Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения

Шкопоров, Андрей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения"

На правах рукописи

ШКОПОРОВ

Андрей Николаевич

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ ПРЕПАРАТОВ-ПРОБИОТИКОВ НОВОГО

ПОКОЛЕНИЯ

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 2008

003454154

Работа выполнена в государственном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Ефимов Борис Алексеевич

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник доктор мед1щинских наук, профессор

Грубер Ирина Мироновна Царев Виктор Николаевич

Ведущая организация

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И М. Сеченова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва

на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.203.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8)

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д 6)

Автореферат разослан «. Jl » M-OfkjL_2008 г.

Защита состоится «.

/£ » _2008 г. в JS-

часов

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Бифидобактерии - род грачположительных неспорообразующих анаэробных бактерий, являющихся облигатными обитателями желудочно-кишечного тракта человека и многих видов животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. В подавляющем большинстве случаев бифидобактерии находятся в тесных мутуалистических отношениях с организмом хозяина, а разрыв такой симбиотической связи грозит нарушением нормальной физиологии интестинального тракта последнего. Длительная симбиотическая коэволюция бифидобактерий и человека привела к формированию у данного рода микроорганизмов большого количества взаимовыгодных адаптаций, благотворно влияющих на жизнедеятельность макроорганизма хозяина. Среди таких свойств наиболее значимы: активная и пассивная колонизационная резистентность, направленная на предотвращение заселения желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микробами, участие в катаболических и биосинтетических процессах в кишечной трубке и иммуномодулирующее влияние [М.С. Collado и другие, 2005; A. Pompei и другие, 2007; Н Tanaka и другие, 2000; F. Backhed и М. Hornef, 2003].

Позитивные пробиотические свойства бифидобактерий с успехом использует как медицина, так и пищевая промышленность. В нашей стране был создан целый ряд биотерапевтических препаратов, имеющих в своем составе живые культуры бифидобактерий и широко применяющихся для лечения широкого круга гастроэнтерологических заболеваний [Г.И. Гончарова, 1982; Б.А. Ефимов и В.М. Коршунов, 1992; С.Н. Барзашка-Попова, 1990]. Бифидобактерии находят все большую популярность как компоненты разнообразных кисломолочных продуктов и продуктов функционального питания.

Благодаря своему общепризнанному благотворному влиянию на физиологию как интестинального тракта, так и всего организма человека в целом бифидобактерии стали объектом многочисленных исследований. Однако до недавнего времени существовали лишь отрывочные сведения о молекулярной биологии и генетике данного рода бактерии Значительный прогресс в изучении тонких молекулярных свойств бифидобактерий наметился на рубеже XX и XXI вв. Последние годы ознаменовались завершением секвенирования геномов нескольких видов бифидобактерий [М А. Schell и другие, 2002] и публикацией значительного числа работ, посвященных вопросам их молекулярной физиологии и молекулярных механизмов взаимодействия с организмом хозяина [М. Ventura и другие. 2005;

A. Margolles и другие, 2006; J. De Dea Lindner и другие, 2007].

Отдельной важной темой является изучение плазмид и мобильных генетических элементов бифидобактерий [Б А Ефимов и другие, 2008] Включение в инструментарий исследователя подобных генетических элементов позволяет от описательной генетики перейти к экспериментальной, базирующейся на методологии генетической инженерии Вместе с тем, расширение наших знаний о генетике этого рода прокариот и разработка методов генетического манипулирования ими позволит улсе в ближайшем будущем направленно создавать пробиотические и биотерапевтические штаммы с принципиально новыми свойствами В частности, это сделает возможным получение рекомбинантных штаммов-продуцентов белковых, нуклеиновых или иных молекул с терапевтическими свойствами.

Цель настоящего исследования

Разработать оригинальный инструментарий и методологию, необходимые для осуществления простой и эффективной генетической модификации бифидобактерий и последующей продукции в них гетерологичных белков с терапевтическими свойствами (цитокинов, ферментов, вакцинных антигенов и пр.)

Задачи исследования:

1. Провести поиск плазмидных ДНК в коллекции штаммов бифидобактерий, выделенных от здоровых детей раннего возраста;

2. Определить полные нуклеотидные последовательности избранных плазмид и проанализировать их методами биоинформатики;

3. На основе описанных плазмид создать челночные клонирующие вектора Bifidobacterium-E. coït, позволяющие доставлять гетерологичные гены в клетки бифидобактерий,

4. Разработать оптимальный протокол генетической трансформации перспективного хозяйского штамма бифидобактерий;

5. Подобрать необходимые генетические элементы (промоторные, терминаторные и лидерные последовательности), обеспечивающие оптимальную транскрипцию и трансляцию гетерологичного гена, а также эффективную секрецию рекомбинантных белков.

Научная новизна

В ходе настоящего исследования впервые было проведено изучение плазмидных профилей в индигенных штаммах бифидобактерий, выделенных от детей раннего возраста Обнаружена существенная частота встречаемости плазмидных ДНК в бифидобактериях различных видов и выявлено доминирование ограниченного числа консервативных семейств таких плазмид в популяциях бифидобактерий. Определены и аннотированы полные нуклеотидные последовательности двух новых плазмид, в числе которых одна - первая полностью просеквенированная плазмида из бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, вторая - плазмида с нетипичным для бифидобактерий генным составом, напоминающая некоторые конъюгативные плазмиды бактерий рода Streptomyces.

Продемонстрировано присутствие на описанных плазмидах генов, вовлеченных в процесс конъюгативного переноса данных молекул ДНК. Отдельный интерес представляет присутствие на одной из плазмид набора генов tra необходимых и достаточных, по всей видимости, для осуществления конъюгативного переноса данной плазмиды по уникальному стрептомицет-подобному механизму.

На основе изученных плазмид создана серия челночных клонирующих векторов Е coli -Bifidobacterium, способных к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток и несущих соответствующие селективные маркерные гены для селекции в них. Продемонстрирована способность большей части полученных векторов к трансформации бифидобактерий вида Bifidobacterium breve с относительно высокой эффективностью.

Сконструированы экспрессирующие челночные вектора, несущие необходимые регуляторные элементы для обеспечения экспрессии гетерологичных генов в бифидобактериях. Функциональность полученных плазмидных векторов была подтверждена при помощи трех модельных генов - FGF2 человека, IL10 человека и атуВ Bifidobacterium adolescentis. Кроме того, в случае с генами FGF2 и IL10, впервые была осуществлена гетерологичная экспрессия человеческого гена в бактериях рода Bifidobacterium.

Практическая значимость работы

Полученные нами данные о высокой частоте встречаемости плазмидных ДНК в клетках бифидобактерий, индигенных для интестиналыюго тракта здоровых детей, а также данные об отсутствии каких-либо потенциально опасных маркеров на данных плазмидах могут внести существенные коррективы в распространенное мнение о недопустимости включения

плазмидных штаммов бифидобактерий в состав препаратов-пробиотиков

Разработанные в ходе настоящего исследования челночные клонирующие вектора Е coli - Bifidobacterium, а также методы их доставки в клетки Bifidobacterium breve имеют высокую практическую значимость. Данный инструментарий может быть использован для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках бифидобактерий как в рамках фундаментальных исследований, направленных на изучение биологии бифидобактерий, так и в рамках прикладных работ, имеющих целью получение пробиотических или биотерапевтических штаммов бифидобактерий с новыми полезными свойствами

Полученные нами штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие основной фактор роста фибробластов человека (FGF-2) н интерлейкин-10 человека (ИЛ-10), имеют как демонстрационное, так и самостоятельное прикладное значение. С учетом последних данных о возможности использования белков FGF-2 и ИЛ-10 для лечения различных тяжелых заболеваний желудочно-кишечного тракта, указанные штаммы-продуценты могут стать прообразами принципиально новых бнотсрапевтических штаммов, полученных с использованием методов генетической инженерии

Разработанные нами Еекторные системы, в комбинации с клонированным геном а-амилазы атуВ Bifidobacterium adolescentis, могут лечь в основу нового поколения безопасных клонирующих векторов для бифидобактерий, соответствующих стандарту «food-grade», полностью лишенных потенциально-опасных фрагментов ДНК и пригодных для получения рекомбинантных пробиотических и биотерапевтических штаммов бифидобактерий.

Разработанные в ходе данного исследования векторные системы уже в настоящее время используются для фундаментальных и прикладных исследований бактерий рода Bifidobacterium как в нашей стране, так и в ряде лабораторий США и Европы

Апробация работы

Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 12 марта 2008 года, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И И Мечникова в 2006 и 2007 годах, а также на международном симпозиуме «Propionibacteria and Bifidobacteria. Dairy and Probiotic Applications» (Wadahl, 2007).

Положения выносимые на защиту:

1. Штаммы бифидобактерий, колонизирующие кишечник здоровых детей, часто являются носителями небольших кольцевых критических плазмидных ДНК, которые реплицируются по механизму «катящегося кольца», несут ряд генов, кодирующих консервативные белки с неизвестными функциями, а также обладают потенциальной способностью к коныогативному переносу;

2 Криптические плазмиды, выделенные из кишечных штаммов бифидобактерий, могут быть использованы для создания челночных клонирующих векторов Bifidobacterium — E.coli, обеспечивающих возможность проведения генетической трансформации бифидобактерий;

3. Полученные в ходе данного исследования челночные клонирующие вектора могут быть использованы для доставки в клетки бифидобактерий генетических конструкций, обеспечивающих продукцию в них гетерологичных белков с полезными свойствами, в том числе цитокинов (FGF-2, ИЛ-10) и ферментов (а-амилаза);

4. Генетически-трансформированные штаммы бифидобактерий, полученные с использованием описанных челночных векторов, могут стать основой для создания принципиально нового поколения пробиотических и биотерапевтических агентов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 8 статей в рецензируемых научных журналах (5 в отечественных и 3 в зарубежных).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на русском языке, на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 189 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 4 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Материалами исследования были штаммы бифидобактерий (всего 85) выделенные из кишечника здоровых детей, типовые штаммы бифидобактерий различных видов, полученные из коллекций АТСС, Nestle Research Centre и коллекции штаммов микроорганизмов университета Корк (Ирландия) Кроме того, объектами исследования являлись плазмидные и геномные ДНК, выделенные из указанных штаммов, их дериваты, полученные методами генетической инженерии, а также штаммы бифидобактерий, трансформированные различными генетическими конструкциями

Видовую идентификацию штаммов бифидобактерий проводили путем секвснирования ПЦР-амплифицированных фрагментов генов 16S-pPHK с применением универсальных домен-специфических бактериальных праймеров Выделение плазмидных ДНК из штаммов бифидобактерий проводили с использованием видоизмененного щелочного метода Бирнбойма и Доли [Н.С. Bimboim и J Doly, 19791 с введением дополнительной обработки клеток лизоцимом и мутанолизином. Плазчиды подвергались рестрикционному анализу и клонировались по обнаруженным уникальным рестрикционным сайтам в вектор pBluescriptlIKS- с использованием «сине-белого теста» и штамма Е. coli XL-lBlue. Определение полной нуклеотидной последовательности плазмид проводили используя подход «праймер-опосредованной прогулки» на секвенаторе ABl Prism 3100 (Applied Biosystems) Компьютерный анализ определенных последовательностей проводили в пакете приложений Vector NT1 9 0 (Informax), а также в сетевых приложениях PFAM, MFOLD, TMPred, SignaYP, ТМНММ и др. Аннотированные последовательности плазмидных ДНК депонировали в базе данных GenBank под номерами DQ305402 и NC_010930.

Конструирование челночных клонирующих векторов Bifidobacterium - E.coli и генетических конструкций для экспрессии генов FGF2, ILIO и атуВ в Bifidobacterium breve проводили в соответствии с общепринятыми методиками 13. Sambrook и DW. Rüssel, 2001] Гены егу194 и FGF2 были выделены как рестриктные фрагменты плазмид pUC19e и pAFGFB. Гены cat!94, ILIO и атуВ были амплифицированы при помощи ПЦР на матрице плазмиды рС194, кДНК-библиотеки мозга человека и геномной ДНК В adolescentis В48 соответственно. Промоторы генов hup и gap, а также терминатор гена hup были ПЦР-амплифкцированы на матрице геномной ДНК В longum VMKB44. Фрагмент гена sec2, кодирующий секреторный сигнальный пептид, был ПЦР-амплифицирован из геномной ДНК

В. breve UCC2003. Для клонирования ПЦР-продуктов с «липкими концами» к 5'-концам праймсров добавляли последовательности соответствующих рестрикционных сайтов. Верификацию получешшх рекомбинантных плазмид проводили с использование методов ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования ДНК-вставок.

Трансформацию штаммов бифидобактерий проводили посредством электропорации после отмьшки осадка культуры, находящейся в среднелогарифмической фазе роста в растворе следующего состава: 0,5 М маннит, 1 мМ цитрат аммония, рН 6,0. Электропорацию клеток проводили в приборе GenePulser (BioRad) со следующими настройками: 2,4 кВ, 25 мкФ, 200 Ом, межэлектродное расстояние 2 мм.

Изучение продукции рекомбинантных белков FGF-2 и ИЛ-10 в трансформированных штаммах бифидобактерий проводили путем иммуноблот-анализа концентрированных супернатантов ночных культур. Иммунодетекцию проводили с использованием козьих поликлональных антител к белкам FGF-2 (кат. Лг° SC-1390, SantaCrus) и ИЛ-10 (кат № аЫ0775, Abeam) человека и вторичных кроличьих антииммуноглобулиновых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (кат. № SC-2768, SantaCrus) Визуализацию проводили хемилюминесцентным методом с использованием в качестве субстратов люминола, п-кумаровой кислоты и пероксида водорода. Экспозицию выполняли на рентгеновсокой пленке Kodak Retina. Продукцию рекомбинантной а-амилазы изучали при помощи йодного теста на культурах бифидобактерий, выращенных на плотной питательной среде с крахмалом. Изучение экспрессии мРНК FGF2 в трансформированных культурах бифидобактерий проводили с использованием методики ОТ-ПЦР в режиме реального времени с интеркалирующим красителем EvaGreen на приборе АНК-32 (Синтол).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Поиск плазмидных ДНК в штаммах бифидобактерий

Для поиска плазмид в бифидобактериях была использована коллекция из 85 штаммов бифидобактерий, выделенных ранее от здоровых детей в возрасте от 6 до 18 месяцев на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. В ходе исследования среди данных штаммов было обнаружено 15 штаммов-носителей плазмид (17,6%) с молекулярной массой от 3,5 до 5,2 т.пн. (Рис. 1). Видовое распределение плазмидных штаммов было следующим: 8 принадлежало к группе Bifidobacterium longum/infantis, 4 относилось к виду В. bifidum, 2 к В. breve, а один изолят был идентифицирован как

представитель группы В. сшепи1ашт/р5еи<10са1епи1ашт. Рестрикционный анализ обнаруженных плазмид показал, что часть молекул являются членами двух консервативных семейств (8 — членами семейства рВ80/рЮ50, 2 — семейства рВ44/рЮ36). Оставшиеся 5 плазмид по рестрикционным картинам оказались не родственны между собой. Для дальнейшего изучения были выбраны плазмиды рВ80 (член консервативного семейства из 8 молекул) и рВ21а (наиболее крупная из выделенных плазмид).

Kb 123456789 10

Рис. X. Плазмндные ДНК из штаммов бифидобактерий. Дорожки 1 и 10 - маркер молекулярных масс Supercoiled DNA ladder («Invitrogen»); дорожка 2 - В. longum В22; дорожки 3 и 5 В. breve В21а; дорожка 4 - В. longum В6; дорожка 6 - B.bifidum В80; дорожка 7 - В. catenulatum В63; дорожка 8 - В. longum В1 (плазмидная ДНК отсутствует); дорожка 9 -плазмидный вектор pBhiescriptll KS- (положительный контроль).

Анализ нуклеотидиых последовательностей плазмид бифидобактерий рВ80 и рВ21а

Определение полной нуклеотидной последовательности рВ80 показало, что эта кольцевая молекула длиной 4898 п.н. (Рис. 2) почти на 98% идентична ранее охарактеризованной гшазмидс pKJ50 из штамма Bifidobacterium longum KJ [M.S. Park и другие, 1999]. Как и ее близкий гомолог, плазмида несет 3 открытые рамки считывания (ORF1, ORF2 и ORF3), кодирующие гипотетические белки RepA (34,4 кДа), МоЬА (42,1 кДа) и MembA (24,7 кДа). Несмотря на высокую степень гомологии нуклеотидных последовательностей, наличие нескольких точковых фрейм-шифт мутаций и одной протяженной делеции (68 п.н.) снижает сходство предсказанных аминокислотных последовательностей белков RepA и МоЬА с их гомологами у pKJ50 до уровня 84% и 75% соответственно.

ВшпН1 (2)

/ *

I рВ80 |

| 4898 ьР I

ОР^З тоЬА

ВатНТ (2337)

ХрпКО

ОЯР4 теш

Ог!Р2 ЙзК

СЖР8

01^1 гер

Рис. 2. Структура плазмид рВ80 и рВ21а. гер, герА - гены репликаз; тетЬА — ген, гипотетического мембранного белка; тоЬА — ген предполагаемой релаксазы, участвующей в мобилизации; /иК— ген гипотетического конъюгативного протеина; тет - ген, трансляционно сцепленный с /¡¡К и кодирующий гипотетический трансмембранный белок.

Гипотетический белок ЯерА имеет многие черты первичной структуры, характерные для белков-инициаторов репликации по механизму «катящегося кольца». Более того, ранее было экспериментально показано присутствие в цитоплазме клеток В. 1оп§шп Ы одноцепочечных форм плазмиды рЮ50, что также свидетельствует в пользу репликации плазмид семейства рВ80/рЮ50 по такому механизму. Присутствие на плазмиде гена гипотетической релаксазы

Mob указывает на ее вероятную способность к мобилизации при наличии в той же бактериальной клетке остальных необходимых генов rra-оперона (в rrans-положении) [Е. Grohmann и другие, 2003] В то же время, до настоящего момента не получено экспериментальных свидетельств существования конъюгации у рода Bifidobacterium.

Гипотетический белок MembA характеризуется кислыми свойствами (pi = 5,1) и наличием трансмембраниого гидрофобного альфа-спирализованного домена В отличие от двух других полипептидов, кодируемых плазмидами pB80/pKJ50 данный белок не имеет функционально охарактеризованных гомологов

Анализ полной нуклеотидной последовательности (5206 пн) плазмиды рВ21а (Рис 2) показал, что, в отличие от плазмиды pBSO, данная молекула не имеет близких гомологов в базах данных. В то же время общая организация данной шшмидной ДНК сходна с таковой у плазмиды pCIBbl, выделенной из В breve [К O'Riordan и G F. Fitzgerald, 1999], и у недавно описанной плазмиды pASV479, выделенной из В pseudolongum subsp. globosum [A Sangrador-Vegas и другие, 2007] Плазмида рВ21а несет не менее 6 открытых рамок считывания

Одна из открытых рамок считывания плазмиды рВ21а, ORF1, кодирует белок Rep (53,2 кДа), содержащий три консервативных домена, характерных для белков - инициаторов репликации по механизму «катящегося кольца». Данный протеин обладает значимой степенью гомологии с Rep-белком, кодируемым плазмидой pCIBbl (36%), а также с Rep-белком плазмиды pASV479

Открытая рамка считывания ORF2 плазмиды рВ21а потенциально кодирует белок с молекулярной массой 31,7 кДа, обладающий значительной гомологией по первичной структуре с целым рядом белков семейств FtsK/SpoIIIE и имеющий в своем составе консервативные домены, присущие семейству белков Тга, участвующих в процессе конъюгативного переноса ДНК по необычному механизму, характерному лишь для бактерий рода Streptomyces.

В отличие от хорошо изученного «классического» пути, требующего присутствия множества генных продуктов и переносящего ДНК между клетками в виде одноцепочечной линейной формы, конъюгативный аппарат стрептомицетов основан на функции лишь одного белка - Тга, способного осуществлять мобилизацию и интермицелиальный перенос плазмидных ДНК [Е. Grohmann и другие, 2003] Кроме того, у стрептомицетов описано явление мобилизации хромосомных генетических маркеров (chromosome mobilizing activity, Ста), также зависящее от белка Тга [G S Pettis и S N Cohen, 2001]. Считается, что мономеры

белка Тга способны к олигомсризадии и образованию кольцеподобных структур, окружающих интактные двуцепочечные ДНК и направляющих га транспорт сквозь мембраны и клеточные стенки из донорских в реципиентные гифы.

Кроме того ближайшими гомологами продукта открытой рамки считывания ORF2, названного нами FtsK, являются одноименный белок, кодируемый плазмидой pCIBbl (63% гомологии) и FtsK-подобный белок, кодируемый плазмидой pASV479 (61% гомологии). Помимо этого, некоторой степенью родства с данным белком обладает Тга-белок, кодируемый плазмидой р4М из В pseudocatenulatum (23% гомологии) [M.J. Gibbs и другие, 2006]. Наличие гомологии первичной структуры гипотетических белков FtsK/Tra, кодируемых плазмидами рВ21а, pCIBbl, pASV479 и р4М, с белками Тга стрептомицетов, а также присутствие в их структуре консервативных мотивов Walker А и Walker В, гидрофобного трансмембранного сегмента и менее консервативного мотива RAAG свидетельствует о высокой вероятности участия данного семейства белков в процессе конъюгации.

Межгенная спейсерная область ftsK-rep плазмид рВ21а, pCIBbl и pASV479 содержит многочисленные повторы и элементы вторичной структуры ДНК, в том числе совершенные и несовершенные инвертированные повторы, а также многочисленные короткие прямые повторы. Эта область характеризуется довольно высокой консервативностью у всех трех плазмид и определенной степенью гомологии с охарактеризованным сй-элементом Streptomyces, играющим роль eis-локуса, необходимого для осуществления мобилизации плазмидной ДНК по Streptomyces-механизму [J. Reuther и другие, 20061

Остальные открытые рамки считывания, расположенные на плазмиде рВ21а, охарактеризованы менее четко Так, ORF3 кодирует гипотетический белок (17,5 кДа), имеющий в составе своей первичной структуры НТН-мотив и обладающий небольшим уровнем сходства с транскрипционными регуляторами семейств LysR и AraC/XylS. Полипептид Mem, кодируемый ORF4 (21,4 кДа), характеризуется наличием не менее двух трансмембранных гидрофобных а-егшрализованных сегментов и гипотетически может являться трансмембранным белком.

Получение челночных клонирующих векторов Е. coli - Bifidobacterium

Предсказание структуры репликонов в охарактеризованных ками плазмидах рВ80 и рВ21а позволило сконструировать серию челночных клонирующих векторов Е coli -

Bifidobacterium. Данные рекомбинантные плазмиды включают в себя высококопийный ориджин репликации Е. coli ColEl, ген резистентности к ампициллину Ыа и ВатШ-рестриктный фрагмент плазмиды рВ80 размером 2564 п.н., содержащий ген репликазы герА и предсказанный двуцепочечный ориджин репликации dso. В связи с тем, что ген fS-лактамазы Ыа кишечной палочки неактивен в грамположительных бактериях, для обеспечения селекции сконструированных векторов в бифидобактериях в них были внедрены гены егу!94 и catl94, обеспечивающие устойчивость к эритромицину и хлорамфениколу соответственно [S. Horinouchi и В. Weisblum, 1982] (Рис. 3).

Рис. 3. Строение челночного клонирующего вектора Е. coli - Bifidobacterium pCESH80. catJ94 — ген резистентности к хлормафениколу; bla — ген ¡З-лактамазы; герА — ген реликазы плазмиды рВ80; f 1 — ориджин репликации фага fl; pUC — ориджин репликации плазмиды pUC19. Вектор pEESH80 отличается заменой гена cat!94 на егу194.

Полученные плазмиды pEESH80 и pCESHSO обладали способностью трансформировать реципиентный штамм Bifidobacterium breve UCC2003 с частотой ЮМО4 КОЕ/мкг ДНК, что подтверждалось путем определения плазмидных профилей трансформированных клоков (Рис. 4).

Определение сегрегационной стабильности плазмиды pEESH80 показало, что данный вектор обладает 100%-ной стабильностью наследования при культивировании

fstU- 9)

ВатШ (2954)

трансформированного штамма В. breve на протяжении 100 генераций в неселективной питательной среде при 37"С. В то же время инкубация при температуре 42UC приводила к резкой потере стабильности плазмиды до уровня <1%. Тот же уровень стабильности при 42°С был характерен и для контрольного вектора pSUW64/123, однако данная плазмида, в отличие от pEESH80, обладала лишь 21 %-ной стабильностью сегрегации и при 37°С на протяжении ¡00 генераций.

КЬ 1 2 3 4 5

Рис 4. Определение плазмидных профилей штаммов-дериватов В. breve UCC2003, трансформированных плазмидами pSUW64/123 (дорожки 2 и 3) и pEESH80 (дорожки 4 и 5); дорожка 1 - маркер молекулярных масс Supercoiled DNA ladder (Invitrogen)

Для дальнейшего улучшения свойств клонирующего вектора pEESH80 нами была предпринята попытка уменьшить размер данной плазмиды за счет удаления неэссенциальных компонентнов. С этой целью из вектора был удален рестриктный фрагмент ВатШ- £amll05I, содержащий ген Ыа и ориджин fl. Полученный вектор pESH83 имеет размер всего лишь 4900 п.н., что существенно меньше, чем у большинства других описанных на сегодняшний день челночных клонирующих векторов Е. coli — Bifidobacterium.

Использование челночных векторов Е. coli — Bifidobacterium для экспрессии гетерологичных генов в клетках В. breve UCC2003

В качестве модельных гетерологичных генов для клонирования в вектора pEESH80/pCESH80 и изучения функциональности последних нами были выбраны: 1) синтетический ген, кодирующий основной фактор роста фибробластов человека (FGF-2); 2) ген атуВ В. adolescentis, кодирующий а-амилазу; 3) кДНК гена IL10 человека, кодирующего интерлейюш-10.

На первом этапе из рестриктных фрагментов и ПЦР-амплифицированных последовательностей были собраны две экспрессирукнцие кассеты, содержащие ген FGF2, трансляционно слитый с последовательностью, кодирующей секреторный сигнальный пептид Sec2 из В. breve [L.E. MacConaill и другие, 2003]. Для обеспечения адекватной экспрессии данной химерной конструкции, она была помещена под контроль конститутивно-активных промоторов генов hup (гистоноподобный белок HU [A. Takeuchi и другие, 2002]) либо gap (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа), а также транскрипционного терминатора гена hup (Рис. 5).

Крп\ Neo I A/del ВатН I EcoR\

Р hup Sec2 FGF2 Т hup

Крп\ Nco\ Nde\ SamHI fcoRI

Рдар Sec2 FGF2 T hup

Рис. 5. Схема строения экспрессирующих кассет с химерным геном sec2- FGF2 в плазмидах pESH46 и pESH86 (А), а также в плазмидах pESH47 и pESH87 (Б). Phup — промотор гена hup В. longum, Pgap — промотор гена gap В. longum, Sec2 — фрагмент гена sec2 В. breve, кодирующий сигнальный пептид. Ломанной стрелкой отмечена точка начала транскрипции.

Путем клонирования данных кассет в челночные вектора Bifidobacterium — Е. coli были получены две серии экспрессирующих плазмид: 1) плазмиды pESH46 и pESH47 были основаны на существующем векторе pSUW64/123 и содержали промоторы Phup и Pgap соответственно; 2) плазмиды pESH86 и pESH87 были основаны на векторе pEESHSO, но также различались присутствием промоторов Phup и Pgap.

Все четыре полученных плазчиды (pESH46, pESH47, pESH86 и pESH87) были способны трансформировать хозяйский штамм В bre\e UCC2003 Однако культура, трансформированная pESH87, демонстрировала очень медленный рост и фототипическую диссоциацию колоний, что вероятно было связано с токсичностью высокого уровня экспрессии слитного белка Sec2-FGF2 В результате этого, штамм, трансформированный pESH87, был исключен из дальнейшей работы Факт присутствия рекочбинантных плазчид pESH46, pESH47 и pESHSó в трансформированных ими культурах был подтвержден путем постановки ПЦР с праймерами, специфичными в отношении гаы FGF2, а также путем определения плазчидного профиля (Рис 6)

Результаты иммунодетекции FGF2 в супернатантах трансформированных культур приведены на Рис. 6 Наиболее высокий уровень экспрессии растворимой иммунореактивности FGF2 определялся в культуре, трансформированной плазмидой pESH86, в то время как в случае со штаммом, трансформированным pESH46, выявлялась лишь слабая полоса Часть илмунореактивности в супернатанте штамма В. breve UCC2003 [pESHSó] располагалась в зоне предсказатгой молекулярной массы процессированного слитного белка Sec2-FGF2 (19 кДа) В это же время во всех образцах выявлялась полоса с меньшей молекулярной массой (14 кДа), возможно появившаяся в результате аберрантной терминации трансляции либо посттрансляционной деградации слитного белка

Известно, что основной фактор роста фибробластов обладает мощным митогенным воздействием на зндотелиальные клетки микрососудов Таким образом, штаммы-продуценты bFGF потенциально могут быть использованы в качестве биотерапевтических препаратов для лечения целого ряда патологических состояний кишечника, таких как неспецифический язвенный колит и постлучевой гастроинтестинальный синдром [Т. Kojima и другие, 2007; F. Paris и другие, 2001]

С целью получения вектора для экспрессии а-амилазы в Bifidobacterium breve была произведена замена последовательности, кодирующей FGF-2 в векторе pESH86, на ПЦР-амплифицированный ген атуВ, лишенный собственного сигнального пептида. В результате этого, ген а-амилазы В. adolescentis был поставлен под контроль промотора hup и сигнального пептида Sec2. Полученная плазмида pESH90 обладала способностью к стабильной трансформации реципиентного штамма В. breve UCC2003 Изучение амилазной активности штамма UCC2003 [pESH90] и исходного штамма UCC2003 чашечным методом показало, что исходный штамм обладает небольшой амилазной активностью, в то время как

вокруг колоний трансформированного штамма видны значительные зоны просветления среды (Рис 7).

1 23456789 10

■ 372 bp

2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7

mm-.—19 kDa leüWií—14 kDa

Рис. 6. Подтверждение трансформации штамма В. breve UCC20Q3 экспрессирующнми векторами pESH46, pESH47, pESH86 и определение экспрессии белка Sec2-FGF2 в этих штаммах методом иммуноблоттинга. А - подтверждение трансформации штамма В. brex'e UCC2003 методом ПЦР с праймерами FGF-F и FGF-R; дорожки 1-3 - трансформация вектором pESH46; дорожки 4-6 - трансформация вектором pESH47; дорожки 7-9 трансформация вектором pESH86; дорожка 10 - исходный штамм. Б -выделение рекомбинантных плазмид из дериватов штамма В. breve UCC2003, трансформированных pESH86 (дорожки 2-4), pESH46 (дорожка 5) и pESH47 (дорожка 6); дорожка 1 - маркер молекулярных масс Supercoiled DNA ladder (Invitrogen). В - выявление присутствия белка FGF2 в концентрированных супернатантах трансформированных культур 8. breve методом иммуноблоттинга; дорожки 1 и 2 - штамм, трансформированный pESH46; дорожки 3 и 4 - штамм, трансформированный pESH47; дорожки 5 и 6 -

нетрансформированный штамм; дорожки 7 и 8 - штамм, трансформированный pESH86.

Рис. 7. Выявление амилазной активности в штамме В. breve UCC2003, трансформированном плазмидой pESH90 (сектора 1 и 2), и в исходном штамме UCC2003

(сектор 3).

Искусственное введение гена амилазы в пробиотические штаммы бифидобактерий способно повысить их терапевтическое значение и улучшить производственные свойства. Кроме этого, ген атуВ обладает определенным потенциалом в качестве селективного маркерного гена для конструирования челночных векторов категории «food-grade».

Для получения бифидобактерий — продуцентов интерлейкина-Ю человека было проведено замещение последовательностей, кодирующих FGF-2 в векторах pESH86 и pESH87, на ПЦР-амплифицированный фрагмент кДНК гена IL10 человека, кодирующий зрелый цолноразмерный полипептид ИЛ-10. Полученные в результате этой манипуляции плазмиды были названы pESH92 и pESH93 соответственно. Оба вектора обладали способностью к трансформации штамма В. breve UCC2003, что подтверждалось результатами ПДР с праймерами к гену ИЛ-10, а также результатами определения плазмидных профилей трансформированных штаммов.

Для изучения экспрессии рекомбинантного ИЛ-10 в супернатантах культур трансформированных штаммов бифидобактерий был применен метод иммуноблоттинга. Результаты иммунодетекции представлены на Рис. 8. Сравнение молекулярных масс,

соответствующих окрашенным зонам свидетельствует о присутствии в супернатанте ночной культуры как полноразмерной зрелой формы белка с молекулярной массой 20 кДа, так и полипептидов с меньшими молекулярными массами (14 кДа и менее), появление которых может быть связано как с аберрантной трансляцией, так и с посттрансляционной протеолитической деградацией исходного полипептида. Кроме того, нельзя исключить и вероятность неферментативного гидролиза ИЛ-10 в кислой среде бактериальной культуры, что было описано ранее [Ь. Бге^сИег и другие, 20001.

Рис. 8. Выявление белка ИЛ-10 в концентрированных супсрнатантах трансформированных культур В. breve методом иммуноблоттинга. дорожка 1 - штамм, трансформированный pESH92; дорожка 2 - штамм, трансформированный pESH93; дорожка 3 - ^трансформированный штамм В. breve UCC2003.

Ранее была показана высокая эффективность данного цитокина для лечения различных воспалительных заболеваний кишечника, таких как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона [М.С. Li и другие, 2004]. В этой связи, предпринимаются попытки разработки пробиотических штаммов — продуцентов ИЛ-10, которые после введения в желудочно-кишечный тракт способны продуцировать данный цитокив непосредстенно в очаге поражения [L. Steidler и другие, 2000]. Таким образом, разработка штаммов бифидобактерий — продуцентов терапевтического интерлейкина-10 несомненно актуальна, а созданная нами векторная система может послужить основной для получения промышленного штамма уже в ближайшем будущем.

выводы

1 Бифидобактерии, колонизирующие толстый кишечник детей раннего возраста, с высокой частотой (17,6%) являются носителями плазмидных ДНК

2 Значительная часть плазмид бифидобактерий представляют собой небольшие хриптические молекулы, реплицирующиеся по механизму катящегося кольца и относящиеся к двум консервативным семействам (pB80/pKJ50 и pB44/pKJ36)

3 Ппазмиды рВ80 и рВ21а, выделенные из штаммов В bifidum В80 и В breve В21а потенциально способны к мобилизации гаи самостоятельному коныогативному переносу, в том числе и по уникальному стрептомицет-подобному мехашпму

4 Сконструированные челночные клонирующие вектора Е toll - Bifidobacterium pEESH80, pCESHSO и pESH83 способны с относительно высокой эффективностью трансформировать реципиентный штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve UCC2003

5 Клонирование гетерологичных генов FGF2, ILIO и атуВ совместно с гомологичными регуляторными элементами бифидобактерий (промоторами Fhup и Рgap, терминатором Тhup, последовательностью сигнального пептида sec2) в разработанные нами векторные плазмиды позволяет получать штаммы бифидобактерий — продуценты рекомбинантных белков с ценными терапевтическими свойствами.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хромова С.С., Ефимов Б А, Тарабрина H П., Шкопоров А Н., Кафарская Л И., Сепиашвнли Я Р. Иммунорегуляция в системе микрофлора — интестинальный тракт // Аллергология и иммунология, 2004, Т 5, № 2 - С. 265-271 2 Хромова С С , Шкопоров А.Н., Ефимов Б А , Тарабрина H П , Черная З.А , Кафарская ЛИ. Микрофлора кишечника и механизмы иммунорегуляции // Вопросы детской диетологии, 2005, Т 3, № 1 - С. 92-96 3. Донских Е Е, Шкопоров А Н., Постникова Е А., Ван Ликуй, Кафарская Л И Молекулярный мониторинг микрофлоры кишечника недоношенных новорожденных // Материалы Четвертого конгресса педиатров-инфекционистов России - Москва, 2005.-С. 66-67.

4. Шкопоров A.II, Хохлова ЕВ, Кафарская ЛИ, Ефимов Б.А. Изучение видового состава бифидобактерий в толстой кишке у детей раннего возраста // Материалы Четвертого конгресса педиатров-инфекционистов России.- Москва, 2005.- С. 201.

5. Shkoporov A.N., Efimov В.А., Khokhlova E.V., Podoprigora G.I., Kafarskaya L.I. Molecular characterization of 84 Bifidobacterium spp. isolates cultured from human infant feces II Материалы конгресса «The 8th Biennial Congress of the Anaerobe Society of the Americas».- Boise, 2006.- P 82.

6 Шкопоров A.H, Хохлова E В. Молекулярная идентификация изолятов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей раннего возраста // Материалы I Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции - Москва, 2006.- С. 443-444

7. Кафарская Л.И., Володин Н.Н, Ефимов Б А., Афанасьев С.С., Шкопоров А.Н. Особенности микробной колонизации кишечника новорожденных и недоношенных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии // Вестник РАМН, 2006, № 1 -С. 10-15.

8. Шкопоров А.Н., Кафарская ЛИ., Афанасьев С.С., Смеянов В.В., Кириллов М.Ю., Постникова Е.А., Максимов Ф.Е., Хохлова Е.В., Ефимов Б.А. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста // Вестник РАМН, 2006, № 1,- С. 45-50.

9. Shkoporov A.N., Efimov В.А., Khokhlova E.V., Smeianov V.V., Kafarskaia L.I. Application of several molecular techniques to study dominant Bifidobacterium spp. strains in healthy children // Материалы международного симпозиума «Proplonibacteria and Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications».- Wadahl, 2007,- P. 88.

10. Shkoporov A.N., Efimov B.A, Khokhlova E.V, Steele J.L, Kafarskaia L.I., Smeianov V.V. Characterization of plasmid DNAs from human infant Bifidobacterium strains: sequence analysis and construction of E. coli-Bifidobacterium shuttle vectors // Материалы международного симпозиума «Propionibacteria and Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications».- Wadahl, 2007,- P. 25.

11. Шкопоров A.H., Смеянов В В , Ефимов Б.А., Хохлова Е В., Кафарская Л.И Изучение плазмидных ДНК в штаммах бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей: анализ нуклеотидной последовательности и конструирование челночных клонирующих векторов // Сборник тезисов докладов к международному конгрессу

«Пробиотики, пребиотнкн, синбиотики и функциональные продукты питания Фундаментальные и 7члинические аспекты» - Санкт-Петербург, 2007 - С. 77

12 Шкопоров АН, Ефимов Б.А, Хохлова ЕВ, Кулагина ЕВ., Кафарская ЛИ Использование комбинации молекулярно-генетических методов для изучения доминантных штаммов бифидобактернй, колонизирующих кишечник здоровых детей // Сборник тезисов докладов к между народному конгрессу «Пробиотики, прсбиогики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» -Санкт-Петербург, 2007.- С 76-77

13. Shkoporov AN, Khokhlova EV, Kulagma EV, Smeianov V.V, Kafarskaia LI, Efimov В A Application of several molecular techniques to study numerically predominant Bifidobacterium spp and Bacteroidales order strains in the feces of healthy children // Biosci Biotechnol Biochem, 2008, № 72.3 - P.-742-748

14 Ефимов Б А., Шкопоров АН, Хохлова ЕВ, Афанасьев СС, Кулагина ЕВ., Кафарская Л И Плазмиды бифидобактернй и их использование в генетической инженерии // Вестник РАМН, 2008, X» 2.- С. 16-21.

15 Shkoporov А N , Efimov В А , Khokhlova E.V., Steele J L , Kafarskaia L.I, Smeianov V V Characterization of plasmids from human infant Bifidobacterium strains sequence analysis and construction of E coh-Biftdobacterium shuttle vectors // Plasimd, 2008, № 60:2 - P. 136-148

16 Shkoporov A N, Efimov В A , Khokhlova E V, Kafarskaia L I, Smeianov V.V. Production of human basic fibroblast growth factor (FGF-2) in Bifidobacterium breve using a series of novel expression/secretion vectors // Biotechnol Lett, 2008, №30:11 - С 1983-1988

17. Шкопоров A H, Хохлова E В , Ефимов Б.А., Кафарская Л И Экспрессия гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) Aequoria victoria в бактериальных клетках Lactobacillus plantarum // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2008, №4 - С. 33-37

18. Kulagina E.V, Shkoporov А N , Donskikh Е.Е, Khokhlova E.V., Kafarskaia LI, Efimov В A Comparative study of species and strain distnbutionof bifidobacteria in the feces of breast-fed infants and thier mothers // Материалы конгресса «The 9th Biennial Congress of the Anaerobe Society of the Americas» - Long Beach, 2008 - P. 27.

Шкопоров Андрей Николаевич (Россия) «Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения» Изучено содержание плазмидных ДНК в коллекции штаммов бифидобактерий, выделенных от здоровых детей. Для двух из пятнадцати обнаруженных плазмид (рВ21а и рВ80) были определены и тщательно проанализированы полные нуклеотидные последовательности. Выявлено присутствие генов, гипотетические продукты которых могут обеспечивать автономную репликацию указанных плазмид по механизму «катящегося кольца», мобилизацию и конъюгативный перенос плазмид, в том числе и по уникальному Streptomyces-попобнощ механизму, а также ряда генов, чье функциональное значение остается неясным. Репликон плазмиды рВ80 был использован для получения серии челночных клонирующих векторов Е. coli — Bifidobacterium, содержащих регуляторные элементы для обеспечения эффективной транскрипции и трансляции клонированных гетерологичных генов. Функциональность сконструированных векторных систем была подтверждена в ходе получения штаммов Bifidobacterium breve — продуцентов фактора роста фибробластов человека, интерлейкина-10 человека и а-амилазы Bifidobacterium adolescentis.

Shkoporov Andrei Nikolaevitch (Russia) Development of methods for genetic modification of bifidobacteria and creation of novel

probiotics.

Content of plasmid DNAs in the collection of Bifidobacterium strains isolated from infant feces was studied Two out of fifteen found plasmids (pB21a and pB80) were sequenced to completion and analyzed extensively. Among the putative products of the detected open reading frames were found homologs to "rolling circle" replication proteins, DNA mobilization proteins, including unique Streptomyces-Ше conjugative transfer factors, and other conserved proteins which functions remain unclear. The predicted replicón of plasmid pB80 was used to construct a series of E. coli - Bifidobacterium shuttle cloning vectors, harboring regulatory DNA elements which enable efficient transcription and translation of cloned heterologous genes. Functionality of these vectors was confirmed by using them to create Bifidobactium breve strains which produce and secrete human FGF-2, human IL-10, and В adolescentis a-amylase.

Подписано в печать 10 11 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 1156 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Шкопоров, Андрей Николаевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Введение '

1.2 Роль и место бактерий рода

Bifidobacterium в микробиоценозе кишечника

1.3 Прикладное значение бифидобактерий

1.4 Плазмиды у бифидобактерий

1.5 Создание челночных клонирующих векторов для бифидобактерий

1.6 Направления прикладных генно-инженерных исследований с применением бифидобактерий

1.7 Регуляторные генетические элементы, необходимые для экспрессии гетерологичных генов в бифидобактериях

1.8 Изучение секретируемых белков и белковых адгезинов у бифидобактерий

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Культивирование штаммов бактерий

2.2 Молекулярно-биологические и биохимические методы

2.2.1 Выделение геномной ДНК из бактериальных и тканевых культур

2.2.2 Выделение плазмидных ДНК

2.2.3 Синтез ДНК-олигонуклеотидов

2.2.4 Полимеразная цепная реакция

2.2.5 Обработка ДНК ферментами нуклеинового обмена

2.2.6 Секвенирование плазмидных ДНК

2.2.7 Трансформация бактериальных штаммов

2.2.8 Выделение тотальной РНК из бифидобактерий

2.2.9 Обратная транскрипция и ОТ-ПЦР в режиме реального времени

2.2.10 Электрофорез нуклеиновых кислот

2.2.11 Выделение секретируемых белков бифидобактерий и иммуноблоттинг

2.3 Специальные биохимические методы

2.3.1 Видовая идентификация изолятов бифидобактерий методом секвенирования фрагмента гена 16S рРНК

2.3.2 Секвенирование плазмид, выделенных из штаммов бифидобактерий

2.4 Методы биоинформатики и компьютерной обработки данных

Глава 3. Собственные результаты

3.1 Поиск плазмидных ДНК в штаммах бифидобактерий

3.2 Определение полной нуклеотидной последовательности плазмид рВ80 и рВ21 а

3.3 Анализ нуклеотидных последовательностей плазмид рВ80 и рВ21а

3.4 Конструирование челночных клонирующих векторов

Е. coli - Bifidobacterium

3.5 Рекомбинантная экспрессия гена фактора роста фибробластов (FGF2) человека в клетках В. breve

3.6 Рекомбинантная экспрессия гена ос-амилазы

В. adolescentis в клетках В. breve

3.7 Рекомбинантная экспрессия гена интерлейкина-10 (ILI0) человека в клетках В. breve

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения"

Актуальность

Бифидобактерии - род грамположительных неспорообразуюпщх анаэробных бактерий, являющихся облигатными обитателями желудочно-кишечного тракта человека и многих видов животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. В подавляющем большинстве случаев бифидобактерии находятся в тесных мутуалистических отношениях с организмом хозяина, а разрыв такой симбиотической связи грозит нарушением нормальной физиологии интестинального тракта последнего. Длительная симбиотическая коэволюция бифидобактерий и человека привела к формированию у данного рода микроорганизмов большого количества взаимовыгодных адаптаций, благотворно влияющих на жизнедеятельность макроорганизма хозяина. Среди таких свойств наиболее значимы: активная и пассивная колонизационная резистентность, направленная на предотвращение заселения желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микробами, участие в катаболических и биосинтетических процессах в кишечной трубке и иммуномодулирующее влияние [М.С. Collado и другие, 2005; A. Pompei и другие, 2007; Н. Tanaka и другие, 2000; F. Backhed и М. Hornef, 2003].

Позитивные пробиотические свойства бифидобактерий с успехом использует как медицииа, так и пищевая промышленность. В пашей стране был создан целый ряд биотерапевтических препаратов, имеющих в своем составе живые культуры бифидобактерий и широко применяющихся для лечения широкого круга гастроэнтерологических заболеваний [Г.И. Гончарова, 1982; Б.А. Ефимов и В.М. Коршунов, 1992; С.Н. Барзашка-Попова, 1990]. Бифидобактерии находят все большую популярность' как компоненты разнообразных кисломолочных продуктов и продуктов функционального питания.

Благодаря своему общепризнанному благотворному влиянию на физиологию как интестинального тракта, так и всего организма человека в целом бифидобактерии стали объектом многочисленных исследований. Однако до недавнего времени существовали лишь отрывочные сведения о молекулярной биологии и генетике данного рода бактерии. Значительный прогресс в изучении тонких молекулярных свойств бифидобактерий наметился на рубеже XX и XXI вв. Последние годы ознаменовались завершением секвенирования геномов нескольких видов бифидобактерий [М.А. Schell и другие, 2002] и публикацией значительного числа работ, посвященных вопросам их молекулярной физиологии и молекулярных механизмов взаимодействия с организмом хозяина [М. Ventura и другие. 2005;

A. Margolles и другие, 2006; J. De Dea Lindner и другие, 2007].

Отдельной важной темой является изучение плазмид и мобильных генетических элементов бифидобактерий [Б.А. Ефимов и другие, 2008]. Включение в инструментарий исследователя подобных генетических элементов позволяет от описательной генетики перейти к экспериментальной, базирующейся на методологии генетической инженерии. Вместе с тем, расширение наших знаний о генетике этого рода прокариот и разработка методов генетического манипулирования ими позволит уже в ближайшем будущем направленно создавать пробиотические и биотерапевтические штаммы с принципиально новыми свойствами. В частности, это сделает возможным получение рекомбинантных штаммов-продуцентов белковых, нуклеиновых или иных молекул с терапевтическими свойствами.

Цель настоящего исследования

Разработать оригинальный инструментарий и методологию, необходимые для осуществления простой и эффективной генетической модификации бифидобактерий и последующей продукции в них гетерологичпых белков с терапевтическими свойсгвами (цитокинов, ферментов, вакцинных антигенов и пр.).

Задачи исследования:

3. На основе описанных плазмид создать челночные клонирующие вектора Bifidobacterium-E. coli, позволяющие доставлять гетерологичные гены в клетки бифидобактерий;

Научная новизна

В ходе настоящего исследования впервые было проведено изучение плазмидных профилей в индигенных штаммах бифидобактерий, выделенных от детей раннего возраста. Обнаружена существенная частота встречаемости плазмидных ДНК в бифидобактериях различных видов и выявлено доминирование ограниченного числа консервативных семейств таких плазмид в популяциях бифидобактерий. Определены и аннотированы полные нуклеотидные последовательности двух новых плазмид, в числе которых одна - первая полностью просеквенированная плазмида из бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, вторая - плазмида с нетипичным для бифидобактерий генным составом, напоминающая некоторые конъюгативные плазмиды бактерий рода Streptomyces.

Продемонстрировано присутствие на описанных плазмидах генов, вовлеченных в процесс конъюгативного переноса данных молекул ДНК. Отдельный интерес представляет присутствие на одной из плазмид набора генов tra необходимых и достаточных, по всей видимости, для осуществления конъюгативного переноса данной плазмиды по уникальному схрептомицет-подобному механизму.

На основе изученных плазмид создана серия челночных клонирующих векторов Е. coli -Bifidobacterium, способных к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток и несущих соответствующие селективные маркерные гены для селекции в них. Продемонстрирована способность большей части полученных векторов к трансформации бифидобактерий вида Bifidobacterium breve с относительно высокой эффективностью.

Сконструированы экспрессирующие челночные вектора, несущие необходимые регуляторные элементы для обеспечения экспрессии гегерологичных генов в бифидобактериях. Функциональность полученных плазмидных векторов была подтверждена при помощи трех модельных генов - FGF2 человека, IL10 человека и атуВ Bifidobacterium adolescentis. Кроме того, в случае с генами FGF2 и IL10, впервые была осуществлена гетерологичная экспрессия человеческого гена в бактериях рода Bifidobacterium.

Практическая значимость работы

Разработанные в ходе настоящего исследования челночные клонирующие вектора Е. coli - Bifidobacterium, а также методы их доставки в клетки Bifidobacterium breve имеют высокую практическую значимость. Данный инструментарий может быть использован для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках бифидобактерий как в рамках фундаментальных исследований, направленных на изучение биологии бифидобактерий, так и в рамках прикладных работ, имеющих целью получение пробиотических или биотерапевтических штаммов бифидобактерий с новыми полезными свойствами.

Полученные нами штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие основной фактор роста фибробластов человека (FGF-2) и интерлейкин-10 человека (ИЛ-10), имеют как демонстрационное, так и самостоятельное прикладное значение. С учетом последних данных о возможности использования белков FGF-2 и ИЛ-10 для лечения различных тяжелых заболеваний желудочно-кишечного тракта, указанные штаммы-продуценты могут стать прообразами принципиально новых биогерапевтических штаммов, полученных с использованием методов генетической инженерии.

Разработанные нами векторные системы, в комбинации с клонированным геном осамилазы атуВ Bifidobacterium adolescentis, могут лечь в основу нового поколения безопасных клонирующих векторов для бифидобактерий, соответствующих стандарту «food-grade», полностью лишенных потенциально-опасных фрагментов ДНК и пригодных для получения рекомбинантных пробиотических и биотерапевтических штаммов бифидобактерий.

Апробация работы

Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 12 марта 2008 года, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова в 2006 и 2007 годах, а также на международном симпозиуме «Propionibacteria and Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications» (Wadahl, 2007).

Положения выносимые на защиту:

2. Криптические плазмиды, выделенные из кишечных штаммов бифидобактерий, могут быть использованы для создания челночных клонирующих векторов Bifidobacterium — E.coli, обеспечивающих возможность проведения генетической трансформации бифидобактерий;

4. Гепетически-трансформированные штаммы бифидобактерий, полученные с использованием описанных челночных векторов, могут стать основой для создания принципиально нового поколения пробиотических и биотерапевтических агентов.

Публикации

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шкопоров, Андрей Николаевич

выводы

1. Бифидобактерии, колонизирующие толстый кишечник детей раннего возраста, с высокой частотой (17,6%) являются носителями плазмидных ДНК.

2. Значительная часть плазмид бифидобактерий представляют собой небольшие критические молекулы, реплицирующиеся по механизму катящегося кольца и относящиеся к двум консервативным семействам (рВ80/рЮ50 и рВ44/рЮ36).

3. Плазмиды рВ80 и рВ21а, выделенные из штаммов В. bifidum В80 и В. breve В21а потенциально способны к мобилизации или самостоятельному конъюгативному переносу, в том числе и по уникальному стрептомицет-подобному механизму.

4. Сконструированные челночные клонирующие вектора Е. coli - Bifidobacterium pEESH80, pCESH80 и pESH83 способны с относительно высокой эффективностью трансформировать реципиентный штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve UCC2003.

5. Клонирование гетерологичных генов FGF2, IL10 и атуВ совместно с гомологичными регуляторными элементами бифидобактерий (промоторами Рhup и Рgap, терминатором Тhup, последовательностью сигнального пептида sec2) в разработанные нами векторные плазмиды позволяет получать штаммы бифидобактерий — продуценты рекомбинантных белков с ценными терапевтическими свойствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шкопоров, Андрей Николаевич, Москва

1. Барзашка-Попова С.Н. Коррекция микрофлоры и местного иммунитета кишечника при дитсбактериозах с помощью лактобацилл. Автореф. дисс. на соискание уч. степени канд. мед. наук. М., 1990.- 24 с.

2. Бондарешсо В.М. Прикладные аспекты молекялярной биологии бифидо- и лактобактерий. Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии. 2006, Март-Апрель; (2):89-97.

3. Володин Н.Н., Коршунов В.М., Гладько И.А., Кафарская Л.И., Сидоров А.А., Ахметова Л.М. Влияние микрофлоры родовых путей беременных на течение периода новорожденности недоношенных детей. Вопросы охраны материнства и детства. 1986,- 31. 3. с. 53-56.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, её защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин. Автореф. дисс. на соискание уч. степени докт. биол. наук. М., 1982.

5. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. Вестник Российской академии медицинских наук. 1996. № 2, с. 60-64.

6. Aires J., Doucet-Populaire F., Butel M.J. Tetracycline resistance mediated by tet(W), tet(M), and tet(O) genes of Bifidobacterium isolates from humans. Appl Environ Microbiol. 2007 Apr;73(8):2751-4. Epub 2007 Feb 16.

7. Altschul S., Madden Т., Schaffer A., Zhang J., Zhang Z„ Miller W„ and Lipman D. 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402

8. Altwegg M. La biotherapie dans la diarrhee. Der Informiete Arz. 1992.- 13. P. 1-16.

9. Alvarez-Martin P., Florez A.B., Mayo B. Screening for plasmids among human bifidobacteria species: Sequencing and analysis of pBCl from Bifidobacterium catenulatum L48. Plasmid. 2007 Mar,57(2): 165-74.

10. Argnani A., Leer R.J., van Luijk N., Pouwels P.H. A convenient and reproducible method to genetically transform bacteria of the genus Bifidobacterium. Microbiology. 1996 Jan;142 ( Pt 1): 109-14.

11. Backhed F., Ilornef M. Toll-like receptor 4-mediated signaling by epithelial surfaces: necessity or threat? Microbes Infect. 2003 Sep;5(ll):951-9.

12. Barbara G., Xing Z., Hogaboam C.M., Gauldie J., Collins S.M. Interleukin 10 gene transfer prevents experimental colitis in rats. Gut. 2000 Mar;46(3):344-9.

13. Bassam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting of bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 1992 Oct;38(l):70-6.

14. Belury M.A. Inhibition of carcinogenesis by conjugated linoleic acid: potential mechanisms of action. J Nutr. 2002 Oct;132(10):2995-8.

15. Bernet M.F., Brassart D., Neeser J.R., Servin A.L. Adhesion of human bifidobacterial strains to cultured human intestinal epithelial cells and inhibition of enteropathogen-cell interactions. Appl Environ Microbiol. 1993 Dec;59(12):4121-8.

16. Birnboim H.C., Doly J., 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. Nov 24;7(6): 1513-23.

17. Blomberg L.A., Henriksson P.L. Conway. Inhibition of adhesion of Escherichia coli K88 to piglet ileal mucus by Lactobacillus spp. Appl Environ Microbiol. 1993. 59: 34-39.

18. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M., van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol.1990 Маг;28(3):495-503.

19. Bourget N., Simonet J.M., Decaris B. Analysis of the genome of the five Bifidobacterium breve strains: plasmid content, pulsed-field gel electrophoresis genome size estimation and rrn loci number. FEMS Microbiol Lett. 1993 Jun l;110(l):ll-20.

20. Buck B.L., Altermann E., Svingerud Т., Klaenhammer T.R. Functional analysis of putative adhesion factors in Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8344-51.

21. Chapman T.M., Plosker G.L., Figgitt D.P. VSL#3 probiotic mixture: a review of its use in chronic inflammatory bowel diseases. Drugs. 2006;66(10): 1371-87.

22. Cohen S.N., Chang A.C., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1972 Aug;69(8):2110-4.

23. Collado M.C., Hernandez M., Sanz Y. Production of bacteriocin-like inhibitory compounds by human fecal Bifidobacterium strains. J Food Prot. 2005 May;68(5): 1034-40.

24. Corneau N., Emond E., LaPointe G., 2004. Molecular characterization of three plasmids from Bifidobacterium longum. Plasmid. Mar;51(2):87-100.

25. Cronin M., Knobel M., O'Connell-Motherway M., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. Molecular dissection of a bifidobacteria! replicon. Appl Environ Microbiol. 2007 Dec;73(24):7858-66.

26. Datta N., Hedges R.W., Shaw E.J., Sykes R.B., Richmond M.H. Properties of an R factor from Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 1971 Dec;108(3): 1244-9.

27. Davies J., Jacob F. Genetic mapping of the regulator and operator genes of the lac operon. J Mol Biol. 1968 Sep 28;36(3):413-7.

28. De Dea Lindner J, Canchaya C, Zhang Z, Neviani E, Fitzgerald GF, van Sinderen D, Ventura M. Exploiting Bifidobacterium genomes: the molecular basis of stress response. Int J Food Microbiol. 2007 Nov 30;120(l-2):13-24. Epub 2007 Jun 14.

29. Del Solar G., Giraldo R., Ruis-Echevarria M.J., Espinosa M., Dias-Orejas R. 1998.

30. Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev June, 62(2): 434-464

31. Dieye Y, Usai S, Clier F, Gruss A, Piard JC. Design of a protein-targeting system for lactic acid bacteria. J Bacteriol. 2001 Jul;183(14):4157-66.

32. Dower WJ, Miller JF, Ragsdale CW. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 1988 Jul ll;16(13):6127-45.

33. Ducote MJ, Prakash S, Pettis GS. Minimal and contributing sequence determinants of the cis-acting locus of transfer (clt) of streptomycete plasmid pUlOl occur within an intrinsically curved plasmid region. J Bacteriol. 2000 Dec;182(23):6834-41.

34. Ferrari FA, Nguyen A, Lang D, Hoch JA. Construction and properties of an integrable plasmid for Bacillus subtilis. J Bacteriol. 1983 Jun;154(3): 1513-5.

35. Fogh J, Wright WC, Loveless JD. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J Natl Cancer Inst. 1977 Feb;58(2):209-14.

36. Fu G.F., Li X., Hou Y.Y., Fan Y.R., Liu W.H., Xu G.X., 2005. Bifidobacterium longum as an oral delivery system of endostatin for gene therapy on solid liver cancer. Cancer Gene Ther. Feb;12(2): 133-40.

37. Fuller R. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 1989. 66: 365-378.

38. Gionchetti P., Rizzello F., Venturi A., Campieri M. Probiotics in infective diarrhoea and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol Hepatol. 2000,15:5, 489-93.

39. Gospodarowicz D. Isolation and characterization of acidic and basic fibroblast growth factor. Methods Enzymol. 1987;147:106-19.

40. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M., Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 2003. 67,277-301.

41. Guglielmetti, S., Karp, M., Mora, D., Tamagnini, I., Parini, C., Molecular characterization of Bifidobacterium longum biovar longum NAL8 plasmids and construction of a novel replicon screening system. Appl Microbiol Biotechnol. 2007. 74, 1053-61.

42. Gunncriusson E, Samuelson P, Uhlen M, Nygren PA, Stahl S. Surface display of a functional single-chain Fv antibody on staphylococci. J Bacteriol. 1996 Mar,178(5): 1341-6.

43. Ilaarman M, Knol J. Quantitative real-time PCR assays to identify and quantify fecal Bifidobacterium species in infants receiving a prcbiotic infant formula. Appl Environ Microbiol. 2005 May;71(5):2318-24.

44. Ilacia JG. Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays. Nat Genet. 1999 Jan;21(l Suppl):42-7.

45. He F, Morita H, Ouwehand AC, Hosoda M, Hiramatsu M, Kurisaki J, Isolauri E, Benno Y, Salminen S. Stimulation of the secretion of pro-inflammatory cytokines by Bifidobacterium strains. Microbiol Immunol. 2002;46(ll):781-5.

46. Heyman M. Effect of a probiotic on the intestinal barrier in a model of allergy to milk proteins of the cow. Arch Pediatr 2000 May 7 Suppl 2: 249s-251s.

47. Hirayama K., Rafter J. The role of probiotic bacteria in cancer prevention. Microbes Infect 2000, 2:6, 681-6.

48. Horinouchi S., Weisblum В., 1982. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J Bacteriol. May, 150(2):815-25

49. Horinouchi S., Weisblum В., 1982. Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin type В antibodies. J Bacteriol, May, 150(2):804-14

50. Ilyina TV, Koonin EV. Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res. 1992 Jul ll;20(13):3279-85.

51. Isolauri E., Joensuu J., Suomalainen H., Luomala M., Vesikari T. Improved immunogenisity of oral D x RRV reasistant rotavirus vaccine by Lactobacillus casei GG. Vaccine. 1995 13,P. 313-312.

52. Ji GE, Han HK, Yun SW, Rhim SL Isolation of amylolytic Bifidobacterium sp. Int-57 and characterization of amylase. J. Microbiol. Biotechnol. (1992) 2: 85-91. ,

53. Kailasapathy K., J. Chin. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol. Cell Biol. 2000.78(l):80-88.

54. Khan SA. Plasmid rolling-circle replication: highlights of two decades of research. Plasmid. 2005 Mar;53(2): 126-36. Epub 2005 Jan 22.

55. Kimura NT, Taniguchi S, Aoki K, Baba T. Selective localization and growth of Bifidobacterium bifidum in mouse tumors following intravenous administration. Cancer Res. 1980 Jun;40(6):2061-8.

56. Kindberg С, Suttie JW, Uchida K, Hirauchi K, Nakao H. Menaquinone production and utilization in germ-free rats after inoculation with specific organisms. J Nutr. 1987 Jun;117(6): 1032-5.

57. Klijn A, Moine D, Delley M, Mercenier A, Arigoni F, Pridmore RD. Construction of a reporter vector for the analysis of Bifidobacterium longum promoters. Appl Environ Microbiol. 2006 Nov;72(ll):7401-5. Epub 2006 Sep 22.

58. Knoerzer W, Binder IIP, Schneider K, Gruss P, McCarthy JE, Risau W. Expression of synthetic genes encoding bovine and human basic fibroblast growth factors (bFGFs) in Escherichia coli. Gene. 1989 Jan 30;75(l):21-30.

59. Kojima T, Watanabe T, Hata K, Nagawa H. Basic fibroblast growth factor enema improves experimental colitis in rats. Hepatogastroenterology. 2007 Jul-Aug;54(77): 1373-7.

60. Kullen MJ, Klaenhammer TR. Genetic modification of intestinal lactobacilli and bifidobacteria. Curr Issues MolBiol. 2000 Apr;2(2):41-50.

61. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.

62. Le Loir Y, Nouaille S, Commissaire J, Bretigny L, Gruss A, Langella P. Signal peptide and propeptide optimization for heterologous protein secretion in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol. 2001 Sep;67(9):4119-27.

63. Lee J.H., O'Sullivan D.J., 2006. Sequence analysis of two cryptic plasmids from Bifidobacterium longum DJOIOA and construction of a shuttle cloning vector. Appl Environ Microbiol. Jan;72(l):527-35.

64. Lee SK, Kim YB, Ji GE. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis. J Appl Microbiol. 1997 Sep;83(3):267-72.

65. Leenhouts, K.J., Kok, J. & Venema, G. 1990. Stability of intergrated plasmids in the chromosome of Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 56: 2726-2735.

66. Lewin B. Genes УШ. 2004. Pearson Prentice Hall. New Jersey.

67. Li MC, He SH. IL-10 and its related cytokines for treatment of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2004 Mar l;10(5):620-5.

68. Lidbeck A, Edlund C, Gustafsson JA, Kager L, Nord CE. Impact of Lactobacillus acidophilus on the normal intestinal microflora after administration of two antimicrobial agents. Infection. 1988;16(6):329-36.

69. Maas RM, Gotz J, Wohlleben W, Muth G. The conjugative plasmid pSG5 from Streptomyces ghanaensis DSM 2932 differs in its transfer functions from other Streptomyces rolling-circle-type plasmids. Microbiology. 1998 Oct; 144 (Pt 10):2809-17.

70. MacConaill LE, Fitzgerald GF, Van Sinderen D. 2003. Investigation of protein export in Bifidobacterium breve UCC2003. Appl Environ Microbiol. Dec;69(12):6994-7001.

71. Maj JG, Paris F, Haimovitz-Friedman A, Venkatraman E, Kolesnick R, Fuks Z. Cancer Res. 2003 Aug 1;63(15):4338-41. Microvascular function regulates intestinal crypt response to radiation.

72. Margolles A, Florez AB, Moreno JA, van Sinderen D, de los Reyes-Gavilan CG. Two membrane proteins from Bifidobacterium breve UCC2003 constitute an ABC-type multidrug transporter. Microbiology. 2006 Dec;152(Pt 12):3497-505.

73. Martin MC, Alonso JC, Suarez JE, Alvarez MA. Generation of food-grade recombinant lactic acid bacterium strains by site-specific recombination. Appl Environ Microbiol. 2000 Jun;66(6):2599-604.

74. Masco L, Huys G, Gevers D, Verbrugghen L, Swings J. Identification of Bifidobacterium species using rep-PCR fingerprinting. Syst Appl Microbiol. 2003 Nov;26(4):557-63.

75. Mathys S, von Ah U, Lacroix C, Staub E, Mini R, Cereghetti T, Meile L. Detection of the pediocin gene pedA in strains from human faeces by real-time PCR and characterization of Pediococcus acidilactici UVA1. BMC Biotechnol. 2007 Sep 12;7:55.

76. Matsuki T, Watanabe K, Fujimoto J, Takada T, Tanaka R. Use of 16S rRNA gene-targetedgroup-specific primers for real-time PCR analysis of predominant bacteria in human feces. Appl Environ Microbiol. 2004 Dec;70(12):7220-8.

77. Matsuki Т., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H., 1999. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers. Appl Environ Microbiol. 0ct;65(10):4506-12.

78. Matsumura H, Takeuchi A, Kano Y. Construction of Escherichia coli-Bifidobacterium longum shuttle vector transforming B. longum 105-A and 108-A. Biosci Biotechnol Biochem. 1997 Jul;61(7):12U-2.

79. Mattarelli P, Biavati B, Alessandrini A, Crociani F, Scardovi V. Characterization of the plasmid pVS809 from Bifidobacterium globosum. New Microbiol. 1994 Oct;17(4):327-31.

80. Mattarelli P, Biavati B, Crociani F, Scardovi V, Prati G. Bifidobacterial cell wall proteins (BIFOP) in Bifidobacterium globosum. Res Microbiol. 1993 Sep;144(7):581-90.

81. Mattarelli P, Biavati B, Pesenti M, Crociani F. Effect of growth temperature on the biosynthesis of cell wall proteins from Bifidobacterium globosum. Res Microbiol. 1999 Mar; 150(2): 117-27.

82. Matteuzzi D, Brigidi P, Rossi M, Di D. Characterization and molecular cloning of Bifidobacterium longum cryptic plasmid pMBl. Lett Appl Microbiol. 1990 Oct;ll(4):220-3.

83. Matteuzzi D, Crociani F, Brigidi P. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium. Ann Microbiol (Paris). 1983 May-Jun;134A(3):339-49.

84. Matto J, Malinen E, Suihko ML, Alander M, Palva A, Saarela M. Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria. J Appl Microbiol. 2004;97(3):459-70.

85. Mazodier P., Petter R., Thompson C., 1989. Intergeneric conjugation between Escherichia coli and Streptomyces species. J Bacteriol. June, 171(6):3583-5.

86. Missich R, Sgorbati B, LeBlanc DJ. Plasmid. . Transformation of Bifidobacterium longum with pRM2, a constructed Escherichia coli-B. longum shuttle vector. 19941. Sep;32(2):208-ll

87. Mitsuoka, Т., 1990. Bifidobacteria and their role in human health. J. Ind. Microbiol. 6, 263-268.

88. Moon G.S., Pyun Y.R., Park M.S., Ji G.E., Kim W.J., 2005. Secretion of recombinant pediocin PA-1 by Bifidobacterium longum, using the signal seguense for bifidobacterial A-amylase. Appl Environ Microbiol. Sept;p.5630-5632.

89. Moreau M.C. Intestinal flora, probiotics and effects on the intestinal IgA immune response. Arch Pediatr. 2000,7 Suppl, 2: 247s-248s.

90. Morita H, He F, Fuse T, Ouwehand AC, Hashimoto H, Hosoda M, Mizumachi K, Kurisaki J. Adhesion of lactic acid bacteria to caco-2 cells and their effect on cytokine secretion. Microbiol Immunol. 2002;46(4):293-7.

91. Muth, G., Farr, M., Hartmann, V., Wohlleben, W., Streptomyces ghanaensis plasmid pSG5: nucleotide sequence analysis of the self-transmissible minimal replicon and characterization of the replication mode. Plasmid. 1995. 33,113-26.

92. Navarre WW, Schneewind O. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol Mol Biol Rev. 1999 Mar;63(1): 174-229.

93. Noda H, Akasaka N, Ohsugi M. Biotin production by bifidobacteria. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 1994 Apr,40(2): 181-8.

94. Orban JI, Patterson JA. Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of bifidobacteria. J Microbiol Methods. 2000 May;40(3):221-4

95. O'Riordan K., Fitzgerald G.F., 1999. Molecular characterisation of a 5.75-kb cryptic plasmid from Bifidobacterium breve NCFB 2258 and determination of mode of replication. FEMS Microbiol Lett. May 15;174(2):285-94.

96. Ornitz DM, Itoh N. Fibroblast growth factors. Genome Biol. 2001;2(3):REVIEWS3005. Epub 2001 Mar 9.

97. Ouwehand AC, Isolauri E, Kirjavainen PV, Salminen SJ. Adhesion of four Bifidobacterium strains to human intestinal mucus from subjects in different age groups.

98. FEMS Microbiol Lett. 1999 Mar l;172(l):61-4.

99. Paris F, Fuks Z, Kang A, Capodieci P, Juan G, Ehleiter D, Haimovitz-Friedman A, Cordon-Cardo C, Kolesnick R. Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice. Science. 2001 Jul 13;293(5528):293-7.

100. Park KB, Ji GE, Park MS, Oh SH. Expression of rice glutamate decarboxylase in Bifidobacterium longum enhances gamma-aminobutyric acid production. Biotechnol Lett. 2005 Nov;27(21): 1681 -4.

101. Park M.S., Shin D.W., Lee K.H., Ji G.E., 1999. Sequence analysis of plasmid pKJ50 from Bifidobacterium longum. Microbiology. Mar;145 (Pt 3):585-92.

102. Park M.S., Shin D.W., Lee K.H., Ji G.E., 2000. Charactacterization of plasmid pKJ36 from Bifidobacterium longum and construction of an E. coli-Bifidobacterium shutlle vector. J Microbiol Biotechnol. 10:312-320.

103. Park MS, Kwon B, Shim JJ, Huh CS, Ji GE. Heterologous expression of cholesterol oxidase in Bifidobacterium longum under the control of 16S rRNA gene promoter of bifidobacteria. Biotechnol Lett. 2008 Jan;30(l): 165-72. Epub 2007 Sep 12.

104. Park MS, Kwon B, Shim JJ, Huh CS, Ji GE. Heterologous expression of cholesterol oxidase in Bifidobacterium longum under the control of 16S rRNA gene promoter of bifidobacteria. Biotechnol Lett. 2008 Jan;30(l): 165-72. Epub 2007 Sep 12.

105. Park MS, Lee KH, Ji GE. Isolation and characterization of two plasmids from Bifidobacterium longum. Lett Appl Microbiol. 1997 Jul;25(l):5-7.

106. Parke D. 1990. Construction of mobilizable vectors derived from plasmids RP4, pUC18 and pUC19. Gene. Sep l;93(l):135-7.

107. Perez PF, Minnaard Y, Disalvo EA, De Antoni GL. Surface properties of bifidobacterial strains of human origin. Appl Environ Microbiol. 1998 Jan;64(l):21-6.

108. Pettis GS, Cohen SN. Unraveling the essential role in conjugation of the Tra protein of Streptomyces lividans plasmid pIJlOl. Antonie Van Leeuwenhoek. 2001 Sep;79(3-4):247-50.

109. Platteeuw C, Simons G, de Vos WM. Use of the Escherichia coli beta-glucuronidase (gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. Appl Environ Microbiol. 1994 Feb;60(2):587-93.

110. Pompei A, Cordisco L, Amaretti A, Zanoni S, Matteuzzi D, Rossi M. Folate production by bifidobacteria as a potential probiotic property. Appl Environ Microbiol. 2007

111. Jan;73(l): 179-85. Epub 2006 Oct 27.

112. Ravn P, Arnau J, Madsen SM, Vrang A, Israelsen H. Optimization of signal peptide SP310 for heterologous protein production in Lactococcus lactis. Microbiology. 2003 Aug;149(Pt 8):2193-201.

113. Reddy BS, Rivenson A. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon, mammary, and liver carcinogenesis induced by 2-amino-3-methylimidazo4,5-f.quinoline, a food mutagen. Cancer Res. 1993 Sep l;53(17):3914-8.

114. Reuther J, Wohlleben W, Muth G. Modular architecture of the conjugative plasmid pSVHl from Streptomyces venezuelae. Plasmid. 2006 May;55(3):201-9. Epub 2006 Jan 24.

115. Reyes Escogido ML, De Le6n Rodriguez A, Barba de la Rosa AP. A novel,binary expression vector for production of human IL-10 in Escherichia coli and Bifidobacterium longum. Biotechnol Lett. 2007 Aug;29(8): 1249-53. Epub 2007 May 9.

116. Rhim SL, Park MS, Ji GE. Expression and secretion of Bifidobacterium adolescentis amylase by Bifidobacterium longum. Biotechnol Lett. 2006 Feb;28(3): 163-8

117. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? Am J Clin Nutr 2000,71:6, Suppl, 1682S-7S; discussion 1688S-90S

118. Roffe C. Biotherapy for antibiotic associated and other diarrhoeas. J.Infect. 1996.- 32. P. 1-10.

119. Rossi M, Brigidi P, Gonzalez Vara у Rodriguez A, Matteuzzi D. Characterization of the plasmid pMBl from Bifidobacterium longum and its use for shuttle vector construction. Res Microbiol. 1996 Mar-Apr;147(3): 133-43.

120. Rud I, Jensen PR, Naterstad K, Axelsson L. A synthetic promoter library for constitutive gene expression in Lactobacillus plantarum. Microbiology. 2006 Apr;152(Pt 4):1011-9.

121. Ryan SM, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Screening for and identification of starch-,amylopectin-, and pullulan-degrading activities in bifidobacterial strains. Appl Environ Microbiol. 2006 Aug;72(8):5289-96.

122. Sakata S, Kitahara M, Sakamoto M, Hayashi H, Fukuyama M, Benno Y. Unification of Bifidobacterium infantis and Bifidobacterium suis as Bifidobacterium longum. Int J Syst Evol Microbiol. 2002 Nov;52(Pt 6):1945-51.

123. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

124. Sanders JW, Leenhouts K, Burghoorn J, Brands JR, Venema G, Kok J. A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation. Mol Microbiol. 1998 Jan;27(2):299-310.

125. Satokari RM, Vaughan EE, Akkermans AD, Saarela M, de Vos WM. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol. 2001 Feb;67(2):504-13.

126. Schafer A., Kalinowski J., Simon R., Seep-Feldhaus A.H., Puhler A., 1990. High-Frequency conjugal plasmid transfer from Gram-negative Escherichia coli to various Gram-positive coryneform bacteria. J Bacteriol. Mar, 172(3): 1663-6.

127. Schurch C. 2002. Development of a novel DNA transformation system for bifidobacteria.

128. Ph.D. thesis. Swiss federal institute of technology, Zurich.

129. Servin-Gonzalez, L., Relationship between the replication functions of Streptomyces plasmids pJVl and pUlOl. Plasmid. 1993.30,131-40.

130. Sgorbati B, Scardovi V, Leblanc DJ. Related structures in the plasmid profiles of Bifidobacterium asteroides, B. indicum and B. globosum. Microbiologica. 1986 Oct;9(4):443-54.

131. Sgorbati B, Scardovi V, Leblanc DJ. Related structures in the plasmid profiles of Bifidobacterium longum. Microbiologica. 1986 Oct;9(4):415-22.

132. Sgorbati В., Scardovi V., Leblanc D.J., 1982. Plasmids in the genus Bifidobacterium. J Gen Microbiol. Sep;128(9):2121-31.

133. Simon GL, Gorbach SL. The human intestinal microflora. Dig Dis Sci. 1986 Sep;31(9 Suppl):147S-162S

134. Simon, R., M. O'Connell, M. Labes, and A. Pthler. 1986. Plasmid vectors for the genetic analysis and manipulation of Rhizobia and other gram-negative bacteria. Methods Enzymol. 118:640-659.

135. Smeianov VV, Efimov BA, Korschunov VM, and Steele JL. Construction of the Bifidobacterium-E. coli shuttle vectors based on two distinctive Bifidobacterium replicons. Материалы конференции ASM Meeting 2002.

136. Snyder L., Champness W. Molecular Genetics of Bacteria. 2002. ASM Press. Washington, DC.

137. Sridhar VR, Smeianov VV, Steele JL. Construction and evaluation of food-grade vectors for Lactococcus lactis using aspartate aminotransferase and alpha-galactosidase as selectable markers. J Appl Microbiol. 2006 Jul; 101(1): 161-71.

138. Steidler L, Hans W, Schotte L, Neirynck S, Obermeier F, Falk W, Fiers W, Remaut E. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10. Science. 2000 Aug 25;289(5483):1352-5.

139. Steidler L, Viaene J, Fiers W, Remaut E. Functional display of a heterologous protein on the surface of Lactococcus lactis by means of the cell wall anchor of Staphylococcus aureus protein A. Appl Environ Microbiol. 1998 Jan;64(l):342-5.

140. Steidler L, Wells JM, Raeymaekers A, Vandekerckhove J, Fiers W, Remaut E. Secretion of biologically active murine interleukin-2 by Lactococcus lactis subsp. lactis. Appl Environ Microbiol. 1995 Apr;61 (4): 1627-9.

141. Suzuki I, Kataoka M, Seki T, Yoshida T. Three single-strand origins located on both strands of the Streptomyces rolling circle plasmid pSN22. Plasmid. 1997;37(l):51-64.

142. Takeuchi A, Matsumura H, Kano Y. Cloning and expression in Escherichia coli of a gene, hup, encoding the histone-like protein HU of Bifidobacterium longum. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 Mar;66(3):598-603.

143. Takeuchi A, Matsumura H, Kano Y. Cloning and expression in Escherichia coli of a gene, hup, encoding the histone-like protein HU of Bifidobacterium longum. Biosci Biotechnol Biochem. 2002Mar;66(3):598-603.

144. Tanaka H, Hashiba H, Kok J, Mierau I. Bile salt hydrolase of Bifidobacterium longum-biochemical and genetic characterization. Appl Environ Microbiol. 2000 Jun;66(6):2502-12.

145. Tanaka K., Samura K., Kano Y., 2005. Structural and functional analysis of pTB6 from Bifidobacterium longum. Biosci Biotechnol Biochem. Feb;69(2):422-5.

146. Tannock GW. Identification of lactobacilli and bifidobacteria. Curr Issues Mol Biol. 1999;l(l-2):53-64.

147. Van der Werf MJ, Venema K. Bifidobacteria: genetic modification and the study of their role in the colon. J Agric Food Chem. 2001 Jan;49(l):378-83.

148. Ventura M, Canchaya C, Bernini V, Del Casale A, Dellaglio F, Neviani E, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Genetic characterization of the Bifidobacterium breve UCC 2003 hrcA locus. Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8998-9007.

149. Ventura M, Fitzgerald GF, van Sinderen D. Genetic and transcriptional organization of the clpC locus in Bifidobacterium breve UCC 2003. Appl Environ Microbiol. 2005 0ct;71(10):6282-91.

150. Ventura M, Kenny JG, Zhang Z, Fitzgerald GF, van Sinderen D. The clpB gene of Bifidobacterium breve UCC 2003: transcriptional analysis and first insights into stress induction. Microbiology. 2005 Sep;151(Pt 9):2861-72.

151. Ventura M, Zhang Z, Cronin M, Canchaya C, Kenny JG, Fitzgerald GF, van Sinderen D. The ClgR protein regulates transcription of the clpP operon in Bifidobacterium breve UCC 2003. J Bacteriol. 2005 Dec;187(24):8411-26.

152. Vincent D, Roy D, Mondou F, Dery C. Characterization of bifidobacteria by random185.186.187.188. 189.

153. DNA amplification. Int J Food Microbiol. 1998 Sep 8;43(3):185-93.

154. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vectors andhost strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors Gene 33:103-119.

155. Yildirim Z, Johnson MG. Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin В, abacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J Food Prot. 19981. Jan;61(l):47-51.

156. Yildirim Z, Winters DK, Johnson MG. Purification, amino acid sequence and mode of action of bifidocin В produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J Appl Microbiol. 1999 Jan;86(l):45-54.

Информация о работе

Шкопоров, Андрей Николаевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы