Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция местных штаммов бифидобактерий для приготовления бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Селекция местных штаммов бифидобактерий для приготовления бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579.842.1/2:679,26

ПАНОВА ЛАРИСА НИКОЛАЕВНА

СЕЛЕКЦИЯ МЕСТНЫХ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ И КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук •

РГо ОД

I 2 КДГ,

ТАШКЕНТ - 1998

Работа выполнена б Институте микробиологии Академии наук Республики Узбекистан

Руководители:

доктор биологических наук

академик Халмурадов А.Г.

кандидат биологических наук

Огай Д.К.

Официальные оппоненты:доктор биологических наук, Мурадов М.М.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и инфекционных заболеваний МЗ РУз

Защита состоится апреля 1998 г. в час на заседании.

Специализированного совета Л 015.02.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте микробиологии АН РУз по адресу: Ташкент 700128, ул. А.Кадыри 7"б"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН РУз

С

Автореферат разослан марта 1998 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

доктор биологических наук Ходжибаева С.М.

доктор медицинских наук, Нарбаева'И.Э.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время роли нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека в регуляции различных систем хозяина (иммунной, сердечно-сосудистой, кроветворной, эндокринной, нервной) уделяют особое внимание.

Именно бифидофлоре принадлежит ведущая роль в поддержании и нормализации микробиоценоза кишечника, поддержании неспецифической резистентности организма, улучшении белкового и минерального обмена и др. Дефицит бифидобактерий вызывает развитие дисбиозов, он ведет к нарушению минерального обмена, процессов кишечного всасывания, белкового и жирового обмена, к формированию хронических расстройств (Гончарова Г.И. 198бг, Козлова Э.П., Курносова H.A., Феклисова Л.В. 198бг, Лянная A.M., Левченко Т.А., Сильч нко H.A. 1994, Soavedra J.M., Bauman N. А., Oung I. et. all, 1994).. Имеются сведения о том, что бифидобактерии являются "поставщиком" ряда незаменимых аминокислот, ■ в том числе триптофана, витаминов, установлена их антиканцирогенная и антимутагенная активность, способность снижать уровень холестерина в крови, ответственной за утилизацию лактозы и др. (Hyghes D.В.,Hoover D.G. 1991, Hull R.R., Conwoy P.L. 1992, Teruakl A,, Che Olng-Ming et ell. 1994, Bartram et all., 1094, Naokl N.. Kohjl 0 et allr 1996). Бифидо-бактерии способны оказывать выраженный ингибиторный эффект на микроорганизмы, метаболиты которых воздействуют 'отрицательно на функцию всего желудочно-кишечного тракта (Mitsuhashi S, Murata N.J. 1991).Ингибирование происходит не только за счет молочной, уксусной кислот, но и за счет синтеза особых антибактериальных веществ-бактериоцинов(МедЬгоиз J..Euloge P.et.all,1990, Gibson, Wang,1994, Чешева B.B., Манвелова М.А. 1994).Все эти положительные эффекты в свое время позволили рассматривать бифидобактерии как основу для создания препаратов, обладающих многофакторным стимулирующим" воздействием на общую резистентность и обмен веществ. Многолетние клинические наблюдения по лечебному и профилактическому применению бактерийных препаратов,в состав которых включены бифидобактерии, лактобактерии, колибактерии, показали, что отсутсвуют побочные эффекты при их длительном применении (Гончарова Г.Н. и др.1979, 1983., Семенова Л.П. и др.1983, ТУ-49d9784,1984., Хамагаева Н.С., Хамнаева Н.И. и др.,1986, тендеров Б.А., Манвелова М. А.,1994). Многофакторное стимулирующее

воздействие бифидосодержащих молочных продуктов способствовало развитию нового научного направления- функциональное питание. К продуктам функционального питания относятся молочные и немолочные продукты, содержащие специально подобранные штаммы бифидобактерий и молочнокислых с установленным лечебным и профилактическим действием (Лянная А.М., Левченко Т.А., Сильченко М.А.1994).

Для поддержания жизнеспособности и стабильности культур би-фидобактерий к ним добавляют другие микроорганизмы, наиболее часто ацидофильные лактобактерии и термофильные стрептококки (Така-по, Salto, Futaml, Haykawa, 1989, Morlnaga, 1990), а так же имеются сведения, что при совместном выращивании бифидобактерий B.blfldum и пропионобактерий Propionibacterium freudenreich!1 активизируется рост и развитие бифидобактерий (Kaneko Т. Morl Н, Iwata М., Meguro S. 1994).

Штаммы, предназначенные для использования необходимо отбирать по целому ряду признаков: способность ингибировать рост патогенных и условно-патогенных кишечных бактерий, способность наращивать микробную массу в короткие сроки культивирования, способность и длительность колонизации желудочно-кишечного тракта, устойчивость к низкой pH и к повышенной концентрации желчи, фенолу, способность кислотообразования и сквашивать молоко, устойчивость к антибиотикам (Семенова Л.П., Гончарова Г.И., Лянная А.М., 1989, Пахомова М.В., Гончарова Г.И.', Лянная А.М., 1991). Такими высокими требованиями можно объяснить факт, что только немногие из выделенных культур бифидобактерий могут быть производственными. В настоящее время только 4 штамма бифидобактерий используются в производстве лечебных препаратов и лечебно-диетических продуктов. Все эти штаммы выделены и изучены в Московском научно-исследовательском институте им.Габричевского Г.Н.. Столь же ограничено количество штаммов и еа рубежом. Однако бактерийные препараты, выпускаемые в нашей республике, на основе российских штаммов бифидобактерий не всегда достаточно эффективны. Тем не мёнее, в Узбекистане до настоящего времени отсутствовали исследования, касающиеся экологии бифидобактерий я "сишечнике местного населения, их изоляция из состава микрофлоры кишечника, получение чистых культур, изучение особенностей биологии о учетом экологического действия окрулгащей среды и особенностей типа питания местного населения. Эти исследования крайне важны для нашего региона из-за ши-

рокого распространения дисбактериоза кишечника у детей и взрослых. Так, при обследовании детей первого года жизни 63,4Х страдают дисбактериозом (Денисова 0.У., Азизова В.К., 1994, Нурузова З.А. 1995, Нурматов В.А. и др. 1994). Факторами, вызывающими дефицит бифидобактерий,являются высокая солнечная инсоляция, насыщенность пищевых продуктов пестицидами, минеральными удобрениями, высокое содержание солей тяжелых металлов в воде, бессистемное использование антибактериальных препаратов и многое другое. Поэтому, разработка новых бактерийных препаратов и кисломолочных продуктов на основе местных,высокоэффективных штаммов бифидобактерий представляется весьма актуальной.

Дель работы. Выделение и изучение морфолого-культуральных, физиолого-биохимических, антибактериальных свойств, подбор условий культивирования, лиофилизации и использование наиболее высокоэффективных местных штаммов бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и кисломолочных продуктов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучение бифидофлоры кишечника детей первого года жизни, находящихся на грудном и искусственном вскармливании на ограниченном контингенте детей;

- выделение местных штаммов бифидобактерий из фекалий здоровых детей, изучение -кислотообразующих и молокосвертывающих свойств;

- изучение морфологических, культуральных, физиолого-биохими-ческих свойств с целью определения таксономического положения культур. Отбор культур бифидобактерий,■ представляющих практический интерес;

- исследование антимикробных свойств бифидобактерий к нежелательной микрофлоре кишечника, устойчивости к ингибирующему действию повышенной концентрации желчи, соли, фено-г, антибактериальным., препаратам:

- изучение "влияния различных бифидогенных факторов среды на рост, развитие, кислотообразовалие, включая и синтез длинноцепо-чечных жирных кислот;

- разработка состава среды и условий культивирования бифидобактерий, пригодных для ферментации микроорганизмов в больших емкостях, подбор параметров культивирования, обеспечивающих активное накопление живых особей бифидобактерий;

- подбор условий лиофилизации бифидобактерий для длительного

-сохранения с учетом степени выживаемости и сохранности основных технологических свойств в разные сроки хранения.

Научная новизна работы. Впервые осуществлено выделение местных штаммов бифидобактерий из фекалий здоровых детей грудного возраста. Из 72 накопительных культур отобрано 4 высокоэффективных штамма бифидобактерий.

На основании морфологических, физиолого-биохимических признаков проведена идентификация чистых культур..Они отнесены к роду Bifidobacterium - видам bifidum (9С), longum (В2. 17х), adoles-centis (30). Все культуры отличаются интенсивностью и высокой скоростью роста при культивировании на среде Блаурокка.

Местные штаммы бифидобактерий обладают высокими антагонистическими свойствами по отношению к кишечным патогенам (E.coli С-600, S/'typhlmurium - В-86Э, 207; P. vulgaris В-1667, К.pneumoniae B-io23; P.aeruginosa В-1484).

Одной из особенностей местных штаммов бифидобактерий является их устойчивость к высокой концентрации желчи ( 40Х), фенола (0,5%), соли (6,5%), некоторым антибиотикам (гентамицин, метицил-лин, стрептомицин, левомицетин, метронидагол).

Наиболее ценным свойством местных штаммов бифидобактерий является их высокая молокосвертывающая активность (В.longum, B.ado-lescentls), поэтому культивирование в обезжиренном молоке и различных молочных средах с биодобавками (дрожжевой, печеночный, кукурузный экстракты) обеспечивают высокий титр живых клеток.

Для выращивания бифидобактерий в больших емкостях рекомендуется более дешевая, чем общепринятые среды Блаурокка или кукуруз-но-лактозная, модифицированная нами гидролизатно-молочная среда, основу которой составляют протосубтилиновый перевар белков молока или трипсиновый перевар казеина молока, с добавлением разработанного нами нового источника ростактивирующих веществ.Показано, что по сравнению с культивированием в термостате, выращивание бифидобактерий на различных средах в анаэростате' в атмосфере' природного газа значительно увеличивает титр живых особей бифидобактерий. Подобранный режим лиофилизации также еСеспечивает сохранение высокого титра клеток в процессе- длительного хр«.ения (1 год).

Практическая ценность работы. Путем отельного отбора получены промышленно зажныв штаммы бифидобактерий, перспективные для Енедрения в фармацевтическую и пищевую промышленность. Впервые

разработаны питательные среды, микроаэрофильные условия культивирования бифидобактерий, максимально приближенные к производственным, определены параметры выращивания микроорганизмов с высокой скоростью роста; полученные данные легли в основу приготовления нового бактерийного препарата "Бифидумбактерин PL" и продуктов лечебно-профилактического действия "Бифилон М" и "Бифилон ЮЛ".

Апробация работы. Материалы работы домалывались на II! Всесоюзном семинаре на тему: "Актуальные проблемы получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения" (Степногорск, 1991), на научной конференции, посвященной 5-летию независимости Республики Узбекистан и 660-летнему юбилею Амира Темура (Ташкент, 1996) и на 1 съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент,1997).

Публикации.По материалам диссертации опубликованы 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы. Материалы изложены на 100 страницах машинописного текста, включая 31 рисунок, 21 таблицу. В списке литературы 142 наименований, из них 93 отечественных, 42 иностранных. .

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории "Генетика молочно-кислых бактерий" Института микробиологии АН РУз. Чувствительность бифидобактерий к антибактериальным препаратам исследовали в лаборатории .микробиологии Научного центра хирургии км. акад. Вахидова В. KG РУз, биохимические исследования проводили в Институте биохимии АН РУз.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Штаммы Bifidobacterium blfldum 9с, long«m 17х, Вг, adolescent 15 30. выделены из фекалий здоровых детей грудного возраста, проживающих в" городе Ташкенте.

Для выделения и культивирования бифидобактерий использовали среды: Блаурокка (Blaurok, 1939), кукурузно-лактозную (АС СССР N 271372). гидролизатно-молочную с внесением печеночного экстракта, гидролизатно-молочную среду с внесением биоконцентрата (модифицированная нами), обезжиренное молоко с внесением ростактиваторов (дролжевой автолизат 57., кукурузный экстракт 0.5Z, печеночный экстракт 5Z).

- о -

БифидоСактерии выращивали б микроаэрофильных и анаэробных (в атмосфере природного газа) условиях. Количество живых клеток определяли путем подсчета колоний при посеве на полужидкие среды, после многократных серийных разведений исследуемых образцов.

Морфологию изучали с помощью метода световой микроскопии, ферментативные свойства - по степени утилизации углеводов с последующим кислотообразованием, протеолитическую активность, отношение к продуктам кишечного обмена устанавливали по методам, описанным в инструкции (Инструкция по отбору и контролю штаммов лактобацилл и бифидобакерий для использования в производстве бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов лечебно-диетического питания, 1986).

Активность кислотообразоьания бифидобактерий определяли титрометрическим (°Т) и потенциометрическим (pH) методами. Идентификацию и количественное определение летучих жирных (длинноце-почечных) кислот, утилизацию лактозы, образование молочной и уксусной кислот исследовали по методам, описанным в статье (M.L.DesJardlns, D.Roy. Ch.Toupln, 1990).

Антагонистическую активность бифидобактерий по отношению к знтеропатогенным для человека микроорганизмам (Escherichia coll -GOO, Salmonella typhlmurium - B-8G9, £07, Proteus vulgaris B-1CG7, Klebsiella pneumoneae B-1323 и Pseudomonas aeruginosa Б-1484) определяли используя метод совместного культивирования (Инструкция - см. Быше).

Чувствительность бифидобактерий B.blfidum 9с, B.longum 17х, В2 и B.adolescentls 30 к 12 антибиотикам устанавливали при добавлении в среду Бырзшшания различные их концентрации (Навашин С.М., Фомина И.П., 1982). Чувствительность культуры B.longum 17х проверяли диско-диффузионным методом (Гивенталь Н.И., Соболев В.Р. и до., 1982).

Для хранения бифидобактерий использовали метод лиофилизации (замораживание при -40°С, высушивание в глубоком вакууме при температуре +35°С).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Из фекалий здоровых детей грудного возраста (57 детей б возрасте от рождения до года) получены чистые культуры бифидобактерий. Все культуры исследованы на жизнеспособность (по количеству колоний на среде Блаурокка и количеству пассажей, при которых

сохраняется титр исходной культуры и способность сквашивать молоко)

При изменении микроэкологии ('перенос In vivo человека в селективную среду культивирования) лишь 4 штамма из 31 культуры обеспечивают титр жизнеспособных клеток от 10в до Ю10/мл. При этом в прямой зависимости от ростовой активности культуры зависит и количество пассажей, при котором сохраняется первоначальная активность .

Из четырех культур с титром клеток 10п-109/мл три культуры сквашивают молоко в течение 24 чэо. и более активной была одна культура с титром клеток 109-101О/мл., которая сквашивала молоко за 18-20 час.

Исследования морфолого-культуральных свойств колоний (витально и с помощью световой микроскопии) показали, что культуры бифидобактерий не отличаются по морфологическим свойствам от описанных ранее (Лазарева Г.И., 1991).

Отмечена вариабельность форм клеток и колоний при выращивании бифидобактерий на различных питательных средах.

Для определения таксономического положения бифидобактерий было отобрано четыре штамма, отличающихся стабильностью кислото-ойразозакия и молокосвертывания. Основным критерием определения систематического положения культур служили ферментативные свойства по сбраживанию углеводов (22 углевода) (Берге-, 1984; Инструкция, 1986; D.Roy et al., 1990).

Данные представлены в таблице 1. Установлено, что из 22 углеводов 9 (манноза, целлобиоза, рафиноза, трегалоза, арабиноза, ксилоза, салицин, маннит, сорбит) являются ключевыми углеводами для идентификации и классификации бифидобактерий. Такие углеводы, как рамноза, инулин, дульцит не подвергаются утилизации. По сбраживанию углеводов один штамм 9с отнесен к B.bifldum, два штамма к B.lonffum (В2,*17х) и один к В.adolescentis 30.

Наиболее слабой ферментативной активностью обладает культура B.bifídum 9с, которая сбраживает моносахара (глюкозу, фруктозу, галактозу, рибоэу), из дисахаридов активно сбраживает лактозу, мальтозу, из спиртов - слабо маннит.

Наибольшей ферментативной активностью обладает B.adolescen-tis SÛ, из 22 углеводов не сбраживает только рамнозу и дульцит. В отличие от типового штамма B.adolèscentis МС-42, сбраживает

трсгалозу, инулин, сорбит.

По сбраживанию углеводов штаммы В2,17х ВЛопдиш занимают промежуточное положение, более активная культура 17х, которая сбраживает моносахара и дисахара (кроме целлобиозы, рамнозы), из спиртов-сорбит.

Таблица 1

Ферментация углеводов местными штаммами бифидобактерий

В.1опеит В.ЫШит В.асЫеБсег^ДБ

Видовое

название 17Х Вг 9с 30 МС-42 ТИПОВОЙ

Контроль без угле-

водов - - - - -

фруктоза + + + + +

Галактоза + + + + +

Глюкоза + + + + +

гиСоза + + + + +

Манноза + - - +/- -

Лактоза + + + + +

Мальтоза + ¥ + + +

Мелибиоза + + + + +

Сахароза + + +/- + +

Целлобиоза . - - - +

Рафиноза + + - + +

Трегалоза Арабиноза + + +/- + ■ -

+ + - + +

Рамноза - - - - -

Ксилоза + + + + +/-

Инулин - - - +/- -

Салицин - - - +/- +

Маннит - - +/- + +

Сорбит +/- - - + -

Дульцит - - - - -

Примечание: "+" - быстрое сбраживание "-" - не сбраживает, "+/-"- медленное сбраживание.

Все штаммы бифидобактерий сквашивают молоко в течение 24 часов. Культура В.ЫИсклп 9с (местный штамма по сравнению с типовым Б.ЫНс1ит I более активная по кислотообразованию. Однако от других видов (местных штаммов) отличается, более слабим кислотообра-зованием (34°Т).

Наиболее активной культурой оказалась культура В.аскЛеэсеп-Из 30 (140°Т), промежуточное положение заняли два штамма В. 1оп-В-г, 17х (соответственно 128, 110°Т).

- и -

Помимо L(+) молочной и уксусной кислот, бифидобактерии накапливают длинноцепочечные кислоты, ценные для организма людей . При культивировании бифидобактерии на различных питательных средах (стерильное обезжиренное молоко, сбалансированная молочная смесь) изменяется соотношение ненасыщенных и насыщенных кислот. При сквашивании молочной смеси обнаружено 10 кислот, обезжиренного молока - о. При этом количество олеиновой, линолевой кислот в сквашенном обезжиренном молоке у этих штаммов составляет соответственно 40,18 и 7,86%, сквашенной молочной смеси - 33,9 и 17,7%.- В сбалансированной молочной смеси количество ненасыщенных кислот превышает количество насыщенных и составляет соответственно 53,13 и 46,82%.

Установлена устойчивость местных штаммов к вредным продуктам кишечного обмена. ■ Все бифидобактерии B.blfidum 9с, B.longum Вг, 17х и B.adolesentls 30 устойчивы к 20-40% желчи, к 0,25-0,5% фенола. |

Местные штаммы бифидобактерий обладают высокой антагонистической активностью к возбудителям кишечной инфекции (табл. 2). При совместном культивировании с E.coli С 600, 3.typhimurium B-S69 все штаммы бифидобактерий полностью подавляют рост и развитие энтеропатогенных культур, в пределах 89-93% подавляют другой штамм 3.typhimurium 207. Угнетение роста и развитие P.vulgaris В-1667 после 48 ч совместного роста составляет 99,5 и 98,7%, Kl.pneumoniae от 82,0 до 99,6%.

Таблица 2

Антагонистическая активность бифидобактерий

Наименование культур Выживаемость тест-культур, %

С-600 В-869 207 В- -1667 В-1823 В-1484

B.blfidum 9с В.longum Вг B.longum 17х B.adolescen-tis 30 100 100 100 100 100 100 100 100 39,0 90,0 93,0 92,0 98,7 99,5 ■ 100 99,5 90,7 82,0 99,6 94,4 79,0 55,0 76,0 55,0

Примечание: E.coli C-GOO P.vulgaris В-1667

3.typhlmurlum В-869 К.pneumoniae В-1823

3.typhlmurlum 207 P.aeruginosa В-1484

Наиболее устойчивой к ингибирующему действию бифидобактерий

оказалась культура P.aeruginosa В-1484 (55-79%).

Установлена чувствительность бифидобактерий к 12 антибактс-риальным препаратам. Все культуры бифидобактерий чувствительны к эритромицину, олеандомицину, бензилпенициллину, ампициллину, кар-бенцяллину, линкомицину. Более подробно изучена чувствительность культуры B.longum 17х к 21 антибиотику. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: стрептомицину, канамицину - МИК 30 мкг/диск, гентамицину - 10 мкг/диск, умеренно устойчив к оксациллину, ами-кацину, диоксициллину - 10 мкг/диск к другим же антибиотикам чувствителен.

Культура проявляет устойчивость к еысоким концентрациям хи-миотерапевтического препарата метронидазол, наиболее часто используемого при лечении язвенных заболеваний ЖКТ и при гинекологических (табл. 3).

Таблица 3

Изучение чувствительности В.longum 17х к метронидазолу

Наименование препарата и его концентрация , мкг/мл

Титр клеток и морфология бифидобактерий при совместном культивировании

время 24 часа

морфология

время 48 часов

морфология

метронидазол GO

80 100

200 300

400' 450

10 клетка без из- 10 менений а

10^ без изменений 10, 10° клетка увеличи- 10' лась, форма прежняя ,

10° клетка набухшая, 10° форма без изменения

10* 902 клеток приобрело кокковую форму, размер клеток сильно „ увеличился .

10 кокковая форма 10

ю

клетка без изменений без изменений форма прежняя

форма без изменений

форма без изменений

кокковая форма, единичные клетки

Концентрация антибиотика 80 мкг/мл не вызывает заметного из-

менекия б морфологии клеток и ингпбирующего воздействия на рост бифидобактерий, что позволяет рекомендовать использование препарата бифидобактерий совместно с данным препаратом.

Изучено влияние общепринятых сред Блаурокка на рост B.bifi-dum 9с. B.longum 17x, В2, B.adolescentis 30. Наиболее оптимальной оказалась среда Блаурокка, где титр живых клеток составил' не менее 108-109 в 1 мл среды, а добавление к указанной среде тви-на-80 вызвало повышение титра клеток до ю9-1010 мл.

Особое внимание было уделено молокосвертывающей активности местного штамма B.longum 17х. В стерильном обезжиренном молоке без добавления ростактивирукшшх веществ очень низок титр живых клеток бифидобактерий.

Добавление к стерильному обезжиренному молоку активаторов роста значительно .интенсифицирует процесс сквашивания молока. При добавлении кукурузного экстракта (0,5%), дрожжевого автолизата (5%) к 24 час культивирования титр клеток (Ед КОЕ/мл) соответственно составляет 5,72-6,25, при добавлении печеночного экстракта (5%) этот показатель резко возрастет и составляет через 24 час -9,0. Для практического использования, при приготовлении кисломолочных продуктов, в качестве ростактиватора можно рекомендовать дрожжевой автолизат, более доступный и дешевый по себестоимости.

Для массового культивирования бифидобактерий при производстве бактерийных препаратов наш рекомендуется гидролизатно-молоч-ная среда с добавлением биоконцентрата (5 7.), обогащенного бифи-догенными Факторами (аминокислотами, витаминами, олигосахарида-ми),из среды исключен пептон . ¿микроаэрофильные условия культивирования,} По сравнению со средами Блаурокка и детской молочной смесю , модифицированная нами гидролизатно-молочная среда к £0 и 24 часам культивирования обеспечивает титр живых особей бифидобактерий (Ед КОЕ) соответственно 6,87; 7,78 , что позволяет, рекомендовать ее для выращивания бифидобактерий в больших емкостях.

Анаэробное (в атмосфере природного газа) культивирование значительно увеличивает количество живых клеток бифидобактерий . К 1G час ферментации на модифицированной гидролизатко-молочной-среде (Ед КОЕ/мл) титр составляет 7,8, по сравнению со средами Блаурокка, детской молочной смесью, кукурузно-лактозной соответственно 8,84; 3,02; 3,50, к 20 час культивирования ка средах гид-ролизатно-молочной и детской молочной смеси - 8,59-8,87, а- на

среде Блаурокка и кукурузно-лактозной несколько выше - 9,22, к 24 час Ферментации на всех средах титр клеток составил 9,2-9,4, а рН среды снижается с 7.2 до 3.1. При анаэробном способе культивирования рН среды снижается с 7,2 до 3,1 к 48 час культивирования.

Изучение влияния различных методов хранения на жизнеспособность бифидобактерий показало, что наиболее пригодным оказался способ лиофилизации при высоком вакууме и низкой температуре. Гитр живых клеток В.1оп5иш 17х выращенного в среде Блаурокка и детской молочной смеси восстановленные сразу после лиофилизации, составляет соответственно 9.4-9.5 Ед КоЕ/мл, на кукурузно-лактоз-ной и модифицированной гидролизатно-молочной среде Й.39-8.84. К 12 месяцам хранения разница в степени выживаемости культуры от состава среды не наблюдается и составляет 7.03-7.3 Ед КоЕ/мл, что позволяет рекомендовать модифицированную гидролизатно-молочную среду в качестве производственной.

Биохимические исследование восстановленного после лиофилизации В.1опдит 17х показало, что культура сохраняет активность по накоплению биомассы, образованию молочной и уксуной кислот, сбраживанию лактозы (таблица 4).

Таблица 4

Накопление биомассы, кислотообразование и утилизация лактозы в динамике роста бифидобактерий ВЛопгит 17х

Бремя культи- Вес сухой био- Количество кислот Количество

вирования, массы, г лактозы, Z

молочной уксусной

час

8 2,3 0,3 - 0,1 3,5

12 3,2 0,5 0,4 2,5

16 3,5 0,75 0,55 1,7

20 3,6 0,8 0,65 0,85

24 3,5 0,85 0,62 0,3

ВЫВОДЫ

1. Нами получены 4 местных штамма бифидобактерий Bifidobacterium blfldum (9с), Bifidobacterium longum (Bg, 17x), Bifidobacterium adolescentis (30) перспективные для практического использования в фармацевтической и молочной промышленности. Эти культуры устойчивы к высокой концентрации соли NaCl (6,57.), желчи (20-40Х) и повышенному содержанию фенола (0,25-0,6%). Установле-

но, что бифидобактерии обладают высокими антагонистическими свойствами к кишечным патогенам (E.coli С600, S.typhimurlum -£07, В-869, P.vulgaris В-1667, К.pneumoniae В-1823, P.aeroglnosa 'В-1484), при совместном культивировании в жидкой среде Блаурокка процент ингибирования кишечной палочки составляет 100%, сальмонелл - 89-100%, протеи - 98-100%, клебсиелл - 82-99%, синегнонной палочки - 55-79%.

2 Местные штаммы бифидобактерий активно развиваются в молоке с ростактиваторами (кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат, печеночный экстракт), сквашивают молоко в течение 16-20 час, общая титруемая кислотность составляет 84-140°Т. При сквашивании обезжиренного молока и молочной смеси "Малютка" образуют длинноцепо-чечные жирные кислоты, содержание которых составляют соответственно: олеиновой 40,18% - 33,7%, линолевой (наиболее ценной) -7,86%- 17,7% .

3. Установлена чувствительность бифидобактерий к 8 антибио-, тикам пенициллинового ряда (эритромицину, олеандомицину, бензил-пеницилину, ампициллину, карбенициллину, линкомицину, оксацилли-ну, тетрациклину); повышенная устойчивость к гентамицину, мети-циллину, стрептомицину, левомицетину и метронидазолу.

4. Для вырашивания бифидобактерий в большой емкости рекомендуется молочная среда на основе протосубтилинового перевара белков молока с добавлением Б% биоконцентрата, которая обеспечивает в микроаэрофильных условиях культивирования высокий титр бифидобактерий - 8.37 через 24 часа.

5. Подобран режим лиофилизации и питательная среда (гидроли-затно-молочная), которые обеспечивают высокий титр живых клеток сразу после лиофилизации 8.4 Ед КоЕ/мл и после хранения в течении 12 месяцев - 7.3 Ед КоЕ/мл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Путем отбора получены производственные штаммы бифидобактерий, которые способны за короткое время активно сквашивать молоко и могут быть использованы при выработке профилактических кисломолочных продуктов.

2. С целью интенсификации ростовых процессов микроорганизмов, разработана питательная среда, микроаэрофильные условия

- 1G -

культивирования максимально приближенные к производственным.

3. Для профилактики и лечения дисбактериозов различного происхождения , острых *и хронических гастритов с пониженной кислотностью, хронических колитов, гепатитов и после длительного принятия антибиотиков, разработан новый бактерийный препарат "Бифидум-бактерин PL" и кисломолочные продукты "Бифилон М" и "Бифилон КМ".

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: '

1. Золотилина Г.Д., Огай Д.К., Панова Л.Н. К вопросу использования бифидобактерий для производства молочных продуктов и биопрепаратов // Тезисы. "Актуальные направления в биотехнологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения"., Степногорск, 1990.

2.Золотилина Т.Д., Панова Л.Н., Огай Д.К.Местные штаммы би-фидобакт^оий - антагонисты возбудителей желудочно-кишечной инфекции. // Доклады Академии наук Республики Узбекистан, N 2, 1992, С.44-45.

3. Панова Л.Н., Огай Д.К., Фимушкина Р.И., Потиевский Э.Г. Новый лечебно-диетический кисломолочный продукт "Бифилон", оценка биологической ценности. // Сб.н.тр. "Вопросы медицинской и социальной реабилитаций в педиатрии"., Ташкент, 1994, с.81-86.

4. Огай Д.К., Григорьянц СЛ., Баженов Л.Г , Панова Л.Н. и др. К вопросу использования микроорганизмов для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта. // Сб.н.тр. "Вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных на этапах длительного наблюдения"., Ташкент, 1994, с.232-233.

5. Потиевский Э.Г., Булатова Г.М., Ахмадулина C.B., Панова . Л.Н. Влияние пектина на жизнеспособность нормальной микрофлоры кишечника человека. //Сб.н.р. "Актуальные вопросы инфекционной патологии"., Ташкент.. 1994, с.126-128.

6. Панова Л.Н. Особенности физиологических свойств местных-штаммов бифидобактерий. // Узбекский биологический журнал, N 1» 1995, с.16-19.

7. Патент N 2048517 на изобретение: "Штамм Blfidobacterium longum, используемый для приготовления бактериальных препаратов и кисломолочных продуктов" / Огай Д.К., Золотилина Г.Д., Панова Л.Н., Халмуррпов А.Г. /Роспатент/, 1995.

8. БФС Уз 42-0089-96. Бифидобактерин сухой PL / Огай Д.К.,

Бакенов Л.Г., Панова Л.Н.

Э. Производственный регламент "Бифидумбактерин - сухой. Огай Д.К., Панова Л.Н., Соловей В.В., Лим С.Л.. 1997.

10. Панова Л.Н. Культивирование местных штаммов бифидобакте-рий для производства биопрепаратов и кисломолочных продуктов.//"1 съезд микробиологов Узбекистана", тезисы докладов. Ташкент. 1997.

Л.Н. Панова

"Бактерияли препарат ва сув-^ати^ махсулотларини тайерлаш учун бифидобактерияларнинг ма^аллий штаммларини яратиш."

X У Л О С А

Бактерияли препаратлар ва сут-^атик, махсулотларини тайерлаш учун бифидобактерияларнинг мздаллий штаммларини яратиш буйича тажриба синовларининг натижаларидан иборат номзодлик диссертация-сининг езмаси екланади. Биринчи марта бифидобактерияларнинг ма^аллий штаммлари ажратиб олинди. Бу бактерияларнинг айнан шашлиги кузатилди, ичак патогендарига нисбатан антагонистик фаол-лиги, ичакда модда алмашинуви натижасида ^осил булатиган зарарли моддалари /ут, фенол/га ва катор антибиотикларга чидамлиги ани^-ланди. Турли сутли му^итларга бифидоген омиллари сифатида ^атор моддаларни ^шганда бифидобактерияларнинг ривожланиши урганилди. Бифидобактерияларни катта идишарда устириш учун му^ит таркиби, узо$ ва^т сагаанганда бифидобактерияларнинг яшаш ^билиятини сац-лаш учун лиофил ^уритиш шароитлари танланди /1йил/.

Бифидобактерияларнинг ма^аллий штаммлар "Бифидббактерин-Р1." ва суг-^тик, махсулотлари "Бифилон-М", "Бифилон-КМ" препаратлари-ни таДерлашда фойдаланилди.

L.N. FANOVA

SELECTION OF LOCAL STRAINS OF BIFIDOBACTERIA FOR MAKING BACTERIAL PREPARATIONS AND SOUR-MILK PRODUCTS

ANNOTATION

Dissertation manuscript is being protected which contains

the results of experimental studies in selection of bifidobacteria local strains for making bacterial preparations and sour-milk products. For the first time, an Isolation of bifidobacteria local strains has been done. An identification of cultures has been conducted, antagonistic activity towards intestinal pathogenes has been determined as well as resístanse to bad products of intestinal metabolism suich as bile, phenol and a number of antibiotics. Development of bifidobacteria in various milky media with adding of a number substances as bifldogenlc factor has been studied. Composition of medium for cultivation of bifidobacteria in large reservoirs has been adjusted as well as conditions of lyop-hilization in order to maintain vitality of bifidobacteria during long preservation (one year). Local strains of bifidobacteria were used for making such preparation as "Bifidobacterin-Pl" and sour-milk products "Blfilon-M" and "Blfilon-KM"

Подписано в печать 12.03.98. г. Тираж 100 печ. л. 1,25 Заказ № 58 Отпечатано в типографии ГФНТИ г. Ташкент Алмазар 171