффективной симбиотической системы, находятся в большей зависимости от температурного режима, чем обычный круглосемянный тип (МШШЬ). Причём, это непосредственно связано с накоплением крахмала в клубеньках гороха.

Растения гороха выращивались в двух температурных режимах (табл.8 и 9): 1.Зимой при недостаточном естественном освещении и средней температуре 11-14°С в фитотроне (в дневное время суток) за весь период вегетации. 2. В летне-осенний период в оптимальных условиях вегетации - хорошее естественное освещение и средняя температура за период вегетации 20-22°С. Оказалось, что при низких температурах и недостаточном освещении контрольные растения росли лучше мутантных о чём свидетельствует больший сырой вес их надземной части и высота (табл. 8). На корнях круглосемянного гороха образовывалось больше клубеньков (табл. 9).

Таблица 8

Рос-г пасте!IиДгороха при разных температурных режимах

Вариант Содержание Амилоза в Сырой вес Высота

(генотип) крахмала в крахмале,% надземной части, растения, см

семенах,% г

на сухой вес 1 * 2** 1* 2**

Контроль кииль 54 33 2.10 ±0.29 2.30 ±0.4 23.1 ±0.9 29.0 ±3.97

1.35 3.10 22.3 31.1

Мутант птЬгЬ 24 49 ±0.12 ±0.4 ±0.7 ±2.28

1.74 2.80 26.5 35.0

Мутант ггНЬКЬ 36 65 ±0.01 ±0.3 ±0.8 ±1.25

1.64 3.0 22.1 31.7

Мутант ЯЯтЬгЬ 35 23 ±0.06 ±0.4 ±0.9 ±2.71

1* - янкарь'февраяь 1998 г, фаза начала цветения. 2** - август-сентябрь 1998 г, фаза начала цветения.

Таблица 9

симбнотической системы на корнях гороха

Вариант (генотип) Суммарный сырой вес клубеньков, мг на 1 растение Число клубеньков (среднее на 1 растение), шт Средний сырой вес одного клубенька на растение, г.

1 ♦ 2»* 1 * 2•* , * 2**

Контроль ККЯЬКЪ 280 ± 43.3 795±151 60 ±15.8 128 ±25.5 4.67 6.40 ± 0.60

Мутант гггЬгЬ 104 ± 24.8 809 ±93 20 ± 5.20 133 ±29.2 5.20 6.80 ± 0.90

Мутант ггКЬИЬ 175 ± 9.80 869 ± 73.0 34 ±5.10 127 ±25.2 5.15 6.80 ± 0.90

Мута(гг 1ШгЬгЬ 170 ±6.20 866 ± 104 42 ±6.90 125.8 ± 15 4.05 6.60 ± 0.80

1 * - январь-февраль 1998, фаза начала цветения.

2 **- август-сентябрь 1998, фаза начала цветения.

При благоприятных условиях выращивания, наоборот, мутантные растения росли лучше контрольных и формировали большую массу клубеньков. Особого внимания здесь заслуживает высокоамилозный мутант (¡гЯЬЯЬ), который даже в условиях пониженных температур и недостаточного освещения рос и формировал симбиотнческую систему не хуже круглосемянного гороха, г.отя и содержал меньше крахмала в семенах. Низкоамилозный мутант (Ш1гЬгЬ), напротив, хуже всех переносил низкие положительные температуры. Причина этого, по-видимому, кроется в существенном различии качественного состава крахмала у этих мутантов.

Известно, что амилопектин (высокоразветвлённый полимер глюкозы) поддаётся ферментативному осахарнванию труднее, чем амилоза (неразветвлённый полимер глюкозы). Так, например, сахарообразующая В -амилаза может целиком превратить амилозу в мальтозу и в результате сделать её растворимой в холодной воде. В то же время от амллопектина она может отщепить всего-навсего несколько единиц мальтозы, причём часть молекулы останется нерастворённой. Фермент атакует сначала невосстанавливающие концы разветвлений, приближаясь затем к местам раздвоения цепей. Для воздействия на те звенья, от которых отходят раззетвления, необходим другой фермент, и при его отсутствии реакция на этом и заканчивается (Фрей-Висслинг, Мюлеталер, 1968).

Таблица 10

Рост и развитие растений гороха в условиях резкого понижения температуры в базе 6-ти пар листьев, до + ТС в дневное время суток (апрель-май. 1999. фдча начала цветения) ___

Вариант (генотип) Высота растения, см Сырой вес надземной части одного растения, г

Контроль RRRbRb 29.8 ± 0.80 2.71 ± 0.20

Мутант rrrbrb 29.1 ± 1.40 2.00 + 0.10

Myrairr rrRbRb 28.2 ± 0.95 2.70 ± 0.20

Мутант KRrbrb 22.2 ± 0.80 1.44 ±0.07

Именно поэтому отложчвшийся в форме амилозы крахмал легче и быстрее используется растением при неблагоприятных условиях, когда может снижаться уровень фотосинтеза и азотфиксацик. Следовательно, чем больше процент запасённого в клубеньках крахмала и чем больше в кем содержится амилозы, тем лучше растения гороха адаптируются к факторам, лимитирующим две важнейшие функции их организма, к каковым относятся фотосинтез и азотфиксация. Вот почему низкоамилозный мутант, отличающийся по общему содержанию крахмала в семенах только на 1% от высокоамилозного мутанта, оказался в самом невыгодном положении.

Результаты опыта 5 (табл. 10) подтверждают изложенное выше. Опыт проводился в апреле-мае 1999 г и в целом дублиропал опыт 4. Однако, в отличие от опыта 4, где весь период вегетации проходил в оптимальном температурном режиме, растения подверглись резкому понижению температуры в фазе 6-ти пар листьев (до +7°С в дневное время суток). Уже сформировавшиеся и функционирующие к тому времени клубеньки на короткое время потеряли свою активность, а затем вновь её восстановили после того, как растения были перенесены в тёплое помещение (+20"С).

О том, что клубеньки временно потеряли свою активность, а затем сё восстановили, судили по окраске среза живых клубеньков т.е. окраске пигмента - леггемоглобина. Клубеньки на время стали зелёные. С повышением температуры восстановился рост клубеньков. Меристема сформировала de novo

клетки бактероидсодержащей ткани в замен деградированных вследствие неблагоприятных условий. Вновь сформированные зрелые клетки содержали леггемоглобин и активно фиксирующие азот бактероиды. О чём, кроме цвета клубеньков свидетельствовало усиление роста мутантных растений.

В фазу начала цветения контрольные и мутантные растения, в основном, выровнялись в росте и имели сходный сырой вес надземной части, кроме низкоамилозного мутанта. У него (1ШгЬгЬ) вес надземной части снизился почта в два раза по сравнению с контролем.

Оценка продуктивности симбнотической системы мутантных растений гороха, выращенных на безазотной питательной среде.

Оценка азотбиксирующей активности клубеньков. Нитрогеназная активность корневых клубеньков измерялась в фазу бутонизации-начала цветения. Считается, что именно в этот период она должна быть максимальной.

Измерение нитрогеназной активности у растений, выращенных при благоприятных условиях (табл. 11) показало, что корневые клубеньки мутантов значительно активнее фиксируют атмосферный азот по сравнению с контрольными растениями. Особенно высокой активностью отличался двойной мутант гггЬгЬ - 53 771 нМ С2Н4/Г'1 • ч"1. У мутантов гтЯЫНЬ (высокоамилозный) и 1ШЬгЬ (низкоамилозный), содержащих 36 и 35% крахмала в семенах, активность азотфиксации составляла 41968 и 33215 нМ Сг ЬЦ/г'1 • ч"1 . Активность азотфиксации контрольных растений составила всего 26669 нМ С^ РЦ/г'1 • ч"1, то есть была ниже в среднем в два раза.

Таблица И

Нитрогеназная. активность клубеньков низкокрахмальных мутантов гороха в

сравнении с клу пеньками кр' Вариант (генотип) гтлосемянного гороха Содержание крахмала в семенах, % на сухой вес семян.' Нитрогеназная активность нМС^Уг'Ч'1.

Контроль ЛЯЯЬЯЬ 54 26669 ±5014

Мутант ггЬгЬ 24 53771±12538

Мутант ггЯЬМ) 36 41968±10141

Мутант ККгЬгЬ 35 33215 ± 7462

Оценка эффективности симбиотической системы в целом. Критерием эффективности симбиотической системы гороха в вегетационных опытах служило накопление азота и белка в растениях за весь период вегетации. А так как в условиях наших опытов растения выращивались в водной кулыуре, на безазотной питательной среде, то этот критерий является достоверным.

Определение содержания общего и белкового азота в растениях гороха по органам показало, что большую долю от общего азота во всех органах гороха составляет белковый азот. По органам белковый азот и белок распределяются следующим образом: надземная часть > клубеньки > корни. То есть больше всего белка содержится в надземной части гороха, а меньше всего- в корнях. Во

всех органах мутантные растения содержали белка больше, чем контрольные. Среди мутантов, самое высокое содержание белка в надземной массе и в корнях имел двойной мутант (птЬгЬ), с самым низким содержанием крахмала в семенах. Ниже приводятся ряды распределения содержания белка по органам среди мугантных растений гороха:

1. Надземная часть и корни: мутант'птЬгЬ > мутант ИЛгЬгЬ > мутант ггКЬЯЬ > контроль (ШШ)Ш));

2. Клубеньки: мутант ггКЬЯЬ > мутант птЬгЬ > мутант Ш^гЪгЬ > контроль ШШЖЬ.

Суммирование содержания белка в целом растении (рис. 2) дало следующий ряд: мутант птЬгЬ > мутант КЯгЬгЬ > мутант ггКЬЯЬ > контроль (ШШ>Ш>).

Итак, в целом мутантные растения содержали белка больше, чем контрольные, и накопление ими белка было обратно пропорционально содержанию крахмала в семенах гороха. Для оценки конечной продуктивности симбиотической системы необходимо было определить то количество белка, которое растения гороха накопили в результате азотфиксирующего симбиоза, то есть содержание белка в растениях гороха за вычетом белка семян.

Таблица 12

Эффективность симбиоза мугантных растений гороха с клубеньковыми бактериями ШнгоЫшп 1ееиттовашт Ьу. уюте, штамм 250а

Варишгг (генотип)

Содержание белка в растении, мг на одно растение.

Содержание белка в

семенах, использованных для посева, мг на сухой вес семян.

Количество белка, накопленного за счёт биологической фиксации азота, мг на 1 растение.

Контроль КШ)Щ)

73.0

32.4

40.6

Мутант птЬгЬ

112

26.0

86.0

Мутант ггИ^Ь

99.7

35.8

63.9

Мутант ЯНгЬгЬ

107

31.0

76.0

Самой продуктивной оказалась симбиотическая система двойного мутанта - гггЬгЬ (табл.12), накопившего в результате симбиотической азотфиксации -56.0 мг белка на растение. В целом же количество симбиотического белка, накопленного мутантными растениями, почти в два раза превышало его содержание в контрольных растениях. Важно отметать, что накопление белка, синтезированного из биологического азота, растениями гороха находилось в обратнопропорциональной зависимости с содержанием крахмала в семенах. Что касается нитрогеназной активности, то чёткая корреляция здесь не прослеживалась, так как низкоамилозный мутант накопил белка (76.0 мг на растение) несколько больше высокоамйлозного мутанта (63.9 мг на растение), хотя его нитрогеназная активность, наоборот, была несколько ниже (табл. И).

Таким образом, низкокрахмальные мутанты гороха обладают несомненно повышенным потенциалом к формированию продуктивного азотфиксирующего симбиоза по сравнению с контрольными растениями. Можно полагать, что в условиях эффективного симбиоза и благоприятных внешних условиях, мутанты ороха способны сформировать более высокие экологически чистые урожаи, чем контрольные растения.

ВЫВОДЫ

1. Изменения генома растения-хозяина в г и гЬ локусах приводят к изменениям его симбиотических свойств..

2. Мутации в локусах морщинистости (г и гЬ) не только изменяют качественное и количественное содержание крахмала в семенах гороха, но и непосредственно влияют на способность клубеньков откладывать крахмал. Чем больше крахмала содержится в семенах гороха, тем больше его накапливается в клубеньках и наоборот.

3. Накопленный корневыми клубеньками гороха крахмал сохраняет качественный состав (соотношение амилозы и амилопектина) исходных семян.

4 .Низкокрахмэльные мутанты гороха, благодаря повышенному содержанию белка в семенах, легче преодолевают период >1-лимитированного (ограниченного доступом азота) роста и в оптимальных условиях выращивания опережают контрольные растения (круглосемянный горох) уже на первых этапах развития.

5. В оптимальных или близких к ним условиях выращивания низкокрахмальные мутанты гороха формируют более эффективный азотфиксирующий симбиоз по сравнению с обычным круглосемянным горохом. За одинаковые промежутки времени иизкокрахмальные мутанты синтезировали в среднем в два раза больше белка по сравнению с круглосемянным горохом.

6. Накопленный клубеньками крахмал является важным энергетическим резервом симбиотической системы и имеет первостепенное значение для поддержания её стабильности в неблагоприятных условиях окружающей среды. Крахмал, отложившийся в форме амилозы, при необходимости, легче и быстрее утилизируется в клубеньках, поэтому высокоамилозный мутант обладает преимуществом над низкоамилозным.

Работа осуществлена в рамках программы-сети Европейского Экономического сооСнцеегеа (ЕЭС) по биотехнологии углеводов ("Cabinet") для зернобобовых,

организованной доктором Клиффом Хедли в Джон Иннес Институте по изучению растений (Норвич, Великобритания).

1. Аль-Мосава Н.П., Хайлова Г.Ф., Жизневская Г.Я., Бограчёва Т.А., Хедли К.Л., Измайлов С.Ф. 1999. Изучение содержания крахмала и азотфиксирующей активности в корневых клубеньках низкокрахмалистых мутантов гороха. Материалы 3-его международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения н перспективы их использования", (21-25 июня, Пущино, Моск. обл., Россия), т.2, стр. 3-5.

2. Аль-Мосава Н.П., Хайлова Г.Ф., Жизневская Г.Я., Хедли К.Л., Измайлов С.Ф. 1999. Азотфиксирующая активность корневых клубеньков генотипов гороха, различающихся по содержанию и составу крахмала в семенах. Тезисы докладов 4-ого Всероссийского съезда общества физиологов растений, (4-9 октября, Москва), т. 1, стр. 202.

3. Al-Mosava N.P., Khailova G., Kirnos S., Nikiforova Т., Izmailov S., Ziznevskaya G., Bogracheva T. and C. Hedley. 1998. Proceedings of the 3-rd European conference qn grain legumes, (14-19 November, Valladolid, Spain), ed AEP, pp. 34-35.

ПУБЛИКАЦИИ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аль-Мосава, Назели Перчевна

ВВЕДЕНИЕ 4.

Глава 1. Обзор литературы. 11.

1.1. Низкокрахмальные мутанты гороха в сравнении с круглосемянным горохом. 11.

1.2. Симбиотическая азотфиксирующая система в корневых клубеньках бобовых. 25.

1.3. Взаимосвязь бобово-ризобиального симбиоза с углеродным обменом растений. ' 30.

1.4. Роль крахмала в азотфиксирующих клубеньках бобовых растений. 34.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 41.

Глава 2. Объекты и методы исследований. 41.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 60.

Глава 3. Рост и развитие мутаитных растений гороха, выращенных на симбиотическом азоте. 60.

3.1. Прорастание и развитие проростков гороха до образования корневых клубеньков. 61.

3.2. Влияние условий окружающей среды на рост и формирование симбиотической системы мутантных растений. 64.

3.3. Формирование клубеньков на корневых системах мутантных и круглосемянных Горохов. 70.

Глава 4. Крахмал в семенах и клубеньках круглосемянного гороха и гороха с морщинистыми семенами. 82.

Глава 5. Оценка продуктивности симбиотической системы мутантных растений гороха, выращенных на безазотной питательной среде. 92.

5.1. Нитрогеназная активность клубеньков гороха. 92.

4.2. Определение конечной эффективности симбиоза. 95.

Глава 6. Симбиосистема и фотосинтетический аппарат мутантов гороха. 102.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Симбиотические свойства низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L"

Актуальность проблемы.

Население Земного шара постоянно растёт. Проблема нехватки продуктов питания с каждым годом становится всё более актуальной. В настоящее время только 15% населения имеет полноценное питание. Предсказывается перспектива исчерпаемости ресурсов уже к 2050 году.

Для формирования высоких и стабильных урожаев сельскохозяйственным растениям необходим связанный азот.

Азот - один из самых распространённых элементов на Земле. Земная атмосфера на 78% состоит из азота. Кроме того, все почвы мира содержат 150 млрд. т. азота. Даже самые бедные дерново-подзолистые почвы в пахотном 20-сантиметровом слое содержат 2-4 т. азота на га, а чернозём содержит 20-30 т. (Ю.В. Новиков, 1998). Но несмотря на это, азота не хватает. Проблема нехватки азота имеет две стороны: 1) различные формы азота в почве недостаточно доступны для растений; 2) растения сами по себе, без ассоциации с микроорганизмами не способны фиксировать азот атмосферы.

Существует только два источника обеспечения растений азотом -химические азотные удобрения и биологическая азотфиксация.

Долгое время первый источник казался наиболее выгодным. Действительно, в удобрениях азот присутствует в виде аммонийных и нитратных солей, т.е. в наиболее усвояемой для растений форме. В начале 80-х годов потребление минеральных удобрений во всём мире составляло 60 млн. т., а к 2000 году предполагалось использовать 110-140 млн. т. (Брей, 1986). Так продолжалось до тех пор, пока не стало очевидным, что внесение минеральных удобрений, особенно в больших дозах, приносит больше вреда, чем пользы:

-действие удобрений недолговечно. Уже на следующий год их эффективность составляет едва 20% от первоначальной;

-значительная часть азота удобрений теряется под действием бактерий-денитрификаторов;

-производство азотных удобрений невыгодно экономически. На долю химически связанного азота .удобрений приходится 30-50% энергопотребления сельского хозяйства и около 1% всей энергии, расходуемой развитыми странами;

-кроме того, производство и применение минеральных удобрений загрязняют окружающую среду токсичными азотными соединениями, ухудшают качество сельскохозяйственной продукции, снижают плодородие почв. По последним данным 77% загрязнителей окружающей среды образуется при выращивании продуктов питания в виде сельскохозяйственных удобряемых культур.

При биологической ' фиксации азота источником энергии, как правило, является солнце, фиксированный азот усваивается растениями практически полностью.

По мнению A.A. Баева и K.M. Злотникова (1984), недостатком биологической азотфиксации как способа обеспечения растений азотом можно считать лишь то, что человечество не научилось еще достаточно активно управлять биологической азотфиксацией.

В настоящее время не вызывает сомнений то, что симбиотическая азотфиксация является эффективным и экологически чистым источником азота.

Тем не менее ни одна страна мира пока не может полностью отказаться от применения азотных удобрений, так как без них нельзя получать высокие урожаи.

Единственный выход из этого положения в будущем - это максимальное увеличение эффективности биологической фиксации азота.

Общие масштабы биологичской азотфиксации на планете составляют 175-324 млн.т. азота в год и в целом даже превосходят вклад в сельское хозяйство химических азотных удобрений (Черемисов, 1985; Шлегель, 1987). Но на единицу площади уровень азотфиксации пока недостаточен для обеспечения необходимых урожаев.

В связи с этим, актуальной задачей является изучение взаимосвязи симбиотической азотфиксации с генетически измененным метаболизмом бобового растения, что позволит создать формы, максимально использующие симбиотический потенциал растения-хозяина и клубеньковых бактерий.

Еще со времен Грегора Менделя было идентифицировано большое количество генетических вариантов у гороха. Эта альтернативная морфология семян контролируется г (rugosus) (White, 1917) и rb (Kooistra, 1962) локусами, где рецессивные аллели, кроме образования морщинистых семян, имеют множество эффектов на развитие и состав семян, что включает снижение содержания крахмала и увеличение пропорции амилозы в крахмале.

В настоящее время путь синтеза крахмала в зародышах гороха хорошо изучен (Denyer, Craig, Harrison, Wang, Hedley, Martin and Smith, 1995). 7

Различия в уровне и составе крахмала в семенах гороха побудили ученых исследовать ферменты биосинтеза крахмала. В результате, были идентифицированы биохимические основы мутаций на локусах г и rb (Smith, 1988; Smith, Betty, Bedford, 1989; Hedley et. al., 1986).

Вполне вероятно, что содержание в семенах крахмала, богатого энергией запасного продукта, может влиять и на азотфиксируюгций симбиоз растения-хозяина и клубеньковых бактерий. Однако, исследования в этом направлении нам не известны.

Таким образом, в настоящее время хорошо известно влияние генов г и rb на развитие семян гороха и состав запасных продуктов в них. Однако, до сих пор неясно, как подобные изменения в генотипе семян бобовых культур отражаются на азотфиксирующем симбиозе гороха с клубеньковыми бактериями.

Суммируя все выше изложенное, можно заключить, что актуальной задачей нашего времени является разработка теоретических и методических основ селекции бобовых культур на повышение интенсивности симбиотической азотфиксации, что позволит создать формы растений, способные максимально использовать потенциал симбиотического взаимодействия. Важна также проверка на интенсивность симбиотической азотфиксации генетически изменённых сортов (Verma, Debauney, 1996).

В настоящей работе мы сделали попытку исследовать влияние генетических изменений растения-хозяина на азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae, на примере низкокрахмальных мутантов гороха.

Цель и задачи исследования.

Настоящая работа посвящена изучению симбиотических свойств трех природных низкокрахмальных мутантов гороха. Цель ее - выяснить, затрагивают ли изменения в локусах морщинистости у семян гороха симбиотическую систему растения, а именно - определить способность клубеньков мутантаых растений гороха к накоплению крахмала и выяснить, обладают ли такие клубеньки азотфиксирующей активностью. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

2. Исследовать клубеньки природных морщинистых мутантов гороха на способность накапливать крахмал.

3. Провести наблюдения за ростом и развитием мутантных растений гороха в условиях азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями ШигоЫит leguminosarшll Ьу. ушае, в сравнении с обычным круглосемянным горохом.

5. Дать оценку азотфиксирующей активности клубеньков у низкокрахмальных мутантов гороха и эффективности работы симбиотической системы вцелом по конечному результату т.е. по количеству белка, накопленного растениями за весь период вегетации.

Впервые изучены симбиотические свойства трех природных низкокрахмальных мутантов гороха (птЬгЬ, ггЯЬШ), Ю1гЬгЬ) Р1зит БаЦуит Ь значительно различающихся количественным и качественным составом крахмала в семенах, в сравнении с обычным круглосемянным горохом (ТЖШ>11Ъ). В вегетационных опытах по выращиванию мутантных и контрольных растений на безазотной питательной среде, продемонстрирована потенциальная возможность низкокрахмальных мутантов к формированию значительно более эффективной симбиотической системы, в отличие от обычного гороха. Впервые, на примере накопления крахмала у клубеньков мутантов гороха, показано существование прямой зависимости между изменениями в генотипе семян и симбиотической системой бобовых растений. Клубеньки гороха накапливали крахмал прямо пропорционально тому количеству, которое содержали исходные семена, сохраняя при этом и качественный состав (соотношение амилозы и амилопектина) крахмала исходных семян. Результаты выращивания опытных растений как в благоприятных, так и в неблагоприятных для нормального развития и функционирования симбиотической системы условиях окружающей среды, явились хорошей иллюстрацией того, что крахмал в клубеньках не только является запасным питательным веществом, откладывающимся там тогда, когда приток Сахаров из надземной части растения превышает их расход на нужды симбиотической системы, но имеет первостепенное значение, как энергетический резерв для поддержания нормального уровня ее функционирования во время неблагоприятного

10 периода, т.е. служит гарантом стабильности симбиотической системы. Полученные результаты являются существенным вкладом в физиологию растений, так как, с одной стороны, служат дополнением к существующей картине о роли отложения в клубеньках крахмала, а, с другой стороны, определяют степень зависимости симбиотической системы от генетических изменений, происходящих в семенах бобовых растений.

Практическая ценность работы.

Изучение сим биотических свойств подобных мутантов позволяет расширить возможности управления процессом биологической азотфиксации в целях повыщения ее интенсивности. Важным источником растительного белка были и остаются зернобобовые культуры. Привлекает внимание способность клубеньков низкокрахмальных мутантов более активно фиксировать атмосферный азот, в результате чего мутантные растения накапливают за период вегетации больше белка, чем контрольные. Таким образом, низкокрахмальные мутанты гороха служат богатым источником экологически чистого и полноценного белка.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Аль-Мосава, Назели Перчевна

ВЫВОДЫ.

1. Изменения генома растения-хозяина в г и гЬ локусах приводят к изменениям его симбиотических свойств.

4. Низкокрахмальные мутанты гороха, благодаря повышенному содержанию белка в семенах, легче преодолевают период лимитированного (ограниченного доступом азота) роста и в оптимальных условиях выращивания опережают контрольные растения (круглосемянный горох) уже на первых этапах развития.

5. В оптимальных или близких к ним условиях выращивания низкокрахмальные мутанты гороха формируют более эффективный азотфиксирующий симбиоз по сравнению с обычным круглосемянным горохом. За одинаковые промежутки времени низкокрахмальные мутанты синтезировали в среднем в два раза больше белка по сравнению с круглосемянным горохом.

120 окружающей среды. Крахмал, отложившийся в форме амилозы, при необходимости, легче и быстрее утилизируется в клубеньках, поэтому высокоамилозный мутант обладает преимуществом над низкоамилозным.

Работа осуществлена в рамках программы-сети Европейского Экономического сообщества (ЕЭС) по биотехнологии углеводов ("Cabinet") для зернобобовых, организованной доктором Клиффом Хедли в Джон Иннес Институте по изучению растений (Норвич, Великобритания).

121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Как мы видим, изменение генома бобового растения-хозяина, приводящее к улучшению качества семян, приводит и к изменению свойств его симбиосистемы.

Представляет интерес тот факт, что мутанты гороха (rrrbrb, rrRbRb, RRrbrb), затрачивающие больше продуктов фотосинтеза и энергии на формирование семян с повышенным содержанием белка и липидов, образуют более активные симбиотические системы: Поддержание функционирования которых также требует больших затрат продуктов фотосинтеза - источника С и энергии.

Как и следовало ожидать, такие мутанты и их симбиосистемы более чувствительны к неблагоприятным условиям окружающей среды (пониженной температуре и недостатку света), чем менее продуктивный круглосемянный горох.

Последний более приспособлен к стрессовым условиям окружающей среды. Равно как и его симбиосистема. Благодаря способности накапливать г крахмал, клубеньки могут функционировать и в том случае, когда поступление фотосинтетатов в них ослабевает или прекращается из-за ухудшения погодных условий. В этом случае источником энергии и углерода для поддержания процесса восстановления азота служит отложенный в них крахмал.

119

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аль-Мосава, Назели Перчевна, Москва

1. Алисова С.М., Тихонович И.А. Использование хлорофильных мутантов гороха как модели в изучении взаимосвязи между фотосинтезом и симбиотической азотфиксацией// Генетика, 1983. т. 19. N 9. с. 1512.

2. Альжапарова Ж.К., Фёдорова Е.Э., Троицкая Г.Н., Жизневская Г.Я. Азотфиксирующая система в клубеньках сои с водород-поглощающей нитрогеназой// Прикладная биохимия и микробиология. 1994. т. 30. N 1.-е. 115-120.

3. Андреева Н.И. ДАН, 1985, 282, N 2, с. 251-253.

4. Баев A.A., Злотникова K.M. Биологическая фиксация азота и генетическая инженерия//Биотехнология. -М. .Наука, 1984. -с. 217-223.

5. Белозёрский А.Н., Проскуряков Н. И. Практическое руководство по биохимии растений. М., 1951. 570 с.122

6. Берестецкий О.А., Доросинский Л.М., Кожемяков А.П. Эффективность препаратов клубеньковых бактерий в Географической сети опытов//Изв. АН СССР. Сер. биол. 1987. N 5. с. 670-679.

7. Борисов и др., 1992, Simbiosis, т. 14, с. 297-313.

8. Брей С.М. Азотный обмен в растениях. М., 1986. 196 с.

9. И. Васильчиков А.Г., Вероничев Б.А., 1999. Материалы 3-его межд. симп. "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" т. 3,-с. 139-141.

10. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М., 1975. 392 с.

11. Генерозова И.П., Хайлова Г.Ф. Особенности разновозрастных клубеньков в условиях неэффективного симбиоза. 1978. Тез. докл. 4-ого Всесоюзного симпозиума. Электронная микроскопия в ботанических исследованиях, с. 99-102.

12. Демиденко Т.Т., Тимофеева Е.Ф. 1937. Докл. АН СССР, новая серия, 14, с. 209.

13. Доросинский Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л., 1970.191 С.

14. Задорин А.Д. Зернобобовые культуры в интенсивном земледелии . Сборник научн. трудов. Совершенствование селекции и технологии возделывания зерновых бобовых и крупяных культур. Орёл. 1992. с. 4-13.

15. Задорин А.Д. Научно технический бюллетень, ВНИИ ЗБК, вып. 42, Орёл, 1996.-с. 11-14.

16. Иванов В.Б. Активные красители в биологии. -И.: Наука. 1982. 214с.123

17. Иванов В.Б. Рост и размножение клеток в меристеме корня: Дис. д-ра биол. наук. М.: Ин-т физиологии растений АН СССР, 1971.

18. Иванов В.Б., Литинская Т.К. Одновременная окраска белков и углеводов проционовыми красителями. Цитология, 1967, 9, N -9, с. 11631165.

19. Израильский В.П., Рунов Е.В., Бернард В.В. Клубеньковые бактерии и нитрагин. М., 1933. 232 с.

20. Квасников Б.В., Долгих С.Т. 1955. Микробиология, 24, вып. 2, -с.180.

21. Лобанов H.A., Шумилин П.И., Трошина К.А. Изменчивость содержания белка в зелёной массе гороха. Научно-технический бюллетень. Выпуск 42, Орёл, 1996. -с. 29-33.

22. Малевская Е.М. Аптека на грядках. Целебные свойства овощей. -М., "Лабиринт", 1994, 116с.

23. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М., Наука, 1973. 287 с.

24. Нгуен Тхи Чи и др. Физиол. растен., 1983, т. 30, вып., 4, с. 5.

25. Новиков Ю.В. Экология, окружающая Среда и человек. М., 1998.311с.

26. Павлюков В.Г. Практикум по тропическому растениеводству. М., 1988. 269 с.

27. Панников В.Д., Павлов А.Н. Минеральное питание растений и урожайность. -М., 1982, 60 с.

28. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. -М.: Агропромиздат, 1988. -271 с.124

29. Рихтер М., Аугустат 3., Ширбаум Ф. И збранные методы исследования крахмала. М: 1975.

30. Романов В.И., Чёткова С.А., Тихонович И.А. Азотфиксация и динамика поступления 14С ассимилированного листьями, в клубеньки хлорофильных мутантов гороха.// Физиол. растений. 1987, - т.34. N 3, -с. 486-492.

31. Сварадж, Четвериков, 1987. Известия АН Индии т. 53, N 5-6, 521526.

32. Тихонович И.А., Романов В.И., Алисова С.М. Азотфиксация и фотоассимиляты в клубеньках хлорофильных мутантов гороха.// Генетика, 1985. т. 21. N6, с. 1021.

33. Третьякова И.Н. Изучение механизма геотропических движений корешков прорастающих семян некоторых хвойных. Физиология растений, 1973,20, вып. 3, с. 514-520.

34. Третьякова И.Н. Цитофизическое изучение показателей роста и геотропизма проростков некоторых хвойных. Автореф. дис.канд. биол. наук. Красноярск: Ин-т леса Сиб. отд-ния АН СССР, 1974.

35. Троицкая Г.Н., Кудрявцева H.H., Ильясова В.Б. Особенности азотфиксирующих систем клубеньков различных видов бобовых растений, 1979,26, N2, с. 294-301.

36. Устименко-Бакумовский В.Г. Растениеводство тропиков и субтропиков. М., 1988, 382 с.

37. Фрей-Висслинг А., Мюлеталер К. Ультраструктура растительной клетки. М., 1968. 445 с.125

38. Хайлова Г.Ф. Особенности роста корней люцерны в стерильной изолированной культуре: Дис. канд. биол.наук. М: Ин-т физиологии растений АН СССР. 1971.

39. Хайлова Г.Ф. Изучение структуры клеток бактероидной ткани клубеньков бобовых растений в связи с отложением в ней крахмала. Физиол. растен., 1978,25, N 6, с. 1172-1178.

40. Чинг с соавт. В обзоре С.Я. Коць. Физиол. растен., т. 26, N 3, 223234,1994.

41. Чундерова А.Н. Оценка сортов бобовых растений на эффективность симбиоза с клубеньковыми бактериями методом ацетиленовой пробы// с. -х. биология. 1981, т. 16. N 3. с. 476.

42. Шулындин А.Ф. 1953. Микробиология, 22, N 3, с. 288.

43. Abu-Shakra S.S., Phillips D.A., Huffaker R.C. Nitrogen fixation and delayed leaf senescence// Science. 1978. Vol. 199. P. 973-975.

44. Anthan and Emerich, 1990, Plant Physiology, 92, 346-351.

45. Atkins C.A., Herridge D.F., Pate J.S. The economy of carbon and nitrogen fixing annual legumes. Experimental observations and theoretical consideration// Isotops in Biological Dinitrogen Fixation. Vienna, 1978. P. 211242.126

46. Bach M.K., Magee W.E., Burns R.H. Translocation of photosynthetic products to soybean nodules and their role in nitrogen fixation// Plant Physiol. 1958.Vol. 33. P. 118-124.

47. Bernicot H., Yean-Paul Lacampagne, F. Muel, Schneider. Grain Legumes, V. 21, 1998, P. 13-21.

48. Bethlenfalvay G.T., Phillips D.A. Photosynthesis and symbiotic nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris L.// Genetic Engineering for Nitrogen Fixation. New York, 1977. P. 401-408.

49. Bogracheva T.Y. et.al. (1995). J. Exp. Botany 46,1905-1913.

50. Bogracheva T.Y. et.al. (1998). Biopolymers 45, 323-332.

51. Bogracheva T.Y. (1998). Grain Legumes, N 20, p. 19.

52. Boiler B.C., Heichel G.H. Canopy structure and photosynthesis of alfalfa genotypes differing in nodule effectiveness// Crop Sci. 1984. Vol. 24. P. 91-96.

53. Brenchley W.E., Thornton H.G. 1925. Proc. Roy. Soc., ser. B, 98.

54. Ching T.M., Hedtke S., Russel S.A. et.al. Energystate and dinitrogen fixation in soybean nodules of dark grown plants// Plant Physiol. 1975. Vol. 55. P. 796-798.

55. Chu A.C.P., Robertson A.G. The effects of shading and defoliation on nodulation and nitrogen fixation by white clover// Plant and Soil. 1974. Vol. 41. P. 509-519.

56. Day, Copeland, 1991, Plant Physiol, and Biochemistry, 29,185-201.

57. Delauney A.Y., VermaD.P.S., 1996. In: Soybean Genetics. Mol. Biology and Biochem. p. 219-224.

58. Kay Denyer, Craig J., Harrison C., Wang T., Hedley C., Martin C. and Smith A. Understanding starch synthesis in developing pea embryos. 2-nd. Europ. Conf. on Grain Legumes, Copenhagen, 1995, p. 388-389.

59. Duhigg P., Melton B., Baltensperger A. Selection for acetylene reduction rates in "Mesilla" alfalfa// Crop Sci. 1978. Vol. 18. P. 813-816.

60. Eckardt J.E., Raguese C.A. Effects of diurnal variation in light and temperature on the acetylene reduction activity (nitrogen fixation) of subterranean clover//Agron. J. 1980. vOL. 72. p. 519-523.

61. Edie S.A., Phillips D.A. Effect of host legume on acetylene reduction and hydrogen evolution by Rhizobium nitrogenase// Plant Physiol. 1983. Vol. 72. P. 156.

62. French D. (1984). In Starch: Chemistry and Technology, (Whistler R.L., Bemiller J.N. and Paschall E.F. eds.), Academic Press, INC., San Diego, 183-247.

63. Georgy C.E., Orcutt F.C., Wilson P.W. 1933. Soil Sci., 36, 375.

64. Cordon A.J. et.al., 1987, J. Exp. Bot. v. 38. p. 84-98.

65. Cordon et.al., 1987. "Carbon metabolism in the legume nodule, in: "Carbon partitioning within and between organisms" ed. C.J. Pollock, J.F. Farrar, A.J. Cordon publ in: "Environmental Plant Biology Bios Scientific Publishers, p. 133-162.

66. Hardarson G., Golbs M., Danso S.K.A. Nitrogen fixation in soybean (Glycine max L. Merrill) as affected by nodulation patterns// Soil biology and Biochemistry. 1989. Vol. 21. N 6. P. 783-787.128

67. Hardy R.W.F., Burns R.S., Holstein R.D. Application of acetylene reduction assay for measurement of nitrogen fixation// Soil Biol. Biochem. 1973. Vol. 5. P. 47-81.

68. Hardy R.W.F., Burns R.C, Hebert R.R., Holsten R.D., Jackson E.K. Biological Nitrogen Fixation: A key to wordl Protein// Plant and Soil. 1981. Spec. Vol. P. 561-590.

69. Hardy R.W.F., Holstein R., Jackson E. et.al. C2H2 C2H4 assay for N2 fixation laboratory and field evaluation// Plant Physiol. 1968. Vol. 43, suppl. P. 913.

70. Hedley C.L. et.al. In Engineering crops for idustrial and uses, (Shewry P.R., Davis P., Napier J. Eds.) Portland Press, London (in press).

71. Hedley C.L. et. al. (1996). In Agri Food Quality 95. An Interdisciplinar approach, (Fenwick G.R., Hedley C.L., Richardson R.L., Khokhar S. Eds.). Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 138-148.

72. Hedley C.L., Lloyd Y.R., Ambrose M.Y., Wang T.L. 1994. Annals of Botany, 74,365-371.

73. Hedley C.L., Smith C.M., Ambrose M.Y., Cook S. and Wang T.L. (1986). An analysis of seed development in Pisum sativum. 2. The effect of the r locus on the growth and development of the seed. Annals of Botany, 58, N 3, 371379.

74. Hedley C.L., and Wang T.L. (1987). Seed and foliar mutants in Pisum, pp. 219-244 in Thomas H. and Grierson D. (eds), Developmental mutants in higher plants. Cambridge, UK, Cambridge University Press.

75. Hedley C., Wang T. Peas in our time. New genes for an old crop. Agrofood Industry, Hi-Tech, 14-17, 1983.1290

76. Hedley С., Wang Т. Manipulating storage product in pea using genetic variants and induced mutants. 1-st Europ. Conference on Grain Legumes, Angers, France, 1992, p 143-144. Proceedings.

77. Hedley C. and Wang T. (1993). Peas in our time. New genes for an old crop. Agrofood chemistry, Hi-Tech, p. 14-17.

78. Hedley C., Wang T.L., Morris V., Bogracheva. 1997. Novel starches from pea seeds. Материалы 2-ого международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". Пущино, 1997, том 4, стр. 381.

79. Herridge D.F., Pate T.S. Utilisation of net photosynthate for nitrogen fixation and protein production in an annual legume // Plant Physiol. 1977. Vol. 60. P. 759-764.

80. Hobbs S.L.A., Machon T.D. Heritability of N2 (C2H2) fixation rates and related characters in peas (Pisum sativum L.) // Can. J. Plant Sci. 1982a. Vol. 62. P. 265-276.

81. Hobbs S.L.A., Mahon T.D. Variability, heritability and relationship to yield of physiological characters in peas // Crop Sci. 1982 b. Vol. 22. P. 773-779.

82. Karr et. al., 1985, Plant Physiol, Vol. 78, P. 576-581.

83. Kijne T.M. The Rhizobium infection process // Biological Nitrogen Fixation. New York, London, 1992. P. 349-398.

84. Kokini J.L. et. al. (1992). Food Technology 46 (6), 124-139.

85. Kooistra F. (1962). О n the differences between smooth and three types of wrinkled peas. Euphytica, 11,357-373.

86. Lamprecht H. (1956). Pisum sativum L. oder P. arvense L. eine nomen-klatorische studie anf genetischer basis. Agri Hortigue Genetica, 14,1-4.130

87. Lawn R.T., Brun W.A. Symbiotic nitrogen fixation in soybeans. 1. Effect of photosynthetic sours sink manipulations // Crop Sci. 1974. Vol. 14. P. 11- 101. Lawree, Weeler, 1975, New Phytol. 74: 437-445.

88. Lee T.A. (1969). Plant and Soil, 30,391.

89. Lindstrom E.S., Newton W.E., Wilson P.W. The relationship between photosynthesis and nitrogen fixation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1952. Vol. 38. P. 392-396.

90. Macleod M.R., Hedley C.L., Martin C.R., Jones D.A., Yohnson S., Bakhsh A., Barber L.M. and Wang T.L. New pea mutants at the R locus, In: 1-st European conference on Grain Legumes. Proceedings. Angers. France, 1992. p. 169-170.

91. Mahon T.D., Domey T.A. Light weight battery operated infrared gas analyser for field measurement of photosynthetic CO2 exchange // Photosynthetica. 1979. Vol. 13. P. 459-466.

92. Mahon T.D. Field evaluation of growth and nitrogen fixation in peas selected for high and low photosynthetic CO2 exchange // Can. J. Plant Sci. 1982. Vol. 62. P. 5-17.-a

93. Mahon T.D., Hobbs S.L.S. Selection of peas for photosynthetic C02 exchange rate under field conditions // Crop Sci. 1981. Vol. 21. P. 616-621.

94. Mendel G. (1865). Versuche uber Pflanzen-Heybriden Verhandlungen des naturforshenden vereins in Brunn. 4,3-47.

95. Minchin F.R., Pate T.S. The carbon balance of a legume and the functional economy of its root nodules //J. Exp. Bot. 1973. Vol. 24. P. 259-271.

96. Minchin F.R., Pate T.S. Diurnal functioning of the legume root nodule // J. Exp. Bot. 1974. Vol. 25. P. 295-308.

97. Neuhaus H.E. and Stiff M. 1990. Planta 182,445-454.

98. Pate J.S., Greig T.M. Rhytmic fluctuations in the synthetic activities of the nodulated root of the legume // Plant and Soil. 1964. Vol. 21. P. 163-184.

99. Perez D., Chambers S., Bacon Y., Morgan M., Lambert N., Hedley C., Wang T. Quantitative analysis of pea seed proteins from existing and induced mutants. 1-st Conf. on Grain Legumes, Angers, France, 1992, p. 173^174.

100. Phillips D.A., Dejong. Dinitrogen fixation in leguminous crop plants. In: "Nitrogen in crop production" Hauked R.D. Amer. Soc. of Agronomy. Madison, Wisconsin, USA, 1984, P. 121-132.

101. Reiback and Streeter, 1983, Plant Physiology 72, 634-640.

102. Romanov V.I., Cordon A.Y., Mincbin F.R., Witty Y.F., Skot L., James C.L., Borrisov A.Y. and Tikhonovich Y. A. (1995), Exp. Bot., 46,293,1809-1816.

103. RothL.T., Stacey G. Bacterium relase into host cells of nitrogen fixing soybean nodules: the symbiosome membrane comes from the sources // Eur. J. Cell. Biol., 1989. Vol. 49. p. 13-23.

104. Schreven D.A. van. 1959. In: "Nutrition of the legumes". Ed. Hallsworth E.G., New York, London, Acad. Press, 1959. Plant and Soil, 11, N 2, 93; 1970. 32, N 1,113; 1972a. 36. N 2, 325; 1972b. 37, N 1,49.

105. Scott et.al., 1976, Nature 263: 703-705.

106. Smith A.M., Bettey M. and Bedford J.D. (1989). Evidence that the rb locus alters the starch content of developing pea embryos through an effect on ADF glucose - pyrophosphatase. Plant Physiology, 89, 1279-1284.

107. Sprent J.I. Growth and nitrogen fixation in Lupinus arboreus as affected by shading and water supply // New Phytol. 1973. Vol. 72. p. 1005-1022.

108. Streeter J.G. Integration of plant and bacterial metabolism in nitrogen fixing systems // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Dordrecht etc., 1995. p. 67-76.132

109. Sutton W.D., Tepsen N.M. Studies with detached lupine nodules in culture. 1. Maintenance and induction of acetylene reduction activity // Plant Physiol. 1975. Vol. 56. p. 665-670.

110. Thummler and Vernia, 1987, J. Biol. Chem., 262, 14730-14736.

111. Wang T.L., Hadaviziden A., Harwood A., Welham T.Y., Harwood W.A., Faulks R. and Hedley C.L. 1990. Plant Breeding 105, 311-320.

112. Wang T.L. and Hedley C. (1991). Seed development in peas. Knowing your three 'r's (or four, or five). Review Article. Seed Science Research, 1991, 1314.

113. Wang T.L., Hedley C.L. (1993). Seed mutants in Pisum. In "Pisum genetics", 25,64-70.

114. Wang T.L. et.al. (1998). J. of Exp. Bot. (in press).

115. Waters L.T., Breen P.J., Mach HJ. et.al. Translocation of 14C -photosynthate, carbohydrate content and nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris L. during reproductive development//J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1980. Vol. 105. P. 424427.

116. Wilson D.W., Fred E.B., Salmon M.R. Relation between carbon dioxide and elemental nitrogen assimilation in leguminous plants // Soil Sci. 1933. Vol. 35. p. 145-165.

117. White O.F. (1917). Studies of inheritance in Pisum. 2. The present state of knowledge of heredity and variation in peas. Proceedings of the American Phylosophicall Society 56, 487-588.1330

118. Wintermans I.F., de Mots A. "Biochim. et Biophys. Acta", 1965, 109,448.

119. Witty J.F., Miiichin F.R. Measurement of nitrogen fixation by the acetylene reduction assay: myths and mysteries // Nitrogen Fixation by Legumes in Mediterranean Agriculture. Dordrecht etc., 1988. p. 331-344.

Информация о работе

Аль-Мосава, Назели Перчевна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.12

Диссертация

Симбиотические свойства низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы