Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и лактобацилл

Младзиевская, Юлия Артуровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и лактобацилл
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и лактобацилл"

На правах рукописи

МЛАДЗИЕВСКАЯ Юлия Артуровна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА И МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ

03.00.23 Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург - 2005

Работа выполнена в ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» и в Санкт-Петербургском НИИ вакцин и сывороток и предприятии по производству бактерийных препаратов.

Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор

Короток Александр Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор

Рыбальченко Оксана Владимировна доктор биологических наук профессор

Заикина Надежда Александровна

Ведущая организация:

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА, г. Санкт-Петербург

Защита состоится « » декабря 2005 г. в часов на заседании Диссертационного совета К 208.088.01 при ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14, СПбХФА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия».

Автореферат разослан «¿7 , ноября 2005 г. Ученый секретарь диссертационного совета

Караваева Анна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В последние годы на Российском рынке появилось много пробиотических препаратов и БАДов на основе живых микроорганизмов. Характеристика их эффективности представлена в большом потоке научных публикаций (Нисевич Н.И. с соавт., 1999; Лыкова Е.А. с соавт., 2003;. Реге1га О.1.А. е1 а1., 2002).

Наиболее часто в бактериотерапии, а также при производстве БАДов и продуктов функционального питания используют бифидобактерии и лакто-бациллы. Эти пробиотики называют классическими, так как их активным началом являются штаммы, выделенные из кишечника человека и доминирующие в нем с первых дней жизни (Эрегй в.Б., 1971; На1акка К. е1 а1., 2001). Кроме того, именно лактобациллам и бифидобактериям присуща способность к колонизации эпителиальных тканей (Коршунов В.М. с соавт., 1999; Чумаева Т.В. с соавт., 2002; иасоЬзеп С.Ы. е1 а1., 1999; Тиото1а Е. е1 а1„ 2001).

Рекомендованные к применению стандартные рецептуры питательных сред для культивирования производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл, как правило, требуют дополнительной корректировки для придания им желаемых ростовых свойств. Поэтому важной задачей в процессе оптимизации питательных сред является не только выбор доступного и недорогого сырья и полуфабрикатов, но и получение на их основе высококачественных и конкурентоспособных пробиотиков (Елинов Н.П., 1995; Абрамов Н.А. с соавт., 1996; Терновская Л.Н. с соавт., 1996; Андреева М.А. с соавт., 1998).

В процессе биотехнологического производства пробиотических препаратов и продуктов на основе лактобацилл и бифидобактерий значимое место отводится разработке методов поддержания стабильности высококонцентрированных микробных биомасс (Ильницкая И.Ю. с соавт., 1986; Несчис-ляев В.А., 1996; Новик Г.Н. с соавт., 1998; Мурашова А.О. с соавт,, 2000). Эта проблема в настоящее время очень актуальна, так как этап лиофилизации все еще является дорогостоящим и энергоемким процессом на многих производствах. Поэтому поиску альтернативных путей поддержания стабильности микробных биомасс всегда уделяется особое внимание.

Важное значение на предприятиях биотехнологического произ-водства имеет контроль готовой продукции (Чупринина Р.П. с соавт., 1995; Рыбачок А.В., 1995; Мохов Д.А. с соавт., 2002). Методы микробиологического контроля разнообразной лакто- и бифидосодержащей пробиотической продукции довольно часто трудоемки, требуют специального оборудования,

дорогостоящих питательных сред и реа1|тр§@вня^£здздШ1!Щакого

БИБЛИОТЕКА 1 С.Петербург лъЛ

~——----- <«• я

контроля не всегда дают точную информацию. Хотя в последние годы появился ряд новых предложений по их оптимизации (Ганина В.И. с соавт., 1999; Мурашова А.О., 2000; Несчисляев В.А. с соавт., 2002; Арчакова Е.Г., 2004), необходимость разработки новых более совершенных и доступных методов контроля не вызывает сомнений.

Для препаратов, выпускаемых на основе давно известных производственных штаммов, часто возникает проблема постепенного снижения уровня их антагонистической активности, что в конечном итоге отражается на лечебно-профилактической эффективности пробиотика. Таким образом, необходим поиск пути увеличения антагонистической активности подобных штаммов.

Все вышеизложенное свидетельствует о том, что, несмотря на уже имеющиеся достижения в области биотехнологии пробиотиков, задача ее дальнейшего совершенствования остается чрезвычайно актуальной.

Цель настоящего исследования.

Цель настоящей работы состояла в усовершенствовании состава питательных сред для культивирования бифидобактерий и лактобацилл и контроля качества лробиотических препаратов; изыскании способов стабилизации бактериальных биомасс и путей повышения уровня антагонистической активности производственных штаммов.

Основные задачи исследования.

1. Оптимизация состава питательных сред для культивирования производственных штаммов Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ и Bifidobacterium bifidum 1 и их производственных биомасс.

2. Усовершенствование лабораторного контроля и разработка селективных сред для количественного учета бифидобактерий в комплексных лробиотических препаратах и молочнокислых заквасках.

3. Изыскание доступных способов стабилизации микробных биомасс и полуфабрикатов.

4. Оценка значимости применения набора методов определения антагонистической активности бифидобактерий и лактобацилл при отборе перспективных производственных штаммов.

5. Поиск путей повышения уровня антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий.

Научная новизна.

Доказана прямая зависимость антагонистической активности и уровня кислотообразования, которая присуща только пробиотическим штаммам лакто-бацилл. Предложена методика определения контрантагонистической резистентности бифидобактерий (обратного антагонизма) в смешанных культурах. Показано, что антагонистическая активность бифидобактерий повышается в процессе их совместного культивирования с шигеллами. Обнаружено, что тиосодержащие органические соединения, способные замедлять окислительные процессы, в частности, унитиол, способны пролонгировать сохранность бифидобактерий.

Практическая значимость работы.

Усовершенствован состав питательных сред МРС-1, КД-5, среды Блаурокка и казеиново-дрожжевой среды для выращивания производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл, лежащих в основе производства Бифидумбактерина сухого и Лактобактерина сухого. Их прописи включены в нормативную производственную документацию предприятия СПбНИИВС (РП № 1547-04 на Бифинорм® Бифидумбактерин сухой и РП № 46-96 на Лактобактерин сухой и ФСП 42-0022-5808-04 на Бифинорм ® Бифидумбактерин сухой). Разработан состав среды для селективного выделения бифидобактерий из их смеси с энтеробактериями, которая позволяет выполнить контроль специфической активности препарата Бификол сухой. Оптимизирован состав питательной среды для дифференциации лактобактерий и термофильного стрептококка на основе рецептуры коммерческого продукта фирмы Hi Media из отечественных полуфабрикатов и реактивов. Предложено использование унитиола для стабилизации биомасс бифидобактерий и полуфабрикатов на их основе. Дана оценка целесообразности проведения комплекса методов по контролю антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий, перспективных в качестве производственных штаммов. Предложен метод определения контрантагонистической резистентности бифидобактерий (обратного антагонизма) в смешанных культурах с использованием налидиксовой кислоты. Изложены результаты селекционной работы с целью повышения антагонистической активности исходного производственного штамма Bifidobacterium bifidum 1 при использовании метода его совместного культивирования с энтеробактериями.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложен комплекс питательных сред на основе полуфабрикатов собственного производства, оптимизирующий процесс производства и контроля качества бифидо- и лактосодержащих пробиотических препаратов.

2. Применение унитиола для стабилизации биомассы бифидобактерий достоверно увеличивает сохранность первоначальной концентрации живых микробных клеток в интервале температур от 2 до 20 °С.

Апробация работы и публикации.

Основные положения работы доложены на юбилейной научно-технической конференции ГосНИИ ОЧБ (Санкт-Петербург, 2000), Всероссийской научной конференции молодых ученых (Уфа, 2004), 2-й Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование; Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда» (Пущино, 2005) заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов НИИ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2005).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 27 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 216 литературных источников, из них 113 отечественных авторов и 103 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования.

Производственные штаммы бифидобактерий: B.bifidum 1, B.longum, B.adolescentis МС-42, B.lactis Bb-12 и свежевыделенные из кишечника здоровых детей штаммы бифидобактерий.

Производственные штаммы лактобацилл: L.plantarum 8Р-АЗ, L.acidophiius 20Т, L.acidophiius 22n, L.acidophiius 5ei3, L.acidophiius 7mi3, L.acidophiius 7m,

L.acidophilus La-5 и свежевыделенные штаммы лактобацилл, полученные из бактериологической лаборатории СПбГПМА и Института акушерства и гинекологии им. Д.А. Отга РАМН.

Производственный штамм Escherichia coli М-17.

Производственный штамм термофильного стрептококка S.thermophilus St-body 1.

Штаммы условно-патогенной микрофлоры, полученные из бактериологической лаборатории Института акушерства и гинекологии им. Д.А. Отта РАМН.

Набор тест-штаммов для определения антагонистической активности производственных штаммов лактобацилл: Shigella flexneri (штаммы № 170 и № 331), Shigella sonnei (штамм 5063), Escherichia coli (энтеропатогенный штамм 157), Staphylococcus aureus (штамм 209), Proteus vulgaris (штамм 177) и Proteus mirabilis (штамм 237).

Стандартные питательные среды для выращивания бифидобактерий, лактобацилл, термофильного стрептококка и кишечной палочки.

Методы исследования.

Количество жизнеспособных клеток и бифидобактерий в 1 мл определяли с помощью десятикратных разведений в среде Блаурокка (ФС 42-3947-00 на Бифидумбактерин сухой).

Количество жизнеспособных клеток лактобацилл и кишечных палочек в 1 мл определяли с помощью десятикратных разведений в 0,9 % растворе NaCI с последующими количественными высевами на плотные питательные среды (ФС 42-0054-00 на Лактобактерин сухой, ФС 42-3268-96 на Бификол сухой).

Прямую антагонистическую активность лактобацилл определяли методом отсроченного антагонизма с помощью перпендикулярных штриховых подсевов тест-штаммов штаммов к культуре-антагонисту на плотной питательной среде.

Прямую антагонистическую активность бифидобактерий определяли: 1) методом отсроченного антагонизма с помощью перпендикулярных штриховых подсевов тест-штаммов к культуре-антагонисту на плотной питательной среде МРС-5 в анаэробных условиях с использованием анаэростата и газо-генерирующих пакетов типа Gas Pack; 2) на основе метода смешанных культур (по ФС 42-3266-96 на Бификол сухой).

Контрантагонистическую резистентность лактобацилл определяли методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде МРС-5 с помощью штриховых подсевов лактобацилл к штаммам-антагонистам.

Определение контрантагонистической резистентности бифидобактерий осуществляли методом смешанных культур при их совместном культи-

вировании с тест-штаммами шигелл с последующим выделением бифидобактерий в чистую культуру в среде Блаурокка с H К.

Изо- и гомоантагонистическую активность лактобацилл определяли методом отсроченного антагонизма с помощью штриховых подсевов штаммов лактобацилл на плотной питательной среде МРС-5.

Активность кислотообразования бифидобактерий и лактобацилл, выражаемую в °Т, определяли титриметрическим методом.

Определение равномерности разлива препарата Бифидумбактерина сухого проводили по МУК 4.1/4.2-588-96.

Обработка результатов исследований проводилась с помощью электронных таблиц Microsoft Excel. Достоверность различий между группами данных оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при t > t о.в (р<0,05). Взаимосвязь между группами оценивали с помощью коэффициента корреляции (г). Повторяемость опытов (п) 4-6-кратная. Равномерность разлива препарата определяли с помощью коэффициента вариации (V).

Основные исследования, а также анализ полученных результатов проводились лично автором в научно-производственном комплексе «Эубиотические препараты» СПбНИИВС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Усовершенствование состава питательных сред для производственного культивирования бифидобактерий и лактобацилл

На этапе выбора оптимальных питательных сред для производства пробиотической продукции на основе лактобацилл проводили сравнительное изучение ростовых свойств нескольких их вариантов. Были усовершенствованы составы выбранных производственных питательных сред - среды МРС-1 и казеиново-дрожжевой среды. Показана возможность исключения из состава среды МРС-1 Твина-80, отсутствие которого не влияло на прирост биомассы производственного штамма L.plantarum 8Р-АЗ.

Проведено изучение возможности частичной замены в питательной среде Блаурокка печеночного экстракта более доступным - дрожжевым. При выборе оптимальных соотношений дрожжевого и печеночного экстрактов (ДЭ и ПЭ), вводимых в состав среды Блаурокка, выявлено, что внесение ДЭ и ПЭ в процентном соотношении 75:25 соответственно может дать достоверно больший прирост биомассы бифидобактерий, чем ее исходный вариант (100% ПЭ).

При оптимизации состава питательной среды КД-5 для получения маточной культуры B.bifidum 1 показана целесообразность создания более плотного варианта среды за счет увеличения в ее составе количества агар- агара (с 0,75 г/л до 1,2 г/л). При этом достигается достоверно больший прирост биомассы бифидобактерий и не превышающая показатель 5% равномерность разлива полуфабриката Бифидумбактерина сухого.

Усовершенствование состава питательных сред для контроля качества пробиотических препаратов и продуктов

На базе отделения питательных сред СПбНИИВС был откорректирован рецепт приготовления дифференциальной среды фирмы Hi Media для количественного учета термофильных стрептококков и болгарской палочки.

Нами заменены углеводы и экстракты зарубежного производства (декстроза, соевый пептон, говяжий и дрожжевой экстракты) на отечественные (глюкоза, пептон ферментативный сухой), а также на собственные (мясной и дрожжевой экстракты). Применение этой среды не только полужидкой, как предлагает производитель, но и в плотном варианте позволяет проводить количественный учет КОЕ микроорганизмов, растущих на поверхности среды и образующих колонии, различные по форме и окраске.

При разработке селективной среды для выделения бифидобактерий из их смеси с энтеробактериями была успешно применена добавка налидиксовой кислоты (невиграмона) к среде Блаурокка. Было установлено, что налидиксовая кислота (НК) способна эффективно подавлять рост кишечной палочки в концентрации (0,00375 г/л), гораздо меньшей предложенной в «Методических рекомендациях по микробиологической диагностике раневых инфекций» (1999 г) (0,03 г/л). Это также на несколько порядков меньше селективной добавки азида натрия (0,1 г/л). Вместе с тем было установлено, что она минимально ингибирует рост бифидобактерий, позволяя получать достоверно большее число их КОЕ/мл в контрольных высевах.

Для изучения возможности выделения бифидобактерий из смеси

с лактобациплами и термофильным стрептококком было проведено сравнительное изучение селективного действия 3-х видов антибиотиков (канамицина, левомицетина и линкомицина). Было показано, что самым уязвимым к действию антибиотиков штаммом бифидобактерий оказался B.bifidum 1, входящий в состав препарата Бифидумбактерин сухой. Рост других штаммов бифидобактерий в присутствии 250 мкг/мл канамицина и 2,5 мкг/мл левомицетина практически не подавлялся. Таким образом, определенными сочетаниями антибиотиков мы получили полное подавление роста лактобацилл и термофильного стрептококка.

Для селективного выделения бифидобактерий B.lactis Bb-12 из закваски АТВ-5 (фирма Hansen), дополнительно содержащей Lactobacillus acidophilus La-5 и Streptococcus thermophilus ST-body 1, проводилось изучение ростовых свойств полужидких сред - ГМС и дифференциальной среды с добавками двух антибиотиков (Табл.1).

Таблица 1

Сравнительное изучение ростовых свойств селективных сред при количественных высевах из молочнокислых продуктов (л=6)

Посевной материал Полужидкая ГМС с антибиотиками (КОЕ/мл) Полужидкая дифференциальная среда с ТТХи антибиотиками (КОЕ/мл) Среда Блаурокка с антибиотиками (КОЕ/мл)

Обрат, заквашенный В.1асЫз ВЬ-12 (5,8±0,7)-107 (5,6±0,6)-107 (5,4±0,5)-107

Обрат, заквашенный L.acidoph¡lus Ьа-б Нет роста Нет роста Нет роста

Обрат, заквашенный З.ШегторИПиэ Нет роста Нет роста Нет роста

Обрат, заквашенный АТВ-5 (2,8±0,6)-106 (3,5±0,5)-10б (3,4±0,6)-106

Оценка полученных результатов позволила сделать вывод о целесообразности применения обоих вариантов питательной среды с селективными добавками для контроля количества жизнеспособных В.1асйв ВЬ-12, входящих в состав трехкомпонентной закваски АТВ-5. Поэтому при

\ проведении контроля кисломолочных продуктов на основе этих штаммов

можно рекомендовать такие полужидкие питательные среды с добавками ^ антибиотиков (250 мкг/мл канамицина и 2,5 мкг/мл левомицетина).

Применение унитиола для стабилизации микробных биомасс

Способность тиосодержащих органических соединений, замедляющих окислительные процессы, в частности унитиола, оказывать стабилизирующий эффект на культуру бифидобактерий - одно из новых и интересных свойств этого соединения, относящегося к группе антидотов тиоловых ядов.

Из всех исследованных штаммов B.bifidum 1, L.plantarum 8Р-АЗ и E.coli М-17 унитиол (У) оказал защитное действие только на бифидобактерии. Это было обнаружено при определении динамики снижения количества КОЕ/мл в течение месяца при температуре (2 - 10) °С в трех вариантах бактериальных биомасс с У.

Конечная концентрация У 1% в среде культивирования, с одной стороны, частично ингибировала растущую культуру бифидобактерий. С другой стороны, при введении этого количества У в готовую биомассу выявлен максимальный эффект пролонгирования сохранности первоначального количества жизнеспособных клеток.

Этот препарат в конечной концентрации 1% оказал длительное защитное действие (до 135 сут) на биомассу бифидобактерий не только в герметично укупоренных, но и в периодически вскрываемых флаконах с резиновыми пробками (до 120 сут).

При разливе биомассы в малых количествах в большую тару (1:5), закрытую ватно-марлевой пробкой, присутствие 1% У позволило сохранить исходный уровень жизнеспособных КОЕ/мл в течение 21 сут (в контроле он упал на 5 порядков).

Благодаря добавлению У в готовую биомассу появилась возможность пролонгированного хранения бифидобактерий даже при условиях, когда температура бытовых холодильников составляла (6-10) °С (Рис. 1 и 2).

30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Время хранения биомассы, сут

•0,5%

I контроль (без унитиола)

Рис.1. Контроль КОЕ/мл клеток во вскрываемых флаконах с биомассой бифидобактерий, содержащей унитиол

га

(О

i2>

0 10 20 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Время хранения биомассы, сут

— 0,5 % —• — контроль (без унитиола)

Рис.2. Контроль КОЕ/мл клеток в герметично укупоренных флаконах с биомассой бифидобактерий, содержащей унитиол

Отмечено, что при содержании 0,5% У в составе готовых полуфабрикатов Бифидумбактерина и Бификола сухого существенно продлевается срок их хранения с заданным количеством КОЕ/мл (до 165 сут) (Рис.3 и 4). Та же

концентрация У в составе биомассы бифидобактерий, не содержащей защитной сахарозо-желатино-молочной среды, оказывает стабилизирующий эффект в меньшей степени (до 120 сут).

20 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Время хранения полуфабриката, сут

- ♦ - Кол-во живых бифидобактерий в полуфабрикате с унитиолом

Д " Контроль полуфабриката (без унитиола)

Рис.3. Контроль КОЕ/мл бифидобактерий во флаконах с полуфабрикатом Бифидумбактерина сухого с 0,5% унитиола

9 г -

0 10 20 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180

Время хранения полуфабриката, сут

—- Кол-во живых бифидобактерий в полуфабрикате с унитиолом -о - Кол-во живых кишечных палочек в полуфабрикате с унитиолом ■ ■ А -Контроль живых бифидобактерий в полуфабрикате (без унитиола) —* — Контроль живых кишечных палочек в полуфабрикате (без унитиола)

Рис 4. Контроль КОЕ/мл бифидобактерий и кишечных палочек во флаконах с полуфабрикатом Бификола сухого с 0,5% унитиола

Представляет большой интерес тот факт, что при внесении У в состав питательной среды появляется возможность без обязательной предварительной процедуры нейтрализации длительно сохранять жизнеспособность отдельных колоний бифидобактерий для дальнейших пересевов при временной невозможности немедленной лиофилизации культуры. Способность У стабилизировать жизнеспособность бифидобактерий в питательной среде не только в условиях холодильника, но и при комнатной температуре, может быть полезной при их транспортировке с возможным повышением температуры окружающей среды. Было отмечено стабилизирующее действие добавки 0,5% У в среду Блаурокка, которая оказалась эффективной даже в условиях хранения бифидобактерий при комнатной температуре. Жизнеспособность отдельных колоний на среде с У сохранялась более месяца, в то время как в контроле способность к росту терялась через 3 недели, а в посевах, хранившихся при комнатной температуре - уже по истечении 2-й недели хранения.

Изучение антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий и оптимизация методов ее определения

При контроле препаратов, содержащих нескольких антагонистически активных штаммов лактобацилл, было установлено, что при удовлетворительном уровне прямого антагонизма может быть достаточно низким уровень их контрантагонистической резистентности (обратного антагонизма).

Контроли прямой антагонистической активности (АА) и контрантагонистической резистентности (КР) лактобацилл достаточно просты в исполнении. Они были использованы при отборе антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из женской половой сферы, и исследования их: а) прямой АА против набора из 30 тест-культур вагинального происхождения и б) КР при использовании в качестве тест-культур грибов рода Candida. Были изучены антагонистические свойства производственных и свежевы-деленных штаммов лактобацилл с помощью метода отсроченного антагонизма на плотной питательной среде между разными штаммами лактобактерий (изо-антагонизм) и между одними и теми же штаммами (гомоантагонизм) (Нес-числяев В.А. с соавт., 2002). Замечено, что чем больше зона подавления роста при контроле гомоантагонизма (ГА), тем больше культура проявляет изоанта-гонистические (ИА) свойства.

При сравнении уровня ИА и ГА производственных штаммов лактобацилл была выявлена практически полная корреляция ме>кду этими показателями (г = 0,98). При исследовании показателей ИА и ГА свежевыделенных штаммов лактобацилл обнаружена лишь слабая обратная зависимость (г = - 0,4).

Для определения АА 4-х производственных штаммов бифидобактерий методом отсроченного антагонизма не всегда можно вырастить чистую культуру бифидобактерий на поверхности плотных сред. Нами был использован другой метод определения АА бифидобактерий, не требующий создания специальных анаэробных условий - совместное выращивание бифидобактерий с тест-штаммами шигелл в толще полужидкой питательной среды с последующими высевами на среду Эндо (для учета количества живых клеток шигелл) и на среду Блаурокка с НК (для выделения чистой культуры бифидобактерий из смеси с шигеллами). Исследования проводились параллельно в двух вариантах: с соотношением вносимых культур 0,1:1 (по ФС на Бификол сухой) и 1:1 (Новик Г.Н. с соавт., 1998).

Было установлено, что самой низкой степенью АА обладает производственный штамм В.ЫИс1ит 1 (Рис. 5).

90 ,

5 70 Г | 60 | 50 Ш 40 § 30 38 20 .

10 , 0 ^

соотношение соотношение соотношение соотношение

вносимых вносимых вносимых вносимых культур 0,1 :1, культур 1:1, культур 0,1:1, культур 1:1, экспозиция 48 ч экспозиция 48 ч экспозиция 72 ч экспозиция 72 ч

ВВ.ЬЖаигп 1 ИВ.Мб ВЬ-12 НВ.'|опдит НВ.асМезсепйз МС-42

Рис.5. Сравнительная характеристика уровня прямой антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий

Примечание: У штаммов В.1асИз ВЬ-12, В.1опдит и В.ас1о1езсепЬ5 МС-42 (отсутствие столбцов на диаграмме) % КОЕ шигелл в пробах не превышал показатель 0,1%.

Снижение КР бифидобактерий (менее 100%) имело место только при исследовании штамма В.Ыййит 1 в соотношении вносимых культур 1:1 (Рис. 6). Было замечено, что при малой посевной дозе всех внесенных штамм-мов бифидобактерий (0,1:1) обнаружен достоверно больший прирост их биомассы после окончания совместного выращивания с шигеллами (в 10 и более раз).

При сравнительном изучении зависимости активности кислотообразования производственных штаммов бифидобактерий от их АА (оценивали средние значения % выживших клеток) корреляции выявлено не было. При совместной экспозиции смешанной культуры в течение 72 ч замечено появление быстрорастущих кометообразных колоний бифидобактерий, отличных по морфологии от типичных колоний («гвоздиков», «крошек»). Такие колонии появлялись в высевах на среду Блаурокка с НК уже через 24 ч. Этот феномен обнаружен у всех 4-х штаммов бифидобактерий.

16000 , 14000 12000 {-10000 +8000 ^ 6000 -4000 Г 2000

0 --Дп.

ВЬ|йс)ит1 В 1асЛ8 ВЬ-12 В 1опдит В ас)о1езсепН8 МС-42

■ % КОЕ бифидобактерий при соотношении вносимых культур 1:1, экспозиция 48 ч

0% КОЕ бифидобактерий при соотношении вносимых культур 0,1 : 1, экспозиция 48 ч

□ % КОЕ бифидобактерий при соотношении вносимых культур 1.1, экспозиция 72 ч

13% КОЕ бифидобактерий при соотношении вносимых культур 0,1 : 1, экспозиция 72 ч

Рис.6. Сравнительная характеристика уровня контрантагонистической резистентности производственных штаммов бифидобактерий

Изучение АА бифидобактерий методом смешанных культур показало удобство количественного определения бифидобактерий в сообществах с энтеробактериями с помощью среды Блаурокка с НК. При этом можно выявить не только возможное негативное влияние патогенной микрофлоры на бифидобактерии in vitro, но и оценить их взаимодействие на всем сроке совместного культивирования.

Была исследована возможность изменения уровня АА менее активного из всех штаммов - B.bifidum 1 пассированием с тест-штаммами шигелл.

Нами проведено несколько серий экспериментов по 10 пассажей с различными соотношениями штаммов шигелл, посевных доз культур и временем их совместной экспозиции. Получены 3 варианта новых штамммов (1 вар., штамм X пассажа вар. А и штамм X пассажа вар. Б).

Степень АА 3-х вариантов исходного штамма варьировала, а уровень активности кислотообразования этих вариантов остался без изменений.

При исследовании промежуточного III пассажа (выделен в процессе получения штамма X пассажа вар. Б) обнаружено, что на среде Блаурокка с НК уже через 24 ч появились колонии, нетипичные для бифидобактерий - кометообразной формы длиной 1,5 - 2,0 см. Микроскопический контроль такой культуры бифидобактерий подтвердил ее подлинность. Показатели АА этого варианта уже через 48 ч экспозиции намного превосходили уровень АА исходного штамма B.bifidum 1. Активность кислотообразования этой культуры снизилась по сравнению с исходным штаммом от (135 ± 0,5) °Т до (85,5 ± 0,5) °Т (Рис. 7).

Закономерность появления быстрорастущего варианта B.bifidum 1 III пассажа была проверена однократным засевом исходного штамма в соотношении 0,1:1 с шигеллами (I пассаж) при экспозиции 48 ч. Снова были выявлены колоний бифидобактерий в виде тяжей.

Обнаружена зависимость между изменением активности кислотообразования, выявленной у двух вариантов пассированных штаммов бифидобактерий, и их степенью антагонистической активности при совместном культивировании с шигеллами в течение 48 ч (Рис.7 и 8).

£ ■

я а.

л (О

с о

1 2

Я о

8 5

о £

с "

160 140 120 100 80 60 40 20 0

. и а о _

I 2 ^ с"?

5 5 -о а = а = а

- |ш 8 £ 2 2 8

о а

ОЗЕЯ % КОЕнигелл при соотношении вносимых культур 0,1:1 яггт % КОЕимгелл при соотношении вносимых культур 1' 1 —А—Активность кислотообразования

Рис.7. Сравнительная характеристика прямой антагонистической активности и активности кислотообразования исходного штамма В.ЫЛйит 1 и его вариантов

8 3

£ с

2 2

Р 3

60000

¡2 20000 f-8

з? юооо

и g

я s

о g

3 2

я H

1% КОЕбифидобактерий при соотношении вносимых культур 0,1:1 1 % КОЕбифидобактерий при соотношении вносимых культур 1:1

Рис. 8. Сравнительная характеристика уровня контрантагонистической резистентности бифидобактерий исходного штамма В.ЫАйит 1 и его вариантов через 48 ч совместного культивирования с шигеллами

Штаммы I и III пассажей оказались более аэротолерантными, благодаря чему был проведен контроль АА бифидобактерий методом отсроченного антагонизма. Вновь подтвердилась высокая степень антагонистической активности. Новые свойства штамма III пассажа приведены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнительная характеристика исходного и измененного штаммов бифидобактерий В.ЫПс1ит 1 третьего пассажа

Свойства Исходный штамм В.ЫМлп 1 Измененный штамм В.ЫАйит 1

Морфология колоний В виде «гвоздиков», «крошек», «зерен» В виде «комет»

Скорость образов: колоний в сред эния отдельных е Блаурокка Через 72 ч Через 24 ч

Поверхностный рост на плотной питательной среде МРС-5 В анаэробных условиях - +

В аэробных условиях - +

Чувствительность к канамицину (250 мкг/мл) и левомицетину (2,5 мкг/мл) Устойчив Чувствителен

Сквашивание молока (внесение в стерильный обрат 1% 48-часовой культуры бифидобактерий) Слабое закис-ление молока без образования сгустка Образует сгусток через 24-48 ч

Активность кислотообразования по Тернеру 130-МОТ 80 - 90 Ч

Уровень антагонистической активности против шигелл в смешанной культуре (норма - число КОЕ/мл шигелл не более 2 %) До 50 % Не более 2 %

При сравнительном изучении АА бифидобактерий исходного штамма B.bifidum 1 и всех его вариантов через 72 ч после совместного культивирования с шигеллами (как требуют условия ФС) обнаружено, что при соотношении вносимых культур 0,1:1 у всех новых штаммов увеличился уровень АА. При соотношении вносимых культур 1:1 ее уровень изменился незначительно (Рис.9).

Н% КОЕ шигелл при соотношении вносимых культур 0,1 ' 1 0% КОЕ шигелл при соотношении вносимых культур 1 ■ 1

Рис.9. Сравнительная характеристика уровня прямой антагонистической активности бифидобактерий исходного штамма B.blfldum 1 и его вариантов через 72 ч совместного культивирования с шигеллами

Данный опыт получения пассированных вариантов исходного производственного штамма бифидобактерий для увеличения его АА может быть полезным в направленной селекционной работе, проводимой в специализированных лабораториях.

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован состав питательных сред для культивирования производственных штаммов Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ и Bifidobacterium bifidum 1: печеночный экстракт на 2/3 заменен более доступным дрожжевым экстрактом, Твин-80 удален из среды МРС-1.

2. Усовершенствован состав селективных питательных сред для контроля количества жизнеспособных бифидобактерий в комплексном препарате Бификол сухой, а также в трехкомпонентных пробиотических молочнокислых продуктах на основе закваски АТВ-5: предложено заменить токсичный азид натрия налидиксовой кислотой, добавление в качестве селективных агентов 250 мкг/мл канамицина и 2,5 мкг/мл левомицетина позволяет полностью подавить рост лактобацилл и термофильного стрептококка.

3. Установлено, что внесение унитиола значительно продлевает сроки

хранения биомассы живых бифидобактерий, а также полуфабрикатов, содержащих эти микроорганизмы.

4. Показано, что применение одновременно нескольких методов определения антагонистической активности лактобацилл (прямого и обратного антагонизма, гомо- и изоантагонизма) имеет важное значение при отборе перспективных производственных штаммов. При анализе штаммосовмес-тимости лактобактерий на этапе разработки комплексных пробиотиков достаточно контроля их гомоантагонистической активности.

5. Определение контрантагонистической резистентности (обратного антагонизма) бифидобактерий при их совместном культивировании с тест-штаммами энтеробактерий целесообразно проводить методом количественных высевов на среду Блаурокка с налидиксовой кислотой в концентрации 0,00375 мкг/мл.

6. Установлено, что пассирование исходного производственного штамма бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 в микст- культуре с тест-штаммами шигелл позволяет получить его новые варианты с увеличенным в 20 раз уровнем антагонистической активности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Королюк A.M., Головачева С.Н., Белова И.А., Младзиевская Ю.А. Применение невиграмона для определения концентрации бифидобактерий в смешанных микробных культурах // Вторая международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» 2-4 сентября 1998 г. Ин-т им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия. - СПб, 1998. - С. 137.

2. Королюк A.M., Савичева A.M., Младзиевская Ю.А., Чупринина Р.П. Принцип микроэкологической адекватности и его реализация при оценке вагинальных эубиотиков // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Дисбактериозы и эубиотики». М., 26-28 марта 1996 г - М., 1996. - С. 18

3. Королюк А М , Петров Л Н., Вербицкая Н.Б, Дробот И.В., Головачева С.Н., Младзиевская Ю.А., Геннадьева Т.Я. Разработка двухкомпонентного эубиотика для нормализации микрофлоры кишечника у детей// Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Дисбактериозы и эубиотики». - М. - 26-28 марта 1996 г. - с. 19.

4. Королюк A.M., Савичева A.M., Младзиевская Ю.А. Оптимизация лабораторного контроля вагинальных эубиотиков // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 28-31 января 1997 г. - М., 1997. - Т.1 - С. 266-267.

5. Королюк A.M., Савичева A.M., Младзиевская Ю.А. Принцип микроэкологической адекватности как необходимое условие разработки некоторых методов оценки качества эубиотиков // III Национальный конгресс «Человек и лекарство», Тезисы докладов,- М., 16-20 апреля 1996 г. - М., 1996. - С. 310.

в. Короток А.М., Белова И.А., Младзиевская Ю.А., Головачева С.Н. Определение концентрации Bifidobacterium bifidum в микробных ассоциациях. Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины (Материалы юбилейной научно-технической конференции ГосНИИ ОЧБ). -СПб., 2000. - С. 41-42.

7. Младзиевская Ю.А., Емельяненко В.А. Характеристика бактерицидного и бактериостатического действия унитиола в жидких бакконцентратах. Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии. Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых, 27 февраля 2004., Уфа. - Уфа, 2004. - С. 113-114.

8. Емельяненко В.А., Младзиевская Ю.А. Возможные пути оптимизации методов определения антагонистической активности бифидобактерий. Там же -С. 114-116.

9. Королюк А.М., Младзиевская Ю.А., Емельяненко В.А. Феномен приобретения полезных свойств производственными штаммами бифидобактерий при совместном культивировании с некоторыми энтеробактериями. 2-я Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование; Биотехнология -Биомедицина - Окружающая среда» (Тезисы докладов), 10-13 мая, 2005 г, Пущино. - Пущино, 2005. - С.24-26.

10. Младзиевская Ю.А., Королюк А.М. Применение наледиксовой кислоты для изучения контрантагонистической резистентности бифидобактерий в смешанных культурах. Там же. - С.33-35.

Список сокращений

АА - антагонистическая активность;

БАД - биологически активная добавка к пище;

ГА - гомоантагонистическая активность;

ДЭ - дрожжевой экстракт;

ИА - изоантагонистическая активность;

KP - контрантагонистическая резистентность;

КОЕ - колониеобразующая единица;

МПА - мясо-пептонный агар;

НК - малидиксовая кислота;

ПЭ - печеночный экстракт;

РЛ - регламент производства;

ТТХ - тетрафен илтетразо лий хлористый;

ФС - фармакопейная статья;

Gas Pack - гаэогенерирующий пакет.

Подписано в печать 27 10.05 г Формат 60x84/16

Тираж 100 зю Объем 2 п.л.

Типография СПбНИИВС

198320, Санкт-Петербург, ул. Свободы, д.52

2 5 4 4 2

РНБ Русский фонд

2006-4 25866

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Младзиевская, Юлия Артуровна

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА.

1.1. Развитие пробиотического направления в микробиологии.

1.2. Требования, предъявляемые к выбору производственных штаммов. 15 ^ 1.3. Развитие и перспективы биотехнологического производства пробиотиков.

1.4. Критерии оценки качества пробиотиков и разработка методов их контроля.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ф 2.1. Объекты исследования.

2.2. Питательные среды и растворы.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Определение количества жизнеспособных клеток (КОЕ/мл).

2.3.2. Определение антагонистической активности.

2.3.3. Определение активности кислотообразования.

2.3.4. Определение равномерности разлива препарата.

2.4. Статистическая обработка результатов. f*

Глава 3. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ.v.

3.1. Оптимизация состава питательных сред для производственного культивирования лактобацилл. 3.1:1. Выбор питательной среды для выращивания производственной биомассы лактобацилл.

3.1.2. Оценка влияния вносимых изменений в состав среды МРС-1 на ее ростовые свойства.

3.1.3. Оптимизация состава питательной среды для реакторного культивирования лактобацилл.

3.2. Усовершенствование состава питательных сред для производственного культивирования бифидобактерий.

3.2.1. Оценка влияния вносимых изменений в состав среды Блаурокка на ее ростовые свойства.

3.2.2. Оптимизация состава питательной среды КД-5 для выращивания производствейной биомассы бифидобактерий.

Глава 4. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ф КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И

ПРОДУКТОВ.

4.1. Выбор селективных компонентов для оптимизации контрольных питательных сред при определении числа живых бифидобактерий в смешанных культурах.

4.1.1. Изучение действия налидиксовой кислоты на бифидобактерии и кишечную палочку.

4.1.2. Оценка селективного действия антибиотиков на бифидобактерии, лактобациллы и термофильные стрептококки в монокультуре и в ассоциациях.

4.2. Оптимизация методов лабораторного контроля количества жизнеспособных клеток стартерных культур в бифидосодержащих ферментированных кисломолочных продуктах. ф} 4.2.1. Выбор питательных сред для культивирования и контроля количества жизнеспособных клеток производственных штаммов закваски АТВ-5 в монокультуре.

4.2.2. Оптимизация состава дифференциальной питательной среды для культивирования и контроля количества жизнеспособных клеток ' производственных штаммов закваски АТВ-5.

Глава 5. ПРИМЕНЕНИЕ УНИТИОЛА ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ МИКРОБНЫХ д БИОМАСС.

5.1. Изучение бактерицидных и бактериостатических свойств унитиола на бифидобактерии, лактобациллы и кишечную палочку.

5.2. Оценка стабилизирующего действия унитиола на бактериальные биомассы бифидобактерий, лактобацилл и кишечных палочек при их хранении в разных температурных интервалах.

5.3. Влияние унитиола на сохранность бифидобактерий.

5.4. Изучение длительности хранения полуфабрикатов препаратов Бифидумбактерина сухого и Бификола сухого с добавлением унитиола.

5.5. Оценка возможности применения питательной среды Блаурокка с унитиолом для контроля количества жизнеспособных бифидобактерий и их последующего длительного хранения.

Глава б. ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛАКТОБАЦИЛЛ И БИФИДОБАКТЕРИЙ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ЕЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

6.1. Сравнительная характеристика прямого антагонизма и контрантагонистической резистентности производственных штаммов и свежевыделенных культур лактобацилл.

6.2. Сравнительное изучение изоантагонистических и гомо-антагонистических свойств производственных штаммов и свежевыделецных лактобацилл.

6.3. Оптимизация методов исследования антагонистической активности бифидобактерий в смешанных культурах.

6.4. Сравнительное изучение уровня антагонистической активности бифидобактерий при их совместном культивировании с шигеллами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и лактобацилл"

Актуальность проблемы. В последние годы на Российском рынке появилось много пробиотических препаратов и БАДов на основе живых микроорганизмов. Характеристика их эффективности представлена в большом потоке научных публикаций (Нисевич Н.И. с соавт., 1999; Лыкова Е.А. с соавт., 2003; Pereira D.I.A. et al, 2002).

Наиболее часто в бактериотерапии, а также при производстве БАДов и продуктов функционального питания используют бифидобактерии и лактобациллы. Эти пробиотики называют классическими, так как их активным началом являются штаммы, выделенные из кишечника человека и доминирующие в нем с первых дней жизни (Sperti G.S., 1971; Hatakka К. et al., 2001). Кроме того, именно лактобациллам и бифидобактериям присуща способность к колонизации эпителиальных тканей (Коршунов В.М. с соавт., 1999; Чумаева Т.В. с соавт., 2002; Jacobsen C.N. et al., 1999; Tuomola E. et al., 2001).

Рекомендованные к применению стандартные рецептуры питательных сред для культивирования производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл, как правило, требуют дополнительной корректировки для придания им желаемых ростовых свойств. Поэтому важной задачей в процессе оптимизации питательных сред является не только выбор доступного и недорогого сырья и полуфабрикатов, но и получение на их основе высококачественных и конкурентоспособных пробиотиков (Блинов Н.П., 1995; Абрамов Н.А. с соавт., 1996; Терновская JI.H. с соавт., 1996; Андреева М.А. с соавт., 1998).

В процессе биотехнологического производства пробиотических препаратов и продуктов на основе лактобацилл и бифидобактерий значимое место отводится разработке методов поддержания стабильности высококонцентрированных микробных биомасс (Ильницкая И.Ю. с соавт., 1986; Несчисляев В.А., 1996; Новик Г.Н. с соавт., 1998; Мурашова А.О. с соавт., 2000). Эта проблема в настоящее время очень актуальна, так как этап лиофилизации все еще является дорогостоящим и энергоемким процессом на многих производствах. Поэтому поиску альтернативных путей поддержания стабильности микробных биомасс всегда уделяется особое У внимание.

Важное значение на предприятиях биотехнологического производства имеет контроль готовой продукции (Чупринина Р.П. с соавт., 1991; Рыбачок А.В., 1995; Мохов Д.А. с соавт., 2002). Методы микробиологического контроля разнообразной лакто- и бифидосодержащей пробиотической продукции довольно часто трудоемки, требуют специального оборудования, дорогостоящих питательных сред и реактивов, а результаты такого контроля не всегда дают точную информацию. Хотя в последние годы появился ряд новых предложений по их оптимизации (Ганина В.И. с соавт., 1999; Мурашова А.О., 2000; Несчисляев В.А. с соавт., 2002; Арчакова Е.Г., 2004), необходимость разработки новых более совершенных и доступных методов контроля не вызывает сомнений.

Для препаратов, выпускаемых на основе давно известных производственных штаммов, часто возникает проблема постепенного снижения уровня их антагонистической активности, что в конечном итоге отражается на лечебнопрофилактической эффективности пробиотика. Таким образом, необходим поиск пути увеличения антагонистической активности подобных штаммов.

Цель работы: Цель настоящей работы состояла в усовершенствовании состава питательных сред для культивирования бифидобактерий и лактобацилл и контроля качества пробиотических препаратов; изыскании способов стабилизации бактериальных биомасс и путей повышения уровня антагонистической активности производственных штаммов. Задачи исследования:

1. Оптимизация состава питательных сред для культивирования производственных у штаммов Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ и Bifidobacterium bifidum 1 и их производственных биомасс.

2. Усовершенствование лабораторного контроля и разработка селективных сред для количественного учета бифидобактерий в комплексных пробиотических препаратах и молочнокислых заквасках.

3. Изыскание доступных способов стабилизации микробных биомасс и полуфабрикатов.

4. Оценка значимости'применения набора методов определения антагонистической активности бифидобактерий и лактобацилл при отборе перспективных производственных штаммов.

5. Поиск путей повышения уровня антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий.

Научная новизна исследования. Доказана прямая зависимость антагонистической активности и уровня кислотообразования, которая присуща только пробиотическим штаммам лактобацилл. у

Предложена методика определения контрантагонистической резистентности бифидобактерий (обратного антагонизма) в смешанных культурах.

Показано, что антагонистическая активность бифидобактерий повышается в процессе их совместного культивирования с шигеллами. л

Обнаружено, что тиосодержащие органические соединения, способные замедлять окислительные процессы, в частности, унитиол, способны пролонгировать сохранность бифидобактерий.

Практическая значимость работы. Усовершенствован состав питательных сред МРС-1, КД-5, среды Блаурокка и казеиново-дрожжевой среды для выращивания производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл, лежащих в основе производства Бифидумбактерина сухого и Лактобактерина сухого. Их прописи включены в нормативную производственную документацию предприятия

СПбНИИВС (РП № 1547-04 на Бифинорм Бифидумбактерин сухой и РП № 46-96 на

Лактобактерин сухой и ФСП 42-0022-5808-04 на Бифинорм Бифидумбактерин сухой). Разработан состав среды для селективного выделения бифидобактерий из их смеси с энтеробактериями, которая позволяет выполнить контроль специфической активности препарата Бификол сухой. Оптимизирован состав питательной среды для дифференциации лактобактерин и термофильного стрептококка на основе рецептуры коммерческого продукта фирмы Hi Media из отечественных полуфабрикатов и реактивов. Предложено использование унитиола для стабилизации биомасс бифидобактерий и полуфабрикатов на их основе. Дана оценка целесообразности проведения комплекса методов по контролю антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий, перспективных в качестве производственных штаммов. Предложен метод определения контрантагонистической резистентности бифидобактерий (обратного антагонизма) в смешанных культурах с использованием налидиксовой кислоты. Изложены результаты селекционной работы с целью повышения уровня антагонистической активности исходного производственного штамма Bifidobacterium bifidum 1 при использовании метода его совместного культивирования с энтеробактериями.

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Изменение уровня антагонистической активности исходного производственного штамма бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 может быть достигнуто в процессе его пассирования в микст-культурах с тест-штаммами шигелл. Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Основные положения работы доложены на юбилейной научно-технической конференции ГосНИИ ОЧБ (Санкт-Петербург, 2000), Всероссийской научной конференции молодых ученых (Уфа, 2004), 2-й Международной конференции «Наука - Бизнес - Образование; Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда» (Пущино, 2005) и на заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов НИИ им. Пастера (Санкт-Петербург, 2005).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК - активность кислотообразования АН - азид натрия

БАД — биологически активная добавка к пище

ГА — гомоантагонистичсеская активность t

ДЭ - дрожжевой экстракт ИА - изоантагонистическая активность КОЕ - колониеобразующая единица МПА - мясо-пептонный агар НД - нормативная документация НК — налидиксовая кислота

ПЭ - печеночный экстракт

РП - регламент производства

ТТХ - тетрафенилтетразолий хлористый

У - унитиол

ФС — фармакопейная статья

GMP - Good Manufacturing Practice (надлежащая практика производства) Gas Pack - газогенерирующий пакет

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Младзиевская, Юлия Артуровна

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован состав питательных сред для культивирования производственных штаммов Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ и Bifidobacterium bifidum 1: печеночный экстракт на % заменен более доступным дрожжевым экстрактом, Твин-80 удален из среды МРС-1.

2. Усовершенствован состав селективных питательных сред для контро-ля количества жизнеспособных бифидобактерий в комплексном препарате Бификол сухой, а также в трехкомпонентных пробиотических молочнокислых про-дуктах на основе закваски АТВ-5: предложено заменить токсичный азид натрия налидиксовой кислотой, добавление в качестве селективных агентов 250 мкг/мл канамицина и 2,5 мкг/мл левомицетина позволяет полностью подавить рост лактобацилл и термофильного стрептококка.

3. Установлено, что внесение унитиола значительно продлевает сроки хранения биомассы живых бифидобактерий, а также полуфабрикатов, содержащих эти микроорганизмы.

4. Показано, что применение одновременно нескольких методов определения антагонистической активности лактобацилл (прямого и обратного антагонизма, гомо- и изоантагонизма) имеет важное значение при отборе перспек-тивных производственных штаммов. При анализе штаммосовместимости лактобак-терий на этапе разработки комплексных пробиотиков достаточно контроля их гомоантагонистической активности.

6. Установлено, что пассирование исходного производственного штамма S бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 в микст-культуре с тест-штаммами шигелл позволяет получить его новые варианты с увеличенным в 20 раз уровнем антагонистической активности.

176

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биотехнологическое производство пробиотиков предполагает постоянное совершенствование технологии получения продукции высокого качества на основе л живых культур пробиотических производственных штаммов, обладающих хорошими технологическими свойствами, высокой степенью антагонистической активности, хорошими иммуномодулирующими свойствами и безопасностью (Зацепин Ю.К., 1986).

Для получения бактериальных биомасс высокой плотности важное место имеет выбор оптимального состава питательных сред (Калинина Т.Э. с соавт., 1996, Андреева М.А. с соавт., 1998, Конькова Н.К, 2002). Как правило, на первых этапах разработки - технологии получения пробиотической продукции производители начинают с рекомендованных к применению стандартизованных составов питательных сред, пригодных для выращивания большинства производственных штаммов. Но не всегда ростовые свойства этих сред полностью удовлетворяют производителей пробиотиков. Импортные полуфабрикаты и реактивы, входящие в их состав, достаточно дороги, а закупка готовых отечественных полуфабрикатов не всегда обеспечивает получение высококачественных готовых питательных сред с хорошими ростовыми свойствами.

Получение собственных полуфабрикатов из доступного на данном предприятии сырья подразумевает возможность коррекции рецептур стандартных питательных сред. При этом должен осуществляться подбор оптимального соотношения используемых на предприятии собственных полуфабрикатов (экстрактов, отваров, аутолизатов и др.) в процессе приготовления, а также контроля качества и ростовых свойств производственных питательных сред.

На этапе выбора оптимальных питательных сред для производства пробиотической продукции на основе лактобацилл проводили сравнительное изучение ростовых свойств нескольких их вариантов. На следующем этапе работы были усовершенствованы составы выбранных вариантов производственных питательных сред - среды МРС-1 и казеиново-дрожжевой среды. При этом f показана возможность исключения из состава среды МРС-1 такого компонента, как Твин-80, отсутствие которого не влияло на прирост биомассы производственного штамма L.plantarum 8Р-АЗ.

Были откорректированы рецептуры модифицированной среды Блаурокка и среды КД-5 для культивирования биомассы бифидобактерий. Эти среды изготавливаются на предприятии из собственных полуфабрикатов, прописи которых находятся в составе регламентов производства на Лактобактерин сухой и Бифинорм® Бифидумбактерин сухой. Предварительно были апробированы варианты печеночных экстрактов, изготовленных на основе лошадиной печени и печени крупного рогатого скота. На основании сравнительного изучения ростовых свойств среды Блаурокка с этими добавками экстракт лошадиной печени был исключен из состава полуфабрикатов для этих сред.

Проведено изучение возможности частичной замены печеночного экстракта в составе питательной среды Блаурокка более доступным - дрожжевым. При выборе оптимальных соотношений дрожжевого и печеночного экстрактов (ДЭ и ПЭ), вводимых в состав среды Блаурокка, выявлено, что внесение ДЭ и ПЭ в соотношении 75:25 соответственно может дать достоверно больший прирост биомассы бифидобактерий B.bifidum 1, чем ее исходный вариант со 100% ПЭ.

При оптимизации состава питательной среды КД-5 для получения маточной культуры бифидобактерий B.bifidum 1 показана целесообразность создания более плотного варианта среды за счет увеличения в ее составе количества агар-агара (с 0,75 г/л до 1,2 г/л). При этом достигается достоверно больший прирост биомассы бифидобактерий и не превышающая показатель 5% равномерность разлива полуфабриката Бифидумбактерина сухого.

На базе отделения питательных сред СПбНИИВС был откорректирован / рецепт приготовления дифференциальной среды фирмы HiMedia для количественного учета термофильных стрептококков и болгарской палочки. Нами заменены углеводы и экстракты зарубежного производства (декстроза, соевый пептон, говяжий и дрожжевой экстракты) на отечественные (глюкоза, пептон ферментативный сухой), а также на собственные (мясной и дрожжевой экстракты), выпускаемые на предприятии для приготовления различных питательных сред.

Дифференциальная среда достаточно проста в приготовлении. Замена t некоторых импортных ингредиентов на отечественные аналоги и собственные полуфабрикаты позволяет рекомендовать ее в качестве полноценной питательной среды для культивирования и дифференциации молочнокислых микроорганизмов, таких как лактобациллы и бифидобактерии. Внесение добавок, обладающих антибиотической активностью, способствует применению этой среды в качестве селективной. Применение этой среды не только полужидкой, как предлагает производитель - фирма Hi Media, но и в плотном варианте позволяет проводить количественный учет КОЕ микроорганизмов, растущих на поверхности среды и образующих колонии, различные по форме и окраске.

В процессе разработки составов питательных сред для селективного выделения бифидобактерий из их смеси с другими микроорганизмами использовались несколько видов антибиотиков, как по отдельности, так и в сочетаниях. Так, при разработке селективной питательной среды для выделения бифидобактерий из их смеси с энтеробактериями, была успешно применена добавка налидиксовой кислоты (невиграмона) к основной прописи среды Блаурокка. В частности, ее использовали при сравнении с селективным действием азида натрия, рекомендованного к применению при контроле препарата Бификол сухой, в состав которого кроме бифидобактерий входит Escherichia coli М-17.

Было установлено, что налидиксовая кислота способна эффективно подавлять рост кишечной палочки в концентрации (0,00375 г/л), гораздо меньшей предложенной в Методических рекомендациях по микробиологической диагностике раневых инфекций (1999 г) (0,03 г/л), а также на несколько порядков меньше селективной добавки азида натрия (0,1 г/л). Вместе с тем было установлено, что она минимально ингибирует рост самих бифидобактерий, позволяя получать достоверно большее число их КОЕ/мл в контрольных высевах.

Среда Блаурокка с добавлением налидиксовой кислоты была успешно применена при выделении бифидобактерий из смеси с шигеллами после совместного культивирования в контроле обратной антагонистической активности.

С целью изучения возможности выделения бифидобактерий из их смеси с двумя видами микроорганизмов - лактобациллами и термофильным стрептококком - было проведено сравнительное изучение селективного влияния на них разных групп антибиотиков. Результаты изучения действия 3-х видов антибиотиков (канамицина, левомицетина и линкомицина) показали, что влияние каждого антибиотика в отдельности на производственные штаммы лактобацилл и бифидобактерий недостаточно для селективного выделения бифидобактерий из их смеси с лактобациллами и термофильным стрептококком.

Исследования показали, что наиболее устойчивыми к этим антибиотикам / оказались именно лактобациллы. В процессе выбора оптимальной концентрации ингибирующих агентов наблюдались такие явления, как: а) частичное подавление роста производственных штаммов бифидобактерий при отсутствии роста всех тестируемых штаммов лактобацилл и термофильного стрептококка; б) одновременный рост как бифидобактерий, так и лактобацилл при полном подавлении термофильного стрептококка; в) рост лактобацилл на фоне частичного подавления роста бифидобактерий и полного ингибирования роста термофильного стрептококка.

Было выявлено, что более уязвимым к действию изучаемых антибиотиков штаммом бифидобактерий оказался B.bifidum 1, входящий в состав препарата Бифидумбактерин сухой. Попытки выделить его из смеси с производственными штаммами бифидобактерий путем воздействия канамицина, левомицетина и линкомицина как по отдельности, так и в совокупности, оказались безуспешными. В то же время рост других штаммов бифидобактерий в присутствии добавок канамицина и левомицетина практически не подавлялся при полном отсутствии роста лактобацилл и термофильного стрептококка. Таким образом, определенными сочетаниями антибиотиков, которые по отдельности не дают необходимого селективного подавления роста лактобацилл для проведения количественного учета бифидобактерий, мы смогли получить более сильный ингибирующий эффект, направленный на полное подавление роста лактобактерий и термофильного стрептококка.

Данные виды антибиотиков дешевы и доступны для любых практических лабораторий. Этот вариант селективных добавок в состав питательных сред может быть использован в практической работе по выделению исследованных нами производственных штаммов бифидобактерий из их смеси с лактобациллами и термофильным стрептококком в производственных лабораториях, ведущих работу с этими культурами.

Для изучения возможности селективного выделения бифидобактерий

Bifidobacterium lactis Bb-12 из закваски АТВ-5 (фирма Hansen), дополнительно / содержащей в своем составе лактобактерии Lactobacillus acidophilus La-5 и термофильный стрептококк Streptococcus thermophilus ST-body 1, было проведено сравнительное изучение полужидких питательных сред - ГМС и дифференци альной среды с селективными добавками двух антибиотиков одновременно. Оценка полученных результатов позволила сделать вывод о целесообразности применения обоих вариантов питательной среды с селективными добавками для контроля количества жизнеспособных бифидобактерий Bifidobacterium lactis Bb-12, входящих в состав трехкомпонентной закваски АТВ-5. Поэтому при проведении контроля качества кисломолочных продуктов на основе этих пробиотических штаммов, получаемых на базе отечественных предприятий, внедривших их в свое производство, можно рекомендовать такие полужидкие питательные среды, как ГМС и модифицированную дифференциальную среду с ТТХ с добавками антибиотиков (250 мкг/мл канамицина и 2,5 мкг/мл левомицетина).

Проблема стабилизации бактериальных биомасс занимает одно их наиболее важных мест в решении ряда биотехнологических задач (Несчисляев В.А., 1996). Способность унитиола оказывать стабилизирующий эффект на культуру бифидобактерий - одно из новых и интересных свойств соединения, относящихся к группе антидотов тиоловых ядов.

При определении бактерицидного и бактериостатического действия этого препарата на производственные штаммы B.bifidum 1, L.plantarum 8Р-АЗ и E.coli М-17 были выявлены те его концентрации, при которых ингибирование не наблюдалось. Из всех исследованных штаммов унитиол оказал защитное действие только на бифидобактерии. Это было обнаружено при определении динамики снижения концентрации КОЕ/мл в бактериальных биомассах с различным конечным содержанием унитиола за 1 месяц при температуре (2 — 10) °С.

Как показали результаты исследований, конечная концентрация унитиола 1% в среде культивирования оказывала, с одной стороны, частичный ингибирующий эффект на растущую культуру бифидобактерий. С другой стороны, при введении этого количества унитиола в полученную биомассу, был выявлен максимальный стабилизирующий эффект, проявляющийся в пролонгировании сохранности первоначального количества жизнеспособных КОЕ бифидобактерий.

Этот препарат в конечной концентрации 1 % способен оказывать длительное защитное действие на клеточную биомассу бифидобактерий (до 135 сут) не только в герметично укупоренных, но и в периодически вскрываемых флаконах с резиновыми пробками (до 120 сут).

Было также отмечено, что при разливе такой биомассы в малых количествах в большую тару (1:5), закрытую ватно-марлевой пробкой, 1% унитиол оказал защитное действие на эти анаэробные микроорганизмы, сохранив исходный уровень жизнеспособных КОЕ/мл бифидобактерий в течение 21 сут (за этот же промежуток времени в,контроле он упал на 5 порядков).

Было установлено, что при добавлении унитиола в готовую биомассу появилась возможность более длительного хранения бакконцентратов бифидобактерий даже при условиях, когда температура бытовых холодильников была гораздо выше необходимого в производственных условиях интервала температур и составляет (6 - 10) °С.

Следует особо отметить, что при содержании 0,5% унитиола в составе готовых полуфабрикатов Бифидумбактерина сухого и Бификола сухого существенно продлевается срок их хранения с заданным количеством КОЕ/мл (до 165 сут). В то же время эта концентрация унитиола в составе биомассы бифидобактерий, не содержащей защитной сахарозо-желатино-молочной среды, оказывает меньший стабилизирующий эффект (до 120 сут).

При изучении возможности применения среды Блаурокка с унитиолом для контроля количества жизнеспособных бифидобактерий и их последующего длительного хранения проведен сравнительный анализ трех вариантов питательных сред. Для этого использовали среду Блаурокка без предварительной регенерации и после нее, а также с добавлением унитиола от 0,1 до 0,5%. Полученные результаты количественных высевов препаратов Бифидумбактерина сухого на все перечисленные варианты питательных сред показали, что достоверных отличий между их ростовыми свойствами нет.

При сравнительном изучении жизнеспособности бифидобактерий при длительном хранении в питательной среде использовали посевы с 0,5% унитиолом в среде Блаурокка, заложенные на хранение как при комнатной температуре, так и в холодовой камере фриго. Было отмечено стабилизирующее действие добавки унитиола в среду Блаурокка, которая оказалась эффективной даже в условиях хранения культуры бифидобактерий при комнатной температуре.

Жизнеспособность отдельных колоний бифидобактерий на среде с унитиолом сохранялась более месяца, в то время как в контроле способность к росту терялась через 3 недели, а в посевах, хранившихся при комнатной температуре — уже по » истечении 2-й недели хранения.

Представляет большой интерес тот факт, что при внесении в состав питательной среды унитиола появляется возможность без обязательной предварительной процедуры нейтрализации длительно сохранять жизнеспособность отдельных колоний бифидобактерий для дальнейших пересевов при временной невозможности немедленной лиофилизации культуры. Способность унитиола стабилизировать жизнеспособность бифидобактерий в питательной среде не только в условиях холодильника, но и при комнатной температуре, может быть полезной при их транспортировке с возможным повышением температуры окружающей среды.

В настоящее время запатентованы и находятся на стадии внедрения в производство новые пробиотические препараты и продукты на основе нескольких антагонистически активных штаммов. В связи с этим особую актуальность приобретают исследования в области совершенствования методов комплексного контроля антагонистической активности производственных штаммов, в том числе бифидобактерий и лактобацилл (Ганина В.И. с соавт.,1999, Коршунов В.М. с соавт., 1999, Арчакова Е.Г., 2004).

При контроле препаратов, содержащих нескольких антагонистических штаммов лактобацилл, обычно предусмотрен только контроль прямой антагонистической активности против набора из 7' тест-штаммов. Было установлено, что при удовлетворительных результатах этого контроля может быть достаточно низким уровень контрантагонистической резистентности производственных штаммов.

Контроли прямой антагонистической активности и контрантагонистической резистентности лактобактерий достаточно просты в исполнении. Они были использованы при отборе антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из женской половой сферы, и исследования их: а) прямой антагонистической активности против набора из 30 тест-культур вагинального происхождения и б) контрантагонистической резистентности при использовании в качестве тест-культур грибов рода Candida.

Далее было продолжено изучение антагонистических свойств производственных штаммов и свежевыделенных лактобацилл с помощью метода отсроченного антагонизма на плотной питательной среде между разными штаммами лактобактерий (изоантагонизм) и между одними и теми же штаммами (гомоантагонизм) (Несчисляев В.А. с соавт., 2002). Было замечено, что чем больше зона подавления роста при контроле гомоантагонизма, тем больше культура проявляет изоантагонистические свойства.

При сравнении изоантагонизма (ИА) и гомоантагонизма (ГА) производственных штаммов лактобацилл нами была выявлена практически полная корреляция между этими показателями. При исследовании показателей ИА и ГА свежевыделенных штаммов лактобацилл обнаружена лишь слабая обратная зависимость. Так как уровни ГА и ИА производственных штаммов имеют прямую зависимость, целесообразно проводить изучение штаммосовместимости лактобактерий путем контроля уровня их ГА при разработке комплексных препаратов - пробиотиков.

Значительные трудности вызывает определение антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий методом отсроченного антагонизма, так как не всегда можно обеспечить рост чистой культуры бифидобактерий на поверхности плотных сред. Нами был использован другой метод определения антагонистической активности бифидобактерий, не требующий создания специальных анаэробных условий - совместное выращивание бифидобактерий с тест-штаммами шигелл в толще полужидкой питательной среды с последующими высевами на среду Эндо (для учета количества живых клеток шигелл) и на среду Блаурокка с налидиксовой кислотой (выделение чистой культуры бифидобактерий из смеси с шигеллами). Исследования проводились параллельно в двух вариантах: по стандартной методике, предложенной в ФС и с соотношением вносимых культур 1:1 (Новик Г.Н. с соавт., 1998).

Полученные результаты контроля уровня прямой антагонистической активности нескольких производственных штаммов бифидобактерий показали, что самой низкой степенью антагонистической активности обладает производственный штамм B.bifidum 1.

Было замечено, что при малой посевной дозе всех внесенных штаммов бифидобактерий (0,1 мл по методике ФС по сравнению с 1 мл при вносимом соотношении 1:1) был обнаружен достоверно больший прирост их биомассы после окончания их совместного выращивания с шигеллами.

Снижение контрантагонистической резистентности бифидобактерий имело место только при исследовании антагонистической активности штамма B.bifidum 1 в соотношении вносимых культур 1:1.

При сравнительйом изучении зависимости активности кислотообразования производственных штаммов бифидобактерий от их антагонистической активности (оценивали средние значения % выживших клеток шигелл) корреляции между этими признаками выявлено не было.

При совместной экспозиции смешанной культуры в течение 72 ч было замечено появление быстрорастущих кометообразных колоний бифидобактерий, отличных по морфологии от типичных колоний («гвоздиков», «крошек»). Такие колонии появлялись ву высевах на среду Блаурокка с НК уже через 24 ч. Этот интересный феномен был обнаружен у всех тестируемых производственных штаммов бифидобактерий.

Изучение антагонистической активности бифидобактерий методом смешанных культур показало удобство количественного определения бифидобактерий в микробных сообществах с энтеробактериями с помощью среды Блаурокка с налидиксовой кислотой. Таким образом, при определении обратной антагонистической активности бифидобактерий при их совместном культивировании с тест-штаммами шигелл можно выявить не только возможность негативного действия патогенной микрофлоры на производственные штаммы in vitro, но и оценить в целом их взаимное влияние на протяжении всего срока совместного культивирования.

После анализа полученных результатов антагонистической активности производственных штаммов бифидобактерий было проведено исследование возможности изменения уровня антагонистической активности наименее активного из всех штаммов - B.bifidum 1 путем его кратковременного пассирования в условиях совместного культивирования с тест-штаммами шигелл.

Для изучения влияния совместного культивирования бифидобактерий с шигеллами на их антагонистическую активность было проведено несколько серий экспериментов по 10 пассажей с различными соотношениями засеваемых штаммов шигелл, посевных доз вносимых культур и варьировании времени их совместной экспозиции.

При культивировании бифидобактерий совместно с культурой шигелл (Shigella flexneri 170) при соотношении вносимых культур 1:1 и времени экспозиции 48 - 72 ч. (вариант 1), уровень антагонистической активности пассированного штамма против S.flexneri 170 и S.sonnei 5063, контролируемый по методике ФС, стал выре (с 87,6% живых клеток шигелл у исходного штамма до 50% - у пассированного, и с 31,6% у исходного штамма до 12,4% - у пассированного соответственно). Уровень антагонистической активности против S.flexneri 331 остался без изменений.

Обратная картина отмечена при соотношении вносимых культур 1:1. Было выявлено значительное уменьшение уровня антагонистической активности пассированного штамма против S.flexneri 170 и S.sonnei 5063 (с 7,7% выживших шигелл у исходного штамма до 32,6% - у пассированного и с 0,42% у исходного штамма до 82,1% - у пассированного соответственно), а уровень антагонистической активности против S.flexneri 331 остался без изменений.

Была обнаружена большая устойчивость пассированного штамма к антагонистическому действию шигелл при соотношении вносимых культур 1:1 уровень обратного антагонизма снизился). Она увеличилась в несколько раз по сравнению с исходным штаммом.

При соотношении вносимых культур по методике ФС было отмечено значительное увеличение прироста биомассы бифидобактерий как исходного, так и пассированного штаммов. Показатель активности кислотообразования этого пассированного штамма остался на прежнем уровне.

Установлено, что 48-часовая культура бифидобактерий (вар.1) при небольшой посевной дозе (1%) обладает большей антагонистической активностью, чем при внесении посевного материала в количестве 10% с тем же сроком выращивания, что и было обнаружено при данном варианте пассировании производственного штамма B.bifidum 1.

После проведения 10 пассажей производственного штамма как с Shigella flexneri 170 (вариант А), так и со смесью трех штаммов шигелл: Shigella flexneri 170, Shigella flexneri 331 и Shigella sonnei 5063 (вариант Б) (с засевом исходного производственного нггамма бифидобактерий вместе с культурой шигелл в пропорции 10:1 и временем экспозиции 24 ч) определяли уровень антагонистической активности полученных пассированных вариантов и активность кислотообразования.

После 48 ч совместной экспозиции с тест-штаммами шигелл нами была отмечена более выраженная устойчивость бифидобактерий варианта Б к действию шигелл - более, чем в 2 раза по сравнению с вариантом А при соотношении вносимых культур по ФС. Противоположная картина наблюдалась при s соотношении вносимых культур 1:1- устойчивость бифидобактерий варианта А к воздействию шигелл была выше в 100-400 раз, чем у варианта Б.

Степень антагонистической активности этих вариантов производственного штамма бифидобактерий сильно варьировала, что не позволило сделать вывод о каком-либо значительном ее изменении по сравнению с исходным штаммом. Уровень активности кислотообразования этих вариантов остался без изменений.

Проведен контроль антагонистической активности культуры бифидобактерий промежуточного III пассажа, полученной при пассировании варианта Б, с нетипичными для бифидобактерий кометообразными колониями (в ходе совместного культивирования при получении III пассажа время инкубации бифидобактерий с шигеллами составило 72 ч). При этом было установлено, что при малой дозе засева этот-штамм сильно подвержен действию шигелл, однако этого не наблюдали при совместном засеве культур в соотношении 1:1. Показатели антагонистической активности бифидобактерий III пассажа при всех соотношениях вносимых культур уже через 48 ч совместного культивирования намного превосходили уровень антагонистической активности исходного штамма B.bifidum I. Уровень активности кислотообразования этого варианта производственного штамма снизился по сравнению с исходным от (135,0+ 0,5) °Т до (85,5± 0,5) °Т.

Закономерность появления быстрорастущего варианта производственного / штамма B.bifidum 1 III пассажа была проверена путем однократного засева исходного штамма B.bifidum 1 в соотношении 0,1:1 совместно с тремя штаммами шигелл при экспозиции в течение 72 ч. Через 24 ч после пересева смешанной культуры на среду Блаурокка с НК было обнаружено появление нетипичных колоний бифидобактерий в виде тяжей.

При проведении контроля активности кислотообразования и антагонистической активности предположение о модифицирующем воздействии тест-штаммов шигелл на культуру бифидобактерий подтвердилось. Получены данные о сильной антагонистической активности бифидобактерий 1 пассажа уже через 48 ч совместного культивирования при всех соотношениях вносимых при засеве культур. При этом отмечено стимулирование роста бифидобактерий при контроле обратного антагонизма с помощью количественных высевов на среду Блаурокка с НК. Активность кислотообразования B.bifidum 1 I пассажа была ниже, чем у исходного штамма, и сходна с таковой у бифидобактерий B.bifidum 1 III пассажа.

Штаммы I и III пассажей оказались более аэротолерантными и росли на поверхности плотной питательной среды в анаэростате с Gas Pack. Благодаря появлению этого нового свойства был проведен контроль их антагонистической активности методом отсроченного антагонизма. При этом вновь подтвердилась высокая степень их антагонистической активности (зоны угнетения роста тест-культур сходны по величине с таковыми у производственных штаммов L.plantarum 8Р-АЗ и Lactobacterium acidophilus «Наринэ» 307/402).

Обнаружена зависимость между изменением активности кислотообразования, изменение которой выявлено у двух вариантов пассированных штаммов бифидобактерий, и их степенью антагонистической активности.

При сравнительном изучении уровня антагонистической активности бифидобактерий исходного штамма B.bifidum 1 и всех его пассированных вариантов через 72 ч после совместного культивирования с шигеллами (как требуют условия ФС) получено, что у всех новых вариантов исходного штамма изменился ее уровень в сторону увеличения (при соотношении вносимых культур 0,1:1,0). При соотношении вносимых культур 1:1 ее уровень изменился не значительно.

Таким образом, при различных условиях пассирования исходного производственного штамма бифидобактерий можно получить ряд новых его вариантов с отличными от исходного штамма свойствами.

Данный опыт получения пассированных вариантов исходного У производственного штамма бифидобактерий с целью увеличения его антагонистической активности может оказаться полезным при направленной селекционной работе, проводимой в специализированных лабораториях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Младзиевская, Юлия Артуровна, Санкт-Петербург

1. Абрамов Н.А., Иванов Д.Г., Ланских А.Г. Перспективы создания промышленной технологии микрокапсулированных препаратов эубиотиков // Всероссийская научно - практическая конференция, посвященная 100-летию основания

2. МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Дисбактериозы и эубиотики». Тезисыдокладов. Москва, 26 28 марта 1996 г. - М., 1996. - С. 2.

3. Алешукина А.В. Антииммуноглобулиновая активность бифидобактерий у мышей в процессе экспериментального дисбиоза // «Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования».

4. Международная научно-практическая конференция памяти Галины Ивановны Гончаровой. М., 2002. - С. 29-30.

5. Андреева М.А., Байбаков В.А. Молокеев А.В., Яцентюк P.M. и др. Питательная среда для производства жидкого концентрата бифидобактерий // Биотехнология. -1998.-№4.-С. 76-86.

6. Арчакова Е.Г. Совершенствование методов контроля специфической активности пробиотиков // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Пермь., 2004. - 16 с.

7. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов, нормализующих микрофлору кишечника // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. Горький, 1988.-С. 74-79.

8. Блинова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. - № 3. — С. 109-113.

9. Бубнов Н.В., Петров И.Г. Способ получения бифидумбактерина сухого: Пат. 2140787 Россия, МПК6, А61К 35/74 № 98105.

10. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова JI.M. Межбактериальные взаимодействия // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2003. - № 4. -С. 3-8.

11. Валышев А.В., Елагина Н.Н., Бухарин О.В. Анаэробная микрофлора женского репродуктивного тракта // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. -№ 4. - С. 78-84.

12. Вейнберг М., Гинсбург Б. Анаэробные микробы и их роль в патологии / Пер. с франц. под ред. М.Вейнберга и В Любарского. Гос. мед. издат. М., 1928. - 403 с.

13. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1999.-№ 6. -С. 102-105.

14. Гончарова Г.И. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни: Автореф. дисс. на соиск уч. ст. канд. биол. наук. М., 1970.

15. Евлашкина В.Ф., Чупринина Р.П., Скорикова И.Г., Лукьянова О.Ю., Рыбачок

16. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: Наука (Сибирское отделение). -1995.-600 с.

17. Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - № 5. - С. 98-104.

18. Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - № 4. - С. 72-78.

19. Габричевского. М., 1986 - С. 69-72.

20. Инструкция по микробиологическому контролю на предприятиях молочной промышленности. М., 1987.

21. Калинина Т.Э. Питательные среды для культивирования бифидобактерий (биохимические подходы к конструированию) // Автореф. дисс на соиск уч. степени канд. мед. наук. Ростов-на Дону, 1995. - 23с.

22. Карпушина С.Г., Тюрин М.В. Иванов А.А., Митрохин С.Д., Лившиц В.А. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерийиз кишечника человека // Биотехнология. 1998. - № 2. - С. 28-36.

23. Квасников Е.А. Биология молочнокислых бактерий. Ташкент, 1960. С. 30-33.

24. Кигель Н.Ф. Новый бактериальный препарат «АФ» на основе молочнокислых бактерий и его биологические свойства // Мкробюл.ж. 2000. - 62. - № 3. -С. 49-55.

25. Конькова Н.К. Пути усовершенствования питательных сред, используемых в технологии производства медицинских и ветеринарных пробиотиков: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Нижний Новгород, 2002. 21с.

26. Коршунов В.М., Гудиева З.А., Ефимов Б.А., Пикина А.П., Смеянов В.В., Reid G. и др. Изучение бифидофлоры влагалища у женщин репродуктивного возраста // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 4. - С. 74-78.

27. Коршунов В.М., Ефимов Б.А. Пикина А.П. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. -№3.-С. 86-91.

28. Коршунов В.М., Уртаева З.А., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. и др. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованиемгнотобиотической технологии // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1999.-№5.-С. 72-77.

29. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей. М. 1991.

30. Тезисы докладов. Москва, 26-28 марта 1996 г. -М., 1996. С. 23.

31. Lebental Е., Lebental Y. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2003.-№4.-С. 88-90.

32. Лесняк С.В., Евтухова Л.Н., Королева А.И., Халенева М.П., Кокорина Т.А. Разработка и изучение референс-препарата бифидумбактерина // Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. Сборник научных трудов. М.,1982. - С. 114-118.

33. Лесняк С.В., Евтухова Л.Н., Шимчук Л.Ф. О свойствах препаратов из нормальной микрофлоры человека // В кн.: Антибиотики и микроэкология человека и животных. М., 1998. - С. 136-140.

34. Липатов Н.Н., Барышникова Е.П., Сажинов Т.Ю., Щербакова Э.Г. Биотехнологические подходы к совершенствованию качества кисломолочных продуктов для специализированного питания // Хранение и переработка сельхозсырья. 1998. -№ 12.-С. 9-11.

35. С.-Петербург, 2003. СПб., 2003. - С. 170.

36. Лянная A.M., Левченко Т.А. Штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513, используемый для получения бифидосодержащих препаратов-эубиотиков и продуктов лечебно-диетического питания:

37. Пат. 2120991 Россия, МПК6 C12N 1/20,1. А61К 35/74.

38. Максимов В.И., Бондаренко В.М., Родомаи В. Е. Влияние пектина намикрофлору желудочно-кишечного тракта // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1988. - № 6. - С. 107-108.

39. Методические рекомендации по микробиологической диагностике дисбактериозов кишечника в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота. Министерство обороны Российской Федерации. Главное военно-медицинское управление. СПб., 1999. - 35 с.

40. Методические рекомендации по микробиологической диагностике раневых инфекций в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота. Министерство обороны Российской Федерации. Главное военно-медицинское управление. СПб., 1999.-75 с.

41. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. МУК 4.1/4.2. 588-96. М., 1996.

42. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов. МУК 4.2.577-96. М., 1996.

43. Молокеев А.В., Молокеева Н.В., Ильина P.M. Способ получения возрастоспецифических бифидопрепаратов: Пат. 2142234 Россия, МПК6 А23С 9/12, А61К 35/74.

44. Молокеев А.В., Никулин Л.Г., Ильина P.M., Криницина Э.В. и др. Препарат -пробиотик в сухой иммобилизованной форме: Пат 2164801 Россия, МПК7 А61К 35/74, А2СС 9/12, № 99125163/13.

45. Морев С.И., Зубков В.В. Влияние пектина на состав микрофлоры кишечника при дисбактериозе // В кн.: Колонизационная резистентность и химиоте-рапевтические антибактериальные препараты (ред. Шендеров Б.А.). М., 1988. -4.2. - С. 290.

46. Мурашова А.О., Ланских А.Г., Баснакьян И.А. Усовершенствование процесса выращивания бифидобактерий в биореакторе для получения лиофилизированнойпосевной культуры // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - № 6. - С. 80-82.

47. Несчисляев В.А. Способ получения суппозиториев бактерийных препаратов для коррекции дисбактериозов: Пат. 2132690. Россия, МПК6 А61К 35/74, A61J 3/08. №97101527/13.

48. Нисевич Н.И., Гаспарян М.О., Новокшенов А.А., Портнов О.Ю. и др. Применение ударных доз бифидумбактерина форте при острых кишечных инфекциях у детей // Terra Medica. 1999. - № 1. - С. 30-31.у

49. Новик Г.И., Астапович Н.И., Богдановская Ж.Н., Рябая Н.Е. Получение лечебно-профилактического препарата энтеробифидин на основе Bifidobacterium adolescentis МС-42 // Приклад, биохимия и микробиол. 2000. - 36. - № 1. -С.104-110.

50. Новик Г.Н., Астапович Н.И, Кадникова Н.Г., Рябая Н.Е. Сохранение жизнеспособности и физиологических свойств бифидобактерий при криоконсервировании и лиофилизации // Микробиология. 1998. - Т. 67. - № 5. -С. 637-643.

51. Новик Г.И., Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Сохранение жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при субкультивировании // Микробиология. 1998. - 67. - № 5. - С. 631-636.

52. Новик Г.И., Астапович Н.И"., Самарцев А.А. Рябая Н.Е. Бифидобактерии: итоги и перспективы исследований // Микробиология и биотехнология на рубеже 21 столетия: Материалы международной конференции. Минск, 1-2 июня, 2000. -Минск, 2000. С. 68-69.

53. Осипова И.Г., Терешкина Н.В., Григорьева JI.B. Евлашкина В.Ф. Изучениебезопасности бифидобактерий, составляющих основу некоторых пробиотиков //

54. Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перепективы использования». Международная научно-практическая конференция памяти Галины Ивановны Гончаровой. М., 2002. М., 2002. - С. 16-17.

55. Поспелова В.В., Рахимова Т.Н., Ханина Г.И., Халенева М.П. Принципы разработки фармакопейных форм бактерийных препаратов для коррекции микрофлоры организма человека // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. Горький, 1988. - С. 85-92.

56. Римарчук Г.В. Эффективность использования живых концентрированных лактобактерий (ЖКЛ) и живых концентрированных бифидобактерий (ЖКБ) // Medicina altera. 2001. - Апр. - С. 21-24.

57. Родоман Н.А., Максимов В.И., Кузьменко Л.Г., Петрук М.Н. и др. Применение лактусана для коррекции микроэкологических нарушений кишечника у детей // Журнал микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2002. - № 1. - С. 68-86.

58. Рожкова И.Ю., Кравцов Э.Г., Лившиц В.А., Ленцнер А.А. Штамм бактерий Lactobacillus fermentum 90-TS-4(21), используемый для получения эубиотического препарата для применения в гинекологической практике: Пат.2133272 Россия, МПК6 C12N 1/20, А61К 35/74.

59. И.И.Мечникова, НПО «Иммунопрепарат». Уфа, 1995. - 4.1. - С. 182-186.

60. Середина Е.Ю. Клинико-лабораторное обоснование применения нового пробиотика у детей раннего возраста при диареях: Автореф. дисс. на соиск. уч. степ канд. мед. наук. М., 2002.-24с.

61. Смирнов В.А., Сорокулова И.Б. Пробиотики на основе живых культур микроорганизмов // Мпсробюл. ж. 2002. - 64. - № 4. - С. 62-80.

62. Соколова К.Я. Усовершенствование метода изучения микробиоценозов //Сборник научных трудов /Нижегор. НИИ эпидемиологии и микробиологии. -1991.-№3.-С. 37-45.

63. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М.: «Наука», - 1964. - 415 с.

64. Фармакопейная статья на Бификол сухой. ФС 42-3268-96.

65. Фармакопейная статья на Бифидумбактерин сухой. ФС 42-3947-00.

66. Фармакопейная статья на Лактобактерин сухой. ФС 42-0054-00.

67. Храмцов А.Г., Виноградская С.Е., Рябцева С.А., Лодыгин А.Д. и др. Способ получения бифидумбактерина: Пат. 2160594 Россия, МПК7 А61К 35/74, А23С 9/12, №99117287/13.

68. Чешева В.В., Манвелова М.А. Питательные среды для культивирования бактерий. Обзор литературы // Проблемы медицинской биотехнологии и иммунологии инфекционных болезней. Сборник научных трудов. М., 1996. - Т.П. - С. 84-90.

69. Гончаровой. М., 2002. М., 2002. - С. 13.

70. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. -М., Грантъ, 2001.-287 с.

71. ИЗ. Шендеров Б.А., Манвелова М.А. Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы: Пат. 2139070. Россия, МПК61. А61К 35/74 C12N 1/20.

72. Beneficial Bacteria Breakthrought in new «Optiflora»Technicology Friendly Bacteria Promote Colon Health // Bisiness Wire, (12 November 1998). P. 0270.

73. Bengmark. S. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora //GUT. 1998;42:2-7.

74. Bernandeau M., Vernoux J.P., Gueguen M. Probiotic properties of two1.ctobacillus strains in vitro // Milchwissenschaft. 2001. - 56. - № 12. - P. 663.

75. Bezkorovainy A. Probiotics: determinants of survival and growth in the gut //

76. American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 2. - P. 399-405.

77. Bandaru R.S. Possible mechanisms by which pro- and prebiotics influence colon carcinogenesis and tumor growth // Journal of Nutrition. 1999. - 129. - P. 1478-1482.

78. Bongaerts G.P.A., Severijnen R.S.V.M. The beneficial antimicrobial effect of probiotics // Med.Hypotheses. 2001. - 56. - № 2. - P. 174-177.

79. Bunthof C.J., Abee T. Development of a flow cytometric method to analyze subpopulations of bacteria in probiotic products and dairy starters // Applied and Environmental Microbiology. June 2002. - Vol. 68. - No. 6. - P. 2934-2942.

80. Cebra J.J. Influences of microbiota on intestinal immune system development // American Journal of Clinical Nutrition. 1999. - Vol. 69. - No. 5. - P. 1046-1051.

81. Collins D.M., Gibson G.R. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches formodulating the microbial ecology of the gut // American Journal of Clinical Nutrition. 1999. Vol. 69. - No. 5. - p. 1052-1057.

82. Collins F.M., Carter P.B. Growth of salmonellae in orally infected germ free mice // Infect. Immun. 1978. - 21. - P. 41-47.

83. Crittenden R., Laitila A., Forssell P., Matto J. et al. Adhesion of Bifidobacteria to granular starch and its implications in probiotic technologies // Applied and Environmental Microbiology. 2001. - Vol. 67. - No. 8. - P. 3469-3475.

84. Discovery of immunity rasing bifidus bacteria // Techno Jap. 1995. - 28. - No. 8. -P. 110.

85. Discussion on probiotics and prebiotics // American Journal of Clinical Nutrition. — 2001. Vol. 73. - No. 2. - P. - 484-486.

86. Dunne С., O'Mahony L., Murphy L., Thornton G. et al. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings //American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 2. - P. 386-392.

87. Dunne C., Murphy L., Flynn S., O'Mahony L. et al. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials // Antonie Van Leeuwenhoek. 1999. - Jul-Nov. - 76(1-4). - P. 279-92.

88. Fuller R. Probiotics in man and animals // J Appl Bacteriol. 1989. - May. - 66(5).1. P. 365-378.

89. Gibson G.R., Fuller R. Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use // Journal of Nutrition. -2000.- 130.-P. 391-395.

90. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics// JNutr.- 1995.-Jun. 125(6).-P. 1401-1412.

91. Gibson G.R., Wang X. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria // J Appl Bacteriol. 1994. - Oct. - 77(4). - P. 412-420.

92. Greene J.D, Klaenhammer T.R. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol 60. - No. 12. -P. 4487-4494.

93. Gyan В., Azadian B.S., Dunwoody G.W., P.G. Richards. Epidural abscess due to

94. Streptococcus milleri and Bifidobacterium species letter. // J.Infect. 1991. V.2. - № 2. -P. 214-215.

95. Hatakka K., Savilahti E., Ponka A., Meurman J.H. et al. Effect of long term consumption of probiotic milk on infections in children attending day care centres: double blind, randomised trial // BMJ. 2001. - 322. - No. 2. - P. 1327.

96. Harty D.W.S., Oacey H.J., Patrikakis M. et al. Pathogenetic potencial of lactobacilli // Intern.J.Food.Microbiol. 1994. - V.23. - № 1/2. - P. 179-189.

97. Heller K.J. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristics and starter organisms // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 2. -P. 374-379.

98. Holzapfel W.H., Haberer P., Geisen R., Bjorkroth J. et al. Taxonomy and importantfeatures of probiotic microorganisms in food and nutrition // American Journal of

99. Clinical Nutrition. 2001. Vol. 73. - No. 2. - P. 365-373.

100. Ishibashi A., Shimamura S. Bifidobacteria: Research and Development in Japan // FoodTechnol.- 1993.-47.-№ 6.-P. 126-136.

101. Isolauri E., Moreau M.C., Roberfroid M., Rowland I. Functional food science and gastrointestinal physiology and function // Br J Nutr. 1998. - Aug. -80 Suppl. - 1. -P. 147-171.

102. Isolauri E., Sutas Y., Kankaanpaa P., Arvilommi H. et al. Probiotics: effects on immunity // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 2.s1. P. 444-450.

103. Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 2. - P. 465-470.

104. Jenkins D.J.A., Kendall C.W.C., Vuksan V. Inulin, oligofructose and intestinal function // Journal of Nutrition. 1999. - 129. - P. 1431-1433.

105. Kalantjopoulos G. Fermented products with probiotic qualities // Anaerobe. 1997. -3. - № 2-3. - p. 185-190.

106. Kaplan H., Hutkins R.W. Fermentation of fructooligosaccharides by lactic acid bacteria and bifidobacteria // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - Vol. 66. - No. 6. - P. 2682-2684.

107. Kirjavainen P.V., Arvola Т., Salminen S.J., Isolauri E. Aberrant composition of gut microbiota of allergic infants: a target of bifidobacterial therapy at weaning? // Gut. -2002.-51.-P. 51-55.

108. Kirjavainen P.V., Quwehand A.C., Isolauri E., Salminen S. The ability of probiotic bacteria to bind to human intestinal mucus // FEMS Microbiol Lett. 1998. - Oct. -15.- 167(2).-P. 185-1899.

109. Klaenhammer T.R. Probiotic bacteria: today and tomorrow // Journal of Nutrition. -2000.- 130.-P. 415-416.

110. Klein G., Pack A., Bonaparte C., Reuter G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria // Int J Food Microbiol. 1998. - May. - 26. -41(2). - P. 103-125.

111. Kok R.G., de Waal A., Schut F., Welling G.W. et al. Specific detection and analysis of a probiotic Bifidobacterium strain in infant feces // Appl. Environ. Microbiol. Vol 62. - No. 10. - 1996. - P. 3668-3672.

112. Korhonen H. Lactic acid bacteria and immune response: Abstr.l7th lnd Congr.

113. Microb.Ecol. and Disease, Helsinki, 28 29 Aug., 1992 // Microb. Ecol. Health and

114. Disease. 1992. - 5. - № 6. - P. IV.

115. Lilly D.M., Stillwell R.H. Probiotics. Growth promoting factors produced by microorganisms // Scince. 1965. - 147. - P. 747-748.

116. Lindsey Edmunds. Probiotics as medical therapies // CMAJ. 2001. - November 27. -2001.- 165 (11).

117. Lu L., Walker W.A. Pathologic and physiologic interactions of bacteria with the gastrointestinal epithelium // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. -No. 6.-P. 1124-1130. '

118. Luchansky J.B., Tsai Shu-Jean; Wisconsin Alumni Research Foundation. Probiotic bifidobacterium strain: Пат.5902743 США, МПК6 С12 N 1/00, С12 N1 /20. № 09/04533246.

119. Mackie R.I., Sghir A., Gaskins H.R. Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract // American Journal of Clinical Nutrition. 1999. -Vol. 69.-№.5.-P. 1035-1045.

120. Majamaa H., Isolauri E. Probiotics: a novel approach in the management of food allergy // J Allergy Clin Immunol. 1997. - Feb. -99(2). -P. 179-185.

121. Mangin I., Bourgen N., Bournik Y., Basetti N. et al. Identification of Bifidobacterium streins by r RNA gene restriction patterns // Appl. and Environ.

122. Microbiol. 1994. - 60. - № 5. - P. 1451-1458.

123. McCartney A.L, Wenzhi W., Tannock G.W. Molecular analysis of the composition of the bifidobacterial and lactobacillus microflora of humans // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol 62. - No. 12. - P. 4608-4613.

124. Medhrous J., Euloge P., Juneeles A.M, Ballongue J. et al. Screening of Bifidobacterium straines for bacteriocin production // Biotechnol.Lett. 1990. - 12. -№8.-P. 575-580.

125. Mlobeli N.T., Gutierrez N.A., Maddox I.S. Physiology and kinetics of Bifidobacterium bifidum during growth on different sugars // Appl. Microbiol.and Biotechnol. 1998. - 50. - № 1.

126. Natural Brand Nutraflora FOS Fructooligosaccharides Dietari Supplement Capsules, Powder// Product Alert. 13 Jan. - 1997.

127. Nebra Y., Blanch A.R. A new selective medium for Bifidobacterium spp. // Applied and Environmental Microbiology. November 1999. - Vol. 65. - No. 11. - P. 5173-5176.

128. Oberhelman R.A., Gilman R.H., Sheen P., Taylor D.N. et al. A placebo-controlled trial of Lactobacillus GG to prevent diarrhea in undernourished Peruvian children // J Pediatr. 1999. - Jan. - 134(1). - P. 15-20.

129. O'Sallivan DJ. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria // Agr. and Food. Chen. 2001.-49. - № 4. - P. 1751-1760.

130. Ouwehand A.C., Salminen S. Adhesion properties to characterize probiotics: Abstr.23th International Congress of Microbial Ecology and Disease, San Francisco, Calif., Sept.22nd 24th, 2000 // Microb.Ecol.Health and Disease. - 2000. - 12. - № 2. -P. 113.

131. Ouweland A., Salminen S. Prebiotics and probiotics; safety aspects and rise assessment: Abstr.l3th Int. Symp. Gnotobiol., Stockholm, June 19-24. 1999 //Microb. Ecol. Health and Disease. - 1999. - 11. - № 2. - P. 109.

132. Parker R.B. Probiotics, the other half of the antibiotic story // Anim. Nutr. Health. -1974.-29.-P. 4-8.

133. Pereira D.I.A., Gibson G.R. Cholesterol assimilation by bifidobacteria isolated from the human gut // Applied and Environmental Microbiology. 2002. - Vol. 68. - No. 9. -P. 4689-4693.

134. Perez P.F., Minnaard Y., Disalvo E.A., De Antoni L et al. Surface Properties of Bifidobacterial Strains of Human Origin // Appl Environ Microbiol. 1998. - January. -Vol. 64.-No. 1.-P. 21-26.

135. Pessi Т., Siitas Y., Marttinen A., Isolauri E. Probiotics reinforce mucosal degradation of antigens in rats: implications for therapeutic use of probiotics // The Journal of Nutrition. 1998. - Vol. 128. - No. 12. - P. 2313-2318.

136. Rada V. Detection of Bifidobacterium species by enzymatic methods and antimicrobial suspectibility testing // Biotechnol. Techn. 1997. - 11. - № 12. -P. 909-912.

137. Rasic G.L., Kurmann G.A. Bifidobacteria and their role: microbiological, nutrional physiological, medical and technological aspects and bibliography.-Basel - Boston -Stuttgart: Birkhauser Verlad. - 1983. - 295 p.

138. Reid G. The scientific basis for probiotic strains of Lactobacillus // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - Vol. 65, No. 9. - P. 3763-3766.

139. Reid G. Probiotic agents to protect the urogenital tract against infection // American Journal of Clinical Nutrition. 2001 - Vol. 73. - No. 2. - P. 437-443.

140. Reid G., Jass J., Sebulsky M.T., McCormick J.K. Potential Uses of Probiotics in Clinical Practice // Clinical Microbiology Reviews. October 2003. - Vol. 16. - No. 4. -P. 658-672.

141. Roberfroid M.B. Concepts in functional foods: the case of inulin and oligofructose // Journal of Nutrition. 1999. - 129. - P. 1398-1401.

142. Rolfe R.D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health // J Nutr 2000. - 130. - No. 2 Suppl. - P. 396-402.

143. Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J. et al. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties // J Biotechnol. 2000. - Dec. 28. - 84(3). -P. 197-215.

144. Saito Y. Metabolism of soybean oligosaccharides in the intestine // J. germfree life gnotobiol. 1992. - V.22. - № 1. - P. 13-17.

145. Salminen S. Uniqueness of probiotic strains // IDF Nutr. News Lett. 1996. - 5. -P. 16-18.

146. Salminen S., Bouley C., Boutron-Ruault M.C., Cummings J.H. et al. Functional food science and gastrointestinal physiology and function // Br J Nutr. 1998. - Aug. -80 Suppl. - 1.-P. 147-171.

147. Salminen S., von Wright A., Morelli L. et al. Demonstration of safety of probioticsa review // Int. J. Food. Microbiol. 1998. - V.44. - P. 93-106.

148. Sanders M.E. Considerations for Use of Probiotic Bacteria to Modulate Human Health // Journal of Nutrition. 2000 - 130. - P. 384-390.

149. Schaafsma G. State of art concenting probiotic strains in milk products // IDF Nutr. News Lrtt. 1966. - 5. - P. 23-24.

150. Schiffrin E.J., Brassart D., Servin A.L., Rochat F. et al. Immune modulation of blood leukocytes in humans by lactic acid bacteria: criteria for strain selection // American Journal of Clinical Nutrition. 1997. - Vol 66. - P. 515-520.

151. Schrezenmeier J., de Vrese M. Probiotics, prebiotics, and synbiotics approaching a definition // Am. J. Clin. Nutr. - 2001. - 73 (suppl). - P. 361-364.

152. Sperti G.S. Probiotics // West Point, CT: Avi Publishing Co. 1971.

153. Stanton C., Gardiner G., Meehan H., Collins K. et al. Market potential forprobiotics // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 2. - P. 476-483.

154. Stephen P.M. Immunoglobulin and fiber-containing composition for human gastrointestinal health:'Пат. 5531989 США, МПК6 A01N 63/04, A61K 35/00. -№437316.

155. Suskovik J., Kos В., Goreta J., Matosik S. Role of lactic acid bacteria and bifidobacteria in symbiotic effect // Food Technol. and Biotechnol. 2001. - 39. - № 3. -P 227-235.

156. Tannock G. W. Molecular assessment of intestinal microflora // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 2. - P. 410-414.

157. Temmerman R., Scheirlinck I., Huys G., Swings J. Culture-independent analysis of probiotic products by denaturing gradient gel electrophoresis // Applied and Environmental Microbiology. January 2003. - Vol. 69. - No. 1. - P. 220-226.

158. Tilsala-Timisjarvi A., Alatossava T. Strain-specific identification of probiotic Lactobacillus rhamnosus with randomly amplified polymorphic DNA-derived PCR primers // Applied and Environmental Microbiology. 1998. - Vol. 64. - No. 12. -P. 4816-4819.

159. Tissier H. Recherches sur la flora intestinal des nourrissons // Theres Paris. 1900. -P. 1-253.

160. Tuomola E., Crittenden R., Playne M., Isolauri E., Salminen S. Quality assurance criteria for probiotic bacteria // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. -No. 2.-P. 393-398.

161. Tuomola E., Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J. et al. Overview of gut flora and probiotics // Int J Food Microbiol. 1998. - May. - 26. - 41(2). - P. 85-101.

162. Tuomola E.M., Salminen S.J. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures // Int J Food Microbiol. 1998. - May. - 41(1). - P. 45-51.

163. Van de Water J., Keen C.L., M. Gershwin E. The influence of chronic yogurt consumption on immunity // Journal of Nutrition. 1999. - 129. - P. 1492-1495.

164. Vanderhoof J.A. Probiotics: future directions // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. - Vol. 73. - No. 6. - P. 1152-1155.

165. Ventura M., Meylan V., Zink R. Identification and tracing of Bifidobacterium species by use of enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences // Applied and Environmental Microbiology. 2003. - Vol. 69. - No. 7. - P. 4296-4301.

166. Ventling B.L., Mistry V.V. Growth and activity of Bifidobacteria in ultrafiltered milk//J. Dairy Sci. 1991.-74. - № l.-Suppl.-P. 82.

167. Ventura M., Zink R. Rapid identification, differentiation, and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis // Applied and Environmental Microbiology. December 2002. - Vol. 68. - No. 12. - P. 6429-6434.

168. Walker W.A. Introduction // American Journal of Clinical Nutrition. 2001. -Vol. 73.-No. 6.-P. 1121-1123.

169. Zhong W., Millsap K., Bialkowska-Hobrzanska H, Gregor R. Differentiation of Lactobacillus species by molecular // Appl Environ Microbiol. July 1998. - Vol. 64. -No. 7. - P. 2418-2423.

170. Yeung P.S, Sanders M.E., Kitts C.L., Cano R. Species-specific identification of commercial probiotic strains // Journal of Dairy Science. 2002.— Vol 85. - Issue 5. -P. 1039-1051.

Информация о работе

Младзиевская, Юлия Артуровна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и лактобацилл - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы