Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль устойчивости к грибным болезням у мягкой пшеницы с интрогрессиями от Triticum timopheevii Zhuk

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль устойчивости к грибным болезням у мягкой пшеницы с интрогрессиями от Triticum timopheevii Zhuk"

У 15-3/208 На правах рукописи

ЛЕОНОВА Ирина Николаевна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ У МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ИНТРОГРЕССИЯМИ ОТ тшпсим Т1МОРНЕЕУ11ЪШК.

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2015

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетик растений Федерального государственного бюджетного научного учреждени «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетик Сибирского отделения Российской академии наук», г. Новосибирск

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Салина Елена Артемовна

Митрофанова Ольга Павловна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. отделом генетических ресурсов пшеницы, ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова», г. Санкт-Петербург

Агафонов Александр Викторович,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник лаборатории интродукции редких и исчезающих видов растений, ФГБУН Центральный сибирский ботанический сад Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

Шаманин Владимир Петрович,

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, профессор кафедры агрономии, селекции и семеноводства, ФГБОУ ВПО Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина, г. Омск

ФГУ «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится «с?/» 0X2/7) £5fUL2b\b г. на утрешь заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций Hi соискание ученой степени кандидата наук, ученой степени доктора наук i ИЦиГ СО РАН в конференц-зале по адресу: 630090 г. Новосибирск, проспеш академика Лаврентьева, 10, тел. (383) 363-49-06, факс: (383) 333-12-78, e-mail dissov@bionet.nsc. ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН и на сайт Института http://www.bionet.nsc.ru.

Автореферат разослан «/V » Q-bnjJQSnGU 2015 г.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, \ /

доктор биологических наук чЬ ПЦ Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность h степень разработанности темы исследования. Сохранение и расширение генетического разнообразия мягкой пшеницы является одной из актуальных проблем генетики, биотехнологии и современной селекции. Мягкая пшеница Triticum aestivum L. представляет собой природный аллополиплоид (геномная формула 2n=6x=42, BBAADD) и входит в группу наиболее ценных сельскохозяйственных культур. Значительное снижение урожая и качества зерна этой культуры вызывают листостебельные грибные инфекции, наиболее вредоносными из которых являются болезни ржавчины (бурая и стеблевая) и мучнистая роса. Ежегодные потери урожая в Российской Федерации от этих болезней составляют от 10 до 30%, при этом эти показатели с каждым годом увеличиваются (Пересыпкин, 1979; Санин, Назарова, 2010; Захаренко, 2013).

Одним из наиболее экологически эффективных способов защиты от фитопагогенов является создание сортов с генетической устойчивостью путем интродукции в мягкую пшеницу генов резистентности. Дикие и культурные сородичи мягкой пшеницы и злаки из отдаленных таксономических групп, несмотря на различный уровень гомеологии геномов, регулярно используются в качестве источников новых генов (Friebe et al., 1996; Афанасенко, 2010; Mcintosh et al., 2013). Среди сородичей мягкой пшеницы выделяется вид Triticum timopheevii Zhuk. (геномная формула 2n=4x=28, GGA'A1), который характеризуется комплексной устойчивостью к грибным патогенам (Жуковский, 1985; Дорофеев и др., 19187). Однако доступность уникального пула эффективных генов иммунитета и перенос этих генов в сорта-реципиенты сопровождается значительными трудностями вследствие стерильности и цитологической нестабильности межвидовых гибридов.

До начала данного исследования в геноме Т. timopheevii было выявлено пять генов устойчивости к грибным болезням: один ген, определяющий устойчивость к бурой ржавчине (Lrl8), три гена устойчивости к стеблевой ржавчине (Sr36, Sr37, Sr40) и ген устойчивости к мучнистой росе (Ртб) (Allard, Shands, 1954; Mcintosh, Guarfas, 1971; Jorgensen, Jensen, 1973; Mcintosh, 1983; Dyck, 1992). Однако литературные и собственные данные свидетельствуют, что вид Т. timopheevii обладает гораздо большим потенциалом и содержит другие, ранее не идентифицированные, гены и QTLs (локусы количественных признаков), обеспечивающие устойчивость мягкой

пшеницы к грибным патогенам (Ьеопоуа е1 а1., 2004; Бадаева и др., 2010; иЬпп е! а1., 2012; М1ко е1 а1., 2013).

В данном исследовании для выявления и идентификации генов резистентности в качестве экспериментальных моделей предложены интрогрессивные линии мягкой пшеницы, содержащие генетический материал разных образцов Т. ЧторИее\>И (ВискэЫапа, КаНпша, 2001; Лайкова и др., 2004). Линии представляют собой геномные библиотеки фрагментов чужеродного материала в генетическом окружении коммерческих сортов мягкой пшеницы (Леонова и др., 2002; Ьеопоуа е1 а1., 2007). Интрогрессивные линии были использованы для изучения процессов формообразования и стабилизации гибридного генома в первых поколениях (Калинина и др., 1989; Гордеева и др., 2009). Однако до сих пор открытым оставался ряд вопросов, связанных с идентификацией и локализацией генетических факторов Т. ИторИее\и, определяющих устойчивость к грибным болезням, с установлением аллелизма с известными генами и с выявлением ранее неизвестных генов. Также отсутствовала информация о влиянии фрагментов интрогрессий Т. ¡¡торЬеегн, содержащих гены устойчивости, на хозяйственно-ценные признаки мягкой пшеницы.

Цель исследовании. Основной целью исследования являлся генетический анализ факторов, определяющих устойчивость интрогрессивных линий мягкой пшеницы к грибным болезням, и оценка влияния чужеродного генетического материала на хозяйственно-ценные признаки. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить генетическое разнообразие коллекции интрогрессивных линий Т. аезй\шпЛ. ИторкееуН по микросагеллитным (вБЯ) локусам и устойчивости к грибным болезням в сравнении с исходными сортами мягкой пшеницы.

2. Оценить частоту, хромосомную локализацию и протяженность интрогрессированных фрагментов в геноме линий Т. ае$И\>ит/Т. иторИееуЦ.

3. Провести генетическое картирование генов и (^ТЬв, определяющих иммунитет к бурой ржавчине и мучнистой росе у линий Т. аезНуит/Т. ЫторИегуП и Т. аеБНуит - Т. и"торИееуН/Ае. ГашскИ.

4. Охарактеризовать интрирессивные линии Т. аезНуит/Т. иторИеел>И по хозяйственно-ценным признакам.

5. Определить генетическую локализацию локусов, ассоциированных с хозяйственно-ценными признаками у интрогрессивных линий Т. аезНуит/Т. Пторкееуп.

6. Оценить влияние генетического материала Т. аторИееуЦ на проявление хозяйственно-ценных признаков.

7. С использованием схемы маркер-контролируемого беккроссного отбора создать линии-доноры, содержащие единичные транслокации с главным локусом устойчивости к бурой ржавчине £}Ьг.^-5В, и подобрать БЗИ-маркеры для последующего переноса локуса в геном восприимчивых форм мягкой пшеницы.

Научная новизна работы. В данном исследовании на примере интрогрессивных линий с генетическим материалом Т. ИторИетИ предложена и опробована технология поиска новых локусов устойчивости к грибным болезням, происходящих из генома родичей мягкой пшеницы, и дальнейшего использования этих локусов для получения линий с генетической устойчивостью (рис. 1).

Рисунок 1. Технология создания коммерческих сортов мягкой пшеницы, устойчивых к грибным болезням.

В работе были идентифицированы новые, ранее не известные, гены и QTLs, обеспечивающие устойчивость мягкой пшеницы к бурой ржавчине (LrTtl, LrTt2, QLr.icg-lA и QLr.icg-2B) и мучнистой росе (QPm.icg-6D), установлен их вклад в фенотипическое проявление признаков устойчивости. Информация о генах LrTtl и LrTt2 внесена в Международный Каталог генных символов (Mcintosh et al., 2013).

Впервые проведена сравнительная оценка генетического разнообразия коллекции интрогрессивных линий T. aestivum/T. limopheevii по геномному составу и устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе. Установлено влияние генотипической среды сорта-реципиента на число и хромосомную локализацию интрогрессированных фрагментов T. timopheevii.

Впервые проведено молекулярно-генстическое картирование локусов, проявляющих ассоциацию с морфологическими признаками и признаками, определяющими продуктивность и длину вегетационного периода у линий T. aestivum/T. timopheevii. Установлено, что фрагменты интрогрессии в хромосомах 2А, 5В, 6D, содержащие локусы устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе, не оказывают негативного влияния на признаки продуктивности мягкой пшеницы. Показана эффективность использования SSR-маркеров, фланкирующих главный локус устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-5B, для создания линий-доноров локуса и его переноса в восприимчивые формы мягкой пшеницы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в данной работе результаты могут быть использованы: 1) в исследованиях, направленных на понимание механизмов интрогрессии чужеродного генетического материала; 2) для изучения взаимодействия генов и QTLs, контролирующих хозяйственно-ценные признаки; 3) для генетической диссекции количественных признаков.

На основе полученных результатов создана электронная база данных по 48 интрогрессивным линиям мягкой пшеницы с генетическим материалом Т. timopheevii, которая включает: 1) характеристику линий по устойчивости к грибным болезням; 2) хромосомную локализацию и протяженность фрагментов интрогрессии Т. timopheevii; 3) локализацию QTLs, контролирующих хозяйственно-ценные признаки; 4) SSR-маркеры, выявляющие ассоциацию с хозяйственно-ценными признаками.

Составлена база данных из 502 SSR-маркеров, в которой представлена информация о полиморфизме, аллельном составе SSR-локусов, длинах фрагментов амплификации для геномов А, А1, В, G и D у сортов мягкой пшеницы и T. timopheevii

var. viticulosum. Информация используется для скрининга гибридных форм пшеницы, содержащих чужеродные замещения и транслокации и для паспортизации сортового материала.

Разработана и опробована схема маркер-контролируемого беккроссного отбора для переноса локусов устойчивости к бурой ржавчине в восприимчивые формы мягкой пшеницы. Разработаны способы ускоренного создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине, с использованием молекулярных маркеров (Патенты на изобретение №2219906; №2407283, №2484621; №2535985). Созданы линии-доноры эффективных генов устойчивости к бурой ржавчине, которые используются для получения устойчивых озимых и яровых сортов мягкой пшеницы. Методология и методы исследования. При выполнении данной работы предложена технология поиска генов/QTLs устойчивости к грибным болезням, происходящих от родичей мягкой пшеницы (рис. 1). Для выявления генов/QTLs использован комплекс классических и современных методов анализа генома растений: фитопатологическое тестирование, анализ количественных признаков, методы маркер-ориентированной селекции, пакеты программ для картирования генов и QTLs и статистической обработки результатов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Локусы LrTtl, LrTt2, QLr.icg-lA и QLr.icg-2B, интродуцированные в геном мягкой пшеницы от Т. timopheevii, обеспечивают эффективную устойчивость мягкой пшеницы к популяции бурой ржавчины Puccinia triticina Eriks., типичной для Западно-Сибирского региона России, и не идентичны ни одному из известных ранее.

2. Фрагменты интрогрессий Triticum timopheevii в хромосомах 2А, 5В и 6D, содержащие генетические факторы, контролирующие устойчивость к бурой ржавчине и мучнистой росе, не оказывают негативного влияния на длину вегетационного периода и признаки, определяющие урожайность мягкой пшеницы.

3. Эффективность создания устойчивых к бурой ржавчине форм мягкой пшеницы в схемах маркер-ориентированной селекции зависит от наличия тесно сцепленных диагностических кодоминантных маркеров, выявляющих гомозиготное

состояние главного локуса устойчивости QLr.icgSB в генотипах мягкой пшеницы.

Степень достоверности результатов. Достоверность результатов определяется достаточным числом многолетних наблюдений и публикациями в международных и отечественных журналах. Достоверность локализации генов и QTLs подтверждена данными, полученными для нескольких картирующих популяций, созданных на основе линий с разным числом и хромосомной локализацией фрагментов Т. timopheevii. Новизна генов и QTLs подтверждается совокупностью результатов по хромосомной локализации локусов и данными фитопатологических оценок линий. Апробация работы. Результаты работы были доложены на 4-й конференции по геному растений (Гатерслебен, 1999); 11-й, 12-й конференциях EWAC (Новосибирск, 2000; Норвич, 2002); конференции Московского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2003); Международной конференции «Отдаленная гибридизация: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); III и VI Съездах ВОГИС (Москва, 2004; Ростов-на-Дону, 2014); Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005); Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007); Международной конференции «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007); Всероссийских конференциях «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (Санкт-Петербург, 2008, 2012); II и III Вавиловских международных конференциях (Санкт-Петербург, 2008; 2012); V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009); Международной конференции "Технологии селекции растений (Вена, 2010); 8-й Международной конференции по пшенице (Санкт-Петербург, 2010); Международной конференции «Генетические ресурсы пшеницы и геномика» (Новосибирск, 2011); Международном конгрессе по селекции растений (Анталия, 2013).

Личный вклад автора. Автору принадлежит постановка цели и задач исследования, обработка, интерпретация и обобщение результатов. Молекулярно-генетическая часть выполнена автором самостоятельно. Фитопатологические тесты проведены в сотрудничестве с коллегами из ИЦиГ СО РАН и СибНИИРС (филиала ИЦиГ СО РАН), ФГБУН ВНИИ фитопатологии и зарубежными учеными.

Публикации. Общее число работ по теме диссертации, включая сборники трудов конференций, составляет 51, из них 24 статьи в международных и отечественных журналах (21 статья из списка, рекомендованного Перечнем ВАК РФ) и 4 патента Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 343 страницах печатного текста, включает 47 таблиц и 34 рисунка. Список цитированной литературы содержит 641 работу, из них 82 отечественных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 является литературным обзором, в котором представлены сведения об использовании пшениц группы Titnopheevi для расширения генетического разнообразия мягкой пшеницы по генам устойчивости к грибным болезням. Подробно описана хромосомная локализация известных генов устойчивости, интродуцированных в мягкую пшеницу от Т. timopheevii. Проведен анализ литературы о влиянии чужеродного генетического материала на проявление хозяйственно-ценных признаков. Описаны технологии и схемы маркер-ориентированной селекции (MAS) и их применение для создания новых форм пшеницы с заданными свойствами.

Глава 2. Материалы и методы исследования В работе использован следующий растительный материал: 1. Интрогрессивные линии Triticum aestivum/Triticum timopheevii (BC|F|8.22), полученные от скрещивания сортов мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 (С29), Скала, Иртышанка 10 (Ирт 10), Целинная 20 (Ц20) и Новосибирская 67 (Н67) с Triticum timopheevii var. viticulosum. Стерильные гибриды F| были однократно беккроссированы исходным сортом пшеницы с последующим самоопылением потомства BC]F| и других поколений в условиях изоляции. В поколениях BC1F4-BC1F5 проводился отбор растений по числу хромосом (2п=42) и устойчивости к полевой популяции бурой ржавчины (Puccinia triticina Eriks.) (Budashkina, Kalinina, 2001).

2. Интрогрессивные линии Т. aestivum - Т. timopheevii/Ае. tauschii, полученные от скрещивания сорта Саратовская 29 и синтетического амфидиплоида Т. timopheevii/Ae. tauschii с последующим беккроссированием на исходный сорт (Maystrenko et al., 1996; Лайкова и др., 2003). В поколениях ВС2-ВС5 проводился отбор цитологически стабильных форм (2п=42) и отбор на устойчивость к бурой ржавчине

(Лайкова и др. 2004). В работе использованы линии поколений BC5F5, BC5F6, BC6F], BC6F4, BC8F7h BC9F4.

3. Популяции для картирования генов/QTLs, созданные на основе скрещивания интрогрессивных линий Т. aestivum/T. timopheevii л. 842-1 (370 растений), л. 842-2 (148 растений), л. 832-2 (111 растений) и Т. aestivum - Т. timopheevii/Ae. tauschii ВС5 и ВС, (по 109 растений) с сортом пшеницы Скала. Растения F2 использованы для генотипирования маркерами, семейства F3_4 для фенотипической оценки признаков.

Геномную ДНК выделяли из 5-7-дневных проростков по методу Plaschke с соавт. (1995). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили согласно протоколу Röder с соавт. (1998). Разделение продуктов ПЦР выполняли на автоматических лазерных флуоресцентных секвенаторах ALF и ALFexpress с использованием SequaGel XR для секвенатора ALF и ReproGel™ High Resolution для ALFexpress. В работе использованы SSR-маркеры Xgwm (Ganal, Röder, 2007), Xgdm (Pestsova et al., 2000), Xbarc (Song et al., 2002), Xwmc (Gupta et al., 2002), Xcfd (Guyomarc'h et al., 2002) и маркеры к генам запасных белков Taglgap и Taglut (Devos et al., 1995).

Восприимчивость растений к бурой ржавчине (патоген Puccinia triticina Eriks.) и мучнистой росе (Blumeria graminis f. sp. tritici) на стадии взрослых расгений оценивали в полевых условиях Новосибирской области на инфекционных участках ИЦиГ СО РАН. Для создания инфекционного фона к мучнистой росе делянки располагались между полосами восприимчивых к болезням сортов озимой пшеницы. Для оценки восприимчивости к бурой ржавчине создавали дополнительный фон путем инокуляции суспензией спор рас гриба местной популяции. Устойчивость к мучнистой росе определяли по модифицированной шкале Саари и Прескотта (Захаренко и др., 2000), к бурой ржавчине по шкапе иммунности Майнса и Джексона (1926) и модифицированной шкале Кобба (Peterson et al., 1948).

Оценку восприимчивости интрогрессивных линий к бурой ржавчине на стадии проростков проводили с использованием метода отсеченных листьев (Михайлова, Квитко, 1970). Тестирование картирующих популяций F3, на ювенильной стадии проводили по методу Roelfs с соавт. (1992). Растения в возрасте 1-2-х листьев иноку ли ровали смесью тест-изолятов, содержащих комбинации рас, вирулентных к генам Lrl, 2а, 2Ъ, 2с, 3bg, Зка, 10, 11, 13, 14а, 14Ь, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 23, 26, 27, 28, 30, 31, 32. 33, 35, 37, 38,49, 40, 44, В. Сравнительный анализ восприимчивости линии

842-2 и изогенной линии Тэтчер (RL6009), содержащей ген Lrl8, проводили с помощью тест-изолятов бурой ржавчины 7147661074, 7747660174, 263701675, вирулентных к гену Lrl8. Обозначение изолятов соответствует восьмеричной номенклатуре J. Gilmour (1973).

Для построения генетических карт хромосом и картирования генов использовали программу MAPMAKER/Exp v. 3.0b (Lander et al., 1987). Генетические дистанции рассчитывали в сантиморганах (сМ) с использованием функции Косамби (Kosambi, 1944). Локализацию QTLs проводили с помощью программ MapManager QTX v. Ь20 (Manly et al., 2001) и QTLCartographer v. 2.5-011 (Wang et al., 2012). Уровень статистической достоверности LRS (likelihood ratio statistics) рассчитывали с помощью метода перестановки для 1000 итераций. Вклад QTL в фенотипическое проявление признака (R2) рассчитывался на основании коэффициентов регрессии для каждой комбинации маркер/фенотип. При картировании учитывались QTLs, которые выявлялись по результатам не менее 2-х полевых сезонов и с LRS > 9.2. Для кластерного анализа применяли пакет программ NTSYS-pc 2.11Q (Rohlf, 1998) с использованием алгоритма UPGMA. Величину генетического разнообразия оценивали по индексу Н, рассчитанного по формуле Нэя: H = 1 -£x2iK, где Х| - частота аллеля, к -число аллелей (Nei, 1973).

Сравнение интрогрессивных линий и исходных сортов по хозяйственно-ценным признакам (период всходы-колошение, высота растения, число продуктивных побегов, длина колоса, число колосков и зерен в колосе, масса зерна с колоса и растения и масса 1000 зерен) проводили с помощью дисперсионного анализа, достоверность различий оценивали по критерию Фишера (F). Статистическая обработка выполнялась с помощью пакета программ STATISTICA v. 7.0.

Глава 3. Результаты исследования 3.1. Молекулярио-генетическое разнообразие интрогрессивных линий T. aestivum/T. timopheeviL В работе изучено молекулярно-генетическое разнообразие 36 интрогрессивных линий Т. aestivum/T. timopheevii по SSR-локусам и устойчивости к грибным болезням. Мониторинг устойчивости линий и родительских сортов к популяциям бурой ржавчины и мучнистой росы Западно-Сибирского региона РФ, проводился в поколениях BC|F7.22 с 1997 по 2014 гг. (Леонова и др., 2002, 2014). В зависимости от года тестирования уровень резистентности большинства линий к

бурой ржавчине варьировал от иммунного (балл 0) до среднеустойчивого (балл 2)

Линии, происходящие от разных сортов, по степени устойчивости к бурой ржавчине располагались в следующей последовательности: л. С29 > л. ИртЮ > л. Скала > л. Ц20 > л. Н67. Оценка восприимчивости к мучнистой росе показала, что 13 линий из 36 проявляли высокоустойчивый тип реакции (балл 9-8) во все годы проведения испытаний. У остальных тип реакции варьировал от среднечувсгви-тельного до среднеустойчивого. Для родительских сортов была характерна высокая восприимчивость к грибным патогенам. Полученные результаты

свидетельствуют, что иммунитет, сформировавшийся в первых поколениях отбора линий на устойчивость к бурой ржавчине, стабильно сохраняется в течение длительного времени, при этом ряд линий характеризуются комплексной устойчивостью к грибным болезням. Генетическое разнообразие по SSR-локусам исследовалось с использованием 161 локуса Xgwm и Xgdm, картированных в геноме Т. aestivum и Т. timopheevii (Salina et al., 2006; Ganal, Röder,

(табл. 1).

Таблица 1. Мониторинг устойчивости линий Т. аез1ыит/Т. пторНееуи к бурой ржавчине и мучнистой росе (1997 - 2014 гг.)

Родительский сорт мягкой пшеницы № линии Тип реакции (баллы по шкале иммунности)

Бурая ржавчина Мучнистая роса

Саратовская 29 742, 744 0/1 7-6

760 0/1 5/7-6

768 1/2 5

811, 838 0/1/2 7-6/9-8

821,837 0/1 7-6/9-8

832-2, 842-2 0/1 9-8

Скала 141, 157, 169, 178 1/2 9-8

175 2 5/7-6

184 1/2 5/7-6

Иртышанка 10 10,38 0/1 5/7-6

28, 67, 140 0/1/2 7-6/8-9

73 0/1 9-8

87 1/2 7-6

94 1/2/3 9-8

114 0/1/2 5

Целинная 20 191,208 1/2 9-8

199 1/2 5

206,212 1/2/3 9-8

Новосибирская 67 676 0/1/2/3 7-6

699 1/2/3 5/7-6

728 0/1/2/3 4-3/5

732 0/1/2 9-8

2007). По результатам спектров ПЦР у интрогрессивных линий выявлен 521 аллель (3.24 аллеля на локус, в среднем), что было значительно выше по сравнению с родительскими сортами (440 аллелей, 2.73 аллеля на локус). Индекс генетического разнообразия Н был также, в среднем, выше у интрогрессивных линий (0.47±0.018) по сравнению с родительскими сортами пшеницы (0.42±0.019), при этом геномы О сортов и линий были сравнимы, тогда как индексы Н для геномов А и В были выше у интрогрессивных линий.

Кластерный анализ, выполненный на основе данных генотипирования, установил, что все линии распадаются на 5 групп согласно их происхождению от сорта мягкой пшеницы, при этом наблюдалось низкое генетическое сходство с родительской формой Т. ИторкесуИ уаг. уШси1о.чит (рис. 2).

Рисунок 2. Дендрограмма генетического сходства интрогрессивных линий Т. аеяНтт/Т. ЧторИее\>и и родительских сортов мягкой пшеницы. Сорт мягкой пшеницы, участвующий в гибридизации, указан справа от номера линии.

По результатам генотипирования интрогрессивных линий хромосомы, содержащие генетический материал Т. НторИеып, были условно разделены на две группы. В первую группу вошли хромосомы 1А, 2А, 2В, 5А, 5В и 6В, где интрогрессии выявлялись с высокой частотой у большинства линий (рис. 3). К другой фуппе были отнесены хромосомы 1В, ЗА, ЗВ, 4В и 7А, где интрогрессии встречались с низкой частотой и у ограниченного числа линий. Молекулярным анализом не выявлено изменений в спектрах амплификации маркеров, специфичных для хромосом 4А, 6А и 7В у всех исследованных линий Т. аеяИуит/Т. ИторИееуи.

11

Рисунок 3. Частота встречаемости генетического материала Т. ЧторИееуН в хромосомах 1А, 2А, 2В, 5А, 5В и 6В интро-грессивных линий (Ьеопоуа е1 а1., 2010Ь, 2011).

Анализ хромосомной локализации фрагментов интрогрессии показал, что линии, полученные на основе разных сортов мягкой пшеницы, отличаются как спектром замещений и транслокаций, так и их числом. Так, у всех линий сорта Целинная 20 не выявлено изменений в спектрах ЯЗЯ-маркеров, специфичных для хромосомы 2А, а у линий сорта Новосибирская 67 не обнаружено интрогрессии в хромосоме 5А (рис. 3). Число фрагментов интрогрессии варьировало от трех до девяти, при этом линии располагались в следующей последовательности: л. С29 (5.7 фрагментов, в среднем) > л. Скала (4.5) > л. ИргЮ (4.3) > л. Ц20 (4.1) > л. Н67 (4.0).

Для большинства линий, содержащих интрогрессии в хромосомах генома В характерно наличие протяженных фрагментов, захватывающих оба плеча хромосомы. В то время как в хромосомах генома А присутствуют более короткие фрагменты, не превышающие 'Л длины плеча хромосомы (рис. 4) (Леонова и др., 2002; 'Птопоуа й а1., 2013). Микросателлитным анализом не установлено межсортовых различий по протяженности интрогрессированного генетического материала Т. ИторИегуИ. 3.2. Локализация локусов, определяющих устойчивость к грибным патогенам Картирование локусов Ьг, контролирующих устойчивость к бурой ржавчине Локализация локусов устойчивости к бурой ржавчине проводилась с использованием линий двух коллекций - Т. аеьй\ит1Т. ИторЬееуп и Т. аезИчит-Т. ¡торИееп'И/Ае. ¡ашсИИ, содержащих генетический материал разных образцов Т. МторИееуи. Для создания картирующих популяций из коллекции 7.' аехНуит/Т. НторИевуИ было отобрано три линии (842-1, 842-2 и 832-2), отличающихся числом фрагментов интрогрессии и устойчивостью к бурой ржавчине на разных стадиях развития (табл. 2).

■I'

1A

Х0мгеМ5 XqmtOVXb XgvmUPf

Xgrm1№ ХдутШ1 Xgvm07S2 XgvrntOm Xgrnttm Хдпт07ТЪ T¡jlMll357 Xgim0135

XgmrCS33 Xgym 0497м

XgvmO099 ХфшПЖ Xg*m0750

20 eM J^

5B

Xgwm0443 Xgwm0544 Хдутг054в XgwmOOö? Xgwmoew Xgwm1180 Xgwm0943 Xgwm0335 Xgwm1165 Xgwm0371 XgwmOKH Xgwm0499 Xgwm0639с

Xgwm1043 Xgvmt0777

X<тт<М0в Xgwm0€04 Xqwm1M5a

Xgwm1016 XgvmtOeu XgwmOOeO Xgwntoeos Xgwm12S7 XgvmtOne

I

Г-

is

Рисунок 4. Схематическая иллюстрация локализации фрагментов Т. timopheevii в хромосомах 1А и 5В интрогрессивных линий Т. aestivum/T. timopheevii. Черные блоки указывают протяженность фрагментов интрогрессии, номера линий помещены над блоками. Порядок маркеров соответствует генетическим картам хромосом Т. aestivum и Т. timopheevii (Ganal, Röder, 2007; Salina et al., 2006). Стрелками указано вероятное положение центромеры.

Таблица 2. Характеристика линий 842-1, 842-2 и 832-2 (Т. ае.мЫит/Т. ИторИее\и) по устойчивости к бурой ржавчине и локализации фрагментов интрогрессии

Линии Устойчивость к бурой ржавчине (тип реакции, баллы) Хромосомная локализация

проростки взрослые растения

842-1 2 1/2 1 А, 2А. 5А

842-2 0 0/1 1А, 2А,2В, 5А, 5В, 6В

832-2 0 0/1 1А, 2А, 2В, ЗВ, 4В, 5А, 5В, 6В, 6D

Для генотипирования индивидуальных растений картирующих популяций F2, полученных на основе линий 832-2 и 842-2, использовали 150 полиморфных Xgwm, Xgdm, Xbarc и Литое маркеров, локализованных в хромосомах, содержащих фрагменты интрогрессии. Интервальное картирование выявило три локуса с различным вкладом и достоверностью в фенотипическое проявление признака устойчивости (табл. 3, рис. 5).

Таблица 3. Хромосомная локализация локусов Ьг, определяющих устойчивость интрогрессивных линий 832-2 и 842-2 к бурой ржавчине

Статистика Хромосома/интервалы маркеров

1А 2А 5В

Х&\-т778-Х&ут633 Х%и>т71 Ь-Х%и>тЗ 12 Ххн>т408-Хрл:т1257

Я2 5.0" /10.06 7.0711.06 72.0780.06

ЬЯБ 8.5*/11.6** 18.9/13.6*** 186.0/122.0****

результаты картирования для линий 842-2а и 832-2 получены на основании данных фитопатологических тестов двух полевых сезонов. Я2 - вклад локуса (%) в фенотипическое проявление признака; ЬЯв - статистика отношения правдоподобия; *р<0.05, ***р<0.001,**** р<0.0001.

Главный локус QLr.icg-5B, расположенный в хромосоме 5В между маркерами Xgwm408 и Х^т1257, определял до 80% фенотипического проявления признака. Локус ()Ьг.к^-2А, картированный в хромосоме 2А между маркерами Х%кт7\Ъ и Xgwm312, контролировал не более 11% проявления признака. Третий локус QLr.icg-1А, определяющий до 10% признака устойчивости, выявлен в хромосоме 1АЬ с максимумом проявления вблизи Xgwm633 (Леонова и др., 2008; Ьеопоуа е1 а1., 2011).

1А

2А

5В

35.3 -

12.1 ' 24.0 '

32.0

43.8 -

112

•ХдптЗ 3

■ХдштЮЯУ ■Хд¥/т691

ХднтШ*

I

" ~Хд*/т778 '

-|-Хдшт«33

'ХдктЯЯ 'Хдпт1139

12.6 27.4

8.5

9.3

\У

а ■

24.2 "

31.9 ' 9.9 '

ХдптбЗб — Хду*т930

ХдштШ Хдшт71а • ~ Хд*гт1199

Г Хотят Хя

тИ >12 „

4" ХдчтЯП 3

ц: и

•-ХдтпЗИ О

Хдч/тПШ Хдта11М

,Хджт№* 0.9 -^гХдштШ ХдтпЧО ^ ХднтЗН ^-ХдтЫЮ Хд*пк39<: -^-ХдштШЗ Хф/тТП

2.5 16.1 5.5 -16.8 -

17.4 -

13.1

1.3 1.0 ■ 11.3 ■

-ХдугтМ!

-\-Xgwm1246a

■ХдптШгЬ ■ХдктПт ■ХдктОШ ХдптИЯ

Рисунок 5. Локализация локусов ¿г на генетических картах хромосом 1А, 2А и 5В линии 832-2. Справа от хромосомы указаны ЗБЯ-маркеры, слева - расстояние в сМ. Черный блок показывает протяженность фрагмента интрогрессии, стрелка - наиболее вероятное положение локуса.

Более точная локализация локуса QLr.icg-2A проведена с использованием линии 842-1, содержащей три фрагмента интрогрессии в хромосомах 1А, 2А и 5А. Ген Lr, происходящий из хромосомы 2А', был картирован с помощью программы MAPMAKER между маркерами Xgwm817 и Xgwm3I2 на расстоянии 12.9 и 11.3 сМ, соответственно, и обозначен символом LrTtl. Картирование главного локуса QLr.icg-5В установило, что ген, обозначенный LrTt2, находится между маркерами Xgwm814 и Xgwml257 и происходит из хромосомы 5GL Т. timopheevii. (Leonova et al., 2004,2011).

Ранее в хромосоме 5BL мягкой пшеницы был идентифицирован ген Lrl8, перенесенный от Т. timopheevii ssp. timopheevii (Mcintosh, 1983). Для выяснения вопроса является ли ген LrTt2 новым геном, линия 842-2 и изогенная линия сорта Тэтчер (RL6009) с геном Lrl8 были проверены на восприимчивость к трем изолятам Puccinia triticina, вирулентных к гену Lrl8 (7147661074, 7747660174, 263701675). Результаты показали, что линия 842-2 проявляет более устойчивый тип реакции по сравнению с RL6009 ко всем тест-изолятам (Leonova et al., 2010).

Дополнительная характеристика линий с помощью SSR-маркеров, специфичных для хромосомы 5В, установила, что RL6009 и 842-2 отличаются как точками транслокации, так и длиной фрагментов ПЦР маркеров Xgwm814 и XgwmJ257, фланкирующих ген LrTt2 (табл. 4). Полученные результаты позволили сделать заключение, что ген LrTt2 является новым, более эффективным, чем Lrl8, геном, унаследованным из хромосомы 5GL Т. timopheevii var. viticulosum.

Таблица 4. Длины фрагментов ПЦР 88К-маркеров, специфичных для хромосомы 5 В, у линий 842-2, ЯЬ6009, Т. ИторИееуИ уаг. уШсиЬзит и сортов С29 и Тэтчер

SSR-маркер Размер фрагмента ПЦР (п. н.)

Т. timopheevii var. viticulosum линия 842-2/C29 '1Ш>0097Тэтчер

Xgwm408 178 178/182 180/180

Xgwm604 null null/113 118/118

Xgwml 246 223 223/236 232/232

Xfrwml072 180 180/195 180/195

Xgyvm814 null null/145 126/145

Xf(wml257 263 263/246 260/262

Генетическое картирование локусов Ьг, определяющих устойчивость к бурой ржавчине линий Т. аез№ит - Т. ЫторЬееуЦ/Ае. IашсЬИ, выполнено с использованием поколений ВС5 и ВС«. Предварительное генотипирование потомства разных

беккроссов с помощью 235 полиморфных Xgwm маркеров показало присутствие генетического материала синтетической пшеницы в хромосомах 1D, 2D, 2В и 6В (рис. <>; Leonova et al., 2Q07). Число фрагментов интрогрессии уменьшалось по мере увеличения числа беккроссов (четыре фрагмента у линий ВС5, три - в потомстве ВС6 И по одному фрагменту у потомков ВС8 и ВС9. Сравнение длин фрагментов ПЦР беккроссных линий и родительских образцов свидетельствует, что замещения по хромосомам генома D относятся к фрагментам Ае. tauschii, тогда как В-геномные транслокации представляют собой фрагменты Т. timopheevii.

Рисунок 6, Графическая презентация локализации и длины фрагментов Т. timopheevii (черные блоки) и Ае. tauschii (серые блоки) у беккроссных линий. С -вероятное положение центромеры.

Линия ВС5, использованная для картирования локусов Lr, имела 4 чужеродных фрагмента - два от Ае. tauschii (хромосомы 1D и 2D) и два от Т. timopheevii (2В и 6В), линия ВС9 - единичный фрагмент Т. timopheevii в хромосоме 2В. Интервальное картирование показало, что у линии ВС5 две хромосомы (2В и 2D) содержат генетические факторы, определяющие устойчивость к бурой ржавчине, при этом наиболее высокий вклад (R2=31) вносит локус QLr.icg-2B, происходящий из хромосомы 2G Т. timopheevii (табл. 5). Второй локус, QLr.icg-2D, картированный в хромосоме 2DS, унаследован от Ае. tauschii и определяет до 19% фенотипического проявления признака. Картирование, проведенное с использованием линии ВС9, подтвердило наличие в хромосоме 2BS локуса Lr, унаследованного от Т. timopheevii, вклад которого в фенотипическое проявление признака составляет более 50%.

Распределение вероятности ассоциаций маркер-признак в хромосоме 2BS у ВС5 и ВС? показало почти идентичное их положение, что позволяет сделать предположение о том, что контроль устойчивости к бурой ржавчине у этих линий осуществляется одним и тем же генетическим фактором.

1D

*|мМ ХртНИ

XgwmlXÜ

2D

2В

6В

ВС,

XpawlOf

ВС»

ВС, ВС, ВС, ВС,

Xewmim ХдгяшШ ХушявП

Xgwmim Kgwmtt» XgwmltM

Xfmuilt Xfwmia

Xfwm12ii Xfm&H

ВС, ВС,

Таблица 5. Локусы Ьг, определяющие устойчивость линий ВС5 и ВС9 к бурой

ржавчине на стадии взрослых растений

Статистика линия ВС5 линия ВС9

локус/интервал маркеров

дЬг. к^-2В/ Хрмт257-Х^т 120 £/ Хяц>т1099-Хрл>т484 <2Шсй-2В/ Ххпт257-Хя»т1177

Я5 31 19 57

41.2*** 22.7** 44.7***

Я2- вклад локуса (в %) в фенотипическое проявление признака; ЬЯБ - статистика отношения правдоподобия; **р<0.01, * * * р<0.001.

Картирование локусов устойчивости к мучнистой росе (Рт) у интрогрессивных линий Т. аех/пит/Т. Иторкееуи

Для выявления (ЗТЬв, проявляющих ассоциацию с устойчивостью линий Т. аезНуит/Т. ЧторИеех'и к мучнистой росе, была использована картирующая популяция, созданная на основе линии 832-2. По результатам двух полевых сезонов в районе фрагмента транслокации длинного плеча хромосомы 60 был картирован локус QPm.icg-6D, который вносит основной вклад в устойчивость к мучнистой росе. Локус расположен между 88Я-маркерами Xgwm732a и Xgwm582a, с максимумом проявления

Рисунок 7. Вероятность распределения ассоциаций маркер-признак для

устойчивости к мучнистой росе линии 832-2. Вертикальные линии и цифры над ними обозначают уровни достоверности (ЬЯ5>13.8 р<0.001; и«>25 р<0.0001). Результаты

бутстрэп-анализа представлены в виде гистограммы.

Известно, что для устойчивых к грибным патогенам линий мягкой пшеницы, полученных от скрещивания с пшеницами группы 'ПторЬееУ!, характерна повышенная частота замещений и транслокаций с участием хромосом 6В и 60 (.)агуе

вблизи Х^тИОЗ и определяет до 39% признака (рис. 7).

13 8 гь.к

*Хдмп|4и»в

»ХдчмтШОдЬ

*Хд*«т1?41

"ХдутпЗУЬ

"Хдшт1гб8

"Хдшт1245

*Хд«т?32а

*Хдмш1103а

*Хдшт5В?Ь

0Рт.1сд- 60

й а1., 2000; Бадаева и др., 2010). В данном исследовании регрессионным анализом не было выявлено ассоциаций 88Г1-маркеров, специфичных для хромосомы 6С Т. ЧторЪееуи с устойчивостью к мучнистой росе. Анализ продуктов ПЦР, полученных с использованием маркеров, картированных в хромосомах 6-й гомеологичной группы Т. аезИшт и хромосом 6А* и 66 Г ИторИееуи, позволяет сделать вывод, что локус QPm.icg-6D, расположенный в районе фрагмента транслокации бОв.бОЬ-бА'Ь, перенесен из хромосомы 6А1 Т. ИторИее\п.

3.3. Влияние чужеродного хроматина на проявление хозяйственно-ценных признаков у интрогрессивных линий Т. аея^ит/Т. Нторкееуи

Для молекулярно-генетического картирования (ЗТЬэ, проявляющих ассоциацию с хозяйственно-ценными признаками, интрогрессивные линии и исходные сорта были предварительно охарактеризованы по комплексу признаков. Оценка высоты растения, числа продуктивных побегов, длины колоса, числа колосков и зерен в колосе, массы зерна с колоса и с растения и массы 1000 зерен проводилась течение трех полевых сезонов (2000, 2003 и 2007 гг.), периода всходы-колошение в 2013-2014 гг. Полученные результаты выявили как положительные, так и отрицательные тенденции изменения признаков у интрогрессивных линий по сравнению с исходными сортами.

Тенденция снижения высоты растений отмечена для большинства линий всех комбинаций скрещивания, при этом достоверное снижение высоты (в среднем, на 810 см) показано для групп, происходящих от сортов Иртышанка 10 и Целинная 20. Увеличение числа продуктивных побегов (на 24%, в среднем), числа колосков в колосе (8%) и массы зерна с растения (35%) установлено для комбинации скрещивания сорта Скала.

Из негативных эффектов отмечено снижение продуктивности колоса в группах, происходящих от сортов Целинная 20 и Новосибирская 67. Для линий сорта Целинная 20 показано уменьшение числа колосков и зерен в колосе, в среднем, по комбинации скрещивания, на 10 и 15%, соответственно. Для линий сорта Новосибирская 67 снижение массы зерна с колоса составляло 20%, в среднем. В то же время для этих комбинаций скрещивания не выявлено достоверных отличий от исходных родительских сортов по признаку масса 1000 зерен.

Для большинства интрогрессивных линий Т. аезНуит/Т. ¡шорИееуп было показано, что они отличаются от исходных сортов более длинным периодом всходы-

колошение, при этом для линий, полученных на основе сортов Саратовская 29 и Скала, различия в сроках колошения составляли от 5 до 8 дней (рис. 8).

период всходы-колошение, дни

60

56

52

ю со h» ю да со «ч

О О Ш Г*, в N (О

сч еч х

Рисунок 8. Характеристика интрогрессивных линий Т. aestivum/T. timopheevii и родительских сортов мягкой пшеницы по длине периода всходы-колошение. Звездочкой отмечены линии, достоверно отличающиеся от исходных сортов (**р<0.01, ***р<0.001).

Для картирования QTLs, проявляющих ассоциацию с хозяйственно-ценными признаками, была использована популяция, полученная на основе интрогрессивной линии 832-2, содержащей множественные фрагменты генетического материала Т. timopheevii (табл. 2). Построение молекулярно-генетических карт хромосом линии 832-2 проводили с помощью 502 маркеров Xgwm, Xbarc, Xwmc, Xcfd, Taglgap и Taglut с известной локализацией на консенсусных картах хромосом Т. aestivum и картах Т. timopheevii (Somers et al., 2004; Salina et al., 2006; Ganal, Röder, 2007). Суммарная длина генетических карт 21 хромосомы линии 832-2 составила 3721.9 сМ, карты включают 264 SSR-локуса со средней дистанцией между ними 14.1 сМ.

По результатам изучения хозяйственно-ценных признаков у картирующей популяции F3.4 в течение трех полевых сезонов (2007, 2009, 2012) в геноме линии 8322 было локализовано 63 QTLs, включая локусы устойчивости к бурой ржавчине и мучнистой росе. Наибольшее число локусов выявлено в хромосомах 2-й и 5-й гомеологичных групп (рис. 9), а также в хромосомах 3D, 4В, 6D и 7В.

Результаты свидетельствуют, что ряд локусов, проявляющих ассоциацию с разными признаками, расположены в одних и тех же районах хромосом и интервалах

SSR-маркеров. К таким локусам относятся QTLs для признаков число зерен в колосе, масса зерна с колоса и масса 1000 зерен (2AL, 5BL, 7AL), число продуктивных побегов, масса зерна с колоса и масса 1000 зерен (3DL), масса зерна с колоса и масса зерна с растения (6DL), число продуктивных побегов, масса зерна с растения и масса 1000 зерен (7BS). Совпадение по локализации QTLs отмечается для периода всходы-колошение и высоты растения (2BS, 2DS, 4BL, 5AL, 6AL). Полученные результаты позволяют предположить, что одни и те же генетические факторы могут принимать участие в контроле этих признаков.

2А

7.4

6.2

21.3

12.4 12.8 -13.8 -

8.2 -

24.4 -

4.3 ' 6.6 '

4.7

1.8 ' 13.4

36.2

6-1 19.0 2.0

Xgwm830 Xgwm296b Xgwm726

Xtealut-Ь H-^,

Xawm40rt>i 3

Xgwm614 ¿

i JÉ

IS

Xgwm7ia I ~~~ Xgwmn 9&e\

f XowmBIBa - - XawmB* : - XawmtOSMe > Xawm103t 4 Xawm71b

хо*гтзтаь

Xgwm312

it I1'

Xgwrn1070k Xgwm12S6

у Xgwm846a Xgvvm382&

щ t j it

5B

0.9 — 3 ^

6.2 7.0 2.6 16.1 —

6.6 —

16 8

XgwmtOS4 Xgwm540 XgwmBW Xgwm371 —t.^ Xgwm499 \ Xgwm€39c

- Xgwm1043 I -Xgwm777 \

- Xgwm408

- Xtrwm134em

13.1 1.9 6.8 — 4.9 —

í 5

00

f.

5

a о о

ui о

-Xgwm1072b\ ¿ ■ Xgwm*i4 I г

- LrTt2 I ^

.Xg*rm1267 I *

-Ы

I

8 8

Рисунок 9. Молекулярно-генетические карты хромосом 2А и 5В линии 832-2. Цветом отмечены $8К-локусы, амплифицирующие фрагменты, специфичные для Т. иторкеечп. Черные блоки обозначают интервал распределения ассоциаций маркер-признак, стрелка— наиболее вероятное положение С)Т1,. Обозначение для локусов представлено в таблице 6.

В районах локализации генетического материала Т. ИторИеегИ было картировано 24 ОТЬв, из которых положительный эффект выявлен для 19, включая локусы устойчивости к грибным болезням (табл. 6). По результатам картирования было установлено, что фрагмент интрогрессии в хромосоме 1А, дополнительно к локусу устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-lA, содержит QTL ((УГп.и%-1А), оказывающий отрицательный аддитивный эффект на число продуктивных побегов.

Таблица 6. Список ОТЬэ, ассоциированных с хозяйственно-ценными признаками у интрогрессивной линии 832-2, расположенных в районах локализации фрагментов интрогрессии Т. ¡¡торИееуН

Признак QTL Хромосома Ближайший маркер R2 /LRS Add

Устойчивость к QLr.icg-lA"/m 1A Xgwm633 4.0/13.5** 0.33

бурой ржавчине QLr.icg-2A 0709 2A Xgwm372b 10.0/13.1** 0.37

(¿г) QLr.icg-5B°7m 5B Xgwml257 80.0/122.0**** 1.77

Устойчивость к

мучнистой росе QPm.icg-6Dmn 6D XgwmII03a 39.0/24.0*** 0.93

(Рт)

Период всходы-колошение (Ш) QHd.icg-2Bfm 2B Xgwml067 36.2/63.0**** 1.66

QHd.icg-4B°' 4B Xgwm375 11.4/12.8*** -0.33

QHd.icg-SA'"m 5A Xgwml26 2.5/9.5** 0.41

Число продуктивных побегов (Тп) QTn.icg-lAmmu 1A Xbarc263 5.0/11.7*** -0.40

QTn.icg-2Am} 2A Xtaglut-b 14.5/14.5*** 0.27

QTn.icg-2Ff"2 2B Xgwmimb 10.0/12.0*** 0.23

QTn.icg-5A°"2 5A XgwmI26 17.1/13.4*** 0.27

QHt.icg-2B"m 2B XgwmlI77 7.0/47.1**** -2.6

Высота растения QHt.icg-4B-2ml 4B Xgwml4^n 11.9/14.6*** -3.45

(НО QHUcg-5Am2 5A Xgwml26 5.9/16.5*** -1.05

QHt icg-6D-2u<"2 6D Xgwmll03mu 7.8/15.7*** -1.85

Число колосков в колосе (Брп) QSpn.icg-2lf'm 2B Xgwm 1067 12.0/17.6*** 0.49

QSpn. icg-4B?'?m 4B Xgwm538 11.0/11.0** -0.79

/1С с .070412 5A Xgwml26 13.0/24.1**** -0.74

Число зерен в QCne.icg-2Amn 2A Xgwm7Ib 16.2/14.7*** 2.3

колосе (Спе) QG„e.icg-5B"m 5B Xgwml072b 14.0/23.2*** 3.91

Масса зерна с колоса (0\уе) QGwe. icg-2A 0912 2A XgwmSlSa 3.2/9.7** 0.01

Масса зерна с растения (й\ур) QHUcgSA0709 5A Xgwm982a 64.0/11.7** 1.04

Масса 1000 зерен QTgw.icg-2A0"2 2A Xgwm 1036 30.0/17.6*** 2.15

QTgw.icg-5B-2"'m SB Xgwm !072b 6.7/9.6** 2.55

LRS - статистика отношения правдоподобия; R2 - вклад локуса (в %) в фенотипическое проявление признака, рассчитанный на основании регрессионного анализа ассоциаций маркер - признак; Add - аддитивный эффект; 070912 - полевой сезон; **р<0.01, ***р<0.001, ****р<0.0001.

В хромосоме 2А в районе локализации другого локуса устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-2A были картированы QTLs, оказывающие положительный аддитивный эффект на число зерен в колосе (QGne.icg-2A), массу зерна с колоса

(QGwe.icg-2A) и массу 1000 зерен (QTgw.icg-2A). Фрагмент транслокации в хромосоме 5BL с главным локусом QLr.icg-5B, оказывал положительное влияние на число зерен в колосе и массу 1000 зерен. Фрагмент транслокации в длинном плече хромосомы 6D, кроме локуса QPm.icg-6D, определяющего устойчивость интрогрессивной линии к мучнистой росе, содержит генетический фактор (QHt.icg-6D-2), который вызывает уменьшение высоты растения.

Полученные результаты позволяют заключить, что фрагменты интрогрессии в хромосомах 2А, 5В и 6D, содержащие локусы, контролирующие устойчивость к грибным патогенам, не содержат генетических факторов, отрицательно влияющих на продолжительность вегетационного периода и продуктивность мягкой пшеницы.

Негативное влияние на сроки колошения установлено для локусов, картированных в районе фрагментов транслокации в хромосомах 2BS и SAL, при этом наибольший вклад (36%) в фенотипическое проявление этого признака оказывал локус QHd.icg-2B, расположенный в коротком плече хромосомы 2В. 3.4. Использование интрогрессивных линий в качестве доноров генов иммунитета в схемах маркер-ориентированной селекции

Для получения линий-доноров с единичной транслокацией в хромосоме SBL, содержащей главный локус устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-SB, была использована схема маркер-контролируемого беккроссного отбора (MABS) (рис. 10).

Рисунок 10. Схема МАВБ для получения линий, содержащих единичный фрагмент транслокации в хромосоме 5ВЬ.

С29 х 8Э2-2

\

1М потоков, 78 SSR маркер®, отобран) 4 растет с wvw тра*лока>да 5B/5G

rtneepu на устпптопъ к бурой pnette

В результате реализации такой схемы на основе линии 832-2, содержащей множественные фрагменты Т. ГгторИееуЦ, на стадии ВСзРг была отобрана линия 5366-180 с единичной транслокацией 5BS.5BL-5GL. Проверка линии 5366-180 на

стадиях проростков и взрослых растений показала, что устойчивость к популяции бурой ржавчины Западно-Сибирского региона составляет 0-1 балла по шкале иммунности (Тимонова и др., 2012; Timonova et al., 2013).

Линия 5366-180 была использована в качестве донора для переноса локуса QLr.icg-SB в селекционную линию 183/2-2 (Chinese Spring/T durum), которая отличается восприимчивым типом реакции к бурой ржавчине (балл 4). Потомство популяции F2 (183/2-2 х 5366-180) было генотипировано SSR-маркерами из области локализации локуса QLr.icg-5B. В качестве маркеров использованы SSR-локусы XgwmI016, Xgwm814 и Xgwml257, фланкирующие QLr.icg-5B на молекулярно-генетической карте хромосомы 5BL (рис. 5). Маркеры XgwmlOlö и Xgwm814 являются доминантными и не амплифицируют фрагменты в геноме линии-донора 5366-180, Xgwml257 - кодоминантный маркер, амплифицирующий фрагменты, специфичные как для линии 183/2-2 (244 н.н.), так и для линии-донора 5366-180 и Т. timopheevii var. viticulosum (263 п.н.) (рис. 11).

244 183/2-2

263 5366 -18О

Tt

1

2-4-4 2©3 2

Г

263 11

244 203 17

48

___--- 50

2<»4 51

263 52

«. Z» DZ » ■ ~ »■ * » ~ «■ т. — ... ». »

Рисунок 11. Элекгрофореграмма продукгов ПЦР, полученных в результате амплификации маркера Х£л*т1257 с ДНК родительских образцов 183/2-2, 5366-180, Т. ИторИееуи и растений популяции Р2 (№1, 2, 7, 11, 16. 17, 48. 50, 51, 52). Размер фрагментов амплификации в п.н. указан над пиками.

По данным генотипирования потомства популяции Р2 гибридные растения были условно поделены на 5 групп в зависимости от состояния (гомо- или гетерозиготное) локусов Х^т]016, Xgwm8¡4 и Xgwml257 (табл. 7). Результаты показали, что спектры ПЦР 15 растений из 71 (группа I) соответствовали

юдительской линии 183/2-2, что свидетельствует об отсутствии транслокащ ¡В8.5ВЬ-5СЬ. Для 20 растений (группа II) было установлено гомозиготное состоян] ю трем микросагеллитным локусам, соответствующее генотипу линии-донора 536 80 и Г йтор!гее\-И, двадцать пять растений оказались гетерозиготами по ввЯ-локу С^т1257 (группа V).

Таблица 7. Длины фрагментов ПЦР и восприимчивость к бурой ржавчине растений популяции Р2_з (¡83/2-2 х 5366-180) в полевых условиях

Группа Образец Степень поражения по шкале Кобба (в %) SSR-маркеры/длина фрагмента ПЦР, п.н.

Xgwml016 Xgwm814 Xgwml257

183/2-2 80-100 156 149 244

5366-180 0-5 null null 263

Т. timopheevii 0 null null 263

1 11 80-100 156 149 244

24 80-100 156 149 244

И 14 0 null null 263

16 1-5 null null 263

23 1-5 null null 263

43 0 null null 263

71 1-5 null null 263

III 21 0 156 null 263

44 0 ! 56 null 263

IV 18 1-5 156 149 263

19 1-5 156 149 263

263

22 10 156 149

25 1-5 156 149 263

53 10 156 149 263

V 39 65-80 156 149 244, 263

51 10-65 156 149 244, 263

56 10-65-100 156 149 244, 263

.ветом выделены SSR-локусы, спектры ПЦР которых совпадают со спектрами линии-доно| 366-180 и Т. timopheevii var. viticulosum.

Из оставшихся 11 растений, 8 растений были гомозиготами по локу( '^л-т1257 (группа IV), а три растения гомозиготами по локусам Х^т814

24

Xgwml257 (группа III) со спектрами ПЦР, типичными для линии 5366-180, что позволяет предположить наличие рекомбинантов по фрагменту транслокации.

Проверка восприимчивости к бурой ржавчине проводилась с использованием популяции F] в течение двух полевых сезонов на инфекционных поля ИЦиГ СО РАН и СибНИИРС. Степень поражения родительской линии 183/2-2 составляла 80-100%, тогда как поражение линии 5366-180 не превышало 5% (табл. 7). Растения группы I были сходны с линией 183/2-2 по фрагментам амплификации трех SSR-локусов и не отличались от нее по восприимчивости к бурой ржавчине. У растений групп II и III в гомозиготном состоянии определялись три и два SSR-локуса, соответственно, со спектрами ПЦР, типичными для Т. timopheevii и линии 5366-180. Степень поражения растений, входящих в состав этих групп, находилась в диапазоне 0-5% и была сходна с линией 5366-180. Для растений группы IV, у которых в гомозиготном состоянии выявлялся только маркер Xgwml257, восприимчивость к бурой ржавчине была выше, чем в группах II и III, но не превышала 10%. В группе V потомство, гетерозиготное маркеру Xgwml257, показало высокую восприимчивость (65-80%), при этом у двух семейств F3(51 и 56) наблюдалось расщепление по устойчивости.

Таким образом, сравнение результатов генотипирования с результатами полевых испытаний рекомбинантных линий на восприимчивость к бурой ржавчине свидетельствует, что для отбора генотипов, содержащих локус QLr.icg-SB в гомозиготном состоянии, необходимо не менее двух микросателлитных маркеров (Xgwm814 и Xgwml257), фланкирующих этот локус, при этом один из них должен иметь кодоминантное наследование.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе предложена и опробована технология поиска и изучения локусов устойчивости к грибным патогенам, происходящих от родичей мягкой пшеницы. Использование в качестве экспериментальных моделей интрогрессивных линий, содержащих большой объем генетического материала Т. timopheevii, позволило выявить новые генетические локусы, оггределяющие устойчивость мягкой пшеницы к бурой ржавчине и мучнистой росе и определить диагностические маркеры для контроля процесса интрогрессии этих локусов от линий-доноров в восприимчивые формы пшеницы.

Сравнение результатов картирования локусов Lr у линий, содержащих

генетический материал от разных образцов Т. timopheevii, показывает, что QTLs, определяющие устойчивость к бурой ржавчине, имеют разную хромосомную локализацию и разное происхождение из генома Т. timopheevii: хромосомы 1 А, 2А и 5В у линий Т. aestivum/T. timopheevii и хромосома 2BS у линий, полученных с участием амфидиплоида Т. timopheevii/Ae. tausch». Сопоставление результатов, полученных в данном исследовании, с литературными данными по идентификации генов Lr, в том числе от пшениц группы Timopheevi, позволило сделать заключение, что картированные локусы являются новыми эффективными локусами, обеспечивающими устойчивость мягкой пшеницы к бурой ржавчине.

Картирование QTLs, проявляющих ассоциацию с хозяйственно-ценными признаками, не выявило негативного влияния генетического материала фрагментов интрогрессии, содержащих локусы Lr и Рт, на урожайность и его компоненты. Полученные результаты позволяют предположить, что линии Т. aestivum/T. timopheevii, содержащие набор интрогрессированных фрагментов, не оказывающих негативных эффектов на хозяйственно-ценные признаки, MoiyT быть использованы в качестве источников целевых локусов для повышения устойчивости пшеницы к грибным патогенам без снижения продуктивности сортового материала.

Результаты, полученные в данной работе, были использованы в качестве практического приложения в схеме маркер-контролируемого беккроссного отбора для создания линий-доноров локусов Lr и их переноса в восприимчивые образцы мягкой пшеницы. Применение схемы MABS позволило в ускоренные сроки за три поколения получить формы, содержащие главный локус QLr.icg-SB в гомозиготном состоянии. Использование SSR-маркеров, фланкирующих QLr.icg-5B, в сочетании с фитопатологическими тестами на устойчивость, подтвердил их диагностическую эффективность для контроля процесса переноса локуса в восприимчивые образцы мягкой пшеницы.

ВЫВОДЫ

1. На основе комплексного анализа аллельного полиморфизма микросателлитных локусов и устойчивости к грибным болезням у интрогрессивных линий Т. aestivum/T. timopheevii показано увеличение генетического разнообразия вследствие переноса материала Т. timopheevii в геном мягкой пшеницы с сохранением значительной части геномного состава родительских сортов.

2. Установлено, что генотипическая среда сорта-реципиента мягкой пшеницы оказывает влияние на число и хромосомную локализацию фрагментов интрогрессии Т. ЫторИееуи, при этом не наблюдается различий по протяженности чужеродного генетического материала.

3. Селекция на устойчивость линий Т. аевИуит/Т. НторИе^Н к бурой ржавчине привела к отбору форм с высокой частотой замещений и транслокаций в хромосомах 1А, 2А, 2В, 5 А, 5В и 6В, что позволило предположить наличие в этих хромосомах эффективных генов резистентности к грибным патогенам.

4. Впервые в геноме линий Т. аез^тт/Т. ¡¡торИееуН и Т. аехЧшт-Т. ИторНееуЦ/Ле. 1аизсЫ1, содержащих генетический материал от двух независимых образцов Т. ЧторИееуЦ, картированы новые гены и С?ТЪз, контролирующие устойчивость мягкой пшеницы к бурой ржавчине. Совокупность результатов по хромосомной локализации локусов и фитопагологической оценке линий позволяет заключить, что гены ЬгШ, ¿гГ/2 и локусы QLr.icg-lA и

2В не идентичны ни одному из известных локусов устойчивости к бурой ржавчине, интродуцированных в геном мягкой пшеницы от Т. ¡¡торИееуН.

5. Впервые установлено, что основной генетический контроль устойчивости к бурой ржавчине у линий Т. аея!пит/Т. Чтор/гееуи осуществляется главным и двумя минорными локусами, унаследованными в составе транслоцированных участков хромосом 5(3, 2А1 и 1А' Т. ЧторИе^Н. Наличие трех генных локусов обеспечивает длительную устойчивость линий к бурой ржавчине.

6. Впервые в геноме интрогрессивной линии Т. ае$Чтт/Т. ПторИееуН в районе фрагмента транслокации бОБ.бОЬ-бА'Ь выявлен локус устойчивости к мучнистой росе <2Рт icg-6D, происходящий из хромосомы 6А' Т. иторИееуп.

7. На примере интрогрессивной линии Т. ае$Ишт/Т. ИторИее\И впервые показано отсутствие негативного влияния генетического материала Т. ЧторИееуп в хромосомах 2А, 5В и 60, содержащих локусы устойчивости к грибным болезням, на другие хозяйственно-ценные признаки. Выдвинуто предположение, что удлинение периода всходы-колошение связано с заменой фрагмента хромосомы 2В мягкой пшеницы на фрагмент хромосомы 20 Т. ЫторИе^п.

8. Предложена и экспериментально подтверждена схема маркер-контролируемого беккроссного отбора для ускоренного получения линий-доноров главного локуса

устойчивости к бурой ржавчине QLr.icg-5B. Установлено, что для эффективного отбора устойчивых образцов, необходимо использовать не менее двух диагностических маркеров, фланкирующих локус QLr.icg-5B.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ

1. Салина, Е.А. Микросателлиты пшеницы: перспективы использования для картирования генов и анализа реконструированных геномов / Салина Е.А., Леонова И.Н., Родер М.С.и др. // Физиология растений. - 2001. - Т. 48. - №3. - С. 441 -446.

2: Леонова, И.Н. Молекулярный анализ устойчивых к бурой ржавчине и (прогрессивных линий, полученных при скрещивании гексаплоидной пшеницы Т. aestivum с тетраплоидной пшеницей Т. timopheevii / Леонова И.Н., Родер М.С., Будашкина Е.Б.и др. // Генетика. - 2002. - Т. 38. - №12. - С. 1648-1655.

3. Salina, Е.А. Microsatellite monitoring of recombination around of Vrn-BI locus of wheat during early backcross breeding / Salina E.A., Dobrovolskaya O.B., Leonova I.N., EfremovaT.T.,R6der M.S.//Plant Breed.-2003.-V. 122.-P. 110-116.

4. Leonova, I. Mapping of the VrnBI gene in Triticum aestivum using microsatellite markers / Leonova I., Pestsova E„ Salina E. et al. // Plant Breed. - 2003. - V. 122. - P. 209-212.

5. Leonova, I. Identification of microsatellite markers for a leaf rust resistance gene introgressed into common wheat from Triticum timopheevii / Leonova I., Borner A., Budashkina E. et al. // Plant Breed. - 2004. - V. 123. - P. 93-95.

6. Каминская, Л.Н. Создание линий тритикале, маркированных Vrn-генами, и их молекулярно-генетический анализ / Каминская Л.Н., Корень Л.В., Леонова И.Н. и др. // Информационный вестник ВОГиС. - 2005. - Т. 9. - С. 481^189.

7. Леонова, И.Н. Молекулярный анализ линий тритикале, содержащих различные системы tTW-reHOB, с помощью микросателлитных маркеров и гибридизации in situ / Леонова И.Н., Добровольская О.Б., Каминская Л.Н. и др. // Генетика. - 2005. - Т. 41. -С. 1236-1243.

8. Salina, Е.А. Wheat genome structure: translocations during the course of polyploidization / Salina E.A., Leonova I.N., Efremova T.T., Roder M.S. // Funct. Integr. Genomics. -2006.-V. 6.-P. 71-80.

9. Leonova, I.N. Detection of quantitative trait loci for leaf rust resistance in wheat-T. timopheevii/T. tauschii introgression lines / Leonova I.N., Laikova L.I., Popova O.M. et al. // Euphytica. - 2007. - V. 155. - P. 79-86.

10. Леонова, И.Н. Генетический анализ и локализация локусов, контролирующих устойчивость интрогрессивных линий Triticum aestivum х Triticum timopheevii к листовой ржавчине / Леонова И.Н., Родер М.С., Калинина Н.П,, Будашкина Е.Б. // Генетика.-2008.-Т. 44.-С. 1652-1659.

11. Салина, Е.А. ДНК-маркеры для генотипирования линий мягкой пшеницы (Т. aestivum L.) с генетическим материалом Aegilops speltoides и Triticum timopheevii Zhuk. / Салина EA., Егорова E.M., Адонина И.Г., Добровольская О.Б., Будашкина Е.Б., Леонова И.Н. // Информационный вестник ВОГИС. - 2008. - Т. 12. - С. 620628.

12. Leonova, I.N. The application of wheat microsatellite markers for the detection of interspecific variation in tetraploid Aegilops species with С and U genomes / Leonova I.N., Roder M.S., Nasyrova F. // Cereal Research Communication. - 2009. - V. 37. - P. 335-343.

13. Гордеева, Е.И. Сравнительный цитологический и молекулярный анализ интрогрессивных линий мягкой пшеницы, содержащих генетический материал Triticum timopheevii Zhuk. / Гордеева Е.И., Леонова И.Н., Калинина Н.Г1. и др. // Генетика.-2009.-Т.45.-С. 1616-1626.

14. Leonova, l.N. Microsatellite mapping of a leaf rust resistance gene transferred to common wheat from Triticum timopheevii / Leonova l.N., Budashkina E.B., Flath K. et al. // Cereal Research Communication. - 2010. - V. 38. - P. 212-219.

15. Leonova, I.N. Triticum aestivum-Triticum timopheevii introgression lines as a source of pathogen resistance genes / Leonova I.N., Budashkina E.B., Kalinina N.P. et al. // Czech J. Genet. Plant Breed. - 2011. - V. 47. - S49-S55.

16. Тимонова, E.M. Влияние отдельных участков хромосом Triticum timopheevii на формирование устойчивости к болезням и количественные признаки мягкой пшеницы / Тимонова Е.М., Леонова И.Н., Белан И.А., Россеева Л.П., Салина Е.А. // Вавиловский журнал генетики и селекции.-2012.-Т. 16.-С. 142-159.

17. Timonova, E.M. Marker-assisted development and characterization of a set of Triticum aestivum lines carrying different introgressions from the T. timopheevii genome / Timonova E.M., Leonova I.N., R6der M.S., Salina E.A. // Mol. Breed. - 2013. - V. 31. -P. 123-136.

18. Леонова, И.Н. Молекулярные маркеры: использование в селекции зерновых культур для идентификации, интрогрессии и пирамидирования генов / Леонова И.Н. // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2013. - Т. 17. - С. 314-325.

19. Леонова, И.Н. Сравнительная характеристика гибридных линий Triticum aestivum/Triticum durum и Triticum aestivum/Triticum dicoccum по геномному составу и устойчивости к грибным болезням в различных экологических условиях / Леонова И.Н., Бадаева Е.Д., Орловская О.А. и др. // Генетика. - 2013. - Т. 49. - С. 1276-1283.

20. Леонова, И.Н. Молекулярно-генетическое разнообразие интрогрессивных линий мягкой пшеницы (Т. aestivum/T. timopheevii) / Леонова И.Н., Орловская О.А., Родер М.С. и др. // Вавилов, журнал генетики и селекции. - 2014. - Т. 18. - С. 681-690.

21. Орловская, О.А. Особенности поведения хромосом в мейозе у линий мягкой

пшеницы с интрогрессией генетического материала тетраплоидных видов рода Triticum / Орловская O.A., Леонова И.Н., Салина Е.А., Хотылева JI.B. // Экологическая генетика. - 2015. - Т. 13. - С. 16-25.

Статьи в других изданиях

22. Каминская J1. Реорганизация генома тритикале / Каминская Л., Корень J1., Леонова И. и др. // Наука и инновации. - 2008. - № 12. - С. 26-30.

23. Börner A. Items from Germany / Börner A., Joshi A.K., Khlestkina E.K.., Kobiljski В., Kranner I., Kumar U., Landjeva S., Leonova I.N. et al. // Annual wheat newsletters. - 2010. -V. 56.-P. 47-52.

24. Леонова, И.Н. Использование SSR-маркеров для характеристики гибридных линий мягкой пшеницы с генетическим материалом Т. durum и Т. dicoccum / Леонова И.Н., Салина Е.А., Орловская O.A. и др. // Молекулярная и прикладная генетика. - 2014. - Т. 18.-С. 61-69.

Патенты

25. Способ создания иммунных аналогов мягкой пшеницы сорта Саратовская 29 с комплексной устойчивостью к болезням / Лайкова Л. И., Арбузова B.C., Попова О.М., Ефремова Т.Т., Леонова И.Н., Ермакова М.Ф. // Патент на изобретение №2217905 от 10.12.2003 г.

26. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой листовой ржавчине / Салина Е.А., Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Егорова Е.М. // Патент на изобретение №2407283 от 27.12.2010.

27. Способ создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к бурой ржавчине / Салина Е.А., Леонова И.Н., Петраш Н.В., Адонина И.Г., Щербань А.Б. // Патент на изобретение № 3484621 от 20.06.2013.

28. Способ создания линий яровой мягкой пшеницы с удлиненным сроком колошения и комплексной устойчивостью к грибным болезням / Салина Е.А., Леонова И.Н., Щербань А.Б. // Патент на изобретение №2535985 or 02.08.2013

Статьи в сборниках научны! трудов

29. Leonova, I.N. The transfer of genes for the disease resistance in cultivated plants; germplasm as a method of their preservation and creation of biodiversity / Leonova I.N., Budashkina E.B., Kalinina N.P. // Biodiversity and Dynamics of ecosystem in North Eurasia. Proceed. Intern. Conf. - Novosibirsk, 2000. - Part 3. - P. 25-27.

30. Leonova, I.N. Comparative molecular and genetic analysis of T. limopheevii x T. aestivum hybrid lines resistant to leaf rust / Leonova I.N., Budashkina E.B., Kalinina N.P. et al. // EWAC Newsletters. - 2001. - P. 140-143.

31. Leonova, I.N. Common wheat introgressive lines-source of new genes for breeding and molecular marking of reconstructed forms / Leonova I.N., Budashkina E.B., Kalinina N.P. // Genetic collection of isogenic and alloplasmic lines. Proceed. Intern. Conf. - Novosibirsk, 2001.-P. 143-145.

32. Laikova, L.I. Molecular genetic analysis of immune analogues for wheat cuitivar's Saratovskaya-29 with complex disease resistance / Laikova L.I., Leonova I.N., Röder M.S. et al. // Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology. Proceed. Intern. Symposium. - Moscow, 2001. - P. 79-80.

33. Budashkina, E.B. The transfer and chromosomal identification of Triticum timopheevii genetic material in the genome of introgression lines of common wheat / Budashkina E.B., Kali nina N.P., Leonova I.N. // EWAC Newsletters. - 2002. - P. 101-103.

34. Будашкина, Е.Б. Вторичные генофонды - источник новых генов для селекции / Будашкина Е.Б., Калинина Н.П., Леонова И.Н. // Сб. материалов 2-й конф. Моск. об-ва генетиков и селекционеров им. Вавилова. - Москва, 2003. - С. 32-33.

35. Будашкина, Е.Б. Вторичные генофонды - путь сохранения уникальных генов диких видов и резерв для селекции / Будашкина Е.Б., Калинина Н.П., Леонова И.Н. // Отдаленная гибридизация. Современное состояние и перспективы развития. Труды международной конференции. - Москва, 2003. - С. 45-47.

36. Будашкина, Е.Б. Создание вторичных генофондов - путь сохранения генов устойчивости диких видов и резерв для селекции / Будашкина Е.Б., Калинина Н.П., Леонова И.Н. // Селекция сельскохозяйственных культур на иммунитет. Сборник трудов научно-методической конференции. - Новосибирск, 2004. - С. 55-61.

37. Будашкина, Е.Б. Вторичные генофонды - путь вовлечения генов диких видов в селекцию при создании устойчивых сортов мягкой пшеницы. / Будашкина Е.Б., Калинина Н.П., Леонова И.Н., Гордеева Е.И. // Сб. материалов 2-го Всероссийского съезда по защите растений. - Санкт-Петербург, 2005. - Т. 1. - С. 405-407.

38. Будашкина, Е.Б. Перенос в геном мягкой пшеницы генов устойчивости к патогенам и их идентификация у интрогрессивных форм / Будашкина Е.Б., Гордеева Е.И., Калинина Н.П., Леонова И.Н. // Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды. Труды Всероссийской научной конференции - Иркутск, 2007. - С. 36-38.

39. Леонова, И.Н. Локализация генов, контролирующих устойчивость интрогрессивных линий мягкой пшеницы Т. aestivum х Т. timopheevii к листовой ржавчине / Леонова И.Н., Будашкина Е.Б. // Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды. Труды Всероссийской научной конференции. - Иркутск, 2007. - С. 151-154.

40. Егорова, Е.М. Получение интрогрессивных линий мягкой пшеницы, содержащих различные фрагменты хромосом А1 и G геномов тетраплоидной пшеницы Т. timopheevii / Егорова Е.М., Леонова И.Н., Салина Е.А. // Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды. Труды Всероссийской научной конференции. - Иркутск, 2007. - С. 82-84.

41. Леонова, И.Н. Использование молекулярно-генетических подходов и методов хромосомной инженерии для изучения и увеличения генетического разнообразия мягкой пшеницы: интрогрессивные линии мягкой пшеницы (Т. aestivum х Т. timopheevii) - новый источник генетического разнообразия / Леонова И.Н., Будашкина Е.Б., Гордеева Е.И., Калинина Н.П. // Биоразнообразие и динамика

генофондов. Сборник материалов отчетной конф. - Москва, 2007. - С. 141-142.

42. Будашкина, Е.Б. Интрогрессивные линии мягкой пшеницы - источник новых генов для селекции пшеницы на устойчивость к патогенам / Будашкина Е.Б., Калинина Н.П., Гордеева Е.И., Леонова И.Н, // Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства. Материалы международной конференции. - Москва, 2007. - С. 43-44.

43. Будашкина, Е.Б. Создание вторичных генофондов - источник генов устойчивости к ,. болезням мягкой пшеницы и их использование в селекции / Будашкина Е.Б., Гордеева

Е.И., Калинина Н.П., Россеева Л.П., Леонова И.Н. // Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке. Сборник трудов II Вавиловской межд. конф. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 247-249.

44. Будашкина, Е.Б. Использование пула генов Triticum timopheevii Zhuk. и молекулярно-генетических подходов в создании интрогрессивных линий, мягкой пшеницы - доноров генов устойчивости к патогенам // Будашкина Е.Б., Калинина Н.П., Гордеева Е.И., Леонова И.Н. // Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам. Сб. материалов 2-й Всероссийской конф. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 114-115.

45. Леонова, H.H. Использование методов «молекулярной» селекции для получения устойчивых к листовой ржавчине линий мягкой пшеницы, содержащих интрогрессии от Triticum timopheevii / Леонова И.Н., Егорова Е.М., Будашкина Е.Б., Салина Е.А. // Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам. Сб. трудов II Всероссийской конференции. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 153-155.

46. Егорова, Е.М. Получение и анализ линий мягкой пшеницы, содержащие единичные интро1ресссивные фрагменты от Т. timopheevii / Егорова Е.М., Леонова H.H., Будашкина Е.Б., Салина Е.А. // Факторы экспериментальной эволюции организмов. Сборник трудов международной конференции. - Алушта, 2009. - С. 298-302.

47. Leonova, I.N. Т. aesivum х Т. timopheevii ¡ntrogressioji lines as a source of pathogen resistance genes / Leonova I.N., Budashkina E.B., Kalinina N.P. et al. // Proceed. 8th International Wheat Conference. - St. Petersburg, 2010. - P. 73-74.

48. Salina, Е.А. Development and application of Triticum timopheevii mapping data in wheat resistance management strategies / Salina E.A., Leonova I.N., Egorova Е.М. et al. // Proceed. 8,h International Wheat Conference. - St. Petersburg, 2010. - P. 468-469.

Благодарности. Приношу глубокую благодарность научному консультанту д.б.н., профессору Сапиной Елене Артемовне за помощь в подготовке диссертации, к.б.н. Е.Б. Будашкиной, к.б.н. Н.П. Калининой, к.б.н. Е.М. Тимоновой, к.с.-х.н. Ю.А. Христову, лаборантам М.В. Баклановой, В.Г. Урбах за помощь в проведении полевых экспериментов. Благодарю за помощь и поддержку коллег из ИЦиГ СО РАН - д.б.н. Л.А. Першину, член-корр. РАН Н.П. Гончарова, к.б.н. О.Г. Силкову и всех сотрудников лаборатории молекулярной генетики и цито генетики растений.

15 — 956в

Подписано к печати 17.07.2015 Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 186

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

2015673909

2015673909