Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярно-генетическое исследование функциональной роли гена brpB в модельном штамме Streptomyces lividans TK и у продуцента биалафоса S. hygroscopicus ATCC 21705

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярно-генетическое исследование функциональной роли гена brpB в модельном штамме Streptomyces lividans TK и у продуцента биалафоса S. hygroscopicus ATCC 21705"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ТАБАКОВ Вячеслав Юрьевич

КЛОНИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ ГЕНА ЬгрВ В МОДЕЛЬНОМ ШТАММЕ Э^ер^тусев 1тс1ап8 ТК64 И У ПРОДУЦЕНТА БИАЛАФОСА Б. Ьудговсоркив АТСС 21705

03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в лаборатории генетики актиномицетов и актинофагов Всероссийского Научно-исследовательского институ та генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители диссертационной работы:

доктор биологических наук, профессор Ломовская Н. Д. кандидат биологических наук, вед. н. сотр. Воейкова Т. А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Каменева С. В. кандидат биологических наук Ухаботина Л. С.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков РАМН.

Защита диссертации состоится 16 февраля 1994 г. в 14 час, на заседании Специализированного ученого совета Д.098.12.01 при Всероссийском Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИгене-тика.

Автореферат разослан января 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В. И. ЩЕРБАКОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Актиномицеты рода БЬгер^тусез являются микроорганизмами с четко дифференцированным жизненным циклом, включающим стадии полигеномного мицелия и гаплоидных спор. Осуществление программы жизненного цикла у стрелтомицетов предполагает активирование и использование групп генов,, детерминиругсших процессы первичного и вторичного метаболизма. Фенотипическими проявлениями вторичного метаболизма являются дифференциация кодо.ний этих микроорганизмов и синтез биологически активных веществ.

Одна из групп биологически активных веществ - антибиотики, широко используется в хозяйственной деятельности человека.

В настоящее время особую актуальность в молекулярной генетике 31герЬошусез приобретает исслёдование механизмов, обеспечивающих дифференциальную" экспрессию генов первичного и вторичного метаболизма, а такде- компонентов системы регуляции, принимающих участие в их переключении.

Штамм ЗЬгерЬстусеэ Яу^гозсор^изАТСС 21705,- продуцент антибиотика гербицида биалафоса является хорошей моделью для исследования структурно-функциональной организации системы первичной инициации и регуляции генов антибиотикообразования у'стрептомице-тов. . ' ' ■ . ,

Цель работы и задачи исследования. ' .

Целью настоящей работы являлось исследование -механизмов специфической регуляции экспрессии генов биосинтеза антибиотика гербицида биалафоса в' штамме продуценте Б^ерЬотусез Ьудгозсорюиз АТСС 21705.

В соответствии с этой целью поставлены следующие задачи:

- клонирование хромосомных детерминантов, обеспечивающих позитивную регуляцию генов биосинтеза биалафоса;

- анализ функционирования'клонированных генов в гетерологич-ном штамме Б. 1тс1апз ТК54;

-г—

- разработка системы введения клонированных генов в штамм S.hygroscopicus АТСС21705;

- изучение влияния клонированных генов на уровень устойчивости и биосинтеза биалафоса в штамме продуценте.

Научная новизна результатов.

- клонирован фрагмент размером 1.45 т. п. н. Хромосомной ДНК S. hygroscopicus с геном ЬгрВ, осушэствляющим позитивную регуляцию гена устойчивости к биалафосу bar в модельном штамме S. lividans ТК64;' ' ,

- сконструирована челночная конъюгативная плазмида pYGTB24 и осуществлен перенос плазмидньи копий гена ЬгрВ в штамм продуцент биалафоса S. hygroscopicus; показано, что в результате интеграции этой плазмиды по гомологии с клонированным фрагментом происходит снижение устойчивости зксконъюгантов S. hygroscopicus (pVSTB24) и их антибиотической и продуктивности; теоретически рассмотрены механизмы функционирования ЬгрВ как регулятора кластера генов биосинтеза антибиотика биалафоса;

- адаптирована методика межродовой . конъюгации Е. col i - • Streptoniyces для передачи конъюгативньй плазмид в промышленные штаммы продуценты биалафоса (S.' hygroscopicus) и хлортет; шиклина (S. aureofaciens);. .

- показана возможность конъюгативной передачи из Е. coli ко-нъюгативных плазмид и. фагов Streptomyces в промышленно' важный "штамм Rhodocoocus rhodochrous Ш, образующий основной фермент биоконверсии акрилового нитрила в акриламид - нитрилазу;

- разработан биологический метод качественного и количественного определения биалафоса и других веществ,'обладаюпшХчтзфта-: минсинтетазной активностью, в т.ч. в культуральной жидкости микроорганизмов! продуцентов; показано, что более низкая, биологичес-• кая активность мономерных аналогов глуташновой . кислоты обусловлена специфичностью системы трансмембранного переноса этих соединений. Y ' ' "

Научно-практическая значимость работы и использование полученных результатов.

Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут быть использованы для:

1. Изучения молекулярных механизмов взаимодействия продукта клонированного гена ЬгрВ с ДНК-мишеныа и инициации транскрипции регулона, ответственного за биосинтез биалафоса.

2. Конструирования векторов, способных интегрировать в хромосому t штаммов-реципиентов путем' гомологичной рекомбинации.

3. Межродового переноса конъюгативндо плазмид из Е. coli в промышленные штаммы Streptornyces и другие микроорганизмы семейства актиномицетов.

4. Качественного и количественного анализа соединений, обладающих антиглутаминсинтетазной активностью. •

Апробация работы и публикации по теме исследований:

Основные результаты работы были представлены к защите на заседании межлабораторного семинара йодсекции "Генетика актиномицетов" института ВНИйгенетика от 24 июня 1993 г. Отдельные материалы докладывались на шести научных конференциях, в т. ч. трех международных. В общей сложности подготовлено к публикации i3 печатных работ (список представлен на 20 стр. автореферата).

Структура и объем работы.

Диссертация построена по традиционному' плану и содержит разделы: .введение, обзор литературы, материалы.и методы, результаты экспериментов, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы ( ■ наименований). '

Диссертация. содержит рисунков и таблиц.

Полный объем работы страниц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Применение метода биологического тестирования для исследования веществ, блокирующих активность глутаминсинтетазы бактериальных и растительных организмов.

Мишенью' действия большой группы веществ, используемых в качестве неселективных гербицидов, является ключевой фермент утилизации неорганического азота бактериальных и растительных организмов - глутаминсинтетаза С ГС).

Помимо химически синтезируемых веществ, в настоящее время большой интерес вызывают гербициды природного происхождение. некоторые из которых представляют собой продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Этот интерес обусловлен экологической безопасностью производства и применения природных гербицидов их быстрой биодеградацией в биоценозах.

Одним из перспективных природных гербицидов является антибиотик- трипепти^ биалафос (БАФ), образуемый', штаммами S. hygroscopicus АТСС 21705 и S. viridochromogenes Tu494. Его молекула состоит из структурного аналога L-глутаминовой кислоты фосфинотрмци:.а (ФГ) и двух остатков L-аланина (Рис. 1): Токсическое действие на чувствительные клетки оказывает ФГ, освобождающийся в клетках поражаемых организмов в результате гидролиза БАФ внутриклетчными пептидазами. .'■■•.

На первых этапах селекционно-генетической работы со штаммами-продуцентами БАФ были разработаны методы, идентификации и* определения 5,йтивности антибиотика среди. продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Для этой цели были использованы бактеркоетати-ческие свойства БАФ в отношениикультур микроорганизмов, растущих на минимальных средах.

Было обнаружено, что Bacillus subtilis АТСС6633, широко применяемый для тестирования биологической активности 'антибиотиков, проявляет чувствительность к низким концентрациям БАФ, используемым в диффузионном тесте. Круговые зоны подавления- роста этого микроорганизма на специальной среде MB наблюдались при использо-

—50

» ' . ' НАФ CHj-P-CHt-eHt-CH-CO-AtH-Cd—CO-f/H-CH-COOH

ОН ' ■ CHi снг

о

ФТ СИ у- р — CHL— CHt— СИ— соон 'ОН ^г

о . ''

« •

см CHj-S-CUi-ùHi-Ui-CooH fm . мi ■ • •

Рис. i. Структурные формулы некоторых соединений, обла-даю!цке - ант и-ГО активность« БАФ - биадафзс; <1Т - фосфинотри-цин; СМ - сульфоксиминметиошш. * •

Рис. 2. Влияние метаболических протекторов ; на эф&кт токсического действия соединений, обладающих анти-ГС.активность**, на гагоне' тест-культуры Вас. subtilis:

а - подпйлешгг тог.огческого действия всех трех .посрете экзогенным глутвд'.ном; б - избирательное влияние ГН на токсическое ."."йетЕ/е ее мономерных аналогов; п - качественный тест, лодт^ер.^,-:'наличие БАФ э культуралъной гядаости (К50 S. ' 1 iy ;г «sop i eus ' АТСС Й1705.

—б-

вании 0.01-0.1 мкг/мл водного раствора БАФ. Оказалось, что. диффузионный метод позволяет проводить достаточно точное определение содержания антибиотика в разбавленных растворах при использовании стандартных калибровочных графиков. Это обеспечивает возможность прямого определения содержания БАФ в культуральной жидкости, получаемой р результате ферментации микроорганизмов-продуцентов.

Антибиотик БАФ эффективно зкскретируется из клеток штаммов-продуцентов. Это свойство было использовано для качественной оценки уровня антибиотикообразования отдельных моноклонов продуцентов методом "агаровых блоков". При этом показана корреляция между уровнями антибиотической активности моноклонов в качественном тесте и при ферментации соответствующих культур микроорганизмов в жидкой среде.

В ходе исследований было установлено, что качественный метод позволяет проводить поиск различных соединений как микробиологического, так и химического синтеза, являющихся специфическими ингибиторами Г'С. Положительная оценка активности у данного соединения иди образца может быть сделана на основании 'изменения формы зоны подавления индикаторного штамма под влиянием диффундирующего в среду глутампна (Рис. 2). '

Один из вариантов данного теста позволяет разделит., вещества, обладающие анти-ГС активностью на основе мономерных аналогов глутаминовой кислоты (ГК), и все остальные соединения, в том числе пептидированныэ производные этих аналогов. Реакция основана на различии механизмов трансмембранного переноса веществ, принадлежащих к данным группам. Так, проникновение в поражаемую йлетку мономенрни/х аналогов ГК осуществляется благодаря функционированию специфической системы транспорта и конкурентно подавляется в присутствии суОстрата. (Рис. 2).

В то же время, проникновение пептидировадных производных этих аналогов (напр. , _ БАФ) связано с действием систем неспецифического танспорта ди- или олигопептидов на функционирование которых наличие ГК никак не сказывается (Рис. 2).

Различие механизмов, танспорта лежит в основе различной эффективности биологического действия (Э. Д.) мономерных и пептиди-

рованных аналогов ГК, которая 'оценивалась количественным методом з отношении зквимолярных количеств действующего начала сравниваемых соединений. Так, оказалось, что Э. Д. синтетических аналогов ГК (Рис. 1): фосфинотрицина, сульфоксимияметионина (СМ) и три-пептида фосфинотрицина - биалафоса соотносятся как 1 : 100 : 5000. ' Из полученных данных следует, что. проникновение свободного <СТ в клетку поражаемой бактерии В. subtilis сильно затруднено по сравнению с его связанной формой в составе БАФ. Причиной этого может быть как слабое соответствие связывающему участку переносчика, так и возможность образования с ним труднодиссоцииируемого комплекса, аналогично действию 'И на ГС. Разл!. шя по Э. Д. между аналогами ГК могут быть обусловлены несовпадением величин констант связывания последних с переносчиком и/или внутриклеточ. j'A мишенью - ГС.

2. Клонирование и изучение функциональной'роли гена ЬгрВ в штаммах S. lividans и S. hygroscopicus.

Молекулярно-генетическое исследование штамма-продуцента биалафоса S. hygroscopicus АТСС21705 в нашей лаборатории было начато с клонирования специфического детерминанта устойчивости к собственному антибиотику - гена bar [1]. Оказалось, что, ■ несмотря на плазмидную амплификацию в составе рекомбинантной плазмиды (50-200 копий геном), клонированный ген bar обеспечивал уровень устойчивости в реципиентном штамме S. lividans ТК64 в 40 раз меньший, чем для продуцирующего БА£> 5. hygroscopicus (Табл. 1).

Мы предположили, что" в гетерологичном штамме S. lividans отсутствуют существенные элементы, обеспечивающие эффективную,экспрессию клонированного гена bar. К подобным элементам относятся структуры, включающие гены, обеспечивающие механизмы регуляции процессов вторичного метаболизма.

В качестве обнаруженного генетического детерминанта, продукт котрого осуществляет позитивную регуляцию экспрессии генов биосинтеза БАФ, описан ген ЬгрА,. физически картированный в составе кластера генов генов биосинтеза БАФ.

С целью клонирования этого гена был использован подход, основанный на принципе комплементарного взаимодействия между генами bar и ЬгрА. При этом-ожидалось, что введение в состав плазмиды PVGB20 (Рис. 3) гена ЬгрА должно существенно усилить экспрессию гена' bar и привести к повышению уровня устойчивости штамма, содержащего плазмиду с этими генами.

Споровые суспензий 1000 клонов S. lividans, несущих плазмид-ную ДНК pVSB20 со встороенньми по SstI сайту фрагментами генома S. hygroscopicus, высевали на минимальную среду с высокой дозой БАФ, летальной для трансформантов S. lividans (pVGÎB20). ■ В результате был получен плазмидный клок с повышенной устойчивостью к ЕАФ (фенотип BAW). .

Рекомбинантная плазмида pVGB21, изолированная из этого клона, содержала вставку гетерологичной ДНК размером 1.45 т. п. н., которая гибридизировалась с соответствующем фрагментом Ssti-рест-рицированной хромосомной ДНК S. hygroscopicus.

Субклонирование данного фрагмента в составе плазмиды pIJ702 с образованием'рекомбинантной молекулы pYQB22 не обеспечивало штамму S. lividans устойчивости к БАФ (Табл. 1).

Методом РНК-ДНК. гибридизации было установлено наличие транс- ' крипцни с клсчированного фрагмента,,а также -показано' '.увеличение содержания Ьаг-мРНК в мицелии,трансформантов S. -lividans (pVGL.il). по сравнению с трансформантами pVGB20," в плазмиде которых присутствовал только ген- bar (Рис. 3). Усиление экспрессии, гена .bar; находящегося в составе плазмиды pVGB21 было подтверждено, определением. активности фермента - N-ацетилтрансферазы (продукта'гена '. bar) в оесклеточных экстрактах трансформантов S. lividans (pVGTB20 и В21). Степень-снижения токсических свойств ФГ в обработанных экстрактами образцах определяли при* помощи биологического теста. Оказалось',, что зона подавления роста Вас. subtil is, индуцируемая ФТ, судесгвенно уменьшалась в случае, использования экстракта из трансформанта S. lividans . (pYGB2i). Аналогичный ре- . зультат был получен для системы взаимодействия Генов в положений trans, когда ген bar был интегрирован в хромосому штамма S. lividans в составе интегративного вектора pVGB212 [Кудрявцева

ватн!

Y

Pat! ЗатНУВдШ

Sst! EcoRV-

: EcoRV-Set!

рис. 3 рестрикционные карты пллзчидних днк использованных в работе по клонированию ssti фрагмента хроиосошюй днк s. hycroscopicus с детерминантом, обладающим свойствами позитивного регулятора транскрипции гена резистентности к биалАфосу bar

EcoRV

-10E. A. и др. , 1994], а клонированнный фрагмент присутствовал в клетках мицелия в составе автономной плазмидной ДНК.

ДНК-ДНК гибридизация показала специфичность исследуемого фрагмента для генома штамма S.. hygroscopicus, его отсутствие в составе хромосомных ДНК штаммов S. lividans, S. coelicolor А3(2), S. aure fací ens, а также другого продуцента БАФ S. V 2 г j dochromogeries.

Рестрикционная карта с возможным направлением транскрипции ORF в составе клонированного фрагмента, определенным при помощи вектора по отбору промотеров pIJ486, представлена на Рис. 4. Как. размер Sstl фрагмента, несущего клонированный детерминант, так и его рестрикционная карта не соответствовали охарактериз.о :чному ранее участку ДНК, содержащему ORF регуляторного гена ЬгрА. Более того, в составе кластера генов биосинтеза БАФ из S. hygroscopicus не обнаруживается участка • ДНК, соответствущео клонированному фрагменту по сайтам рестрикционного расщепления (Рис. 5). г

Таким образом, полученные данные указывали, что продукт клонированного гена, обозначенного нами ЬгрВ, осуществляет позитивную регуляцию гена устойчивости к БАФ в гетерологичном штамме S. lividans. • '

Представляло интерес выяснить влияние этого регуляторного детерминанта на уровень устойчивости и биосинтеза БАФв продуценте этого антибиотика - S.. hygroscopicus.^

С этой целью клонированный фрагмент в составе автономной ко-нъюгативной плазмиды pVGTB24 (Рис. б) был передан в штамм продуцент БАФ S. hygroscopicus (см. раздел 3). Оказалось, что уровни устойчивости и антиблотикообразования у экеконъюгантов рУБТВЗД>ы-jiiï снижены по сравнению с- исходным штаммом S. hygroscopicus. Гак, биосинтез -БАФ в ферментации погруженной культуры экеконъюгантов ■ S. hygroscopicus(pVGTíB24) составил 60-80Z от 'исходного. Активность N-ацетилтрансферазы в мицелии клонов-экеконъюгантов была •ниже, чем у- исходного штамма S. hygroscopicus, что подтверждает , данные о . снижении уровня-устойчивости, полученные в результате, генетических исследований. •

Вместе с, тем, стабильность наследования.плазмиды pVGTB24 в

Таблица 1. Характеристики фенотипов и уровней конститутивной устойчивости к биалафосу анализируемых в работе штаммов БЬгер^тусез

Шгамм I биотип | Уровень конститутивной

I I устойчивости к БАФ,

| I мкг/мл

1. Реципиентный штамм Th , ВА

S. lividans ТК64

2. Трансформанты

а. pVGB5

б. pVSB20

в. pVGBSl . Г. pVQB22

3. Штаммы- продуценты БАФ

а. S. hygroscopicus Th', ВА'

х ft

б. S. viridochromogenes Th , ВА , №sl+

Th , ВА Th*, ВАЯ Th*,'BAb Th*, ВА*

№э1+ Mel-Mel-

bhR

0. 5

1.0

1.0 15.0 < 0.5

40.0 1.0

Ssti

Sfcxxl

SW/

bfpB

lOOn.H.

Рис. 4. Реетрикционная карта клонированного фрагмента'.хромосомной ДНК S. hygroscopicus размером 1.45 т. п. н. и возможное направление транскриции предполагаемого гена активатора кластера генов биосинтеза БАФ ЬгрВ.

генов биосинтеза ВАФ, размером,' 35 т. п. н. [БаНэаж! А. еЬ а1., 1991] и схема, отражающая возможный , механизм функционирования ^ продукта гена ЬгрВ в качестве первичного активатора транскрипции. этого кластера Данный механизм предполагает передачу . инициирующего сигнала на специфический ген-регулятор ЬгрА, который контрсК лирует транскрипцию с ЬгрА- зависимых проьютёров в составе квас- . ■тера . . . ; ■ ' ■■ _ • . • •• •

рассевах споровых суспензий эксконъюгантов. оцениваемая по сохранению маркера устойчивости к тиострептону в неселективных условиях роста, достигала 100%; что не характерно для плазмидных ДНК, Находящихся в автономном состоянии в штаммах Streptomyces (см. раздел 3).

Таким образом, полученные в ходе изучения свойств эксконъюгантов данные свидетельствовали об интеграции плазмиды pVGTB24 в хромосому штамма S. hygroscopicus по гомологии с клонированным . фрагментом. Результаты ДНК-ДНК гибридизации рестрицирйванных по уникальному для pVGTB24 сайту хромосомных ДНК клг -ов, эксконъюгантов S. hygroscopicus згР -меченной плазмидой рРМЗОЗ подтвердили это предположение. Отмечено, что интегрированный вектор подвержен структурным перестройкам в составе хромосомной ДНК. Эти перестройки носят характер дедеций и могут затрагивать различные по протяженности участки в районе oriT pVGTB24. .

Очевидно, события, сопровождающие процесс интеграции, нарушают функционирование хромосомной копии гена ЬгрВ.. выполняющего существенную для становления антибиотикооС/^азования и резистентности к БАФ роль в штамме S. hygroscopicus.

. ' На' основании данных литературы о принципах структурно-ф: чк-_ циональной организации кластеров генов биосинтеза ант] "иотиков у , Streptomyces й результатах•моЛекуЛярно-генетического исследования кластера генов биосинтеза БАФ из штаммов S. hygroscopicus и S.; . v iridochr-omogenes,; мы предполагаем, что клонированный ген ЬгрВ, очевидно, должен обеспечивать начальную инициацию процесса транс- ' крипции ' кластера генов БАФ. Точкой приложения' действия продукта этого регуляторного гена, невидимому может являться район операторов межцистронного промежутка генов пептидной конденсации ala и bar (Рис. 5). Так,, нам удалось показать, что фрагмент ДНК разме-. ром 2 т. п. н., содержащий ген bar, теряет, электрофоретическую подвижность при обработка экстрактом из клеток S. lívidans (pVGB22). Предполагается, что это происходит в результат.» комплексообразо-вания между ДНК и ДЙК-свяаывающнм белковым продуктом гена brpR

В настоящее время функции и структура ДНК клонированного ре-

-lit—

гуляторного гена ЬгрВ интенсивно изучается в чашей лаборатории.

3. Оптимизация системы введения и изучение свойств конъюга-•.. - тивных векторов в промышленных штаммах актиномицетов

Современные подходы к оптимизации процессов получения продуктов микробиологического синтеза включают методы молекулярной биологии и генетической инженерии. Однако, использование этих методов в отношении многих промышленно-важных штаммов семейства Act1ncmycetales затруднено в связи с отсутствием эффективных систем введения рекомбинантной ДНК

Весьма перспективным в этом отношении может оказаться метод межродовой конъюгации, в котором используются мобилизующие функ-

> С ~ " - -г

ции репдиконов некоторых плазмид Е. coli для передачи'"специально сконструированных векторов г клетки грамг. дожительных бактерий.

В ходе исследований нами были подобраны условия для осудест-• вления конъюгативного переноса автономных челночных "и'интегратив-чых плазмид в промышленные штаммы актиномицетов продуцентов: биа-лафоса - S. hygroscopicus АТСС 21705; хлортетрациклина - • S. aureofaciens S755 и Rhodococcus rhodochrous Ш^юбразуквдй основ-'ной фермент биоконверсии акрилового нитрила в акриламид - нитри-лаэу.

В качестве автономных конъюгативных векторов использовали модельную челночную плазмиду рРШЗЗ [Р. Mazodier et al. , 1989] и сконструированную на ее основе плазмиду pVGTB24,-"подученную в результате лигирования фрагмента Bglll плазмиды рРШОЗ с плазмидой PVGB22 (Рис. 6).

В качестве вектора с интегративными свойствами использовали плазмиду pTOl [Bolotin A. and Vavilova Е. , 1992], несущую в своем составе ДНК attP района умеренного актинофага £С31 (Рис. 6). Все эти плазмиды содержат опТ последовательность IncP плазмиды RK2 Е: coli S-17.1. Мобилизация конъюгативных плазмид из штамма-донора Е. coli S-17.1 происходит за счет функционирования tra-onepoha плазмиды RP4, интегрированной в его хромосому.

Методика конъюгативного переноса, предложенная в работе

Pstl

EcoRI bqiii Hind m

Pat

Hindm

\Xhol "•si/

EcoRI By ill Hindlll '

Pstl

oriR pBR322

Or/'R PIJIOI

Hindm

EcoRV

oriR plJ101

Kpnl BarnHI , Salt . Il SacllClal

Patl

hindm

I Ü or//? T7promo ter Д ~*BR322 If

Revena A primer X

Gsul

Clal

Kpnl Sacl EcoRI

Рис.б Рестрикционно-генетические картн использованных в работе конь-вгативных плазмид.

P. Mazodier et al., 1989, оказалась неэффективной для исследуемых наш плазмид промышленных штаммов актиномицётов. Конъюгативный перенос плазмид в пгтаммы S. hygroscopicus, S. aureofaciens й R. rhodochrous был "осуществлен на агаризованных средах СР-6"и СР-12, используемых для поддержания культур Streptomyces, с эффективностью, 'зависящей от вида передаваемой ДНК (Табл. 2). Очевидно, трудноусваиваемые- источники углерода и азота, используемые в качестве питательных компонентов этих сред, создают селективные преимущества для актиномицётов в конъюгативной системе и делают ненужным последующий этап механического удаления . штамма-донора. Е. coli S-17.1.

В полученных таким образом экоконъюгантах актиномицётов исследовали физическое состояние переданных путем конъюгации ллаз-мидных ДНК, а также их влияние на некоторые фенотипические признаки этих штаммов.

Ешо показано, что автономная форма ДНК плазмиды рРМВОЗ свободно выделяется в препаративных количествах из мицелия эксконъю-гантов штаммов S. hygroscopicus и S. aureofaciens. Однако, стабильность ее наследования в рассевах спор штаммов S. hygroscopicus и S. aureofaciens после выращивания культур в селективных условиях составляемо и 0.1%, соответственно, а после' выращивания культур в неселективных условиях эти значения- снижались до 0.1 и 0.01%, что указывает на низкий уровень-.наследования этой плазмиды.

Конъюгативный -перенос • плазмиды pVGTB24 в штаммы S. hygroscopicus и • R. rhodochrous осуществлялся с низкой частотой. При этоу. в штамме S. hygroscopicus происходила интеграция плазмиды pVGTB24 по гомологии с клонированным в ее составе фрагментом хромосомы ДНК штамма, несушим.регуляторньй ген ЬгрВ (см. раздел 2). Плазмидная ДНК pV6TB24 не выделялась в препаративных количествах из соответствующих зксконъюгантов R. rhodochrous.' Однако, в отличие от зксконъюгантов S. hygroscopicus, выделенные образцы ДНК обладали способностью трансформировать компетентную культуру Е. coli." Это подтверждает автономную форму существования плазмиды PVGTB24 в штамме R. rhodochrous". Стабильность наследования

Таблица 2. Эффективность переноса различных видов конъюга-тивных плазмид из Е. coli s-17.1 в промышленные штаммы актино-мицетов (кол. экск.: чаш.) .

Штаммы

рРМЗОЗ

PV0TB24

рТ01

S. aureofaciens S755 S. hygroscopicus ATCC21605 R. rhodochrous M8

10й

10* - 103

10 10'

10

10 10*

ioJ - 10v

6,0 Т.П.Н.- . ' . . . 8'5 T-n-"-.

фрагмент может быть лиги-рован з кольцевую молекулу . исходного вектора рТ01

ßawm

вф* I— —

2,5 т.п.н.

Рис. 7. Схема двух (олиго)'копийной интеграции вектора рГ01 . в хромосому реципиентного штамма 1?. г^осЬгош М8. Схема объясняет возможную интеграцию вектора рТ01 в • нескольких копиях в хромосому штамма Р. гЬойос!тгоиз. Черной стрелкой обозначен участок интеграции плазмиды рТ01 - а^ВР.

pVGTB24 в зксконъюгантах этого штамма, оцениваемая пег сохранению маркера устойчивости к тиострептону после одного пассажа в неселективных условиях, составила 20%. Наибольшая частота возникновения экеконъюгантов для всех трех промышленных штаммов актиномице-тов наблюдалась в отношении интегративного вектора рТ01 (Табл. 2).

Феномен сайт-специфической интеграции плазмиды в геном этих штаммов был подтвержден методом ДНК-ДНК-гибридизации. Меченная ДНК рТ01 гибридизовалась с двумя фрагментами Sst1-рестрицирован-ных хромоемных ДНК экеконъюгантов S. hygroscopicus и S. aureofaciens и с тремя фрагментами ВатНЬрестрициро'ванной хромосомной ДНК экеконъюгантов R. rhodochrcus. Оказалось, что встраивание рТ01 в геном R. rhodochrous присходит более чем в одной копии, что обеспечизает характерную картину ДНК-ДНК-гибридизации. На рис. 7 предложена схема возможной интеграции вектора рТ01 в нескольких копиях в хромосому штамма R. rfpdochrous, объясняющая наличие трех полос "ответа" на радиоавтографе ДНК-ДНК-гибридизации. .

Наличие нескольких копий рТ01 в хромосоме штамма было подтверждено после реконструкции исходной молекулы вектора рТ01 в- результате самолигирования. BamHI- рестриктов хромоемных ДНК клонов экеконъюгантов. Однако, если стабильность наследования рТ01 для клонов экеконъюгантов штаммов S. hygroscopicus и S. aureofaciens составляла 100% по маркеру устойчивости к тиострептону, то у R. rhodochrous ее величина достигала лишь 50-80%. В совокупности с данными об образовании делеционных форм плазмидных ДНК рТ01, реконструированных из хромосом экеконъюгантов, этот факт■может свидетельствовать о структурной, нестабильности вектора в составе-хромосомы R. rhodochrous. Эти данные были получены совместно с сотрудниками лаборатории генетйки биодеградации ВНИИгенетика.

Исследование ' влияния интеграции плазмиды рТ01 на морфогенез и уровень биосинтеза антибиотиков у штаммов экеконъюгантов показало, что, в отличие от .S. lividans, S. aureofaciens и R. rhodochrous, клоны экеконъюгантов S. hygroscopicus утрачивали способность к дифференциации и на 50% снижали антибиотическую продуктивность при ферментации, по сравнению с исходным ' штаммом.

Очевидно, интегрция pTOl затрагивает существенные для осуществления этих функций районы генома штамма S. hygroscopicus.

Таким образом, межродовая конъюгация может использоваться как альтернативный способ введения рекомбинантной ДИК в генетически малоизученные промышленные штаммы актиномицетов.

■ Эксперйментальн' г данные, отражающие возможность функцищди-рования элементов ДНК Strentomyces в R. rhodochrous являются дополнительным свидетельством генетического родства между микроорганизмами этих родов. Так, экспрессия гена устойчивости к тиост-рептону - tsr в чувствительном к антибиотику штамме R. rhodochrous свидетельствуют о сходстве систем транскрипции и трансляции; автономное поддержание плазмиды pVGTB24 в клетках этого микроорганизма говорит о сходстве систем репликации ДНК; функционирование фрагмента генома умеренного фага Streptomyces, обеспечивающего сайт-специфическую интеграцию плазмиды pTOl в хромосому R. rhodochrous, свидетельствует о наличии сходных последовательностей ДНК по крайней мере 'в районах геномов Streptomyces и R. rhodochrous, содержащих сайты интеграции -attB.

В Ь1 J3 О Д Ы

1. Клонирован фрагмент ДНК хромосомы S. hygroscopicus, содержащий регуляторный ген ЬгрВ.

2. Показано позитивное влияние клонированного гена на уровень экспрессии гена резистентности к'биалафосу - bar в модельном штамме S. • lividans.

.3. Продемонстрировано участие , гена ЬгрВ в экспрессии генов резистентности и биосинтеза б^алафоса для продуцента антибиотика - S. hygroscopicus. . ••

4. Разра' тана система конъюгативного переноса плазмидных ДНК в. результате межродовой конъюгации из Е. col i в промышленные штаммы актиномицетов S. hygroscopicus, S. ' aureofaciens и R. rhodochrous. * * -

5. Установлено, что генетические структуры плазмид и фагов

Streptomyces ..агут функционировать в штамме R. rîpdochrous. .

6. Разработана тест-система, позволяющая определять вещест- . ва, обладающие анти-глутаминсинтетазной активностью (в т. ч., мономерные и пептидированные аналоги глутаминовой кислоты). Показано, что более низкая биологическая активность мономерных аналогов глутаминовой кислоты обусловлена специфичностью системы трансмембранного переноса этих соединений.

Основные результаты, представленные в диссертационной работе, изложены в следующих печатных работах:

1. Сезонов Г. В., Табаков Е Ю. Кудряшова Е. А. , Экспрессия клонированного гена резистентности к биалафосу bar в штаммах Streptomyces // Антибиотики и химиотерапия, 1990, Т. 35, N 12, С. 70-74.

2. Бегопоу G. V., Tabakov V. Yu., Biryukova I. Y., Kudryashova H. A. , Lorovskaya N. D. Conparative study of.strains Streptomyces hygroscopicus ATCC21705 and S. viridochroinogenes Tu494 producing antibiotic herbicide bialaphos // Abstr. Symp. "Genet. Product. Format, in Streptomyces", .Weimar, 6DR, 1990.

3. Sezonov G. V., Biryukova I. V., Kudryashova H. A., Tabakov" V. Yu., Mkrtumian N. M., Lomovskaya N. D. Emloymeht of the molecular cloning methods in the studies of Streptomyces hygroscopicus ATCC21705 and S. .viridochroinogenes Tu494 strains producing antibiotic herbicide 'bialaphos '// Abstr. 7th- fiat, Conf. on Product Formation and Application of Antibiotics", ■ Razgrad, Bulgaria,'1990.

4. Сезонов Г. R , Кудряшова Е. А., .Табаков В. Ю., Ломовская Д Д. Использование гена устойчивости- bar Streptomyces hygroscopicus АТСС21705 в качестве фенотипического маркера при молекулярном клонировании генов биосинтеза биалафоса - экологически безопасно-. го антибиотика гербицида // Трз. Всесоюзн. Конф. "Новые направл. биотехнологии", Пущино, 1990, С. 50.

5. Сезонов ï. Е , Табаков Е К1, Ломовская Е Д. Клонирование гена устойчивости bar из продуцента гербицидного антибиотика биала-

фоса - Streptomyces hygroscopicus ATCC21705 и изучение его функционирования в штаммах S. lividans ТК64 и S. viridochromogenes Tu494 // Тез. Мевдунар. Конф. молодых ученых, Москва "Получение, исследование, применение антибиотиков и БАВ", Москва,1990, С. 13.

6. Tabakov V. Yu. , Lomovskaya N. D. Cloning of chromosomal detérminant of Str ptomyces hygroscopicus ATCC21705 positively affecting the bialaphos resistance level, controlled by the bar gene // Abstr. of ASM Conf. . Bloomington, USA, 1992.

7. Kudryavtseva H. A. , Tabakov V. Yu. , Bolotin A. P. , Yavilova E. Yu. ,Lomovskaya N. D. intergenus conjugation in E. coli and producers of bialaphos, Streptomyces hygroscopicus and Chlortetracycline, S. aureoifaciens // Abstr. of ASM Conf., Bloomington, USA, 1992.

8. Кудрявцева E. A. , Табаков В. Ю. , Болотин А. П. , Вавилова Е. К1 , Ломовская Н. Д. Разработка систем межродовой конъюгации Е. coli - Streptomyces в генной инженерии продуцентов биалафоса S. hygroscopicus и хлортетрациклина S. aureofaciens. V Конференция РФ Новые ралравления биотехнологии", 18-22 лая 1992, Пущино

9. Табаков В. Е Клонирование хромосомного детерминг.лта Streptomyces hygroscopicus, позитивно влияющего на уровень устойчивости- к биалафосу, контролируемый геном bar V Конференци. РФ Новые ралравления. биотехнологии", 18-22 мая 1992, Пуни :о, С.. 42.

10. Сезонов Г. а , Табаков В. Юк , Кудряшова Е. А., Бирюкова И. В. , Ломовская Н. Д. Использование методов биологического тестирования и молекулярного клонирования в исследовании штаммов Streptomyces hygroscopicus АТСС21705 и S. viridochromogenes Tu494, образующих антибиотик гербицид биалафос // Сб. "Генетическая инженерия продуцентов антибиотиков", Медбиозкономика. 1992. Вып. XXI. С. 137.

11. Табаков В. Ю., Токмакора И. Л., . Сезонов Г. В. , Хромосомный детерминант Streptomyces hygroscopicus, позитивно влияющий на уровень устойч вости к биалафосу, контролируемый геном bar // Антибиотики и химиотерапия,'1992, Т. 37, N 10, С. 10-15.

12. Табаков В. KÍ , Воейкова Т. А., Токмакова И. JL , Болотин А. П. , Вавилова Е. (Q , Лэмовекая К Д. Межродовая коньюгация Escherichia col i-Streptomyces как способ передачи коньюгативных плазмид в

--22- .

продуценты антибиотиков хлортетрациклина и биалафоса 7/ Генетика,' 1994, N1 (в печати).

13. Табаков В. К1, Токмакова И. JL , Воейкова Т. А., Молекуляр-но-генетическое исследование функциональной роли регуляторного-гена ЬгрВ в системе продуцента биалафоса Strep!" onyces hygroscopicus АТСС21705 /7 Генетика,1994, N4 (в печати).