Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические основы формирования признаков антоциановой окраски у изогенных и интрогрессивной линий мягкой пшеницы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические основы формирования признаков антоциановой окраски у изогенных и интрогрессивной линий мягкой пшеницы"

На правах рукописи

005013561

ТЕРЕЩЕНКО ОЛЕСЯ ЮРЬЕВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИЗНАКОВ

АНТОЦИАНОВОЙ ОКРАСКИ У ИЗОГЕННЫХ И ИНТРОГРЕССИВНОЙ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (ттпсим АЕБПУиМ Ь.)

03.02.07 - генетика

1 5 МАР 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

005013561

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Хлесткина Елена Константиновна

Официальные оппоненты: Дорогина Ольга Викторовна

доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Кочетов Алексей Владимирович кандидат биологических наук, доцент, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, г. Иркутск

Защита диссертации состоится «1L» 2012 г. на утреннем заседании

диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан « в » Oooajyvrva. 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Мягкая пшеница ( Triticum aestivum L., 2п = 6х = 2, аллогексаплоидный геном BBAADD) является на сегодняшний день основной ельскохозяйственной культурой и одним из наиболее перспективных объектов сследования в области генетики и селекции растений. К числу активно изучаемых енетических систем данного вида относится система генов биосинтеза антоциановых оединений, функционирование которой приводит на уровне фенотипа к крашиваншо различных органов пшеницы (перикарпа зерна - гены Рр, стебля - Pc, олеоптиле - lie, листовых пластинок - Plb, листовых влагалищ - Pis, пыльников -an). Интерес исследователей к системе генов биосинтеза антоцианов обусловлен рко выраженными антиоксидантными свойствами данных соединений, пособствующими устойчивости растений к воздействию широкого спектра иотичсских и абиотических стрессовых факторов (Chalker-Scott, 1999; Gould, 2004).

На сегодняшний день гены, определяющие признаки антоциановой окраски азличных органов пшеницы, картированы (Mcintosh et а!., 2011), однако их клеотидные последовательности остаются до сих пор невыделенными, ракгически неизученной остаётся и функциональная активность данных генов, становлена только роль гена Rc, детерминирующего антоциановую пигментацию олеоптиле, в регуляции транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтеза нтоцианов (Ahmed et al., 2006; Khlestkina et al., 2008, 2010). О регуляторной роли нов Рр, Pc, Plb, Pis и Pan высказывалось лишь предположение, которое в настоящее ремя нуждается в экспериментальном подтверждении. Для решения данной задачи, а акже исследования молекулярно-генетических механизмов формирования нтоциановой окраски различных органов пшеницы были выбраны такие нетические модели, как почти изогенные и интрогрессивные линии пшеницы, зданные в лаборатории хромосомной инженерии злаков ИЦиГ СО РАН.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в становлении особенностей генетической регуляции биосинтеза антоциановых игментов в различных органах мягкой пшеницы. В работе были поставлены едующие задачи:

) микросагеллитное генотинирование изогенных и интрогрессивных линий мягкой пшеницы, отличающихся по признакам антоциановой окраски;

2) сравнительный анализ транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтез антоцианов халконсинтазу (CHS), халконфлаванонизомеразу (CHI), флаванон-3 гидроксилазу (F3H), дигидрофлавонол-4-редуктазу (DFR) и антоцианидинсинтаз (ANS), в различных органах у линий пшеницы, отличающихся по признак антоциановой окраски;

3) выделение и определение полноразмерных нуклеотидных последовательносте пшеницы, кодирующих один из ключевых ферментов биосинтеза антоцианов - CHI

4) установление хромосомной локализации и картирование выделенных генов Chi геноме мягкой пшеницы;

5) сравнительная характеристика структурно-функциональных особенносте выделенных генов Chi пшеницы.

Научная новизна работы. В настоящей работе были получены новые данны раскрывающие особенности генетической регуляции биосинтеза антоцианов различных органах пшеницы. А именно, впервые показано, что функциональны аллели генов Рр, детерминирующих антоциановую окраску перикарпа зерна, могу встречаться не только среди образцов T. aestivum и Т. durum, но и у T. timopheevi Aegilops speltoides и Ae. tauschii. Впервые экспериментальным,путем установлено, чт гены Рр, Pc, Plb и Pis, определяющие антоциановую окраску различных органо T. aestivum, участвуют в регуляции транскрипции структурных генов биосинте антоцианов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans. При этом показано, что механизмы регуляци транскрипции F3h отличаются от таковых у других структурных генов биосинте антоцианов. Впервые определены нуклеотидные последовательности трё гомеологичных копий гена Chi пшеницы, структурно-функциональный анал которых показал, что при некотором отличии с/я-регуляторных элементов все тр копии являются транскрипционно активными и кодируют высокоидентичнь аминокислотные последовательности, незначительные различия в которых i затрагивают сайты, важные для правильной укладки и функциональной активност фермента CHI.

Практическая ценность работы. Получен ряд новых маркеров, которые moi эффективно использоваться для идентификации отдельных хромосом мягко пшеницы. .1

Положения, выиосимые на защиту:

1) У пшеницы регуляция транскрипции гена F3h происходит обособленно от других структурных генов биосинтеза антоцианов.

2) Признак антоциановой окраски перикарпа зерна появился у аллополиплоидных пшениц в результате объединения в одном ядре геномов диплоидных видов

азличных родов (Tritícum и Aegilops), несущих по одному из двух комплементарных генов Рр.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 15 российских и еждународных конференциях, среди которых 45-ая и 46-ая международные научные тудснческие конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2007 и 2008, овосибирск), 5-ый съезд ВОГиС (2009, Москва), международная конференция (Генетика, геномика и биотехнология растений» (2010, Новосибирск), международная онференция «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск), 14-и 15-ая международные конференции Европейского сообщества по анеуплоидам шеницы EWAC (2007, Стамбул, Турция; 2011, Нови Сад, Сербия), 2-ая еждународная школа-конференция молодых учёных «Генетика и селекция растений, снованная на современных генетических знаниях и технологиях» (2011, Москва-венигород) и др.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, из них 2 татьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, 2 статьи в борниках трудов конференций, 1 глава в коллективной монографии и 18 тезисов онференций.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора итературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, ыводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 140 -раницах печатного текста, включая 14 таблиц и 34 рисунка. Список цитированной штературы содержит 261 работу.

Личный вклад автора. Основные результаты работы были получены и фоанализированы автором самостоятельно: в частности, микросателлитный анализ шний, изучение транскрипции струетурных генов биосинтеза антоцианов, лонирование и структурно-функциональный анализ генов Chi пшеницы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для клонирования нуклеотидных последовательностей мягкой пшеницы, установления их хромосомной и внутрихромосомной локализации использовались, соответственно, сорт Chinese Spring, нуллитетрасомные (Sears, 1944, 1946) и делеционные (Endo and Gill, 1996) линии данного сорта (семена/ДНК предоставлен д-ром А. Бёрнером и д-ром М.С. Рёдер, IPK-Gatersleben, Германия). Д. генетического картирования использовали F2 популяцию Т. aestivum Саратовская 29 Т. timopheevii 842 х Скала (Leonova et al., 2004), ДНК которой и данны микросателлитного анализа любезно предоставила к.б.н. Леонова И.Н. (ИЦиГ С РАН, Новосибирск). Хромосомную локализацию и оценку фрагментов хромосом несущих гены, определяющие антоциановую пигментацию различных органов, также оценку содержания антоцианов (рис. 1) и анализ транскрипции геио проводили при использовании набора линий, описанных в таблице 1, любезн предоставленных к.б.н. B.C. Арбузовой, к.б.н. Т.А. Пшеничниковой, к.б.н. Е.Б Будашкиной (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск) и д-ром А. Бёрнером (IPK-Gatersleben Германия).

Таблица 1. Почти изогенные, («прогрессивные и замещённые линии, а также их родительские форм используемые для микросателлитного анализа (*), оценки содержания антоцианов (") и анали транскрипции генов биосинтеза антоцианов (***).

Обозначение лннни

Описание линии (ссылка)

родительская форма 1

Контроль

родительская форма 2

дополнительный контроль

i:S29PplPp2

почти изогснпая линия, BCg (Arbuzova et al, 1998)

Т. aestmtm Саратовская 29 (C29)

Т. aestivum Purple Feed

i:S29PpIPp3p

почти изогепная линия, BCg (Arbuzova et al , 1998)

Т. aestivum C29

Т. aestivum Purple

PC

интрогрессивная линия, BC5 (Tereshchenko et al, 2012)

T. aestivum С29-Г.

timopheevii 821 (Budashkina, 1988)

T. aestivum Родина-

Ae speltoides 102/00' (Лапочкина, _2001)_

сорта C29 и Родина

CS(Hope 7А), CSfHope 7B)

линии мягкой пшеницы с межсортовым замещением хромосомы (Kuspira and Unrau, _1958)_

Т. aestivum Chinese Spring (CS)

T. aestivum Hope

сорта CS и Мироновская 808

Структуры праймеров к генам биосинтеза антоцианов пшеницы были взяты и литературы (Himi et al., 2005), либо сконструированы в данной работе с помощь компьютерной программы OLIGO (Offerman and Rychlik, 2003) на основани нуклеотидных последовательностей генов и EST пшеницы и других видов растени" выявленных в базе данных нуклеотидных последовательностей NCB (www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/) с помощью алгоритма BLAST (Altchul et al., 1990 Для генотипирования почти изогенных (далее по тексту 'изогенных')

4

г

I ^прогрессивных линий использовались праймеры к микросателлитным маркерам 1 GWM (Gatersleben Wheat Microsatellite; Röder et al., 1998; Ganal and Röder, 2007), любезно предоставленные д-ром M.C. Рёдер (IPK-Gatersleben. Германия).

\ Рис. 1. Окраска колеоптиле и перикарпа зерна у С29, i:S29PplPp2PF и i:S29PplPp3p с указанием генов, детерминирующих окраску (а). Количественное содержание антоцианов в колеоптиле данных линий с 3 по 7 день после прорастания зерна (б). ODS3o - оптическая плотность при длине волны 530 нм.

J С помощью специфичных праймеров. разработанных в данной работе к гену Chi-Bl, из геномной ВАС-библиотеки сорта CS д-ром X. Бергес (INRA. Тулуза,

I

Франция) был отобран и любезно предоставлен для работы ВАС-клон, содержащий нуклеогидную последовательность данного гена.

ДНК растений выделяли согласно Plaschke et al. (1995). ДНК ВАС-клона выделяли с использованием набора реагентов «Montage Plasmid Miniprep„TS Kit» (Millipore). Выделение и очистку РНК растений проводили при использовании наборов реагентов «Plant Rneasy Kit» (Qiagen) или «Plant RNA MiniPrep™» (Zymo ' Research) и «RNase-Free DNase Set» (Qiagen). кДНК синтезировали из 1 мкг j суммарной РНК с помощью обратной транскрипции, используя олигонуклеотидную затравку (dT)15 и набор реагентов «Omniscript Reverse Transcription Kit» (Qiagen). Синтезированную кДНК использовали в ОТ-ПЦР для анализа транскрипции | структурных генов биосинтеза антоцианов. в качестве эндогенного контроля использовали ген Ubc. ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, используя протоколы, рекомендуемые разработчиками праймеров, либо протокол «Touchdown» (Somers et al., 2003). Электрофоретический анализ геномной ДНК, ДНК

I

ВАС-клона и ПЦР-продуктов проводили согласно Maniatis et al. (1982). ПЦР-

I

фрагменты выделяли из 1% агарозного геля с помощью набора реагентов «MinElute Gel Extraction Kit» (Qiagen). При содействии ЦКП СО РАН «Межинститутский центр

5

I

секвенирования ДНК» анализировали клонированные фрагменты ДНК с помощью набора для секвенирования «ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit» (Perkin Elmer) и микросателлитные фрагменты с использованием маркера длины «GeneScan™-500LIZ™ Size standard» (Applied Biosystems).

Антоцианы выделяли экстракцией в 1%-м растворе HCl в метаноле согласно Christie et al. (1994), их количество оценивали с помощью спектрофотометра «SmartSpec™Plus» (BioRad) при длине волны 530 нм. Сравнение полученных данных проводилось с использованием критерия Манна-Уитни (Васильева, 2004).

Кластерный анализ выполнялся с помощью программы MEGA 3.1. (Kumar et al., 2004) при использовании метода присоединения соседей (Saitou and Nei, 1987). Построение генетических карт проводилось с помощью компьютерной программы MAPMAKER 2.0 (Lander et al., 1987). Поиск си-регуляторных элементов генов осуществлялся с помощью программы «Signal Scan» в базе данных PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/; Higo et al., 1999). Предсказание третичной структуры белков проводилось с помощью программы SWISS-MODEL (Kiefer et al., 2009). Конструирование 5'-регуляторных областей генов Chi-Al и Chi-Dl осуществлялось при использовании нуклеотидных последовательностей из базы данных CEREALSDB (http://www.cerealsdb.uk.net/copyright.htm). Множественное выравнивание последовательностей проводилось с помощью программы Multalin (Corpet, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности формирования признаков антоциановой окраски у изогенных и иптрогрессивной линий мягкой пшеницы. Для исследования нами были выбраны изогенные (i:S29PplPp2PF и i:S29PplPp3p) и интрогрессивная (PC) линии, полученные в ИЦиГ СО РАН на основе отбора по признаку антоциановой (фиолетовой) окраски перикарпа зерна (табл. 1). На основе оценки антоциановой пигментации различных органов, проведённой у данных линий, а также их родительских форм (табл. 2), видно, что линии отличаются не только по наличию/отсутствию окраски, но и по её интенсивности. При этом количественный анализ содержания антоцианов в колеоптиле показал, что изогенные линии, визуально характеризующиеся как интенсивно окрашенные, содержат в 3-4 раза больше антоцианов по сравнению со слабо окрашенной С29 (рис. 1).

6

Таблица 2. Визуальная оценка пигментации различных органов у изогснных линий ¡:829Рр1Рр2рр и г.829Рр1РрЗр, шггрогрессивной линии РС, а также исходных форм, на основе которых они были получены.

Антоциановая пигментация органов

Сорт/линия колеоптиле стебель листовые плястннки листовые влагалища перикарп зерна

Purple интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная

Purple Feed интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная

i S29PpiPp2''1" интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная

i S29PplPp3p интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная

Саратовская 29 слабая слабая слабая слабая отсутствует

Родина отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует

линия 821 слабая отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует

линия 102/00' интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная отсутствует

PC интенсивная интенсивная интенсивная интенсивная шггснсивная

Для того чтобы выяснить, какие участки генома ответственны за различия между изучаемыми формами по окраске колеоптиле и других органов (рис. 1, табл. 2), было проведено генотипирование ДНК данных форм с использованием микросателлитных маркеров. Сравнение результатов фенотипирования (табл. 2) и генотипирования (рис. 2) изогенных линий позволило локализовать в них гены, унаследованные от сортов-доноров: Rc, Pc, Plb, Pis и PpJ - в хромосоме 7D, а РрЗ - в хромосоме 2А (рис. 2). При этом локализация гена Рр1 в хромосоме 7D пшеницы показана впервые. До настоящей работы ген Рр1 был картирован только в хромосоме 7В (Dobrovolskaya et al., 2006; Khlestkina et al., 2010). Сравнение локализации гена Ppl в хромосоме 7D у линий i:S29PplPp2PF и i:S29PplPp3p и гена Рр1 в хромосоме 7В у тетраплоидной пшеницы (Khlestkina et al., 2010) указывает на то, что данные локусы являются гомеологичными и согласно правилам номенклатуры генов пшеницы должны быть обозначены Pp-Dl и Рр-В1, соответственно.

Интересно, что у аллополиплоидной пшеницы комплементарные гены,

необходимые для формирования фиолетовой окраски зерна, находятся в разных

геномах: РрЗ в геноме А, а Рр-1 в геномах В или D. Этим можно объяснить тот факт,

что данный признак впервые появляется на тетраплоидном уровне организации

генома пшеницы. Причём у тетраплоидной пшеницы происхождение данного

признака оставалось неизвестным, так как у диплоидных видов-доноров геномов

пшеницы фиолетовая окраска зерна не встречается (Zeven, 1991). Однако выявление

гена Рр-1 в геноме D (рис. 2) указывает на возможность присутствия функционально

активных аллелей генов Рр и у диплоидных видов, что подтверждают и результаты

анализа другой генетической модели - шггрогрессивной линии PC (рис. 3). При

объединении в данной линии функционально активных аллелей комплементарных

7

генов Рр-1 от Ае. яре1101с}е8 (ББ, 2п = 2х= 14) и РрЗ от Т. НторИееуЦ (СОА*А1, 2п = 4х = 28) происходит формирование антоциановой окраски перикарпа, отсутствующей у доноров интрогрессий (табл. 2, рис. 3).

a) i.S29PpIPp2x"'F

J^mdÛPS

¿S3

^Мш&ФЯ XgwœiKSS п»

■ XgitufOSSS

P/tJ

■ЛtomOtif ш

X&mQ&fS 24~

■ Skmtll2i2 ~

• Щгях.Ш'М ijjj

■ xgmiïse

□ C29 x&mtm П Peuple Feed

6) i:S29P|>lP]>3p 14

-г- Щкялт 4

- Kg™*to&as

.Jt&mü&i'Ji

»r ¿¿weiifii

-xavmûm

-XgrntOisiS - X&twOi:Stf

ХцыъЯЖ РеФ1

Xsfusdùt'f Äsfcl

ршт

Х&твШ шя

Pj*

до

□ C29

H ttifple

Pf-Dt «e-lU iW>1

Рис. 2. Схематическое изображение интрогрессий от сортов-доноров в изогенные линии i:S29PplPp2PF (а) и i:S29PplPp3p (б), определенных с помощью микросателлитных маркеров. С29 - рекуррентный сорт, Purple Feed и Purple - сорта-доноры На основании анализа фенотипа (табл. 2) и в согласовании с данными из каталога генных символов пшеницы (Mcintosh et al., 2011) отмечены гены Рр, Pc, Rc, Plb, Pis. Слева приведены расстояния между маркерами в сМ по данным Ganal and Röder (2007).

i

Интересно, что ген РрЗ происходит от диплоидного вида рода Triticum, а Рр-1 -, от диплоидных видов рода Aegilops. Можно сделать вывод о важной роли аллополиплоидизации в появлении данного признака у тетраплоидных и гексаплоидных видов пшениц, благодаря которой в одном ядре объединяются функциональные аллели комплементарно действующих генов, унаследованных от-представителей разных родов.

Транскрипция структурных генов биосинтеза антоцианов в различных органах контрастно окрашенных изогенных линий. Для определения роли генов, детерминирующих окраску различных органов мягкой пшеницы, в биосинтезу антоциановых пигментов было проведено сравнительное исследование транскрипции, структурных генов биосинтеза антоцианов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans у контрастно! окрашенных форм пшеницы - у С29 и изогенных линий i:S29PplPp2PF, i:S29PplPp3p,:

Г"

.охарактеризованных выше (табл. 2, рис. 2). IIa рисунке 4 суммированы полученные данные по анализу транскрипции генов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans в различных органах данных линий.

П П № 5)

' ,îfÏÏ5BS

■ хцкмош

■ Xp-.n047ï

■ Xgv.>яд*2£

Ppj

Agitai ОН. JjpmU*

«

-iRc-Sl Ip)b_sl \Pls-Sl

Г ZfrnMif

■XgKKOj 77

-Х^тОЗЛ

C.29 821 PC Хромосома 2A

I 1 - T. aesîivum

1 - T. timopheevii

C29 102.001 PC

Хромосома 7B/7S

- T. aestivwii -Ae. spelioidei

Рис. 3. Схематическое изображение интрогрессии от T. timopheevii (а) и Ae. speltoides (б) в ;1инию PC и в её родительские формы - линии 821 и 102/00'. Отмечены гены Рр, Rc, Pc, Plb, Pis. Слева приведены расстояния между маркерами в сМ по данным Ganal and Röder (2007).

С29 отличается от изогенных линий по экспрессии генов Chs, Chi, F3h, Dfr и fins в колеоптиле, стебле, листовых пластинках, листовых влагалищах и перикарпе

icpiia. Выявленные отличия объясняются присутствием в геноме изогенных линий

[

функционально активных аллелей генов Rc-Dl, Pls-Dl, Plb-Dl, Pc-Dl, Pp-Dl и РрЗ -рис. 1, 2) и свидетельствуют о регуляторной роли этих генов в биосинтезе антоцианов. Причём различия в аллельном состоянии регуляторных генов Rc, Pis, Plb,

Pc и Рр сопряжены как с количественными отличиями в транскрипции структурных

I

1енов (усиление транскрипции Chs, Chi, Dfr и Ans), так и с качественным (F3h в неокрашенных тканях неактивен, в окрашенных активен). Интересно, что у

.азличных видов растений структурные гены по-разному сочетаются в группы в

F

зависимости от коэкспрессии (Dooner, 1983; Cone et al., 1986; Ludwig et al., 1989; JCIein et al., 1989; Goff et al., 1990; Martin and Geräts, 1993). Обособленность F3h от

других структурных генов биосинтеза антоцианов выявлена только у пшеницы и[ является, по всей видимости, специфической особенностью ТгШсит.

колеоптиле корень

3 МЗЯОНЙП-КОА

4-«умарил-

■К31НШ!

?

хат

к Нш Г ' " I Ш , 31 • г > i'

фПШКОШ

|ш вянввикам»

флавай-3,4-диолы (пейкоантоцианйдины)

1ms Щ,1 } ВЯ в 33 Г*П "П ВЕС Ж Н23 :жггг

}-ОВ-анТОЦИаИЙДЙ«Ы

}мт

mt

цгг

Übe

ттт

Рис. 4. ОТ-ПЦР-фрагменты, полученные при использовании праймеров к генам Chs (длин; ПЦР-фрагмента 434 п.н.), Chi (394 u.), F3h-1 (479 п.н.), Dfr (373 п.н.) и Ans (163 п.н.) v кДНК, синтезированной на основе РНК, выделенной из различных органов С29 i:S29PplPp2 и i:S29PplPp3 Übe — эндогенный контроль Слева приведена схем; биосинтеза антоцианов по Wmkel-Slurley, 2001.

Выделение, картирование и анализ генов Chi мягкой пшеницы. Цм

понимания особенностей регуляции транскрипции генов биосинтеза антоциано1| важной является информация о нуклеотидных последовательностях генов, включаз их регуляторные области. Однако у пшеницы до настоящей работы не была выделен^ полноразмерная нуклеотидная последовательность гена Chi. С помощью анализа EST пшеницы, гомологичных нуклеотидной последовательности гена Chi ячмен.; (AF474923), были идентифицированы 3 копии гена Chi пшеницы, локализованные i хромосомах 5А, 5В и 5D (рис. 5). Использование делеционных линий (рис. 6а), ' также генетическое картирование (рис. 66) показало, что выявленные гень локализуются в дистальных районах длинных плеч хромосом 5А, 5В и 5D i гомеологичных позициях и должны быть обозначены Chi-Al, Chi-BI и Chi-Db соответственно.

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов ПЦР. полученных с использованием подобранных в данной работе копий-специфичных праймеров на ДНК СБ и нуллитетрасомных линий М5АТ5В. Ы5ВТ5А, Ы5ЭТ5В. Справа приведена длина амплифицированных фрагментов ПЦР.

Секвенироваиие ВАС-клона из геномной библиотеки С5, несущего ген СЫ-В1, позволило определить полноразмерную нуклеотидную последовательность данного гена. Нуклеотидные последовательности генов СШ-А1 и СЫ-Э1 были определены с помощью секвенирования ПЦР-фрагментов, полученных с использованием копий-специфичных праймеров. Секвенированные последовательности генов СЫ-А1 (892 п.н.), СЫ-В1 (1550 п.н.) и СЫ-В1 (908 п.н.) размещены в базе данных ТЧСВ! под номерами ЛЧ039037, Ж039038 и Ж039039, соответственно.

а)

5А

5В

5D

б)

XvtnW

Chi-Al

I]

Xidoli}6 Xgw,nl 2-16-----

Chi-Bl

-с

Xb(dQ45Q

Chi-Dl

nrawOI/7

X0wmO49/

xowmaseo

84'¿/Скала

Рис. 6. Схема делеционных карт хромосом 5 А, 5В и 5D пшеницы с локализованными на них генами Chi-Al, -Я/, -DI (а) и генетическая карта хромосомы 5В мягкой пшеницы, сконструированная на основе анализа популяции 842/Скала с использованием маркера к Chi-В1 (б).

Анализ выделенных нуклеотидных последовательностей показал, что гены Chi-Al, -В1 и -D1 содержат по три экзона и два интрона. При этом длина белок-кодирующей последовательности гена Chi-Al составляет 690 п.н., генов Chi-Bl и Chi-Dl - 696 п.н. На основании выделенных нуклеотидных последовательностей предсказаны аминокислотные последовательности СН1-А1. -В1 и -D1, составившие 230, 232 и 232 аминокислотных остатка, соответственно (рис. 7). Уровень идентичности между нуклеотидными и белковыми последовательностями гомеологичных копий гена Chi пшеницы составил 96-97%. Сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей генов Chi-Al, -В1 и -DI с белковой последовательностью CHI Medicago sativa L., для которой была определена вторичная и третичная структура (Jez et al., 2000), позволило идентифицировать

аминокислотные остатки, образующие активный центр ферментов CHI пшеницы и являющиеся идентичными у CHI-A1, -В1 и -D1 (рис. 7). Таким образом, данные ферменты, предположительно, являются функциональными.

01а (Jib 02 рза рЗЬ al

К. sativa CHI T.aestlvum CHI-Dl T.aestzvum CHI-B1 T.aestivum CHI-A1

M. sativa Oil T.aestivum CHI-D1 T.aestivum CHI-B1 T.aostivum CHI-A1

«.»ativ« CHI T.aostdvum CHI-D1 T.avstivum CHI-B1 T.aostivum CHI-A1

W-sativa CHI 3*. a<55 tivum CHI-D1 T-aestivum CHI-B1 T.aestzvwn CHI-A1

MAAS1T AI1"VENL£Y PAW TSPVTG MAVSELEVDGWFPPLARPPGS; MÄ.VSELEVDGWFPPLARPPGS: MAVSELEVDGWFPP LARPPGS!

10

20

«.5

(Ш

pUiAWCiKFAEAFKiVWF^PGASV pAAVDKFKEAFGPHSFAPGAS I, AftAVDKFKEAFGPHSFAPGA5IlJ ^aüVDKFKEMGPHSFÄSGiSIlJ^

130 HO 150

цггмл! BTVAFS

К II

Stsxpeküaalb

05. V SQ ISSVPESG gSSVPESGGVi

170 178

03f аб

iXRCLlftli.PÄLLNBGfiFKXGN

LSL|r|raELLKOSfii,SGGEPMEAVSVSV LS LKTRVAE L LKGAS í fAGGE PAAE PVSV SV LSbfrfvAELLKGA AGGS PAVE PVSVSV 200 210 220 230

Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей генов Chi пшеницы и Medicago sativa L. Отмечены аминокислотные остатки, связывающие субстрат (зелёные), образующие водородные связи в активном центре фермента (розовые) и консервативные аминокислотные остатки у разных видов растений (синие). Горизонтальной линией отмечены аминокислоты, образующие структурные мотивы: a-спирали и ß-складки (по Jez et al., 2000). Жёлтым цветом выделены аминокислотные замены, отличающиеся между CHI пшеницы.

Сравнение нуклеотидных последовательностей регуляторных районов генов Chi пшеницы длиной 636 п.н., показало, что уровень идентичности между гомеологичными копиями составляет 69-75%, а число и взаимное расположение обнаруженных си-регуляторных элементов отличается (рис. 8).

Chi-Al

Chi-Bl

Chi-Dl Г

Рис. 8. Схематическое изображение взаимного расположения сй-регуляторных элементов, i специфичных для генов биосинтеза антоцианов, найденных в регуляторных областях генов Chi-Al, -В1 и -Dl. MRE - MYB-recognition element, RRE - R response element, G-box (ACE -ACGT-containing region).

Тем не менее, все три копии являются транскрипционно активными в колеоптиле, как показал экспериментальный анализ (рис. 9), а также в других органах пшеницы, на что указывает наличие идентичных EST в базе данных NCBI (Chi-Al - 2 EST; Chi-Bl - 5 EST; Chi-Dl - 10 EST).

<£û* <¡ú* < ta * < ta

t t S S £ ä «lg « Ъ

& & ä & I S m & §• 1 S »о

£ £ S. S. £ Я P E £ â £ £ £

000200о2у?!й000г«щ000

llSlilSillliilSll

Ubc Chi-A1 Chi-B1 Chi-D1

Рис. 9. Электрофореграмма ОТ-ПЦР-фрагмеитов, полученных при использовании праймеров к генам Chi-Al (длина фрагмента с ДНК/кДНК 321/191 п.н), Chi-Bl (325/188) и Chi-Dl '(318/191) и кДНК-матрицы, полученной на основе РНК, выделенной из неокрашенного ¡колеоптиле CS и окрашенных колеоптиле Мироновской 808, CS(Hope 7А) и CS(Hope 7В). В Качестве контроля специфичности праймеров приведены результаты ПЦР с ДНК CS и нуллитетрасомных линий N5AT5B, N5BT5D и N5DT5B. Ubc - эндогенный контроль.

Интересно, что среди идентифицированных сгя-регуляторных элементов генов Chi пшеницы помимо MRE, RRE и G-боксов (рис. 8), которые согласно Hartmann et al. (2005) являются специфичными для генов биосинтеза антоцианов, были выявлены ¡также предположительные cw-регуляторные элементы, ответственные за гветозависимую экспрессию генов, за экспрессию генов в ответ на биотический и абиотический стресс, а также на гормональные стимулы, присутствие которых может объяснить независимую от биосинтеза антоцианов транскрипцию гена Chi (рис. 4, 9).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Длительное время признаки антоциановой окраски мягкой пшеницы ¡использовались лишь для описания сортов и внутривидовой таксономической г<лассификации. Однако постоянно появляющиеся данные о роли антоциановых соединений в защите растений при стрессе, а также об их положительном влиянии на здоровье человека, стали привлекать внимание исследователей к изучению генетических основ биосинтеза антоциановых соединений. В данной работе было Проведено исследование, направленное на понимание молекулярно-генетических - еханизмов, лежащих в основе формирования признаков антоциановой окраски у тшеницы. Благодаря использованию изогенных и интрогрессивных линий,

13

полученных в ИЦиГ СО РАН, в настоящей работе установлено присутствие функционально активных аллелей генов Рр у диплоидных доноров геномов пшеницы и сделаны выводы о консервативности генов Рр-1 и РрЗ среди видов Triticum и Aegilops, а также о важности аллополиплоидизации в появлении новых признаков у пшеницы. Обнаружены регуляторные особенности формирования признаков антоциановой окраски у пшеницы, в частности, выявлена обособленность регуляции экспрессии гена F3h от других структурных генов биосинтеза аптоцианов.

Проделанная работа позволяет наметить направление дальнейших исследований в области генетики признаков антоциановой окраски пшеницы, именно: выделение и анализ структурно-функциональной организации генов, детерминирующих окраску, регуляторпая роль которых была установлена настоящей работе; сравнительное изучение структурной организации промогоро всех структурных генов биосинтеза антоцианов с целью объяснения обособленност регуляции транскрипции гена F3h.

выводы

1. С помощью генотипирования изогенных и интрогрессивных линий мягко" пшеницы функционально активные аллели генов Рр-1 и РрЗ, детерминирующи антоциановую окраску перикарпа зерна при комплементарном взаимодействи друг с другом, впервые локализованы в хромосомах 7D T. aestivum (Рр-1), 2 T. timopheevii (РрЗ) и 7S А е. speltoides (Рр-1).

2. С помощью сравнительного анализа изогенных линий впервые показано, что гены определяющие антоциановую окраску стебля (Pc), листовых пластинок (Plb) листовых влагалищ (Pis) и перикарпа зерна (Рр), участвуют в регуляцш транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans i соответствующих органах.

3. Различия в аллельном состоянии регуляторных генов Pc, Plb, Pis и Рр сопряжень как с количественными отличиями в транскрипции структурных генов (усилени транскрипции Chs, Chi, Dfr и Ans), так и с качественным (F3h в неокрашеннь: тканях неактивен, в окрашенных активен).

4. Впервые выделены полноразмерные нуклеотидные последовательности генов Chi Al, Chi-Bl и Chi-Dl мягкой пшеницы; данные гены картированы в дистальнь; районах длинных плеч хромосом 5А, 5В и 5D, соответственно.

14

5. Установлено, что при некотором отличии см-регуляторпых элементов все три копии гена Chi пшеницы являются транскрипционно активными и кодируют высокоидентичные аминокислотные последовательности, незначительные различия в которых не затрагивают сайты, важные для правильной укладки и функциональной активности фермента CHI.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Khlestkina E.K, Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Anthocyanin biosynthesis genes location and expression in wheat-rye hybrids // Mol. Genet. Genom. - 2009. - V. 282. - P. 475-485.

2. Адонина И.Г., Орловская O.A., Терещенко О.Ю., Корень Л.В., Хотылева JI В., Шумный В К., Салима Е Л Формирование хозяйственно-ценных признаков у линий гсксаплоидных тритикале с интрогрессиями от дикорастущих видов эгилопсов в зависимости от геномного состава // Генетика. - 2011. - Т. 47. - № 4. - С. 516 - 526.

Главы в монографиях

3. Khlestkina Е.К., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Flavonoid biosynthesis genes in wheat and wheat-alien hybrids: studies into gene regulation in plants with complex genomes // Mothersil C.E., Korogodina V., Seymour C.B. (Eds) Radiobiology and Environmental Security (NATO Science for Peace and Security Series C: Environmental Security): Radiobiology and Environmental Security. Dordrecht, the Netherlands: Springer, 2012. - P. 31-41.

Статьи в сборниках трудов конференций

4. Khlestkina Е.К., Salina Е.А., Tereschenko O.Yu., Leonova I.N., Börner A., Röder M.S. Approach to comparative mapping of structural genes in polyploid wheat and rye // EWAC Newsl. - 2008. - V. 14. - P. 33-34.

5. Tereshchenko O.Yu., Khlestkina E.K., Gordeeva E I., Arbuzova V S., Salina E.A. The genetic basis of anthocyanin biosynthesis in wheat, rye and wheat-rye hybrids under normal and stress conditions // Modem problems of genetics, radiobiology, radioecology and evolution: Abstr. and papers by young scientists of Third International Conference, Dedicated to N.W.Timofeeff-Ressovsky 9-14 October 2010. - Alushta, 2010.-P.171-174.

Тезисы конференций

6. Терещенко О.Ю. Клонирование н сравнительный анализ генов флаванон-3-гидроксилазы пшеницы (Triricum aestivum) и ржи (Seeale cereale) II Студент и научно-технический прогресс: Тез. докл. XLV международной научной студенческой конференции 10-12 апреля 2007 г. -Новосибирск, 2007. - С. 166-167.

7. Терещенко О.Ю., Хлесткина Е.К., Салина Е.А. Клонирование, локализация и сравнительный анализ генов флаванон-З-гидроксилазы пшеницы (Triricum aestivum) и ржи (Seeale cereale) II Проблемы молекулярной и клеточной биологии. Тез. докл. Международной молодежной научно-методической конференции 9-12 мая 2007 г. - Томск, 2007. - С. 165.

8. Терещенко О.Ю. Клонирование, локализация и анализ экспрессии структурных генов F3H, ANS и 3RT биосинтеза антоцианов ржи (Seeale cereale) II Студент и научно-технический прогресс: Тез. докл. XLVI международной научной студенческой конференции 26 - 30 апреля 2008 г. -Новосибирск, 2008. - С. 127-128.

. Khlestkina Е.К., Salina Е.А., Matthies I., Tereshchenko O.Yu., Leonova I., Börner A, Röder M. Comparative molecular-genetic mapping of flavanone 3-hydroxylase in wheat, rye and barley // Genetics -understanding living system: Abstract book of XX international congress of genetics 12-17 July 2008. -Berlin, 2008.-P.178.

Ю.Хлесткина E.K., Терещенко О.Ю., Салина E.A. Экспрессия генов защитной реакции у гибридных форм пшеницы // Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии: второе чтение,

посвященное памяти В.И. Корогодина и В.А. Шевченко 12-13 января 2009 г. - Дубна - Москва, 2009.-С. 103.

11.Терещенко О.Ю., Хлесткина Е.К., Салина Е.А. Гены биосинтеза акгоцианов ржи (Seeale cereale), их локализация и особенности функционирования у ржи и пшенично-ржаных гибридов // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со Дня рождения Ч. Дарвина: Тез. докл. V съезда генетиков и селекционеров 21-28 июня 2009 г. - Москва, 2009. - С. 336.

12.Хлесткина Е.К., Терещенко О.Ю., Салина Е.А. Структурно-функциональная организация генов биосинтеза флавоноидов в сложных геномах // Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со Дня рождения Ч. Дарвина: Тез. докл. V съезда генетиков и селекционеров 21-28 июня 2009 г. - Москва, 2009. - С. 356.

13.Khlestkina Е.К., Tereshchenko O.Y., Pshenichnikova Т А., Arbuzova V S., Röder M.S., Börner A., Salina Е.А. Flavonoid biosynthesis genes in wheat: genome location and function // Abstr. 8th International wheat conference 1 - 4 June 2010. - St.Peterburg, 2010. - P.449.

M.Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Gene expression upon genome complexification: studies on flavonoid biosynthesis genes in wheat and wheat-alien hybrids II Plant genetics, genomics and biotechnology: Proceedings of the international conference 7-10 June 2010. - Novosibirsk, 2010. - P 34.

15.Adonina I.G., Orlovskaya O.A., Tereshchenko O.Yu., Koren L.V., Khotyleva L.V, Salina E.A. Introgression of Aegilops genetic material into the genome of hexaploid triticale and influence of genome structure on formation of economic-valuable traits // Plant genetics, genomics and biotechnology: Proceedings of the international conference 7-10 June 2010. - Novosibirsk, 2010. - P. 48.

16 Tereshchenko O.Yu., Khlestkina E.K., Gordeeva Е.1., Arbuzova VS., Salina E.A. Biosynthesis о flavonoids under salinity stress in Triticum aestivum L. // Plant genetics, genomics and biotechnology: Proceedings of the international conference 7-10 June 2010. - Novosibirsk, 2010. - P. 84.

17.Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Salina E.A Regulatory-target gene relationships in Triticeae allopolyploid and hybride genomes // Abstracts of the seventh international conference on bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology 20 - 27 June 2010. - Novosibirsk, 2010. - P. 131.

18.Khlestkina E.K, Tereshchenko O.Yu., Salina E.A. Flavonoid biosynthesis genes in wheat and wheat-alien hybrids: studies into gene regulation in plants with complex genomes // Modern problems о genetics, radiobiology, radioecology and evolution: Abstr. and papers by young scientists of Third International Conference, Dedicated to N.W.Timofeeff-Ressovsky 9-14 October 2010. - Alushta 2010 -P.17.

19.Адонина И.Г., Орловская O.A., Терещепко О.Ю., Корень Л.В, Хотылева JI.B, Салина Е.А Генотипирование линий тритикале, полученных от скрещивания с геномно-замещенными формами мягкой пшеницы. Формирование хозяйственно-ценных признаков в зависимости от структуры генома // Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий. Сборник тезисо! международной научной конференции 25 - 29 октября 2010. - Минск, 2010. - С. 28.

20 Tereshchenko O.Yu., Khlestkina Е.К., Leonova I.N., Berges H, Tatkov S.I., Salina E.A. Homoeologou chalcone flavanone isomerase genes in allohexaploid wheat II Wheat genetic resources and genomics: Abstracts of the international conference 28 August - 1 September 2011. - Novosibirsk, 2011. - P. 40.

21.Khlestkina E.K., Tereshchenko O.Yu., Arbuzova V S., Börner A., Pershina L.A., Salina E.A. A new range of wheat precise genetic stocks application: insights into gene function // Abstracts of the 15" EWAC Conference 7-11 November 2011. - Novi Sad, Serbia, 2011. - P. 12.

22 Tereshchenko O.Yu., Khlestkina E.K., Gordeeva E.I., Arbuzova V S., Salina E.A. Relationship betwee anthocyanin biosynthesis and abiotic stress in wheat // Abstracts of the 15lh EWAC Conference 7-11 November 2011. - Novi Sad, Serbia, 2011. - P. 26.

23.Терещенко О.Ю., Гордеева Е.И., Арбузова B.C., Хлесткина E.K. Генетические основы и роль стрессоустойчивости признаков антоциановой окраски у изогенных линий мягкой пшениць (Triticum aestivum L.) И Генетика и селекция растений, основанная на современных генетически знаниях и технологиях: Тез. II Международной школы-конференции молодых учёных 5 - 1 декабря 2011. - Москва-Звенигород, 2011. - С. 69.

Подписано к печати 22.02.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 22

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Терещенко, Олеся Юрьевна, Новосибирск

61 12-3/1204

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

на правах рукописи

Терещенко Олеся Юрьевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИЗНАКОВ АНТОЦИАНОВОЙ ОКРАСКИ У ИЗОГЕННЫХ И ИНТРОГРЕССИВНОЙ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ {ТЫТЮиМАЕБПУиМЬ.)

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, Хлесткина Е.К.

Новосибирск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................................................................9

1.1. Антоциановые соединения: структура, биосинтез и биологическая роль............................................................10

1.1.1. Место антоциановых соединений среди других групп флавоноидных соединений..................10

1.1.2. Строение, классификация антоциановых соединений и их модифицированные формы... 11

1.1.3. Биосинтез антоциановых соединений у растений и его генетическая регуляция............................14

1.1.3.1. Общая характеристика биохимического пути биосинтеза антоциановых соединений

у растений..............................................................................................................................................................................................................14

1.1.3.2. Основы генетической регуляции биосинтеза антоциановых соединений у растений.... 20

1.1.4. Биологическая роль антоциановых соединений............................................................................................................30

1.2. Генетические основы биосинтеза антоциановых соединений у пшеницы....................................................34

1.2.1. Структурные гены биосинтеза антоцианов пшеницы..............................................................................................34

1.2.2. Регуляторные гены биосинтеза антоцианов пшеницы..............................................................................................38

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................................................................................46

2.1. Растительный материал............................................................................................................................................................................................46

2.2. Нуклеотидные последовательности и праймеры..................................................................................................................46

2.3. Фенотипический анализ и количественная оценка содержания антоцианов в растительных

тканях......................................................................................................................................................................................................................48

2.4. Подготовка растительного материала для выделения РНК........................................................................................51

2.5. Выделение РНК растений и обратная транскрипция..........................................................................................................52

2.6. Выделение ДНК растений..........................................................................................................................................................................52

2.7. ВАС-клоны: клонирование, отбор и выделение ДНК...................................................................................................53

2.8. Полимеразная цепная реакция..................................................................................................................................................................53

2.9. Электрофорез в агарозном геле............................................................................................................................................................54

2.10. Анализ длины микросателлитных фрагментов с помощью ДНК-секвенатора................................................54

2.11. Анализ первичной структуры ДНК..................................................................................................................................................55

2.12. Молекулярно-генетическое картирование генов и методы статистического анализа..................56

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................................................................................................................................58

3.1. Сравнительная оценка различных образцов мягкой пшеницы по признакам антоциановой

окраски и их генотипирование........................................................................................................................................................58

3.2. Изучение транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов в различных органах

мягкой пшеницы..........................................................................................................................................................................................63

3.3. Клонирование и анализ нуклеотидных последовательностей генов Chi мягкой пшеницы..............................................................................................................................................................................................................67

3.3.1. Идентификация гомеологичных копий гена Chi пшеницы................................................................................67

3.3.2. Выделение полноразмерных нуклеотидных последовательностей генов Chi-Al, Chi-Bl и Chi-Dl пшеницы..........................................................................................................................................................................................71

3.3.3. Сравнение кодирующих нуклеотидных последовательностей генов Chi мягкой пшеницы..............................................................................................................................................................................................................73

3.3.4. Кластерный анализ белковых последовательностей CHI-Al, CHI-B1 и CHI-D1........................79

3.3.5. Компьютерный анализ 5'-регуляторных районов генов Chi-Al, Chi-Bl и Chi-Dl........................79

3.3.6. Анализ экспрессии генов Chi-Al, Chi-Bl и Chi-Dl в колеоптиле пшеницы........................................87

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................................................................................89

4.1. Локализация генов, определяющих антоциановую пигментацию различных органов мягкой

пшеницы................................................................................................................................................................................................................89

4.2. Экспрессия структурных генов биосинтеза антоцианов в различных органах мягкой

пшеницы..............................................................................................................................................................................................................93

4.3. Локализация и структурно-функциональная организация генов Chi мягкой пшеницы......................96

4.3.1. Сравнение геномной локализации генов Chi мягкой пшеницы и других видов

растений................................................................................................................................................................................................................97

4.3.2. Сравнение структурной организации генов Chi мягкой пшеницы и других видов растений................................................................................................................................................................................................................99

4.3.3. Сравнение аминокислотных последовательностей CHI мягкой пшеницы и других видов растений..................................................................................................................................................................................................................Ю2

4.3.4. Анализ с/л'-регуляторных элементов промоторов генов Chi-Al, Chi-Bl и Chi-Dl мягкой пшеницы......................................................................................................................................ЮЗ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................................................................................................................Ю9

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................................................................................................in

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................................................................................................112

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................................................................................................................................................126

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

2-ODD - 2-оксоглутаратзависимая диоксигеназа (2-oxoglutarate-dependent dioxygenase)

3RT - антоцианидин-3-гликозидрамнозилтрансфераза

4CL - 4-кумарат:КоА лигаза

ОТ - обратная транскрипция

ПНР - полимеразная цепная реакция

п.н. - пара нуклеотидов

С29 - сорт мягкой пшеницы Саратовская 29

АСЕ - ACGT-содержащий элемент, си-регуляторный элемент, распознаваемый bZIP транскрипционными

факторами (ACGT-containing element) AT - ацилтрасфераза

Cl - ген кукурузы, контролирующий антоциановую окраску щитка и алейронового слоя (colorless 1)

CHI - халконфлаванонизомераза

CHS - халконсинтаза

CS - сорт мягкой пшеницы Chinese Spring

DFR - дигидрофлавонол-4-редуктаза

DHK - дигидрокемпферол

DHM - дигиромирицетин

DHQ - дигидрокверцетин

F3H - флаванон-3-гидроксилаза

F3'H - флавоноид-З'-гидроксилаза

F3 ' 5 'H - флавоноид-3 ' 5 ' -гидроксилаза

LDOX (ANS) - лейкоантоцианидиндиоксигеназа (антоцианидинсинтаза) Mpcl - Myb-like protein Cl

MRE - MYB-распознаваемый элемент, сй-регуляторный элемент, распознаваемый MYB-подобными

факторами транскрипции (MYB-recognition element) ОМТ - О-метилтрансфераза PAL - фенилаланинаммиаклиаза

Pan - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (пурпурную) окраску пыльников (purple anthers) Pc - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (пурпурную) окраску стебля (purple culm) Pg - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (пурпурную) окраску колосковых чешуй (purple glume) PI - ген кукурузы, контролирующий антоциановую (пурпурную) окраску перикарпа зерна, листовой обертки

початка, колеоптиле, листовых влагалищ, пыльников, стебля, листовых пластинок (purple leaf) Plb - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (пурпурную) окраску листовых пластинок (purple leaf blades)

Pis - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (пурпурную) окраску листовых влагалищ (purple leaf sheaths)

Рр - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (пурпурную) окраску перикарпа зерна пшеницы (purple pericarp)

Ra - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (красную) окраску ушек листового влагалища (red auricles)

Rc - ген пшеницы, контролирующий антоциановую (красную) окраску колеоптиле (red coleoptile)

RRE - R-распознаваемый элемент, m-регуляторный элемент, распознаваемый bHLH транскрипционными

факторами (R-response element) UFGT - уридиндифосфат-флавоноидгликозилтрансфераза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Мягкая пшеница (Triticum aestivum L., 2п = 6х = 42, аллогексаплоидный геном BBAADD) является на сегодняшний день основной сельскохозяйственной культурой и одним из наиболее перспективных объектов исследования в области генетики и селекции растений. К числу активно изучаемых генетических систем данного вида относится система генов биосинтеза анТоциановых соединений, функционирование которой приводит на уровне фенотипа к окрашиванию различных органов пшеницы (перикарпа зерна - гены Рр, стебля - Pc, колеоптиле - Rc, листовых пластинок - Р1Ъ, листовых влагалищ - Pis, пыльников - Pan). Интерес исследователей к системе генов биосинтеза антоцианов обусловлен ярко выраженными антиоксидантными свойствами данных соединений, способствующими устойчивости растений к воздействию широкого спектра биотических и абиотических стрессовых факторов (Chalker-Scott, 1999; Gould, 2004).

На сегодняшний день гены, определяющие признаки антоциановой окраски различных органов пшеницы, картированы (Catalogue of gene symbols for wheat, 2011), однако их нуклеотидные последовательности остаются до сих пор невыделенными. Практически неизученной остаётся и функциональная активность данных генов, установлена только роль гена Rc, детерминирующего антоциановую пигментацию колеоптиле, в регуляции транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтеза антоцианов (Ahmed et al., 2006; Khlestkina et al., 2008b, 2010a). О регуляторной роли генов Рр, Pc, Plb, Pis и Pan высказывалось лишь предположение, которое в настоящее время нуждается в экспериментальном подтверждении. Для решения данной задачи, а также исследования молекулярно-генетических механизмов формирования антоциановой окраски различных органов пшеницы были выбраны такие генетические модели, как почти изогенные и

интрогрессивные линии пшеницы, созданные в лаборатории хромосомной инженерии злаков ИЦиГ СО РАН.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в установлении особенностей генетической регуляции биосинтеза антоциановых пигментов в различных органах мягкой пшеницы. В работе были поставлены следующие задачи:

1)микросателлитное генотипирование изогенных и интрогрессивных линий мягкой пшеницы, отличающихся по признакам антоциановой окраски;

2) сравнительный анализ транскрипции генов, кодирующих ферменты биосинтеза антоцианов халконсинтазу (CHS), халконфлаванонизомеразу (CHI), флаванон-3-гидроксилазу (F3H), дигидрофлавонол-4-редуктазу (DFR) и антоцианидинсинтазу (ANS), в различных органах у линий пшеницы, отличающихся по признакам антоциановой окраски;

3) выделение и определение полноразмерных нуклеотидных последовательностей пшеницы, кодирующих один из ключевых ферментов биосинтеза антоцианов — CHI;

4) установление хромосомной локализации и картирование выделенных генов Chi в геноме мягкой пшеницы;

5) сравнительная характеристика структурно-функциональных особенностей выделенных генов Chi пшеницы.

Научная новизна работы. В настоящей работе были получены новые данные, раскрывающие особенности генетической регуляции биосинтеза антоцианов в различных органах пшеницы. А именно, впервые показано, что функциональные аллели генов Рр, детерминирующих антоциановую окраску перикарпа зерна, могут встречаться не только среди образцов T. aestivum и Т. durum, но и у T. timopheevii, Aegilops speltoides и Ае. tauschii. Впервые экспериментальным путём установлено, что гены Рр, Pc, Plb и Pis, определяющие антоциановую окраску различных органов T. aestivum, участвуют в регуляции транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов Chs, Chi, F3h, Dfr и Ans. При этом показано, что механизмы

регуляции транскрипции F3h отличаются от таковых у других структурных генов биосинтеза антоцианов. Впервые определены нуклеотидные последовательности трёх гомеологичных копий гена Chi пшеницы, структурно-функциональный анализ которых показал, что при некотором отличии сй-регуляторных элементов все три копии являются транскрипционно активными и кодируют высокоидентичные аминокислотные последовательности, незначительные различия в которых не затрагивают сайты, важные для правильной укладки и функциональной активности фермента CHI.

Практическая ценность работы. Получен ряд новых маркеров, которые могут эффективно использоваться для идентификации отдельных хромосом мягкой пшеницы.

Положения, выносимые на защиту:

1) У пшеницы регуляция транскрипции гена^З/г происходит обособленно от других структурных генов биосинтеза антоцианов.

2) Признак антоциановой окраски перикарпа зерна появился у аллополиплоидных пшениц в результате объединения в одном ядре геномов диплоидных видов различных родов (Triticum и Aegilops), несущих по одному из двух комплементарных генов Рр.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 15 различных российских и международных конференциях, среди которых 45-ая и 46-ая международные научные студенческие конференции «Студент и научно-технический прогресс» (2007 и 2008, Новосибирск), международная молодёжная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (2007, Томск), 20-ый международный конгресс по генетике «Генетика - понимание живых систем» (2008, Берлин), 2-ое чтение памяти В.И. Корогодина и В.А. Шевченко «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (2009, Москва, Дубна), 5-ый съезде ВОГиС (2009, Москва), 8-ая международная конференция по пшенице (2010, Санкт-Петербург), международная конференция «Генетика, геномика и

биотехнология растений» (2010, Новосибирск), 7-ая международная конференция по биоинформатике регуляции и структуры генома (2010, Новосибирск), 3-яя международная конференция «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции», посвященная Н.В.Тимофееву-Ресовскому (2010, Алушта), международная конференция «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (2010, Минск), международная конференция «Генетические ресурсы и геномика пшеницы» (2011, Новосибирск), 14-ая и 15-ая международные конференции Европейского сообщества по анеуплоидам пшеницы (EWAC) (2007, Стамбул; 2011, Нови Сад), 2-ая международная школа-конференция молодых учёных «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2011, Москва, Звенигород).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, из них 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, 2 статьи в сборниках трудов конференций, 1 глава в коллективной монографии и 18 тезисов конференций.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 140 страницах печатного текста, включая 14 таблиц и 34 рисунка. Список цитированной литературы содержит 261 работу.

Личный вклад автора. Основные результаты работы были получены и проанализированы автором самостоятельно: в частности, микросателлитный анализ линий, изучение транскрипции структурных генов биосинтеза антоцианов, клонирование и структурно-функциональный анализ генов Chi пшеницы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Изучение генетических основ морфологических признаков окраски у растений, в частности, пшеницы, ведёт свою историю ещё с начала XX века (Wheldale, 1916; Goulden et al., 1928). Однако исследование биохимических и молекулярно-генетических аспектов формирования данных признаков у растений началось сравнительно недавно. У мягкой пшеницы ряд биохимических исследований показал, что пурпурная окраска колеоптиле, листовых пластинок, стебля, пыльников и других органов связана с присутствием ан