Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция производственно-перспективных штаммов бифидобактерий, выделенных от детей

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Селекция производственно-перспективных штаммов бифидобактерий, выделенных от детей"

}

На правах рукописи

ЖИЛЕНКОВА ОЛЬГА ГЕННАДЬЕВНА

СЕЛЕКЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННО-ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о 3 0ЕЗ 2011

Москва-2011

4843636

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители: . . ,,

' Амерханова Аделаида Михаиловна

доктор биологических наук

кандидат биологических наук, ^ ^

Воронина Ольга Львовна

доцент

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Мазурова Изабелла Константиновна

профессор

доктор медицинских наук,

Анкирская Алла Семеновна

профессор

Ведущая организация:

ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития РФ (г. Москва)

Защита состоится « /О '■¿/¿2^' 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Автореферат разослан » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бифидобактерии являются важнейшим симбионтом желудочно-кишечного тракта человека. У детей к 3-х месячному возрасту их доля в микробиоме составляет более 99%, что свидетельствует о ведущей роли этой группы бактерий в становлении и развитии систем гомеостаза детского организма. Они обладают морфокинетическим действием, образуют ферменты, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липи-дов и нуклеиновых кислот, продуцируют биологически активные соединения, в частности, витамины группы В, выполняют иммуногенную и антимутагенную функции, а также участвуют в детоксикации экзо- и эндогенных токсических агентов (Mitsuoka Т. et.al.,1974; Гончарова Г.И., 1986; Новик Г.И., 1998; Шендеров Б.А., 1998, 2008,2010; Gore С., 2008; Smehilova' М. et.al., 2008; Sanders М.Е., Marco M.L., 2010).

В современных условиях массированного антропогенного воздействия на биосферу страдает не только природа, но и сам человек, в частности, негативные изменения в онтогенезе происходят и на уровне его микроэкологии, нарушая естественный ход ее развития.

С 80-х годов прошлого века и по настоящее время исследователи отмечают дефицит бифидофлоры и снижение ее видового разнообразия у детей раннего возраста, признанных клинически здоровыми. Характерным явлением последних двух десятилетий также стало изменение видового состава бифидофлоры (Benno Y. et al., 1984; Гончарова Г.И., 1986; Vilková E et al., 2004; Young S.L., et al., 2004; Шкоропов A.H. и др., 2007).

Период первичного становления микробиоценоза можно без преувеличения назвать базисом здоровья человека в будущем. Вместе с тем, целый ряд факторов может стать причиной возникновения дисбиоти-ческих нарушений, и их коррекция требует применения таких проби-отических средств, которые учитывали бы особенности бифидофлоры современных детей. Так, рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише (Сукачев В.Н., 1964; Бигон М., Харпер Дж., 1989; Рыбальченко О.В., 2008). В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. В микрофлоре желудочно-кишечного тракта

(ЖКТ) человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза.

Важно отметить при этом, что вмешательство неблагоприятных внешних факторов, таких как отсутствие грудного вскармливания, эндогенные инфекции, неблагоприятная экология и пр. могут нарушить естественный ход развития микробиоценоза ЖКТ ребенка (Соколова К.Я., 1999; Мухина Ю.Г., 2005; Кафарская Л.И., 2006; Smehilova, 2008).

В связи с изменениями микрофлоры ЖКТ первостепенное значение приобретает необходимость всестороннего изучения видового спектра и фенотипических особенностей бифидобактерий, которые являются физиологичными для детей, и селекции штаммов, наиболее перспективных для производства пробиотических препаратов.

Изучение выделенных культур должно основываться на комплексной методологии, включающей изучение их антибиотикорезистентнос-ти, культуральных, антагонистических, морфологических, физиолого-биохимических свойств и молекулярно-генетической идентификации с последующей селекцией штаммов, наиболее перспективных для конструирования пробиотических препаратов для детей. Это позволит проводить коррекцию микроэкологических нарушений более эффективно и безопасно.

Цель исследования - селекция производственно-перспективных штаммов бифидобактерий, как резерва для конструирования пробиотических препаратов для детей.

Задачи исследования

1. Разработать метод выделения бифидобактерий из содержимого ЖКТ (фекалий) детей 1-18 месяцев и 3-5 лет.

2. Произвести выделение культур бифидобактерий, изучить их морфологические и культуральные свойства.

3. Провести сравнительное изучение рекомендованных нормативными документами коммерческих биохимических микротест-систем применительно к изучению сахаролитических свойств бифидобактерий и возможности их видовой идентификации.

4. С помощью молекулярно-генетического типирования определить видовую принадлежность выделенных бифидобактерий и оценить видовое разнообразие бифидофлоры исследуемых групп детей.

5. Адаптировать методы определения антибиотикорезистентности, применяемые для патогенных микроорганизмов, к бифидобактериям, и

изучить отношение выделенных культур к антибактериальным веществам.

6. По совокупности фено- и генотипических признаков провести отбор наиболее перспективных штаммов, как основы для пробиотических препаратов.

7. Сконструировать консорциумы из референсных производственных и вновь выделенных штаммов бифидобактерий, проанализировать их пробиотические и технологические свойства.

Научная новизна

Разработана новая технология селекции бифидобактерий с целью совершенствования пробиотических препаратов для детей младшего возраста, которая основана на выделении бифидобактерий, всестороннем изучении их фенотипических свойств и видовой идентификации с помощью молекулярно-генетического анализа на основе секвенирования фрагментов генов 16S rDNA и трансальдолазы (tal). Данная технология дает возможность проводить комплексный скрининговый анализ пула выделенных культур с целью селекции штаммов по заданным критериям, применима к практике работы с коллекционными штаммами и для использования в производстве пробиотических препаратов.

Получены новые данные о видовом разнообразии бифидофлоры здоровых детей, относящихся к двум возрастным группам: 1-18 месяцев и 3-5 лет. Установлено более широкое видовое разнообразие бифидобактерий детей раннего возраста, по сравнению с бифидофлорой детей старшей возрастной группы. Биоразнообразие видов в младшей группе компенсирует незрелость ферментативной системы в данный возрастной период. В старшей группе детей выделение 3-х видов, отличающихся высокой биохимической активностью, коррелирует с большей зрелостью ЖКТ и сменой видов в процессе сукцессии в силу их экологического преимущества.

Отобрано семь штаммов бифидобактерий, перспективных для конструирования пробиотических препаратов для детей младшего возраста. На них получены патенты РФ.

Практическая значимость

Разработаны и апробированы на большом количестве штаммов новые методы определения антибиотикорезистентности бифидобактерий. Для практики изучения коллекционных культур отобраны 36 антимикробных веществ, относящихся к 16 группам антибиотиков. Впервые

разработана панель из 15 антимикробных препаратов, значимых для штаммовой идентификации микроорганизмов рода Bifidobacterium, которые относятся к 8 группам: пенициллинам; цефалоспоринам 1 и 3-его поколения; аминогликозидам 1, 2 и 3-ого поколения; тетрациклинам, фторхинолонам и макролидам.

Государственная коллекция микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнад-зора пополнена 287 культурами бифидобактерий, представляющими материал для углубленного изучения биологических свойств бифидобактерий, выделенных от современных детей. Из них 37 штаммов бифидобактерий паспортизированы и депонированы в коллекции. Для проведения скрининговых исследований биохимической активности культур бифидобактерий предложена коммерческая микротест-система ANAEROtest-23 (Pliva Lachema Diagnostica, Чешская Республика).

Последовательности фрагментов генов 37 штаммов бифидобактерий были аннотированы и зарегистрированы в GenBank.

На основе результатов, полученных при морфологическом изучении выделенных культур, референсных и типовых штаммов бифидобактерий, создана фототека колоний и микропрепаратов клеток, предназначенная для коллекционной работы.

Внедрение результатов работы в практику

Разработанные методические подходы для изучения фено- и гено-типических свойств бифидобактерий вошли в МУК 2.3.2.2789-10 «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Новая технология селекции и изучения бифидобактерий используется в научной и практической работе лабораторий и ГКНМ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора и внедряется в работу других научно-практических и производственных лабораторий РФ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработана новая технология выделения и изучения фенотипи-ческих свойств бифидобактерий, их видовой идентификации, основанная на усовершенствованных и стандартизованных приемах проведения исследований, которая перспективна для селекции новых штаммов и ведения коллекционных и производственных культур бифидобактерий.

2. С использованием генотипирования на основе секвенирования

фрагментов двух генов 16S г DNA и tal изучен видовой состав бифи-добактерий, выделенных от современных клинически здоровых детей двух возрастных групп: 1-18 месяцев и 3-5 лет.

3. На основе анализа данных, полученных при фенотипическом и молекулярно-генетическом изучении выделенных штаммов бифидобак-терий, отобраны наиболее перспективные штаммы для использования при конструировании пробиотических препаратов для детей.

4. Устойчивые консорциумы, сочетающие референсные и вновь выделенные штаммы бифидобактерий, проявляют синергидный эффект.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции «Медицинская биотехнология» Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 2 от 19.10.2010.

Результаты диссертационной работы были представлены на Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегратив-ной медицине» (Судак, Украина, 2008); 2-м Международном конгрессе «Санкт-Петербург-Пробиотики-2009»; Международной научной конференции «Пробиотики и Пребиотики» (Кошице, Словакия, 2010).

Связь темы исследования с планом научной работы учреждения

Диссертационная работа проведена в рамках НИР (per. № 01.2.006. 08847) и темы «Паспортизация пробиотических штаммов для ЗПВ, оценка их безопасности и функциональной эффективности» в рамках Государственного контракта № 02.522.12.2009 от 26.06.2008.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 38 научных работ, в том числе, 6 - в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации; 7 - в сборниках научных трудов; 17 - в материалах конференций; 7 патентов на изобретение РФ; 1 - методические рекомендации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 10 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 201 источник, в том числе, 146 отечественных и 55 иностранных авторов. Диссертация содержит 39 таблиц и 20 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Характеристика обследованных детей. Для изучения индигенных бифидобактерий современных детей было сформировано 2 группы:

1) 25 детей 3-5 лет, относящихся, по заключению врачей, к I и II группам здоровья (далее по тексту - старшая группа детей);

2) 11 детей в возрасте от 1 до 18 месяцев, рожденных здоровыми матерями естественным путем, находившихся на грудном или смешанном вскармливании (далее по тексту - младшая группа детей).

Все дети на момент исследования признаны врачами клинически здоровыми. Не менее чем за неделю до исследования из их рациона исключали продукты, препараты и смеси, содержащие бифидобактерии.

Штаммы микроорганизмов. В качестве референсных использовали всесторонне изученные и используемые в производстве штаммы бифидобактерий из ГКНМ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Ро-спотребнадзора: ГКНМ -19 -В. longum В379М; ГКНМ - 80 -B.bifidum 791; ГКНМ -150 - В. breve 79-88; ГКНМ -155 - В. infantis 73-15; ГКНМ - 159-2?. adolescentis ГО-13.

Определение антагонистической активности проводили с тест-культурами, полученными из ГИСК им. JI.A. Тарасевича: Shigella flexneri 170, Shigella flexneri 337, Shigella sonnei 5063, Escherichia coli 157, Staphylococcus aureus 209, Proteus vulgaris 111, Proteus mirabilis 237.

Культуральные среды, условия роста и хранения культур микроорганизмов. В работе применяли как отечественные, так и импортные лабораторные и производственные питательные среды, рекомендованные нормативными документами и соответствующие нормам ВОЗ, имеющие сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000: МПА, Сабу-ро, Эндо, стафилококковый агар; БС; МРС-4 производства ГНЦ НИИ прикладной микробиологии (г. Оболенск) и MRS (bioMeriux); агаровая среда Мюллера-Хинтона обогащенная; среда «Бруцелла», стерильное обезжиренное молоко, ГМ-среда.

Субстанции антибиотиков: гентамицина, ципрофлоксацина, док-сициклина, эритромицина, ампициллина, цефтриаксона, азитромицина, ванкомицина, кларитромицина, для изучения минимальной подавляющей концентрации, предоставленны ФГУН ГНЦА (г. Москва).

Диски с антибиотиками. В работе использовали диски с антибиотиками производства НИИЭМ им. Пастера (Россия) и HiMedia Laboratories Pvt. (Индия).

Методы исследований

В исследованиях использовали как традиционные методики, так и новые методические подходы, разработанные или модернизированные в ходе данной исследовательской работы.

Штаммы бифидобактерий при выращивании в полужидких питатель-

ных средах, разлитых высоким столбиком, инкубировали в микроаэро-фильных условиях. При выращивании на поверхности агаризованных сред - в анаэробных условиях в анаэростатах производства bioMerieux с использованием газогенерирующих пакетов GENbox anaero (bioMeriux, Франция), обеспечивающих концентрацию кислорода через 2,5 часа < 0,1 %, и через 24 часа - концентрацию углекислого газа > 15%. Температура культивирования - 37±1°С. Контроль создания анаэробиоза осуществляли при помощи индикатора фирмы bioMeriux.

При изучении морфологических свойств определяли подвижность клеток, способность к образованию капсул и спор, тинкториальные свойства и характер расположения клеток в микроскопических препаратах.

Культуральные свойства изучали по характеру роста на полужидких и агаризованных питательных средах, способности накапливать биомассу на лабораторных и производственных средах: определяли количество КОЕ/мл, динамику накопления органических кислот, способность сквашивать обезжиренное молоко, наличие каталазной активности, разжижение желатины, устойчивость к соли и желчным кислотам.

Антагонистические свойства по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам изучали методом отсроченного антагонизма на агаризованных средах (Блинковой Л.П., 1986, 2002, 2004)

Изучение физиолого-биохимических свойств бифидобактерий

Применяли коммерческие тест-системы, рекомендованные Роспотреб-надзором для идентификации анаэробов: API-50 и API-20A (bioMerieux, Франция), ANAEROtest 23 (PLIVA-Lachema Diagnostica s.r.o., Чехия)

Генотипирование бифидобактерий проводили на основе секвени-рования фрагментов генов 16S rDNA и tal (Воронина О.Л., Карзанова М.Е., 2006). Консенсусные последовательности сравнивали с помощью пакета BLAST с данными GenBank. Видовую принадлежность устанавливали при сходстве 99-100%.

Изучение антибиотикорезистентности бифидобактерий

Предварительный этап определения минимальных подавляющих концентраций осуществляли стандартным методом двойных микроразведений. Для получения антибиотикограмм изучаемых штаммов использовали диско-диффузионный метод, модифицированный автором и адаптированный для исследования бифидобактерий.

Определение безвредности штаммов бифидобактерий проводили в соответствии с Государственной фармакопеей СССР, XI, выпуск 2. (1984 г.) на 200 белых беспородных половозрелых мышах обоего пола весом 23-26 г.

Статистическую обработку полученных данных проводили в рамках базовой программы статистики (Microsoft Excel) нахождения

среднего арифметического значения (М) и стандартной ошибки (ш). Число бактерий выражали в КОЕ/ мл и lg^/мл или г исследуемого материала.

Лабораторные исследования проведены непосредственно автором настоящей работы в лабораториях ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского: биологии бифидобактерий под руководством д.б.н. Амерхановой A.M., микробиологии и профилактики кишечных инфекций под руководством к.м.н. Пожалостиной JI.B., а также совместно с н.с. Киселевой И.А. в лаборатории клинической микробиологии, и сотрудниками отделения детских инфекций МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского под руководством д.м.н., профессора Феклисовой JI.B. и к.м.н. Мескиной Е.Р.. Молекулярно-генетическая идентификация выделенных культур проведена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ РАСХН группой исследователей под руководством к.б.н. Лунина В.Г. и к.б.н. Ворониной О.Л.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Выделение бифидобактерий из содержимого кишечника детей

Выделение бифидобактерий из фекалий обследуемых детей осуществляли по методике, разработанной автором, которая заключалась в многократном чередовании пересевов выросших после культивирования на селективной питательной среде изолированных колоний, характерных для бифидобактерий, с полужидкой на агаризованную БС, отбора и анализа отдельных колоний с целью получения однородных чистых культур бифидобактерий.

В результате проведенной работы выделено 287 культур. Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств позволило отнести их к роду Bifidobacterium.

На основе материалов, полученных при морфологическом изучении вновь выделенных культур и референсных и типовых штаммов бифидобактерий, создана фототека колоний и микропрепаратов клеток, которая предназначена для работы с коллекционными культурами.

2. Изучение фенотипических свойств бифидобактерий

2.1. Исследования биохимических свойств бифидобактерий. Выбор среды культивирования определяли на основании критерия наибольшего соответствия сахаролитических способностей штамма описанию видов, выполненному Reuter G (1963 г.). При сравнении нескольких лабораторных сред, используемых для культивирования бифидобактерий, по этому критерию наиболее технологичной признана среда БС.

Изучение биохимических свойств проводили, используя параллельно три рекомендованные коммерческие биохимические тест-системы. Данные биохимического тестирования референсных штаммов бифидо-

бактерий при помощи тест-систем представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты биохимического тестирования референсных штаммов

бифидобактерий с помощью 3-х коммерческих тест-систем.

API-50CHL API-20A ANAEROtest -23

Активный ингредиент В. bifdum 791 В. longum В 379 М В. breve 79-88 \в. infantis 73-15 В. adolescentis ГО-13 В. bifdum 791 В. longum В 379 М В. breve 79-88 В. infantis 73-15 В. adolescentis ГО-13 В. bifdum 791 В. longum В 379 М В. breve 79-88 [В. infantis 73-15 1 В. adolescentis ГО-13

L-рамноза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

дульцитол 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

эритрол 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

D-галактоза + + + + + 0 + 0 0 + + + + + +

D-глюкоза + ± + + + + + + + + + + + + +

D-фруктоза + ± + 0 + 0 + 0 0 + + + + 0 +

D-лактоза + + + + + + + + + + + + + + +

D-сахароза 0 ± ± 0 0 0 0 + + + 0 + + 0 +

D-мальтоза 0 + + 0 0 0 + + 0 + 0 + + 0 +

D-мелибиоза 0 + + + + нет в тесте нет в тесте

D-раффиноза 0 + + + 0 + 0 + + + ± + + + +

L-арабиноза 0 + 0 0 + ± ± 0 ± ± ± + 0 ± ±

D-ксилоза 0 + 0 ± 0 ± 0 ± ± ± ± 0 ± ± ±

салицин 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

D-целлобиоза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 +

D-манноза 0 0 ± 0 0 0 0 + 0 0 0 0 + 0 0

D-трегалоза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + ± 0 0 0 +

D-мелецитоза 0 0 0 0 0 0 0 0 0 + 0 0 0 0 +

инулин 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

D-манит 0 0 + 0 0 0 0 + 0 0 0 0 + 0 0

D-сорбитол 0 0 + 0 0 0 + + + 0 0 + + 0 0

инозит 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Отличия от данных Reuter G. 33 35 29

Примечание: В левой графе таблицы серым цветом выделены субстраты, которые бифидобакгерии не ферментируют; желтым - всегда утилизируемые бифидобактериями. В основной части таблицы желтым выделены ячейки с результатами, соответствующими признаку у Reuter G, белые ячейки противоречат по данным Reuter G. Количество противоречий для каждой тест-системы по пяти штаммам сведено в последней графе.

Как видно из результатов, представленных в таблице, коммерческие биохимические тест-системы позволяют определить спектр сахароли-тических свойств штаммов бифидобактерий.

Вместе с тем, результаты проведенных исследований показали, что с помощью изученных тест-систем невозможно идентифировать до вида как референсные, так и вновь выделенные штаммы бифидобактерий, поскольку точность идентификации ограничивалась в большинстве случаев классом Actinobacteria. Наименьшее количество ошибок при этом отмечено при использовании тест-системы ANAEROtest -23 (PLIVA-Lachema Diagnostica s.r.o., Чешская Республика), которая позволяет с 80% долей достоверности идентифицировать бифидобактерии только 2-х видов - В. longum и В. breve (Таблица 2).

Таблица 2

Идентификация штаммов бифидобактерий по данным

коммерческих тест-систем

Штамм API-50CHL API-20A ANAEROtest-23

ГКНМ 79-88 В. breve Actinomyces israelii 62,4 % f7r2 B. breve 64,2%

ГКНМ В379М В. longum Actinomyces israelii 99% B. spp.2 89,3 % B. longum 99,8%

ГКНМ 791 В. bifidum Actinomyces naeslundii 71,3 % B. spp. 1 29,6% E^erthella lentum

ГКНМ ГО-13 В. adolescentis Actinomyces israelii 97,5 % B.spp.2 91,5% Eggerthella alactolyticum 97%

ГКНМ 73-15 В. infantis Actinomyces israelii 39,% B.spp. 1 71,3% Eggerthella lentum 92,6%

OV29-3ch Actinomyces odontolyticus 100% B.spp.2 93,5% Actinomyces odontolyticus 92%

OVl-lch Actinomyces israelii 98% B. spp.2 89% B. longum 99%

Следуя методическим указаниям МУК 2.3.2.2789-10, «штаммы с неясной этиологией не могут быть рекомендованы в качестве производственных», в связи с чем необходимо было остановиться на методе, позволяющем идентифицировать бифидобактерии до вида.

Анализ литературы и собственные исследования свидетельствуют, что для видовой идентификации бифидобактерий требуется применение молекулярно-генетических методов на основе секвенирования нескольких мишеней в геноме (Новикова H.A., Соколова К.Я., 2004; Шко-ропов H.A., 2006; Бондаренко В.М., 2006; Gill S.R., 2006; Kazuyoshi N., 2008; Namba К., 2008 и др).

3. Генотипирование штаммов бифидобактерий проводили на основе секвенирования фрагментов двух генов: 16SrDNA и tal, что позволило установить вид каждого штамма.

Информационный ген 16S rDNA позволяет достоверно разделить бифидобактерии только на уровне рода, но не позволяет различить генетически близкородственные виды бактерий. Поэтому проведено двухлокусное секвенирование с анализом последовательностей одного из операционных генов - tal, кодирующего наиболее значимые для бифидобактерий белки клеточного метаболизма (house-keeping genes), что позволяет не только различать близкородственные виды В. infantis и В. longum, В. catenulatum и В. pseudocatenulatum, но и выявлять внутривидовые различия для видов В. adolescentis, В. breve, В. longum. Однако, данная мишень не позволяет дифференцировать виды В. angulatum и В. catenulatum, различимые по фрагменту 16S rDNA.

Последовательности фрагментов генов были аннотированы и зарегистрированы в GenBank под номерами, указанными в таблицах 3,4 и 5.

Таблица 3

Видовая идентификация референсных штаммов бифидобактерий молекулярно-генетическими методами

№ Название штамма Вид GenBank Accession Number

16S rDNA tal

1. ГКНМ: ГО-13 В. adolescentis В. adolescentis EF409965 B. adolescentis EF417571

2. ГКНМ: 791 В. bifidum В. bifidum DQ887552 B. bifidum Q887902

3. ГКНМ:79-88 В. breve В. breve EF409969 B. breve EF417565

4. ГКНМ: 73-15 В. infantis В. longum / infantis DQ887556 B. infantis DQ887906

5. ГКНМ: В379М В. longum B. longum / infantis DQ887558 B. longum DQ887907

Таблица 4

Видовая идентификация штаммов, выделенных от детей 3-5 лет

№ Название штамма Вид GenBank Accession Number

16S rDNA tal

1. FHHMB OV2-lch В. catenulatum HM989853 HM989860

2. FHHMB OVl-lch В. longum HM989851 HM989858

3. FHHMB OVl-2ch В. longum HM989852 HM989859

4. FHHMB OV7ch В. longum HM989854 HM989861

5. FHHMB OV28-3ch В. longum HM989855 HM989862

6. FHHMB OV29-3ch В. longum HM989850 HM989857

7. FHHMB OVll-llch В. animalis HM989849 HM989856

Таблица 5

Видовая принадлежность штаммов бифидобактерий, выделенных от грудных детей

№ Название штамма Вид GenBank Accession Number

16S TDNA tal

1. РННМВ: ОУ2 В. pseudocatenulatum EU272010 EU272016

2. ЕННМВ: ОУ5 В. adolescentis FJ169926 FJ357018

3. ПШМВ: ОУ7 В. bifidum EU272011 EU272017

4. ЕННМВ: ОУ 8 В, bifidum FJ169930 FJ357019

5. ЕННМВ: ОУ9 В. pseudocatenulatum FJ169931 FJ357020

6. ЕННМВ: ОУ 15 В. angulatum EU272012 EU272020

7. ЕННМВ: ОУ 17 В. pseudocatenulatum EU334365 EU334366

8. ЕННМВ: ОУ 18 В. bifidum FJ169939 FJ357026

9. ЕННМВ: ОУ 19 В. bifidum EU272013 EU272019

10. ЕННМВ: ОУ 20 В. longum EU272014 EU272018

11. ЕННМВ: ОУ 21 В. pseudocatenulatum FJ169940 FJ357027

12. ЕННМВ: ОУ 22 В. adolescentis FJ169941 FJ357028

13. ЕННМВ: ОУ 23 В. bifidum FJ169942 FJ357029

14. ЕННМВ: ОУ24 В. adolescentis FJ169943 FJ357030

15. ЕННМВ: ОУ 1 В. longum / pseudocatenulatum FJ357032 FJ357015

16. ЕННМВ: ОУЗ В pseudocatenulatum FJ169922 FJ357016

17. ЕННМВ: ОУ 4-1 В. ruminantium FJ169923 GQ848098

18. ЕННМВ: ОУ 4-2 В. breve FJ169924 FJ357017

19. ЕННМВ: ОУ 4-3 В. ruminantium FJ169925 GQ438825

20. ЕННМВ: ОУ6-1 В. ruminantium FJ169927 GQ438826

21. ЕННМВ: ОУ 6-3 В. ruminantium FJ169928 GQ438827

22. ЕННМВ: ОУ 6-Зк В. ruminantium FJ169929 GQ452825

23. ЕННМВ: ОУ 10-1 В. bifidum FJ169932 FJ357021

24. ЕННМВ: ОУ 10-3 В. ruminantium FJ169933 GQ452826

25. ЕННМВ: ОУ 10-5 В. ruminantium FJ169934 GQ452827

26. ЕННМВ: ОУ 11 В. longum / pseudocatenulatum FJ169935 FJ357022

27. ЕННМВ: ОУ 12 В. breve EU272015 EU272021

28. ЕННМВ: ОУ 13 В. longum / pseudocatenulatum FJ169936 FJ357023

29. ЕННМВ: ОУ 14-1 В. breve FJ169937 FJ357024

30. ЕННМВ: ОУ 16 В adolescentis FJ169938 FJ357025

4. Изучение видового пейзажа бифидобактерий, выделенных от детей двух возрастных групп

Анализ выборки штаммов бифидобактерий, выделенных от детей на основе генотипирования, продемонстрировал существенное различие

в видовом разнообразии бифидофлоры детей двух возрастных групп (рис. 1). У детей младшей возрастной группы выделены штаммы 8 видов бифидобактерий, от старшей группы - только 3-х видов.

Младшую группу детей можно подразделить на две подгруппы:

1) в которой индигенная бифидофлора выделялась в количествах, соответствующих норме - 109"10 КОЕ/мл; 2) подгруппа детей, у которых количество индигенной бифидофлоры было значительно ниже нормативных показателей, но после проведения коррекции нормобиоценоза синбиотическим препаратом «Бифидум-Мульти-1» содержание бифидобактерий было восстановлено до нормы.

На рисунках 2А и 2Б представлен видовой пейзаж каждой подгруппы. Как видно из рисунка 2 А, у детей первой подгруппы преобладают штаммы вида В. bifidum (20%), которые прослеживаются во всех возрастах от 1 до 18 месяцев. Для ЖКТ этих детей характерными также были виды В. pseudocatenulatum (17%), В. angulatum (3%), В. longum (3%), В. adolescentis (14%).

У детей второй подгруппы доминирующим является вид В. ruminan-tium, который отмечался у детей 3,5 - 5 месяцев. У ребенка, старшего по возрасту (6,5 мес.), обнаружен вид В. adolescentis. У младшей подгруппы детей также были выделены штаммы вида В. breve, характерного именно для детей первых месяцев жизни. Штаммы природного реком-бинанта В. longum /pseudocatenulatum также выявлены только в этой подгруппе и обнаружены у двух детей - 4 и 5 месяцев. У детей обеих подгрупп младшей группы дополнительно обнаружены бифидобакте-рии видов В. pseudocatenulatum и В. bifidum. Большая доля штаммов вида В. pseudocatenulatum может свидетельствовать об их адаптации к микробиоценозу ЖКТ детей младшей возрастной группы.

Полученные данные согласуются с результатами, полученными другими исследователями (Young S.L., et al., 2004; Бондаренко В.М. и др., 2004, 2007; Шкоропов А.Н. и др., 2005, 2007; Рыбальченко О.В., 2008), свидетельствующих о значимости видов В. breve, В. bifidum, В.longum для ЖКТ детей.

Исследование бифидофлоры детей, принимавших синбиотик, показало возможность востановления собственной бифидофлоры у детей раннего возраста. В данный период жизни ребенка, который характеризуется незрелостью ферментативной системы, биоразнообразие бифидофлоры особенно важно, поэтому можно предположить, что проведение курсов приема пробиотиков или синбиотиков в этот период имеет значение для становления наиболее физиологичного микробиоценоза ЖКТ ребенка.

АкШп.тИит 23%

14«

А. Ыцши / Ш*

т

Н: |пМ|||1

Дети 1-18 мес

Дети 3-5 лет

Рис. 1 Сравнение видового разнообразия бифидобактерий, выделенных от детей двух возрастных групп

В, ЫПйит о в, р$еис1осй1епи1|>1ит

В. анвШоШт □ В, )оп@ит I, ММйМПШ

Л(1<>1<г4«пи5

. 0Щш1ит : рмгийесвШпЫМит ЫМит

Возраст, мес.

I, штмнМит о 1,

□ §.№№ит

ЫГЙит

р&вийеедИниШш« Возраст, мес.

Рис. 2 (А) Виды бифидобактерий, представителей собственной бифи-дофлоры детей раннего возраста

(Б) Виды бифидобактерий, выделенных от детей раннего возраста, принимавших синбиотик «Бифидум-Мульти-1»

т

5. Формирования выборки потенциальных пробиотических штаммов

По признаку доминирования в микробиоценозе детей младшей возрастной группы, на основании всестороннего изучения морфологических, физиолого-биохимических свойств, кинетики роста, динамики накопления органических кислот, способности сквашивать обезжиренное молоко, устойчивости к желчи, соли, безопасности для лабораторных животных было отобрано 7 штаммов бифидобактерий (OV2, OV7, OV12, OV15, OV17, OV19, OV20), перспективных для конструирования средств коррекции микрофлоры ЖКТ детей.

Важнейшим критерием отбора пробиотических штаммов является изучение их антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, которая обеспечивает колонизационную резистентность микробиоценоза ЖКТ. Отобранные штаммы характеризовались высокой антагонистической активностью, сравнимой с активностью референсных штаммов бифидобактерий, а у штамма В. longum OV20 -превышающую ее (таблица 6).

Таблица 6

Антагонистическая активность производственных и отобранных

штаммов бифидобактерий по отношению к патогенам

Штаммы бифидобактерий Значения зоны задержки роста патогенных и условно-патогенных бактерий, мм

Staphylococcus aureus ATСС 6538-Р Shigella flexneri 337 Shigella sonnei 177 Proteus vulgaris 1274 Escherichia coli 157

Производственные штаммы бифидобактерий

В. bifiudm 791 15±2 20±5 20±2 20±2 16±3

В. longum В379М 26±1 33±1 28±2 31±1 27±1

В. breve 79-88 23±2 34±1 28±2 29±1 27±1

В.adolescentes ГО-13 19±2 28±2 28±2 27±3 24±2

B.infantis 73-15 14±1 25±2 19±1 22±3 18±3

Штаммы, выделенные от детей раннего возраста

В. pseudocatenula-tum OV2 25±3 34±5 30±5 31±2 27±5

В. bifidum OV7 15±2 20±2 20±3 19±3 16±3

В. breve OV12 20±3 28±3 26±5 28±2 26±3

В. angulatum OV15 26±3 30±2 31±3 32±3 2 6±4

В. pseudocatenula-tum OV17 23±3 28±5 25±5 27±1 18±5

В. bifidum OV19 15±4 19±3 18±5 18±3 12±3

В. longum OV20 26±3 32±5 30±3 32±2 28±3

6. Исследование антибиотикорезистентности вновь выделенных штаммов

Необходимым этапом селекции перспективных для производства штаммов, является изучение их чувствительности к антибиотикам, что важно для составления рациональных схем лечения и контроля за накоплением и распространением антибиотикоустойчивых форм бактерий.

Применение двух методов - двойных серийных разведений и диско-диффузионного метода - позволило предложить алгоритм испытания 36 антимикробных препаратов и определить для бифидобактерий пределы чувствительности к ним.

Метод определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных веществ позволил распределить исследуемые штаммы микроорганизмов по трем категориям: чувствительный, промежуточно-устойчивый и устойчивый.

Изучение к 36 антибиотикам показывало, что производственные и вновь выделенные штаммы бифидобактерий устойчивы к противогрибковым препаратам; полимиксину, хинолонам и фторхинолонам и чувствительны к 14 антимикробным веществам: пенициллинам (ампициллину, карбенициллину, азлоциллину); цефалоспоринам 1 поколения (цефалотину); макролидам (эритромицину, кларитромицину, рокситро-мицину); линкозаминам (линкомицину и клиндамицину); гликопептиду (ванкомицину); хлорамфениколу и ансамицину (рифампицину). Учитывая, что данные признаки, присущие всему роду Bifidobacterium, тестирование по всем 36 антибиотикам важно при первичном изучении культур бифидобактерий.

Для дифференциации штаммов бифидобактерий внутри вида предложена сокращенная панель из 15 антибиотиков, относящихся к 8 группам антимикробных препаратов (таблица 7).

Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что отношение бифидобактерий к антибактериальным средствам можно рассматривать, как дополнительный диагностический признак рода Bifidobacterium, а индивидуальные свойства отдельных штаммов использовать как метки при дифференциации.

Таблица 7

Сравнение антибиотикорезистентности производственных штаммов бифидобактерий и штаммов, выделенных от детей раннего возраста

Название антибиотика Диаметр зоны ингибирования эоста исследуемых штаммов, мм

В. ЪфОит 791 В. Ы[иЛит ОУ-7 В. Ъгехе 79-88 СЧ £ 0 1 ■о В. кт^ит В379М о 0 1 л О) В. ифпП.ч 73-15 т 1 а 1 03 В. ап£и\аШт ОУ-15 В.гитттПшт ОУ-Ю-5

Оксациллин 0±0 12±0 24±2 31±2 12±0 24±2

Ампициллин 17±3 39±2 25±1 24±2 18±2 36±2 22±2 36±2

Цефазолин зш 16±1 12±2

Цефтазидим 18±2 30±0 28±2 33±1 20±2 36±2

Стрептомицин 19±2 0±0 12±2

Неомицин \ъа 0±0 10±0 0±0 0±0

Канамицин 0±0 20±3 16±2 15±3 10±2

Гентамицин 0±0 10±5 ЗОЙ 0±0 14±2 15±0 15±3 12±2 (Ж) 0±0

Амикацин 12±2 0=ь0 20±0 0±0 0±0

Тетрациклин 10±2 30±0 23±1

Доксициклин 10±0 32±0 22±2 30±2 25±2 34±2

Азитромицин 33=12 17±1 24±0 17±1 20±2

Ципрофлоксацин 0±0 10±0 13±2 16±2 14±2 16±2 10±0 30±2

Пефлоксацин 6±2 0±0 18±2 0±0 0±0 6±2 0±0 12±0

Ломефлоксацин 19±2 12±1 0±0 10±0 14±2 19±3 14±2 23±2 10±0 0±0

чувствителен промежуточно-устойчив устойчив высоко устойчив

Индивидуальные особенности штаммов в отношении к антибиотикам целесообразно использовать при конструировании препаратов на основе консорциумов штаммов, расширяя таким образом спектр их ан-тибиотикорезистентно ста.

7. Изучение штаммов бифидобактерий при совместном культивировании

Как уже было показано ранее (Поспелова В.В., 2000; Амерханова А.М. 2009), наиболее приоритетным в сравнении с другими подходами к конструированию пробиотических препаратов, является принцип консорциума - научно обоснованное и биотехнологически выверенное комбинирование культур пробиотических микроорганизмов.

При совместном культивировании производственных и новых штаммов бифидобактерий отсутствовал взаимный антагонизм бифидобактерий. Сравнение характеристик штаммов в индивидуальных культурах (таблица 8) с показателями в консорциумах (таблица 9).

Таблица 8

Культуральные свойства штаммов при раздельном выращивании

Концентрация клеток Значение кислотности

Название штамма в бульонной 24 ч. бульонной 24 ч.

культуре, КОЕ/мл культуры, °Т

В. bifidum 791 3,0 х 108 180

В. pseudocatenulatum OV-2 2,5 х 108 210

В. breve-OV-12 2,0 х 108 210

В. bifidum-OV-l 2,0 х 108 180

Таблица 9

Результаты совместного культивирования штаммов бифидобактерий в консорциумах

Штаммы Концентрация клеток, КОБ/мл Кислотность совместной культуры, °т

В. bifidum ГКНМ 791 В. pseudo-ca-tenula-tum OV2 В. breve OV12 B. bifidum OV7

Двухкомпонентный консорциум

ГКНМ 791+OV7 8,0 х 108 - - 8,0 x 108 194

ГКНМ 791+ OV12 7,0 х 108 - 6,5 x 108 - 196

Трехкомпонентный консорциум

КНМ 791+ OV2+ OV7 1,0 х 10' 7,0 х 108 - 7,0 x 108 196

ГКНМ 791 + OV12+ ОУ7Г 6,5 х 108 - 8,0 x 10" 7,0 x 108 198

ГКНМ 791+ OV2+ ОУ12 7,2 х 108 6,0 x 10" 8,3 x 108 - 194

Четырехкомпонентный консорциум

ГКНМ 791+ OV2+ OV12+ OV7 1,5 х 10' 7,0 x 108 7,4 x 108 7,0 x 108 198

Показана возможность сокультивирования отобранных штаммов би-фидобактерий в двух-, трех- и 4-х-компонентых консорциумах. Отмечено положительное влияние при совместном культивировании штаммов друг на друга, которое проявлялось в большем накоплении биомассы и устойчивости их к органическим кислотам, увеличении сроков хранения комплексных препаратов, а также активации физиолого-биохими-ческой активности бифидобактерий, выделенных от детей раннего возраста. Совместное культивирование новых штаммов бифидобактерий в сочетании с производственным штаммом ГКНМ 791 показало увеличение биохимической активности штамма ОУ-2 в способности сбраживать субстраты - с 4-х до 13-ти (таблица 10).

Таблица 10

Физиологическая активность штаммов ГКНМ 791 и 0\'2 по данным А^ЕЯСИеяМЗ

ОУ2 после

Активный ингредиент ГКНМ 791 ОУ2 совместного культивирования с ГКНМ 791

Ъ-рамноза + 0 0

Б-галактоза + ± +

Б-глюкоза + 0 +

Б-фруктоза + 0 +

Б-лактоза + + +

Б-сахароза 0 ±

Б-мальтоза 0 +

Б-раффиноза 0 0

Ь-арабиноза ± ± ±

Б-ксилоза ± ± ±

салицин 0 +

О-целлобиоза 0 +

Б-манноза 0 +

Б-трегалоза ± 0 +

Б-мелецитоза 0 0

Б-маннит 0 +

Б-сорбитол + 0 ±

Рис. 3. Штаммы ОУ2 и ГКНМ 791 при совместном культивировании на полужидкой БС среде

Морфологические отличия формы колоний штаммов бифидобактерий, стабильно сохраняющиеся при выращивании в совместной культуре на полужидкой среде, позволили количественно оценивать каждый штамм в консорциуме (рис. 3).

Таким образом, от здоровых детей выделено 287 культур, которые по дифференциальным признакам отнесены к роду Bifidobacterium. Всесторонне охарактеризованные 37 штаммов бифидобактерий депонированы в Государственной коллекции нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Из них 7 штаммов бифидобактерий В. bifidum OV-7, В. angulatum OV-15, В. pseudoca-tenulatum OV-17, В. bifidum OV-19, В. longum OV-20, В. breve OV-12, B. pseudocatenulatum OV-2 запатентованы и готовы к производственным испытаниям.

выводы

1. Разработана новая комплексная технология выделения и изучения фенотипических свойств бифидобактерий и их молекулярно-генетиче-ской идентификации, что явилось основой для селекции штаммов, перспективных для конструирования пробиотических препаратов, а также для ведения коллекционных и производственных культур.

2. Определен видовой состав бифидофлоры детей с использованием метода генотипирования на основе секвенирования фрагментов двух генов: 16S rDNA и tal. Показано большее разнообразие видов в младшей группе детей, у которых выделены бифидобактерии видов: B.angulatum (3%), B.pseudocatenulatum (17%), B.longum/pseudocatenulatum (10%), B.longum (3%), В.breve (10%), B.bifidum (20%), B.adolescentis (14%), B.ruminantium (23%). У старшей группы идентифицировано только три вида: B.longum (72 %), B.animalis (14 %), В. catenulatum (14%), что коррелируют с состоянием ферментативной системы разных возрастных групп. Биоразнообразие видов в младшей группе компенсирует незрелость ферментативной системы в данный возрастной период. В старшей группе детей выделение 3-х видов, отличающихся высокой биохимической активностью, коррелирует с большей зрелостью ЖКТ и сменой видов в процессе сукцессии в силу их экологического преимущества.

3. Выявление оптимальной сахаролитической активности штаммов бифидобактерий возможно при использовании системы ANAERO-test-23 (PLIVA-Lachema Diagnostica s.r.o., Чешская Республика). Весь цикл селекции и изучения штаммов бифидобактерий необходимо проводить на стандартизованной среде для культивирования и выделения бифидобактерий (ГНЦ НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск), в наибольшей степени учитывающей метаболические потребности бактерий этого рода.

4. На основании изучения антибиотикорезистентности бифидобактерий для дифференциации штаммов впервые предложена панель из 15 противомикробных препаратов: пенициллины - оксациллин, ампициллин; цефалоспорины 1 поколения -цефазолин; цефалоспорины 3 поколения - цефтазидим; аминогликозиды 1 поколения - стрептомицин, неомицин, канамицин; аминогликозид 2 поколения - гентамицин; ами-ногликозид 3-го поколения - амикацин; тетрациклины - тетрациклин, доксициклин; макролиды - азитромицин и фторхинолоны - ципрофлок-сацин, пефлоксацин и ломефлоксацин. Антибиотикорезистентность является дополнительным признаком дифференциации штаммов.

5. Изучение видового разнообразия бифидофлоры детей раннего возраста позволило отобрать 7 штаммов (B.angulatum OV-15, B.pseudocatenulatum OV-17, B.pseudocatenulatum OV-2, B.longum OV-20, B.breve OV-12, B.bifidum OV-7, B.bifidum OV-19) с определенными фи-

зиолого-биохимическими свойствами, наиболее физиологичными для ЖКТ детей этого возраста, обладающих высокой антагонистической активностью, антибиотикорезистентностью, безопасностью и перспективных для конструирования пробиотических препаратов. На отобранные штаммы получены патенты РФ.

6. На основе референсных и вновь отобранных штаммов сконструированы консорциумы по принципу синбиоза. В консорциумах показано проявление синергидного эффекта в накоплении биомассы, повышении устойчивости к кислотам и активации биохимических показателей всех включенных в них штаммов.

7. Отработаны критерии дифференцирования различных штаммов в консорциуме и их количественного учета, основанные на морфологических различиях колоний бифидобактерий при совместном культивировании. Это решает вопрос производственного контроля состава консорциума.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные в настоящем исследовании подходы к определению биохимической активности и спектра антибиотикорезистентности бифидобактерий в комплексе с молекулярно-генетическим типиро-ванием на основе секвенирования фрагментов двух генов могут быть рекомендованы к использованию при идентификации вновь выделенных штаммов и ведении коллекционных и производственных культур бифидобактерий.

2. Для дифференциации штаммов бифидобактерий внутри вида предложена сокращенная панель из 15 антибиотиков, относящихся к 8 группам антимикробных препаратов.

3. Последовательности фрагментов генов 37 штаммов бифидобактерий, зарегистрированные в GenBank, существенно пополнили имеющуюся базу данных по исследуемым мишеням.

4. Запатентованные производственно-значимые штаммы OV2, OV7, OV12, OV15, OV17, OV19 и OV20 могут быть рекомендованы к использованию при разработке новых комплексных пробиотических препаратов для детей раннего возраста.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Феклисова JI.B. Микробиоценоз слизистых оболочек ротоглотки и кишечника у детей, посещающих детские сады / Е.Р. Мескина, A.M. Амерханова, О.Г. Жиленкова, Е.А. Воропаева, JI.B. Пожалостина, К.Д. Моисеева и др. // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» - М., - 2004. - С. 76.

2. Амерханова A.M. Опыт применения БАД к пище «Бифидумбактерин Мульти» в педиатрической практике / А.Е. Лаврова, Г.В. Дмитриева, И.А. Пырикова, Е.С. Зубкова, О.Г. Жиленкова, A.A. Кураленко // Вестник Российской АМН. - 2005. - № 12. - С.30-32.

3. Карзанова М.Е. Определение видовой принадлежности штаммов би-фидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы / О.Л. Воронина, В.Г. Лунин, О.Г. Жиленкова, A.M. Амерханова // Доклады Россельхозакадемии. - 2006. - №5. - С. 9-12

4. Амерханова А.М Принципы конструирования препаратов-синбиоти-ков и оценка их клинической эффективности/ В.А. Алешкии, Н.М. Грачева, М.С. Петрова, О.П. Попова, Е.С. Зубкова, О.Г. Жиленкова, A.A. Кураленко, А.И. Соловьева // Вестник Российской АМН. - 2006. - № 6. - С. 38-45.

5. Мескина Е.Р. Состояние микрофлоры кишечника у детей, посещающих детское дошкольное учреждение / A.M. Амерханова, Л.В. Пожалостина, О.Г. Жиленкова // Сборник научно-практических работ «Современные подходы к профилактике, диагностике и лечению детей в амбулаторных условиях». К 30-летию ФГУ «Поликлиника консультативно-диагностическая» - М., 2006. - С. 104-112.

6. Феклисова Л.В. Состояние микробиоценоза кишечника у детей, посещающих дошкольные учреждения, и возможность коррекции нарушений при использовании синбиотика Бифидум-Мульти-2 / A.M. Амерханова, Е.Р. Мескина, О.Г. Жиленкова, Л.В. Пожалостина // Сборник работ Всероссийской научно-практической конференции «Этапная реабилитация и профилактика инфекционных заболеваний у детей» - С-Петербург. - 2006. - С, 75.

7. Феклисова Л.В. Микробиоценоз слизистых оболочек ротоглотки и кишечника детей, посещающих детские сады / Е.Р. Мескина, A.M. Амерханова, О.Г. Жиленкова, Е.А. Воропаева, Л.В. Пожалостина, К.Д. Моисеева, Т.А. Да-нилкова, Л.А. Омельченко, В.Д. Галкина // Сборник работ Всероссийской научно-практической конференции «Этапная реабилитация и профилактика инфекционных заболеваний у детей» - С-Петербург - 2006. - С.76.

8. Феклисова Л.В. Новые препараты-синбиотики для коррекции микрофлоры у детей разных возрастных групп / Е.Р. Мескина, A.M. Амерханова, О.Г. Жиленкова // Журнал «Ремедиум Приволжья». - 2006. - № 6. - С. 53.

9. Мескина Е.Р. Состояние микрофлоры кишечника у детей, посещающих детское дошкольное учреждение / A.M. Амерханова, Л.В. Пожалостина,

О.Г. Жиленкова, К.Д. Моисеева II Сборник научно-практических работ под редакцией Л.В.Феклисовой - 2006. - С. 104-112.

10. Феклисова Л.В. Возможности применения синбиотиков для снижения заболеваемости часто болеющих детей, посещающих дошкольные учреждения / A.M. Амерханова, О.Г. Жиленкова, Е.Р. Мескина, Е.А. Воропаева, Л.В. Пожалостина, Е.С. Зубкова, A.A. Кураленко, К.Д. Моисеева // Вопросы практической педиатрии. - 2007. - № 2(6). - С. 53-59.

11. Амерханова A.M. Роль пробиотических микроорганизмов в современных технологиях профилактической и восстановительной медицины и возможности повышения эффективности препаратов на их основе / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, О.Г. Жиленкова, С.А. Лисунова, Е.С. Зубкова, A.A. Кураленко // Сборник «Новые лекарственные средства» - М., - 2007. - вып.4. - С. 4-7.

12. Феклисова Л.В. Состояние микрофлоры кишечника и ротоглотки у детей детских дошкольных учреждений, возможность коррекции синбиоти-ком Бифидум-Мульти-2 / A.M. Амерханова, Е.Р. Мескина, О.Г. Жиленкова, Е.С. Зубкова, A.A. Кураленко, Л.В. Пожалостина, Е.А. Воропаева, К.Д. Моисеева // Сборник «Новые лекарственные средства» - М.,- 2007, - вып.4. - С. 20-22.

13. Воронина О.Л. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы / М.Е. Субботина, В.Г. Лунин, О.Г. Жиленкова, A.M. Амерханова // Клиническое питание (Материалы Международного конгресса «Пробиотики, пребиотики, синбио-тики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» Санкт-Петербург, 14-16 мая 2007 года (в рамках 9-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Сакт-Петербург - Гастро 2007»)), -2007,-№ 1-2,-С. А31.

14. Жиленкова О.Г. Чувствительность к антибактериальным препаратам производственных штаммов бифидо- и лактобактерий / С.А. Лисунова, A.M. Амерханова, Е.С. Зубкова, A.A. Кураленко // Материалы Международного конгресса «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» Санкт-Петербург, 14-16 мая 2007 года (в рамках 9-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Сакт-Петербург - Гастро 2007»). -2007, - № 1-2, - С. 151.

15. Мескина Е.Р. Новые пути оптимальной коррекции микробиологических нарушений кишечника у детей / Л.В. Феклисова, A.M. Амерханова, О.Г. Жиленкова, Л.В. Пожалостина // Сборник материалов III ежегодной Московской конференции с участием регионов России и стран СНГ «Гнойно-септические заболевания у детей» - М., - 2007. - С. 107-108.

16. Давыдкин В.Ю., Спектр антибиотикочувствительности производственных штаммов бифидобактерий к антимикробным препаратам / И.Ю.Давыдкин, О.Г. Жиленкова, А.Л. Байракова, О.И. Рубальский, A.B. Мелихова // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - М., - 2007,2. - С. 297-298.

17. Воронина О.Л. Анализ видового разнообразия бнфидофлоры детей раннего возраста и влияние синбиотика «Бифидум-Мульти-1» на становление и развитие бифидобактерий детского кишечника / М.С. Кунда, М.Е. Субботина, О.Г. Жилеикова, A.M. Амерханова, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин // Вопросы детской диетологии. - 2008. - № 6(5). - С. 59-64.

18. Мескина Е.Р. Некоторые клинические аспекты состояния микробиологических биотопов ротоглотки и кишечника у организованных дошкольников / A.M. Амерханова, JI.B. Пожалостина, Е.А. Воропаева, О.Г. Жилеикова // Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ - М., - 2008. - С. 200-207.

19. Амерханова A.M. Воплощение идей Мечникова И.И. в разработках МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского / О.Г. Жилеикова, O.JI. Воронина, С.С. Афанасьев, ВА. Алешкин // Юбилейный Пятый Московский международный конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития. - 16-20 марта 2009.-С. 19-22.

20. Амерханова A.M., Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе консорциума. / Е.С. Зубкова, С.А. Лисунова, О.Г. Жилеикова,

A.A. Кураленко // Материалы 2-го Международного конгресса по пробиотикам 6-ой Объединенной научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И.Мечникова, ФГУП «Гос НИИИ ОЧБ» ФМБА России, ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и ФГУ ВГНКИ «Санкг-Петер-бург- Пробиотики-2009» Санкт-Петербург. - 2009. - № 4-, М2. - С. А 4. \

21. Давыдкин В.Ю. Некоторые аспекты культивирования бифидобактерий / О.Г. Жилеикова, И.Ю. Давыдкин // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологи им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзо-ра. - Нижний Новгород. - 2009. - С. 340.

22. Амерханова А.М. Роль бифидофлоры в жизнеобеспечении организма ребенка и факторы, определяющие ее формирование / О Л. Воронина, О.Г. Жилеикова, A.B. Алешкин, CA. Лисунова, Е.С. Зубкова, A.A. Романова, М.Е. Субботина, М.С. Кунда // Вопросы детской диетологии. - 2010. - № 8 (3).- С. 22-29.

23. Воронина О.Л. Анализ видового разнообразия бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов пяти генов «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» / М.С. Кунда, В.В. Бит-кина, М.Е. Субботина, О.Г. Жилеикова, A.M. Амерханова. - Минск,- 31.05-04.06.2010.-С. 32-35.

24. Тутельян В. А./ С.А.Шевелева, С.А. Хотимченко, В.А. Исаков, И.Я. Конь,

B.К. Мазо, Н.Р. Ефимочкина, Э.Н. Трушина, С.Ю. Батищева, A.B. Черкашин, В.А. Алешкин, Б.А. Шендеров, A.M. Амерханова, О.Г. Жилеикова, М.С. Бля-хер, И.М. Федорова, Е.А. Воропаева, Ю.Ю. Черепанова, Ю.Н.Урбан, А.Л. Гинзбург, H.A. Зигангирова, Б.С. Народицкий, Л.Н. Нестеренко, И.А. Шагинян, М.Ю. Чернуха, Ю.В. Ананьина, Н.К. Янковский, В.Н. Даниленко, С.Г. Ботина,

O.K. Аверина, B.B. Зинченко, Е.А. Карбышева, В.Д. Харитонов, В.Ф. Семени-хина, И.В. Рожкова, В.Г. Будрик, С.П. Синеокий, А.И. Туркин, Я.В. Иванова / Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. // Методические указания.- М., Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,- 2010.- 91 с. (утверждено лабораторным советом Роспотребнадзора 18.06.2010).

25. Voronina O.L. Intastinal bifidoflora of children - the indicator of chandge in ecological conditions / M.S. Kunda, M.E. Subbotina M.E O.G. Zhilenkova, A.M. Amerkhaniva // From experimental biology to preventive and integrative medicine. Proceedings of International Interdisciplinary Symposium 2008 Международный Междисциплинарный Симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной интегративной медицине». - Судак, Крым, Украина 19-30 сентября 2008 г. - С.32-34.

26. Voronina O.L. Polymorphism of bifidobacteria genes in Bifidobacterium ado-lescentis group / M.S. Kunda, M.E. V.V. Bitkina, O.G. Zhilenkova, A.M. Amerkhaniva // XXXII International Congress of the Society of Microbial Ecology and Disease. -St-Petersburg, Russia, -October 29-30, 2009. - P. A30.

27. Voronina O.L. The analysis of genetic similarity of Bifidobacterium rumi-nantium strains, isolated from early age infants and from cow's milk / M.S. Kunda, V.V. Bitkina, O.G. Zhilenkova, A.M. Amerkhaniva // XXXII International Congress of the Society of Microbial Ecology and Disease - St-Petersburg - Probiotics 2009, St-Petersburg, Russia, October 28-30,2009. - P. A 30-A 31.

28. Zhilenkova O.G. Study of antibiotic resistance in bifidobacteria strains deposited in the bank / M.E. Subbotina, S.A. Lisunova, O.L. Voronina, A.M. Amerkha-nova // XXXII International Congress of the Society of Microbial Ecology and Disease.- St-Petersburg, Russia,- October 29-30,2009. - P. A 32.

29. Zhilenkova O.G. Comparative characterization of biochemical test systems used for specific identification of bifidobacteria / S.A Lisunova, E.S., Zubkova, A.A. Kuralenko, A.M. Amerhanova // XXXII International Congress of the Society of Microbial Ecology and Disease.- St-Petersburg - Probiotics 2009, St-Petersburg, Russia, - October 28-30,2009. - P. A32.

30. Voronina O.L, Genotyping in decision of problem of Bifidobacterium species identification by biochemical approach / M.S. Kunda, M.E. V.V. Bitkina, O.G. Zhilenkova, A.M. Amerkhaniva // Конференция «Молекулярная Филогене-тика MolPhy-2» МГУ им. М.В. Ломоносова. - Москва, 18.05.2010-21.05.2010. -Р. 11-14.

31. Voronina O.L. The searching of Bifidobacterium infantis in present-day first year infants / M.S. Kunda, M.E. V.V. Bitkina, O.G. Zhilenkova, A.M. Amerkhaniva // International Scientific Conference on Probiotics and Prebiotics - IPC2010, - Kosice, Slovakia, - 15-17 June 2010,- P. 161-162.

Патенты:

1. Патент РФ № 2375443 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium bifidum OV-7 используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств /Алешкин В.А., Амерхаиова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С.; заявитель н патентообладатель: ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора,- заявка № 2008128541 от 15.07.2008.

2. Патент РФ № 2373277 от 20.11.2009 Штамм Bifidobacterium angulatum OV-15, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств /Алешкин В.А., Амерхаиова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С.; заявитель и патентообладатель: ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.- заявка № 2008128544 от 15.07.2008.

3. Патент РФ № 2373275 от 20.11.2009 Штамм Bifidobacterium pseudoca-tenulatum OV-17, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств / Алешкин В.А., Амерхаиова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С.; заявитель и патентообладатель: ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-заявка № 2008128543 от 15.07.2008.

4. Патент РФ № 2375444 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium bifidum ОУ-19, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств /Алешкин В.А., Амерхаиова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С.; заявитель и патентообладатель: ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. - заявка № 2008128540 от 15.07.2008.

5. Патент РФ № 2375445 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium longum ОУ-20, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств /Алешкин В.А., Амерхаиова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Жиленкова О.Г., Воронина О.Л., Субботина М.Е., Кунда М.С.; заявитель и патентообладатель: ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.- заявка № 2008128542 от 15.07.2008.

6. Патент РФ № 2373274 от 20.11.2009 Штамм Bifidobacterium breve OV-

12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств / Алешкин В.А., Амерханова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин A.B., Жиленкова О.Г., Воронина ОЛ., Субботина М.Е., Кунда М.С.; заявитель и патентообладатель: ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспогребнадзора.- заявка № 2008128539 от 15.07.2008.

7. Патент РФ № 2373278 от 20.11.2009 Штамм Bifidobacterium pseudoca-tenulatum OV-2, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств / Алешкин В.А., Амерханова A.M., Афанасьев С.С., Алешкин A.B., Жиленкова О.Г., Воронина O.JI., Субботина М.Е., Кунда М.С.; заявитель и патентообладатель: ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-заявка № 2008128545/13 от 15.07.2008.

Список сокращений

БАД - биологически активная добавка к пище

БС - среда для культивирования бифидобакгерий производства Государственного научного центра прикладной микробиологии г.Оболенск ГКНМ - Государственная коллекция нормальной микрофлоры ФГУ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора ГМ - среда - гидролизатно-молочная среда ЖКТ - желудочно-кишечный тракт КЖ - культуральная жидкость КОЕ - колониеобразующая единица

Лаг-фаза - период между посевом культуры бактерий и началом ее размножения

ОСМ - оптический стандарт мутности

ОЕ - оптическая единица

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СанПиН - Санитарные нормы и правила

°Т - градусы Тернера

УПБ - условно-патогенные бактерии

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ФОС - фруктоолигосахариды

АТСС (American Туре Culture Collection) - американская коллекция типовых культур

DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen and Zellkulturen) - немецкая коллекция микроорганизмов dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты ddNTP - дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты

JCM (Japan Culture Collection of Microorganism) - японская коллекция микроорганизмов

М - среднее арифметическое

m - стандартная ошибка отклонения от среднего арифметического

16S рРНК, 16S rDNA- 16S рибосомальная РНК

tal -трансальдолаза (transaldolase)

QS- «quorum sensing» - ощущение чувства кворума

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 шт. Заказ № 901 Типография «Литера-принт» Москва, ул. Прянишникова, д. 19а, стр. 4 Тел./факс: (495) 771-34-77

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жиленкова, Ольга Геннадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА БИФИДОБАКТЕРИЙ

1.1. Анатомо-морфологические свойства бифидобактерий 12 1-.2. Цикл развития бифидобактерий

1.3. Культуральные свойства бифидобактерий

1.4. Ферментативные свойства

1.5. Экологические ниши обитания бифидобактерий,

1.6. Антибиотикочувствительность бифидобактерий

ГЛАВА 2. СОСТОЯНИЕ БИФИДОФЛОРЫ ДЕТЕЙ И ЭТАПЫ ЕЁ ФОРМИРОВАНИЯ 30 2.1 .Характеристика микрофлоры желудочно-кишечного тракта

2.2. Физиологические функции бифидобактерий

2.3. Формирование бифидофлоры в организме ребенка

ГЛАВА 3. ОТБОР ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ 45 БИФИДОБАКТЕРИЙ 50 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. МАТЕРИАЛЫ 50 4.1.1.Объекты исследования

4.1.2. Штаммы микроорганизмов

4.1.3. Синбиотик

4.1.4. Животные

4.1.5. Питательные среды - - ------------------------------—

4.1.6. Антибиотики

4.1.7. Биохимические микротест-системы

4.1.8. Реактивы

4.1.9. Приборы и оборудование

4.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.2.1. Отбор и транспортировка материала

4.2.2. Выделение и культивирование бифидобактерий

4.2.3. Изучение культуральных свойств бифидобактерий

4.2.4. Определение содержания жизнеспособных бифидобактерий. 4.2.5: Сохранение чистых культур бифидобактерий!

4.2.6. Активизация лиофилизированных культур бифидобактерий

4.2.7. Изучение динамики^накопления бактериальной'массы бифидобактерий

4.2:8. Определение активной кислотности 4:2.9. Определение титруемой кислотности ^

4.2.10. Определение сквашивающей-активнослгштаммов

4.2.11. Приготовление бактериальной суспензии

4.2.12. Определение сахаролитической-активности

4.2.13. Определение каталазной активности

4.2.14. Определение продукции желатиназы

4.2.15. Генотипирование бифидобактерий'

4.2.16. Определение антибиотикорезистентности бифидобактерий методом двойных серийных разведений

4.2.17. Определение антибиотикорезистентности бифидобактерий диско-диффузионным методом

4.2.18. Определение антагонистической активности

4.2.19. Определение безвредности штаммов бифидобактерий для лабораторных животных

4.2.20. Определение устойчивости бифидобактерий к солям-желчи

4.2.21. Контроль культуры бифидобактерий на наличие посторонней микрофлоры

4.2.22. Контроль активности и стерильности питательных сред

4.2.23. Статистическая обработка полученных данных ——

Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 5.1 ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИФИДОБАКТЕРИЙ 5.1.1 Морфологические характеристики референсных штаммов бифидобактерий

5.1.2.Морфологические характеристики культур бифидобактерий, выделенных от детей

5.1.3. Ферментативная активность бифидобактерий

56 56 56*

62 62

5.2. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ БИФИДОБАКТЕРИИ

5.3. СРАВНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ГЕНОТИПИРОВАНШШ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПО ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ПРИЗНАКАМ

5.4.ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ,

БИФИДОБАКТЕРИЙ

5.4.1. Метод микроразведений в полужидкой питательной^среде

5.4.2. Диско-диффузионный метод определения антибиотикорезистентности бифидобактерий

5.5. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БИФИДОБАКТЕРИЙ

5.5.1. Показатели культивирования бифидобактерий, выделенных от детей

5.5.2. Сравнение показателейкультивированияпроизводственных и производственно перспективных штаммов бифидобактерий

5.6. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИШТАММОВБИФИДОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ

5.7. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ

5.8. ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВ ОСТИ. ШТАММОВ

БИФИДОБАКТЕРИЙ К СОЛЯМЖЕЛЧИ

5.9. ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПРИ СОВМЕСТНОМКУЛЬТИВИРОВАНИИ

5.9.1. Оценка длительности хранения штаммов бифидобактерий в бульонной культуре

5.9.2. Проявлениесинергидногоэффекта совместного культивирования на физиологическую активность штаммов - - --------- - - —1435.9:3. Исследование консорциумов производственных и производственно перспективных штаммов бифидобактерий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Селекция производственно-перспективных штаммов бифидобактерий, выделенных от детей"

Бифидобактерии являются важнейшими симбионтами желудочно-кишечного тракта человека. У детей к 3-х месячному возрасту их доля в микробиоме составляет более 99%, что свидетельствует о ведущей роли этой группы бактерий в становлении и развитии систем гомеостаза детского организма. Они обладают морфокинетическим действием, образуют ферменты, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, продуцируют биологически активные соединения, в частности, витамины группы В, выполняют иммуногенную и антимутагенную функции, а также участвуют в детоксикации экзо- и эндогенных токсических агентов [177, 45, 96, 131, 193, 188]. В современных условиях массированного антропогенного воздействия на биосферу страдает не только природа, но и сам человек, в частности, негативные изменения в онтогенезе происходят и на уровне его микроэкологии, нарушая ход её развития.

С 80-х годов прошлого века и по настоящее время исследователи отмечают дефицит бифидофлоры и снижение ее видового разнообразия у детей раннего возраста, признанных клинически здоровыми. Изменение видового состава бифидофлоры также стало характерным явлением последних двух десятилетий [147, 148, 45, 199, 201, 136, 137].

Период первичного становления микробиоценоза можно без преувеличения назвать базисом здоровья человека в будущем. Вместе с тем, целый ряд факторов может стать причиной возникновения дисбиотических нарушений, и их коррекция требует применения, таких пробиотических средств, которые учитывали бы особенности бифидофлоры^ современных, детей. Так, рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен принимать во внимание такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише [18, 109]. В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. В микрофлоре желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человеческого организма данная закономерность прослеживается, в смене видового» состава бифидофлоры в процессе онтогенеза.

Важно отметить при* этом, что вмешательство- неблагоприятных факторов, таких как отсутствие грудного вскармливания, эндогенные инфекции, неблагоприятная экология и прочее могут нарушить,естественный, ход развития^микробиоценоза ребенка [117, 62, 63, 133, 193].

В-связи* с изменениями в микроэкологии. ЖКТ ребенка первостепенное значение приобретает необходимость всестороннего изучения видового спектра и фенотипических особенностей бифидобактерий; которые являются* физиологичными для детей, и селекции штаммов, наиболее перспективных для,производства пробиотических перапаратов:

Изучение выделенных культур должно основываться, на комплексной-методологии,, включающей изучение* их антибиотикорезистентности, культуральных, антагонистических, морфологических, физиолого-биохимических свойств и молекулярно-генетической идентификации с последующей селекцией штаммов, наиболее перспективных для конструирования пробиотических препаратов для' детей': Это позволит проводить коррекцию микроэкологических нарушений более" эффективно и безопасно.

Цель исследования - селекция производственно перспективных штаммов бифидобактерий, как резерва для конструирования пробиотических препаратов для детей.

Задачи исследования

1. Разработать метод выделения бифидобактерий из содержимого ЖКТ. (фекалий) детейЫ8 месяцев и 3-5 лет.

2. Произвести выделение культур бифидобактерий, изучить их морфологические и культуральные свойства.

3. Провести сравнительное изучение рекомендованных нормативными документами коммерческих биохимических микротест-систем применительно к изучению - сахаролитических свойств бифидобактерий и возможности их видовой идентификации.

4. С помощью молекулярно-генетического типирования определить видовую принадлежность выделенных бифидобактерий и оценить видовое разнообразие бифидофлоры исследуемых групп детей.

5. Адаптировать методы определения антибиотикорезистентности, применяемые для- патогенных микроорганизмов, к бифидобактериям, и изучить отношение выделенных культур к антибактериальным веществам.

6. По совокупности фено- и генотипических признаков »провести отбор наиболее перспективных штаммов, как основы для пробиотических препаратов.

7. Сконструировать консорциумы.из референсных производственных и выделенных штаммов бифидобактерий, проанализировать их пробиотические и технологические свойства.

Научная новизна

Разработана новая технология* селекции бифидобактерий с целью совершенствования^ пробиотических препаратов для детей младшего возраста, которая основана на выделении бифидобактерий, всестороннем изучении их фенотипических свойств и видовой идентификации с помощью молекулярно-генетического анализа на основе секвенирования фрагментов* генов lóS rDNA и трансальдолазы {tal). Данная технология дает возможность проводить комплексный^ скрининговый анализ пула выделенных культур с целью селекции штаммов по заданным критериям, применима к практике работы с коллекционными штаммами и для использования в производстве пробиотических препаратов.

Получены новые данные о видовом разнообразии бифидофлоры здоровых детей, относящихся к двум возрастным группам: 1-18 месяцев и 3-5 - лет. Установлено более- широкое^ видовое разнообразие^.бифидобактерий детей раннего возраста, по сравнению с бифидофлорой детей старшей возрастной группы. Биоразнообразие видов в младшей группе компенсирует незрелость ферментативной системы в данный возрастной период. В старшей группе детей выделение 3-х видов, отличающихся, высокой биохимической активностью, коррелирует с большей зрелостью ЖКТ и сменой видов в процессе сукцессии в силу их экологического преимущества.

Отобрано семь штаммов бифидобактерий, перспективных для; конструирования пробиотических препаратов для детей младшего возраста. На них получены патенты РФ.

Практическаягзначимость.

Разработаны и апробированы на большом количестве штаммов» новые методы определения антибиотикорезистентности бифидобактерий: Для» практики изучения коллекционных культур отобраны, 36 антимикробных веществ, относящихся; к 17 группам антибиотиков. Впервые разработана панель из 15 антимикробных препаратов, значимых для штаммовой идентификации микроорганизмов'рода Bifidobacterium, которые относятся к 8 группам: пенициллинам; цефалоспоринам 1-го и 3-го поколения; аминогликозидам 1, 2 и 3-го поколения; тетрациклинам, фторхинолонам и макролидам.

Государственная* коллекция <микроорганизмов*нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН' МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора пополнена 287 культурами бифидобактерий, представляющими материал для углубленного изучения биологических свойств бифидобактерий, выделенных от современных детей. Из них 37 штаммов бифидобактерий паспортизированы и депонированы в коллекции. Для проведения скрининговых исследований биохимической активности культур бифидобактерий предложена коммерческая микротест-система ANAEROtest-23 (Pliva Lachema Diagnostica, Чешская Республика).

Последовательности фрагментов генов 37 штаммов бифидобактерий были аннотированы и зарегистрированы в GenBank. На основе результатов, полученных при морфологическом изучении выделенных культур, референсных и типовых штаммов« бифидобактерий, создана фототека колоний и микропрепаратов клеток, предназначенная для коллекционной работы.

Внедрение результатов*работы»в практику

Разработанные методические подходы для изучения фено- и генотипических свойств бифидобактерий вошли в МУК 2.3.2.2789-10 «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов». Новая технология селекции и изучения бифидобактерий используется в научной-и практической работе лабораторий и ГКНМ ФРУН МНИИЭМ им. F.H. Габричевского Роспотребнадзора и внедряется в» работу других научно-практических и производственных лабораторий РФ:

Основные положения; выносимые на защиту

1. Разработана новая технология выделения« и изучения фенотипических свойств бифидобактерий, их видовой идентификации, основанная на усовершенствованных и стандартизованных приемах проведения исследований, которая перспективна для» селекции новых штаммов и ведения- коллекционных и производственных культур бифидобактерий.

2. G использованием генотипирования на основе секвенирования фрагментов двух генов 16S rDNA и tal изучен видовой состав бифидобактерий, выделенных от современных клинически здоровых детей двух возрастных групп: 1-1 ^месяцев и 3-5 лет.

3. На основе анализа данных, полученных при фенотипическом и молекулярно-генетическом изучении выделенных штаммов бифидобактерий, отобраны наиболее перспективные штаммы для использования-при конструировании пробиотических препаратов для детей.

4. Устойчивые* консорциумы, сочетающие референсные и вновь выделенные штаммы бифидобактерий, проявляют синергидный эффект.

Апробация работы

Диссертация апробирована- -на заседании -секции- «Медицинская— биотехнология» Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 2 от 19.10.2010 г.

Результаты диссертационной работы были представлены на Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» (Санкт-Петербург, 2007 г.); Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2008 г.); 2-м Международном конгрессе «Санкт-Петербург-Пробиотики-2009 г.»; Международной научной конференции «Пробиотики и Пребиотики» (Кошице, Словакия, 2010 г.).

Связь темы исследования с планом научной работы учреждения

Диссертационная работа проведена в рамках НИР (рег. № 01.2.006.08847) и темы «Паспортизация пробиотических штаммов для ЗПВ, оценка их безопасности и функциональной эффективности» в рамках Государственного контракта № 02.522.12.2009 от 26.06.2008 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 37 научных работ, в том числе, 6 - в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации; 6 - в сборниках научных трудов; 17 - в материалах конференций; 7 патентов на изобретение РФ; 1 - методические рекомендации.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 154 страницах основного текста и состоит из введения, обзора литературы, 9 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 201 источник, в том числе, 141 отечественных и 60 иностранных авторов. Диссертация содержит 39 таблиц и 20 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Жиленкова, Ольга Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана новая комплексная технология выделения и изучения фенотипических свойств бифидобактерий и их молекулярно-генетической идентификации, что явилось основой для селекции штаммов, перспективных для- конструирования» пробиотических препаратов, а также для- ведения коллекционных и производственных культур.

2. Определен видовой состав бифидофлоры детей с использованием метода генотипирования на основе секвенирования фрагментов- двух генов: 16S rDNA и tal. Показано большее разнообразие видов в- младшей группе детей, у которых выделены бифидобактерии видов: B.angulatum (3%), B.pseudocatenulatum (17%), B.longum/pseudocatenulatum (10%), B.longum (3%), B.breve (10%), B.bifidum (20%), B.adolescentis (14%), B.ruminantium (23%). У старшей группы идентифицировано только- три вида: B.longum (72 %), B.animalis (14 %), В. catenulatum (14%), что коррелируют с состоянием ферментативной системы разных возрастны групп. Биоразнообразие видов в младшей группе компенсирует незрелость ферментативной системы в данный возрастной период. В старшей группе детей выделение 3-х видов, отличающихся высокой биохимической активностью, коррелирует с большей зрелостью ЖКТ и сменой видов в процессе сукцессии в силу их экологического преимущества.

3. Выявление оптимальной сахаролитической активности штаммов бифидобактерий возможно при использовании системы ANAEROtest-23 (PLIVA-Lachema Diagnostica s.r.o., Чешская Республика). Весь цикл селекции и изучения штаммов бифидобактерий необходимо проводить на стандартизованной среде для культивирования и выделения бифидобактерий (ГНЦ НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск), в наибольшей степени учитывающей метаболические потребности бактерий этого рода.

4. На основании изучения- антибиотикорезистентности бифидобактерий для дифференциации штаммов впервые предложена панель из 15* противомикробных препаратов: пенициллины — оксациллин, ампициллин; г{ефалоспорины 1 поколения —цефазолин; цефалоспорины 3 поколения — цефтазидим; аминогликозиды 1 поколения — стрептомицин, неомицин, канамицин; аминогликозид 2 поколения — гентамицин; аминогликозид 3-го поколения• - амикацин; тетрациклины — тетрациклин, доксициклин; макролиды - азитромицин и фторхинолоны — ципрофлоксацин, пефлоксацин и ломефлоксацин. Антибиотикорезистентность является- дополнительным признаком дифференциации штаммов. 1

5. Изучение видового разнообразия бифидофлоры детей раннего возраста позволило отобрать 7 штаммов- (B.angulatum> OV15, В. pseudocatenulatum OV17, B.pseudocatenulatum OV2, B.longum (3V20, B.breve OV12, B.bifidum OV7, B.bifidum OV19) с определенными5 физиолого-биохимическими свойствами, наиболее физиологичными для ЖКТ детей этого возраста, обладающих высокой антагонистической активностью, антибиотикорезистентностью, безопасностью и перспективных для конструирования пробиотических препаратов. На отобранные штаммы получены патенты РФ.

6. На основе референсных и вновь отобранных^ штаммов-сконструированы консорциумы по принципу синбиоза. В консорциумах показано проявление синергидного эффекта в накоплении биомассы, повышении^ устойчивости к кислотам и активации, биохимических показателей всех включенных в них штаммов.

7. Отработаны критерии дифференцирования различных штаммов* в консорциуме и их количественного учета, основанные на-морфологических различиях колоний бифидобактерий при-совместном культивировании. Это решает вопрос производственного контроля состава консорциума.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные в настоящем исследовании подходы к определению биохимической активности и спектра антибиотикорезистентности бифидобактерий в комплексе с молекулярно-генетическим типированием на основе секвенирования фрагментов двух генов могут быть рекомендованы к использованию при идентификации вновь выделенных штаммов и ведении коллекционных и производственных культур бифидобактерий.

2. Для дифференциации штаммов бифидобактерий внутри вида предложена сокращенная панель из 15 антибиотиков, относящихся к 8 группам антимикробных препаратов.

3. Последовательности фрагментов генов 37 штаммов бифидобактерий, зарегистрированные в GenBank, существенно пополнили имеющуюся базу данных по исследуемым мишеням.

4. Запатентованные производственно-значимые штаммы OV2, OV7, OY 12, OY 15, OY 17, OV19, OV20.

158

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жиленкова, Ольга Геннадьевна, Москва

1. Авдеев В.Г. Пробиотики и- пребиотики в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта // Клинич. фармакология и терапия:- 2006.- № 15(1).-С.36-40.

2. Авдеева JI.B., Полишук Е.И., Покас Е.В. Методические подходы к определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам // Лабор. диагностика-2005.-№ 3(33).-С. 35-40.

3. Агаджанян H.A., Труханов А.И., Шендеров Б;А. // Этюды об адаптации и путях сохранения здоровья.-М.- Сирин.-2002.-156 с.

4. Александрова Х.М. Изучение* эффективности антагонистических препаратов в комплексной терапии кишечных инфекций у детей // Автореф.дис. .канд. мед.наук.-Москва.-1972.- 15 с.

5. Александрович Н.Ж, Пирогова З.И. Нарушение микробного^ пейзажа человека и пути их коррекции // Клиническое питание.-2005.-№ 2.- С.43-46:

6. Амерханова A.M. Научно-произвосдтсвенная разработка новых перпаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности.// Автореф.дис. .д-ра биол.наук.- М.-2009.- 48 с.

7. Анкирская A.C. Влияние эубиотиков на. состав микробиоценоза влагалища у беременных, страдающих истрико-цервикальнойнедостаточностью // Медицинские аспекты микробной экологии: Сб.-научн. тр: МНИИЭМ им. Г.Н! Габричевского.-М.-1991.- С.204-209.

8. Анкирская А. Е. Бактериальный вагиноз.7/ Акуш. и гинек. -1995;-№ 6-С. 13-16.

9. Анохин В4.А., Тюрин Ю.А. Роль.основных представителей анаэробной«-кишечной микрофлоры в норме и патологии* // Казанский» медицинский журнал. -2001.- Т.82.- №2.- С.149-151.

10. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н: и др. Способ определения: микрофлоры влагалища и способ лечения заболеваний; сопровождающихся нарушениями* микрофлоры влагалища // Патент РФ.- № 227-447.- приоритет от 09.07.2004.

11. Бандоян А.К. и др.- Состав регуляторов, автолиза- бактерий //Микробиология.- 1984*.-Т.53.- №6.-С. 942-946.

12. Бархатова Т.В. Создание технологий синбиотических- продуктов на основе растительных олигосахаридов // Автореф. дис.д-ра~ технич.наук.-Ставрополь.-2003 .-48 с.

13. Белобородова Н:В. Селективная деконтаминация в профилактике и лечении хирургической инфекции у новорожденных //Автореф. ди.канд.мед.наук.-М.-1983.-24 с.

14. Белова^И.В. Конструирование.нового' многокомпонентного пробиотика и, использование его в комплексной терапии хеликобактерассоциированных заболеваний // Автореф.дис. .канд.мед.наук.-Н:Новгород.- 2005.-24 с.

15. Бельмер С. В. Антибиотикоассоциированный дисбактериоз кишечника // Рос. мед. журн. 2004.-Т. 12. № 3.- С. 148

16. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация; методы выявления. // Журн.микробиол.-2003:-№3.-С.109-113.160= '

17. Бондаренко В.М., Воробьев* А.А. Дисбиозы и препараты с • пробйотагаескоШфунюдаей///. Жда

18. Бондаренко В;М:, ЧупрининаР.П., АладышеваЖ.И.,Мацулевич ТВ. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клиническая гастроэнтерология;-2004.- T.3W С: 83-87.

19. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы // М'ЮОТАР: М- 2007.- 3 89 с.

20. Бондаренко/ В: М:, Грачева Н. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериозы кишечникау взрослых.г М:-2003:-224 с.

21. Бондаренко В. М:, Грачева Н: М. Препараты пробйотики, пребиотики и синбиотики в терапии- и профилактике кишечных дисбактериозов // Фарматека. -2003. 7. С. 56-63.

22. Бондаренко5 В.М; Роль, транслокации кишечной; бактериальной аутофлоры и ее токсических биомолекул в патологии человека //Эксперимен. клин.гастроэнтерология.-2007.-М5 .-(2.86-93.

23. Воеводин Д.А., Розанова Г.Н., Стенина М.А., Чередеев А.Н. Роль дисбактериоза в фомировании хронической инфекционной патологии у детей // Журнал Микробиол.-200Г.-№6.-С.88-93.

24. Воробьев A.A., 'Абрамов H.A., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы актуальная проблема, медицины // Вестник Российской АМН.-1997.-№3 .-С.4-7.

25. Воробьев A.A., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А. и др. Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция*бифидосодержащими пробиотиками // Вестник Российской. АМН.- 2004.2:-С.13-17.

26. Воробьев A.A., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А. и др. Анализ штаммовой общности пристеночных биотопов желудочно-кишечного тракта // Вестник Российской АМН.- 2004:- № 6.- С. 15-18.

27. Воробьев A.A., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М:Л. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс // Журн. микробиол.-2005.- №6.- С.3-7.

28. Ганина В.И. Научные и практические основы биотехнологии ' кисломолочных продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами //г Автореф.дис. . .д-ра технич.наук.-М.- 2001.- 48 с.

29. Ганина В:И., Большакова Е. В. Действие пробиотических продуктов на возбудителей кишечных инфекций // Мол. пром. 2001. - №11. - С. 47-48.

30. Ганина В .И.Современный взгляд на пробиотические продукты // Всё о молоке: 2001. - №3. - С. 56-64.

31. Гриневич В.Г.и др. Пребиотики в лечении; заболеваний внутренних органов // Российский медицинский журнал.- 2003.-№ 5.- С.53-56.

32. Гончарова Г.И. . Изучение бифидобактерий, разработка препарата-«сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни // Автореф: дисс. канд.биол.наук.- М. -1970.- 15 с.

33. Гончарова Г.И* Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме*и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин // Автореф.дис. .д-ра биол.наук.- М:- 1982.-48 с.

34. Гончарова Г.И., Лянная А.М., Козлова Э.П., Семенова Л.П. Роль бифидофлоры в повышении устойчивости организма к инфекции // В сб. материалов международной конференции «Гнотобиология в теоретич. и практической медицине».- М.- 1986,- С.62.

35. Гончарова Г.И., Селянова Л.П. и др. Количественный уровень бифидофлоры в кишечнике н его коррелятивная связь,с состоянием здоровья человека // Антибиотики и микроэкология человека и животных. М,- 1988.-С. 118-124.

36. ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов. М., Комитет стандартизации и метрологии СССР- 1992. -С.8-11.

37. ГОСТ 4233-77 Изотонический (физиологический) 0,85% раствор хлористого натрия, стерильный.

38. ГОСТ 4328-77 (с изм 1,2) Раствор гидроокиси натрия для нейтрализации.

39. Государственная Фармакопея ССС. Изд. XI, вып. 1,2. М.- 1998.- С. 182-183.

40. Грачева Н.М. Дисбактериозы и суперинфекции, причины их возникновения, диагностика, лечение// Лечащий врач.- 1991.- № 1.- С. 18-21.

41. Гриневич В. Б., Захаренко> С. М., Осипов Г.А. Принципы коррекции дисбиозов кишечника. // Лечащий Врач. 2008. -№ 6. - С. 6-9.

42. Дещекина М.Ф., Коршунов В.М., Демин В.Ф. и др. Изучение формирования микрофлоры кишечника у новорожденных детей при совместном-и. раздельном пребывании с матерью // Педиатрия:-1990.'-№1.-G.13-17.

43. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание.// М.- Грант,-2002. 296 с.

44. Ермоленко^ Е.И., Суворов' А.Н., Воейкова A.B. Определение антагонистической, активности« лактобактерий // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: Сб. материалов конф. М.-2004.- С.25-26.

45. Ефимов-Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и, количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища//Журн. Микробиол.- 2002.- №4.- С.72-78.

46. Ефимов- Б.А. Микроэкология кишечника человека, коррекция микрофлоры при дисбиотических состояниях // Автореф.дис. .д-ра медиц.наук. -М.- 2005.- 48 с.

47. Иванов В.П., Бойцов A.F., Коваленко А.Д., Ластовка О.Н., Нилова Е.А. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника // Информационное письмо кафедры микробиологии СПБГМА им. И.И.Мечникова, Санкт-Петербург.- 2002.- 56с.

48. Ильина Т.С., Романова А.Л., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования, бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика.-2004.-№40(11).- С.1-12.

49. Калмыкова А.И., Селятинская В.Г., Пальчикова H.A., Богатова Н.П. Клеточные и системные механизмы действия пробиотиков. // Новосибирск.-2007.-279 с.

50. Кафарская Л.И, Володин Н.Н, Афанасьев C.G., Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А. Особенности микробной| колонизации кишечника новорожденных и недоношенных детей в отделении- реанимации и интенсивной терапии // Вестник Российской АМН.- 2006.- №1- С. 10-15.

51. Кафарская Л.И., Постникова Е.А., Донских Е.Д:, Ефимов Б.А. Особенности становления микрофлорьъу детей раннего * возраста // Детские инфекции.- 2006.- Т.5.- №1'.- С. 6-11.

52. Козлова Э.П. Микрофлора кишечника новорожденных в норме и патологии и восстановление ее бифидумбактерином // Автореф. дис. . .канд. мед.наук.-М.- 1978.-25 с.

53. Конь И.Я. Пробиотики w кисломолочные продукты в питании детей раннего возраста// Лечащий врач.-2007.- №1.- С.32-36:

54. Коршунов В.М., Володин Б.А., Ефимов Б.А. Дисбактериозы кишечника. // Детская больница. М. -2000.- №1.- С. 66-74.

55. Коршунов В.М., Ефимов Б.А., Пикина А.П. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального' питания, и коррекции микрофлоры кишечника.// Журн. микробиол.- М,-2000:-№3.-С. 86-91.

56. Костюкевич О. И. Современные представления о микробиоценозе кишечника: Дисбактериоз и его коррекция»// Рос. мед. журн. 2007.- С. 2176.

57. Красильников А.П. Основы клинической микробиологии // Мед. и микробиология, вирусология и иммунология.- М.~ 1994.- С.483-496.'

58. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей // М.¡Медицина,-1991.-С. 240.

59. Лизько H.H., Шилов В'.М. Современная концепция состава кишечной микрофлоры у здоровых взрослых людей // Журнал Микробиол.- 1979.-№2.-С. 36-41.

60. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Парфенов: А.И. и др: Синдром избыточного бактериального роста в тонкой- кишке: патогенез, клиническое значение и тактика терапии // Эксперим. Клин.гастроэнтерол.-М. 2005.-№ 6.- С.51-57.

61. Лянная А.М;, Гончарова Г.И., Высоцкий В.В. Морфология бифидобактерий на. светооптическом- и электронно-микроскопическом уровне и их биологические свойства // Журн. микробиол. 1979. - №6. - С.54-58.

62. Лянная. A.M. Видовой состав коллекции бифидобактерий и их биологические свойства// Автореф. дис. .канд. биол.наук.-М.- 1981.- 24 с.

63. Маев И. В. и др. Антибиотикоассоциированная диарея, // Гастроэнтерол. -2007. № 1. С. 45-49. (Прил. к журн. Cons. Med.)

64. Мазанкова Л.Н., Лыкова Е.А. Пробиотики: Характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике // Детские инфекции.-2004.-№1.-С.18-23.

65. Малкоч В:, Бельмер С.В., Ардатская М.Д., Минушкин О.Н. Значение пребиотиков для функционирования кишечной микрофлоры // Вопросы детской»диетологии.-2006.-Т 4. -№1,- С.9-12.

66. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.- М.-Мир.-1984.- С. 333-334.82., Мечников И.И. Этюды оптимиста (1907). М.:Наука.- 1988.- 97с.

67. Мечников И.И. Молочные микробы и, их значение для здоровья , // Вестник знания.-1911.-№3:г С; 231-240.

68. МУК 4.2.577- 96.Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов:.Методические указания?- М:: Минздрав России, 1988. С. 32-34.

69. МУК 4.2.999-00. Определение количества бифидобактерий В; кисломолочных продуктах: Методические указания- — М.:Федеральный центр? Госсанэпиднадзора Минздрава-России, 2000. — С. 12-13.

70. МУК 4.2.1890-04 .«Определение чувствительности микроорганизмов^ к антибактериальным препаратам» // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2004. -т.6.- № 4- С. 306-359:

71. Нетребко O.K. Пробиотики и пребиотики в питании детей грудного возраста // Педиатрия.-2007.-Т.86.-№1.- С. 80-87.

72. Новик Г.И., Высоцкиш В.В., Богдановская Ж.Н. Ультраструктура клеток некоторых видов рода Bifidobacterium // Микробиология.-1994.-Т.63.-В.З.- С. 515-521.

73. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Архитектоника популяций бифидобактерий: субмикроскопический' аспект когезии клеток Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum // Микробиология,-1996.-Т.65.- №1,- С.60-66.

74. Новик Г.И., Высоцкий В В. Репродукция и дифференциация клеток в цикле развития популяций Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum// Микробиология.-1996.- Т.65.- №3.- С. 357-364.

75. Новик Г.И. Исследование структурно-функциональной организации» бифидобактерий //Микробиология.- 1998.- Т.67.- № 3.- С.376-383.

76. Новик Г.И., Самарцев А.А., Астапович Н.И. и др. Биологическая активность микроорганизмов-пробиотиков // Прикладная биохимия и микробиология.-2006.- Т.42.-№2.- С. 187-194.

77. Осипова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков // Дисс. . .докт. биол.наук.-М.- 2006.- 285 с.

78. Осипов Г.А., Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных процессах. // Вест. Российс. АМН.- Т.13.-№2.-С.52-59.

79. Отраслевой стандарт 91.500.11.0004-2003 // «Протокол ведения больных. Дисбактериозом кишечника» 2003.- 70 с.

80. Парфенов А. И., Ручкина С. В., Осипов Г. А. Нормальная микрофлора кишечника и дисбактериоз // Cons, provis. -2004. № 2. - С. 22—49.

81. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры-для организма человека IIМ.- Медгиз.-1955.- 435 с.

82. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериоз кишечника //М.-1984.-144 с.

83. Преображенская Ю.В., Михалюк А.Щ Миклаш У. А., Каврус. Mi А. Методы, определения количества КОЕ в лечебно- профилактических препаратах бифидобактерий на< основе мясного бульона. // Вестник ГрДУ -Серия 2 № 1 - 2004: - С. 110- 113.

84. Поспелова В. В., Грачева Н.М. и др. Эубиотики эффективные средства' нормализации микрофлоры,— и вклад МНИИЭМ в их разработку // Врач.-1997.-№4.- С.30-31.

85. Рациональная антимикробная фармакотерапия: Руководство ' для практикующих врачей / Под общ. ред. В. П. Яковлева, С. В. Яковлева.- М. -2003.- 1008 с

86. Рыбальченко О.В. , Бондаренко В.П., Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека // СПб. ИИЦ BMA.- 2008. 103 с.

87. Руководство по лечебному питанию детей // Под редакцией Лододо К.С.- М.:Медицина. 2000.-384 с.

88. Селиванов Е.В., Звягинцев E.H. Методическое пособие Правила взятия материала для лабораторных исследований» М.- 2005.- 50 с.

89. Семенова Л.П., Гончарова Г.И., Козлова Э.П. Применение сухого бифидумбактерина в комплексном лечение недоношенных и доношенных новорожденных детей // Методические рекомендации.- М.-1976.-12 с.

90. Соколова Соловьева И.В. // Дисбактериозы: теория и практика:-Н;Новгород.- 1999.- 198 с,

91. Суворов А.Н. Дисбактериоз* с позиций современной медицинской микробиологии // Актуальные проблемы дисбактериозов // Тез.докл.к конф.-Барнаул.-1997.- С. 3-81

92. Тец В:В:Микроорганизмы и антибиотики. Инфекции кожи, мягких тканей, костей и суставов: — СПб. 2006. — 128 с.120: ТУ10-02-02-789-192-95. Среды питательные сухие для выращивания бифидобактерий и пропионовокислых бактерий.

93. Украинцев С.Е., Нетребко O.K. Пищевые волокна и прсбиотики // Вопросы детской диетотерапии.-2006.- Т.4.г№5:- С.26-30;

94. Хавкин А.И. Мйкробйоценоз кишечника и иммунитет,// РМЖ.-2003.-№11(3).- С. 122-125.

95. Шабалов Н.П., Корниенко: Е.П. Микробиоценоз кишечника новорожденных в,нормеги патологии?// Метод, рекомендации. — СПб.- 1994. -С. 9. •

96. Шевелева С.А. Анализ, микробиологического риска как основа^ для совершенствования; системы оценки; безопасности; и контроля: пищевых продуктов // Автореф. дис. . .д-rpa мед.наук.- М.- 2007.- 46 с.

97. Шендеров Б .А. //, Медицинская. микробная экология и функциональное питании: В^З-х т.„-М1:«Грантъ» 1998 - 2001.-Т. 1-3;

98. Шендеров. Б.А. Базовые механизмы регуляции гомеостаза и их модуляцияшутриентамш//Клиническое питание;- 2004.- №3.- С. 14-19г133; Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль. в. профилактике метаболического синдрома//М.:ДеЛи принт,-2008; 317 с.

99. Шендеров Б.А, Молекулярный язык пробиотических микроорганизмов? //Пищевые ингредиенты,-2009;-№1,-С48-49.

100. Шкоропов А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С. и др Молекулярно -генетический анализ видового и штаммового разнообразия; бифидобактерий у детей раннего возраста// Вестн. РАМН. 2005. - №1. - С. 45-51.

101. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская- Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования// Вопросы практической педиатрии.*- 2007-2 (5):С. 76-79.

102. Шунько Е.Е., Янковский Д:С., Дымент F.C., Краснова Ю.Ю. Проблемные вопросы микроэкологии и антибактериальной- терапии новорожденных с перинатальной патологией // Пробиотики в современной* медицине. Здоровье женщины,- 2004.-№ 4 -176 с

103. Юнкерова В: И., Григорьева С. Г. Метематико-статистическая» обработка данных медицинских исследований. СПб.- 2002.- 266 с.

104. Яцык Г.В., Скворцова В.А., Боровик Т.Э., Лододо К.С. Функциональное состояние ЖКТ у новорожденных // Педиатрия.- 2001.-№3.-С.89-92.

105. Adrews J.M. В SAC standardized* disc susceptibility testing method // J. Antimicrob. Chemother.,- 2001 .48 (SI).- P.5-16.

106. Backhed F., Ding H., Wang T. ey al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage // Proc. Nat. Acad. Scienses. -2004.-Vol. 101 .-No 11.- P.15718-15723.

107. Bailey M. The mucosal immune system: Recent developments and future directions in the pig // Dev Comp Immunol. 2009.-Vol.33 (3).-P.375-83.

108. Begley, M., Hill, C., Gahan, C. G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics // Appl. Environ. Microbioh-2006.- Vol.72.-P.1729-1738.

109. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology /9th edition'. Baltimore; London - 1984- №1:- 964 p.

110. Bengmark S. Immunonutrition: role of biosurfactants, fiber and probiotic bacteria. //Nitrition.-1998. -14 (7-8).- P.585-594.

111. Benno Y., Sawada K., Mitsuoka T. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants // Microbiol. Immunol.- 1984.- 28.- P. 975-986.

112. Benno J., Mitsuoka T. Bifidobacteria and microflora, // Development of intestinal?microflora inhuman^andfanimals. 1986:- Vol:5.- N-1.- P;13-25;., 149; Berg The indigenous-gastrointestinal; microflora // Trends Microbiol*: -1996.-№4.-P.430-435.

113. Camp H.J.M., Orden, Oosterhof A., Veerkamp J. // Biochem.J.- 1985. -Vol. 228. № 3. - P. 683 - 688.15 5 ; Cawan S ; and Steel: K. Manual for the Identification of Medical Bacteria.// Gambrige:University Press -1966;-P: 19; 27-28 -116* and 1-56.

114. Collins M.D., Gibson G.R: Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches fon modulating the microbial ; ecology of the gut:// Am; J; Glim-Nutr.-1999: -69 (5) -P.1052-1057.

115. D'Aimmo M. R:, Modesto M., Biavati B. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium spp. Isolated from dairy and pharmaceutical products // Int. J. Food Microbiol:- 2006.- №12. P. 232-238.

116. Dauer A.W., Kirby W.M.M:, Sherris J.C., Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized, singl disk method // Amer J4 Clin Pathol.- 1966. 45. -Pf493-496.

117. Deutshes Institut1 fur Normung Medical Microbiology // Susceptibility Testing of Pathogens to Antimicrobial Agents. Berlin DIN - 1999*.- S. 404-589:

118. Eggerth A.M. The gram-positive nonsporebearing anaerobic bacilli of human feces // J. Bacteriol. 1975. Vol. 30. - P. 277 - 299.

119. Edlund C., Nord C. E. Effect on the human normal microflora of oral antibiotics for treatment of urinary tract infection // J. Anthimicrob. Chemother. -2000.- Vol: 46. Suppl. 1.- P: 41-44

120. Eckburg P.B. et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. // Science .- 2005.-Vol.308.- P.1635-1638:

121. Fotiadis CI, Stoidis GN, Spyropoulos BG, ZografosED; Role of probiotics, prebiotics and synbiotics in chemoprevention for colorectal cancer //World J Gastroenterol.- 2008.- №14.-Vol. 14(42).- P. 6453- 6457.

122. Gellenberg H. The development of straight rool type of Lactobac. bifidus // J. Gen. Microbiol. 1955. - Vol. 13. - P. 394 - 397.

123. Gellenberg H Specific contaminants-in cultures of bifid bacteria // Acta. Pathol. Microbiol-Scand. 1958. - Vol. 44. -P. 293-298.

124. Gibson G.R., Probert H.M., Van Loo J.A. E., Roberfroid M.B. Dietary odulation of the human colonic microbiota: Updating the concept of prebiotics // Nutr.Res Rev.-2004-№17-P. 257-259

125. Hayword A.G., HaleC.M.F., Bisset K.N. The morphology and relationship of Lactobac. bifidus // J. Gen. Microbiol. 1955. - Vol. 13. - P. 292 - 294.

126. Heinel H, Bendig J Microecology and Therapy- 1980 Vol. 10.- P.41 -87

127. Matsuki, T. Distribution of Bifidobacterial species in« human intenstinal microflora examined with 16SrRNA-genetargeted species-specific primers / T. Matsuki, K.Watanabe, R. Tanaka et al. // Appl.Environ.Microbiol.- 1999.-№65(10).-P. 4506-4512.

128. Mevissen-Verhage E.A.E., Marcelis J. H., De Vos M. N. et al. Bifidobacterium, Bacteroides and Clostridium spp. in fecal samples from breast fed and bottle-fed infants with and without iron supplement. J. Clin. Microbiol. 1987.-Vol.25. -P.285-289.

129. Mitsuoka T., Hayakawa K., Kimura N. The fecal' flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups// Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. A 1974.-Vol.226.- P.469-478.

130. Mitsuoka T. Intestinal Flora and Host // Asian.Med.J.-1989-Vol.31.-№7.-P.400-409.

131. NCCLS. Metods for dilution Susceptibility Test for Bacteria That Grow Aerobically, Approved standard- 6 th Edition. NCCLS document M-7-A6. NCCLS Wayne, PA. - USA - 2003.

132. NCCLS. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test, Approved,standard 8th Edition. NCCLS document M2-A8.NCCLS Wayne, PA -USA-2003.

133. Novik G.I.,Astapovich N.I., Bagdanovskaya Zh.N.,Ryabaya N.E. // Appl. Biochem. Vicrobiol. 2000. - №*1.-P. 90-93.

134. Rambaud. J.-C. Gut microflora1. Digesstive physiology and pathology//Paris: John Libbey Eurotext.-2006. -250 p.

135. Regurna T., Burton J., Matsuki T. et al. Identification,and enumeration of human Bifidobacterium species by PCR targeting the transaldolase gene // App. Environ. Microbiol.- 2002,- .№5.- P. 2420-2427.

136. Reuter G. Vergleichende Untersuchungen über die Bifidus-Flora im Sfuglings- und Erwachsenensthul. Zentralbl. l-14//Bakt.Mikrob. Hyg. 1 Abt. Orig.-1963.- №191.- P.486-507.

137. Reuter G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition, and succession//Current Issues in Intestinal Microbiol.-2001.- Vol.2(2).-P.43-53.

138. Roberfroid M. Prebiotics: The Concept Revisited// J. Nutr. 2007- 137 (3).-P.830 -837.

139. Sanders M.E., Gibson G.,Gill H.S. et al. Probiotics: Their Potential to Impact Human Health //CAST Issue Paper.- October 2010.-№ 36 20p.

140. Sanders M.E., How Do We Know When Something Called «Probiotic» Is Really a probiotic. // A Gudeline for Consumers and Health Care professionals. Functional Food Reviews -2009 -1 (1) (Spring): P.3-12.

141. Satokari R.M., Vaughan E.E., et al. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis // App. Environ. Microbiol.- 2001.-2.- P. 504-513.

142. Simmering R., Blaut M. Pro- and prebiotics— the tasty guardian angles // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001- № 55- P. 19-28 .

143. Scardovi, V., Trovatelli, L. D., Crociani, F. andSgorbati, B., Bifidobacteria in bovine rumen. New species of the genus Bifidobacterium: B. globosum n. sp. and B. ruminale n. sp. // Arch. Microbiol., 1969 - №68 - P.278-294.

144. Scardovi, V., The Genus,Bifidobacterium. In The Prokaryotes: A Handbook on*Habitats,.Isolation;änd>Iäenti^^^ .Mi- P;, Stolp; Hi and*

145. Truper, H: G;); Springer Verlag, Berlin; - 1981 - Volt 2 - 1951p:. 1-93'i Smehilova M:, -Vilkovä;E.,.Nevoral Gomparisomofiintestinalvmicroflora in healthy infants^ and! infants with? allergic: colitis. Folia* Microbiöll -Praha: r2008-53(3).-P.255-258.

146. Stackebrand, E., and Goebel, B. M;Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacterioli- 1994.-№ 44.- P.846-849.

147. Werner H., Seeliger H.P.R., Die: Diagnostic der Bifidusbacterien und ihre? Abgrenzung gegen morphologisch ahnliche Keim // Das Arztliche Laboratorium.-1963 S.357-368