Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля

Евлашкина, Вера Францевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля"

На правах рукописи

ЕВЛАШКИНА Вера Францевна

Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

UU3471Э42

Москва- 2009г.

003471942

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Чупринина Раиса Павловна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Поспелова Вероника Владимировна доктор биологических наук, профессор Блинкова Лариса Петровна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится « ^ » @ 6 2009 года в Ш часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологиии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 125212 г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»

Автореферат разослан « ^У 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук С.Ю. Комбарова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Широкое распространение различных болезней, патогенетически связанных с дисбактериозом, и высокая частота выделения ле-карственноустойчивых форм патогенных и условно патогенных микроорганизмов, высеваемых при обследованиях на дисбактериоз, делает актуальной проблему обеспечения практического здравоохранения средствами коррекции микробиоценоза разных биотопов организма человека. (Грачева Н.М. с соавт., 1982; Алешкин В.А. с соавт., 2006; Феклисова JI.B. с соавт., 2008). Применение бактерийных препаратов (пробиотиков) разнонаправленного действия неуклонно расширяется и включает не только заболевания желудочно-кишечного тракта, но и разные формы патологии полости рта, женских гениталий, кожные болезни, нарушения иммунного статуса и др. (Грачева Н.М. с соавт., 1982; Анкирская A.C. с соавт., 2000; Алешкин В.А. с соавт., 2005; Поспелова В.В. с соавт., 2007; Бонда-ренко В.М., Лиходед В.Г., 2008; Добрица В.П. с соавт.,2008; Hoffman F.A, 2008; Sutton А., 2008). Для целей бактериальной терапии используют биопрепараты из живых микроорганизмов нормального микробиоценоза человека: бифидобакге-рий, лактобацилл, кишечной палочки, энтерококков и других представителей нормофлоры (Гончарова Г.И., 1970, 1982; Поспелова В.В. с соавт., 2000, 2008; Алешкин В.А. с соавт., 2003; Амерханова A.M., 2003; Brow A.C., Valiere A, 2004; Pospelova Y.V., 2007; Camilleri M., 2008). В России зарегистрированы отечественные и зарубежные моно- и комплексные биопрепараты (бифидумбактерин, бификол, пробифор, бифилиз, колибактерин, ацилакт, аципол, флорин форте, споробактерин, гастрофарм, бифиформ, линекс, экофемин, бактисубтил и др).

Первый отечественный бифидосодержащий биопрепарат бифидумбактерин содержит в своем составе бифидобактерии вида B.bifidum, штаммы № 1, 791 или ЛВА-3 (Гончарова Г.И., 1970, 1982; Козлова Э.П с соавт., 1987). В настоящее время бифидумбактерин сухой выпускают 10 предприятий РФ. Кроме препарата во флаконах и порошке выпускают бифидумбактерин в форме таблеток, капсул и суппозиториев.

Комплексный биопрепарат бификол создан на основе таксономически отда-

ленных микроорганизмов двух видов - B.bifldum 1 и E.coli М-17, один из которы строгий анаэроб, а другой растет в условиях аэробиоза. Препарат получают путе совместного культивирования обоих штаммов. В основе композиции препарат лежит природный синергизм бактерий названных видов (Рахимова Н.Г., 1977 Поспелова В.В., 1979). По данным Государственных клинических испытаний би фикола выявлена его высокая терапевтическая эффективность и отмечено опти мальное соотношение производственных штаммов, позволяющее уменьшить на порядка содержание колибактерий, предусмотренное для колибактерина бе ущерба для клинической эффективности препарата (Рахимова Н.Г., 1975; Грачев Н.М., 1982; Поспелова В.В.с соавт., 1986; Pospelova V.V., 2006). Выпуск бификол освоен 7 предприятиями РФ и 2 зарубежными.

Созданные в 70-е годы прошлого столетия пробиотики бифидумбактерин и бификол не утратили своего значения и продолжают пользоваться спросом в здравоохранении (Михайлова H.A. с соавт., 2006; Осипова И.Г. с соавт., 2006, Бонда-ренко В.М., 2007). Согласно современным тенденциям развития проблемы бактериальной терапии будущее, несомненно, принадлежит поликомпонентным препа-ратам-пробиотикам (Алешкин В.А., 2006; Бондаренко В.М., Лиходед В.Г).

Качество бактерийных препаратов формируется на всех технологических этапах, начиная от штаммов и сырья, используемых питательных сред, условий культивирования бактерий, замораживания, способа их высушивания и кончая готовой продукцией в зависимости от формы выпуска, условий хранения, транспортирования и определяется адекватностью методов контроля. Биопрепараты должны быть стандартными, стабильными, соответствовать требованиям нормативной документации (НД) в течение всего срока годности, поэтому важное значение имеет контроль готовой продукции (Чупринина Р.П., 2002; Осипова И.Г., 2006).

Основным показателем качества бифидумбактерина и бификола является специфическая активность, под которой для бактерийных препаратов понимается количество живых бактерий в дозе (ОСТ 91500.05.001.00).

Разработанная технология производства бификола в условиях стационарного

культивирования штаммов на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского обеспечивала требуемое количественное соотношение живых микроорганизмов обоих видов в дозе препарата - не менее 107 КОЕ бифидобактерий и колибакте-рий.

Однако освоение производства бификола новыми предприятиями и модификация исходной технологии (использование нового оборудования, глубинного культивирования без соблюдения коррекции кислотности с аэрацией различной степени интенсивности и разных по составу питательных сред) привело к нестандартности препарата по специфической активности. Она колебалась на разных предприятиях от серии к серии. Неконтролируемый рост кишечной палочки и низкое содержание бифидобактерий не позволяли с помощью существующего метода контроля объективно определять количество живых бифидобактерий в дозе бификола как в готовом препарате, так и в полуфабрикате.

Опыт работы контролирующих организаций показывает, что улучшению качества коммерческих препаратов способствует наличие стандартных образцов разных уровней: международных, национальных, отраслевых и стандартных образцов предприятий, использование которых обеспечивает стандартизацию и сравнительное изучение контролируемых параметров препаратов, выпускаемых на разных предприятиях (Дзагуров С.Г., 1970; Бектимиров Т.А., 2004).

Разработанный ранее Отраслевой стандартный образец (ОСО) колибактерина с успехом применяют в течение многих лет для контроля колисодержащих препаратов. (Лесняк с соавт.,1975; Шимчук Л.Ф., 1983) До настоящего времени разработок ОСО бифидумбактерина не предпринималось.

В связи с изложенным представлялось необходимым разработать, изучить и внедрить в практику производства ОСО бифидумбактерина для более достоверного определения количества живых бифидобактерий в дозе бифидосодержащих препаратов, а также изучить разные способы ингибирования кишечной палочки в смешанной культуре, не влияющие на рост бифидобактерий и позволяющие учитывать количественное содержание бифидо- и колибактерий при совместном выращивании.

Цель исследования - экспериментально разработать и апробировать в производственных условиях новые методы контроля специфической активности би-фидосодержащих моно- и комплексного биопрепаратов (бифидумбактерина и би-фикола).

Задачи исследования:

1 .Оценить информативность метода контроля содержания живых бифидо- и колибактерий в дозе бификола по ВФС 42-65ВС-86.

2. Разработать, изучить и внедрить в практику Отраслевой стандартный образец бифидумбактерина, предназначенный для сравнительной оценки специфической активности бифидумбактерина и бификола.

3. Изучить чувствительность штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17, входящих в бификол, к воздействию высоких температур и к 19 антибиотикам разных химических групп.

4. Изучить кислотообразующую активность бифидо- и колибактерий в смешанной культуре.

5. Изучить чувствительность штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17, составляющих бификол, к ингибирующему действию азида натрия и разработать условия приготовления питательной среды с этим ингибитором, готовой к применению, для контроля содержания живых бифидо- и колибактерий в бификоле.

6. Разработать и апробировать в условиях производства точный метод контроля специфической активности бификола (по содержанию живых бифидо- и колибактерий в дозе).

Диссертация выполнена в соответствии с основными планами научных исследований ГИСК им. Л.А. Тарасевича:

- Характеристика производственных штаммов-продуцентов колибактерина, бифидумбактерина и лактобактерина по антагонистической активности, устойчивости к антибиотикам и жизнеспособности. УДК 578.085.1-612.336.3, № гос. Регистрации 79049914.

- Разработка, усовершенствование и стандартизация методов контроля лекарственных форм биопрепаратов из лакто- и бифидобактерий. УДК 612.336.358.

09.003.12:658.516. № Гос. Регистрации 0186.

- Договоры № 737/089/024 и 034/ 089/009 с Минздравом России - Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».

Научная новизна

1. Выявлено избирательное действие азида натрия по отношению к кишечной палочке в смешанных культурах с бифидобактериями в жидких питательных средах. Подобраны концентрации и показана возможность использования азида натрия для ингибирования роста кишечной палочки, что позволило разработать, апробировать и внедрить надежный метод оценки количества жизнеспособных би-фидобактерий в препарате бификол.

2. Изучена кислотообразующая активность бифидо- и колибактерий при совместном культивировании и выявлена прямая связь между содержанием в исследуемом разведении бифидобактерий (чувствительность до 1 колонии) и показателем титруемой кислотности питательной среды. Показатель кислотности не ниже 100 °Т свидетельствует о присутствии бифидобактерий в данном разведении и позволяет определить количество бифидобактерий в препарате.

3. Показано, что чувствительность к антибиотикам культур B.bifidum 1 и E.coli М-17 в моно- и комплексном препаратах изменяется в зависимости от состава питательных сред и условий культивирования.

4. Разработана модификация питательной среды Блаурокка с использованием азида натрия, обеспечивающая точность количественного учета бифидобактерий в препарате.

Практическая значимость работы 1. Разработан, апробирован на разных предприятиях и внедрен в нормативную документацию метод контроля количественного содержания живых бифидо-и колибактерий в комплексном препарате бификол.

2. Разработан и апробирован на предприятиях Отраслевой стандартный образец бифидумбактерина (ОСО-42-28-161-89), предназначенный для контроля содержания жизнеспособных бифидобактерий в производственных сериях бифидумбактерина, бификола и других бифидосодержащих препаратов. ОСО внесен в Государственный Реестр.

3. Новый метод учета количества живых микроорганизмов в бификоле с использованием модифицированной питательной среды Блаурокка позволил усовершенствовать технологию совместного культивирования штаммов В.Ы/Ыит 1 и Е. соН М-17 и способствовал повышению качества препарата.

Внедрение результатов работы

Результаты научной работы отражены в НД:

1. Изменения № 2 к ВФС 42-65ВС-86 на бификол (ФС 42-3268-96, ФСП 420010160601, ФСП 42-0028220201, ФСП 42-0109220501, ФСП 42-0108220601, ФСП 42-0381241702, ФСП 42-01003753002, ФСП 42-0061231902, ФСП 42-0504676205,ФСП 42-6203-06, ФСП 42-1606-06).

2. РП на бификол

3. Свидетельство на ОСО бифидумбактерина 42-28-161-89. Утв. ГИСК им. Л.А. Тарасевича 5.01.89. ОСО бифидумбактерина внесен в Государственный Реестр.

4. Инструкция по применению ОСО бифидумбактерина.

5. Бифидумбактерин сухой (ФС 42-132 ВС-94, ФС 42- 3947-00; ФСП 42-0028212701, ФСП 42-0135112201, ФСП 42-0100-228902, ФСП 42-0110332002, ФСП 420338284602, ФСП 42-0269231802, ФСП 42-0109453403, ФСП 42-0108453203, ФСП 42-0381454003, ФСП 42-0022580804, ФСП 42-0010508904, ФСП 420504722405).

6. Бифидумбактерин в свечах (ВФС 42-224ВС-89, ФС 42-3240-95; бифидумбактерин суппозитории ФСП 42-0109027000, ФСП 42-0108027100, ФСП 42-0100229002, ФСП- 42-0504229004, ФСП 42-0109027005, ФСП 42-0108027105, ФСП 420107026605).

7. Бифидумбактерин в таблетках (ФС 42-3449-97, ФСП 42-0135112201, ФСП 42-01070-61705).

8. Биомасса бифидобактерий (ВФС 42-3378-99, ФСП 42-0134137550-01, ФСП 42-0110-305402).

9. Бифидумбактерин в капсулах (ВФС 42-3356-99, ФСП 42-0109137801, ФСП 42-0108138101, ФСП 42-0109137806, ФСП 42-0338353202).

10. Бифидумбактерин форте (ВФС 42-2459-95, ФС 42-3784-99).

11. Бифилиз сухой (ВФС 42-2631-95, ФСП 42-0110027200, ФСП 42- 0108138001, ФСП 42-0109137901, ФСП 0110-0272-05).

12. РП на бифидумбактерин сухой, таблетки, свечи, капсулы и порошки.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанный метод определения количества живых бифидо- и колибакте-рий в бификоле позволяет объективно оценить качество выпускаемого на предприятиях страны комплексного препарата.

2. Модифицированная и апробированная на предприятиях отрасли питательная среда Блаурокка с азидом натрия, предназначенная для контроля количества жизнеспособных бифидобактерий в комплексном бифидосодержащем препарате, оптимальна по составу, способу приготовления и чувствительности.

3. Показатели кислотообразующей активности штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 позволяют определить количество жизнеспособных бифидобактерий и колибактерий в составе комплексного препарата бификол.

4. Разработанный ОСО-42-28-161-89 бифидумбактерина позволяет стандартизовать условия проведения контроля бифидумбактерина и бификола на этапах технологического процесса и в готовых препаратах.

Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, протокол № 18 от 16.12.2008 г.

Результаты проведенных исследований доложены на: VI Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Н.Новгород, 1991); в школе ОБК (Москва, 1992, 1993, 1998); 2 Международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 1998); Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней» (С-Петербург, 2003); Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания». (Москва, 2004); III конгрессе педиатров -инфекционистов России (Москва, 2004); Всероссийских научно-практических конференциях «Вакцинология». (Москва, 2006; 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах, иллюстрирована 25 таблицами, 5 рисунками, состоит из введения, об-

зора литературы, главы с описанием материалов и методов, 4 глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, приложения. Список использованной литературы содержит 128 отечественных и 96 иностранных источников.

Все исследования выполнены в лаборатории бактерийных вакцин ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича и получены автором самостоятельно.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

► Производственные штаммы В.Ы/^ит 1 и Е.соН М-17, находящиеся в коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Характеристики данных штаммов изложены в ФС на бифидумбактерин, колибактерин, бификол.

Таблица 1. Бактерийные препараты, использованные в работе

Название препаратов Кол-во серий Предприятие - изготовитель

Бификол - коммерческие серии 205 МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, НПО "Биомед" им. И.И. Мечникова, НПО "Имму-нопрепарат" г. Уфа, НПО «Биомед» г. Пермь, Тюменский НИИНИП, Харьковское предприятие по производству бактерийных препаратов, Тбилисский НПО "Бактериофаг",

Бифидумбактерин -коммерческие серии 36 МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, НПО "Биомед" им. И.И. Мечникова, НПО "Имму-нопрепарат" г. Уфа, НПО «Биомед» г. Пермь, «ИмБио» г. Н. Новгогод, Тюменский НИИНИП, Тбилисский НПО "Бактериофаг»

Колибактерин - коммерческие серии 34 Тюменский НИИКИП, «ИмБио» г. Н. Новгогод, НПО "Биомед" им. И.И. Мечникова

Экспериментальные варианты бификола 15 Приготовлены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича из коммерческих серий колибактерина и бифидумбактерина

Экспериментальные серии бифидумбактерина для приготовления ОСО бифидумбактерина 4 МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича

► ОСО колибактерина, серия 1.

► Антибиотики - 19 наименований, относящиеся к разным химическим группам отечественного и зарубежного производства: эритромицин, олеандомицин,

бензилпенициллин, ампициллин, карбенициллин, линкомицин, оксациллин, цепо-рин, тетрациклин, тетраолеан, гентамицин, метициллин, мономицин, стрептомицин, левомицетин, неомицин, канамицин, леворин, нистатин.

► Питательные среды: Блаурокка, КД-5, МПБ, Эндо.

► Химические вещества: натрия азид фирмы SERVA, натрия хлорид фирмы «Химмед», натрия гидроксид, фенолфталеин фирмаы «Реахим».

Методы исследования

- Количество живых бифидобактерий и колибактерий в одной дозе бификола с подсчетом КОЕ определяли с помощью десятикратных разведений в среде КД-5 с последующим высевом кишечной палочки на среду Эндо (ВФС 42-65ВС-86 на бификол сухой).

- Количество живых бифидобактерий в одной дозе бифидумбактерина с подсчетом КОЕ определяли с помощью десятикратных разведений в среде Блаурокка (ФС 42-3947-00 на бифидумбактерин сухой).

- Количество живых колибактерий в одной дозе колибактерина с подсчетом КОЕ определяли с помощью десятикратных разведений в 0,9 % растворе натрия хлорида с последующим высевом на среду Эндо (ФСП 42-0504722505)

- Определение активности кислотообразования (титруемая кислотность) би-фидо- и колибактерий проводили титриметрическим методом при выращивании в среде Блаурокка и выражали в градусах Тернера (°Т) (ФС 42-3947-00 на бифидумбактерин сухой).

- Антибиотикорезистентность штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 изучали в отношении 19 антибиотиков методом 2 кратных серийных разведений в пробирках со средой Блаурокка и МПБ соответственно в объеме 10 мл. Изучаемые культуры B.bifidum 1 и E.coli М-17 разводили вышеуказанными средами и в концентрации 105-106 клеток/мл вносили в объеме 1 мл в пробирки с разведенными антибиотиками. Контролем служили пробирки с тем же количеством культуры, не содержащей антибиотиков. За МИК (минимальную ингибирукмцую концентрацию) в соответствии с требованиями действующих МУК 4.2.1890-04 принимали концентрацию, при которой отсутствовал видимый рост культуры.

- Термостабильность ОСО бифидумбактерина изучали на основании кривой деградации живых микробов при разных температурах и сроках хранения (WHO/ ТВ/ Technical Guide, 1977).

- Точность розлива, остаточную влажность, наличие вакуума в ампулах определяли по методам, изложенным в МУК 4.1/4.2.588-96.

- Морфологические, тинкториальные и физиолого-биохимические свойства культур изучали общепринятыми методами бактериологии.

- Достоверность различий между результатами исследований вычисляли с помощью методов вариационной статистики (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962).

Результаты оценивали на основании данных 5 опытов.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ стандартности производственных серий бификола по содержанию жизнеспособных B.bifidum 1 и Е.соИШЛ! и разработка ОСО бифидумбактерина

Согласно исходной НД на бификол, определение количества живых бифидо-и колибактерий в бификоле проводили при совместном культивировании штаммов в среде КД-5. Однако трудность определения количественного содержания бифидобактерий заключается в том, что этот микроорганизм является строгим анаэробом и при культивировании на полужидкой среде КД-5 характерные колонии бифидобактерий видны только на 3 - 4 сутки инкубации. Колибактерии обладают на этой среде более высокой скоростью роста, с визуальным проявлением мутности на первые сутки роста, не формируют четких изолированных колоний. Поэтому регламентированный метод был неприемлем для количественной оценки содержания бифидобактерий в бификоле.

На первом этапе исследований изучали морфологию роста бифидо- и колибактерий при культивировании в средах КД-5 и Блаурокка. Для этой цели использовали штаммы B.bifidum 1 и E.coli М-17, ОСО колибактерина, коммерческие серии колибактерина, бифидумбактерина, бификола и экспериментальные варианты бификола. Испытуемые препараты разводили согласно ФС, титровали методом десятикратных разведений в пробирках со средой КД-5 и Блаурокка и

инкубировали при температуре (38+1) °С в течение 4-х суток. В посевах бифи-думбактерина в среде Блаурокка вырастали изолированные колонии в форме «гвоздиков» и плотных «тяжиков» длиной 2-5 мм. При посеве колибактерина отмечали неравномерное помутнение среды с удлиненными рыхлыми «тяжами» длиной 15-20 мм. В опытах с бификолом отмечался рост, аналогичный росту при посеве колибактерина (табл.2).

Таблица 2. Характер роста штаммов В.Ь^ит 1 и Е.соН М-17 на среде Блаурокка

Препараты Характер роста микроорганизмов в разведениях:

10"" 10"' 10"в ю-9

БИФИДУМБАКТЕРИН Просматриваются изолированные колонии в виде «гвоздиков» или плотных «тяжиков» длиной 2-5 мм Роста нет

КОЛИБАКТЕРИН На фоне помутнения среды просматриваются удлиненные рыхлые «тяжи» длиной 15-20 мм.

БИФИКОЛ На фоне помутнения среды просматриваются удлиненные рыхлые «тяжи» длиной 15-20 мм.

Таким образом, было установлено, что вследствие неравномерного помутнения среды, вызванного ростом кишечной палочки, учесть количество бифидобак-терий в смешанной культуре невозможно.

В среде КД-5, регламентированной НД, морфология роста кишечной палочки была аналогична росту в среде Блаурокка, тогда как у бифидобактерий в среде КД-5, в отличие от роста на среде Блаурокка, отмечена нечеткая форма колоний: они были мелкими и более рыхлыми. Поэтому дальнейшее изучение препаратов проводили на среде Блаурокка.

Необходимость стандартизации условий изучения специфической активности бифидосодержащих препаратов требовала разработки ОСО бифидумбактерина по аналогии с действующим ОСО колибактерина, успешно используемым при контроле препаратов, начиная с 1979 г.

Для приготовления серий предполагаемого ОСО бифидумбактерина культуру штамма В.Ы/к!ит 1 выращивали в стационарных условиях в бутылях с питательной средой Блаурокка при температуре (38+1) °С 48 часов. Полученную биомассу соединяли с защитной средой, разливали по 3 мл в вакуумные ампулы. Замораживали при температуре минус (39+1) °С в течение 120 часов споследую-

щим высушиванием в аппарате ТГ-50 в течение 65 часов.

Согласно экспериментально разработанным условиям, на базе МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского были приготовлены 4 серии предполагаемого ОСО. После изучения серий с учетом физических свойств, точности розлива по весу сухого вещества в ампулах, количеству жизнеспособных бифидобактерий в 1 мл, активности кислотообразования, остаточной влажности и наличию вакуума была отобрана серия, максимально отвечающая ОСО в соответствии с ГОСТ 8.315-78. ОСО би-фидумбактерина в ампулах имеет вид мелкопористой массы кремового цвета, которая образует гомогенную суспензию при добавлении 0,9 % раствора натрия хлорида. Изучение свойств предполагаемого ОСО показало: точность розлива по сухому веществу - (482,4+1,29) мг с коэффициентом вариации 1,34; остаточная влажность - 1,07 %, активность кислотообразования - (120+6) °Т, содержание живых бифидобактерий -(2,0+0,18)х107 КОЕ/мл. В процессе хранения ОСО при температуре минус 15 °С не отмечено отмирания живых бифидобактерий (р>0,05). С целью прогнозирования стабильности ОСО в процессе хранения, изучена его термостабильность (методика ВОЗ) в течение 42 дней при температуре (37+1) °С. При этом выявлена достаточно высокая термоустойчивость препарата. Разработанный ОСО бифидумбактерина апробирован на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (41 серия) и в Тюменском НИИКИП (20 серий). Свидетельство на ОСО-42-28-161-89 бифидумбактерина и Инструкция по применению утверждены Ученьм Советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича 05.01.89 г и постоянно используются производствами при контроле коммерческих серий бифидумбактерина с 1989 г, бификола - с 1992 г и других бифидосодержащих препаратов. Изучение устойчивости штаммов В.Ь'фйит 1 и Е.соН М-17 в составе бификола к термическим воздействиям и антибиотикам разных химических групп

Нами изучено влияние термического воздействия на жизнеспособность штаммов В.Ы^ит 1 и Е.соН М-17. С этой целью образцы бифидумбактерина и колибактерина прогревали на водяной бане при температуре 56 °С и 100 °С. Показано, что количество жизнеспособных бифидобактерий и колибактерий снижалось с одинаковой закономерностью. Таким образом, исследования показали, что

попытка ингибировать кишечную палочку термической обработкой не дала положительных результатов (табл.3).

Таблица 3. Влияние термического воздействия на выживаемость

штаммов В. bifidum 1 и E.coli М-17

Название препарата Исходное кол-во в дозе Температура и время воздействия Содержание жизнеспособных бактерий

В.bifidum 1 E.coli М-17

Бифидумбактерин 10' 100 °С -1 мин 10"-105 -

56 °С -10 мин 104-10> -

Колибактерин 10x10Ч 100 °С -1 мин - 108

56 °С -10 мин - 10*

Бификол Ю'-Ю8 100°С -1 мин Учету не подлежит* 10"

56 °С -10 мин ю6

Примечание: * Учету не подлежит вследствие помутнения среды, вызванного

ростом колибактерий

С целью выбора антибиотика, способного ингибировать рост кишечной палочки и не влиять на рост бифидобактерий, были проведены исследования по определению чувствительности штаммов В. bifidum 1 и Е. coli М-17 к 19 антибиотикам разных химических групп.

Из тех антибиотиков, к которым штамм В.bifidum 1 устойчив (леворин, нистатин, канамицин, неомицин, левомицетин, мономицин, стрептомицин), штамм E.coli М-17 был чувствителен только к мономицину, стрептомицину и канамици-ну (табл.4). Поскольку устойчивость бифидобактерий оказалась наиболее высокой к канамицину (МИК 226,0 мкг/мл), для дальнейших исследований был выбран этот антибиотик.

При анализе чувствительности к канамицину штаммов, входящих в бификол, выявлено, что после совместного культивирования устойчивость штамма E.coli М-17 повышалась до МИК 128 мкг/мл (табл. 5). При выращивании штамма В.bifidum 1 в среде с концентрацией канамицина 128 мкг/мл снижалось количество колоний, изменялась их форма и уменьшался размер. Это не позволило использовать канамицин для ингибирования роста кишечной палочки с целью учета количества бифидобактерий в комплексном препарате бификол. По-видимому, в процессе совместного культивирования выделяемые бифидобактериями метабо-

Таблица 4. Сравнительная чувствительность к антибиотикам

штаммов В.ЫАйит 1 и Е.соИ М-17

Антибиотики Испытуемые штаммы и степень их чувствительности к антибиотикам (МИК мкг/мл)

В. Ы/гс1ит 1 Е. соН М-17

Леворин >2040; высокоустойчив > 2040; высокоустойчив

Нистатин >2040; высокоустойчив >2040; высокоустойчив

Канамицин 226,0; высокоустойчив 8.0; чувствителен

Неомицин 75,0; высокоустойчив 32,0; устойчив

Левомицетин 75,0; высокоустойчив 32,0; устойчив

Мономицин 25,0; устойчив 8,0; чувствителен

Стрептомицин 25,0; устойчив 8,0; чувствителен

Таблица 5. Чувствительность штаммов В.ЫАйит 1 и Е.соН М-17 к различным кон-

центрациям канамицина в монокультурах и при совместном культивировании

Способ выращивания штаммов Концентрация канамицина мкг/мл Степень разведения выращенных культур

Е.соН М-17 В.Ы^йит 1

10"6 10 10"8 Ю-9 10"6 10 10"8 10

Монокультура 256 Р/Н Р/Н Р/Н РУН Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н

128 Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н

64 Р Р/Н Р/Н Р/Н >100 21 2 Р/Н

32 Р р р Р/Н >100 23 1 Р/Н

8 Р р р р >100 25 2 Р/Н

Контроль Р р р р >100 2 Р/Н

Совместное культивирование 256 Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н

128 Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н 9 Р/Н Р/Н

64 р р р Р/Н р Р Р Р/Н

32 р р р Р р Р Р Р

8 р р р Р р Р Р р

Контроль р р р Р р Р Р р

Примечание: Контроль - рост В.Ъфбит 1 и Е.соН М-17 в отсутствии канамицина;

Р - рост кишечной палочки; Р/Н - роста не имеется

литы повышают устойчивость кишечной палочки к антибиотику. Аналогичное явление в отношении лактобактерий отмечено и другими исследователями (Петров Л.Н., 2008).

Разработка метода оценки содержания живых бифидобактерий в бификоле по активности кислотообразования штаммов В.Ь'фйит 1 иЕ.соНМ-17

В основу этого метода заложены отличительные свойства двух микроорганизмов отдаленных таксономических групп -В.Ы$с1ит и Е.соН. Как известно, би-фидобактерии сбраживают глюкозу главным образом до уксусной и Ь+ молочной кислот. Кроме того, в небольших количествах образуются муравьиная и янтарная кислоты. Ферментативной особенностью Е.соН является сбраживание глюкозы и других углеводов с образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. (Вещеу). Различный уровень кислотообразующей активности предположительно мог быть использован для дифференциации штаммов В.Ьфс1ит 1 и Е.соН М-17 в смешанной культуре.

Активность кислотообразования изучали на монопрепаратах, производственных штаммах и ОСО. В пробирках со средой Блаурокка готовили ряд последовательных десятикратных разведений и инкубировали при температуре (38+1) °С в течение 4 суток. По истечении срока инкубации из каждого разведения, в котором отмечался видимый рост, переносили по 2,5 мл суспензии в пробирки с 25 мл среды Блаурокка. Посевы инкубировали в течение 72 ч. По окончании срока инкубации во всех посевах определяли показатель кислотности по Тернеру (рис. 1). Полученные показатели активности кислотообразования культур В.Ы^ит 1 и Е.соН М-17 сравнивали с количеством колоний, выросших в каждом разведении.

Установлено, что, независимо от степени разведения монопрепаратов и количества колоний, выросших в каждом учитываемом разведении в пределах 10"1-Ю'10, показатели кислотности в образцах после высева из этих разведений колебались в небольших пределах для каждой серии и от серии к серии (табл.6). При этом показатель кислотообразующей активности бифидобактерий был не менее (100+5) °Т, у кишечной палочки существенно ниже - не более (73+2) °Т.

Следует отметить, что выявление бифидобактерий возможно также в случае,

этап опыта

Среда Блаурокка

этап опыта

/—^ю

-й У У У У

! 10 ю 10

* Т Ж

ян

определение активности кислотообраэования (°Т)

Рис.1. Схема 3-х этапов опыта по выявлению разведения бификола, содержащего бифидобактерии.

4 суток инкубаци

(38*1 )°С

3 суток ¡_ инкубаций (38*1)°С

Таблица 6. Показатели кислотообразующей активности бифидумбактерина и

Разве- Показатели активности кислотообразования в °Т (М+ш)

дение Название препарата / производство

БИФИДУМБАКТЕРИН Штамм КОЛИБАКТЕРИН Штамм

МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского «ИмБио» В. Ы/1с1ит1 Тюменский «ИмБио» К со а М-17

Н.Новгород НИИКИП Н.Новгород

10"' 160+2 126+4 164+2 72+3 65+2 69+3

10"2 148+9 115+8 160+2 73+2 58+3 70+2

кг* 160+5 120+6 158+4 70+2 62+5 65+4

ю-4 165+3 122+8 158+3 68+5 64+4 64+7

10° 157+8 116+8 150+5 70+2 60+3 67+3

Ю'ь 148+1 120+9 157+2 72+2 65+2 70+3

ю-7 133+8 115+5 148+3 73+1 59+3 65+3

ю-8 125+9 100+5 140+2 73+2 65+5 65+4

10"у 22* 22* 126+4 68+2 62+2 65+5

ю-10 22* 22* 22* 22* 22* 65+3

КОЕ/доза 107 107 107 108 108 Ю10

Примечание: * кислотность среды

когда для определения кислотности берут разведение препарата, содержащее только одну видимую колонию. При этом культура, выросшая через 72 часа, за-кисляет среду до показателя кислотности, характерного для роста бифидобакте-рий -100 °Т и более (табл. 7). Рост кишечной палочки, независимо от засеянной концентрации, закисляет среду не более чем до 75 °Т.

Таблица 7. Показатель кислотности (°Т) среды в зависимости от количества _выросших колоний бифидобактерий в дозе _

производство № образца Высев из разведения 10"8

Количество бифидобактерий (КОЕ х 107) Показатель кислотности

«ИмБио» 1 2 100

Н.Новгрод 2 1 100

3 ■ 1 ■:•:.■.. ■ ; 102

4 4 105

5 3 105

МНИИЭМ 1 5 130

им. Г.Н.Габри- 2 7 129

чевского 3 4 125

4 б 130

5 5 119

Штамм 1 8 130

В.Ы^йит I 2 9 130

ОСО бифидум-бактерина 1 2 3 4 5 1 3 2 2 2 125 126 120 130 119

Разработанный метод определения кислотообразования единичными коло-

ниями апробирован на 31 серии бификола разных производств. Полученные показатели варьировали от серии к серии и в ряде случаев не соответствовали предъявляемым требованиям НД (рис 2). Так, только 5 серий МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и 2 серии Харьковского предприятия содержали количество бифидобактерий 107, соответствующее НД. Низкое содержание бифидобактерий в бифи-коле отмечалось на фоне высокого содержания кишечной палочки.

Таким образом, разработанный метод информативен для контроля содержания живых бифидобактерий в дозе бификола, поскольку показатель кислотообра-

зования 100 °Т гарантировано подтверждает их присутствие в данном разведении препарата. Учитывая, что данный метод трудоемок и длителен, возникла необхо-| димость разработать более удобный способ определения живых бифидобактерий в бификоле с использованием ингибитора роста кишечной палочки.

60% Г1

МНИИЭМ им. «Биомед» им. «Биомед» Харьковское Г.Н.Габричевского И.И.Мечникова г. Пермь предприятие

Показатель количества живых бифидобактерий в 1§/мл □ 7 Об 04 йЗ @2 В1

Рис.2. Оценка качества бификола различных производств при использовании для контроля метода активности кислотообразования

Чувствительность штаммов В.Ы/Ыит 1 и Е.соН М-17, входящих в бификол, к азиду натрия и использование его ингибирующей активности в отношении кишечной палочки для учета роста бифидобактерий

При подборе ингибитора роста кишечной палочки в смешанных культурах мы остановили свой выбор на азиде натрия, который известен подавляющим действием в отношении грамотрицательных бактерий в условиях плотных сред. Поэтому необходимо было изучить свойства азида натрия в полужидкой среде Блау-рокка и подобрать такую концентрацию, которая не влияла бы на рост бифидобактерий.

Анализ полученных данных свидетельствует о том, что азид натрия в концентрации 0,5; 1,0; 1,5 мг на 10 мл среды Блаурокка не оказывал существенного

влияния на жизнеспособность бифидобактерий, в концентрации 2 и 2,5 мг угнетал, а в концентрации 3 и 3,5 мг полностью ингибировал его. В опытах с коли-бактерином установлено, что между количеством жизнеспособных колибактерий и концентрацией азида натрия, необходимой для подавления роста кишечной палочки, существует прямая зависимость. Так, для ингибирования роста кишечной палочки в количестве 103 КОЕ, требуется 0,6 мг азида натрия на 10 мл среды Блаурокка, а при содержании 107 КОЕ нужно 1,6 мг ингибитора.

В результате исследования подобрана концентрация азида натрия 1 мг на 10 мл среды Блаурокка, которая не влияла на жизнеспособность бифидобактерий и была достаточной для полного угнетения роста кишечной палочки в учитываемых разведениях (10"М0"8). В опыте с экспериментальным вариантом бификола показано, что количество КОЕ бифидо- и колибактерий в дозе соответствовало их количеству в монопрепаратах (табл.8). Так, количество бифидоколоний в среде Блаурокка с азидом натрия и без него в бифидумбактерине и в бификоле в среде с азидом натрия было одинаковым. Количество КОЕ колибактерий в дозе бифико-

Таблица 8. Оценка жизнеспособности бифидо- и колибактерий __ в моно- и комплексном препаратах_

Препарат Среда Блаурокка Количество колоний В. ЫАйит 1 и рост Е.соИ М-17 в разведениях:

ю-' 10 10 ю-4 Ю-4 ю-6 10 10 10

коли- БАКТЕ-РИН без азида натрия Р Р Р р р р р P Р Р/Н

с азидом натрия слабый рост Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н Р/Н

БИФИ-ДУМ-БАКТЕ-РИН без азида натрия Учет невозможен вследствие большого количества B.bifidum 1 >100* 20* 1* Р/Н Р/Н

с азидом натрия Учет невозможен вследствие большого количества В.Ы^ит 1 >100* 22* 1* Р/Н Р/Н

БИФИ-КОЛ без азида натрия Р Р Р р р р Р р р Р/Н

с азидом натрия Учет невозможен вследствие большого количества В.Ь^ит 1 >100* 20* 2* Р/Н Р/Н

Примечание: Р - рост E.coli М-17; Р/Н- роста не имеется * количество колоний B.bifidum 1

ла и колибактерина было одинаковым при посеве на среду Эндо и в среду Блау рокка без азида натрия.

Таким образом, разработан простой метод количественного учета жизнеспо собных бифидо- и колибактерий в комплексном препарате бификол, доказана ег достоверность и информативность.

В связи с тем, что азид натрия добавляли в среду Блаурокка ех4етроге, не обходимо было разработать условия изготовления модифицированной среды азидом натрия, готовой к применению для контроля количества живых бифидо-колибакгерий в производстве (отработать режим стерилизации), а также прове рить чувствительность среды Блаурокка с ингибитором. Для этого в 1 литр сре ды Блаурокка вносили 100 мг азида натрия и перемешивали, получая при это среду с 0,01 % концентрацией ингибитора. Среду разливали в пробирки по 10 м и стерилизовали. Нами апробированы разные режимы стерилизации (120 °С-1 мин; 112 °С - 20 мин; 110 °С - 30 мин) и доказано, что автоклавирование при тем пературе 110 °С в течение 30 минут не разрушает азида натрия, сохраняет опти мальные ростовые свойства для бифидобактерий и высокую ингибирующую активность в отношении кишечной палочки. Пять партий питательной среды оценивали в опытах по контролю жизнеспособности бифидобактерий на 5-и сериях коммерческого бификола, по 3 образца от каждой серии.

Модифицированная питательная среда Блаурокка с азидом натрия была апробирована на предприятиях отрасли и признана оптимальной по составу и способу приготовления для выявления роста бифидобактерий в двухкомпонентном препарате бификол.

С помощью разработанного метода контроля проведена оценка стандартности коммерческих серий бификола по показателю количества КОЕ бифидобактерий в дозе препарата (рис. 3). Показано, что все отконтролированные серии бификола (п=40) отвечали требованиям НД (107 КОЕ/дозе) по количественному содержанию жизнеспособных колибактерий и только 11 соответствовали по этому показателю для бифидобактерий. В 29 сериях содержание КОЕ в дозе бифидобактерий было ниже регламентированного показателя.

о4-

75%

50%-

25%-

Показателъ количества живых бифидобактерий 1§/мл

□1В7

I % б 0^5

0 183

Рис.3 Оценка качества бификола различных производств при использовании нового метода контооля

Внедрение в производство нового метода контроля бификола позволило предприятиям выявить нестандартность технологии изготовления препарата вследствие неточности в определении количества жизнеспособных бифидобактерий на этапах технологического процесса и разработать меры по усовершенствованию производства бификола. Среди отконтролированных в ГИСК им. Л.А. Та-расевича 87 коммерческих серий бификола, приготовленных после внедрения нового метода контроля, 66 соответствовали требованиям НД по содержанию КОЕ бифидобактерий в дозе и только 21 серия (24,1 %) не соответствовала. Эти серии представлены на предварительный контроль в связи с освоением нового производства и были забракованы (рис. 4).

Таким образом, разработанные и внедренные в производство новый метод контроля специфической активности бификола (по жизнеспособности) и ОСО бифидумбактерина способствовали усовершенствованию и стандартизации на

каждом предприятии технологии совместного культивирования бифидо- и коли-бактерий, что отразилось на их соотношении в готовом препарате и привело к повышению качества и стандартности бификола.

до внедрения нового после внедрения нового

метода контроля метода контроля

27,50%

п = 40 п = 87

Количество серий Ü - не соответствует требованиям НД;

□ - соответствует требованиям НД.

Рис. 4. Эффективность внедрения нового метода контроля бификола при определении количества живых бифидобактерий (р<0,05).

Выводы

1. Установлено, что метод контроля по ВФС 42-65ВС-86 двухкомпонентного ' пробиотика бификол не обеспечивал точного учета содержания живых бифидо-и колибактерий в дозе препарата.

2. Выявлены различия по кислотообразующей активности у штаммов В.Ы-fidum 1 ( не ниже 100 °Т) и E.coli М-17 (не выше 75 °Т), что служит одним из надежных показателей для определения количества живых бифидо- и колибактерий в дозе препарата бификол.

3. Предложена готовая к применению на производстве модифицированная среда Блаурокка с добавлением азида натрия, ингибирующая рост штамма E.coli М-17 в смешанных культурах и сохраняющая ростовые свойства штамма B.bifidum 1. Это позволяет надежно определять количество бифидо- и колибактерий в двухкомпонентном препарате бификол.

4. Разработан, апробирован и утвержден Отраслевой стандартный образец

(ОСО-42-28-161-89) бифидумбактерина, который обеспечивает точный учет со-

держания живых B.bifidum 1 в moho- и комплексных бифидосодержащих препаратах (бифидумбактерин, бификол, бифилиз, бифидумбактерин форте и т.д.).

5. Показано, что ингибирующее действие высоких температур и различия по чувствительности к антибиотикам разных химических групп не могут быть использованы для надежного разделения бифидо- и колибактерий в препарате бификол.

6. Разработанные методы оценки количества жизнеспособных бифидо- и колибактерий (кислотообразующая активность, определение КОЕ штаммов на модифицированной среде Блаурокка с азидом натрия и использование ОСО бифи-думбактерина) обеспечили стандартизацию основных эталов технологии совместного культивирования штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17. Это положительно отразилось на количественном соотношении бифидо- и колибактерий в готовом препарате и привело к повышению качества и стандартности производственных серий бификола на всех выпускающих его предприятиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Евтухова JI.H., Евлашкииа В.Ф., Скорикова И.Г. Качество препаратов из нормальной микрофлоры кишечника человека //Сб.научн.тр. Ташкентского НИ-ИВС "Медицина", 1988 - С. 74-79.

2. Евтухова Л.Н., Скорикова И.Г., Евлашкииа В.Ф. К вопросу об усовершенствовании метода контроля содержания бифидобактерий в бификоле // Сб.научн.тр. Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. М.,1989 - С. 98-105.

3. Чупринина Р.П., Евтухова Л.Н. Бвлашкина В.Ф. Проблемы стандартизации препаратов из нормальной микрофлоры организма человека //Тезисы докладов YI Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. Н.Новгород, 1991.- С. 135-136 .

4. Бвлашкина В.Ф., Чупринина Р.П., Евтухова Л.Н. Метод оценки жизнеспособных бифидобактерий в препарате "Бификол'У/Микробиол. журн., Украина, 1993, Т.55, № 5, с. 84-88.

5. Бвлашкина В.Ф., Чупринина Р.П., Евтухова Л.Н. Разработка метода оценки жизнеспособных бифидобактерий в бификоле //Ж. Клиническая лабораторная диагностика.- 1993.- № 4.-С. 73-74.

6. Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Бвлашкина В.Ф. Препараты для профилактики и лечения дисбактериозов различной этиологии. //В кн.: «Актуальные проблемы создания и применения иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней. - Пермь. -1993, Т.1 - С. 264-279.

7. Евлашкина В.Ф., Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Лукьянова О.Ю., Рыба-чок A.B. К вопросу о стандартизации технологии изготовления бификола // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Материалы международ. симпозиума, посвященного 150-летию со для рождения И.И. Мечникова и 90-летию Уфимского НИИВС НПО «Иммунопрепарат».Уфа, 1995,4.1, с.179-182.

8. Чупринина Р.П., Конькова Н.К., Евлашкина В.Ф., Рыбачок A.B. Перспективы повышения качества препаратов эубиотиков//Современная вакцинология. Тез. док. 2 Междунар. конф., посвящ. 100-летию Пермского НПО «Биомед» Пермь, 16-18.06.1998. с.143.

9. Колганова Т.В., Ватанабэ X., Далин М.В., Васильева Е.А., Осипова И.Г., Лившиц В.А., Лукьянова О.Ю., Евлашкина В.Ф. К вопросу о механизме защитного действия пробиотиков//Сб.тр.: Биомедицинские технологии. Вып. 16, - М., 2001. с.23-29.

10. Чупринина Р.П., Ладыгина A.B., Евлашкина В.Ф. Пробиотики и механизм их лечебного действия//Международ. конгресс «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» С-Петербург, 3-5 сентября 2003,-С16-18.

11. Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина A.B. Доклинические испытания новых пробиотиков//Матер. Международной конференции.: "Пробиотики, пребиотики, симбиотики и функциональные продукты питания.-Москва, 2004.-С. 10.

12. Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф., Васильева Е.А. Классификация про-биотиков, достоинства и недостатки//Материалы 3-го конгресса педиатров-инфекционистов России: Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей. Инфекция и иммунитет. Москва 8-10.12.2004. - С.247.

13. Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина A.B. Доклиническая оценка безопасности (безвредности) производственных штаммов и лекарственной формы пробиотиков//Тез. Всероссийской научно-практической конф. «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» М., 2006, с.105.

14. Терешкина Н.В, Григорьева Л.В., Осипова И.Г., Чупринина Р.П., Евлашкина В.Ф. Исследование «острой» и «хронической» токсичности - необходимый элемент доклинического изучения пробиотиков/ЛОшническое питание.-2007,- № 1-2.. С. 69.

15. Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф., Терешкина Н.В., Васильева Е.А. Коррекция экспериментального дисбактериоза пробиотиками// Вестник Российского университета дружбы народов. 2008.- № 1,- С. 91-95.

16. Осипова И.Г., Васильева Е.А., Евлашкина В.Ф Дисбиозы кишечника// Методические рекомендации. М.: Изд. РУДН, 2008, 39 с.

17. Чупринина Р.П., Осипова И.Г., Евлашкина В.Ф., Ладыгина A.B., Терешкина Н.В, Абрамцева М.В. Система предварительного доклинического изучения безопасности пробиотиков//Тез. Всероссийской научно-практической конф. «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологиических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» 11-12 ноября М. 2008 с.124.

Список сокращений

1ФС - временная фармакопейная статья

[Д-5 - казеиново- дрожжевая среда

ЮЕ - колониеобразующая единица

ЛИК - минимальная ингибирующая концентрация

4НИИЭМ - Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии

микробиологии ШБ - мясопептонный бульон Щ - нормативная документация

ШИКИП - научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии

)БК - отдел бактериологического контроля

)СО - отраслевой стандартный образец

П - регламент производства

Т - градусы Тернера

'С - фармакопейная статья

>СП - фармакопейная статья предприятия

Заказ №585. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Пстроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Евлашкина, Вера Францевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА И ЕЕ РОЛЬ В ОБЕСПЕЧЕНИИ

СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ОРГАНИЗМА-ХОЗЯИНА.

ГЛАВА 2. МИКРОБНЫЕ БИОПРЕПАРАТЫ В СИСТЕМЕ МЕР ПО КОРРЕКЦИИ БАКТЕРИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ОЦЕНКИ ИХ АКТИВНОСТИ.

ЧАСТЬ II. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Материалы.

3.2 Методы исследований.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ СТАНДАРТНОСТИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ БИФИКОЛА ПО СОДЕРЖАНИЮ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ B.bifidum 1 и E.coli М-17 И РАЗРАБОТКА ОТРАСЛЕВОГО СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА БИФИДУМБАКТЕРИНА.

4.1. Изучение характера роста штаммов B.bifidum I и E.coli М-17 в жидких питательных средах.

4.2 Разработка и изготовление первой серии Отраслевого стандартного образца (ОСО) бифидумбактерина.

4.3 Изучение свойств ОСО бифидумбактерина.

4.4 Результаты применения ОСО бифидумбактерина для оценки содержания живых особей бифидобактерий в бифидумбактерине.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ШТАММОВ B.bifidum 1 и E.coli М-П В СОСТАВЕ БИФИКОЛА К ТЕРМИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ И АНТИБИОТИКАМ РАЗНЫХ ХИМИЧЕСКИХ ГРУПП

5.1. Изучение влияния термического воздействия на жизнеспособность бифидобактерий и кишечной палочки.

5.2 Изучение чувствительности штаммов В.bifidum 1 и

E.coli М-17, входящих в бификол, к действию антибиотиков разных химических групп.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ БИФИДОБАКТЕРИЙ В БИФИКОЛЕ ПО АКТИВНОСТИ КИСЛОТООБРАЗОВАНИЯ ШТАММОВ B.bifidum I и E.coli М

6.1 Кислотообразующая активность бифидобактерий и кишечной палочки в монокультурах.

6.2. Кислотообразующая активность искусственно смоделированного препарата бификола в сравнении с бифидумбактерином и колибактерином.

6.3. Применение кислотообразующей активности бифидобактерий для контроля коммерческих серий бификола.

ГЛАВА 7. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ В.bifidum 1 и E.coli М-17, ВХОДЯЩИХ В БИФИКОЛ, К АЗИДУ НАТРИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЕГО ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ В ОТНОШЕНИИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ ДЛЯ УЧЕТА РОСТА БИФИДОБАКТЕРИЙ

7.1. Влияние разных концентраций азида натрия на рост бифидобактерий и кишечной палочки в монокультурах.

7.2. Испытание ингибирующего действия азида натрия в отношении кишечной палочки на искусственно смоделированных вариантах бификола и коммерческих сериях бифидумбактерина и колибактерина.

7.3. Разработка условий приготовления модифицированной питательной среды Блаурокка с азидом натрия и ее апробация на коммерческих сериях бификола.

7.4. Сравнение двух новых разработанных методов оценки количественного содержания бифидобактерий в бификоле.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля"

Актуальность проблемы.

Широкое распространение различных болезней, патогенетически связанных с дисбактериозом, и высокая частота выделения лекарственно-устойчивых форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, высеваемых при обследованиях на дисбактериоз, делает актуальной проблему обеспечения практического здравоохранения средствами коррекции микробиоценоза разных биотопов организма человека [3,26,90,108,194,198].

Применение бактерийных препаратов (пробиотиков) разнонаправленного действия неуклонно расширяется и включает не только заболевания желудочно-кишечного тракта, но и разные формы патологии полости рта, женских гениталий, кожные болезни, нарушения иммунного статуса и др.

• [3,5,15,26,29,35,44,91,93,138,142,165].

Для целей бактериальной терапии используют биопрепараты из живых микроорганизмов нормального микробиоценоза человека: бифидобакте-рий, лактобацилл, кишечной палочки, энтерококков и других представителей нормофлоры [2,4,13,22,46,52,55,92,94,103,115,118,126]. В Российской Федерации зарегистрированы отечественные и зарубежные моно- и комплексные биопрепараты (бифидумбактерин, бификол, пробифор, бифилиз, колибактерин, ацилакт, аципол, флорин форте, споробактерин, биоспорин, гастрофарм, бифиформ, бифиформ Кидс, линекс, экофемин, бактисубтил и

ДР)

Первый отечественный бифидосодержащий биопрепарат бифидумбактерин содержит в своем составе бифидобактерии вида В. bifidum, штаммы № 1, 791 или JIBA-3 [21,22,47]. В настоящее время бифидумбактерин сухой выпускают 10 предприятий РФ. Кроме препарата во флаконах и порошке выпускают бифидумбактерин в форме таблеток, капсул и суппозиториев.

Комплексный биопрепарат бификол создан, на основе таксономически отдаленных микроорганизмов двух видов - B.bijidum 1 и E.coli М-17, один из которых строгий анаэроб, а другой растет в условиях аэробиоза. Препарат получают путем совместного культивирования обоих штаммов. В основе композиции препарата лежит природный синергизм бактерий названных видов [88,97]. По данным Государственных клинических испытаний бификола выявлена его высокая терапевтическая эффективность и отмечено оптимальное соотношение производственных штаммов, позволяющее уменьшить на 3 порядка содержание колибактерий, предусмотренное для.колибактерина без ущерба для клинической эффективности препарата [26,27,89,96,195]. Выпуск бификола освоен 7 предприятиями РФ и 2 зарубежными.

Созданные в 70-е^годы прошлого столетия пробиотики бифидумбак-терин и бификол не утратили своего значения и продолжают пользоваться спросом в здравоохранении [14,71,80]. Согласно современным тенденциям развития проблемы бактериальной, терапии будущее, несомненно, принадлежит поликомпонентным препаратам-пробиотикам [3,15].

Качество бактерийных препаратов формируется на всех технологических этапах, начиная от штаммов и сырья, используемых питательных сред, условий культивирования бактерий, замораживания, способа» их высушивания и кончая готовой продукцией в зависимости от формы выпуска, условий хранения, транспортирования и определяется адекватностью методов контроля. Биопрепараты должны быть стандартными, стабильными, соответствовать требованиям нормативной документации (НД) в течение всего срока годности, поэтому важное значение имеет контроль готовой продукции [79,121,205].

Основным показателем качества бифидумбактерина и бификола является* специфическая активность, под которой для бактерийных препаратов понимается количество живых бактерий в дозе (ОСТ 91500.05.001.00, ФС на бифидумбактерин и бификол).

Разработанная технология производства бификола в условиях стационарного культивирования штаммов на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского обеспечивала требуемое количественное соотношение живых микроорганизмов обоих видов в дозе препарата - не менее 107 КОЕ бифидо-бактерий и колибактерий (ФС на бификол).

Однако освоение производства бификола на новых предприятиях и модификация исходной технологии (использование нового оборудования, глубинного культивирования без соблюдения коррекции кислотности с аэрацией различной степени интенсивности и разных по составу питательных сред) привело к нестандартности препарата по специфической активности. Показатели жизнеспособности колебались на предприятиях от серии к серии. Неконтролируемый рост кишечной палочки и низкое содержание бифидобакте-рий не позволяли с помощью существующего метода контроля объективно определять количество живых бифидобактерий в дозе бификола как в готовом препарате, так и в полуфабрикате.

Разработанный ранее Отраслевой стандартный образец (ОСО) колибак-терина с успехом применяется в течение многих лет для контроля колисо-держащих препаратов [57,125]. До настоящего времени разработок ОСО би-фидумбактерина не предпринималось.

В связи с изложенным представлялось необходимым разработать, изучить и внедрить в практику производства ОСО бифидумбактерина для более достоверного определения количества живых бифидобактерий в дозе бифидосодержащих препаратов, а также изучить разные способы ингибирования кишечной палочки в смешанной культуре, не влияющие на бифидобактерии и позволяющие учитывать количественное содержание бифидо- и колибак-терий при совместном выращивании.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - экспериментально разработать и апробировать в производственных условиях новые методы контроля специфической активности бифидосодержащих моно- и комплексного биопрепаратов (бифидумбактерина и бификола). г

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1.Оценить информативность метода контроля содержания живых бифидо- и колибактерий в дозе бификола по ВФС 42-65ВС-86.

4. Изучить кислотообразующую активность бифидо- и колибактерий в смешанной культуре.

6. Разработать и апробировать в условиях производства точный метод контроля специфической активности бификола (по содержанию живых би-фидо- и колибактерий в дозе).

Диссертация выполнена в соответствии с основными планами научных исследований ГИСК им. J1.A. Тарасевича:

- Характеристика производственных штаммов-продуцентов колибакте-рина, бифидумбактерина и лактобактерина по антагонистической активности, устойчивости к антибиотикам и жизнеспособности. УДК 578.085.1612.336.3, № гос. Регистрации 79049914.

- Разработка, усовершенствование и стандартизация методов контроля лекарственных форм биопрепаратов из лакто- и бифидобактерий. УДК 612.336.3 58.09.003.12:658.516. № Гос. Регистрации 0186. 0 067168.

Научная новизна

1. Выявлено избирательное действие азида натрия по отношению к кишечной палочке в смешанных культурах с бифидобактериями в жидких питательных средах. Подобраны концентрации и показана возможность использования азида натрия для ингибирования роста кишечной палочки, что позволило разработать, апробировать и внедрить надежный метод оценки количества жизнеспособных бифидобактерий в препарате бификол.

3. Показано, что чувствительность к антибиотикам культур B.bifiduml и E.coli М-17 в моно- и комплексном препаратах изменяется в зависимости от состава питательных сред, используемых для культивирования штаммов и условий культивирования.

Практическая значимость работы

1. Разработан, апробирован на разных предприятиях и внедрен в нормативную документацию метод контроля количественного содержания живых бифидобактерий и кишечной палочки в комплексном препарате бификол.

2. - Разработан и апробирован на предприятиях Отраслевой стандартный образец бифидумбактерина (ОСО-42-28-161-89), предназначенный для контроля содержания жизнеспособных бифидобактерий в производственных сериях бифидумбактерина, бификола и других бифидосодержащих препаратов. ОСО внесен в Государственный реестр.

3. Новый метод учета количества живых микроорганизмов в бификоле с использованием модифицированной питательной среды Блаурокка позволил усовершенствовать технологию совместного культивирования штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 и способствовал повышению качества препарата.

Результаты научной работы отражены в НД:

1. Изменения № 2 к ВФС 42-65ВС-86 на бификол (ФС 42-3268-96, ФСП 42-0010160601, ФСП 42-0028220201, ФСП 42-0109220501, ФСП 42-0108220601, ФСП 42-0381241702, ФСП 42-0100375302, ФСП 42-0061231902, ФСП 42-0504676205, ФСП 42-6203-06, ФСП 42-1606-06).

2. РП на бификол

3. Свидетельство на ОСО бифидумбактерина 42-28-161-89. Утв. ГИСК им. JI.A. Тарасевича 5.01.89. ОСО бифидумбактерина внесен в Государственный Реестр.

4. Инструкция по применению ОСО бифидумбактерина.

5. Бифидумбактерин сухой (ФС 42-132 ВС-94, ФС 42- 3947-00; ФСП 420028-212701, ФСП 42-0135112201, ФСП 42-0100228902, ФСП 42-0110332002, ФСП 42-0338284602, ФСП 42-0269231802, ФСП 42-0109453403, ФСП 420108453203, ФСП 42-0381454003, ФСП 42-0022580804, ФСП 42-0010508904, ФСП 42-0504722405).

6. Бифидумбактерин в свечах (ВФС 42-224ВС-89, ФС 42-3240-95; бифидумбактерин суппозитории ФСП 42-0109027000, ФСП 42-0108027100, ФСП

42-0100-229002, ФСП - 42-0504229004, ФСП 42-0109027005, ФСП 42-0108027105, ФСП 42-0107026605).

7. Бифидумбактерин в таблетках (ФС 42-3449-97, ФСП 42-0107061700, ФСП 42-0135112201, ФСП 42-0107061705).

8. Биомасса бифидобактерий (ВФС 42-3378-99, ФСП 42-01341375-01, ФСП 42-0110305402).

9. Бифидумбактерин в капсулах (ВФС 42-3356-99, ФСП 42-0109137801, ФСП 42-0108138101, ФСП 42-0338353202, ФСП 42-0109137806,).

10. Бифидумбактерин форте (ВФС 42-2459-95, ФС 42-3784-99).

11. Бифилиз сухой (ВФС 42-2631-95, ФСП 42-0110027200, ФСП 4201081380-01, ФСП 42-0109137901, ФСП 42- 0110027205).

12. РП на бифидумбактерин сухой, таблетки, свечи, капсулы и порошки.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Евлашкина, Вера Францевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что метод контроля по ВФС 42-65ВС-86 двухкомпо-нентного пробиотика бификол не обеспечивал точного учета содержания живых бифидо- и колибактерий в дозе препарата.

2. Выявлены различия по кислотообразующей активности у штаммов B.bifdum 1 ( не ниже 100 °Т) и E.coli М-17 (не выше 75 °Т), что служит одним из надежных показателей для определения количества живых бифидо-и колибактерий в дозе препарата бификол.

3. Предложена готовая к применению на производстве модифицированная среда Блаурокка с добавлением азида натрия, ингибирующая рост штамма E.coli М-17 в смешанных культурах и сохраняющая ростовые свойства штамма В. bifidum 1. Это позволяет надежно определять количество бифидо- и колибактерий в двухкомпонентном препарате бификол.

4. Разработан, апробирован и утвержден Отраслевой стандартный образец (ОСО-42-28-161-89) бифидумбактерина, который обеспечивает точный учет содержания живых B.bifidum 1 в моно- и комплексных бифидо содержащих препаратах (бифидумбактерин, бификол, бифилиз, бифидумбактерин форте и т.д.).

М-17. Это положительно отразилось на количественном соотношении бифидо- и колибактерий в готовом препарате и привело к повышению качества и стандартности производственных серий бификола на всех выпускающих его предприятиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Широкое распространение различных болезней, патогенетически связанных с дисбактериозом, и высокая частота выделения лекарственноустой-чивых форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, высеваемых при обследованиях на дисбактериоз, делает актуальной проблему обеспечения практического здравоохранения средствами коррекции микробиоценоза разных биотопов организма человека [3,26,90,108,194,198]. Применение бактерийных препаратов разнонаправленного действия неуклонно расширяется и включает не только заболевания желудочно-кишечного тракта, но и разные формы патологии полости рта, женских гениталий, кожные болезни, нарушения иммунного статуса и др.[3,5,15,26,29,35,44,91,93,138, 142, 165].

Известно, что лечебное действие пробиотиков обусловлено биологическими свойствами штаммов, входящих в их состав, а также метаболитами, продукцией бактериоцинов, витаминов, ферментов и других биологически активных веществ, антагонистической активностью против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, стимуляцией специфических и неспецифических факторов иммунитета. Эти свойства проявляются в зависимости от физиологического состояния микроорганизмов, на основе которых изготовлен бактерийный препарат, и условий технологического процесса приготовления препарата.

Первый отечественный бифидосодержащий биопрепарат бифидумбактерин содержит в своем составе бифидобактерии вида B.bifidum, штаммы № 1, 791 или ЛВА-3 [21,22,47]. Комплексный биопрепарат бификол (приказ МЗ СССР от 30.09.1975 о разрешении к промышенному изготовлению и реализации) создан на основе совместно выращиваемых микроорганизмов двух видов — B.bifidum .1 и Е.coli.М-17, представителей нормофлоры организма человека, один из которых строгий анаэроб, а другой растет в условиях аэробиоза. В основе композиции препарата лежит природный синергизм бактерий названных видов [88,97]. По данным Государственных клинических испытаний бификола, выявлена его высокая терапевтическая эффективность и отмечено удачное соотношение составляющих производственных штаммов, позволяющее уменьшить на 3 порядка содержание колибактерий, предусмотренное-для монопрепарата колибактерина, без ущерба для клинической эффективности препарата [26,27,89,96,195].

Высокая терапевтическая эффективность отечественных бифидосо-держащих препаратов бифидумбактерина и бификола привела к расширению масштабов их выпуска и увеличению числа производящих предприятий. В настоящее время-бифидумбактерин сухой выпускают 10 предприятий России. Кроме препарата во флаконах и порошке выпускают бифидумбактерин в* форме таблеток, капсул и суппозиториев. Выпуск бификола- освоен 7 предприятиями России и 2 зарубежными предприятиями.

Выпускаемые предприятиями препараты должны быть стандартными и стабильными, соответствовать требованиям НД'и обеспечивать эффективное лечебное действие, установленное при клиническом испытании препарата на больных на протяжении всего срока годности. Лечебная эффективность бификола зависит не только от количественного содержания живых B.bifidum 1 и E.coli М-17, но и от их соотношения в препарате, поэтому ведущим показателем качества бификола является специфическая активность, определяемая по содержанию в дозе живых КОЕ бифидобактерий и колибактерий [79,121, 205].

Однако расширение производства на новых предприятиях и модификация- исходной технологии при использовании нового оборудования привели к нестандартности препарата по специфической активности.

Анализ* результатов контроля с помощью дополнительных методов (окраски мазков, приготовленных из учитываемых разведений препарата) выявил, что часть производственных серий бификола не соответствовала требованиям НД (107 КОЕ\доза) по количеству живых бифидобактерий.

Неконтролируемый рост кишечной палочки и низкое содержание бифидобактерий не позволяли с помощью существующего метода контроля объективно определять количество живых бифидобактерий в дозе бификола как в готовом препарате, так и в полуфабрикате.

Доказано, что различия в показателях контроля коммерческих серий бифидосодержащих препаратов нередко связаны с несовершенством питательных сред, используемых при изготовлении и контроле препарата, а также с условиями проведения контроля. В этой связи оценку количества КОЕ бифидобактерий в дозе препарата целесообразно проводить в сравнении с ОСО, активность которого известна, а его использование позволило бы оценивать и стандартизовать условия проведения контроля [9,33].

В связи с изложенным, представлялось необходимым разработать, изучить и внедрить в практику производства ОСО бифидумбактерина для более достоверного определения содержания живых бифидобактерий в дозе бифидосодержащих препаратов, а также изучить разные способы ингибиро-вания кишечной палочки в смешанной культуре, не влияющие на бифидо-бактерии и позволяющие учитывать количественное содержание бифидо- и колибактерий при совместном выращивании.

Согласно исходной НД на бификол, определение количества живых би-фидо- и колибактерий в бификоле проводили при совместном культивировании штаммов в среде КД-5. Однако трудность определения количественного содержания бифидобактерий заключается в том,, что этот микроорганизм является строгим анаэробом и при культивировании на полужидкой среде КД-5 характерные колонии бифидобактерий видны только на 3 - 4 сутки инкубации. Колибактерии обладают на этой среде более высокой скоростью роста с визуальным проявлением мутности на первые сутки роста и не формируют четких изолированных колоний, поэтому регламентированный метод был неприемлем для количественной оценки содержания бифидобактерий в бификоле.

На первом этапе исследований изучали характер роста бифидо- и колибактерий при культивировании в средах КД-5 и Блаурокка. Для этой цели использовали штаммы B.bifidum I и E.coli М-17, ОСО колибактерина, коммерческие серии колибактерина, бифидумбактерина, бификола и экспериментальные варианты бификола. Испытуемые препараты разводили согласно НД, титровали методом десятикратных разведений в пробирках со средой КД-5 и Блаурокка и инкубировали при температуре (38+1) °С в течение 4 суток. В посевах бифидумбактерина в среде Блаурокка вырастали изолированные колонии в форме «гвоздиков» и плотных «тяжиков» длиной 2-5 мм. При посеве колибактерина отмечали неравномерное помутнение среды с удлиненными рыхлыми «тяжами» длиной 15-20 мм. В опытах с бификол ом отмечался рост, аналогичный росту при посеве колибактерина. Таким образом, было доказано, что удлиненные рыхлые «тяжи» в препарате бификол не являются бифидобактериями, за которые их принимали длительное время.

Для стандартизации условий проведения испытаний специфической активности бифидосодержащих препаратов был приготовлен ОСО бифидумбактерина. Изучены 4 серии бифидумбактерина и выбрана одна, которая соответствовала требованиям, предъявляемым к Стандартным образцам. Разработанный ОСО бифидумбактерина апробирован на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и в Тюменском НИИКИП и введен в НД

ФС и РП на бифидосодержащие препараты). Свидетельство на ОСО-42-28-161-89 бифидумбактерина и Инструкция по применению утверждены Ученым Советом ГИСК им. JI.A. Тарасевича 05.01.89 г, служит эталоном показателя жизнеспособности бифидобактерий и постоянно используются производствами при контроле коммерческих серий бифидумбактерина с 1989 г, бификола - с 1992 г и других бифидосодержащих препаратов.

ОСО позволил выявить нестандартность по качеству контрольных питательных сред. В связи с этим во всех предприятиях была проведена научная работа по стандартизации физико-химических показателей питательной среды Блаурокка, КД-5 и их основ. Следует подчеркнуть, что особенно важно использовать ОСО при проведении арбитражного, рекламационного и предварительного контроля, когда имеется необходимость выявить активные серии от неактивных и исключить влияние на результаты экспериментов побочных факторов (условий проведения опыта, а главное - качества среды). Применение его в практике контроля способствовало стандартизации выпускаемых серий бификола и бифидумбактерина, а также возможности дать дифференцированную оценку качества препарата разных производств.

Далее были изучены различные способы угнетения роста кишечной палочки в бификоле с целью выявления роста бифидобактерий.

Изучено влияние термического воздействия на жизнеспособность бифидобактерий и кишечной палочки. Исследование показало, что попытка ингибировать кишечную палочку путем термической обработки не дала положительных результатов. При прогревании образцов бификола, бифидумбактерина и колибактерина на водяной бане при температуре 56 °С и 100 °С количество КОЕ бифидо- и колибактерий снижалось с одинаковой закономерностью.

Для выбора антибиотика, способного ингибировать рост кишечной палочки и не влиять на рост бифидобактерий, проведены исследования по определению чувствительности штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 к 19 различным антибиотикам. Наиболее подходящим антибиотиком оказался канамицин. Однако при анализе чувствительности к канамицину штаммов, входящих в бификол, было выявлено, что после совместного культивирования устойчивость штамма E.coli М-17 повышалась до МИК 128 мкг/мл. При выращивании штамма B.bifidum 1 в среде с концентрацией канамицина 128 мкг/мл снижалось количество колоний, изменялась их форма и уменьшался размер. Это не позволило использовать канамицин для ингибирования роста кишечной палочки с целью учета количества бифидобактерий в комплексном препарате бификол.

При изучении возможности использования кислотообразующей активности двух компонентов бификола для оценки специфической активности препарата было установлено, что разная кислотообразующая активность штаммов В.bifidum. 1 и E.coli М-17 позволяет оценить количество бифидобактерий в дозе препарата бификол. Следует отметить, что учесть бифидо-бактерии возможно и в случае, когда для определения кислотности берут разведение препарата, содержащее только одну видимую колонию. При этом о при пересеве из разведения 10', в котором отмечался рост 1-2 колоний бифидобактерий, в пробирку со средой Блаурокка и последующей инкубацией в течение 72 часов кислотность среды с выросшей культурой соответствовала не менее 100-125 °Т. Таким образом, установлено, что бифидобактерии (при использовании метода кислотообразующей активности) находятся в том разведении, где показатель кислотности по Тернеру не ниже 100 °Т. Этот метод позволяет определить количество бифидобактерий в бификоле. Однако метод не позволяет увидеть форму колоний, к тому же он продолжителен (7 суток) и достаточно трудоемок.

При подборе ингибитора роста кишечной палочки в смешанных культурах мы остановили свой выбор на азиде натрия, который известен своим подавляющим действием в отношении грамотрицательных бактерий [45,56].

Исследование влияния разных концентраций азида натрия на рост кишечной палочки и бифидобактерий в монокультурах и в смоделированных вариантах бификола показало, что азид натрия в концентрации 0,5; 1,0; 1,5 мг на 10 мл среды Блаурокка не оказывал существенного влияния на жизнеспособность бифидобактерий, в концентрации 2 и 2,5 мг угнетал рост бифидобактерий, а в концентрации 3 и 3,5 мг полностью подавлял его. В опытах с колибактерином установили, что между количеством живых колибактерий и концентрацией азида натрия, необходимой для подавления роста кишечной палочки, существует прямая зависимость. Так, для ингибирования роста кишечной палочки в количестве 10 КОЕ требуется 0,6 мг азида натрия на 10 мл среды Блаурокка, а при содержании

107 КОЕ нужно 1,6 мг ингибитора.

В результате исследований установлено, что подобранная концентрация азида натрия 1мг на 10 мл среды Блаурокка оптимальна для количественного учета бифидобактерий в препарате, так как не угнетает рост бифидобактерий и достаточна для ингибирования роста кишечной палочки в учитываемых f\ П Я разведениях (10" ,10" и 10" ).

Изучение возможности использования азида натрия для подавления роста кишечной палочки при контроле определения количества живых бифидобактерий в бификоле привело к разработке модификации питательной среды Блаурокка с азидом натрия, оптимальной по составу и способу приготовления, обеспечивающей точность и надежность количественного учета бифидобактерий. Апробированы разные режимы стерилизации (120 °С - 15 мин; 112 °С - 20 мин; 110 °С - 30 мин) и доказано, что автоклавирование при температуре 110 °С в течение 30 минут не разрушает азида натрия, сохраняет оптимальные ростовые свойства для бифидобактерий и высокую ингибирую-щую активность в отношении кишечной палочки.

Таким образом, проведенные нами исследования способствовали разработке 2 методов, позволяющих точно определить разведение бификола, в котором имеется рост бифидобактерий.

Культуральный метод с использованием среды Блаурокка с азидом натрия более нагляден, не требует дополнительных пересевов и, следовательно, менее трудоемок и экономичен по времени и по использованию питательных сред, лабораторной посуды и времени сотрудника. Корреляция показателей кислотообразующей активности с наличием выросших видимых колоний бифидобактерий при использовании метода с азидом натрия свидетельствует о надежности обоих разработанных методов контроля содержания жизнеспособных бифидобактерий в комплексном препарате бификол.

При использовании новых методов контроля была подтверждена . нестандартность технологии изготовления препарата на вновь открывшихся производствах, что выражалось в занижении количественного содержания бифидобактерий в бификоле. Из 40 серий бификола, выпущенных до внедрения нового метода контроля, только 11 содержали необходимое количество бифидобактерий. Остальные 29 серий содержали заниженное количество бифидобактерий при завышенном количестве колибактерий.

Применение надежного метода контроля количественного содержания живых бифидобактерий и колибактерий в дозе бификола способствовало стандартизации на каждом предприятии технологии совместного культивирования обоих компонентов, что отразилось на их соотношении в готовом препарате и привело к повышению качества и стандартности коммерческих серий бификола.

Широкое применение нового метода контроля специфической активности бификола (на среде Блаурокка с азидом натрия) и использование ОСО бифидумбактерина внесло коррективы в оценку питательных сред как производственных для культивирования микроорганизмов, так и контрольных.

Возникла необходимость повсеместно проводить контроль питательных сред по физико-химическим параметрам: общему и аминному азоту, содержанию пептидов, триптофана, натрия хлорида и др. Полученные результаты позволили производителям внести единые требования к качественным показателям питательных основ и сред в нормативную документацию (РП). Эти мероприятия положительно отразились на показателе количественного содержания двух микробных компонентов в бификоле. Так, из 87 серий, выпущенных после внедрения в НД нового метода, не соответствовала требованиям НД только 21 серия, которые были забракованы на этапе предварительного контроля.

Многократно подтвержденная достоверность и воспроизводимость разработанного метода контроля, а также его апробация на различных предприятиях отрасли послужили основанием для введения данного метода в действующую НД (Изменение N 2 ВФС 42-65ВС-86 на бификол сухой, РП на бификол) для количественной оценки бифидобактерий и колибактерий в бификоле.

После перехода на новый метод контроля и доработки технологического процесса производства на каждом конкретном предприятии, разработки и обеспечении таких режимов культивирования в реакторе, где соблюдау ется количественное соотношение штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 (10 КОЕ\доза), производители в Российской Федерации выпускают бификол, соответствующий требованиям НД.

Таким образом, разработанные и внедренные в производство новый метод контроля специфической активности бификола и ОСО бифидумбактерина способствовали усовершенствованию и стандартизации на каждом предприятии технологии производства бифидосодержащих препаратов, что привело к повышению качества и стандартности бифидумбактерина, бификола. .

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евлашкина, Вера Францевна, Москва

1. Алешкин В.А., Тихонова Н.Т. и др. Новое направление бактериотерапии — комплексные пробиотики//Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. -М., 2002, С. 47.

2. Алешкин В. А., Афанасьев С. С., Поспелова В. В. и др. Становление пробио-тикотерапии в России //Вестник Российской академии медицинских наук 2005. -№ 12,С. 3-13.

3. Алешкин В. А., Афанасьев С. С., Поспелова В. В. и др. Пробиотики, пребио-тики, синбиотики и их роль в поддержании иммуномикроэкологического статуса человекаУ/Materia Medica, 2006 «Фармарус Принт», Москва, с 43-57.

4. Амерханова A.M. Дифференцированный подход к возрастным группам больных залог эффективности применения пробиотических средств//Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. - М., 2003. - вып. 7, С.9-17.

5. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Видовой состав и некоторые биологические свойства лактобацилл при различных состояниях микроэкологии влагалища //Акушерство и гинекология,- 2000.- № 3. С. 26-28.

6. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях //Л., 1962. 180 с. ,

7. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В., Кондракова О.А. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры//Журн. Рос-хим. им. Д.И.Менделеева. 1994. - Т. 38. - № 6, С. 66-78.

8. Бектимиров Т.А. Экспертиза и испытание иммунобиологических препаратов// Тез. Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» М., 2004. С.10-11.

9. Бланков Б.И., Казьмина Ю.Г. Особенности антагонистической активно• сти E.coli'М-17//В кн.: Кишечные и воздушнокапельные инфекции: Труды МНИИЭМ, т. 13.- М. -1969. - С.387-389.'

10. Блинкова Л.П., Альтшулер М.Л., Горобец О.Б., Дорофеева Е.С. Бактериоци-ны и бактериоциноподобные вещества как биологически активные средства// Клиническое питание 2007, № 1-2, С. 22.

11. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника у взрослых//КМК Scientific Press. -М., 2003,- 220 с.

12. БондаренкоВ.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидобактерий и лактобацилл.//Журн. микробиол., 2006, №2, С.89-97.

13. Бондаренко В.М. Характеристика и терапевтический потенциал проби-отиков по данным клинических испытаний.//Биопрепараты.- 2007. -№1. С.11-15.

14. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г. Идеи И.И.Мечникова и современная микроэкология кишечника человека//. Журн. микробиол., 2008, №5, С.23-29.

15. Брашкина Н.П., Самсыгина Г.А., Першина Г.Д. и др. Линекс в лечении дис-бактериоза кишечника у детей раннего возраста//Сб.: «Человек, и лекарство».-М.,1998. С.257.

16. Брюханов А.Л., Нетрусов А.И. Аэротолерантность строго анаэробных микроорганизмов: факторы защиты от окислительного стресса (обзор)//Прикладная биохимия и микробиология, 2007, том 43, № 6, С. 635-652.

17. Вилыианская Ф.Л., Щетинин И.Н., ГавриловЛ.Ф. и др. Изучение процесса заселения E.coli М-17 кишечника больных острой дизентерией леченных бифико-лом.// Журн. микробиол., 1981, № 6, С. 107-110.

18. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Журн. микробиол., 1999.- № 6, С. 102- 105.

19. Гивенталь Н.И., Соболев В.Р., Ведьмина Е.А. и др.- Лабораторное дело, 1982, № 1, С. 44-48.

20. Гончарова Г.И. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «Сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни: Автореф. дис. кан. биол. наук. -М., 1970. -20 с.

21. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерина: Автореф. дис. док.биол. наук.- М., 1982. 38 с.

22. Гончарова Г.И., Семенова Л.П., Лянная A.M. и др. Бифидофлора человека, ее нормализующие и защитные функции //Антибиотики и мед. биотехнол. 1987, № 3 -С. 179-183.

23. Горская Е.М. Гнотобиологические исследования в определении колонизационной резистентности кишечника.//Антибиотики и химиотер.-1989.-Т.34.-№.-С.601.

24. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.// Научн. доклад па соискание степени док. мед. наук.- Москва.- 1994.- 53с.

25. Грачева Н.М, Поспелова В.В., Трембовля С.И., Вильшанская Ф.Л, Курносо-ва Н.А., Гаврилов А.Ф., Плотникова Л.В., Одинцова И.Л. Бификол в комплексном лечении больных с острыми кишечными инфекциями// Экспресс- информация. М., 1982. -вып. 10. -С.13-18.

26. Грачева Н.М, Гаврилов А.Ф., Щербаков И.Т., Леонтьева Н.И. Эффективность коротких курсов лечения бактериальными биопрепаратами у больных с острыми кишечными инфекциями// Новые лекарственные препараты. Экспресс информация. М., 1990. -вып. 5. -С.9-16.

27. Грачева Н.М., Поспелова В.В., Аваков А.А. и др. Новый бифидосодержащий пробиотик «Бифидин сухой»// Новые лекарственные препараты. Экспресс- информация. М., 2000. -вып.З. -С.37-42.

28. Грачева Н.М., Колганова Н.А., Щербаков И.Т. с соавт. Микробная экология и состояние слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у больных аллергическими заболеваниями//Журн. микробиол., 2004, №2, С.79-81.

29. Григорьев А.В., Бондаренко В.М., Абрамов Н.А. и др. Разработка и клиническая оценка пробиотика «Бифидумбактерин форте»//Журн. микробиол., 1997, №3, С. 92-96.

30. Григорьева В.М, Астанина Л.Н , С.В. Лесняк С.В., Евтухова Л.Н. Чувствительность к антибиотикам бифидобактерий и лактобактерий, используемых для приготовления бифидум- и лактобактерина//Антибиотики и медицинская биотехнология, 1983, N6 с 418-421.

31. Гриценко В. А., Бухарин О. В. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека// Журн. микробиол., 2000, № 3, С. 92-99.

32. Дзагуров С.Г. Проблема стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов//В кн.: Материалы XV Всесоюзного съезда эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов.- Тбилиси 1970, ч. 2, с. 174-177.

33. Евтухова JI.H. Восстановление жизнеспособности бактерий, поврежденных некоторыми физическими факторами: Автореф.дисс.канд.биол.наук.-М.,1969.-14 с.

34. Добрица В.П., Петров Л.Н., Симбирцев А.С., Лобзин Ю.В. Иммунорегуля-ция бактериальными пробиотиками//Тез. Всеросс. научно-практ. конф.«Вакциноло-гия 2008». 11-12 ноября М., 2008, с.49.

35. Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека//Ж. микробиол., 2002, № 5, С. 98 104.

36. Злобин В.Н., Осин Н.С., Помелова В.Г. Перспективы совершенствования средств индикации на основе иммунофлюоресцентного анализа// Вестник РАМН, 1999, № 8, С. 6-8.

37. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Бондаренко В.М. Модуляция иммунной системы лактобактериями//Журн. микробиол., 2004, №6, С.57-60.

38. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Шаповалова О.В. Влияние бактерий рода Lactobacillus на миграционную активность макрофагов//Журн. микробиол., 2006, № 6, С.40-44.

39. Ивановская Н.П., Осин Н.С., Храмов Е.Н., Злобин В.Н. Люминесцентноци-тохимические методы индикации микроорганизмов//Вестник РАМН, 1999, № 8, С.33-39.

40. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфекто-логии /под ред. Онищенко Г.Г., Алешкина В.А., Афанасьева С.С., Поспеловой В.В. ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, М., 2002. 595 с.

41. Карапетян А.О. Биологический антагонизм некоторых представителей кишечной микрофлоры и опухолевых клеток (в свете данных морфологических и бактериологических исследований).//Автореф. дис. канд. мед.наук. -М., 1987.-17 с.

42. Карпушина С.Г., Тюрин М.В., Иванов А.А. и др. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерий' из кишечника человека/Биотехнология. -1998, № 2; С.28-36.

43. Кашковская Н.В. Экспериментально-клиническое обоснование применения биологических микробных препаратов-в гинекологии л и стоматологии: Автореф. дис.канд.биол.наук. -М., 1992. -17 с.

44. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М. "Наука", 1975. - 392 с.

45. Коваленко Н.К, Биология молочнокислых бактерий пищеварительного тракта человека и животных: Автореф. дис. докт. биол. наук. -Киев, 1991.-29 с.

46. Козлова Э.П., Гончарова Г.И., Лянная-А.М. и др.Бифидумбактерин*в,лечении и профилактике дисбактериоза кишечника//Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация: -М., 1987. вып.4. -С.6-13.

47. Козлова4Э.П., Грачева Н:М:, Лянная A.M. и др. Перспективы использования бифидобактерий разных видов в составе лечебно-профилактических средств// Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация:-М.,1987.- вып.4.-С.14-19.

48. КоротяеВ'А.И. Механизмы саморегуляции бактериальной клетки. М., «Медицина», 1973.

49. Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника и коррекция микрофлоры анти-биотикоустойчивыми бифидобакгериями: Автореф.дис.док.мед.наук.-М., 1983.-42с.

50. Курепина Н.Е., Хмель И.А. Микроцины: природа и генетическое детерминирование//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1986, № 4, С.3-10.

51. Ленцнер А.А. Лактобациллы микрофлоры человека: Автореф. дис. док. мед. наук.- Тарту, -1973, 32 с.

52. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиот. и мед. биотех.- 1987. -32, № З.-С. 173-179.

53. Лизько Н.Н., Шилов В.М. Ж. Применение метода часовых стекл при исследовании кишечной микрофлоры //Лабораторное дело. 1979, № 7, С. 430-433.

54. Лесняк С.В., Шимчук Л.Ф., Евтухова Л.Н. и др. Разработка и изучение предполагаемого референс-препарата колибактерина // В кн.: Стандарты, штаммы и методы контроля вирусных, бактерийных препаратов и аллергенов. Сб. научных трудовМ., 1975.-С. 115-121.

55. Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю, Лиходед Н. В. и др. Состояние антиэндоток-синового иммунитета при экспериментальном кишечном дисбакгериозе у мышей.// Журн. микробиол.;.1998, №4, С. 14-16.

56. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Изачик Ю.А. и др. Коррекция про-биотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей//Журн. микробиол., 1996, № 2, С. 88-91.

57. Лянная A.M. Видовой состав коллекции бифидобактерий и их биологические свойства: Автореф. дис.канд.биол.наук. -М., 1981. -21 с.

58. Лях С.П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам.// М., «Наука». 1976.- с. 1-160.

59. Малик Н.И., Панин А.Н., Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био № 3(18), март 2002.

60. Мейсель М.Н. Люминесцентно-микроскопический анализ функционального состояния живого вещества-Изв. АН СССР. Сер. физ., 1951, т. 15, № 6, 778.

61. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания. М. : Информационно-издательский центр МЗ России, 1998.- 128 с.

62. Мечников И.И. Молочнокислые микробы и польза, приносимая ими здоровью СПБ изд. М.П. Петрова.-1911. 32 с.

63. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс -диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Автреф. дис. докт. мед. наук. 1998. -37 с.

64. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине, (пер. с англ.). М., «Медицина», 1978.- 600 с.

65. Мухаммедов И.М., Шадиев Х.К., Абдуллаев М.И. с соавт. Нарушения микрофлоры кишечника и иммунной системы у детей, больных витилиго. Журн. микробиол., 2004, №2, С.74-76.

66. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., 1982.-С. 38-49.

67. Несчисляев В.А. Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов: Автореф. дисс.докт.мед.наук. Пермь, 2005, 47 с.

68. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М., 2004; Роль цитокинов в модуляции иммунореактивности организма бактериями родаLactobacillus Л Журн. микробиол., 2004, №6, С. 101-106.

69. Новик Г.И. Исследование' структурно-функциональной организации бифиг добактерий//Микробиология. Ж. -1998, № 3, С.376-383.

70. Осипова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиог тиков//Автореф. дисс:докт.бйол.наук.-М;-2006.-48 с.

71. Пёретц Л.Г. Значение нормальной, микрофлоры;для организма человека -М., 1955.- 431 с.

72. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М: «Мир», 1978.

73. Петров Л.Н., Вербицкая Н:Б., Дабрица В.П1, Галкин Г.Н., Петров Н.Л. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. С-Петербург, 2008,- 136 с.

74. Пинегин Б.В:, Коршунов В.М., Гладько Я.А. и др. Совместное использование антибиотиков- и антибиотикоустойчивых бифидобактерий при лечении острых кишечных инфекций//Журн. микробиол., 1983, № 5; С. 28-32.

75. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колонизационной резистентности.//Антибиотики и колонизационная резистентность./Труды ВНИИ антибиотиков .- М. -1990. -вып.Х1Х. -С.15-25.

76. Поспелова В.В. Микробные биопрепараты для коррекции бакгериоценоза кишечника, их конструирование и применения. Автореф. дисс. докт. мед. наук. -М., 1979.-38 с.

77. Поспелова В.В., Черепанова Ю.В., Волкова Е.В., Лахтин В.М., Агапова Ю.В. Разработка пробиотиков наружного применения на основе лактобацилл// Клиническое питание, 2007.- №1-2, с.А 63.

78. Ратникова И.А., Гаврилова Н.Н., Колокова Н.Н. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий//Биотехнология.-1995. № 5-6. - С. 19-20.

79. Рахимова Н.Г. Комплексный биологический препарат бификол и его осо-бенности//В кн: Эпидемиология, клиника, профилактика и лечение острых и хронических кишечных инфекций. М., 1975,т. 15, с. 113-116.

80. Рахимова Н.Г. Разработка комплексного бактерийного препарата бификол и его эффективность при кишечных расстройствах, связанных с дисбактериозом: Ав-тореф. дис.кан.биол.наук. -М., 1977. -16 с.

81. Савицкая И.С., Бондаренко В.М. Подавление мутагенной активности метаболитов кишечника при нормобиоценозе//Журн. микробиол., 2008, №3, С.53-58.

82. Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет мик-роорганизмов//ГОУ ВПО УГТУ-УПИ 2005.

83. Саливан А., Норд К. Место пробиотиков в терапии инфекций желудочно-кишечного тракта у человека.// Клинич. микробиол. и антимикробная химиотерапия 2003, Т.5, № 3, С. 275-284.

84. Суворов А.Н., Захаренко С.М., Алехина Г.Г. Энтерококки как пробиотики выбора// Клиническое питание. 2003. № 1. С 26-29.

85. Сундукова М.Б. Исследование размножения бифидобактерий в стерильном молоке//В кн: Использование микробиологических процессов при производстве цельномолочных продуктов и молочных консервов. -М, 1983. -С. 14-18.

86. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Поспелова В.В. и др. К механизму антагонистической активности лакгобацилл// Журн. микробиол, 1989, № 2, С.3-8.

87. Ушакова А.Ю., Феклисова Л.В. Мескина Е.Р. Тедер Ю.Г. Волохович Т.Т., Пожалостина Л.В. Клинико-лабораторная эффективность применения различных схем аципола в лечении детей, больных острыми кишечными инфекциями// Биопрепараты. 2008, №2, С. 19-21.

88. Фихман Б.А. Рефрактометрия бактерий. В кн.: Эксериментальная микроио-логия. София, 1965, С. 207-230.

89. Халенева М.П. Эффективность разных составов накопления и обезвоживания биомассы в производстве таблетированного бифидумбактерина: Авто-реф.дис.канд.био.наук. М., 1989. -23 с.

90. Чард Т. Радиоиммунологические методы: Пер. с англ./ Перевод Морозовой М.С.; Под ред. и с предисл. Я. М. Варшавского.- М., Мир, 1981,- 248 с.

91. Чахава О.В. Гнотобиологические аспекты изучения нормальной микрофлоры// В кн.: Тез.докл.ХУТ Всесоюз.съезда микробиологов и эпидемиологов. -ч.1.-М., 1977.-С.255-256.

92. Чахава О.В., Горская Е.М., Рубан С.З. Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии//М.- Медицина.- 1982.- 152 с.

93. Червин В.В., Червинец В.М., Бондаренко В.М., Базлов С.Н. Язвенная болезнь, хронический гастрит и эзофагит в аспекте дисбактериоза эзофагогастродуо-денальной зоны. Тверь: ООО «изд. «Триада», 2004. - 200 с.

94. Червинец В.М., Бондаренко В.М., Самоукина A.M., Червинец Ю.В Скрининг непатогенных антагонистически активных штаммов Enterococcus faecium// Журн. микробиол., 2007, № 1, С.57-61.

95. Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Шабанова Н.А. и др. Бактериоциноген-ные высокоантагонистические штаммы лактобацилл. //Журн. микробиол., 2006, №7, С.78-82.

96. Черняховер С.И., Кожевникова Т.П. Использование окислительных ферментов в качестве теста определения количества живых бактерий в вакцине БЦЖ// В кн.: Вакцины и сыворотки. Сб. трудов ГИСК им. JI.A. Тарасевича. М., 1971, вып. 10, С. 24-26.

97. Чеснокова BJI. Варианты штамма E.coli М17, перспективные для получения эубиотиков: Автореф. дис.канд.мед.наук., М. 1998,- 20 с.

98. Чешева В.В., Манвелова М.А. Питательные среды для культивирования бифидобактерий. Обзор. Проблемы медицинской биотехнологи и иммунологии инфекционных болезней//Сб.науч.тр. -М., 1996. -т.2. -С.84-90.

99. Чудинов А.В., Савицкий А.П., Злобин В.Н.Люминесцентный ультрамикроанализ для одновременного определения биологических и химических веществ: методология и пути решения//Вестник РАМН № 8, 1999, С. 15-20.

100. Чупринина Р.П. Биопрепараты: требования к отбору производственных штаммов, оценка показателей, проблемы стандартизации // Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. -М ., 2002.-С. 10-11.

101. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание/Атом 1: Микрофлора человека и животных и ее функции.-«Грант»-М., 1998. -287 с.

102. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание// том 2: Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. Грант». -М., 1998. - 413 с.

103. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.З: Пробиотики и функциональное питание. М, 2001. - 288 с.

104. Шимчук Л.Ф. Стандартизация колибактерина.// Автореф. кан. биол. наук -М. -1983. -22 с.

105. Щербаков И.Т., Гаврилов А.Ф., Грачева Н.М. и др. Влияние лакто-содержащих бактерийных биологических препаратов на процессы репарации в слизистой оболочке толстой кишки//Сб.науч.тр. МНИИЭМ: Иммунобиологические препараты.-М., 1989.-С 157-161.

106. Щербакова Э.Г., Грачева Н.М. Щербаков И.Т. и др. Морфофунк-циональное состояние слизистой оболочки кишечника при применении бифилиза у больных острыми кишечными инфекциями//Сб. статей: Пробл. лимфологии и количественной патологии. М., 1997. - С.114.

107. Янковский Д.С. Состав и функции микробиоценозов различных биотопов человека// Журн. Здоровье женщины 4(16)/2003. -с.145-158.

108. Agarwal R.K. Probiotics: the health friendly gut bacteria. Indian Pediatr. 2008 Dec; 45(12):953-4.

109. Amor K. Ben, Vaughan E.E., and de Vos W.M. Advanced molecular tools for the identification of lactic acid bacteria J. Nutr., March 1, 2007; 137(3): 741 747.

110. Bailey M. The mucosal immune system: Recent developments and future directions in the pig. Dev Comp Immunol. 2009; 33(3):375-83.

111. Begley M., Hill C., Gahan C.G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72: 1729-1738.

112. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract: the role of probiotic flora. Gut 1998; 42:2-7.

113. Bengmark S. Immunonutrition: role of biosurfactants, fiber and probiotic bacteria. Nitrition. 1998; 14 (7-8): 585-594.

114. Benno Y., Endo K., Takeo M., et al. Comparison of fecal microflora of elderly persons in rural and urban areas of Japan. Apl. Environ. Microbiol. 1989; 5:1100-1105.

115. Bergey's manual® of Systematic Bacteriology. Williams & wilkins.1984., v.l, 964 c.

116. Bjoorksten B. Evidence of probiotics in prevention of allergy and asthma. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2005; 4:599-604.

117. Bomba A., Nemcova R., Herich R. et al. Interaction of Lactobacillus spp. and enteropathogenic Escherichia coli under in vitro and in vivo conditions. Vet. med. 1996; 41(5):155-158.

118. Brown A.C., Valiere A. Probiotics and medical nutrition therapy. Nutr Clin Care. 2004; 7(2):56-68. Review.

119. Callaway T.R., Edrington T.S., Anderson R.C., Harvey R.B., Genovese K.J., Kennedy C.N., Venn D.W., Nisbet D.J. Probiotics, prebiotics and competitive exclusion for prophylaxis against bacterial disease. Anim Health Res Rev. 2008 Dec;9(2):217-25.

120. Camilleri M. Probiotics and irritable bowel syndrome: rationale, mechanisms and efficacy. J Clin Gastroenterol. 2008; 42 (suppl 3): 123-5.

121. Carr F.J., Chill D., Maida N. The lactic acid bacteria: a literature survey. Crit Rev Microbiol. 2002; 28(4):281-370.

122. Corcoran B.M., Ross R.P., Fitzgerald G.F., Stanton C. Comparative survival of probiotic lactobacilli spray-dried in the presence of prebiotic substances. J Appl Microbiol. 2004; 96(5): 1024-39.

123. Cross M.L. Microbes versus microbes: immune signals generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002; 34:245-53.

124. Cross M.L., Ganner A, Teilab D, Fray L.M. Patterns of cytokine induction by gram-positive and gram-negative probiotic bacteria. FEMS Immunol Med Microbiol. 2004;42:173-80.

125. Drago L, Gismondo M.R., Lombardi A. et al. Inhibition of in vitro growth of enteropathogen by new lactobacillus isolates of human intestinal origin. FEMS microbial Lett, 15:153(2):455-463, 15 Aug 1997.

126. Drasar В., Hill M. Human intestinal flora. London: Acad, press, 1974. 261 p.

127. Elliott S.J., Krejany E.O., Mellies J.L. et al. Esp G, a novel type III system-secreted protein from enteropathogenic Escherichia coli with similarities to VirA of Shigellaflexneri. Infect Immun. 2001; 69(6):4027-4033.

128. Galdeano C.M., Perdigon G. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation. J Appl Microbiol. 2004; 97(4):673-81.

129. Gibson D.L., Vallance B.A. Intestinal microbiota are transiently altered during Salmonella-induced gastroenteritis. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; 2(4):525-9.

130. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic micro-biota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutr. 1995; 125(6):1401-1412.

131. Goerg K.J., Schlorer E. Probiotic therapy of pseudomembranous colitis. Combination of intestinal lavage and oral administration of Escherichia coli. Dutsch. Med. Wochenschrift. 1998; 123(43):1274-1278.

132. Gratz S, Mykkanen H, Ouwehand A.C., Juvonen R, Salminen S, El-Nezami H. Intestinal mucus alters the ability of probiotic bacteria to bind aflatoxin Bi in vitro. Appl Environ Microbiol. 2004 Oct;70(10):6306-8.

133. Guarino A, Lovecchio A, Canani R.B. Probiotics as prevention and treatment for diarrhea. Curr Opin Gastroenterol. 2009 Jan;25(l):18-23.

134. Haskard C. A., El-Nezami H.S., Kankaanpaa P.E., Salminen S., Ahokas J.T. Surface binding of aflatoxin Bi by lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67:3086-3091.

135. Hoffman F.A. Development of probiotics as biologic drugs. Clin Infect Dis. 2008 Feb 1; 46 (suppl 2): 125-7.

136. Howarth G.S. Inflammatory bowel disease, a disregulated host-microbiota interaction: are probiotics a new therapeutic option? J Gastroenterol Hepatol. 2008; 23(12):1777-9.

137. Hsieh M.H., Versalovic J. The human microbiome and probiotics: implications for pediatrics. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 2008 Nov-Dec; 38(10):309-27.

138. Hsu C.A., Yu R.C., Chou C.C. Production of beta-galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions. Int J Food Microbiol. 2005 Oct 15; 104(2): 197-206.

139. Huebner E.S., Surawicz C.M. Probiotics in the prevention and treatment of gastrointestinal infections. Gastroenterol Clin North Am. 2006 Jun; 35(2):355-65.

140. Isolauri E, Arvola T, Siitas Y, Salminen S. Probiotics in the management of atopic eczema. Clin Exp Allergy. 2000; 30: 1605-10.

141. Kailasapathy K., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol Cell Biol. 2000 Feb;78(l):80-8.

142. Kasper H. Protection against gastrointestinal diseases present facts and future developments. J. Food Microbiol. 1998; 41(2):127-131.

143. Kim G.B., Yi S.H., Lee B.H. Purification and characterization of three different types of bile salt hydrolase from Bifidobacterium strains. J. Dairy Sci. 2004; 87:258-266.

144. Kim G.B., Brochet M., Lee B.H. Cloning and characterization of a bile salt hydrolase (bsh) from Bifidobacterium adolescentis. Biotechnol. Lett. 2005; 27:817-822.

145. Klayraung S., Viernstein H., Okonogi S. Development of tablets containing probiotics: Effects of formulation and processing parameters on bacterial viability. Int J Pharm. 2009; 370(l-2):54-60.

146. Kligler В., Cohrssen A. Probiotic. Am Fam Physician. 2008; 78(9): 1073-8.

147. Kocourkova I., Ladnikova R., Zizka J., Rosova V. Effect of oral application of a probiotic E. coli strain on the intestinal microflora of children of allergic mothers during the first year of life. Folia Microbiol (Praha). 2007; 52(2): 189-93.

148. Lee S.K., Kim V.B., Ji G.S. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis. J.Appl.Microbiol. 1997; 83(3):267-272.

149. Liong M.T. and Shah N.P. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains. J. Dairy Sci. 2005; 88:55-66.

150. Liopis M., Antolin M., Guarner F., Salas A., Malagelada J.R. Mucosal colonization with Lactobacillus casei mitigates barrier injury induced by exposure to trinitroben-zene sulphonic acid. Gut. 2005; 54:955-9.

151. Lizko N.N., Vikha G.V., Korolkov V.I. et al. The effect of adaptohit on the state of intestine microbiocenosis on the primate experimental models. Bioscience and Microflora. 1997; 16 (suppl 2): 24-26.

152. Lyons T.P., Fallen R.J. The probiotic concept: coming of age. World Biotech. Report. 1986; 2(7): 69-80.

153. Marin M. L., Lee J.H., Murtha J. et al. Differential cytokine production in clonal macrophage and T-cell lines cultured with bifidobacteria. J. Daryg Sci. 1997; 80(11):2713-2720.

154. Marteau P., Pochart P., Dore J., Bera-Maillet C., Bernalier A., Corthier G. Comparative study of bacterial groups within the human cecal and fecal microbiota. Appl Environ Microbiol. 2001;67:4939-42.

155. Marteau P., Boutron-Ruault M.C. Nutritional advantages of probiotics and pre-biotics. British Journal of Nutrition. 2002; 87 (suppl. 2): 153-157.

156. Masco L., Van Hoorde K., De Brandt E., Swings J., Huys G. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products. J An-timicrob Chemother. 2006 Jul; 58(l):85-94.

157. Mayer L. Mucosal immunity and gastrointestinal antigen presentation. Pediatr Gastroenterol Immunol 2000; 30(Suppl): 4-12.

158. Milinkovic M., Vlajinic S. Relationship between oxygen consumption and colony count test.//Symposia series Immunobiological standardization, 1971; 17:227-232.

159. Modler G.W., McKellar R.C., Yaguchi M. Bifidobacteria and bifidogenic factors. J Inst Can Sci Technol Ailment 1990; 23:29-41.

160. Nomoto K., Yokokura Т., Mitsuyama M. et al. Prevention of indigenous infection of mice with Escherichia coli by nonspecific immunostimulation. Antimicrob. Agents and Chemother. 1992; 36(2):361-367.

161. Orhage K., Nord C.E. Bifidobacteria and lactobacilli in human health. Drugs Exp. And Clin. Res. 2000; 26(3):95-lll.

162. Ouwehand A.C., Kurvinen Т., Rissanen P. Use of a probiotic Bifidobacterium in a dry food matrix, an in vivo study. Int J Food Microbiol. 2004; 95(l):103-6.

163. Pereira D.I., Gibson G.R. Effects of consumption of probiotics and prebiotics on serum lipid levels in humans. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2002; 37:259-281.

164. Posrigon G., Maldonado Galdeano C., de Moreno de LeBlanc A., Vinderola G., Bibas Bonet M.E. Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria. Clin. Vaccine Immunol. 2007; 14(5):485-492.

165. Reid G., Devillard E. Probiotics for mother and child. J Clin Gastroenterol. 2004; 38(suppl 6):94-101.

166. Rosenfeldt V., Michaelsen K.F., Jakobsen M. et al. Effect of probiotic Lactobacillus strains in young children hospitalized with acute diarrhea. Pediat. Infect. Disease J. 2002; 21(5):411-416.

167. Saarela M., Matto J., Mattila-Sandholm T. Safety aspects of Lactobacillus and Bifidobacterium species originating from human oro-gastrointestinal tract or from probiotic products. Microbial Ecology in Health and Disease. 2002; 14:233-240.

168. Saavedra J. M. Use of probiotics in pediatrics: rationale, mechanisms of action, and practical aspects. Nutr Clin Pract. 2007; 22(3):351-365.

169. Samartsev A.A., Astanovich N.L, Novik G.I. Features of growth and formation of extracellular proteinases of Bifidobacterium adolescentis 94-BJM. Microbiologic. 1997; 66(5):635-639.

170. Schultz M., Lindstrom A.L. Rationale for probiotic treatment strategies in inflammatory bowel disease. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; 2(3):337-55.

171. Shi H.N., Walker A. Bacterial colonization and the development of intestinal defences. Can J Gastroenterol. 2004;,18(8):493-500.

172. Snelling A.M. Effects of probiotics on the gastrointestinal tract. Curr Opin Infect Dis 2005; 18:420-6.

173. Sutton A. Environmental assessment requirements for live biological drugs. Clin1.fect Dis. 2008; 46 Suppl 2:112-4.

174. Sutton A. Product development of probiotics as biological drugs. Clin Infect Dis. 2008; 46 (suppl 2): 128-32.

175. Tannock G.W., Dashkevicz M.P., Feighner S.D. Lactobacilli and bile salt hydrolase in the murine intestinal tract. Appl. Environ. Microbiol. 1989; 55:1989-1992.

176. Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora. Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73(suppl):410-414.

177. Trois L., Cardoso E.M., Miura E. Use of probiotics in HIV-infected children: a randomized double-blind controlled study. J Trop Pediatr. 2008; 54(1): 19-24.

178. Troost F.J., van Baarlen P., Lindsey P., Kodde A., de Vos W.M., Kleerebezem M., Brummer R.J. Identification of the transcriptional response of human intestinal mucosa to Lactobacillusplantarum WCFS1 in vivo. BMC Genomics. 2008; 9:374.

179. Tsai Y.T., Cheng P.C., Fan C.K., Pan T.M. Time-dependent persistence of enhanced immune response by a potential probiotic strain Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101. Int J Food Microbiol. 2008; 128(2):219-25.

180. Van der Kleij H., O'Mahony C., Shanahan F. et al. Protective effects of Lactobacillus reuteri and Bifidobacterium infantis in murine models for colitis do not involve the vagus nerve.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008; 295(4): 1131-7.

181. Van der Waaij D. Antibiotic choice: The importance of colonization resistance. N.Y.: Acadlmic Press, 1983. 298 p.

182. Van-Laere K.M., Beldman G., Voragen A.G. A new arabinofuranohydrolase from Bifidobacterium adolescentis able to remove arabinosyl residues from doublesubstituted xylose units in arabinoxylan. Appl.Microbiol. Biotechnol. 1997;47(3):251-255.

183. Vinderola C.G., Mocchiutti P., Reinheimer J.A. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products. J Dairy Sci. 2002; 85(4):721-9.

184. Vinderola G., Matar C., Palacios J., Perdigon G. Mucosal immunomodulation by the non-bacterial fraction of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389. International Journal of Food Microbiology. 2007; 115:180-186.

185. Wagner R.D. Effects of microbiota on GI health: gnotobiotic research. Adv Exp Med Biol. 2008; 635:41-56.

186. Watson D., Sleator R.D., Hill C., Gahan C.G. Enhancing bile tolerance improves survival and persistence of Bifidobacterium and Lactococcus in the murine gastrointestinal tract. BMC Microbiol. 2008; 8:176.

187. WHO/TB/Technical Guide 1977. № 9.

188. Ya Т., Zhang Q., Chu F. et al. Immunological evaluation of Lactobacillus casei Zhang: a newly isolated strain from koumiss in Inner Mongolia, China. BMC Immunol. 2008; 9:68.

189. Yan F., Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells. J. Biol. Chem. 2002; 277:50959-50965.

190. Yaskari J., Kontula P., Siitoneri A. et. al. Oat betaglucan and xylan hydrolysates as selective substrates for Bifidobacterium and Lactobacillus strains. Appl. Microbiol. Biotechhnol. 1998: 49(2): 175-181.

Информация о работе

Евлашкина, Вера Францевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы