Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов

Дарсания, Маквала Шотаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов"

На правах рукописи

РГБ ОД

ДАРСАНШ Маквала Шотаевна

МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА. ОБЕЗЬЯН И ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛЕЧЕБНЫХ БИШШ1АРАТШ 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского Министерства здравоохранения РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.В.Поспелова доктор медицинских наук, профессор Э.К.Дикидзе

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор К.И.Савицкая доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Лизько

Ведущая организация:

Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича

Защиту диссертации состоится "с*7 " ^СЩ^)^ 20(30 г. в /0 часов на заседании диссертационного совета Д 064.18.01 в Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского МЗ К& по адресу: 125212, г.Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

С.Ю.Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обезьяны являются высокочувствительной и наиболее адекватной живой моделью для изучения различных форм клиническое патологии человека, расшифровки патогенеза заболеваний, разработки и испытания новых средств терапия (Б.А.Лапин с соавт., 1963; З.П.Фридман, 1972; В.В.Поспвлова с соавт., 1986; Н.Н.Лизько с соавт., 1992; ~/К , 1993;

^■л&^-Склел .1994; ¿Йгс^^г^ ЗГр? г

1995 и др.). Доставка этих животных из ареалов естественного обитания в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки сопряжена с переменой климатических условий, температурного режима и рационов питания, а также с резким ограничением подвижности при переходе к содержанию в неволе (Ж.Ш.Сарсания, 1990). Эти факторы оказывают отрицательное влияние на состояние естественной резистентности обезьян, способствуют развитию дисбиотических нарушений и повышают восприимчивость к инфекционным заболеваниям. Формированию дисбактериоза кишечника и неспецифических диарей у обезьян впаообствуют также мероприятия по санации антибиотиками на фермах экспортных компаний во время закупки этих животных (Н.Н.Лизько с соавт., 1992, 1997; А.А.Ленцнер с соавт., 1991 и др.).

Таким образом, процесс акклиматизации обезьян является весьма ответственным этапом подготовки этой высокоценной модели к медико-биологическим исследованиям. Одна из важнейших задач этого этапа заключается в восстановлении физиологической нормы микробного ценоза пищеварительного тракта обезьян, с которым связана регуляция таких жизненно ванных функций организма, как ферментативные процессы, синтез витаминов, формирование иммунологической реактивности и общей неспецифической резистентности. Как известно, в медицинской практике при дисбиотических нарушениях микрофлоры пищеварительного тракта находят широкое применение биопрепараты из живых бактерий симбиотической микрофлоры разного видового состава (Н.М.Грачева с соавт., 1990, 1999; В.В.Поспелова с соавт., 1997; А.А.Воробьев с соавт., 1998 , 1989;

¿М, , 1995; -ЗС'г? ¿/-а* , 1996;

. «Зй^*. , 1998 и др.).

фекций, а в условиях снижения естественной резистентности часто страдают клинически выраженными формами дисбактериозов (Б.А.Лапин 1981; В.И.Дкобава с соавт., 1990; , 1962;

1991; У, , 1996;

1997 И др.).

Согласно разработанным ранее Методическим рекомендациям (Б.А.Лапин с соавт., 1966), при дисбактериозах кишечника у обезья целесообразно применение микробных биопрепаратов медицинского наз начения - колибактерина, бифидумбактерина, бификола (Э.К.Дкикидзе с соавт., 1964, 1986; Б.А.Лапин с соавт., 1867; Н.Н.Лизько с соавт., 1991; Г.В.Виха с соавт., 1997 и др.).

Бифидобакгерии как основные представители симбиотического биоценоза кишечника являются важным фактором физиологической нормы человека и высших животных ( 1997).

Видовой состав рода бифидобактерий включает значительное чис ло вариантов, которые свойственны разным возрастным группам хозяев-носителей. Известна смена вида В. , свойственного грудным детям, на вид В. у детей старшего возраста и взрослых. Публикации последних лет свидетельствуют о возрастающем внимании к данному виду бифидобактерий как отличающемуся гаммой биолого-генетических особенностей от представителей других

ВИДОВ Х^. , 1997; ¡Яг^^ь-Т^ен/^^*^

1997; /^-г , 1997 и др.).

ется как единственно встречающийся у обезьян вид бифидобактерий, однако разработки средств бактериальной терапии для обезьян с использованием бифидобактерий данного вида ранее не проводилось.

Изложенное состояние проблемы определило цель настоящего исследования и круг решаемых конкретных задач работы.

Цель работы; охарактеризовать состояние микроэкологии содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и возрастных групп и на этой модели обосновать применение пробиотиков, содержащих бифидобактерии вида В. _ и иммуноглобулинового

препарата КИП.

Задачи исследования:

- провести сравнительное изучение микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов;

- изучить видовой состав бифидофлоры у разных видов и возрастных групп обезьян;

- определить показатели дисбиотических нарушений микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян в процессе акклиматизации и после антибиотикотерапии;

- апробировать кукурузно-лактозную питательную среду для выявления и лабораторного культивирования бифидобактерий;

- дать сравнительную оценку антагонистической активности и активности кислотообразования у штаммов бифидобактерий, свежевы-целенных от обезьян;

- принять участие в доклинической апробации нового пробиоти-ка из бифидобактерий вида В. аЖ&лсялЛ-их ("Бифидин сухой")

а комплексного иммуноглобулинового препарата КИП.

Научная новизна работы. Дана сравнительная характеристика ликрофлоры содержимого толстой кишки обезьян разных видов и возрастных групп;

- в составе бифидофлоры обезьян семейства мартышкообразных з возрасте 1-5 лет выявлено наиболее частое (55-70 %) выделение 3. у представителей видов макак резус, ма-¡еак лапундер, макак яванский, макак бурый, зеленая мартышка и пре-эбладание В. (до 70 %) у павианов гамадрилов; от детенышей обезьян, независимо от вида, выявлена наиболее частая вы-зеваемость В. ;

- установлено сходство дисбиотических нарушений микроэкологии содержимого толстой кишки у страдавдих диареей обезьян в процессе акклиматизации в карантинных группах и после курса антибио-гикотерапии в связи с перенесенной ОКИ;

- выявлена микробная обсемененность содержимого желудка у слинически здоровых обезьян в группе карантина, что указывает на глубину дисбиотических поражений организма зтих животных в провесе акклиматизации;

- показано отсутствие корреляции между антагонистической активностью и активностью кислотообразования у штаммов бифвдобакте->ий, свежевыделенных от обезьян;

- в результате доклинических испытаний впервые обоснована

перспективность применения нового микробного биопрепарата из бифидобактерий вида В. , которые ранее не использовались в производстве пробиотиков в России, а также энте-ральной и ректальной форд комплексного иммуноглобулинового препарата КШ;

- получено Авторское свидетельство на способ лечения диа-рейных заболеваний у обезьян с применением иммуноглобулинового препарата КИП;

получено Удостоверение на рацпредложение по методике исследования содержимого желудка обезьян при помощи фиброволоконного эндоскопа.

Практическая значимость работы-

- определены критерии оценки микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и разных возрастных групп, что может быть использовано в качестве модели при исследованиях медицинского плана, а также в работе ветеринарных служб питомников и зоопарков;

- предложено использование нового микробного биопрепарата "Бифидан сухой" на основе бифидобактерий В.

и комплексного иммуноглобулинового препарата КИП при диареях, связанных с дисбиотическими нарушениями микрофлоры кишечника у обезьян.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Состав микрофлоры содержимого толстой кишки у здоровых обезьян разных видов семейства мартышкообразных однотипен.

- Бифидофлора взрослых обезьян макак резус, макак лапундер, макак яванский, макак бурый, мартышка зеленая представлена преимущественно видом В_ ; от павианов гамадрилов с наибольшей частотой высеваются В. у детенышей обезьян, независимо от вида, преобладают бифидобактерии В. - -¿-^'¿¿¿игг^

- Кукурузно-лактозная питательная среда как простая по составу и обеспечивающая стандартность результатов может быть использована при бактериологических исследованиях на дисбактериоз

кишечника и лабораторном культивировании бифидобактерий;

- Бифидобактерии штамма В. лг/о^^^'х МС-42 и комплексный иммуноглобулиновый препарат КШ целесообразно использовать в составе средств для коррекции бактериоценоза кишечника и купирования диарейного синдрома, в том числе у обезьян.

Работа выполнялась в соответствии с научными планами НИР МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского и Института медицинской приматологии РАМН.

Основные результаты исследований, приведенные в диссертации, получены автором лично. Наблюдения за эффективностью микробных биопрепаратов у обезьян проводились совместно с к.м.н. С.А.Шаги-нян; эксперименты по применению препарата КШ выполнялись совместно с к.б.н. И.В.Борисовой, инструментальное обследование обезьян при помощи фиброволоконного эндоскопа осуществлялось совместно с д.б.н. И.Б.Сорокуловой и врачом А.В.Тофаном.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета "Иммунология и медицинская биотехнология" ШИИШ им. Г.Н.Габричевского. Результаты работы доложены и обсуждены на конференции молодых учета МНИИШ им. Г.Н.Габричевского "Клинико-лаборатор-ные аспекты исследований в инфекционной патологии", Москва 19-21 января 1367 г.; на Всесоюзной конференции "Вопросы медицинской приматологии. Наиболее перспективное использование обезьян в медицине и биологии" (Сухуми, 1967 г.); на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований" (Москва, 1968 г.); на конференции молодых ученых МНИИШ им. Г.Н.Габричевского "Актуальные проблемы эпидемологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний (Москва, 1996 г.); на Всесоюзной научно-практической конференции, посвященной 100-летию основания МНИИЗЛ им. Г.Н.Габричевского "Дисбактериозы и эубиотики" (Москва, 1996 г.); на юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИЭПиТ, с участием России и стран дальнего зарубежья "Актуальные проблемы медицинской приматологии" (Сухуми, 1997 г.); на Российской конференции "Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях" (Москва, 2000 г.).

Внедрение результатов работы

Основные положения диссертации внедрены в практику работы питомника обезьян Института медицинской приматологии РАМН. С це-

лью коррекции микрофлоры кишечника обезьян при дисбактериозах различного генеза и диареях применяются бифидосодериащие микробные биопрепараты, предпочтительно бифидин и комплексный иммуно-глобулиновый препарат КИП. При бактериологических исследованиях микрофлоры кишечника используется с положительным эффектом куку-рузно-лактозная питательная среда. Материалы доклинической апробации экспериментальных серий бифидина использованы при обосновании внедрения данного препарата в практику здравоохранения РФ.

Публикации

Материалы диссертации отражены в II опубликованных работах, получены Авторское свидетельство и Удостоверение на рацпредложение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы в 3-х частях, 4 глав собственных исследований, заключения и выводов.

Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами и 4 рисунками.

Список цитированной литературы содержит 125 работ на русском и 55 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследований

При исследованиях микрофлоры содержимого толстой кишки обезьян использовались принятые в медицине приемы, изложенные в Методических рекомендациях по клинической бактериологии и диагностике дисбактериоза кишечника (Грачева Н.М., Гончарова Г.И., Ава-ков A.A. и др., IS66; Грачева Н.М., Оцук Н.Д., Чупринина Р.П., 1999), с применением соответствующих селективных и дифференциаль но-диагностических сред: Левина, Плоскирева, Эндо, Калины, жел-точно-солевого агара с цистином.

В ходе первичных исследований микрофлоры пищеварительного тракта обезьян были выборочно, на 10 обезьянах, исследованы пробы содержимого желудка. Для забора проб пользовались фиброволо-конным эндоскопом модели ХР 10 фирмы ./S^y^i . Перед

началом процедуры осуществляли общую внутривенную анестезию при помощи калипсола из расчета 2 мг/кг веса животного. Стерильный поливиниловый катетер, наполненный стерильным физраствором, вводили обезьяне через рот до дистального конца эндоскопа. Эндоскоп

вводили в луковицу двенадцатиперстной кишки, после чего выдвигали катетер в просвет луковицы и удаляли из него полностью физраствор при помощи шприца. Затем эндоскоп возвращали в желудок и катетером при помощи шприца производили забор содержимого в объеме 3-6 мл. Полученные пробы помещали в стерильные пробирки и подвергали бактериологическому исследованию.

Для выделения и количественного учета бифидобактерий, наряду с принятой согласно Методическим рекомендациям, печеночно-цис-тиновой средой (Грачева Н.М., Гончарова Г.И., Аваков A.A. и др., IS66), использовали разработанную с нашим участием среду нового состава, кукурузно-лактозную, которая рекомендована Лабораторным Советом Минздрава РФ. В сравнительных исследованиях по оценке эффективности новой среды использовали также казеиново-дрожжевую среду, утвержденную в составе технологической документации на би-фидумбактерин.

При дифференциации выделяемых штаммов бифидобактерий до вида пользовались набором углеводов (I %) следующего состава: ара-биноза, ксилоза, целлобиоза, сорбит, салицин, трегалоза, крахмал. Основу среды составляли: мясная вода - 0,3 %, бактопептон - I %, 0,5 %, индикатор бромкрезолпурпур (1,6 %-тй спиртовый раствор - 2 мл.

Изучение антагонистической активности выделенных штаммов бифидобактерий проводили в условиях плотных и жидких питательных сред, пользуясь методом "отсроченного антагонизма" согласно технологической документации на бифидумбактерин и методом развивающихся смешанных популяций, регламентированным технологией производства бификола. Объектами антагонизма служили музейные штаммы, полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасовича: ¿fAs ^^e^J (подтип 2а № 170 и Ш 337, . ^¿реЛА^я&ъе? J6 1776, Cf&ctif я/siviss j'f, 209p ^¿crfe&f Иг^ял»'* ^г^Т,з^/ss.

Названные штаммы использовались как эталон чувствительности к угнетающему действию микробов-антагонистов из группы музейных производственных штаммов. Количественное соотношение взаимодействующих штаммов в исходных посевах выдерживали в пределах 1:10 в пользу тест-микроба. В контрольные пробирки засевали тест-штаммы в виде монокультур. Посевы инкубировали при 37°С в течение 96 часов, сопровождая этот процесс периодическими контрольными высевами проб на соответствующие плотные среды. Количественную оценку антагонистической активности испытуемых штаммов осуществляли при помощи показателя П , который представляет собой отношение чи-

ела живых микробов тест-штаммов в контроле к их содержанию в опытной пробе, выраженные через десятичные логарифмы (Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Ханина Г.И. и др., 1990).

В ряде опытов, при массовой постановке, пользовались упрощенной модификацией методики, предложенной Н.В.Кашсовской (1992), с сохранением критерия оценки антагонизма - показателя П^ .

Активность кислотообразования изучаемых штаммов бифидобак-терий определяли титрометрическим методом, с использованием ку-курузно-лактозной питательной среда из расчета 3-5 % свежевыра-щенной культуры к объему среды, с последующим выращиванием при 37°С и титрованием 0,1 ^-ным раствором ■//¿¿-¿У/- с индикатором фенолфталеином. Кислотность выражали в градусах Тернера (°Т).

Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятой методике вариационной статистики (Ашмарин И.П., Воробьев A.B., 1962; Зайдель А.Н., 1968; Зайцев Г.Н., 1973; Мо-лета Ю.С., Тарасов В.В., 1881).

Таблица I.

Общий объем выполненных исследований

Содержание работы \ ^ешй

______________2___________I _ _ 3 _

I. Первичное бактериологическое обследование

обезьян 512 в том числе:

здоровых 210

в карантинных группах 120 в том числе:

клинически здоровых 50

страдающих диареей 70

больных 182 в том числе:

с бактериологически подтвержденной ОКИ 96

с диареей неустановленной этиологии 86

2. Наблюдения за эффективностью микробных биопрепаратов у обезьян 252 в том числе:

у получавших биопрепараты 142

в контроле 110

I 2 1 з

3. Доклиническое изучение комплексного иммуно-

глобилинового препарата КИП 36

в том числе:

у больных обезьян, получавших КИЕ 15

у больных обезьян в контроле 15

у здоровых обезьян 6

4. Выделено штаммов бифидобактерий 210

в том числе видов: 114

В. 54

5. Количество штаммов, изученных на антагонис-

тическую активность 97

в том числе: вида В. вида В.-. 43 35

вида 19

6. Количество штаммов, изученных по активнос-

ти кислотообразования 210

7. Количество обезьян с применением инструмен-

тального забора проб из желудка 10

8. Опыты по сравнительному изучению эффективности кукурузно-лактозной и печеночно-цис-тиновой сред для культивирования бифидо-

бактерий 19

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования проводили на узконосых обезьянах семейства мар тышкообразных ( 'éAc ), представлявших роды-^Й -

СУсга--, ¿éiu-<yí<:'¿<t.ccA-s . Первичному бактериологи-

ческому обследованию содержимого толстой кишки были подвергнуты 512 обезьян, в том числе 269 самок и 243 самца. По видовому составу наблвдаемые животные распределялись следупцим образом: мака ки резусы () - 130, макаки яванские

) - 81, макаки лапундеры ( .Jtf) -макаки бурые ( -VP", ¿гь^гч'-г/^ ) - 63, зеленые мартышки ( a-é&bb^s ) - 42, павианы гамадрилы (Аг^р^/.г^.г^ ) 119. Видовой и количественный состав наблюдаемых обезьян представлен в табл.2. Возраст обезьян был от состояния новорожденное ти до 5 лет и старше.

По клиническому статусу все наблюдаемые обезьяны были распределены в 3 группы: I) здоровые, 2) проходившие акклиматизацию в карантинных группах после привоза из других стран, в том числе клинически здоровые и страдавшие диареей, и 3) больные бактериологически подтвержденными формами ОКИ или с ОКИ неустановленной этиологии (табл.2). Здоровых обезьян было 210, в карантинных группах - 120, в группе больных - 182 обезьяны. В числе 210 здоровых обезьян было 25 детенышей пяти видов в возрасте 1,5-2 мес. обезьян 1-3 лет было 74; от 3 до 5 лет - 88; старше 5 лет - 23.

С целью определения состава микрофлоры содержимого толстой кишки в норме были исследованы пробы испражнений клинически здоровых обезьян разных видов в различные сезоны года при разной продолжительности нахождения в карантинных группах питомника пос ле прибытия из отдаленных географических зон естественного обитания, а также длительно адаптированных к местным условиям "аборигенов" и особей, родившихся в питомнике.

Было установлено, что в группе здоровых обезьян бифидобак-терии высеваются из проб фекалий со 100 %-яой частотой. Их средний количественный уровень составлял от 8,16±0,16 до 9,25±0,21£. Лактобациллы высевались от 100 % обследованных обезьян в количестве 7,91^0,31 - 8,25± 0,21^' /г. Несколько меньшим количественным уровнем (7,25±0,27 - 7,34±0,12 ф /г) и меньшей частотой выделения (60-70 %) характеризовались бактероиды. В аэробном звене микрофлоры толстой кишки здоровых обезьян в 100 % случаев опреде лялись биологически полноценная кишечная палочка (5,98±0,29 -

Видовой состав наблюдаемых обезьян

Таблица 2,

Вид

Количество особей

здоровые

!в карантин- Тбольные ОКИ

них группах

установленной и неустановл. этиологии

макак резус

макак яванский (Л/,ы макак лапундер

( /пеягл/гЛла^

макак бурый

43 40 40 27

40 15 10 12

47 26 27 24

мартышка зеленая

павиан гамадрил

Всего:

210

120

182

- 6,22±0,33 # /г) и энтерококк (5,94±0,32 - 6,82±0,29 ^ /г). Кишечная палочка со сниженной ферментативной активностью, протеи, дрожжи и дрожжеподобные грибы, стафилококки - хотя и обнаруживались у здоровых обезьян с довольно высокой частотой - до 65 %, однако их содержание было транзиторным и не превышало концентрации 3-4 /г. (табл.3). Патогенные микробы семейства кишечных у клинически здоровых обезьян, как правило, не обнаруживались. С невысокой частотой и в низких разведениях встречались ЗУ^с&с^ё^ ,

В целом видовой состав и количественные соотношения выделяемых микроорганизмов у здоровых обезьян приближались к таковым у здоровых взрослых лщцей; исключение составляло только более высо-

Таблица 3.

Качественный и количественный состав микрофлоры содержимого толстой кишки у клинически здоровых обезьян семейства мартышкообразных (6 видов)

Выделяемые ! Частота Í Количество

микроорганизмы ! выявления {%) ! ^ /г

Бифидобактерии 100 8,16*0,16 - 9,25*0,21

Лактобациллы 100 7,91-0,31 - 8,25*0,21

Бактероиды 60-70 7,25*0,27 - 7,34*0,12

Кишечная палочка

биологически

полноценная 100 5,96¿0,29 - 6,22*0,33

Кишечная палочка

со сниженной

ферментативной

активностью 42-51 2,91*0,41 - 3,53*0,26

Энтерококки 100 5,94*0,32 - 6,82*0,29

Микробы рода

протея 60-65 3,88 ±0,29 - 4,11*0,16

Стафилококки 3,91*0,34

сапрофитные 60-65 - 4,42*0,37

Дрожжи и

дрожжеподобные

грибы 20-22 3,44*0,42 - 4,01*0,29

кое содержание у обезьян энтерококка, который в микрофлоре кишечника человека находится на уровне 5-6 <ф. /г.

Существенных различий в общем составе кишечной микрофлоры между наблюдаемыми видами обезьян выявлено не было. Приведенный состав микрофлоры кишечника здоровых обезьян был близок к таковому у тех из обезьян карантинных групп, которые во время прохождения акклиматизации не страдали диареей и не проявляли каких-либо признаков клинического дискомфорта.

При обследовании же обезьян карантинных групп, которые страдали диареей, были выявлены существенные отличия от состава микрофлоры клинически здоровых. Таких обезьян было 70 из числа 120, находившихся в карантинных группах. У них отмечено снижение общего количества высеваемых микроорганизмов как в анаэробном, так

и в аэробном звене на 1-2 . Частота обнаружения протеев возрастала до 100 % при повышении их количественного содержания до показателей 5,9 - 6,5^ /г. Нарастало количество ферментативно дефектных форм кишечной палочки и патогенного стафилококка, увеличивалась частота выделения представителей условно-патогенной флоры. Рост бифидобактерий был резко подавлен - их удавалось высевать в основном из разведения 10"®, либо они отсутствовали вовсе даже в минимальном из учитываемых разведений - Ю-5 (табл.4). Та же тенденция прослеживалась в отношении лактобацилл и бактероидов.

В группе обезьян, больных ОКИ, микрофлора кишечника характеризовалась практически теми же сдвигами, что и у страдавших диареей неустановленной этиологии в карантинных группах. На этом фоне выявлялись патогенные энтеробактерии - шигеллы, сальмонеллы. Частота обнаружения бифидобактерий и лактобацилл снижалась до 40-50 % и только в минимальных разведениях фекалий.

Таблица 4.

Частота выделения и количественное содержание бифидобактерий в фекалиях обезьян карантинных групп

Кол-во обследованных обезьян карантинных групп по клиническому состоянию

не обнаружены! в разведении !

Наличие бифидобактерий

обнаружены в разведениях

Ю"5 ¡10"5|10"6|10"7£10-6|Ю"9| 10

,-Ю

Без диареи 50

50 50 50 48 41

Страдавдие диареей 70

42 24 II 0

Наряду с учетом частоты выделения и количественного содержания бифидобактерий в микробиоценозе толстой кишки, был изучен видовой состав бифидофлоры у обезьян разных возрастных и видовых групп.

В числе 210 клинически здоровых обезьян шести перечисленных

видов (табл.2), 185 были преимущественно в возрасте от I до 5 лез В бифидофлоре этих обезьян преобладали представители вида В.-

, частота выделения которых составляла 55-70 %; pese высевались вида В. (с частотой у разных видов обезьян от 5 до 25 %) и В. j^s/í^^^ (с частотой выделения от 10 до 27 %). В числе наблюдаемых видов обезьян особое место занимали павианы гамадрилы, бифидофлора которых во всех возрастных группах с наибольшей частотой была представлена видом В. ¿/а/х-(рис.1). У детенышей обезьян раннего возраста, в числе которых все вскармливались молоком матери, бифидофлору составлял преимущественно вид В, , который высевался с частотой 56 %, тогда как виды В. и В. ^Ц^л*^ были идентифицированы в 24 и 20 % случаев соответственно.

При бактериологических исследованиях микрофлоры кишечника обезьян с целью выделения бифидобактерий была изучена ростовая активность кукурузно-лактозной питательной среды (КЛС). В данном разделе работы были исследованы пробы фекалий 25 обезьян, содержавшихся в карантинных группах питомника, часть из которых получала бифидосодержащие биопрепараты по поводу выявленного дис-бактериоза. Исследованию были подвергнуты пробы фекалий из разведений исходного материала от Ю-5 до 10" . К концу срока культивирования (в пределах 48 часов) в полужидкой среде (с 0,2 % агара) формировались характерные для бифидобактерий колонии -гвоздики, которые легко поддавались количественному учету.

Результаты, получаемые на КЛС, были сопоставлены с данными исследования тех же проб с помощью классической печеночно-цистиновой среда (ПЦС), что позволило убедиться в высоких ростовых качествах КЛС. Новая среда ни в одной из проб не уступала ПЦС по срокам и уровню выявляемого количества бифидобактерий. Было подтверждено положение, что содержание бифидобактерий в фекалиях здоровых обезьян, независимо от вида, находится на уровне не ниже I010, а при дисбиотических нарушениях резко снижается вплоть до отсутствия роста в минимальном из учитываемых разведений - Таким образом, КЛС может быть расценена как вполне приемлемая для выделения и количественного учета бифидобактерий, наряду со средой классической рецептуры, каковой является ПЦС. Положительным свойством КЛС является высокая степень ее прозрачности, что обеспечивается поддержанием белков кукурузного экстракта в растворенном состоянии за счет включения в ре-

Рисунок №1

(овой состав бифидобактерий, выделенных от здоровых обезьян.

Макаки резусы

12%

21%

Макаки бурые

59%

22%

1акаки яванские

25%

20%

68%

Зеленые мартышки

27%

Макаки лапундеры

Павианы гамадрилы -10%

25% 70%

•20%

■:'■;] В. асМевсепНв ^ В.Ы^ит В. 1опдит

цептуру 0,5-0,8 % трехзамещенного лимоннокислого натрия.

Интенсивность роста бифидобактерий на КЛС в сравнении с ЩС была проконтролирована на примере стандартных производственных штаммов, принадлежащих к двум разным видам рода бифидобактерий -I и В. МС-42. Применение но-

вой среды сохраняло характерные признаки ростовой активности каждого из штаммов, проявляющиеся при культивировании в контрольной среде классической рецептуры.

В ходе исследований микрофлоры содержимого толстой кишки обезьян было выделено 210 штаммов бифидобактерий, среди которых были идентифицированы виды В.^^-^^'ьг^ (114 щтаммов),

(54 штамма) и В. . (42 штамма). Для

изучения антагонистической активности была отобрана группа из 97 штаммов пропорционально частоте выделения из фекалий обезьян: В. - 431 в. 35, В. - 19.

При испытаниях на плотной среде методом штриховых перекрестных посевов антагонистическую активность свежевыделенных штаммов сопоставляли с этим свойством у штамма В.- МС-42,

отобранного для изготовления экспериментальных серий нового биопрепарата "Бифидин". Диаметр зон задержки этим штаммом роста ши-гелл, сальмонелл, протеев и патогенного стафилококка составлял 26-27 мм. В проведенных нами опытах зоны задержки роста тест-культур свежевыделенными штаммами бифидобактерий составляли 1216 мм и ни в одном случае не достигали показателей, характеризовавших штамм МС-42. По степени сравнительно более высокой антагонистической активности было отобрано II свежевыделенных штаммов В.. , 7 штаммов и 5 - В.^я^. которые могли бы быть использованы в дальнейших поисковых исследованиях технологического плана. В качестве наиболее активного штамма-антагониста для доклинических испытаний на данном этапе был отобран штамм В. МС-42, составляющий микробную основу разрабатываемого биопрепарата "Бифидин".

Высокая степень антагонистической активности, отличавшая штамм В. ¿ы^&^ся/^'х МС-42 от других параллельно испытывав-шихся штаммов кислотопродуцирующей группы, была сопоставлена с его активностью кислотообразования. Наблюдения в данном направлении были проведены в ходе апробации ростовой среды КЛС. По результатам контрольного титрования, в 19 партиях ростового субстрата после трехсуточного культивирования штамма МС-42 средние значения кислотности в градусах Тернера составляли 132,0*3,41.

Такими же показателями характеризовался рост 123 свежевыделенных штаммов бифидобактерий (В. - 71, В. - 52),

различавшихся по степени антагонистической активности в широком диапазоне значений. Следовательно, корреляции между антагонистической активностью и активностью кислотообразования у свежевыделенных от обезьян штаммов бифидобактерий установлено не было.

Исследованиями, проведенными в предыдущие годы НИИ экспериментальной патологии и терапии АМН и НИИ медицинской приматологии РАМН совместно с Московским НИИЕМ им. Г.Н.Габричевского, было установлено, что медицинские микробные биопрепараты являются эффективными средствами нормализации микрофлоры кишечника при дисбак-териозах у обезьян. Вместе с тем, сроки наступления лечебного эффекта, особенно при учете бактериологических показателей, достигают 3-4 недель как в наблюдениях на обезьянах, так и по данным медицинской клинической практики. Это определяет актуальность исследований, направленных на усовершенствование средств коррекци-онной бактериотерапии, на подбор более эффективных и адэкватных основ для новых моно- и поликомпонентных лечебных биопрепаратов.

С учетом этих обстоятельств, нами были проведены наблюдения за коррекционной активностью штамма бифидобактерий в. av^s^A^¿f '.1С-42, который ранее в составе биопрепаратов не использовался и отличался от известных производственных штаммов более высокой антагонистической активностью. Кроме того, данный штамм обладал расширенным широким спектром ферментации углеводов и укороченным ростовым циклом, что позволяло рассчитывать на его выраженную биологическую активность в составе лечебных препаратов. Штамм В. g^f-fí/ts^-sls МС-42 был включен в качестве действующего начала в состав разрабатываемого микробного препарата "Бифидин сухой", который проходил этап доклинической апробации.

В данном разделе работы под наблюдением находились 252 обезьяны. Из них 182 перенесли острую кишечную инфекцию установленной или неустановленной этиологии и получили курс терапии антибиотиками, после чего страдали диареей. У остальных 70 обезьян длительная диарея имела место в процессе акклиматизации во время пребывания в группах карантина.

Данные бактериологических исследований свидетельствовали о наличии существенных отклонений в составе фекальной микрофлоры этих обезьян. Общее количество бифидобактерий, лактобацилл и бактероидов оказалось уменьшенным на 1-2 порядка. Характерным признаком состояния микрофлоры у данной группы обезьян являлось раз-

кое угнетение основного представителя анаэробного звена - бифи-добактерий, количественное содержание которых не превышало уровня 6,21-6,61^ /г, а частота обнаружения составляла около 50 %. Нарушения аэробного звена микрофлоры проявлялись в нарастании частоты выделения до I00 % и увеличении количества микробов рода протея, содержание которых в I г фекалий достигало 6,21-6,67^1 ; увеличивалась частота обнаружения ферментативно дефектных форм кишечной палочки до 76-82 % случаев при количественном содержании 5,91-6,29ф' /г. Количество энтерококков снижалось на I порядок; частота вцделения патогенного стафилококка достигала 75 % в количестве 4,91-5,25^ /г. Условно-патогенные энтеробактерии -цитробактер, энтеробактер, клебсиелла выделялись в количестве 4,32-4,92^' /г с частотой обнаружения 72 %.

Таким образом, проведение курса антибиотикотерапии у обезьян, больных ОКИ, завершившегося элиминацией патогенного начала -шигелл, сальмонелл, повлекло за собой отрицательные сдвиги в составе бактериоценоза кишечника, которые поддерживали диарею и определяли необходимость проведения коррекционной бактериотера-пии.

Группу обезьян, получавших бактериальную терапию по поводу диарейного синдрома, составили 142 особи, а остальные НО из 252 страдавшие аналогичными формами патологии по данным клинического и бактериологического обследования, были отнесены к контрольной группе, получавшей симптоматическую терапию, без назначения микробных биопрепаратов.

Обезьянам опытной группы применяли микробные биопрепараты трех вариантов состава:

1) биомасса бифидобактерий штамма В. ¿¿¿Л^/УЛМС-42 (экспериментальные серии препарата "Бифидин сухой");

2) коммерческий биопрепарат "Бифидумбактерин сухой", основу которого составляли бифидобактерии штамма В. I;

3) экспериментальная биомасса лактобацилл штамма

г&^гь'гы, селекционированного из кисломолочного продукта. Каждый из биопрепаратов применяли в виде сухой порошке образной биомассы живой культуры, которую смешивали '^/^¿а-с фруктовой начинкой конфет и скармливали обезьянам 2 раза в дев суточную дозу биопрепаратов составляли 2 г биомассы. Продолжительность применения биопрепаратов составляла 10, 20 и 30 дней, что имело целью выбор достаточной курсовой дозы с учетом резуль-

татов катамнестического наблюдения.

По окончании полного курса лечения был получен выраженный клинический и бактериологический эффект, что проявлялось нормализацией стула после длительной диареи, уменьшением уровня высе-ваемости протея, ферментативно дефектных эшерихий и патогенного стафилококка; бифидобактерии стали обнаруживаться в количестве 8,21±0,18 /г, лактобациллы - 7,86±0,14 /г. Стойкость достигаемого эффекта зависела от продолжительности курса лечения. Так, десятидневные курсы применения биопрепаратов из лактобацилл _ ''¿/е^А'- ¿'с/'ф&^'леЛ и бифидобактерий

вида ' Ъ.^'^'ч&'/к— заканчивались клиническим эффектом только у 60-80 % наблюдаемых животных, а бактериологическим - у 40-60 %, причем уже в ранние сроки катамнеза патологические симптомы проявлялись вновь. Оптимально продолжительными курсами бактериальной терапии обезьян при назначении биопрепаратов двух названных видов оказались курсы в 28-30 дней, которые обеспечивали эффект независимо от видового состава входивших в них штаммов.

Более выраженной оказалась активность биопрепарата из В. , применение которого сопровождалось нор-

мализацией стула у всех 46 получавших его обезьян уже на 3-4 сутки от начала лечения, а к 2-му дню происходила существенная нормализация микрофлоры. В контрольной группе из 110 обезьян к концу наблюдения положительных сдвигов в микрофлоре толстой кишки отмечено не было. Дефицит бифидофпоры сохранялся на исходном уровне, несколько дазд возросла частота выделения ферментативно дефектных форд кишечной палочки. Обращали на себя внимание высокие частота и уровень выделения в контрольной группе микробов рода протея.

В наших наблюдениях на обезьянах мы принимали также участие в доклинических испытаниях комплексного иммуноглобулинового препарата КИП. Под наблюдением находилось 30 обезьян макаков резусов с клиническим диагнозом "колит", что проявлялось сильно выраженной диареей (жидкий стул с кровью). В опыт были взяты 3 группы по 5 обезьян, которым применяли КИП тремя разными способами аппликации: внутримышечно, и в ректальных свечах.

У всех обезьян, получавших КИП, независимо от способа введения, уже к 3-му дни наступало значительное улучшение клинического состояния, стал оформленным стул. В числе 15 обезьян контрольной группы с аналогичным диагнозом, не получавших КИП, ни у

одной сдвигов в клинической картине не произошло, диарея продолжалась. При исследовании сыворотки крови, взятой от 10 обезьян опытных групп, в ШГА было обнаружено повышение титров антител против шигелл, сальмонелл, эшерихий на 2-3 двукратных разведения по сравнению с исходными, что свидетельствовало о поступлении препарата в кровь не только после внутримышечного введения, но также после пероральной и ректальной аппликации. Повышение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови после энторального и ректального введения было отмечено также у 6 здоровых обезьян, которые служили дополнительным контролем на переносимость препарата. Однако это явление оказалось более выраженным у больных обезьян, чему по-видимому способствовало повышение проницаемости сосудов вследствие местной воспалительной реакции.

Результаты проведенных наблюдений на обезьянах убеждают в адекватности данной модели для доклинической оценки и дифференцированного отбора разрабатываемых микробных и сывороточных биопрепаратов медицинского назначения. Кроме того, достигаемое быстрое излечение обезьян, страдающих диарейным синдромом, создает большой экономический эффект за счет предотвращения гибели этих высокоценных животных.

Проведенные исследования определяют перспективность использования бифидобактерий вида В. ¿гв составе микробшс биопрепаратов медицинского назначения и целесообразности применения таких препаратов для коррекции микрофяоры кишечника у обезьяз семейства мартышкообразных (макаки резусы, лапундеры, яванские, бурые и зеленые мартышки), у которых по материалам литературы и нашим данным, в норме преобладают бифидобактерии вида В.

К настоящему времени новый микробный биопрепарат "Бифидин сухой", созданный на основе штамма В. МС-42, про-

ходит заключительный этап внедрения в практику здравоохранения; на способ лечения диарейных заболеваний у обезьян при помощи им-муноглобулинового препарата КИП получено Авторское свидетельство

вывода

1. Состав микрофлоры содержимого толстой кишки у здоровых обезьян разных видов семейства мартышкообразных однотипен.

2. Бифвдофиора взрослых обезьян макак резус, макак лапундер макак яванский, макак бурый, мартышка зеленая представлена прей-

мущественно видом В. ot^^a^-^A's , а от павианов гамадрилов с наибольшей частотой высеваются В. ^^'¿¿¿-ле-г- .

3. У детенышей обезьян, независимо от вида, в микрофлоре кишечника преобладают бифидобактерии 3. .

4. Дисбиотические нарушения микрофлоры толстой кишки у обезьян, страдающих диареей в процессе акклиматизации, и прошедших курс антибиотикотерапии по поводу перенесенной острой кишечной инфекции, имеют сходные бактериологические показатели.

5. Кукурузно-лактозная питательная среда как простая по составу и обеспечивающая стандартность результатов может быть использована для выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий.

6. У свежевыделенных штаммов бифидобактерий, вегетирующих

в кишечнике обезьян, корреляции между антагонистической активностью и активностью кислотообразования не обнаружено.

7. Бифидобактерии штата® В. МС-42 и комплексный иммуноглобулиновый препарат КИП целесообразно использовать в составе средств для коррекции бактериоценоза кишечника и купирования диарайного синдрома, в том числе у обезьян.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алешкин В.А., Борисова И.В., Ханина Г.И., Шагинян С.А., Дарсания М.Ш. Изучение эффективности иммуноглобулинового препарата КИП при кишечных дисфункциях у обезьян // В кн.:"Актуальные проблемы медицинской приматологии". Юбилейная конференция, посвященная 70-летию НИИЭПиТ с участием России и стран дальнего зарубежья. Тез.докл.Сухуми, 1997. - с.З.

2. Дарсания М.Ш., Шагинян С.А., Тофан A.B., Сорокулова И.Б. Способ визуального исследования пищевода, желудка и 12-и перст-

ной кишки у обезьян макака резус фиброволоконным эндоскопом// Удост. на рацпредложение ffi 237. - 1968.

3. Дарсания М.Ш., Поспелова В.В., Шагинян С.А., Рахимова Н.Г., Полещук В.Ф., Кашковская Н.В. Видовой состав бифидофлоры обезьян

в свете доклинической оценки биопрепаратов медицинского назначения //В кн.:"Медицинские аспекты микробной экологии". Москва, I993/1994. выпуск 7-8, часть I, с.107-109.

4. Дкикидзе Э.К., Шагинян С.А., Дарсания М.Ш., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Алешкин В.А., Борисова И.В. Способ лечения диарей-

ных заболеваний у обезьян // Авторское свидетельство $ I8278I5 13 октября 1992 г., с приоритетом изобретения от 28 декабря I99C

5. Лапин Б.А., Дкикидзе Э.К., Поспелова В.В., Шагинян С.А., Полещук В.Ф., Дарсания М.Ш. Дисбактериозы кишечника у обезьян в условиях содержания в неволе и коррекционная активность микробных биопрепаратов //В кн.:"Дисбактериозы и эубиотики". Всесоюзная научно-практическая конференция, посвященная 100-летию основания МННИЭМ им. Г.Н.Габричевского, тез.докл. Москва. 26-28 марта 1996. - с.21.

6. Маят I.A., Дарсания М.Ш. Изучение эффективности новых микробных биопрепаратов медицинского назначения при дисбактерио-зах кишечника // В кн.:"Клинико-лабораторные аспекты исследований в инфекционной патологии". Конференция молодых ученых МНИИЭ& им. Г.Н.Габричевского. Москва. IS87. деп. в МШ, IS68. разд.З,

is 8, публ.Je 3064.

7. Милорадова Е.А., Дарсания М.Ш. Бифидобактерии вида адо-лесцентис и частота их выделения при медико-биологических исследованиях // В кн.:"Актуальные проблемы эпидемологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний". Конференция молодых ученых МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. Москва, 26-29 марта 1991 г., деп. в MPS, 1991, разд.З, Je 4-6, публ.is 1417.

8. Поспелова В.В., Осипова И.Г., Дарсания М.Ш., Ханина Г.И. Экспериментальное обоснование разработки пробиотика "Бифидин сухой" с использованием обезьян для оценки его эффективности // В кн.:"Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях. Материалы Российской конференции, Москва, 26-27 сентября 2000 г., Т.П, с.258-260.

9. Поспелова В.В., Шагинян С.А., Дарсания М.Ш. Обезьяны как модель для доклинической оценки медицинских микробных препаратов // В кн.:"Актуальные проблемы медицинской приматологии". Юбилейная конференция, посвященная 70-летию НИИЭПиТ с участием России и стран дальнего зарубежья. Сухуми, 1997, тез.докл., с.з: 32.

10. Шагинян С.А., Поспелова В.В., Дарсания М.Ш. Эффективность биопрепаратов из молочнокислых и бифидобактерий как средства коррекции микрофлоры кишечника обезьян // В кн.:"Вопросы медицинской приматологии, наиболее перспективное использование обезьян в медицине и биологии". Всесоюзная конференция. Сухуми, 1987, с.63-64.

11. Шагинян С.А., Поспелова В.В., Дарсания М.Ш. Бактерий-

ные биопрепараты как средство коррекции микрофлоры кишечника у обезьян при подготовке к медико-биологическим исследованиям // В кн.¡"Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для иедико-биологических исследований". Всесоюзная конференция. Москва. 1996, тез.докл., часть 2, с.59-62.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дарсания, Маквала Шотаевна

Список использованных сокращений.

Введение.

Часть 1. Обзор литературы.

Глава 1. Микрофлора кишечника и ее роль в обеспечении состояния здоровья организма-хозяина.

Глава 2. Микробные биопрепараты в системе мер по коррекции бактериоценоза кишечника при дисбактериозах.

Глава 3. Обезьяны как модель для изучения разных форм клинической патологии человека.

Часть 2. Собственные исследования.

Глава 4. Материалы и методы.

4.1. Методы выделения и культивирования изучаемых микроорганизмов.

4.2. Методы изучения антагонистической активности свежевыделенных и лабораторных штаммов би-фидобактерий.

4.3. Методика изучения активности кислотообразова-ния.

4.4 Методика инструментального забора проб для бактериологического исследования содержимого желудка.

4.5. Методы статистической обработки результатов исследований.

4.6. Общий объем выполненных исследований.

Глава 5. Показатели микрофлоры кишечника обследованных обезьян разных видов и разных возрастных групп.

5.1. Видовой и возрастной состав наблюдаемых животных.

5.2. Результаты бактериологических исследований содержимого толстой кишки обезьян в разных наблюдаемых группах.

5.3. Видовой состав выделенных штаммов бифидо-бактерий в разных возрастных группах обезьян разных видов.

5.4. Результаты бактериологических исследований содержимого желудка у клинически здоровых обезьян карантинной группы.

Глава 6. Характеристика штаммов бифидобактерий, выделенных при исследованиях микрофлоры кишечника обезьян.

6.1. Интенсивность роста и морфология колоний би-фидобактерий при культивировании в кукурузно-лактозной питательной среде.

6.2. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бифидобактерий в отношении эталонных тест-культур.

6.3. Активность кислотообразования.

Глава 7. Разработка способов коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах у обезьян с применением новых биологических препаратов.

7.1. Изучение коррекционной активности культуры бифидобактерий штамма В.асЫеБсепйз.

7.2. Доклиническое изучение комплексного имму-ноглобулинового препарата КИП при диарейных заболеваниях у обезьян.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов"

Актуальность проблемы. Обезьяны являются высокочувствительной и наиболее адекватной живой моделью для изучения различных форм клинической патологии человека, расшифровки патогенеза заболеваний, разработки и испытания новых средств терапии (49; 58; 59; 88; 111; 126; 138; 156). Доставка этих животных из ареалов естественного обитания в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки сопряжена с переменой климатических условий, температурного режима и рационного питания, а также с резким ограничением подвижности при переходе к содержанию в неволе (98). Эти факторы оказывают отрицательное влияние на состояние естественной резистентности обезьян, способствуют развитию дисбиотических нарушений и повышают восприимчивость к инфекционным заболеваниям. Формированию дисбактериоза кишечника и неспецифических диарей у обезьян способствуют также мероприятия по санации антибиотиками на фермах экспортных компаний во время закупки этих животных (52; 59).

Таким образом, процесс акклиматизации обезьян является весьма ответственным этапом подготовки этой высокоценной модели к медико-биологическим исследованиям. Одна из важнейших задач этого этапа заключается в восстановлении физиологической нормы микробного ценоза пищеварительного тракта обезьян, с которым связана регуляция таких жизненно важных функций организма как ферментативные процессы, синтез витаминов, формирование иммунологической реактивности и общей неспецифической резистентности. Как известно, в медицинской практике при дисбиотических нарушениях микрофлоры пищеварительного тракта находят широкое применение биопрепараты из живых бактерий симбиотической микрофлоры разного видового состава (30; 31; 90; 94; 133; 136; 143.).

Как показали результаты многолетних исследований, обезьяны близки к человеку по физиологии пищеварительного тракта, восприимчивы к болыпинству свойственных человеку острых кишечных инфекций, а в условиях снижения естественной резистентности часто страдают клинически выраженными формами дисбактериозов (29; 139; 162; 164; 166).

Формирование и сохранение облигатного бактериоценоза кишечника у обезьян является существенным звеном обеспечения физиологической нормы не только пищеварительного тракта, но и ряда других органов и систем. Результаты ранее проведенных в данном направлении исследований получили отражение в ряде публикаций и обосновали разработку Методических рекомендаций по применению при клинически выраженных дисбактериозах у обезьян микробных биопрепаратов медицинского назначения: колибактерина, бифи-думбактерина и бификола (18; 27; 28; 50; 59).

Бифидобактерии как основные представители симбиотического биоценоза кишечника являются важным фактором физиологической нормы человека и высших животных. С их количественным равновесием в составе анаэробного звена микрофлоры связывают состояние эубиоза, обеспечение колонизационной резистентности и проявление непосредственной антагонистической активности против патогенных микроорганизмов в полости пищеварительного тракта (147).

Видовой состав рода бифидобактерий включает значительное число биологических вариантов, которые различаются по ферментативной активности, свойственны различным биотопам и разным возрастным группам хозяев-носителей. Известна смена видов бифидобактерий в онтогенезе человека, при которой вид В.Ыйёит с узким спектром ферментативной активности, свойственный детям раннего возраста, вскармливаемым грудью, замещается видом В.асЫезсепЙБ у детей старших возрастных групп и взрослых, а при искусственном вскармливании - уже в первые месяцы жизни ребенка.

Публикации последних лет свидетельствуют о возрастающем внимании к данному виду бифидобактерий, как отличающемуся гаммой биолого-генетических особенностей от представителей других видов (148; 167; 178).

Видовой состав бифидофлоры обезьян освещен в литературе крайне скудно. Отсутствует сравнительный анализ видов бифидобактерий у приматов разных классов и различных возрастных групп обезьян. В качестве эталона для исследований микрофлоры кишечника обычно используются обезьяны вида макак резус. В.асЫеБсепЙБ упоминается как единственно встречающийся у обезьян вид бифидобактерий. Однако разработки средств бактериальной терапии для обезьян с использованием бифидобактерий данного вида ранее не проводилось.

Цель работы: охарактеризовать состояние микроэкологии содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и возрастных групп и на этой модели обосновать применение пробиотиков, содержащих бифидобактерии вида В.асЫезсепЙБ и иммуноглобулинового препарата КИП.

Задачи исследования: провести сравнительное изучение микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов; изучить видовой состав бифидофлоры у разных видов и разных возрастных групп обезьян; определить показатели дисбиотических нарушений микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян в процессе акклиматизации и после антибио-тикотерапии; апробировать новую кукурузно-лактозную питательную среду для выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий; дать сравнительную оценку антагонистической активности и активности ки-слотообразования у штаммов бифидобактерий, свежевыделенных от обезьян; принять участие в доклинической апробации нового пробиотика из бифидо-бактерий вида В.асЫезсепЙБ ("Бифидин сухой») и комплексного иммуног-лобулинового препарата КИП.

Научная новизна работы: дана сравнительная характеристика микрофлоры содержимого толстой кишки обезьян разных видов и разных возрастных групп; в составе бифидофлоры обезьян семейства мартышкообразных в возрасте 1 -5 лет выявлено частое (55-70 %) выделение В.асЫезсепЙз у представителей видов макак резус, макак лапундер, макак яванский, макак бурый, зеленая мартышка и преобладание В.Ыйс1ит (до 70 %) у павианов гамадрилов; от детенышей обезьян, независимо от вида, выявлена наиболее частая высевае-мость В.ЫШит; установлено сходство дисбиотических нарушений микроэкологии содержимого толстой кишки у обезьян, страдающих диареей в процессе акклиматизации в карантинных группах и после курсов антибиотикотерапии в связи с перенесенной ОКИ; выявлена микробная обсемененность содержимого желудка у клинически здоровых обезьян в группе карантина, что указывает на глубину дисбиотических поражений организма этих животных в процессе акклиматизации; показано отсутствие корреляции между антагонистической активностью и активностью кислотообразования у штаммов бифидобактерий, свежевыде-ленных от обезьян; в результате доклинических испытаний впервые обоснована перспективность применения нового микробного биопрепарата из бифидобактерий В.асЫеБсепйз, которые ранее в производстве пробиотиков в России не использовались, а также энтеральной и ректальной форм комплексного имму-ноглобулинового препарата КИП; получено Авторское свидетельство на способ лечения диарейных заболеваний у обезьян с применением иммуноглоблинового препарата КИП; получено Удостоверение на рацпредложение по методике исследования содержимого желудка обезьян при помощи фиброволоконного эндоскопа.

Практическая значимость работы:

Для бактериологических исследований микрофлоры кишечника, выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий показана возможность использования кукурузно-лактозной питательной среды несложной рецептуры, обеспечивающей стандартность получаемых результатов; определены критерии оценки микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и разных возрастных групп, что может быть использовано в качестве модели при исследованиях медицинского плана, а также в работе ветеринарных служб питомников и зоопарков; предложено использование нового микробного биопрепарата «Бифидин сухой» на основе бифидобактерий В.асЫезсепЙБ и комплексного иммуногло-булинового препарата КИП при диареях, связанных с дисбиотическими нарушениями микрофлоры кишечника у обезьян.

Основные положения, выносимые на защиту

Состав микрофлоры содержимого толстой кишки у здоровых обезьян разных видов семейства мартышкообразных однотипен; бифидофлора взрослых обезьян макак резус, макак лапундер, макак яван-скии, макак бурый, мартышка зеленая представлена преимущественно видом В.асЫезсепЙБ; от павианов гамадрилов с наибольшей частотой высеваются В.Ыйскнп; у детенышей обезьян, независимо от вида, преобладают би-фидобактерии В.Ыйёшп; кукурузно-лактозная питательная среда как простая по составу и обеспечивающая стандартность результатов может быть использована при бактерио логических исследованиях на дисбактериоз кишечника и лабораторном культивировании бифидобактерий; ^ бифидобактерии штамма В.асЫезсеп^Б МС-42 и комплексный иммуногло-булиновый препарат КИП целесообразно использовать в составе средств для коррекции бактериоценоза кишечника и купирования диарейного синдрома, в том числе у обезьян.

Внедрение результатов работы

Основные положения диссертации внедрены в практику работы питомника обезьян Института медицинской приматологии РАМН. С целью коррекции микрофлоры кишечника обезьян при дисбактериозах различного генеза и диареях применяются бифидосодержащие микробные биопрепараты, предпочтительно бифидин и комплексный иммуноглобулиновый препарат КИП. При бактериологических исследованиях микрофлоры кишечника используется с положительным эффектом кукурузно-лактозная питательная среда. Материалы доклинической апробации экспериментальных серий бифидина использованы при обосновании внедрения данного препарата в практику здравоохранения РФ.

Результаты работы доложены: на Всесоюзной конференции «Вопросы медицинской приматологии» (Сухуми, 1987 г.); на Всесоюзной конференции «Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований» (Москва, 1988 г.); на Всесоюзной научно-практической конференции, посвященной 100-летию основания МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского «Дисбактериозы и эубиотики» (Москва, 1996 г.); на Юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИЭПиТ, с участием России и стран дальнего зарубежья «Актуальные проблемы медицинской приматологии» (Сухуми, 1977 г.); на Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях»

Москва, 2000 г.): на двух конференциях молодых ученых МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (1987 и 1996 гг).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, получены Авторское свидетельство и Удостоверение на рацпредложение.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дарсания, Маквала Шотаевна

ВЫВОДЫ

2. Бифидофлора взрослых обезьян макак резус, макак лапундер, макак яванский, макак бурый, мартышка зеленая представлена преимущественно видом В.асЫеБсепЙБ, а от павианов гамадрилов с наибольшей частотой высеваются В.ЫГк!ит.

3. У детенышей обезьян, независимо от вида, в микрофлоре кишечника преобладают бифидобактерии В.ЫГккип.

4. Дисбиотические нарушения микрофлоры толстой кишки у обезьян, страдающих диареей в процессе акклиматизации, и прошедших курс антибио-тикотерапии по поводу перенесенной острой кишечной инфекции, имеют сходные бактериологические показатели.

6. У свежевыделенных штаммов бифидобактерий, вегетирующих в кишечнике обезьян, корреляции между антагонистической активностью и активностью кислотообразования не обнаружено.

7. Бифидобактерии штамма В.асЫеБсепЙБ МС-42 и комплексный имму-ноглобулиновый препарат КИП целесообразно использовать в составе средств для коррекции бактериоценоза кишечника и купирования диарейного синдрома, в том числе у обезьян.

Выражаю глубокую благодарность моим научным руководителям - профессорам Этери Капитоновне Джикидзе и Веронике Владимировне Поспеловой за постоянное внимание и заботливую помощь в планировании и проведении исследований.

Самую искреннюю и сердечную благодарность приношу также моему непосредственному наставнику и товарищу по работе - к.м.н. Софье Арвидовне Шагинян за поддержку и большую помощь в выполнении темы.

М.Ш.Дарсания

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Неуклонно возрастающий интерес исследователей к проблеме физиологической роли нормальной микрофлоры организма человека обусловлен высокой частотой различных форм клинической патологии, при которых антимикробная терапия не оказывает эффекта и возникает необходимость применения средств, восстанавливающих естественный биоценоз, повышающих общую неспецифическую резистентность макроорганизма.

К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный и клинический материал, свидетельствующий об участии симбиотической микрофлоры в ряде жизненно важных функций организма-хозяина. Это - участие в обеспечении колонизационной резистентности, под которой понимается защита от доступа патогенного начала к эпителиальным клеткам стенки кишечника и последующего его проникновения во внутреннюю среду макроорганизма. В этой защите участвует мукозный барьер кишечника, являющейся продуктом совместного функционирования макроорганизма и симбиотической микрофлоры, который покрывает сплошным слоем эпителиальные клетки и заполняет пространства между ворсинками.

Весьма существенна роль индигенной микрофлоры в становлении местного и общего иммунитета, стимуляции синтеза секреторного ^А, играющего важную роль в формировании резистентности макроорганизма. В стимуляции иммунной системы принимают участие мурамилдипептиды, являющиеся компонентами клеточной стенки бактерий - симбионтов.

Доказано участие бактерий нормальной микрофлоры в ферментативной деятельности пищеварительного тракта. С функцией бактериоценоза кишечника связывают расщепление и утилизацию пищевых субстратов, продукцию энзимов, необходимых для метаболизма белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот, терморегуляцию, восполнение энергетических потребностей макроорганизма и др. Известно участие микрофлоры кишечника в рециркуляции желчных кислот и ряда макро- и микроэлементов, всасывания солей кальция и железа, поддержании ионного гомеостаза, связывании и нейтрализации токсических и о 1 с/ и субстанции, разрушении аллергенов, факторов лекарственной устойчивости патогенных микробов и др. обсуждается вопрос об участии микрофлоры пищеварительного тракта в синтезе витаминов, продукции бактериоцинов, микроци-нов, антибиотиков.

Важной функцией нормальной микрофлоры кишечника является антагонистическая активность против многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, поступающих в пищеварительный тракт. По наблюдениям И.И. Мечникова жизнедеятельностью полноценного кишечного бактериоценоза может быть обеспечена невосприимчивость к холере. Известны данные об участии в антагонистической активности лактобацилл продуцируемых ими соединений типа антибиотиков, которые проявляют свою активность независимо от продукции молочной кислоты.

В литературе последних лет большое внимание уделяется бифидобакте-риям как важнейшим представителям защитной микрофлоры человека. Установлено, что видовой состав бифидофлоры неодинаков и претерпевает изменения в зависимости от возраста, характера питания и ряда других физиологиче

1 гр и V/ ских факторов. Так, у детей, с первых дней жизни получающих естественное вскармливание грудное молоком, в бифидофлоре кишечника преобладают виды В.Ыйскип, ВлпГапЙБ, характеризующиеся узким спектром ферментативной активности, а именно, преимущественным расщеплением лактозы, что соответствует составу постоянно поступающего в пищеварительный тракт субстрата в виде грудного молока. У детей старше 3 лет и взрослых людей доминирующими видами бифидобактерий являются В.1оп§ит и В.асЫезсепЙБ, которые обнаруживаются с частотой 75,0 и 56,2 %. Частота же выделения вида В.ЬШскпп снижается до 18,7 %. От здоровых доношенных детей при вскармливании с наибольшей частотой высеваются бифидобактерии вида В.асЫеБсепйз (47,8 %), которым уступают виды B.longшn (34,8 %) и В.ЫАёит (30,4 %).

Бифидофлора оказывает разностороннее положительное влияние на физиологические функции организма человека. Создавая в кишечнике кислую среду за счет образования летучих жирных кислот и молочной кислоты, бифи-добактерии препятствуют развитию патогенной и гнилостной микрофлоры, предотвращают метеоризм, нормализуют перистальтику, способствуют всасыванию кальция, железа, витамина Д, участвуют в синтезе витаминов группы В и К. Отсутствие или уменьшение содержания бифидобактерий ниже нормального уровня является одним из патогенных факторов дисфункции кишечника и нарушения оптимальной физиологической деятельности целого ряда органов и систем макроорганизма. Значительное количество публикаций посвящено вопросам культивирования бифидобактерий, подбору стимуляторов для их роста, изучению секретируемых ими биологически активных субстанций. Однако и до настоящего времени вопрос о подборе идеальной ростовой среды для бифидобактерий остается нерешенной и актуальной задачей.

Сложная микроэкологическая система, каковой является бактериоценоз пищеварительного тракта, претерпевает существенные качественные и количественные изменения под воздействием разного рода неблагоприятных факторов, что приводит к формированию дисбактериоза. Попытки предупредить или воздействовать искореняющим образом на уже развившейся дисбактериоз при помощи средств антимикробной терапии не обеспечивают благоприятных результатов и еще более усугубляют уже начавшийся дисбиотический процесс. Это определяет необходимость применения средств коррекционной бактериальной терапии, направленных на восстановление нормальной микрофлоры.

Начало исследованиям по применению средств бактериальной терапии путем использования живых культур молочнокислых и бифидобактерий было положено работами И.И. Мечникова и его школы. Уже в те годы с успехом были применены в лечебной практике лактобациллин, представляющий собой молочную культуру болгарской палочки в сочетании с молочнокислым стрептококком, и нативная культура бифидобактерий для лечения грудных детей, страдавших диспепсическими расстройствами. С внедрением метода лиофильной сушки биологических субстратов в 60-70-е годы была решена проблема создания стабильных сухих форм микробных препаратов медицинского назначения. В настоящее практика отечественного здравоохранения располагает бифидосо-держащими биопрепаратами моно- и поликомпонентного состава - «Бифидум-бактерин сухой», «Бифидумбактерин форте», «Бифилиз», «Бифилонг», «Бифи-кол» и ряд их вариантов в различных лекарственных формах.

На протяжении последних лет широким фронтом ведутся работы по углубленному изучению представителей разных видов рода Bifidobacterium с целью формирования поливидового арсенала производственных штаммов, отвечающего задачам конструирования медицинских биопрепаратов в лечебно-диетических продуктов разного назначения. Публикации последних лет свидетельствуют о возрастающем внимании к виду B.adolescentis как отличающемуся гаммой биолого-генетических особенностей от других видов данного рода бифидобактерий.

Обезьяны являются наиболее информативной моделью для выяснения разных сторон жизненно важной роли симбиотической микрофлоры в организме человека. Они же представляют собой высокочувствительную и наиболее адекватную живую модель для изучения различных форм клинической патологии человека, расшифровки патогенеза заболеваний, разработки и испытания новых средств терапии. Доставка этих животных из арсеналов естественного обитания в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Южной Америки сопряжена с переменной климатических условий, температурного режима и рационов питания, а также с резким ограничением подвижности при переходе к содержанию в неволе. Эти факторы оказывают отрицательное влияние на состояние естественной резистентности обезьян, способствуют развитию дисбиотиче-ских нарушений и повышают восприимчивость к инфекционным заболеваниям. Формированию дисбактериоза кишечника и неспецифических диарей у обезьян способствуют также мероприятия по санации антибиотиками на фермах экспортных компаний во время закупки этих животных.

Таки образом, процесс акклиматизации обезьян является весьма ответственным этапом подготовки этой высокоценной модели к медико-биологическим исследованиям. Одна из важнейших задач этого этапа заключается в восстановлении физиологической нормы микробного ценоза пищеварительного тракта обезьян, с которым связана регуляция таких жизненно важных функций организма, как ферментативные процессы, синтез витаминов, формирование иммунологической реактивности и общей неспецифической резистентности.

Согласно данным многолетних исследований, обезьяны близки к человеку по показателям физиологии пищеварительного тракта, восприимчивы к большинству свойственных человеку острых кишечных инфекций, а в условиях снижения естественной резистентности часто страдают клинически выраженными формами дисбактериозов. Согласно разработанным ранее Методическим рекомендациям, при дисбактериозах кишечника у обезьян целесообразно применения микробных биопрепаратов медицинского назначения - колибактерина, бифидумбактерина, бификола.

Видовой состав бифидофлоры обезьян освещен в литературе крайне скудно. Отсутствует сравнительный анализ видов бифидобактерий у приматов разных классов и различных возрастных групп обезьян. В качестве эталона для исследований микрофлоры кишечника обычно используются обезьяны вида макак резус. В.асЫеБсепйз упоминается как единственно встречающийся у обезьян вид бифидобактерий, однако разработки средств бактериальной терапии для обезьян с использованием бифидобактерий данного вида ранее не проводилось.

Изложенное состояние проблемы определило цель настоящего исследования и круг решаемых конкретных задач работы, которые были направлены на характеристику состояния микроэкологии содержимого толстой кишки у обезьян разных видов и возрастных групп и обоснование на этой модели применения пробиотиков, содержащих бифидобактерии вида B.adolescentis и иммуногло-булинового препарата КИП.

В ходе исследований решались задачи: провести сравнительное изучение микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян разных видов; изучить видовой состав бифидофлоры у разных видов и возрастных групп обезьян; определить показатели дисбиотических нарушений микрофлоры содержимого толстой кишки у обезьян в процессе акклиматизации и после антибиотикотерапии; апробировать кукурузно-лактозную питательную среду для выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий; дать сравнительную оценку антагонистической активности и активности кислотообразования у штаммов бифидобактерий, свежевыделенных от обезьян; принять участие в доклинической апробации нового пробиотика из бифидобактерий вида B.adolescentis («Бифи-дин сухой») и комплексного иммуноглобулинового препарата КИП.

Проведение бактериологическое обследование 512 узконосых обезьян шести видов семейства мартышкообразных (макак резус, макак яванский, макак лапундер, макак бурый, зеленая мартышка, павиан гамадрил) позволило дать сравнительную характеристику микрофлоры содержимого толстой кишки обезьян разных видов и возрастных групп. Было установлено, что состав микрофлоры содержимого толстой кишки у здоровых обезьян названных видов, принадлежащих к трем родам семейства мартышкообразных (Macaca, Сег-copithecus и Papio), однотипен и приближается к таковому у здоровых взрослых людей; исключение составляет несколько более высокое содержание у обезьян энтерококка. Бифидобактерии высевались из проб испражнений здоровых обезьян со 100 %-ной частотой, их средний количественный уровень составил от 8,16+0,16 до 9,25+0,21 lg/r; лактобациллы были выделены также от 100 % обследованных обезьян в количестве 7,91 ±0,31 - 8,25±0,21 lg/r. Несколько меньшим количественным уровнем (7,25±0,27 - 7,34±0,12 lg/r) и меньшей частотой выделения характеризовались бактероиды. В 100 % случаев определялась биологически полноценная кишечная палочка в количестве 5,98±0,29 -6,22+0,33 lg/r.

При исследованиях фекальной микрофлоры обезьян на предмет выделения бифидобактерий была использована кукурузно-лактозная питательная среда в сравнении с принятой в производстве печеночно-цистиновой. Стандартность получаемых результатов, при простоте и доступности рецептуры, определяют возможность рекомендовать данную среду для бактериологических исследований микрофлоры кишечника, выделения и лабораторного культивирования бифидобактерий.

По данным проведенных исследований, в составе бифидофлоры обезьян семейства мартышкообразных в возрасте 1-5 лет выявлено наиболее частое (5570 %) выделение B.adolescentis у представителей видов макак резус, макак ла-пундер, макак яванский, макак бурый, зеленая мартышка и преобладание B.bifidum (до 70 %) у павианов гамадрилов; от детенышей обезьян, независимо от вида, выявлена наиболее частая высеваемость B.bifidum.

При обследовании обезьян, страдающих диареей во время акклиматизации или получивших антибиотикотерапию в связи с перенесенной ОКИ, были выявлены существенные отличия от состава микрофлоры клинически здоровых. У них отмечено снижение общего количества высеваемых микроорганизмов в анаэробном и аэробном звене на 1-2 lg. Возросла частота выделения протеев до 100 % при повышении количественного содержания до 5,9 - 6,5 lg/r, был резко подавлен рост бифидобактерий, лактобацилл и бактероидов. Установлено сходство дисбиотических нарушений микроэкологии содержимого толстой кишки у страдающих диареей обезьян в процессе акклиматизации в карантинных группах и после курса антибиотикотерапии в связи с перенесенной ОКИ. Выявлена микробная обсемененность содержимого желудка у клинически здоровых обезьян в группе карантина, что указывает на глубину дисбиотических поражений организма этих животных в процессе акклиматизации.

При изучении антагонистической активности 97 свежевыделенных от обезьян штаммов бифидобактерий (В.асЫеБсеШлз - 43, В.Ыйс1ит - 35, В.1о1^ит - 19) в сопоставлении с активностью кислотообразования корреляции между двумя названными характеристиками выявлено не было.

Согласно разработанным ранее Методическим рекомендациями, медицинские микробные биопрепараты находят применение при дисбактериозах и диспептических расстройствах у обезьян. Однако сроки наступления лечебного эффекта, особенно при учете бактериологических показателей, достигают 3-4 недель как в наблюдениях на обезьянах, так и по данным медицинской клинической практики. Это определяет актуальность исследований по усовершенствованию средств бактериотерапии путем подбора более эффективных микробных основ моно- и комплексных биопрепаратов.

На решение данной задачи были направлены исследования по оценке коррекционной активности штамма бифидобактерий В.асЫезсепЙБ МС-42, который выделялся более высокой степенью антагонистической активности среди параллельно испытывавшихся свежевыделенных и эталонных штаммов микроорганизмов кислотопродуцирующей группы. Этот штамм обладал расширенным спектром ферментации углеводов, укороченным ростовым циклом и, согласно данным литературы, характеризовался высокими показателями активности при изготовлении заквасок для кисломолочных продуктов. В производстве микробных биопрепаратов в России этот штамм, равно как и другие представители вида В.асЫезсепйз ранее не использовались.

В ходе доклинической апробации разрабатываемого микробного препарата «Бифидин сухой» штамм В.асЫеБсепЙБ МС-42 был применен при лечении 142 обезьян, страдавших диареей на фоне дисбактериоза кишечника. Микробные биопрепараты применяли в трех вариантах состава: 1) биомасса бифидобактерий штамма В.асЫезсеп^Б МС-42 (экспериментальные серии препарата "Бифидин сухой"); 2) коммерческий биопрепарат «Бифидумбактерин сухой», основу которого составляли бифидобактерии штамма В.ЫАскип 1; 3) экспериментальная биомасса лактобацилл штамма L.delbrüeckii subsp. bulgaricus, селекционного из кисломолочного продукта. Каждый из биопрепаратов применяли в виде сухой порошкообразной биомассы живой культуры, которую смешивали с фруктовой начинкой конфет и скармливали обезьян 2 раза в день. Продолжительность лечения составила 10, 20 и 30 дней, что имело целью выбор достаточной курсовой дозы с учетом результатов катамнестического наблюдения.

По окончании 30-дневнего курса лечения получаемый клинический и бактериологический эффект проявлялся нормализацией стула после длительной диареи, уменьшением уровня высеваемости протея, ферментативно дефектных эшерихий и патогенного стафилококка; бифидобактерии стали обнаруживаться в количестве 8,21 ±0,18 lg/r, лактобациллы - 7,86+0,14 lg/r. Десятидневное применение биопрепаратов из названного штамма лактобацилл и бифидобактерий вида B.bifidum заканчивалось клиническим эффектом только у 60-80 % наблюдаемых животных, а бактериологическим - у 40-60 %, причем уже в ранние сроки катамнеза патологические симптомы проявлялись вновь. Оптимально продолжительными курсами назначения биопрепаратов двух названных видов оказалось 28-30 дней, что обеспечивало эффект независимо от видового состава входящих в них штаммов.

Более выраженной оказалась активность биопрепаратов из штамма B.adolescentis МС-42, применение которого сопровождалось нормализацией стула у всех 46 получавших его обезьян уже на 3-4 сутки от начала лечения, а к 20-му дню происходила существенная нормализация микрофлоры. В контрольной групе из 110 обезьян к концу наблюдения положительных сдвигов в микрофлоре толстой кишки отмечено не было. Дефицит бифидофлоры сохранялся на исходном уровне, несколько даже возросла частота выделения ферментативно дефектных форм кишечной палочки. Обращали на себя внимание высокие частота и уровень выделения в контрольной группе микробов рода протея.

Проведенные исследования определяют перспективность использования бифидобактерий вида B.adolescentis в составе микробных биопрепаратов медицинского назначения и целесообразность применения таких препаратов для коррекции микрофлоры кишечника у обезьян семейства мартышкообразных (макаки резус, лапундеры, яванские, бурые и зеленые мартышки), у которых по материалам литературы и нашим данным, в норме преобладают бифидобакте-рии этого вида.

Полученные на обезьянах данные по характеристике коррекционной активности экспериментальных серий штамма B.adolescentis МС-42 были использованы при обосновании разработки нового микробного биопрепарата «Бифи-дин сухой», который к настоящему времени проходит заключительный этап внедрения в практику здравоохранения. Полученные в эксперименте результаты о высокой санирующей активности штамма B.adolescentis МС-42 нашли подтверждение в ходе последующих клинических испытаний бифидина. Была выявлена более высокая эффективность бифидина в сравнении с бифидумбак-терином по срокам нормализации стула, действию на восстановление бифи-дофлоры и элиминацию условно-патогенных микроорганизмов, особенно сальмонелл (26, 91).

В ходе доклинических испытаний комплексного иммуноглобулинового препарата КИП в опыт были взяты 3 группы по 5 обезьян с диагнозом «колит» при сильно выраженной диарее (жидкий стул с кровью). КИП применяли тремя разными способами аппликации: внутримышечно, per os и в ректальных свечах.

У всех обезьян, получавших препарат, независимо от способа введения, уже к 3-му дню наступило значительное улучшение клинического состояния, стал оформленный стул. В числе 15 обезьян контрольной группы с аналогичным диагнозом, не получавших КИП, ни у одной сдвигов в клинической картине не произошло, диарея продолжалась. В сыворотке крови, взятой от 10 обезьян опытных групп, было обнаружено повышение титров антител в РПГА против шигелл, сальмонелл, эшерихий на 2-3 двукратных разведения по сравнению с исходными, что свидетельствовало о поступлении препарата в кровь не только после внутримышечного введения, но также после пероральной и ректальной аппликации. Повышение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови после энтерального и ректального введения было отмечено также у 6 здоровых обезьян, которые служили дополнительным контролем на переносимость препарата. Однако это явление оказалось более выраженным у больных обезьян, чему по-видимому, способствовало повышение проницаемости сосудов вследствие местной воспалительной реакции.

Результаты проведенных наблюдений на обезьянах убеждают в адекватности данной модели для доклинической оценки и дифференцированного отбора разрабатываемых сывороточных биопрепаратов медицинского назначения. Кроме того, достигаемое быстрое излечение обезьян, страдающих диарейным синдромом, создает большой экономический эффект за счет предотвращения гибели этих высокоценных животных. На способ лечения диарейных заболеваний у обезьян при помощи иммуноглобулинового препарата КИП получено Авторское свидетельство.

Результаты проведенных наблюдений определяют перспективность дальнейших исследований в направлении создания комплексных биопрепаратов, сочетающих в своем составе высокоэффективный микробный и иммуноглобу-линовый компоненты.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дарсания, Маквала Шотаевна, Москва

1. Алешкин В.А., Борисова И.В., Холчев Н.В. и др. Получение и исследование комплексных иммуноглобулиновых препаратов/ Новые лекарственные препараты//Экспресс-информация. -М., 1993. -вып.З. -С. 1-11.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях/Я!., 1962. 180 с.

3. Бевз Н.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Бордашевская И.А. Адгезивные свойства бифидобактерий//Всес. Семинар «Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные пр-ты». -28-29 июля 1988 г -ч.П. -С. 161.

4. Блохина И.Н., Леванова Г.Р., Лихачева А.Ю. Подходы к классификации бифидобактерий на основе данных о структуре их ДНК//Молекулярн. генетика, микробиол. вирусолог. -1995. -№ 4. -С.27-29.

5. Болезни обезьян, опасные для человека, правила содержания и работы с обезьянами в карантине: Метод, рекомендации/ НИИ ЭпиТ АМН СССР; Подгот. Лапин Б.А. -Сухуми. -1981.-21 с.

6. Бондаренко A.B., Бондаренко Вл.М., Бондаренко В.М. Дисбакте-риозы и эубиотики.//М., 1996. 8 с.

7. Бондаренко В.М., Боев Б.В., Лыкова Е.А., Воробьев A.A. Дисбакте-риозы желудочно-кишечного тракта//Рос.журн.гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -1998. -Т.VIII. -С.66-70.

8. Борисова И.В., Холчев Н.В., Поспелова В.В., Джикедзе Э.К. Получение комплексных иммуноглобулиновых препаратов (КИП) для парэнтераль-ного и энтерального применения//Иммуноглобулиновые и другие препараты крови. Сб.науч.тр. -Горький. -1986. -С.69-73.

9. Бочков И.А. Особенности формирования аутомикрофлоры у новорожденных детей в раннем неонатальном периоде (эпидемиологические и микробиологические аспекты): Автореф.дис.докт.мед.наук. -М., 1998. -36 с.

10. Бочков И.А., Крави М., Лянная A.M., Сильченко H.A. Колонизационная резистентность симбионтов микрофлоры влагалища рожениц/Эпидемиология и инфекционные болезни. -1997. -5. -С.39-42.

11. Брашкина Н.П., Самсыгина Г.А., Першина Г.Д. и др. Линекс в лечении дисбактериоза кишечника у детей раннего возраста//Сб.: «Человек и лекарство». -М., 1998. -С.257.

12. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. Определение силы ци-тадгезии лактобацилл// Семинар «Колонизационная резистентность и химиоте-рапевтические антибактериальные пр-ты». -28-29 июля 1988 г-ч.П. -С. 163.

13. Будагов P.C., Ульянова Л.П., Поспелова В.В. и др. Биопрепарат на основе L.acidophilus новое средство раннего лечения комбинированных радиа-ционно-термических поражений//Радиационная биология, радиоэкология. -М., 1997. -Т.37. -вып.5. -С.743-749.

14. Виха Г.В., Лизько H.H., Корольков В.И. и др. Углеводный адапто-ген для профилактики иммунных расстройств и коррекции дисбактерио-зов//Авиакосмич. и экол. медицина. -1998. -32. -№ 4. -С.21-25.

15. Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И., Мартьянова Э.М. и др. Применение лактосодержащего болгарского препарата нормофлор больным с острыми кишечными инфекциями//Сб.науч.тр.: Острые кишечные инфекции вирусно-бактериальн. природы. -М., 1988. С. 99-103.

16. Гончарова Г.И. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «Сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни: Автореф. дис.кан.биол.наук. -М., 1970. -20 с.

17. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерина: Автореф. дис. док.биол.наук. -М., 1982. 38 с.

18. Гончарова Г.И., Козлова Э.П., Лянная A.M., Чистякова В.И. Значение бифидофлоры для организма человека и необходимость ее нормализации// Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1987. вып. 4, С.1-5.

19. Гордова Л.А. Топография кишечных ферментов у обезьян//Журн. Эволюц.биохиии и физиологии. -1996. —2. № 5. -С.658-661.

20. Гордова JI.A., Егорова В.В., Иезуитова H.H., Тимофеева Н.М. Некоторые свойства растворимой и нерастворимой форм кишечных гидролаз у обезьян// Журн. эволюц.биохиии и физиологии. -1998. -34. № 3. -С.338-345.

21. Грачева Н.М., Поспелова В.В., Аваков A.A. и др. Новый бифидо-содержащий пробиотик «Бифидин сухой»// Новые лекарственные препараты. Экспресс- информация. М., 2000. -вып.З. -С.37-42.

22. Джикидзе Э.К., Шагинян С.А., Поспелова В.В. Микрофлора кишечника обезьян в норме и при патологии и ее коррекция препаратами из живых бактерий облигатного биоценоза человека (колибактерин, бификол, бифи-думбактерин)//ЖМЭИ. -1984. -№ 12. -С.44-48.

23. Джикидзе Э.К., Шагинян С.А., Поспелова В.В. и др. Использование обезьян как модели для оценки эффективности микробных биопрепаратов при заболеваниях, связанных с дисбактериозом// Вестник АМН СССР. 1986. -№ 3. -С.74-77.

24. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов: Пособие для врачей и студентов/ МЗ РФ; Подгот. Н.М.Грачева, Н.Д.Ющук, П.Р.Чупринина и др. М., 1999.-44 с.

25. Дисбактериозы у детей: Учебное пособие для врачей и студентов/ ММА им.И.М.Сеченова; Под ред. А.А.Воробьева и С.Г. Пака. М., 1998. -60 с.

26. Зайдель A.A. Элементарные оценки ошибок измерений. -Л-д., «Наука». 1968. -96 с.

27. Калмыкова А.И. Обзор применения пробиотиков в медицине для восстановления микробной экологии кишечника и профилактики дисбактерио-зов//Научно-произв. фирма «Био-Веста». -Новоросибирск, 1999. -24 с.

28. Карпушина С.Г., Тюрин М.В., Иванов A.A. и др. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерий из кишечника человека//Биотехнология. -1998. -№ 2. -С.28036.

29. Каталог «Бактериологические среды для санитарной и клинической микробиологии, биотехнологии и контроля лекарственных средств// Обо-ленск, 1999.-56 с.

30. Кашковская Н.В. Экспериментально-клиническое обоснование применения биологических микробных препаратов в гинекологии и стоматологии: Автореф. дис.канд.биол.наук. -М., 1992. -17 с.

31. Коваленко Н.К. Биология молочнокислых бактерий пищеварительного тракта человека и животных: Автореф. дис. докт. биол. наук. -Киев, 1991. -29 с.

32. Козлова Э.П., Гончарова Г.И., Лянная A.M. и др. Бифидумбактерин в лечении и профилактике дисбактериоза кишечника//Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1987. -вып.4. -С.6-13.

33. Козлова Э.П., Грачева Н.М., Лянная A.M. и др Перспективы использования бифидобактерий разных видов в составе лечебно-профилактических средств// Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1987. -вып.4. -С. 14-19.

34. Колпаков А.И., Бондаренко В.М., Куприянова-Ашина Ф.Г., Егоров С.Ю. Стимулирующее действие экзогенной РНКазы на эубиотические штаммы лактобацилл, бифидобактерии и Escherichia соП//ЖМЭИ. -1996. -№ 4. -С. 14-18.

35. Коррекция дисбактериоза у больных раком толстой кишки с использованием молочнокислых бактерий «Наринэ»: Метод. Рекомендации/ МЗ АрмССР;. Подгот. Л.У. Назаров, A.M. Агавелян, A.C. Акопян и др. Ереван, 1991.-12 с.

36. Корзая Л.И. Спонтанный и экспериментальный гепатит А низших обезьян Старого Света: Автореф.дис.док.мед.наук. -М., 1999. -40 с.

37. Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника и коррекция микрофлоры антибиотикоустойчивыми бифидобактериями: Автореф. дис.док.мед.наук. М., 1983. -42 с.

38. Коршунов В.М., Ефимов Б.А., Пикина А.П. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника//ЖМЭИ. -2000. -№ 3. -С.86-91.

39. Крылов В.П., Орлов В.Г., Малышева Т.В. Принципы комбинированной терапии кишечного дисбактериоза//ЖМЭИ. -1998. -№ 4. -с.64-66.

40. Куваева И.Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофло-ра//М.: Медицина. -1976. -248 с.

41. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей//М.Медицина. -1991. -240 с.

42. Лапин Б.А., Норкина Л.Н., Черкович Г.М. и др. Обезьяна объект медицинских и биологических экспериментов//Сухуми, 1963.

43. Лапин Б.А., Джикижзе Э.К., Фридман Э.П. Руководство по медицинской приматологии/ АМН СССР// М.Медицина. -1987. -192 с.

44. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Видовой состав лактофлоры кишечника здоровых макак резусов//ЖМЭИ. -1989. -№ 6. -С.11-14.

45. Ленцнер Х.П., Янкаускене P.A. К стабильности лактофлоры стенки кишечника//Всес.семинар «Колониз.резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты» 28-29 июня 1988 г, г.Москва. -М., -ч.1. -С.59.

46. Лечение дисбактериозов кишечника путем введения культуры молочнокислых бактерий штамма 317/402 в дистальный отдел толстой кишки: Метод, рекомендации/ МЗ АрмССР; Подгот. K.M. Дехцунян, А.Д. Амбарцу-мян, П.П. Ананикян и др Ереван, 1985. -7 е.

47. Лизько H.H. Пробиотики в экстремальных условиях//В сб.: Проблемы инфекционных болезней(клиника, диагностика, лечение). МНИИЭМ, сб. посвящ. 140-летию со дня рождения Г.Н.Габричевского. 4.2. М., 2000. -С.247-250.

48. Лопатина Т.К., Бляхер М.С., Николаенко В.Н. и др. Иммуномоду-лирующее действие препаратов эубиотиков//Вестник РАМН. - 1997. № 3. -С.30-34.

49. Лыкова Е.А. Антибиотико резистентность штаммов, входящих в состав препаратов пробиотиков//ЖМЭИ. -2000. -« 2. -С.63-66.

50. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Изачик Ю.А. и др. Коррекция про-биотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоленаль-ной патологии у детей//ЖМЭИ. -1996. -№ 2. -С.88-91.

51. Лянная A.M. Видовой состав коллекции бифидобактерий и их биологические свойства: Автореф.дис.канд.биол.наук. -М., 1981.-21 с.

52. Мечников И.И. Молочнокислые микробы и польза приносимая ими здоровью СПБ изд. М.П. Петрова. -1911. 32 с.

53. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс -диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Авто-реф.дис.докт.мед.наук. —., 1998. -37 с.

54. Молета Ю.С., Тарасов В.В. Математические методы статистического анализа в биологии и медицине Изд. МГУ, М., 1981.-179 с.

55. Нахмансон Г.Л. Бифидобактерии, их антагонистические свойства и значение для организма детей грудного возраста: Дисс.канд.мед.наук. -Свердловск, 1946. -23 с.

56. Новик Г.И. Исследование структурно-функциональной организации бифидобактерий//Микробиология. -1998. -№ 3. -С.376-383.

57. Новик Г.И., Астапович Н.И., Самарцев А.А., Рябая Н.Е. Выделение и характеристика белково-полисахаридного комплекса, секретируемого Bifidobacterium adolescentis//Mикpoбиoлoгия. -1997. № 5. -С.621-627.

58. Новик Г.И., Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Сохранение жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при субкультивирова-нии//Микробиология. —1998. -67. -№ 5. -С.631-636.

59. Новый биологический препарат аципол для лечения и оздоровления детей: Учебное пособие/Подгот. Л.В.Феклисова, Н.С.Королева, Н.А.Бавина идр.-М., 1996.-12 с.

60. Огошкова И.А. Нарушения иммунитета, микробиоценоза кишечника, их коррекция бифидумбактерином и карболеном у детей первых трех месяцев жизни с тяжелыми формами острой пневмонии: Авто-реф.дис.канд.мед.наук. -Челябинск, 1996. -23 с.

61. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева Л.В. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков//ЖМЭИ. -1998. -№ 6. -С.68-70.

62. Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунобиология и кишечная микрофлора// «Аграр.наука», НК «Родник». -1998. -47 с.

63. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека-М., 1955.-431 с.

64. Пинегин Б.В., Тарабрина Н.П., Коршунов В.М. Изучение биологических свойств при приобретении ими антибиотикоустойчивости// В кн.: Сб.научн. работ 2-го Московского мед ин-та. -1982. -81. № 14. -С.33-38.

65. Пинегин Б.В., Коршунов В.М., Гладько Я.А. и др. Совместное использование антибиотиков и антибиотикоустойчивых бифидобактерий при лечении острых кишечных инфекций//Ж.микробиол. -1983. -№ 5. -С.28-32.

66. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника// М., Медицина. -1984. -144 с.

67. Поспелова B.B. Микробные биопрепараты для коррекции бакте-риоценоза кишечника, их конструирование и применение: Авто-реф.дис.док.мед.наук. -М., 1979. -32 с.

68. Поспелова В.В., Манвелова М.А., Рахимова Н.Г. и др. Ацидофильные лактобактерии и их значение в системе средств, регулирующих бактерио-ценоз//В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии. -М., 1991. -С. 175182.

69. Поспелова В.В., Грачева Н.М., Ханина Г.И. и др. Эубиотики эффективное средство нормализации микрофлоры - и вклад МНИИЭМ в их разработку (к 100-летию института)//Врач. -1997. -№ 4. -С.30-32.

70. Почхуа М.А. Микрофлора верхних дыхательных путей и оценка иммунореактивности обезьян при действии факторов космического полета: Автореф.дис.кан.биол.наук. —., 1989. -30 с.

71. Почхуа М.А., Корольков В.И., Князев В.М. Микрофлора верхних дыхательных путей обезьян макаков-резусов при действии факторов космического полета//В сб.: Результаты исследований на биоспутниках. РАН, Отделение физиологии. -М., «Наука», 1992. -с. 117-119

72. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбак-териозе кишечника: Метод, рекомендации/ Подгот. H.M. Грачева, Г.И. Гончарова, A.A. Аваков М., 1986. -23 с.

73. Применение бактерийных препаратов при клинически выраженных дисбактериозах у обезьян в условиях питомников и зоопарков: Метод, реко-мендации/ИЭПиТ АМН СССР; Под ред. Б.А.Лапина. Сухуми. -1986. -14 с.

74. Рахимова Н.Г. Разработка комплексного бактерийного препарата бификоа и его эффективность при кишечных расстройствах, связанных с дис-бактериозом: Автореф. дис.кан.биол.наук. -М., 1977. -16 с.

75. Самарцев A.A., Астапович Н.И., Новик Г.И. Особенности роста и образования внеклеточных протеиназ Bifidobacterium adolescentis 94-БИМ//Микробиолгия. -1997. -66. -№ 5. -С.635-639.

76. Семенихина В.Ф., Сундукова М.Б. Штамм бифидобактерий В.adolescentis МС-42, используемый для приготовления кисломолочных продуктов// Авт. свидетельство №2900607/28-13/1981.

77. Семенихина В.Ф., Сундукова М.Б. Использование бифидобактерий при производстве детских кисломолочных продуктов//В кн.:ХХ1 Международ, молочный конгресс. —.М., 1982. -т. 1. -кн.2. -С.98-99.

78. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиоти-ков из бактерий рода ВасШи8//Микробиол.журнал. -1993. -55. -№ 4. -С.92-112.

79. Смирнов В.К., Лизько H.H., Печенкина P.A. и др. Пищеварительные ферменты и кишечная микрофлора в экстремальных условиях/ТВ сб. трудов 1У Междунар. Симпозиума «Гастроинтестинальная микрофлора человека». -Штральзунд, Германия. -1987. -С.21.

80. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов//Антибиотики и химиотерапия. -1998. -44. -2. -С.20-23.

81. Сорокулова И.Б. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиотиков: Авто-реф.дис.докт.биол.наук. -Киев, 1999. -37 с.

82. Сундукова М.Б. Исследование размножения бифидобактерий в стерильном молоке//В кн: Использование микробиологических процессов при производстве цельномолочных продуктов и молочных консервов. -М., 1983. -С.14-18.

83. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Поспелова В.В. и др. К механизму антагонистической активности лактобацилл/УЖМЭИ. -1989. -№ 2. -С.3-8.

84. Фридман Э.П. Лабораторный двойник человека// М., «Наука». -1972.-198 с.

85. Халенева М.П. Эффективность разных составов накопления и обезвоживания биомассы в производстве таблетированного бифидумбактерина: Автореф.дис.канд.био.наук.-М., 1989.-23 с.

86. Циклинская П.В. К вопросу об этиологии инфекционных желудочно-кишечных заболеваний у детей раннего возраста//Харьковский мед.журнал. -1914. -С.381-400.

87. Цой И.Г., Сапаров A.C., Тимофеева И.К. Иммуностимулирующее действие лактобактерий на цитотоксичность естественных клеток киллеров и продукцию интерферона//ЖМЭИ. -1994. -№ 6. -С. 112-113.

88. Чахава О.В. Гнотобиологические аспекты изучения нормальной микрофлоры// В кн.: Тез.докл.XVI Всесоюз.съезда микробиологов и эпидемиологов. -4.1. -М., 1977. -С.255-256.

89. Чепнян Е.Р. Фенотипическая характеристика лимфоцитов и реактивность их с агонистическими моноклональными антителами у здоровых павианов гамадрилов: Автореф.дис.канд.биол.наук. -М., -1996. -24 с.

90. Четверикова Н.Ю. Использование специализированных продуктов, обогащенных бифидо- и лактобактериями, в лечении и профилактике функциональных заболеваний толстой кишки: Автореф. дис.канд.мед.нак. -М., 1997. -24 с.

91. Чешева В.В., Манвелова М.А. Питательные среды для культивирования бифидобактерий. Обзор. Проблемы медицинской биотехнологи и иммунологии инфекционных болезней//Сб.науч.тр. -М., 1996. -т.2. -С.84-90.

92. Чиненкова А.Н. Комбинированное применение безалкогольных бальзамов и пробиотиков для коррекции нарушенного микробиоценоза кишечника у детей: Автореф.дис.канд.мед.наук. -Пермь, 1999. -22 с.

93. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание/ том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции.-1. Грант» -М., 1998. 287 с.

94. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание/ том 2: Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. «Грант». -М., 1998. -413 с.

95. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека//Рос.журн.гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктоло-гии. -1998. -T.VIII. -С.61-65.

96. Щербаков И.Т., Гаврилов А.Ф., Грачева Н.М. и др. Влияние лакто-содержащих бактерийных биологических препаратов на процессы репарации в слизистой оболочке толстой кишки: Сб.науч.тр. МНИИЭМ: Иммунобиологические препараты/-М., 1989. -С. 157-161.

97. Якушенко М.Н., Тхагапсоева Ж.М., Бондаренко В.М. Регуляция микроэкологических нарушений кишечника у новорожденных детей с перинатальной патологией новым пробиотиком бифидумбактерином-форте//ЖМЭИ. -1997. -№ 6.-С. 18-22

98. Baibakov V.I., Karikh T.L., Borukaeva L.A. et al. Normalization of intestinal microflora and the general condition of mice of the YCR line as affected by Bifidobacterium concentrate//Antbriot. -Khimioter. -1997. -42 (3). -P.20-24.

99. Bengmark S. Immunonutrition: role of biosurfactants, fiber and probiotic bacteria//Nitrition. -1998. -14 (7-8). -P.585-594.

100. Bergey's Manual of determinative bacteriology, eight edition// Baltimore.-1974.

101. Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L., Collins J.K. Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobocterium isolates from the humman gastrointstinal tract// Lett.Appl. Microbiol. -1998. -26 (5). -P.333-357.

102. Dickey D.T., Billman G.E., Tean K. et al. The effects of horisontal body casting on blood vulume, drug responsiveness and +Gs tolerance in the rhesus monkey// Aviat. Space environm. Med. -1982. -№2. -P.142-146.

103. Elmer G.W., Surawicz C.M., Mc Farland L.V. Biotherapeutic agents. A neglected modality for the treatment and prevention of selected intestinal and vaginal infections// JAMA 1996. -20, 275 (11). -P.870-876.

104. Fikes J.D. et al. Gastric infection in cynomolgus moneys (Macaca fescicu-laris)//Vet. Pathol. -1996. Mar; 33 (3). -P.171-175.

105. Fuller R. Probiotics in man and aimals//J. of App.Bacteriology. -1989. -66. -P.365-378.

106. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietery modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics//J.Nutr. -1995. -125 (6). -P. 14011412.

107. Goerg K.J., Schlorer E. Probiotic therapy of pseudomembranous colit. Combination of intestinnal lavage and oral administration of Escerichia coli// Dtsch. -Med. Wochenschrift. 1998. -23., 123 (43). -S.1274-1278.

108. Hackstein Y.H., Van-Alen T.A., Op-Den-Camp H. et al. Intestinal metha-nogenesis in primates a genetic and evolutionary approach// DTW. Dtsch. Tierarztl. Wochenschrift. -1995. -102 (4). -S. 152-154.

109. Handt Z.K., Fox J.G., Van L.L. et al. Diagnosis of Helicobacter pylori infection in a colony of rhesus monkeys (Macaca mulatta)//J. Clin. Microbiol. —1997. -35 (1). -P.165-168.

110. Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J. et al. Overview of gut Flora and Pro-biotics//Int. J.Food Microbiol. -1998. -26, 41 (2). -P.85-101.

111. Kamai V., Konishi H., Horitsu H.H. et al. Purification and characterization of D-xylose isomerase from Bifidobacterium adolescentis//Biosci-Biotechnol-Biochem. -1994. -58 (4). -P.691-694.

112. Kaneko J., Mori H., Jwata M., Meguro S. Growth stimulator for bifidobacteria produced by Propionibacterium freudenreichii and several intestinal bacteria//J.Dairy Sei. -1994. -77 (2). -P.393-404.

113. Karpunina T.I., Gorovits E.S., Chinenkova A.N., Perevalov A.I. Increasing the effectiveness of the therapeutic action of Probiotics//Zh.-Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. -1998. -2. -C. 104-107.

114. Kasper H. Protection against gastrointestinal diseases present facts and future developments//Int: J.Food Microbiol. -1998. -26, 41 (2). -P. 127-131.

115. Kullen M.Y., Brady L.Y., O'Sullivan D.J. Evaluation of using a short region of the rec-A gene for rapid and sensitive speciation of dominant bifidobacteria in the human large intestine//FEMS Microbiol.Lett. -1997. -15, 154 (2). -P.377-383.

116. Lee S.K., Kim V.B., Ji G.S. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis// J.Appl.Microbiol. -1997. -83 (3). -P.267-272.

117. Lizko N.N., Vikha G.V., Korolkov V.I. et al. The effect of adaptohit on the state of intestine microbiocenosis on the primate experimental models// Bioscience and Microflora. -1997. -V.16. -Supplement № 2. -P.24-26.

118. Lizko N.N., Vikha G.V., Korolkov V.I. et al. Stress-induced dysbioses and ways to correct them//Gastroenterology international. -1998. Supplement № 1. -P.141-143.

119. Lodinova-Zadnikova R., Sonnenbirn U., Tlaskalova H. Probiotics and E.coli infections in man// Vet. -O. -1998. -20, supple. 3. -P.978-981.

120. Lykova E.A., Bondarenko V.M., Izachik Ju.A. et al. The probiotic correction of microecological and immune disorders in gastroduodenall pathology in chil-dren//Zh. Microbiol. Epidemiol, and Immunol. -1998. -№2. -P.88-91.

121. Lyons T.P., Fallon R.J. The probiotic concept: coming of age//The World Biotech. Report. -1986. -V.2.(7). -P.69-80.

122. Mangin I., Bourget N., Simonet J.M., Decaris B. Selection of species-specific DNA probes which detect strain restriction polymorphism in four Bifidobacterium species// Res.Microbiol. -1995. -146 (1). -P.59-71.

123. Marin M. L., Lee J.H., Murtha J. et al. Differential cytokine production in clonal macrophage and T cell lines cultured with bifidobacteria// J. Daryg Sci. -1997. -80 (11). -P.2713-2720.

124. Masubuchi N., Takahashi S., Nakano M. et al. Experimental infection of the cynomolgus monkey with Helicobacter pylori// Nippon-Rinsho. -1993. -51 (12). -P.3127-3131.

125. Mukai T., Toba T., Ohori H. Collagen binding of Bifidobacterium adoles-centis//Curr.-Microbiol. -1997. -34 (5). -P.326-331.

126. Neut C., Lesieur V., Beerens H., Romond C. Changes in the composition of infant faecal flora during weaning//Microecol. Therapy. -1985. -15. -P.21-26.

127. Novik G.I., Astapovich N.I., Samartsev A.A., Riabaia N.E. Isolation and characteristics of a protein-polysaccharide complex, secreted by Bifidobacterium adolescentis//Microbioligiia. -1997. -66 (5). -P.621-627.

128. Novik G.I., Astapovich N.I., Riabaia N.E. et al. Biological activity of the protein- polysaccharide complex secreted by Bifidobacterium adolescen-tis//Microbiologiia. -1997. -66 (5). -P.628-634.

129. Podolsky D.K., Madara J.L., King N. et al. Colonic mucin composition in primates. Selective alteration associated with spontaneous colitis in the colton-top tamarin//Gastroenterology. -1985. -v.88. -P.20-25.

130. Poleshchuk V.F., Dokin V.P., Balayan M.S. et al. Outbreak of a severe disease with fatalities among Saguinus mysfax associated with organophosphate de-sinfection/ZPrimate report. Primatology in Eastern Europe. Separatum . -1991. -№ 29. -P.55-57.

131. Ralter S.S. Enteic viruses of nonhuman primates// Vet.Pathol. Suppl. -1982. -19. -Suppl. 7. -P.33-43.

132. Rambaut P. Recent progress in NASA biomedical research// EKEM. -182. -№3. -P.7-16.

133. Sahay P., Axon A.T. Reservoirs of Helicobacter pylori and modes of transmission// Helicobacter. -1996. -1 (3). -P. 175-182.

134. Salminen S., Isolauri E., Onnela T. Gut flora in normal and disordered states//Chemotherapy. -1995. -41. -Suppl.l. -P.5-15.

135. Samartsev A.A., Astanovich N.I., Novik G.I. Features of growth and formation of extracellular proteinases of Bifidobacterium adolescentis 94-BJM//Microbiologie. -1997. -66 (5). -P.635-639.

136. Sato T., Takeuchi A. Infection by spirilla in the stomach of the rhesus monkey// Vet. Pathol. Suppl. -1982. -19, 7. -C. 17-25.

137. Saxelin M., Pessi T., Salminen S. Fecal recovery following oral administration of Lactobacillus strain GG (ATCC 53103) in gelatin capsules to healthy volunteers// Isnt: J.Food Microbiol. -1995. -25 (2). -C. 199-203.

138. Shuto R., Fujioka T., Kodama R., Nasu M. Experimental study in Japanese monkey with Helicobacter pylori infection//Nippon Rinsho. -1993. -51 (12). -C.3132-3137.

139. Smirnov V.V., Reznik S.R., V'iunitskaia V.A. et al. The current concepts of the mechanisms of the therapeutic-prophylactic action of Probiotics from bacteria in the genus Bacillus// Microbiol. -Z. -1993. -55 (4). -P.92-112.

140. Sorokulova I.B. A comparative study of the biological properties of Bio-sporin and other commercial Bacillus based preparation//Microbiol.Z. -1997. -59 (6). C.43-49.

141. Strus M. The significance of lactic acid bacteria in treatment and prophylaxis of digestive tract disorders//Postepy -Hig.-Med.-Dosw. -1997. -51 (6). -P.605-619.

142. Suzuki H., Hamada M., Kato F. Metabolism lithocholic and chenodeoxy-cholic acids in the squirrel monkey// Gastroenterology. -1985. -vol.89. -P.631-636.

143. Tannock G.W., Dashkevicz M.P., Feighner S.D. Lactobacilli and bile salt hydrolase in the murine intestinal tract//Appl.Environ. Microbiol. -1989. -v.55. -P.1989-1992.

144. Thomson J.A., Scheffler J.J. Hemorrhagic typhlocolitis associated with at-tachihg and effacing Escherichia coli in common marmosets//Lab.Anim. Sci. —1996. -46 (3). -P.275-279.

145. Tissier H. Reparation des microbes dans l'intestin du nourisson//Annales de l'Institut Pasteur. -1905. -19, 5. -P. 109-111.

146. Van-Laere K.M., Beldman G., Voragen A.G. A new arabinofuranohydro-lase remuve from Bifidobacterium adolescentis able to arabinasyl residues from double-substituted xylose units in arabinoxylan// Appl.-Microbiol.-Biotechnol. -1997. -47 (3). -P.251-255.

147. Yaskari J., Kontula P., Siitonen A. et.al. Oat beta-glucan and xylan hy-drolysates as selecive substrates for Bifidobacterium and Lactobacillus strains// Appl. Microbiol. Biotechhnol. -1998. -49 (2). -P.175-181.

148. СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

149. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГОСУДАРСТВЕННОМ КОМИТЕТЕ СССР ПО НАУКЕ И ТЕХНИКЕ {Г0СК0МИ30БРЕТЕНИЙ)

150. На основании полномочий, предоставленных Правительством СССР, Госкомизобретений выдал настоящее авторское свидетельство на изобретение:

151. Способ лечения диарейных заболеваний"

152. Автор (авторы): Дарсания" Макваяа Юзтаевяа и другие,указанные в описании

153. НАМ04ШСЗД0ВАТМВЖЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬ НОЙ ПАТОЛОГИИ И ТЕРАПИИ „АМН СССР И МОСКОВСКИЙ одаййТРпи. МУТО41СВД0ВАТЕШЖИИ ИНСТИТУТ ШИДЕШ0Я01ИИ Заявитель. й Шр0ЭД0Л0ГйИ ИМ.Г. Н.ГАБРИЧЕВСКОГО

154. Заявка № 4897956 Приоритет изобретения 28декабря1990Г

155. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР13 октября 1992г.

156. Действие авторского свидетельства распространяется на всю территориюЛоюза ССР.

157. Председатель Комитета . Начальник отдела .pos с н ^яffc>€ V i; Л';- a

Информация о работе

Дарсания, Маквала Шотаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Микрофлора кишечника обезьян и доклиническое изучение лечебных биопрепаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы