Получение и анализ Tn5-мутантов Sinorhizobium meliloti с измененными поверхностными полисахаридами

Затовская, Татьяна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и анализ Tn5-мутантов Sinorhizobium meliloti с измененными поверхностными полисахаридами
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ Tn5-мутантов Sinorhizobium meliloti с измененными поверхностными полисахаридами"

^НКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЗАТОВСКАЯ Татьяна Викторовна

ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ Тп5-МУТАНТОВ БтогЫгоЫит теШой : ИЗМЕНЕННЫМИ ПОВЕРХНОСТНЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ

Специальность: 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

005043634

Санкт-Петербург - 2012

005043634

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Симаров Борис Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Квитко Константин Васильевич, Санкт-Петербургский государственный университет

кандидат биологических наук Коновалова Галина Сергеевна, Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И.Вавилова Россельхозакадемии

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

растений и микроорганизмов РАН г. Саратов

Защита диссертации состоится 24 мая 2012 г. в / -f часов на заседанш Объединенного совета ДМ 212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Биолого-почвенный факультет, аудитория 133.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке

им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 23 апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.И. Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Почвенные бактерии сем. Rhizobiaceae вступают в симбиоз с бобовыми растениями. При этом на корнях растений образуются клубеньки, в которых бактерии, преобразованные в бактероиды, фиксируют атмосферный азот. Формирование симбиоза происходит при участии различных сигнальных молекул обоих партнеров. Важную роль в этом процессе играют поверхностные полисахариды бактерий. Клубеньковые бактерии синтезируют четыре типа поверхностных полисахаридов — экзополисахариды (ЭПС), капсулярные полисахариды (КПС), липополисаха-риды (ЛПС) и Р-1,2-глюканы (Fraysse et al., 2003).

Объектом наших исследований были клубеньковые бактерии Sinorhizo-Ыит meliloti, вступающие в симбиоз с люцерной, донником и пажитником. В настоящее время у этого вида ризобий детально изучены только экзополисахариды - ЭПС1 и ЭПС2. У эталонного штамма 1021 S. meliloti была установлена структура ЭПС1 и ЭПС2, изучена генетика их синтеза и его регуляции. Показана роль ЭПС в формировании симбиоза. Липополисахариды - наименее изученные полисахариды S. meliloti. Структура полисахаридной части ЛПС не установлена ни для одного штамма S. meliloti, не выяснены функции большинства генов, контролирующих синтез коровой области ЛПС. Практически ничего не известно о генах синтеза О-цепи S. meliloti. Исследование роли ЛПС в симбиозе проводилось только у штамма 1021 S. meliloti.

Основным подходом в изучении структуры, функций и генетики синтеза полисахаридов в настоящее время остается получение Тп5-транспозоновых мутантов с нарушениями синтеза полисахаридов. Новые возможности в изучении функций полисахаридов и генетики их синтеза открылись после полного секвенирования генома эталонного штамма 1021 S. meliloti (Galibert et al., 2001). Кроме двух уже исследованных кластеров генов, детерминирующих синтез ЭПС1 и ЭПС2, на мегаплазмиде pSymb S. meliloti было выявлено несколько генетических кластеров, которые также могут быть связаны с синтезом полисахаридов (Finan et al., 2001). Их функции у S. meliloti пока не известны. Таким образом, изложенные сведения определяют актуальность данной работы.

Целью нашей работы было — выявление новых генов Sinorhizobium meliloti, вовлеченных в контроль синтеза липополисахаридов и других поверхностных полисахаридов и выяснение их роли в формировании бобово-ризобиальном симбиоза бактерий с Medicago sativa. Задачами данной работы являлись:

1. Получение Тп5-мутантов S. meliloti с нарушениями синтеза ЛПС и других поверхностных полисахаридов, первичная характеристика их ЛПС и капсулярных полисахаридов при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза.

2. Изучение симбиотических свойств - эффективности и нодуляционной конкурентоспособности - Тп5-мутантов S. meliloti с измененными поверхностными полисахаридами.

3. Идентификация генов, инактивированных Тп5-инсерциями у полученных мутантов S. meliloti.

4. Изучение компонентного состава липополисахаридов штамма СХМ1-188

S. meliloti и ЛПС-мутантов с помощью газо-жидкостной хроматографии и гель-фильтрации.

Научная новизна полученных результатов. Впервые получено два Тп5-мутанта S. meliloti, не имеющих высокомолекулярной формы ЛПС (ЛПС1). Показано, что отсутствие ЛПС1 в одном случае связано с Тп5-инсерцией в гене fabF2, кодирующем ацил-АПБ-синтазу, фермент синтеза 27-ОН-С28 жирной кислоты (жк) в липидной части ЛПС, а в другом случае - с Тп5-мутацией в гене metH, кодирующем метионинсинтазу. Показано, что отсутствие высокомолекулярного ЛПС1 у S. meliloti не влияет на способность формировать симбиоз с люцерной и симбиотическую эффективность, но приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности бактерий. Впервые получен Тп5-мутант S. meliloti по гену tolC и показано, что мутация в этом гене приводит к нарушению секреции экзополисахаридов 5. meliloti. Установлено, что мутант по гену tolC S. meliloti не способен вступать в симбиоз с Medicago sativa. Показано, что белок-канал TolC у S. meliloti вовлечен в секрецию белков ExsH и ExpEl. Получены Тп5-мутанты S. meliloti по генам SMc00951 и SMc02705 и изучены их симбиотические свойства. Исследован Тп5-мутант meliloti по гену phbA и показано, что мутация влияет на синтез ЭПС1 и ПОМ при выращивании бактерий на минимальной среде. Установлено, что ген phbA у S. meliloti транскрибируется во время симбиоза.

Практическая значимость работы. Результаты исследований были использованы в научно-практическом пособии "Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценозах" (Румянцева и др., 2011). Мутант Tsl52, характеризующийся повышенной симбиотической эффективностью и конкурентоспособностью, проходит испытания в географической сети опытов (ГСО). Мутант Tsl52 применяется в качестве штамма-тестера для оценки нодуляционной конкурентоспособности штаммов S. meliloti в микровегетационных опытах. Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курса лекций «Симбиогенетика», читаемого на кафедре генетики и селекции СПбГУ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Тп5-мутанты S. meliloti, лишенные высокомолекулярной формы ЛПС, формируют эффективный симбиоз с М. sativa и М. truncatula, но характеризуются резко сниженной конкурентоспособностью.

2. Отсутствие высокомолекулярного ЛПС у S. meliloti связано с отсутствием длинноцепочечной 270Н-С28 жирной кислоты в липиде А ЛПС.

3. Белок TolC у S. meliloti необходим для секреции экзополисахаридов ЭПС1 и ЭПС2, секреции белков ExsH и ExpEl и формирования симбиоза с М. sativa. Апробация работы. Результаты работы были представлены на X Международном конгрессе по азотфиксации (С.-Петербург, 1995), 8-м Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, 1996), И-м съезде ВОГиС (С-Петербург, 2000), XVI Международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Гаага, 2001), XI Международном конгрессе по молекулярным растительно-микробным взаимодействиям (Санкт-Петербург, 2003), III съезде ВОГиС, (Москва), 2004 г., 12 съезде Общества Микробиологов Украины им. С. Н. Виноградского (Ужгород, Украина, 2009 г.).

Данная работа выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования "Геномные технологии и клеточная биология" ГНУ ВНИИСХМ ОЗ Россельхозакадемии (ГК Министерства образования и науки №16.552.11.7047).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов докладов на научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 2-х глав экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 179 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 44 рисунка. Список литературы включает 347 наименований, из них 17 - на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Штаммы бактерий, плазмиды. Объектами исследований были штамм СХМ1-188 S. meliloti (Федоров, Симаров, 1983) и полученные у него мутанты с нарушениями синтеза поверхностных полисахаридов (Затовская и др., 1998). Для отбора мутантов с изменениями синтеза поверхностных полисахаридов использовали три селективные среды: 1) LB с 0,1% дезоксихолатом натрия (ДОХ); 2) минимальную среду с 0,02% Конго красным и 3) LB с 0,02% калько-флуором. Конкурентоспособность оценивали с использованием тестерного штаммма СХМ1-48 S. meliloti (SmR, Fix ") (Шарыпова, Симаров, 1985). При изучении экспрессии гена phbA использовали штамм М4 S. meliloti, содержащий конститутивно экспресссирующийся ген gusA (Selbischka et al., 1995). Для клонирования фрагментов ДНК был использован штамм DH5a Е. coli (F recAl, endAl, gyrA96, hsdRll, deoR, A(lacZYA-argF)U169) (Grant et al., 1990). Конъюгационный перенос плазмид проводили при помощи штамма S17-1, в хромосому которого интегрирована плазмида pRP4 (Tc::Mu, Km::Tn7) (Simon et al., 1983). Для Tn5-мутагенеза использовали плазмиду pSUP5011 (pBR325-Tn5::mob, ApR, TcR, CmR) (Simon, 1983). Для клонирования фрагментов ДНК были использованы плазмиды pUC18 (lacZ::M13mp, ApR) (Simon et al., 1983) и pTZ19R (/acZ::M13mp, ApR) (Meade et al., 1986). Для конструирования транскрипционного слияния была использована плазмида pCambial381Xa (/acZ::M9mp, gusA без промотора, KmR) (Cambia, Австралия, 1998). Методы. Методы работы с ДНК. Выделение геномной ДНК проводили по стандартной методике (Meade et al., 1982), выделение плазмидной ДНК - по методу щелочного лизиса (Birnboim, Doly, 1979).

Реакции рестрикции, лигирования ДНК, электрофорез ДНК в агарозном геле, блот-гибридизацию по Саузерну, трансформацию плазмид проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Секвенирование выполняли с использованием терминирующих нуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями, на секвенаторе ДНК MegaBASElOOO (Amersham Biosciences). Для определения последовательностей ДНК, смежных с Тп5, использовали праймер на IS-элемент Тп5-транспозона 5' G AGAAC AC AG ATTTAGCCC AG-3'. Секвенированные последовательности сравнивали с последовательностями из генетического банка данных (GeneBank) с помощью программы NCBI BLAST.

Получение фаголизатов и трансдукцию проводили по лабораторной методике (Новикова и др., 1984) с использованием фага фМ12 {Finan et al., 1984). Экспрессию транскрипционного слияния phbA:gusA в свободноживущих бактериях и в симбиозе с M.sativa выявляли по наличию активности ß-глюкуро-нидазной активности в присутствии X-GlcA.

Электронно-микроскопический анализ клубеньков проводили согласно стандартным протоколам. Полутонкие и ультратонкие срезы клубеньков были выполнены при помощи ультрамикротома (Reichert-Jung Ultracut). Методы исследования ЛПС и белков. ЛПС, полученные из сырых бактериальных экстрактов, обработанных протеиназой К, анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ-электрофорез). Использовали 12% концентрирующий и 12% разделяющий гели, которые окрашивали нитратом серебра согласно стандартным протоколам (Tsai, Frasch, 1982). Для выявления КПС гели обрабатывали 2 % альциановым голубым, затем нитратом серебра согласно методике (Corzo et al., 1991).

Для изучения компонентного состава ЛПС экстрагировали из высушенных бактериальных клеток 45%-ной горячей водно-фенольной смесью (Westphal, Jann, 1965). ЛПС отделяли от периплазматических глюканов путем трехкратного ультра-центрифугирования при 105-120 тыс. об/мин в течение 5-6 часов. Глюканы оставались в супернатанте, ЛПС - в осадке. Очищенные ЛПС лиофилизировали. Состав моносахаридов и жирных кислот в препаратах ЛПС анализировали методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Хром-5 (Чехословакия) с пламенно-ионизационным детектором. Содержание нейтральных углеводов, уроновых кислот, 2-кето-З-дезокси-окту-лозоновой кислоты (КДО) и белков в препаратах ЛПС определяли общепринятыми аналитическими методами (Захарова, Косенко, 1982). Мягкий кислотный гидролиз ЛПС проводили 1%) уксусной кислотой (4 ч, 100°С) или 2% уксусной кислотой (5 ч, 100°С). Полисахаридную часть отделяли от липида А центрифугированием. Фракционирование олигосахаридов проводили на колонке (55,4 х 2,1 см), заполненной Sephadex G-25 (Pharmacia) и прокалиброванной с использованием углеводных стандартов.

Секретируемые белки S. meliloti экстрагировали буферно-фенольной смесью из очищенного лиофилизированного супернатанта культуральной жидкости бактерий, выращенных на жидкой минимальной среде Винсента в течение 3,5 сут. Электрофорез белков в ПААГ с ДСН проводили по стандартной методике (Laemmli, 1071). Перенос на нитроцеллюлозные мембраны и иммунодетекцию белков выполняли согласно стандартным протоколам (Towbin et al., 1979, Harlow, Lane, 1988). Антисыворотки против белков ExpEl, ExsH и ExoK штамма Rm2011 S. meliloti были любезно предоставлены А. Беккер (Университет г. Билефельд, Германия).

Анализ симбиотических свойств мутантов. Симбиотические свойства штаммов изучали в условиях стерильного микровегетационного опыта (Федоров и др., 1983) на люцерне М. sativa (сорт Вега) и на М. truncatula (сорт Jamalong). Симбиотическую эффективность мутантов определяли по массе высушенной надземной части растений. Нодуляционную конкурентоспособность (НКС) мутантов изучали прямым (резистентным) и косвенным методами. Для оценки

НКС косвенным методом использовали тестерный штамм СХМ1-48 теШоН. Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖЕНИЕ

Получение Тп5-мутантов таШой с измененными поверхностными

полисахаридами

Мутантов с измененными поверхностными полисахаридами получали у штамма СХМ1-188 5. теШоН путем неспецифического Тп5-мутагенеза и последующего отбора на селективных средах. При отборе мутантов учитывались: 1) окраска и слизистость колоний на минимальной среде с Конго красным (выявление мутантов с различными изменениями синтеза полисахаридов - ЭПС, ЛПС, КПС); 2) отсутствие роста на среде ЬВ с ДОХ (выявление ЛПС - мутантов); 3) изменения в свечении бактериальных колоний в УФ свете на среде ЬВ с Калькофлуором белым (выявление мутантов, дефектных в синтезе ЭПС1). Всего было отобрано 8 мутантов: 5 мутантов - ТЬ29, Тв22, Тв32, ТЬ9 и Тб152 - из транспозантов, полученных ранее в лаборатории С. Н. Юргель, и 3 мутанта - Тг53, ТгбЗ и Тг465 - из Тп5-транспозантов, полученных автором. Все мутанты отличались от родительского штамма СХМ1-188 по окраске колоний и характеру роста на селективных средах (табл. 1).

ЛПС исследуемых штаммов анализировали электрофорезом в полиакрил-амидном геле с ДСН (рис. 1). ЛПС родительского штамма СХМ1-188 5. теШоН разделялись на две зоны: высокомолекулярную (8-ЛПС), обозначаемую у ризобий ЛПС1, и низкомолекулярную (Я-ЛПС), обозначаемую ЛПС2. У мутантов ТЬ29 и Тб22 отсутствовала зона ЛПС 1. У мутантов ТЬ9 и Тг53 обе зоны ЛПС были модифицированы. Анализ капсулярных полисахаридов у исследуемых штаммов показал, что у мутанта Тг53 отсутствовала зона КПС, а мутант Тб22 синтезировал КПС с большей электрофоретической подвижностью, чем родительский штамм СХМ1-188 51. теШоН.

Саузерн блот-гибридизацией ДНК мутантов с Тп5-зондом было подтверждено, что все мутанты содержат единственную копию Тп5-транспозона в геноме. Трансдукция маркера устойчивости к канамицину из мутантов в родительский штамм и анализ трансдуктантов подтвердили, что фенотипичеекие особенности всех мутантов обусловлены Тп5-инсерциями в их геном, а не другими генетическими изменениями.

Таким образом, впервые были получены два Тп5-мутанта теШоН, не имеющих высокомолекулярной формы ЛПС (ТЬ29 и Тз22). Мутанты ТЬ9 и Тг53 содержали обе формы ЛПС, но отличались рисунком микрогетерогенности ЛПС. Повышенная чувствительность мутантов Тв32, ТгбЗ и Тг465 к ДОХ могла быть вызвана изменениями клеточной поверхности, не связанными с синтезом ЛПС. Изменения слизеобразования и флуоресценции колоний в УФ свете у мутантов Тг53, ТгбЗ и Тз152 указывали на нарушения у них синтеза экзополисахаридов.

Таблица 1. Характеристика роста штамма СХМ1-188 теШой и его Тп5- мутантов на селективных средах

Штамм Окраска колоний на минимальной среде с Конго красным Рост на среде ЬВ с ДОХ Свечение в УФ свете на среде ЪВ с Калькофлуором

СХМ1-188 розовая + +

ТЬ 29 красная - +

Тэ 22 красная - +

Те 32 коричневая + +

ТЬ 9 оранжевая + +

Тг 53 оранжевая / красная + -

Тг 63 красная / черная - -

Тг465 красная - + +

ТБ 152 черная + +

ЛПС1

«а®.

ЛПС 2

12 3 4

5 6 7 8 9

Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН липополисахаридов штамма СХМ1-188 5. теШоН и его Тп5-мутантов.

Обозначения: 1 - СХМ1-188; 2 - ТЬ9; 3 - ТЬ29; 4 - Тз22; 5-Т532; б-Тг53; 7 - ТгбЗ; 8 - ТЬ9; 9 - Тг4б5.

Анализ симбиотических свойств Тп5-мутантов с измененными полисахаридами

Симбиотическая эффективность и нодуляционная конкурентоспособность мутантов были изучены в нескольких микровегетационных опытах на люцерне Medicago sativa и М. truncatula. Мутанты Tb29, Ts22, Ts32, Tb9, Тг465 и Tsl52 формировали эффективный симбиоз с обоими растениями-хозяевами. Масса растений М. sativa, инокулированных мутантами Tb29, Ts22, Ts32, ТЬ9 и Тг465, достоверно не отличалась от массы растений, инокулированных родительским штаммом. Мутант Tsl52 имел повышенную симбиотическую эффективность по сравнению с родительским штаммом, что подтвердилось в 11 микровегетационных опытах (прибавка массы растений М. sativa составляла, в среднем, 20%).

НКС мутантов определяли косвенным и прямым методами. При оценке ИКС применяли разбивку на классы. Мутанты ТЬ29 и Ts22, не имеющие высокомолекулярного ЛПС1, и мутант Тг465 с повышенной чувствительностью к ДОХ характеризовались достоверно сниженной НКС (класс К(-)). Конкурентоспособность мутантов Ts32 и ТЬ9 была ниже, чем у исходного штамма, но выше, чем у тестерного штамма. Они были отнесены к классу К( + ). НКС мутанта Tsl52 была высокой (класс К( + )).

Мутанты Тг53 и ТгбЗ с нарушениями синтеза экзополисахаридов были дефектны в формировании симбиоза и образовывали на корнях М. sativa и М. truncatula мелкие белые, не фиксирующие азот клубеньки. Электронно-микроскопический анализ клубеньков, индуцированных этими мутантами на М. sativa, показал, что гистологическая зональность в клубеньках была слабо выражена. Зона инфекции в клубеньках была представлена растительными клетками, содержащими небольшое количество недифференцированных бактероидов. Большую часть клубеньков занимала зона старения.

Трансдуктанты, полученные от каждого мутанта, характеризовались такими же симбиотическими свойствами, что и соответствующие им мутанты. Это подтверждает связь Тп5-инсерций с симбиотическим фенотипом мутантов.

Характеристика генов, инактивированных Тп5-инсерциями у мутантов с измененными полисахаридами

Для того, чтобы выяснить, какие гены были затронуты Тп5-инсерциями у мутантов, проводили клонирование и секвенирование фрагментов ДНК мутантов, смежных с Тп5. В результате клонирования по сайтам рестрикции EcoRI и ВатШ были получены плазмиды, содержащие фрагмент Тп5 с прилегающей областью ризобиальной ДНК (0,8 - 7,0 т.п.н.). Анализ секвенированных последовательностей ДНК представлен в таблице 2.

У всех мутантов Тп5-транспозон встроился в открытые рамки считывания. Смежные с Тп5 последовательности ДНК мутантов были гомологичны последовательностям генов штамма 1021 S. meliloti, геном которого был полностью сек-венирован. Идентичность по нуклеотидным основаниям составляла 97-100%. Для характеристики генов использовали данные аннотации генома штамма 1021 S. meliloti на сайте http://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhirne.cgi.

Таблица 2. Анализ секвенированных последовательностей ДНК мутантов

Tn5-мутант Просек-вениро- вано нуклео-тидов % гомологии с S.meliloti Rml021* Ген -мишень Тп5 Продукт гена

Tb 29 798 98 /аЬР2 (хромосома) ацил-АПБ-синтаза (400 амк)

Ts 22 618 75 теШ (хромосома) Метионинсинтаза (1527 амк)

Tb 9 611 99 1рБЬ (хромосома) УДФ-глюкуронат-эпимераза (328 амк)

Tr 53 389 100 ехоВ (мега 2) УДФ-глюкозо-4-эпимераза (328 амк)

Tr 63 638 99 М/С (хромосома) Белок-канал внешней мембраны (456 амк)

Ts 32 852 99 8Мс00951 (хромосома) Трансмембранный белок (604 амк)

Tr 465 633 98 8Мс02705 (хромосома) Белок внешней мембраны (937 амк)

Tsl52 638 98 рЬЪА (хромосома) Ацетил-КоА-ацетилтрансфераза (393 амк)

* % идентичности по нуклеотидным основаниям между секвенированными фрагментами генов мутантов (без последовательностей Тп5) и фрагментами соответствующих генов штамма 1021 5. теЫоН.

У мутанта ТЬ29 с изменениями ЛПС Тп5-транспозон встроился в ген fabF2, кодирующий ацил-АПБ-синтазу II. Данный фермент участвует в синтезе 27-ОН-28:0 жк, характерного компонента липида А ЛПС у всех представителей Rhizobiaceae. У мутанта Ts22 Тп5-инсерция произошла в ген metH, кодирующий метионинсинтазу. Фермент переносит метальные группы и участвует в синтезе метионина. Ген не входит в состав какого-либо кластера.

У мутанта ТЬ9 транспозон встроился в ген IpsL, кодирующий фермент для образования УДФ-галактуроновой кислоты. Галактуроновая кислота входит в состав кора ЛПС у S. meliloti. Мутация по гену IpsL была ранее описана также у штамма 1021 S. meliloti (Keating et al, 2002).

Мутант Тг53 содержит Тп5-инсерцию в гене ехоВ, кодирующем эпимеразу для образования УДФ-галактозы. Ранее было показано, что у S. meliloti галактоза входит в состав ЛПС, а также в состав ЭПС1 и ЭПС2 (Leigh, Lee, 1988; Her et al., 1990; Reinhold et al., 1994). Нами было установлено, что мутация по гену ехоВ у штамма СХМ1-188 S. meliloti также блокирует синтез КПС.

У мутанта ТгбЗ Тп5-инсерция была локализована в гене tolC на хромосоме. Ген tolC кодирует белок-канал внешней мембраны и является компонентом секреторных систем I типа, участвующих в экскреции некоторых белков у грам-отрицательных бактерий. У мутанта Ts32 Тп5-транспозон был локализован в гене SMc00951, а у мутанта Тг465 - в гене SMc02705. Оба гена расположены в различных локусах хромосомы, не связанных с кластерами генов синтеза ЛПС, и кодируют консервативные белки внешней мембраны.

У мутанта Tsl52 Тп5-инсерция была локализована в гене phbA, кодирующем ацетил-КоА-ацетилтрансферазу ((3-кетотиолазу), ключевой фермент синтеза полиоксимасляной кислоты (ПОМ) (Tombolini et al., 1995).

Сравнительный анализ липополисахаридов родительского штамма СХМ1-188 5. meliloti и мутантов ТЬ29 и Ts22

На основе сравнительного анализа ЛПС родительского штамма и мутантов предполагалось выявить различия в составе ЛПС1 и ЛПС2 и выяснить состав О-цепи у £ meliloti. Был исследован моносахаридный и жирнокислотный состав ЛПС родительского штамма и мутантов ТЬ29 и Ts22.

Состав жирных кислот в ЛПС исследуемых штаммов представлен в таблице 3. Главным отличием ЛПС мутанта ТЬ29 от ЛПС родительского штамма было отсутствие у мутанта 27-ОН С28:0 жк. В ЛПС обоих мутантов по сравнению с ЛПС родительского штамма было меньшее относительное содержание 3-ОН-С14:0 жк и более высокое содержание С18:0 жк и окси X жк.

Таблица 3. Жирнокислотный состав ЛПС штамма СХМ1-188 S. meliloti и его мутантов ТЬ29 и Ts22.

Компонент Штамм

СХМ1-188 ТЬ29 Ts22

% от суммы площадей на ГЖХ-хроматограммах

3-ОН С14:0 48,5 41,0 38,5

3-ОН С15:0 8,2 7,9 8,9

3-ОН С16:0 5,6 4,6 6,7

3-ОН С18:0 20,2 19,6 21,3

С18:1 11,4 10,1 пд

С18:0 3,7 11,6 8,7

ОкеиХ (Т 3-ОН С:14=1,33) 2,4 5,2 4,8

27-ОН С28:0 * + - Не определяли

В полисахаридной части ЛПС всех трех исследуемых штаммов были выявлены глюкоза, галактоза, галактуроновая и глюкуроновая кислоты, КДО,

манноза, неидетифицированный сахар X (предположительно, 6-дезоксигексоза), рамноза, следы ксилозы и фукозы. В ЛПС родительского штамма СХМ1-188 в небольшом количестве был выявлен также галактозамин (табл. 4).

Таблица 4. Моносахаридный состав ЛПС штамма СХМ1-188 теШой и его Тп5-мутантов Тя22 и ТЬ29.

Компонент Штамм

СХМ1-188 Тв22 ТЬ29

% от суммы площадей на ГЖХ-хроматограммах

Глюкоза 56,3 60,3 66,0

Галактоза 13,2 11,8 16,4

Манноза 7,0 5,6 3,2

Дезоксигексоза X П^1с = 0,47) 8,6 10,7 8,9

Рамноза 14,9 11,6 5,5

% от сухой массы препарата*

Общие углеводы 26,0 26,4 39,2

Уроновые кислоты 11,6 9,3 9,3

КДО 5,2 10,8 10,8

Глюкозамин 2,44 2,45 1,85

Этаноламин 0,24 0,22 0,18

Галактозамин 0,15 - -

* В таблице не учтены жирные кислоты, фосфатные и сульфатные группы, присутствующие в ЛПС теШоН.

Для исследования полисахаридной части ЛПС (кора и О-цепи) проводили мягкую деградацию ЛПС 1% уксусной кислотой. Полисахаридную порцию ЛПС, отделенную от липида А, фракционировали на колонке с БерИаскх 0-25. Элюционные профили выхода фракций с колонки строили по содержанию в них углеводов, уроновых кислот и КДО (рис. 2). Моносахаридный состав каждой фракции у всех штаммов определяли методом ГЖХ. В таблице 5 представлен моносахаридный состав фракций ЛПС родительского штамма.

При гельфильтрации на 8ер1ш<1ех 0-25 частично деградированные полисахариды ЛПС исследуемых штаммов разделились на 4 (у ТЬ29) или 5 (у СХМ1-188 и Тв22) фракций. Фракции I (около 4000-4600 Да) были небольшие. Они могут представлять собой недеградированный ЛПС или сопутствующий полисахарид. Фракции II (около 2700 Да) у всех штаммов элюировались в одном объеме и содержали весь набор Сахаров, выявленных в недеградированном ЛПС. Предполагается, что эти фракции представляют собой полный коровый олигосахарид. Фракции III (690-770 Да) у всех трех штаммов также выходят в одном элюционном объеме. Они содержат только глюкозу, уроновые кислоты, галактозу и маннозу и представляют собой небольшие олигосахариды (тетрамеры Сахаров), образовавшиеся при расщеплении кора.

Ат- углеводы, Л 5зо -уроновые кислоты

СХМ1-188

А549 - КДО

А49о-углеводы, А530 -уроновые кислоты

ТЬ29

А54, - КДО

110 130 150

А490- углеводы, А5зо-уроновые кислоты

А549 - КДО

110 ПО 150

Рис. 2. Элюционные профили, полученные после гель-фильтрации на 8ер1ис1ех 0-25 полисахаридной части ЛПС штаммов СХМ1-188, ТЬ29 и Тя22 5. теШой, деградированных 1 % уксусной кислотой. Обозначения: -•—углеводы, —уроновые кислоты, А КДО.

Фракции IV (360-540 Да) у штаммов СХМ1-188 и Тв22 представляют собой смесь отщепившихся в результате деградации димеров и тримеров Сахаров. В этих фракциях содержится много КДО. Фракция V (180-210 Да) - фракция мономеров Сахаров. Она наиболее выражена у родительского штамма. В этой фракции у СХМ1-188 содержатся различные нейтральные сахара и уроновые кислоты.

Мы не выявили отдельной фракции, соответствующей О-полисахариду ЛПС1.Это может свидетельствовать о нетипичном строении ЛПС 8. теНИой. О-цепь могла отделяться от кора и элюироваться в том же объеме, что и коровый олигосахарид, если между ними содержится КДО. Другим объяснением полученных данных может быть то, что высокомолекулярный

Таблица 5. Моносахаридный состав полисахаридных фракций ЛПС штамма СХМ1-188 теШоН, частично деградированного 1%-ной уксусной кислотой.

Моносахарид Ф ракции (ММ, Да)

I (4000) II (2700) III (690-770) IV (360-540) V (180-210)

% от суммы площадей на ГЖХ-хроматограммах

Глюкоза 53,6 90,1 J 68,0 50,0 74,8

Галактоза 17,0 4,5 18,7 34,2 16,5

Манноза 12,5 2,2 1,3 0,9 2,6

X (TG|C 0,47) 4,8 2,2 - 6,2 6,1

Рамноза 12,1 1,0 - 8,7 -

мкг/мл максимального выхода фракции

Общее содержание углеводов 20,2 134,0 94,0 53,0 98,0

Уроновые кислоты 18,5 121,0 113,0 36,0 98,0

кдо - 0,2 2,8 1,7 1,0

Соотношение углеводов к уроновым кислотам

1Д 0,83 1,5 1

ЛПС1, обнаруживаемый при электрофорезе ЛПС S. meliloti, представляет собой агрегированную форму ЛПС2. Отсутствие длинноцепочечной 27-ОН-С28 жк влияет на агрегационные свойства ЛПС, что может приводить к исчезновению высокомолекулярной формы ЛПС.

Изучение tolC мутанта ТгбЗ, дефектного в продукции экзополисахаридов

Мутант ТгбЗ имел Тп5-инсерцию в гене tolC, кодирующем белок-канал, но имел фенотип, характерный для мутантов, дефектных в синтезе экзополисахаридов. Мы исследовали связь белка TolC с продукцией экзополисахаридов у S. meliloti. При выращивании на среде с Калькофлуором белым мутант ТгбЗ не образовывал вокруг колоний светящихся в УФ-свете ореолов. Эта особенность характерна для мутантов S. meliloti, дефектных в секреции эндогликаназ ExsH и ЕхоК, расщепляющих высокомолекулярный ЭПС1. Способность tolC мутанта ТгбЗ продуцировать второй экзополисахарид S. meliloti - ЭПС2 - тестировали на среде MOPS с низким содержанием фосфора (0,1 шМ К2НРО4). На этой среде мутант ТгбЗ формировал бесслизистые колонии, что свидетельствовало о нарушении у него продукции ЭПС2.

Поскольку ТгбЗ имел мутацию в гене tolC, он мог быть дефектен в секреции белков, экспортирующихся через секреторные системы I типа. Отсутствие светящихся ореолов у мутанта ТгбЗ могло быть связано с отсутствием белка ExsH, а бесслизизистые колонии - с отсутствием белка ExpEl, необходимого для экспорта ЭПС2. Из литературных данных известно, что белки ExsH и ExpEl выделяются через секреторные системы I типа.

Мы проанализировали наличие белков ExsH, ExpEl и ЕхоК в культуральной жидкости у tolC мутанта при помощи поликлональных

антисывороток, полученных против этих белков. Для анализа секретируемых белков использовали штаммы СХМ1-188ехо7, ТгбЗехоУ и 11т2011 ехоУ, не синтезирующие ЭПС1, что облегчало процедуру выделения секретируемых белков из культуральной жидкости. Штамм Кт20\\ехоУ был взят как контрольный, т.к. антисыворотки были получены к его белкам. Результаты анализа представлены на рис. 3.

ЕхвН ЕхрЕ1 ЕхоК

^—

1 2 3 1 2 3 1 2 3

Рис. 3. Иммуноблотинг секретируемых белков штаммов Rm201 \exoY, СХМ1-188ехоУ и ТгбЗexoY S. meliloti с поликлональными антисыворотками против белков ExsH, ExpEl и ЕхоК. Обозначения: 1- Rm201 \exoY, 2 - СХМ1-188ехоУ, 3 - ТгбЗехоГ. Стрелками обозначены ответы с белками ExsH, ExpEl и ЕхоК.

Показано, что иммунные ответы на связывание с антисыворотками против белков ExsH и ExpEl отсутствуют у мутанта ТгбЗетоУ. Белок ЕхоК, который выделяется через секреторную систему II типа, содержится в смеси секретируемых белков штаммма ТгбЗехоУ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что белки ExsH и ExpEl у S. meliloti экспортируются во внешнюю среду через белок-канал TolC.

Предполагается, что Fix(-) - фенотип мутанта ТгбЗ обусловлен нарушении-ями у него секреции экзополисахаридов, в частности ЭПС1.

Изучение мутантаphbA мутанта Tsl52 S. meliloti

Мутант Tsl52 имел Тп5-инсерцию в гене phbA, участвующим в синтезе ПОМ. При выращивании на минимальной среде Tsl52 образовывал малослизистые колонии, что указывало на изменение у него продукции экзополисахаридов. На среде LB с Калькофлуором белым колонии мутанта Tsl52 флуоресци-ровали в УФ свете, что свидетельствовало о синтезе ЭПС1. Однако, если мутант Tsl52 предварительно выращивали на минимальной среде, а затем переносили на среду с Калькофлуором, колонии Tsl52 не флуоресцировали (рис. 4). Тестирование мутанта на среде MOPS с 0,1 шМ К2НР04 показало, что продукция ЭПС2 у него не изменена. Эти данные свидетельствуют о том, что мутация по гену phbA блокирует синтез ЭПС1 у S. meliloti только при выращивании бактерий на минимальной среде и не влияет на синтез ЭПС2.

Была исследована способность мутанта Tsl52 синтезировать ПОМ. Из данных литературы известно, что у S. meliloti отложения ПОМ образуются только в свободноживущем состоянии. Они хорошо видны в бактериях

теШой, находящихся в инфекционных нитях, но никогда не обнаруживаются в бактероидах. Электронно-микроскопический анализ клубеньков выявил отложе-ния ПОМ в бактериях мутанта Те 152, находящихся в инфекционных нитях, но в меньшем количестве, чем у родительского штамма теШоП. В бактероидах обоих штаммов гранулы ПОМ отсутствовали. Мы также исследовали отложения ПОМ в свободноживущих клетках родительского штамма и мутанта, выращенных на минимальной среде. Отложения ПОМ содержались в большом количестве в клетках родительского штамма и также выявлялись в некоторых клетках Тб152. Однако в большинстве клеток мутанта, выращенных на минимальной среде, гранулы ПОМ отсутствовали (рис. 5).

IsZ •/- Щ

Рис. 4. Свечение колоний штаммов СХМ1-188 и Tsl52 S. meliloti в УФ свете на среде LB с Калькофлуором белым после выращивания на минимальной среде.

У штамма Tsl52 мутация в гене phbA приводила к повышению эффективности симбиоза. Для того чтобы выяснить, экспрессируется ли ген phbA у S. meliloti в условиях симбиоза (в бактероидах), было сконструировано слияние гена phbA S. meliloti с репортерным геном gusA. Проростки люцерны М. sativa были инокулированы штаммом СХМ1-188 (phbA::gusA) и контрольным штаммом. После обработки буферным раствором, содержащим X-GlcA, клубеньки, образованные штаммом СХМ1-188 (phbA:: gusÁ), полностью

окрашивались в синий цвет (рис. 6). Это свидетельствует об экспрессии гена phbA во всех зонах клубенька.

Таким образом, хотя ПОМ не обнаруживается в бактероидах S. meliloti, ген phbA экспрессируется в процессе симбиоза. Возможно, выключение этого гена у мутанта Tsl52 приводит к повышению его симбиотической эффективности.

Рис. 5. Исследование накопления ПОМ у свободноживущих бактерий. Отложения ПОМ показаны стрелками.

Рис. 6. Анализ экспрессии гена phbA у штамма СХМ1-188 S. meliloti в условиях симбиоза с М. sativa.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получено два Тп5-мутанта (ТЬ29 и Ts22) S. meliloti, не имеющие высокомолекулярного ЛПС1, и показано, что отсутствие ЛПС1 у S. meliloti не влияет на симбиотическую эффективность бактерий, но значительно снижает их нодуляционную конкурентоспособность.

2. Показано, что отсутствие ЛПС1 у мутанта ТЪ29 связано с Тп5-инсерцией в ген fabF2, кодирующий ацил-АПБ-синтазу, необходимую для синтеза 27-ОН-С28 жирной кислоты в липиде А ЛПС, а у мутанта Ts22 с Тп5-инсерцией в ген metH, кодирующий метионинсинтазу.

3. Исследован компонентный состав ЛПС штамма СХМ1-188 S. meliloti и ЛПС-мутантов ТЬ29 и Ts22 и показано, что в липиде А мутанта ТЬ29 отсутствует 27-ОН-С28 жирная кислота, а по моносахаридному составу ЛПС родительского штамма и обоих мутантов существенно не различаются.

4. Показано, что мутация в гене IpsL (мутант ТЬ9) не влияет на эффективность и конкурентоспособность штамма СХМ1-188 meliloti, а мутация в гене ехоВ (мутант Тг53) приводит к отсутствию КПС и Fix(-) - фенотипу на растениях-хозяевах Medicago sativa и Medicago truncatula.

5. Впервые получены Тп5-мутанты S. meliloti по генам SMc00951 (мутант Ts32) и SMc02705 (мутант Тг465), кодирующим консервативные белки внешней мембраны, и показано, что мутации в данных генах приводят к снижению конкурентоспособности S. meliloti, но не влияют на симбиотическую эффективность бактерий.

6. Впервые получен Тп5-мутант ТгбЗ S. meliloti по гену tolC и показано, что белок TolC у S. meliloti вовлечен в секрецию белков ExsH и ExpEl и является необходимым для продукции экзополисахаридов и формирования симбиоза с люцерной.

7. Показано, что мутация по гену phbA, кодирующему ацетил-КоА-ацетил-трансферазу, не блокирует синтез ПОМ у штамма СХМ1-188 S. meliloti, но отменяет синтез ЭПС1 при выращивании бактерий на минимальной среде, а также приводит к повышению эффективности симбиоза с люцерной М. sativa. Ген phbA S. meliloti экспрессируется во время симбиоза с М. sativa.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. В рецензируемых изданиях:

1. Затовская Т.В., Ушаков К.В., Юргель С.Н., Косенко Л.В., Захарова И.Я., Симаров Б.В. Получение Тп5-мутантов Rhizobinm meliloti с измененным составом липополисахаридов и анализ их симбиотических свойств // Генетика. 1998. Т.34, N6. С.742-748.

2. Косенко Л.В., Затовская Т.В. Изучение липополисахаридов Sinorhizobium meliloti СХМ1-188 и двух его мутантов, характеризующихся сниженной нодуля-ционной конкурентоспособностью // Микробиология. 2004. Т.73, N3. С. 350-357.

3. Затовская Т.В., Шарыпова Л.А., Селиверстова Е.В., Симаров Б.В. Мутант ТгбЗ по гену tolC штамма СХМ1-188 Sinorhizobium meliloti не способен к формированию эффективного симбиоза с люцерной // Генетика. 2007. Т.43, N3. С.323-332.

В других изданиях:

4. Затовская Т.В., Косенко JI.B., Юргель С.Н., Симаров Б.В. ЛПС-мутанты Sinorhizobium meliloti и их нодуляционная конкурентоспособность // Микробиол. журнал (Украина). 2000. Т.62. N2. С.27-37.

5. Zatovska T.V., Kosenko L.V., Ushakov K.V., Yurgel S.N., Simarov B.V. Rhizobium meliloti mutants with altered surface and their symbiotic properties П Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture. 1995. V.27. P.425.

6. Zatovska Т., Kosenko L., Zakharova I., Simarov В., Yurgel S. The role of bacterial lipopolysaccharides in determination of nodulation competitiveness of Rhizobium meliloti // Proc. 8th Intern. Congr. of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Jerusalem, Izrael, 1996, August 18-23.

4. Zatovskaya Т. V., Kosenko L.V., Simarov B.V. Partial characterization of Rhizobium meliloti Ts22 impaired in lipopolysaccharide synthesis // Proc. 9th Intern. Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. 1999. Amsterdam. Holland. P.58.

6. Затовская T.B., Косенко Л.В., Ушаков K.B., Шарыпова Л.А. Биохимическая и симбиотическая характеристика Rhizobium meliloti TnJ-мутанта, дефектного в синтезе липополисахаридов // Тезисы П-й съезда ВОГиС, Санкт-Петербург,

1-5 февраля 2000 г. Т.1. С. 282-283.

7. Моржина Е.В., Затовская Т.В., Стефанов С.Ю. Морфологический анализ клубеньков, формируемых мутантами Sinorhizobium meliloti Тг53 и ТгбЗ, дефектными по синтезу полисахаридов // Тезисы П-й съезда ВОГиС, Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000 г. Т.1. С. 292.

8. Zatovska T.V., Kosenko L.V., Varbanetz L.D., Simarov B.V. Lipopolysaccharides from Sinorhizobium meliloti CXM1-188 and its LPS-mutant Ts22 // Abstracts of XVI International Symposium on Glycoconjugates. 2001. August 19-24. C5.ll. The Hague,Netherlands.

9. Zatovska T.V., Kosenko L.V., Sharypova L.A. Lipopolysaccharides from Sinorhizobium meliloti CXM1-188 and its Tn5-mutant affected in biosynthesis of 27-OH-C28:0 fatty acid // Proc. of 11-th Intern. Congr. on Molecular Plant-Microbe Interactions. St.-Petersburg: Russia, 18-26 July 2003. P. 282.

12. Затовская T.B., Симаров Б.В., Шарыпова Л.А. Гены, контролирующие синтез ЛПС у Sinorhizobium meliloti СХМ1-188 // Тезисы III съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004 г. С.425.

13. Затовская Т.В., Симаров Б.В. Влияние мутации в гене phbA на синтез экзо-полисахаридов у Sinorhizobium meliloti II Тезисы докладов 12 съезда Общества Микробиологов Украины им. С. Н. Виноградского, 25-30 мая 2009 г., С. 52. Ужгород, Украина.

Подписано в печать: 19.04.2012 Тираж: 100 экз. Заказ № 520

Отпечатано в цифровой типографии ART-XPRESS 199155, Санкт-Петербург, ул. Уральская, д. 17 тел.: 331-33-22 www.art-xpress.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Затовская, Татьяна Викторовна

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ПОЛИСАХАРИДЫ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ В БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНОМ СИМБИОЗЕ, ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СИНТЕЗА

1.1. Строение клеточной оболочки грам-отрицательных бактерий.

1.2. Липополисахариды & теШоИ и других клубеньковых бактерий.

1.3. Капсулярные полисахариды & теШоИ.

1.4. Экзополисахариды клубеньковых бактерий.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы и плазмиды.

2.2. Среды для выращивания бактерий.

2.3. Микробиологические методы.

2.4. Методы работы с ДНК.

2.5. Методы анализа ЛПС.

2.6. Получение секретируемых белков и иммуноблотинг.

2.7. Обнаружение активности Р-глюкуронидазы в клетках 5. теШоН.

2.8. Оценка симбиотических свойств 5. теШоН.

2.9. Микроскопическое исследование клубеньков.

2.10. Статистическая и компьютерная обработка данных.

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ Тп5-МУТАНТОВ МЕЫЮТ1С ИЗМЕНЕННЫМИ

ПОВЕРХНОСТНЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ И АНАЛИЗ ИХ СИМБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

3.1. Получение мутантов 5. теШой с измененными поверхностными полисахаридами.

3.2. Саузерн-блот гибридизация ДНК мутантов с Тп5-зондом.

3.3. Анализ ЛПС мутантов электрофорезом в полиакриламидном геле с ДСН.

3.4. Анализ капсулярных полисахаридов.

3.5. Трансдукция генов с Тп5-инсерциями из мутантов в родительский штамм СХМ1-188 5. теШоП.

3.6. Анализ симбиотических свойств мутантов.

3.7. Симбиотический фенотип мутантов Тг53 и ТгбЗ.

3.8. Электронно-микроскопический анализ клубеньков, образованных мутантами

Тг53 иТгбЗ.

3.9. Анализ нетипичных клубеньков, образованных мутантом Тг53.

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Тп5 - МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННЫМИ ПОВЕРХНОСТНЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ

4.1. Идентификация генов, инактивированных Тп5-инсерциями у мутантов.

4.2. Сравнительный анализ липополисахаридов родительского штамма

СХМ1-188 5. теШоН и ЛПС-мутантов Тб22 и ТЬ29.

4.3. Изучение /о/С мутанта ТгбЗ, дефектного в продукции экзополисахаридов.

4.4. Изучение рИЪА мутанта Тэ 152 5. теЫоИ.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и анализ Tn5-мутантов Sinorhizobium meliloti с измененными поверхностными полисахаридами"

Почвенные бактерии сем. Rhizobiaceae (клубеньковые бактерии) вступают в симбиоз с бобовыми растениями. При этом на корнях растений формируются клубеньки, где бактерии, преобразованные в бактероиды, фиксируют атмосферный азот. Формирование симбиоза - сложный, специфичный процесс, протекающий при участии различных сигнальных молекул обоих партнеров (Jones et ai., 2007).

Обмен молекулярными сигналами начинается в ризосфере еще до того, как бактерии прикрепляются к корневым волоскам растений. Флавоноиды, ароматические соединения, выделяемые корнями растений, активируют продукт бактериального гена nodD, транскрипционного регулятора других nod генов ризобий (Rhijn, Vanderleyden, 1995). Активация nod генов, в свою очередь, приводит к синтезу и секреции липоолигосахаридных молекул (Nod-факторов), которые запускают и контролируют самые ранние этапы возникновения клубеньков у растения-хозяина Nod-факторы вызывают деформацию, утолщение и скручивание корневых волосков, колонизированных бактериями. Nod-факторы также индуцируют деление клеток внутренней коры корня, что приводит к формированию примордия, из которого образуется симбиотический орган - клубенек (Jones et al., 2007). Бактерии колонизируют корневые волоски, захватываются ими и проникают в клетки развивающегося клубенька по специальным структурам — инфекционным нитям, образующимся путем врастания мембраны корневых волосков. В инфекционных нитях ризобии активно делятся и, путем эндоцитоза, попадают в цитоплазму клеток растения-хозяина. Там бактерии окружаются перибактероидными мембранами растительного происхождения и дифференцируются в бактероиды, способные восстанавливать атмосферный азот до аммония.

Важную роль в становлении бобово-ризобиального симбиоза играют поверхностные полисахариды бактерий (Канненберг и др., 2002; Fraysse et al., 2003). Ризобии, как и большинство грам-отрицательных бактерий, синтезируют четыре типа полисахаридов. Это липополисахариды (ЛПС), составляющие внешний слой клеточной стенки бактерий, капсулярные полисахариды (КПС), связанные с поверхностью клетки, экзополисахариды (ЭПС), выделяющиеся во внешнюю среду, и циклические глюканы, расположенные в периплазматическом пространстве. Все эти полисахариды защищают бактерии от неблагоприятных условий внешней среды и участвуют в прикреплении их к корневым волоскам растения, наряду с белками рикадгезинами и пилями. Однако главная функция полисахаридов в формировании симбиоза - сигнальная.

Показано, что низкомолекулярные формы экзополисахаридов ризобий необходимы на стадии инфицирования растения-хозяина. Они подавляют защитную реакцию растения-хозяина, развивающуюся в ответ на вторжение бактерий (Niehaus et ai., 1993; Rolfe et al., 1996; Jones et al., 2008). Не менее важную роль в формировании симбиоза играют ЛПС у клубеньковых бактерий R. leguminosarum, R. etli, Bradyrhizobium japonicum. Мутанты этих бактерий, не синтезирующие О-антигенные цепи ЛПС, не способны формировать эффективный симбиоз с растениями-хозяевами и вызывают образование не фиксирующих азот псевдоклубеньков (Priefer, 1989; Perotto et al., 1994). Было показано, что ЛПС модулируют развитие инфекционных нитей у R. leguminosarum bv trifolii и также оказывают супрессорное влияние на развитие защитной реакции у растения-хозяина (Dazzo et al., 1991; Niehaus et al., 1994; Albus et al., 2001). Кроме того, ЛПС играют важную роль на более поздних стадиях формирования симбиоза - при переходе бактерий в состояние бактероидов. Было показано, что дифференцировка бактерий R. leguminosarum в бактероиды сопровождается изменениями компонентного состава и физико-химических свойств ЛПС, и эти изменения инициируются окружающими условиями - снижением pH среды и содержания в ней О2 (Cannenberg, Carlson, 2001). Показано, что синтез ЭПС и ЛПС у клубеньковых бактерий находится под влиянием глобальных транскрипционных регуляторов, играющих важную роль в адаптации бактерий к условиям окружающей среды в свободноживущем состоянии и в симбиозе с растениями (Glenn et al., 2007; Wells et al, 2007).

Объектом наших исследований были клубеньковые бактерии Sinorhizobium meliloti, вступающие в симбиоз с люцерной, донником и пажитником. В настоящее время у этого вида ризобий детально изучены только экзополисахариды - ЭПС1 и ЭПС2. Показано, что для формирования симбиоза 5. meliloti с люцерной необходимо участие ЭПС1 (Leigh et al., 1985; Battisti et al., 1992). Мутанты, дефектные в синтезе ЭПС1, вызывают образование видоизмененных, не фиксирующих азот клубеньков (Leigh et al., 1985; Pellock, Cheng, 2000). У штамма 1021 S. meliloti была установлена структура ЭПС1 и ЭПС2 (Her et al., 1990; Reinhold et al., 1994), изучена генетика синтеза ЭПС и его регуляции (Leigh, Walker, 1994; Becker, Pühler, 1998).

Липополисахариды - наименее исследованные полисахариды у S. meliloti.

Структура полисахаридной части ЛПС пока не установлена ни у одного штамма S. meliloti, а данные о составе ЛПС штаммов 1021 и 2011 S. meliloti отчасти противоречивы (Ferguson et al., 2002; Campbell et al., 2002). Не выяснены функции большинства генов, контролирующих синтез коровой области ЛПС. Практически ничего не известно об О-цепи S. meliloti и ее роли в симбиозе. Кроме того, исследование роли ЛПС и других полисахаридов в формировании бобово-ризобиального симбиоза проводилось только у штаммов 1021 и 2011 S. meliloti, у которых некоторые гены синтеза и регуляции полисахаридов повреждены мутациями (Pellock et al, 2002; Becker et al., 2005).

Основным подходом в изучении функций, структуры и генетики синтеза полисахаридов остается получение Тп5-транспозоновых мутантов с нарушениями синтеза полисахаридов. Встройка Тп5-транспозона инактивирует ген, а также метит его устойчивостью к канамицину, что облегчает определение последовательностей ДНК, смежных с транспозоном. Новые возможности в изучении функций полисахаридов и генетики их синтеза открылись после полного секвенирования генома модельного штамма 1021 5. meliloti (Galibert et al., 2001). Кроме двух уже исследованных кластеров генов, детерминирующих синтез ЭПС1 и ЭПС2, на мегаплазмиде pSymb S. meliloti было выявлено несколько генетических кластеров, которые также могут быть связаны с синтезом полисахаридов (Finan et al., 2001). Их функции у S. meliloti пока не известны.

Таким образом, изложенные сведения определяют актуальность данной работы. Целью нашей работы было - выявление новых генов Sinorhizobium meliloti, вовлеченных в контроль синтеза липополисахаридов и других поверхностных полисахаридов, и выяснение их роли в формировании симбиоза бактерий с Medicago sativa.

Конкретными задачами данной работы являлись:

1. Получение Тп5-мутантов S. meliloti с измененными поверхностными полисахаридами и первичная характеристика их липополисахаридов и капсулярных полисахаридов при помощи электрофореза в полиакриламидном геле.

2. Изучение симбиотических свойств - эффективности и нодуляционной конкурентоспособности у Тп5-мутантов S. meliloti с измененными поверхностными полисахаридами.

3. Идентификация генов, инактивированных Тп5-инсерциями у полученных мутантов S. meliloti.

4. Сравнительный анализ состава липополисахаридов штамма СХМ1-188 S. meliloti и ЛПС-мутантов с помощью газо-жидкостной хроматографии и гель-фильтрации. Научная новизна полученных результатов.

Впервые было получено два Тп5-мутанта S. meliloti, не имеющих высокомолекулярной формы ЛПС (ЛПС1). Показано, что отсутствие ЛПС1 в одном случае было связано с Тп5-мутацией в гене fabF2, что приводило к отсутствию длинноцепочечной 27-ОН-С28 жирной кислоты в липидной части ЛПС, а в другом случае - с Тп5-мутацией в гене metH, кодирующем метионинсинтазу. Установлено, что отсутствие высокомолекулярного ЛПС1 не влияет на способность S. meliloti вступать в симбиоз с М. sativa и M. truncatula и на симбиотическую эффективность, но приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности бактерий. Показано, что родительский штамм СХМ1-188 S. meliloti и мутанты, не имеющие высокомолекулярной формы ЛПС, не различаются по моносахаридному составу ЛПС. Впервые получен Тп5-мутант S. meliloti по гену tolC и показано, что мутация приводит к нарушению секреции экзополисахаридов и способности формировать эффективный симбиоз с Medicago sativa и M. truncatula. Установлено, что белок TolC у S. meliloti вовлечен в секрецию белков ExsH и ExpEl. Впервые получены Тп5-мутанты S. meliloti по генам SMc00951 и SMc02705 и изучены их симбиотические свойства. Показано, что мутация по гену phbA, кодирующему ацетоацетил-КоА-трансферазу, приводит к повышению симбиотической эффективности у штамма СХМ1-188 и влияет на синтез ЭПС1 и ПОМ при выращивании бактерий на минимальной среде. Установлено, что ген phbA у

5. meliloti экпрессируется во время симбиоза. Практическое значение полученных результатов.

Результаты тестирования полисахаридов S. meliloti на селективных средах были использованы в научно-практическом пособии "Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценозах" (Румянцева и др., 2011). Мутант Tsl52 S. meliloti, характеризующийся повышенной симбиотической эффективностью и конкурентоспособностью, был взят для испытаний в географическую сеть опытов (ГСО) ВНИИСХМ, депонирован в коллекции ГНУ ВНИИСХМ РАСХН. Мутант Tsl52 рекомендован в качестве тестерного штамма для оценки нодуляционной конкурентоспособности штаммов S. meliloti.

Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курса лекций «Симбиогенетика», читаемого на кафедре генетики и селекции СПбГУ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Затовская, Татьяна Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые получено два Тп5-мутанта (ТЬ29 и Ts22) S. meliloti, не имеющие высокомолекулярного ЛПС 1, и показано, что отсутствие ЛПС 1 у S. meliloti не влияет на симбиотическую эффективность бактерий, но значительно снижает их нодуляционную конкурентоспособность.

2. Показано, что отсутствие ЛПС1 у мутанта ТЬ29 связано с Тп5-инсерцией в ген fabF2, кодирующий ацил-АПБ-синтазу, необходимую для синтеза 27-ОН-С28 жирной кислоты в липиде А ЛПС, а у мутанта Ts22 с Тп5-инсерцией в ген metH, кодирующий метионинсинтазу.

3. Исследован компонентный состав ЛПС штамма СХМ1-188 S. meliloti и ЛПС-мутантов ТЬ29 и Ts22 и показано, что в липиде А мутанта ТЪ29 отсутствует 27-ОН-С28 жирная кислота, а по моносахаридному составу ЛПС родительского штамма и обоих мутантов существенно не различаются.

4. Показано, что мутация в гене IpsL (мутант ТЬ9) не влияет на эффективность и конкурентоспособность штамма СХМ1-188 S. meliloti, а мутация в гене ехоВ (мутант Тг53) приводит к отсутствию КПС и Fix(-) - фенотипу на растениях-хозяевах Medicago sativa и Medicago truncatula.

5. Впервые получены Тп5-мутанты S. meliloti по генам SMc00951 (мутант Ts32) и SMc02705 (мутант Тг465), кодирующим консервативные белки внешней мембраны и показано, что мутации в данных генах приводят к снижению конкурентоспособности 5". meliloti, но не влияют на симбиотическую эффективность бактерий.

4.4.3. Заключение

Таким образом, был исследован мутант Ts 152 S. meliloti, имеющий Тп5-инсерцию в гене phbA, кодирующем ключевой фермент синтеза ПОМ - ацетил-КоА-ацетилтрансфе-разу. Мутант отличался от родительского штамма СХМ1-188 S. meliloti повышенной симбиотической эффективностью и обладал высокой конкурентоспособностью. Было показано, что мутация по гену phbA у штамма Tsl52 снижала синтез ПОМ, но не отменяла его полностью. Мутация по гену phbA блокировала синтез ЭПС1 и ПОМ только при выращивании бактерий на минимальной среде, в условиях, способствующих синтезу этих полимеров. Мутация не влияла на синтез ЭПС2 - второго экзополисахарида S. meliloti. При помощи сконструированного нами слияния phbA: : gusA было показано, что ген phbA экспрессируется во время симбиоза с М. sativa.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Поверхностные полисахариды клубеньковых бактерий играют важную роль в формировании бобово-ризобиального симбиоза. С начала 70-х годов проводятся интенсивные исследования состава, структуры и биологических свойств ЛПС, главных компонентов клеточной стенки бактерий, определяющих ее антигенные свойства.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Затовская, Татьяна Викторовна, Санкт-Петербург

1. Детерман Г.Г. Гель-хроматография //Москва: Мир. 1970. 252 с.

2. Зарецкая А.Н. Метод трансформации как способ повышения активности клубеньковых бактерий люцерны // Микробиология. 1976. Т. 45. № 5. С. 873-878.

3. Затовская Т.В., Ушаков К.В., Юргель С.Н., Косенко Л.В., Захарова И.Я., Симаров Б.В. Получение Тп5-мутантов Rhizobium meliloti с измененным составом липополисахаридов и анализ их симбиотических свойств // Генетика. 1998. Т.34, N6. С.742-748.

4. Затовская Т.В., Шарыпова Л.А., Селиверстова Е.В., Симаров Б.В. Мутант ТгбЗ по гену tolC штамма СХМ1-188 Sinorhizobium meliloti не способен к формированию эффективного симбиоза с люцерной // Генетика. 2007. Т.43, N3. С.323-332.

5. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов // Киев: Наукова думка. 1982. 192 с.

6. Красильников H.A., Кореняко А.И. О методах количественного учета клубеньковых бактерий в почве // Микробиология. 1940. Т. 19. С. 27-31.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1980. 293 с.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

9. Новикова Н.И., Чеснокова О.Н., Сафронова В.И. и др. Трансдукция генов Rhizobium meliloti, маркированных Тп5, с помощью фага ^М12//Генетика. 1989. Т. 25, N 12. С. 2121-2125.

10. Новикова Н.И., Шарыпова Л.А., Симаров Б.В. Транспозоноовый мутагенез у штамма СХМ1-105 Rhizobium meliloti II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1986. N8. С.32-35.

11. Онищук О.П., Шарыпова Л.А. Курчак О.Н. и др. Выявление генов Sinorhizobium meliloti, влияющих на синтез поверхностных полисахаридов и конкурентоспособность // Генетика. 2005. Т. 41. С. 1617-1623.

12. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Липополисахарид-белковые комплексы внешней мембраны грамотрицательных бактерий // Биоорг. Химия. 1983. Т.9. С. 725-733.

13. Федоров С.Н., Симаров Б.В. Получение мутантов Rhizobium meliloti с измененными симбиотическими свойствами под действием УФ-излучения//С.-х. биология. 1987, №9. С. 44-49.

14. Шарыпова Л.А., Симаров Б.В. Способ сравнения конкурентоспособности эффективных штаммов Rhizobium meliloti II Тр. ВНИИСХМ. 1985, №55. С. 85-89.

15. Юргель С.Н., Шарыпова Л.А., Симаров Б.В. Тп5 мутации Rhizobium meliloti, вызы-ющие повышение редокс-потенциала свободноживущих клеток и эффективность их симбиоза с люцерной // Генетика. 1998. Т.34. № 6. С.1-15.

16. Albersheim P., Nevins D.J., English P.D., Karr A. A method for the analysis of sugars in plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography // Carbohydr. Res. 1967. V. 5. P. 340-345.

17. Albus U., Baier R., Hoist O., Puhler A., Niehaus K. Suppression of an elicitor-induced oxidative burst reaction in Medicago sativa cell cultures by Sinorhizobium meliloti lipopolysaccharides // New Phytologist 2001. V. 151. P. 597-606.

18. Allen O.N. Experiments in soil bacteriology. Minneapolis: Burges Publishing Co, 1959.54 p.

19. Allaway D., Jeyaretnam В., Carlson R.W., Poole P.S. Genetic and chemical characterization of a mutant that disrupts synthesis of the lipopolysaccharide core tetrasaccharide in Rhizobium leguminosarum // J. Bacteriol. 1996. V. 178, N21. P. 6403-6406.

20. Altschul S.F., Gish W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.

21. Aman P., Mc-Neil M., Franzen L.-E., Darvill A.G., Albersheim P. Structural elucidation, using HPLC-MS, of the acidic polysaccharide secreted by Rhizobium meliloti strain 1021 // Carbohydr. Res. 1981. V.95. P. 263-282.

22. Amemura A., Hisamatsu H., Mitani H., Harada T. Cyclic (l-2)-(3-D-glucan and the octa-sacchride repeating units of extracellular acidic polysaccharides produced by Rhizobium И Carbohydr. Res. 1983. V. 114. P. 277-285.

23. Andersen C., Hughes C., Koronakis V. Channel vision. Export and efflux through bacterial channel-tunnels // EMBO Reports. 2000. V.l, N4. P. 313-318.

24. Anderson A.J., Dawes E.A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates // Microbiol. Rev. 1990. V. 54 P. 450-472.

25. Aneja P., Zachertowska A., Charles T.C. Comparison of the symbiotic and competition phenotypes of Sinorhizobium meliloti PHB synthesis and degradation pathway mutants // Can. J. Microbial. 2005. V. 51. P. 599-604.

26. Ausubel F.M., Brent R, Kingston R.E., Moore D.D. Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. Current protocols in Molecular Biology. USA Current Protocols. 1994. Willey. New York.

27. Bahlawane C., Mcintosh M., Krol E., Becker A. Sinorhizobium meliloti regulator MucR couples exopolysaccharide synthesis and motility // MPMI. 2008. V.21, N11. P. 1498- 1509.

28. Barra L., Fontenelle C., Ermel G., Trautwetter A., Walker G.C., Blanco C. Interrelations between glycine betaine catabolism and methionine biosynthesis in Sinorhizobium meliloti strain 102F34 // J. Bacteriol. 2006. V. 188, N20. P. 7195-7204.

29. Bazu S.S., White K.A., Que N.L., Raetz C. A deacylase in Rhizobium leguminosarum membranes that cleaves the 3-O-linked beta-hydroxymyristoyl moiety of lipid A precursors // J.Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 11150-11158.

30. Basu S.S., Karbarz M.J., Raetz C.R.H. Expression cloning and characterization of the C28 acyltransferase of lipid A bisynthesis in Rhizobium leguminosarum II J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 28959-28971.

31. Battisti L., Lara J.C., Leigh J.A. Specific oligosaccharide form of the Rhizobium meliloti exopolysaccharide promotes nodule invasion in alfalfa // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. V. 89, N 12. P. 5625-5629.

32. Baumann U., Wu S., Flaherty K.M., McKay D.B. Three-dimensional structure of the alkaline protease of Pseudomonas aeruginosa: a two-domain protein with a calcium binding parallel beta roll motif//EMBO J. 1993. V. 12. P. 3357-3364.

33. Becker A., Frassy N., Sharypova L. Recent advances in studies on structure and symbiosis-related function of Rhizobial K-antigens and lipopolysaccharides // MPMI. 2005. V. 18, N9. P. 899-905.

34. Becker A., Kleickmann A., Arnold W. Pühler A. Analysis of Rhizobium meliloti exoH/exoK/exoL fragment: ExoK shows homology to excreted endo-ß-l,3-l,4-glucanases and ExoH resembles membrane proteins // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 238. P.145-154.

35. Becker A., Pühler A. Production of exopolysaccharides 11 in Rhizobiaceae: Molecular biology of model plant-ssociated bacteria (Spaink H.P., Kondorosi A. & Hooykaas P.J.J., eds.). 1998. Kluwer Acadeic Publishers, Boston, pp. 97-118.

36. Becker A., Rüberg S., Baumgarth B., Bertram-Drogatz P.A., Quester L., Pühler A. Regulation of succinoglycan and galactoglycan biosynthesis in Sinorhizobium meliloti II J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 4. P. 187-190.

37. Beringer J.E. R1 transfer in Rhizobium leguminosarum II J. Gen. Microbiol. 1974. V. 84. P. 188-198.

38. Bergersen, F. J., Peoples, M.B. and Turner, G.L. A role for poly-beta-hydroxybutyrate in bacteroids of soybean root nodules // Proc. R. Soc. Lond, Ser. B Biol. Sei. 1991. V. 245. P. 59-64.

39. Beveridge T.J. Structures of gram-negative cell and their derived membrane vesicles // J. Bacteriol. 1999. V. 181, N16. P. 4725-4733.

40. Bhat U.R., Mayer H., Yokota A., Hollingsworth R.I., Carlson R.W. Occurence of lipid A variants with 27-hydroxyoctacosanoic acid in lipopolysaccharides from members of the family Rhizobiaceae II J. Bacteriol. 1991b. V. 173. N7. P. 2155-2159.

41. Bhat U.R., Carlson R.W. Chemical characterization of pH-dependent structural epitopes of lipopolysaccharides from Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli II J.Bacteriol. 1992. V. 174. P. 2230-2235.

42. Birnboim H, Doly J. A rapid alcaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. V. 7. P. 1513-1523.

43. Bitter T, Muir H.M. A modified uronic acid carbazole reaction // Analyt. Biochem. 1962. V. 4, N4. P. 330-334.

44. Bohlool B.B, Schmidt E.L. Lectins: a possible basis for specificity in the Rhizobium-legume root nodule symbiosis // Science. 1974. V. 185, N 19. P. 269-271.

45. Brade H, Galanos C. Common lipopolysaccharide specificity: new type of antigen residing in the inner core region of S- and R-form lipopolysaccharides from different families of gram-negative bacteria // Infect. Immun. 1983. V.42. P.250-256.

46. Breedveld M.W, Zevenhuiszen L.P.T.M, Zehnder A.J.B. Osmotically induced oligo- and polysaccharide synthesis by Rhizobium meliloti SU-47 // J.Gen. Microbiol. 1990. V. 136. P. 2511-2519.

47. Brozek K.A, Carlson R.W, Raetz C.R.H. Lipoplysaccharide biosynthesis in Rhizobium leguminosarum II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 32126-32136.

48. Brozek K.A, Kadrmas J.L, Raetz C.R.H. Lipopolysaccharide biosynthesis in Rhizobium leguminosarum II J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 32112-32118.

49. Campbell G.R.O., Reuhs B.L., Walker G.C. Chronic intracellular infection of alfalfa nodules of Sinorhizobium meliloti requires correct lipopolysaccharide core // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. N6. P. 3938-3943.

50. Campbell G.R.O., Sharypova L.A., Scheidle H., Jones K.M., Niehaus K., Backer A., Walker G.C. Striking complexity of lipopolysaccharide defects in a collection of Sinorhizobium meliloti mutants // J. Bacteriol. 2003. V.185. N13. P. 3853-3862.

51. Carlson R.V. Heterogeneity of Rhizobium lipopolysaccharides // J. Bacteriol. 1984. V.158, N3. P. 1012-1017.

52. Carlson R.W., Garci F., Noel K.D., Hollingsworth R. The structures of the lipopolysaccharide core components from Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli CE3 and of its symbiotic mutants, CE109 and CE309 // Carbohydr. Res. 1989. V.195. P. 101-110.

53. Carlson R.W., Hollingsworth R.L., Dazzo F.B. A core oligosaccharide component from the lipopolysaccharide of Rhizobium trifolii ANU843 // Carbohydr. Res. 1988. V. 176, N1. P. 127-135.

54. Carlson R.W., Kalembasa S., Turowski D., Pachori P., Noel K.D. Characterization of the lipopolysaccharides from Rhizobium phaseoli mutant that is defective in infection thread development//!. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 4923-4928.

55. Carlson R.W., Reuhs B., Chen T.B., Bhat U.R., Noel K.D. Lipopolysaccharide core structures in Rhizobium etli and mutants deficient in O-antigen // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N20. P. 11783-11788.

56. Carrion M., Bhat U.R., Reuhs B., Carlson R.W. Isolation and characterization of the lipopolysaccharides from Bradyrhizobium japonicum II J. Bacteriol. 1990. V.172, N4. P. 1725-1731.

57. Cava J.R., Elias P.M., Turowski D.A., Noel K.D. Rhizobium leguminosarum CFN142 genetic regions encoding lipopolysaccharide structures essential for complete nodule develop-ment on bean plants //¿Bacterid. 1989. V. 172. P. 8-15.

58. Cevallos M.A., Encarnación S., Leifa A., Mora Y., Mora J. Genetic and physiological characterization of a Rhizobium etli mutant strain unable to synthesize poly-(3-hydroxy-butyrate // J. Bacteriol. 1996. V. 176. P. 1646-1654.

59. Charles T.C., Finan T.M. Analysis of a 1600-kilobase Rhizobium meliloti megaplasmid using defined deletions generated in vivo // Genetics. 1991. V. 127. P. 5-20.

60. Charles T.C., Nester E.W. A chromosomally encoded two-component sensor transduction system is required for virulence of Agrobacterium tumefaciens II J. Bacteriol. 1993. V.175. P. 6614-6625.

61. Charles T.C., Quo-Qin Cai, Aneja P. Megaplasmid and chromosomal loci for the PHB degradation pathway in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti II Genetics. 1997. V.146. P. 1211-1220.

62. Chen E.J., Sabio E.A., Long S.R. The periplasmatic regulator ExoR inhibits ExoS/ChvI two-component signalling in Sinorhizobium meliloti II Mol.Microbiol. 2008. V. 65, N5. P.1290-1303.

63. Cheng H-P., Walker G.C. Succinoglycan production by Rhizobium meliloti is regulated through the ExoS-ChvI two-component regulatory system // J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 20-26.

64. Cheng H-P., Walker G.C. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1998. V.180, N 19. P.5183-5191.

65. Chouly C., Colquhoun I.J., Jodelet A., York G., Walker G.C. NMR studies of succinoglycan repeating-unit octasaccharides from Rhizobium meliloti and Agrobacterium radiobacter II Int. J. Biol. Macromol. 1995. V.17, N6. P. 357-363.

66. Clover R.H., Kieber J., Signer E.R. Lipopolysaccharide mutants of Rhizobium meliloti are not defective in symbiosis // J. Bacteriol. 1989. V. 171. P. 3961-3967.

67. Cronan G.E., Keating D.H. Sinorhizobium meliloti sulfotransferase that modifies lipopolysaccharides // J. Bacteriol. 2004. V. 186, N13. P. 4168-4176.

68. Dazzo F. B., Hubbell D. H. Cross-reactive antigens and lectin as determinants of symbiotic specificity in the Rhizobium-clover association // Appl. Microbiol. 1975. V.30, N6. P. 17251731.

69. De Castro C., Bedini E., Nunziata R., Rinaldi R., Mangoni L., Parrilli M. Elucidation of the O-chain structure from the lipopolysaccharide of Agrobacterium tumefaciens strain C58 // Carbohydr. Ree. 2003. V. 338. P. 1891-1894.

70. De Castro C., Carannate A., Lanzetta R., Nunziata R., Piscopo V., Pariiii M. Elucidation of two O-chain structures from the lipopolysaccharide fraction of Agrobacterium tumefaciens F/l // Carbohydr. Ree. 2004. V. 339, № 14. P. 2451-2455.

71. De Castro C., Molinaro A., Lanzetta R., Silipo A., Parrilli M. Lipopolysaccharide struc-tures from Agrobacterium and Rhizobiaceae species // Carbohydr. Ree. 2008. V. 343. P. 19241933.

72. De Maagd R.A., Lugtenberg B.J.J. Outer membranes of Gram-negative bacteria // Biochem. Soc. Transact. 1987. V.15. P. 54-62.

73. D'Haeze W., LeofFC., Freshour G., Noel K.D., Carlson R.W. Rhizobium etli CE3 bacteroid lipopolysaccharides are structurally similar but not identical to those produced by culturad CE bacteria// J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 17101-17113.

74. Delepelaire P. Type I secretion in gram-negative bacteria // Biochim. Biochys. Acta 2004. V. 1694. P. 149-161.

75. Diebold R., Noel K.D. Rhizobium leguminosarum exopolysaccharide mutants: biochemical and genetic analyses and symbiotic behavior on three hosts // J. Bacterid. 1989. V. 171. P. 4821-4827.

76. Djordjevic S.P., Rolfe B.G., Batley M., Redmond J.W. The structure of the exopolysaccharide from Rhizobium sp. strain ANU280 (NGR234) // Carbohydr. Res. 1986. V.148. P. 87-99.

77. Doerrler W.T., Gibbons H.S., Raetz C.R. MsbA dependent translocation of lipids across the inner membrane of Escherichia coli II J. Biol. Chem. 2004. V. 279, N 43. P. 45102-45109.

78. Doherty D., Leigh J.A., Glazebrook J., Walker G.C. Rhizobium meliloti mutants that overproduce the R. meliloti acidic calcofluor binding exopolysaccharide // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 4249-4256.

79. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. V. 28, N 3. P. 350-356.

80. Duong F., Lazdunsir A., Cami B., Murgier M. Sequince of a cluster of genes controlling synthesis and secretion of alkaline protease in Pseudomonas aeruginosa: relationships to other secretory pathways // Gene. 1992. V. 121. P. 47-54.

81. Eggleston G., Huber M.C., Liang R., Karr A.L., Emerich D.W. Bradyrhizobium japonicum mutants deficient in exo- and capsular polysaccharides cause delayed infection and nodule initiation H MPMI. 1996. V.9, N5. P. 419-423.

82. Encarnación S., Dunn M., Willms K., Mora J. Fermentative and aerobic metabolism in Rhizobium etli II J. Bacteriol. 1995. V.177, N11. P. 3058-3066.

83. Encarnación S., Vargas M.C., Dunn M.F., Davalos A., Mendoza G., Mora Y., MoraJ.AniA regulates reserve polymer accumulation and global protein expression in Rhizobium leguminosarum II J. Bacteriol. 2002. V. 184, N 8. P. 2287-2295.

84. Epple G., van der Drift K.M., Thomas-Oates J.E., Geiger O. Characterization of a novel acyl carrier protein, RkpF, encoded by operon involved in capsular polysaccharide biosynthesis in Sinorhizobium meliloti Hi. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 4950-4954.

85. Evans L., Linker A., Impallomeni G. Structure of succinoglycan from an infectious strain of Agrobacterium radiobacter II Int. J. Biol. Macromol. 2000. V.27, N5. P. 319-326.

86. Fedulova N.G., Chennenskaya N.G., Romanov V.I, Kretovich V.L. Ensymes of Ensymes of poly-ß-oxybutyrate metabolism in bacteroids of lupini nodules // Physiology of Plants.- 1980. V.27. P. 544-549.

87. Fath M.J. and Kolter R. ABC transporters: bacterial exporters // Microbiol. Rev. 1993. V.57. P. 995-1017.

88. Ferguson G.R., Datta A., Carlson R.W., Walker G.C. Importance of unusually modified lipid A in Sinorhizobium stress resistance and legume symbiosis // Mol. Microbiol. 2005. V. 56, N1. P. 68-80.

89. Ferguson G.P., Roop I.I., Walker G. Deficiency of a Sinorhizobium meliloti bacA mutant in alfalfa symbiosis correlates with alteration of the cell envelope // J. Bacteriol. 2002. V. 184, N20. P. 5625-5632.

90. Finan T.M., Hartwieg E., LeMieux K., Bergman K., Walker G.C., Signer E.R. General transduction in Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1984. V. 159. P. 120-124.

91. Finan T.M., Hirch A.M., Leigh S.A., Johanson E., Kudlau G.A., Deegan S., Walker G.C., Signer E.R. Symbiotic mutants of Rhizobium meliloti that uncouple plant from bacterial differentiation // Cell. 1985. V. 40. P. 869-877.

92. Forsberg L.S., Bhat U.R., Carlson R.W. Structural characterization of the O-antigenic polysaccharide of the lipopolysaccharide from Rhizobium etli strain CE3 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, N25. P. 18851-18863.

93. Fraysse N., Couderc F., Poinsot V. Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis // Eur. J. Biochem. 2003. V.270. P. 1365-1380.

94. Gao M., Chen H., Eberhard A., Gronquist M.R., Rolfe J.B., Bauer W.D. sinl and expR-dependent quorum sensing in Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 79317944.

95. Garcia de los Santos and Brom S. Characterization of two plasmid-borne Ipsfi loci of Rhizobium etli required for lipopolysaccharide synthesis and for optimal interaction with plants // MPMI. 1997. V.10. N7. P. 891-902.

96. Geremia R.A., Cavaignac S., Zorreguita, Toro N., Olivares J., Ugalde R.A. A Rhizobium meliloti mutant that forms ineffective pseudonodules in alfalfa produced exopolysaccharide but fails to form p-(l,2)-glucan // J. Bacteriol. 1987. V.169. P. 880-884.

97. Gibson K.E, Barnett M.J, Toman C.J, Long S.R, Walker G.C. The symbiosis regulator CbrA modulates a complex regulatory network affecting the flagellar apparatus and cell envelope proteins // J. Bacteriol. 2007. V.189. P. 3591-3602.

98. Gibson K.E, Campbell G.R, Lloret J, Walker G.C. CbrA is a stationary-phase regulator of cell surface physiology and legume symbiosis in Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 2006. V. 188. P. 4508-4521.

99. Gil-Sserrano A, del Junko A.S, Tejero-Mateo P, Megias M, Caviedes M.A. Structure of the extracellular polysaccharide secreted by Rhizobium leguminosarum var. phaseoli CIAT 899 // Carbohydr. Res. 1990. V. 204. P. 103-107.

100. Glazebrook J, Walker G.C. A novel exopolysaccharide can function in place of the Calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti 11 Cell. 1989. V.56. P. 661-672.

101. Glenn S.A, Gurich N, Feeney M.A, Gonzalez J.E. ExpR/Sin quorum-sensing system system controls succinoglycan production in Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 2007. V. 189, N19. P. 7077-7088.

102. Gluksmann M.A, Reuber T.L, Walker G.C. Genes needed for the modification, polymerization, export and processing of succinoglycan by Rhizobium meliloti-. a model for succinoglycan biosynthesis // J. Bacteriol. 1993. V.175, N 21. P. 7045-7055.

103. Glucksmann A.M., Reuber T.I, Walker G.C. Family of glycosyl transferases needed for the synthesis of succinoglycan by Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 7045-7055.

104. Gonzalez J.E, Reuhs B.L, Walker G.C. Low molecular weight EPS II of Rhizobium meliloti allows nodule invasion in Medicago sativa II Proel. Natl. Sci. USA. 1996. V.93. P.8636-8641.

105. Gonzalez J.E, York G.M, Walker G.C. Rhizobium meliloti exopolysaccharides: synthesis and symbiotic function // Gene. 1996. V. 179. P. 141-146.

106. Grant S.G.N, Jessee J, Bloom F.R. et al. Differential plasmid rescue from transgenic mouses DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutant // PNAS. 1990. V. 87. P. 46454649.

107. Groisman E.A. The pleiotropic two-component regulatory system phoP-phoQ // J.Bacteriol. 2001. V.183,N6. P.1835 -1842.

108. Gudlavalleti S.K., Forsberg L.S. Structural characterization of the lipid A component of Sinorhizobium sp. NGR234 rough and smooth form lipopolysacharide // J. Biol. Chem. 2003. V.278, N6. P. 3957 3968.

109. Hardy R.W.F., Holstein R., Jackson E., Burns R.S., C2H2-C2H4-assay for N2 fixation: laboratory and field evaluation // Plant. Phys. 1968. V. 42. P. 9-13.

110. Harlow E., Lane D. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA. 1988.

111. Her G.-R., Glazebrook J., Walker G.C., Reinhold V.N. Structural studies of a novel exopolysaccharide produced by a mutant of Rhizobium meliloti Rml021 // Carbohydr. Res. 1990. V.198. P. 305-312.

112. Hirsch A.M., Bang N., Ausubel F.M. Ultrastructural analysis of ineffective alfalfa nodules formed by nif Tn5 mutants of Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1983. V.155. P. 367-380.

113. Hirsch A.M., Long S.R., Bang M., Haskins N., Ausubel F.M. Structural studies of alfalfa roots infected with nodulation mutants of Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1982. V.151. P. 411-419.

114. Hoang H.H., Becker A., González J.E. The LuxR homolog ExpR, in combination with the Sin quorum-sensing system, plays a central role in Sinorhizobium meliloti gene expression // J. Bacteriol. 2004. V.186, N16. P. 5460-5472.

115. Hoang H.H., Gurich N., González J.E. Regulation of motility by the ExpR/Sin quorum-sensing system in Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 2008. V.190, N3. P. 861-871.

116. Hoist O., Brade H. Chemical structure of the core region of bacterial lipopolysaccharides // Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides / Eds. D.C. Morrison, J.L.Ryan. Boca Raton: CRC Press, 1992. V.l. P. 135-170.

117. Hoist O., Ulmer A.J., Brade H., Fiad H.D., Rietchel E.T. Biochemistry and cell biology of bacterial endotoxin // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. V.l6. P. 83-104.

118. Hotter G.S., Scott B. Exopolysaccharide mutants of Rhizobium loti are fully effective on a determinate nodulating host but are ineffective on an indeterminate nodulating host // J. Bacteriol. 1991. V.l73, N2. P. 851-859.

119. Hollingsworth R.I., Dazzo F.B., Hallenga K., Musselman B. The complete structure of the trifoliin A lectin-binding capsular polysaccharide of Rhizobium trifolii 843 // Carbohydr. Res. 1988. V. 172, N 1. p. 97-112.

120. Ielpi L., Cuoso R.O., Dankert M.A. Sequential assembly and polymarization of the poly-prenol-linked pentasaccharide repeating unit of the xanthan polysaccharide in Xanthomonas camprestris //J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 2490-2500.

121. Ish-Horovics D., Burke J.F. Rapid and efficient cosmid cloning // Nucl. Acids Res. 1981. V.9. P. 2989-2998.

122. Jones K.M., Kobayashi H., Davies B.W., Taga M.E., Walker G.C. How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium Mediacago model // Microbiology. 2007. V.5. P. 619-633.

123. Kadrmas J.L., Brozek K.A., Raetz C.R.H. Lipopolysaccharide Core Glycosylation in Rhizobium leguminosarum II J. Biol. Chem. 1996. V.271. P. 32119-32125.

124. Karbarz M.J., Kalb S.R., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Expression cloning and biochemical characterization of a Rhizobium leguminosarum lipid A 1-phosphatase // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. N41. P. 39269-39279.

125. Karbarz M.J., Six D.A., Raetz C.R.H. purification and characterization of the lipid Al-phosphatase LpxE of Rhizobium leguminosarum II J. Biol. Chem. 2009. V.284, N2. P. 414425.

126. Kanjilal-Kolar S. Basu S.S., Kanipes M.I., Guan Z., Garrett T.A., Raetz C.R.H. Expression cloning of three Rhizobium leguminosarum lipopolysaccharide core galacturonosyltransferases //J. Biol. Chem. 2006. V.281, N18. P. 12865-12878.

127. Kanjilal-Kolar S., Raetz C.R.H. Dodecaprenyl phosphate-galacturonic acid as a donor substrate for lipopolysaccharide core glycosylation in Rhizobium leguminosarum II J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 12879-12887.

128. Kannenberg E.L., Carlson R.W. Lipid A and O-chain modifications cause Rhizobium lipo-polysaccharides to become hydrophobic during bacteroid development // Mol. Microbiol. 2001. V.39. P. 379-391.

129. Kannenberg E.L., Perotto S., Bianciotto V., Rathbun E.A., Brewin N.J. Lipopolysaccharide epitope expression of Rhizobium bacteroids as revealed by in situ immunolabelling of pea root nodule sections. J Bacteriol. 1994. V. 176, N7 P. 2021-2032.

130. Keating D.H., Willits M.G., Long S.R. A Sinorhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in cell surface sulfation // J. Bacteriol. 2002. V.184. P. 6681-6689.

131. Kijne J.W., Smit G., Diaz C.L., Lugtenberg B.J.J. Lectin-enhanced accumulation of manganese-limited Rhizobium leguminosarum cells on pea root hair tips // J.Bacteriol. 1988. V.l70, N7. P. 2994 -3000.

132. Kim S.A., Copeland L. Enzymes of poly-ß-hydroxybutyrate metabolism in soybean and chickpea bacteroids // Appl. & Environ. Microbiol. 1996. V.62, N11. P. 4186-4190.

133. Kim S.A., Copeland L. Acetyl coenzyme A acetyltransferase of Rhizobium sp. (Cicer) strain CC 1192 // Appl. & Environ. Microbiol. 1997. V.63. N9. P. 3432-3437.

134. Kim C.H., Tully R.E., Keister D.L. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium fredii HH303 which are symbiotically effective // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V.55. P. 1852-1859.

135. Kiss E, Kereszt A, Barta F, Stephens S, Reuhs S, Kondorosi A, Putnoky P. The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strain-specific genes that determine K-antigene structure // Mol. Plant-Microbe Interact. 2001. V.14. P. 1395-1403.

136. Kiss E, Reuhs B, Kim J.S, Kereszt A, Petrovics G, Putnoky P, Dusha I, Carlson R.W, Kondorosi A. The rkpGHI and J genes are involved in capsular polysaccharide production by Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1997. V.179. P. 2132-2140.

137. Kneen B.E, LaRue T.A. Congo Red absorbtion by Rhizobium leguminosarum II Appl. Environ. Microbiol. 1983. V.45. N1. P. 340-342.

138. Korhonen T.K, Tarkka E, Ranta H, Haahtela K. Type 3 fimbriae of Klebsiella sp.: molecu-lar characterization and role in bacterial adhesion to plant roots // J. Bacteriol. 1983. V.155.P. 860-865.

139. Koronakis V, Sharff A, Koronakis E, Luisi B, Hughes C. Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export // Nature. 2000. V. 405. P. 914-919.

140. Kosch K, Batinic T, Niehaus K, Werner D, Muller P. // In I.A. Tichonovich, N.A. Provorov, V.I. Romanov, Newton W.E. (eds.). Nitrogen Fixation: Fundamental and Applica-tions, Kluwer Acad.Publ. Dordrecht, the Netherlands 1995. P. 329.

141. Kowalski M. Prophage substitution in Rhizobium meliloti strains // Microb.Genet.Bull. 1965. V.22, N 1. P.19.

142. Kretovich W.L, Romanov V.I, Shramko V.I, Yushkova L.A, Fedulova N.G. Nitrogen fixation and poly-(3-hydroxybutyric acid content in bacteroids of Rhizobium lupini and Rhizobium leguminosarum II Plant and Soil. 1977. V. 48. P. 291-302.

143. Krol E, Becker E. Global transcriptional analysis of phosphate starvation response in Sinorhizobium meliloti strains 1021 and 2011 // Mol. Genet. Genomics. 2004. V.272. P. 1-17.

144. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during assembly of the head of bacteriophage T4//Nature. 1970. V. 227. P. 680-683.

145. Lagares A, Caetano-Anolles G, Niehaus K, Lorenzen J, Ljunggren H.D, Puhler A, Favelukes G. A Rhizobium meliloti lipoplysaccharide mutant altered in competitoveness for nodulation of alfalfa// J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5941-5952.

146. Lagares A, Hozbor D.F, Niehaus K, Pich Otero A.J, Lorenzen J, Arnold W, Puhler A. Genetic characterization of a Sinorhizobium meliloti chromosomal regiuon inveolved in lipoplysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 1248-1258.

147. Leigh J.A., Coplin D.L. Exopolysaccharides in plant-bacterial interactions // Annu. Rev. Microbiol. 1992. V. 46. P.307-346.

148. Leigh J.A., Lee C.C. Characterization of polysaccharides of Rhizobium meliloti exo mutants that form ineffective nodules // J. Bacteriol. 1988. V.170. N8. P. 3327-3332.

149. Leigh J.A., Reed J.W., Hanks J.F., Hirsch A.M., Walker G.C. Rhizobium meliloti mutants that fail to succinilate their Calcofluor-binding exopolysaccharide are defective in nodule invasion // Cell. 1987. V.51. P. 579-587.

150. Leigh J.A., Signer E.R., Walker G.C. Exopolysaccharide deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1985. V. 82. P. 62316235.

151. Leigh J.A., Walker G.C. Exopolysaccharide of Rhizobium: synthesis, regulation and symbiotic function // Trends Genet. 1994. V.10. P. 63-67.

152. Lellouch A.C., Geremia R.A. Expression and study of recombinant ExoM, a ßl-4 glucosyl-transferase involved in succinoglycan biosynthesis in Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1999. V. 181. N4. P. 1141-1148.

153. Lerouge I., Vanderleyden J., O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal / plant-microbe interaction // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 26. P. 17-47.

154. Letoffe S., Delepelaire P., Wandersman C. Protease secretion by Erwinia chrysanthemi: specific secretion functions are analogous to those of Escherihia coli a-haemolysin // EMBO J. 1990. V. 9. P. 1375-1382.

155. Letoffe S., Ghigo J.-M., Wandersman C. Identification of two components of the Serratia marcescens metalloprotease transporter: protease SM secretion in Escerihia coli is TolC dependent // J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 7321-7328.

156. Levery S.B., Zhan H., Lee C.C., Leigh J.A., Hakomori S. Structural analyses of a second acidic exopolysaccharide of Rhizobium meliloti that can function in alfalfa root nodule ivasion // Carbohydr. Res. 1991. V. 210. P. 339-347.

157. Long S., Reed J.W., Himawan J., and Walker C. Genetic analysis of a cluster of genes required for synthesis of the Calcofluor-binding exopolysaccharide of Rhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1988.V.170, N9. P.4239-4248.

158. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.K., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V.153, N1. P. 265-275.

159. Ludwig A., Jarchau T., Benz R., Goebel W. The repeat domain of Escherihia coli haemolysin (HlyA) is responsible for its Ca2+ -dependent binding to erythrocytes // Mol. Gen. Genet. 1988. V. 214. P. 553-561.

160. Lugtenberg B., van Aphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherihia coli and other Gram-negative bacteria // Biochem. Biophis. Acta. 1983.V. 737. P. 51-115.

161. Marketon M.M., Gronquist M.R., Eberhard A., González J.E. Characterization of the Sinorhizobium meliloti sinR/sinl locus and the production of novel N-acyl homoserin lactones // J. Bacteriol. 2002. V. 184, N 20. P. 5686-5695.

162. Meade H.M., Long S.R., Ruvkun G.B., Brown S.E., and Ausubel F.M. Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis // J.Bacteriol. 1982. V. 149. P. 114-122.

163. Mead D.A., Szczesna Scorupa E., Kemper B. Single-stranded DNA "blue" T7 promoter plas-mids: a versatile tandem promoter system for cloning and protein engineering // Protein Eng. 1986. V. 1. P. 67-74.

164. Mendrygal K.E., Gonzalez J.E. Environmental regulation of exopolysaccaride production in Sinorhizobium meliloti II J.Bacteriol. 2000. V.l82, №3. P.599-606.

165. Morris C.E., Monier J.M. The ecological significance of biofilm formation by plant-associated bacteria // Trends Plant Sci. 2002. V.7. P. 440-447.

166. Moss C.W., Samuels S.B., Liddie J., McKinney R.M. Occurrence of branched chain hydro-xyl fatty acids in Pseudomonas maltophylia // J. Bacteriol. 1973. V. 114, N 3. P.1018-1020.

167. Muszynski A., Laus M., Kijne J.W., Carlson R.W. Structures of the lipopolysaccharides from Rhizobium leguminosarum RBL5523 and its UDP-glucose dehydrogenase mutant (ex o5) 11 Glycobiology. 2011. V. 21, N 1. P. 55-68.

168. Navarini L., Cesaro A., Ross-Murphy S.B. Exopolysaccharides from Rhizobium meliloti YE-2 grown under vdifferent osmolarity conditions: viscoelastic prooerties // Carbohydr. Res. 1992. V. 223. P. 227-234.

169. Niehaus K., Kapp D., Puhler A. Plant defence and delayed infection of alfalfa pseudonodules induced by an exopolysaccaharide (EPS I)-deficient Rhizobium meliloti mutant // Planta. 1993. V. 190. P. 415-425.

170. Noel K.D., Forsberg L.S., Carlson R.W. Varying the abundance of O antigen in Rhizobium etli and its effect on symbiosis with Phaseolus vulgaris II J. Bacteriol. 2000. V.182, N 9. P. 5317-5324.

171. Noel K.D., Vandenbosch K.A., Kulpaca B. Mutations in Rhizobium phaseoli that lead to arrested of development of infection threads // J. Bacteriol. 1986. V. 168, N3. P. 1392-1401.

172. Norrander J., Kempe T., Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligonucleotide-directed mutagenesis // Gene. 1983. V. 26. P. 101-106.

173. Ojrda K.J., Box J.M., Noel K.D. Genetic basis for Rhizobium etli CE3 O-antigen O-methylated residues that vary according to growth conditions // J.Bacteriol. 2010. V. 192. P. 679-690.

174. Paau A.S., Bloch C.B., Brill W.J. Developmental fate of Rhizobium meliloti bacteroids in alfalfa nodules // J. Bacteriol. 1980. V. 143. P. 1480-1490.

175. Parniske M., Kosch K., Werner D., Mliller P. exoB mutants of Bradyrhizobium japonicum with reduced competitiveness on Glycine max // Mol. Plant-Microbe Interact. 1993. V.6. P. 99-106.

176. Parniske M., Schmidt P.E., Kosch K., Miiller P. Plant defense response of host plants with determinate nodules induced by EPS defective exoB mutants of Bradyrhizobium japonicum II Mol. Plant-Microbe Interact. 1994. V. 7. P. 631-638.

177. Parveen N., Webb D.T., Borthakur D. The symbiotic phenotypes of exopolysaccharide-defective mutants of Rhizobium sp. strain TALI 145 do not differ on determinate- and indeterminate-nodulating tree legumes // Microbiology. 1997. V.143. P. 1959-1967.

178. Pellock B.J., Cheng H-P., Walker G.C. Alfalfa root nodule invasion efficiency is dependent on Sinorhizobium meliloti polysaccharides // J. Bacteriol. 2000. V. 182, №15. P. 4310-4318.

179. Pellock B.J., Teplitski M., Boinay R.P., Bauer W.D., Walker G. A LuxR homolog controls production of symbiotically active extracellular polysaccharide II by Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 2002. V. 184, №18. P. 5067-5076.

180. Peoples O.P., Sinskey A.J. Polyhydroxybutyrate biosynthesis in Alcaligenes eutrophus HI6. Identification and characterization of the genes encoding P-ketothiolase and acetoacetyl-CoA reductase // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 15293-15297.

181. Perret X., Staehelin C., Broughton W.J. Molecular basis of symbiotic promiscuity // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64, N1. P. 180-201.

182. Philip-Hollingsworth S., Hollingsworth R.I., Dazzo F.B. Host-range related structural featu-res of related structural features of leguminosarum II J. Biol. Chem. 1989. V. 264, N 3. P. 1461-1466.

183. Povolo S., Casella S. A critical role for aniA in energy-carbon flux and symbiotic nitrogen fixation in Sinorhizobium meliloti II Arch. Microbial. 2000. V. 174. P. 42-49.

184. Povolo S., Tombolini R., Morea A. Isolation and characterization of mutants of Rhizobium meliloti unable to synthesize poly-(3-hydroxybutyrate // Can.J. Microbiol. 1994. V. 40. P. 823-829.

185. Price N.J.P. Carbohydrate determinants of Rhizobium-legume symbioses // Carbohydr. Res. 1999. V. 137. P. 1-9.

186. Price N.J.P., Jeyaretnam B., Carlson R.W., Kadrmas J.L., Raetz C.R.H. Brozek K.A. Lipid A biosynthesis in Rhizobium leguminosarum: role of a 2-keto-3-deoxyoctulosonate-actived 4' phospatase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. P. 7352-7356.

187. Priefer U.B. Genes involved in lipopolysaccharide production and symbiosis are clustered on the chromosome of Rhizobium leguminosarum biovar viciae VF39 // J. Bacteriol. 1989. . 171. P. 6161-6168.

188. Pugsley A.P. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria // Microbial. Rev. 1993. V. 57. P. 50-108.

189. Putnoky P., Grosskopf E., Ha D.T.C., Kiss G.B., Kondorosi A. Rhizobium fix genes mediate at least two communication steps in symbiotic nodule development // J. Cell Biol. 1988. V. 106. P. 597-607.

190. Putnoky P., Petrovics G., Kereszt A., Grosskopf E., Ha D.T.C., Banfalvi Z., Kondorosi A. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in plant-bacterium interaction // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 5450-5458.

191. Que N.L.S., Lin S., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Purification and mass spectrometry of six lipid A species from the bacterial endosymbiont Rhizobium etli II J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 28006-28016.

192. Que-Gewirth N.L.S., Karbarz M.J., Kalb S.R., Cotter R.J., Raetz C.R.H. Origin of the 2-amino-2-deoxy-gluconate unit in Rhizobium leguminosarum II J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 12120-12129.

193. Raetz C.R.H., Reynolds C.M., Trent M.S., Bishop R.E. Lipid A modification systems in gram-negative bacteria // Annu. Rev. Biochem. 2007. V. 76. P. 295-329.

194. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins // Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71. P.635-700.

195. Reed J.W, Capage M, Walker G.C. Rhizobium meliloti exoG and exoJ mutations affect the exoX-exoY system for modulation of exopolysaccharide production. // J. Bacteriol. 1991. V. 173, N12. P. 3776-3788.

196. Reed J.W, Glazebrook J, Walker G.C. The exoR gene of Rhizobium meliloti affects RNA levels of other exo genes but lacks homology to known transcriptional regulator // J. Bacteriol. 1991. V. 173, N12. P. 3789-3794.

197. Reuber T.L, Walker G.C. Biosynthesis of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti II Cell. 1993a. V.74. P. 269-280.

198. Reeves P.R, Hobbs M, Valvano M.A, Skurmik M, Whitfield C, Coplin D, Kido N, Klena J, Maskell D, Raetz C.R, Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature // Trends Microbiol. 1996. V. 4. P. 495-503.

199. Reuber T.L, Walker G.C. Biosynthesis of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti II Cell. 1993a. V. 74. P. 269-280.

200. Reuber T.L, Walker G.C. The acetyl substituent of succinoglycan is not necessary for alfalfa invasion by Rhizobium meliloti Rml021 // J. Bacteriol. 19936. V. 175. P. 3653-3655.

201. Reinhold B.B, Chan S.Y, Reuber T.L, Marra A, Walker G.C, Reinhold V.N. Detailed structural characterization of succinoglycan, the major exopolysaccharide of Rhizobium meliloti Rml021 // J. Bacteriol. 1994. V.176. P. 1997-2002.

202. Reuhs B.L, Kim J.S, Badgett A, Carlson R.W. Production of cell-associated polysaccharides of Rhizobium fredii USDA205 is modulated by apigenin and host root extract // Mol. Plant Microbe Interact. 1994 V.7, N 2. P. 240-247.

203. Reuhs B.L., Williams M.N.V., Kim J.S., Carlson R.W., Cote F. Suppression of the Fix " -phenotype of Rhizobium meliloti exoB mutants by IpsZ is correlated to a modified expression of the K-polysaccharide // J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 4289-4296.

204. Rhijn P., Vanderleyden J. The Rhizobium-Plant symbiosis // Microbiol. Reviews. 1995. V. 59. P. 124-142.

205. Rietschel E.T., Brade H. Bacterial endotoxins // Sci. Am. 1992. - V. 267. - P. 54-61.

206. Ridge R. A model of legume root hair growth and Rhizobium infection // Symbiosis. 1992. V. 14. P.359-373.

207. Ridley B.L., Jeyaretnam B.S., Carlson R.W. The type and yield of lipopolysaccharide from symbiotically deficient Rhizobium lipopolysaccharide mutants vary depending on the extraction method // Glicobiology. 2000. V. 10. P. 1013-1023.

208. Rivilla R., Sutton J.M., Downie J.A. Rhizobium leguminosarum NodT is related to a family of outer-membrane transport proteins that includes TolC, PrtF, CyaE and AprF // Gene. 1995. V. 161. P. 27-31.

209. Robertsen B.K., Aman P., Darvill A.G., McNoril M., Albersheim P. Host-symbiont interactions. The structure of acidic exrtracellular polysaccharides secreted by Rhizobium leguminosarum and Rhizobium trifolii 17 Plant Physiol. 1981. V. 67. P. 389-400.

210. Rolfe B.G., Carlson R.W., Ridge R.W., Dazzo F.B., Mateos P.F. Pankhurst C.E. Defective infection and nodulation of clovers by exopolysaccharide mutants of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii // Aust. J. Plant Physiol. 1996. V. 23. P. 285-303.

211. Rose T., Sebo P., Bellalou J., Ladant D. Interaction of calcium with Bordetella pertusis adenylate cyclase toxin // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 26370-26376.

212. Ruberg S., Piihler A., Becker A. Biosynthesis of exopolysaccharide galactoglucan in Sinorhizobium meliloti is subjected to complex control by the phosphate-dependent regulator PhoB and proteins ExpG and MucR // Microbiology 1999. V. 145. P. 603-611.

213. Russa R., Bruneteau M., Shashkov A.S., Urbanik-Sypniewska T., Mayer H. Characterization of the lipopolysaccharides from Rhizobium meliloti strain 102F51 and its nonnodulating mutant WL113 // Arch. Microbiol. 1996. V. 165. P. 26-33.

214. Scheidle H., Grob A., Niehaus K. The lipid A substructure of the Sinorhizobium meliloti lipopolysaccharides is sufficient to suppress the oxidative burst in host plants // New Phytologist 2005. V. 165. P. 559-566.

215. Scott D.B., Young C.A., Collins-Emerson J.M. et al. Novel and complex chromosomal arrangement of Rhizobium loti nodulation genes // MPMI. 1996. V. 9. N 3. P. 187-197.

216. Selbitschka W., Dresing U., Hagen M. et al. A biological containment system for Rhizobium meliloti and based on the use of recombination-deficiint (recA") strains // FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V. 16. P. 223-232.

217. Sen K., Nikado H. Lipopolysaccharide structure required for in vitro trimerization of Escherichia coli OmpF porin // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 926-928.

218. Sharff A., Fanutti C., Shi J., Calladine C., Luisi B. The role of the TolC family in protein transport and multidrug efflux. From stereochemical certainty to mechanistic hypothesis // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 5011-5026.

219. Simon R., Priefer U., Pühler A. Vector plasmids for in vitro manipulations of gramnegative bacteria. In: Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction. Edited by A. Pühler. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. 1983. P. 98-106.

220. Simon R. High frequency mobilization of gram-negative bacterial replicons by the in vitro constructed Tn5-mob transposon // Mol. Gen. Genet. 1984. V. 196, N 3. P. 413-420.

221. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J. Correlation between extracellular fibrils and attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1986. V.168. P. 821827.

222. Smit G., Kijne J.W., Lugtenberg B.J. Involvement of both cellulose fibrils and Ca2+ -dependent adhesin in the attachment of Rhizobium leguminosarum to pea root hair tips // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 4294-4301.

223. Soto G.E., Hultgren S.J. Bacterial adhesions: common themes and variations in architecture and assembly // J.Bacteriol. 1999. V. 181. P. 1059-1071.

224. Stacey G., So J.-S., Roth L.E., Lakshumi S.K., Carlson R.W. A lipopolysaccharide mutant of Bradyrhizobium japonicum that uncouples plant from bacterial differentiation // MPMI. 1991. V. 4. P. 332-340.

225. Tao H., Brewin N. J., Noel K. D. Rhizobium leguminosarum CFN42 lipopolysaccharide antigenic changes induced by environmental conditions // J. Bacteriol. 1992. V.174. P. 2222- 2229.

226. Tavernier P., Portais J.C., Saucedo J.E.N., Courtois J., Courtois B., Barbotin J.N. Exopolysaccharide and poly-(3-hydroxybutyrate coproduction in two Rhizobium meliloti strains // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63, N1. P. 21-26.

227. Tolmasky M.E., Staneloni R.J., Leloir L.F. Lipid-bound saccharides in Rhizobium meliloti IIL Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 6751-6757.

228. Tombolini R., Povolo S., Buson A., Squartini A., Nuti M. Poly-P-hydroxybutyrate (PHB) biosynthetic genes in Rhizobium meliloti 41 // Microbiol. 1995. V. 141. P. 2553 2559.

229. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 4350-4354.

230. Tsai C.- M., Frasch C.E. A sensitive silver strain for detecting lipopolysacharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. V. 119. P. 115-119.

231. Tsyganov V.E., Morzhina E.V., Stefanov S.Y., Borisov A.Y., Lebsky V.K., Tichonovich I.A. The pea (Visum sativum L.) genes sym33 and sym40 control infection thread formation and root nodule function // Mol. Gen. Genet. 1998. V. 259. P. 491-503.

232. Urbanik-Sypniewska T., Seydel U., Greek M., Weckesser J., Mayer H. Chemical studies on the lipopolysaccharide of Rhizobium meliloti 10406 and its lipid A // Arch. Microbiol.1989. V. 152, N6. P. 527-532.

233. Uttaro A.D., Cangelosi G.A., Geremia R.A., Nester E.W., Ugalde R.A. Biochemical characterization of avirulent exoC mutants of Agrobacterium tumefaciens // J. Bacteriol.1990. V. 172, N3. P. 1640-1646.

234. Valverde C., Hozbor D.F., Lagares A. Rapid preparation of affinity-purified lipopolysaccharide samples for electrophoretic analysis // Bio Techniques. 1997. V. 22, N2. P. 230236.

235. Vedam V., Kanenberg E.L., Haynes J.G., Sherrier D.J., Datta A., Carlson R.W. A Rhizobium leguminosarum AcpXL mutant produces lipopolysaccharide lacking 27-Hydroxyoctacosanoic acid // J. Bacteriol. 2003. V. 185, N6. P. 1841-1850.

236. Vincent J.M. A manual for the practical study of root nodule bacteria. 1970. Oxford: IBP Handbook №15. 164 pp.

237. Wang Y., Hollingsworth R.I. The structure of the O-antigenic chain of the lipopolysaccharide of Rhizobium trifolii 4S // Carbohydr. Res. 1994. V. 260. P. 305-317.

238. Wang L-X., Wang Y., Pellock B., Walker G.C. Structural characterization of the symbiotically important low-molecular weigh succinoglycan of Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1999. V. 181, №21. P. 6788-6796.

239. Wang X., Quinn P.J. Lipopolisaccharide: biosynthetic pathway and structure midification // Progress in Lipid Res. 2010. V. 49. P. 97-107.

240. Wells D.H., Chen E.J., Fisher R.F., Long S.R. ExoR is genetically coupled to the ExoS-Chvl two-component system and located in the periplasm of Sinorhizobium meliloti II Mol. Microbiol. 2007. V.64, №3. P. 647-664.

241. Wells D.H. and Long S.R. The Sinorhizobium meliloti stringent response affects multiple aspects of symbiosis 11 Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 1115-1127.

242. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Methods Carbohydr. Chem. 1965. V.5. P.83-91.

243. Whitfield C. Biosynthesis and assembly of capsular polysaccharides in Escherihia coli II Annu. Rev. Biochem. 2006. V. 75. P. 39-68.

244. Whitfield C., Roberts I.S. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherihia coli II Mol. Mocrobiol. 1999. V. 31. P. 1307-1319.

245. Whitfield C., Valvano M. A. Biosynthesis and expression of cell-surface polysaccharides in gram-negative bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1993. V. 35. P. 135-246.

246. Williams M.N., Hollingsworth R.I., Klein S., Signer E.R. The symbiotic defect of Rhizobium meliloti exopolysaccharide mutants is suppressed by lpsZ*~, a gene involved in lipoplysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 1990a. V. 172. P. 2622-2632.

247. Williams M.N., Hollingsworth R.I., Brzoska P.M., Signer E.R. Rhizobium meliloti loci required for suppression of exopolysaccharide mutations by lipopolysacchride // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 11. P. 6596-6598.

248. Willis L.B, Walker G.C. The phbC (poly-P-hydroxybutyrate synthase) gene of Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti and characterization of phbC mutants // Can. J. Microbiol. 1998. V. 44. P.554-564.

249. Yang C.E., Signer R., Hirsch A.M. Nodules initiated by Rhizobium meliloti exopolysaccharide mutants lack a discrete, persistent nodule meristem // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 141-151.

250. Yao S-Y., Luo L., Har K.J., Becker A., Ruberg S., Yu G.Q., Zhu J.-B., Cheng H.-P. Sinorhizobium meliloti ExoR and ExoS proteins regulate both succinoglycan and flagellum production // J. Bacteriol. 2004. V. 186, № 18. P. 6042-6049.

251. York G.M., Walker G.C. The Rhizobium meliloti exoK gene and prsD/prsE/exsH genes are components of independent degradative pathways which contribute to production of low-molecular-weight succinoglycan // Mol. Microbiol. 1997. V. 25, № 1. P. 117-134.

252. York G.M., Walker G.C. The succinyl and acetyl modifications of succinoglycan influence susceptibility of succinoglycan to cleavage by Rhizobium meliloti glycanases ExoK and ExsH//J. Bacteriol.- 1998,-V. 180.- P. 4184-4191.

253. Zevenhuizen L.P.T.M. // in: V.Cresezi, I.C.M. Dea, S. Paoletti, S.S. Stivalla, I.W. Sutherland (eds.). Biomed. Biotechn. Adv. Industr. Polysacch. 1989. Gordon and Breach. NY, USA. P. 301-311.

254. Zevenhuizan L.P.T., Faleschini P. Effect of the concentration of sodium chloride in the medium on the relative proportions of poly- and oligo-saccharides excreted by Rhizobium meliloti strain YE-2SL // Carbohydr Res. 1991. V. 209. P. 203-209.

255. Zevenhuizen L.P.T.M., van Neerven A.R.W. (l-2)-|3-D-Glucan and acidic oligosaccharides produced by Rhizobium meliloti II Carbohydr. Res. 1983. V. 118. P. 127-134.

256. Zevenhuizen L.P.T.M., Scholten-Koerselman H.J., Posthumus M.A. Lipopolysaccharides of Rhizobium //Arch. Microbiol. 1980. V. 125. P. 1-8.

257. Zhan H., Lee C.C., Leigh J.A. Induction of the second exopolysaccharide (EPSb) in Rhizobium meliloti strain SU47 by low phosphate concentrations // J. Bacteriol. 1991. V.173. P. 7391-7394.

258. Zhan H., Levery S.B., Lee C.C., Leigh J.A. A second exopolysaccharide of Rhizobium meliloti strain SU47 that can function in root nodule invasion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. V. 86. P. 3055-3059.

259. Zimmermann J., Voss H., Schwager C et al. A simplified method protocol for fast plasmid DNA sequencing //Nucleic. Acids Res. 1990. V.18. P. 1067.1. БЛАГОДАРНОСТИ

260. В завершение я хочу выразить глубокую признательность и благодарность всем тем людям, благодаря которым данная работа была выполнена.

261. Я благодарна всем без исключения сотрудникам лаборатории генетики и селекции микроорганизмов ВНИИСХМ за поддержку и доброжелательное отношение.

262. Данная работа была выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования "Геномные технологии и клеточная биология" ГНУ ВНИИСХМ 03 Россельхозакадемии (ГК Министерства образования и науки №16.552.11.7047).1&0

Информация о работе

Затовская, Татьяна Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Получение и анализ Tn5-мутантов Sinorhizobium meliloti с измененными поверхностными полисахаридами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы