Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка питательных сред и процесса непрерывного культивирования бифидобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка питательных сред и процесса непрерывного культивирования бифидобактерий"

На правах рукописи

КРИТСКАЯ Ирина Владимировна

РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ПРОЦЕССА НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ

(03.00.07-"микробиология")

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

ст от

«5Г

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологических наук.

профессор Баснакьян И.А. кандидат биологических наук Гиршович Е.С.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук

профессор

Лиходед В.Г.

доктор биологических наук Блинкова Л.П.

Ведущая организация- Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится 20 ноября 1997 г ъ ¡4 часов на заседании диссертационного совета Д 001.38.01 при НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 103064, г.Москва, Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан Д^ октября 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н.

Кудрявцева Н.Г.

ВВЕДЕНИЕ

В проведенных в последние годы исследованиях, посвященных изучению микрофлоры кишечного тракта, большое внимание уделяется анаэробной 'рамположительной флоре, в том числе бифидобактериям, которые являются феобладающими микроорганизмами микрофлоры кишечника. В настоящее вре-1Я доказана их защитная роль, антагонистическая, витаминообразующая и Ферментативная функции (Gibson G., et.al.,1995).

Одним из патогенетических факторов, определяющих длительные ки-]ечные дисфункции является отсутствие или резкое снижение количества >ифидобактерий в кишечнике детей и взрослых, что может служить крите-жем при оценке степени и глубины дисбактериоза (Беюл Е.Ф.,1989). Поэтому в общепринятой методике исследований на дисбактериоз, количест-¡енная оценка содержания бифидобактерий является обязательной.

Эффективность диагностики, профилактики и лечения дисбактериозов, 1 также научных исследований по этой проблеме в первую очередь опреде-шется качеством питательных сред для выделения и количественной ха-)актеристики бифидобактерий, наработкой биомассы производственных 1таммов бифидобактерий и контролем их жизнеспособности в готовых пре-1аратах (Ворошилина H.H.,1975).

Известны среды, предложенные зарубежными авторами - среда для вычленяя и учета бифидобактерий ( ВIM-25 - Munoa,Pares, 1988), среда (ля выращивания бифидобактерий ( TPY - Sgorbat, Scardov, 1982) и ряд фугих. Однако эти среды являются многокомпонентными, в их состав вхо-;ят дорогостоящие реактивы и основы (цистин, твин, фитон, триптиказа и 1Р-).

В нашей стране лучшей питательной средой для выделения бифидобактерий считается среда Блаурокка в модификации Г.И.Гончаровой (Гончаро-¡а Г.И.,1987). Однако в связи с отсутствием возможности получать эту :реду, изготовленную промышленным способом, многие бактериологические Моратории вынуждены готовить ее сами, используя нестандартную печень :ельскохозяйственных животных, подвергавшихся интенсивной и длительной ¡етеринарной обработке кормовыми антибиотиками. Это приводит к ухудше-!ию качества питательных сред.

Исходя из литературных данных, теоретически обоснована и практи-[ески подтверждена необходимость восстановления высокого уровня бифи-юфлоры в кишечнике больных (при дисбактериозах различной этиологии) v ¡доровых людей . Для этого рационально создание и применение бактери-шьных препаратов, содержащих бифидобактерии, так как именно эти преврати способствуют восстановлению бифидофлоры и нормализации аутофло-

ры в целом, что обеспечивает эффективность терапии при различных фор мах патологических состояний кишечника (Гончарова Г.И. и соавт., 1987 Дорофейчук В.Г. и соавт., 1991, Saavedra J.,et.al., 1994).

Одним из самых эффективных средств коррекции дисбактериозов явля ется препарат бифидумбактерин (Грачева Н.М. и соавт.,1986).

В настоящее время сферы его применения значительно расширены (комплексная терапия кишечных инфекций, гнойно-септические заболевания пневмонии, гепатиты и другие патологические состояния, осложненнь дисбактериозом) ( Коршунов В.М.,и соавт. 1986, Bertassoni М. et.al. ,1994),

Это определяет необходимость поиска методов, повышающих эффектш ность наработки биомассы бифидобактерий и степень жизнеспособной микробной популяции. Поэтому актуально изыскание оптимальных услов! культивирования бифидобактерий, обеспечивающих получение максималы эффективного и стабильного препарата (Зацепин Ю.К.,1986 , Hages D. et.al., 1991)

До настоящего времени в производстве лечебных препаратов с биф! добактериями применяется метод периодического культивирования, котор; имеет ряд недостатков. К этим недостаткам относятся большое количеств нежизнеспособных и покояидахся особей , постоянное и интенсивное нака) ливание продуктов жизнедеятельности, ингибирующих рост ( в частност] продуктов , вызывающих сильное закисление культуры). С другой сторон] при периодическом культивировании популяция находится в состоянии, о: тимальном по количеству живых клеток, только в начале малого промежу! ка времени фазы экспоненциального роста. Получаемый таким образом пр парат представляет собой физиологически неоднородную популяцию бакт рий. Это отражается на жизнеспособности и выживаемости микробов, вв денных в кишечный тракт человека, что снижает терапевтическую ценное препарата. Более перспективным методом получения биомассы с заран заданными свойствами является процесс управляемого непрерывного кул тивирования, который позволяет получать биомассу со стабильными биол гическими свойствами ( Баснакьян И.А., 1992). Сведений о подобных пр цессах культивирования бифидобактерий в доступной нам литературе мы встречали .

Кроме того, в нашей стране до настоящего времени, не существу стандартной питательной среды для накопления биомассы бифидобактерий

Целью настоящей работы является разработка процесса непрерывного культивирования бифидобактерий и питательных сред для выделе-

1 и наработки их биомассы.

Задачи исследования:

1. Разработать сухую питательную основу, пригодную для конструирования питательных сред для культивирования бифи-добактерий;

2. Разработать составы чувствительных питательных сред для выделения и культивирования бифидобактерий;

3. Изучить морфологические, культуральные, биохимические и физиологические свойства бифидобактерий при их выращивании в разработанных средах;

4. Изучить кинетику роста бифидобактерий в средах различного состава.

5. Сконструировать питательную среду для накопления биомассы бифидобактерий с оптимальным содержанием сухих питательных основ серии "Бактофок".

6. Изучить возможность применения сконструированной среды в процессах периодического и непрерывного культивирования бифидобактерий в колбах и в биореакторах.

7. Разработать процесс непрерывного культивирования бифидобактерий, наработать их биомассу и изучить ее свойства.

Научная новизна настоящей работы состоит в следующем:

1.Впервые разработаны стандартные сухие питательные основы, полу-энные из непищевого сырья (мясо-костного и печеночного фарша тюленя), ригодные для конструирования питательных сред для выделения и накоп-эния биомассы бифидобактерий.

2.Разработан процесс непрервного культивирования бифидобактерий, оказана целесообразность его применения при производстве биомассы, по войствам не уступающей или превосходящей биомассу коммерческого бифи-умбактерина.

3.Получены новые знания о физиологических и культуральных свойс-вах бифидобактерий при их выращивании в средах различного состава и в роцессе непрерывного культивирования в биореакторе.

Практическое значение работы определяется большой потребностью [едицинских учреждений в питательных средах для диагностики дисбакте-жозов, в том числе и в питательной среде для выделения бифидобакте-

)ИЙ.

В результате проведенных исследований разработана рецептура высо-

кочувствительной среды, обеспечивающей повышение точности микробиоло гических анализов на дисбактериоз ; отработана методика непрерывног управляемого культивирования бифидобактерий с использованием новой пи тательной среды, что может позволить повысить выход и жизнеспособност биомассы при производстве бифидосодержащих препаратов.

Положения, выносимые на защиту. 1.Новая питательная среда для вы деления бифидобактерий; 2. Новая питательная среда для культивировали бифидобактерий; 3.Процесс управляемого непрерывного культивировали бифидобактерий в разработанной среде.

Апробация работы. Диссертация апробирована на научной конференщ отдела микробиологии условно-патогенных бактерий НЖВС им. И.И.Мечни кова РАМН 20 мая 1997 г, отдельные фрагменты работы доложены на конфе ренции молодых ученых НШВС им.И.И.Мечникова (1995 г) и 5 Всероссийс кой конференции "Научные основы технологии промышленного производсть ветеринарных биологических препаратов" (1996 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, получено авторское свидетельство N1705341 (список приводится в конце авторефе рата).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 3 глг обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, вь водов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложе* на стр. ¡!)0 машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 27 тг лицами.

В работе использовано 90 отечественных и 76 зарубежных источнике литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ.

Объекты исследований.

Микробные тест-штаммы. Испытания образцов питательных сред и м< тодов культивирования микробов проводили с использованием произволе твенных, перспективно-производственных и музейных тест-штаммов бифидс бактерий, полученных в лиофилизированном виде из музеев МНИИ; им.Г.И.Габричевского и ГИСК им.Тарасевича . Использовались тест-штам) видов: Bifidobacterium bifidum ( ЛВА-3; 1; 791), Bifidodacterium lot gum (379М;Я-3), Bifidobacterium adolescentis (Г0-13).

Сырье для приготовления питательных сред.

- ч -

Основы микробиологических питательных сред серии "Бактофок", [редставляющие собой сухие ферментативный гидролизаты средней средней :тепени расщепления печеночного, мясо-печеночного и мясо-костного фар-зей (соответственно) промысловых видов морского зверя .

Процессы культивирования бифидобактерий.

Для изучения кинетики роста микроорганизма в средах различного состава мы использовали автоматизированный микробиологический анализа-rop "Bioscreen" ("Labsystems" Финляндия). В работе применена программа 'Bioscreen" версия 4.1 с изменяемыми параметрами.

Процесс периодического культивирования микроорганизма проводили в •солбах.

Процессы непрерывного культивирования проводили в биореакторах "Анкум-2М" (Россия) и "Marubishi" (Япония).

Методы исследования.

Физико-химические методы.

1. Определение прозрачности и цветности препаратов серии "Бактофок".

Определение цвета раствора препарата определяли визуально при сравнении 5 мл 2,0 % раствора, помещенного в пробирку с дистиллированной водой.

Испытание на прозрачность производили при освещении электрической лампой матового стекла мощностью 40 Вт на черном фоне при вертикальном расположении пробирки.

2. Растворимость определяли кипячением определенной навески препарата в 100 мл дистиллированной воды в течение 1-2 минут.

3. Содержание аминного азота определяли методом формольного титрования .

4. Содержание хлоридов определяли методом аргентометрии.

5. рН определяли потенциометрически с использованием стеклянногс электрода.

6. Остаточную влажность определяли методом высушивания в сушильном шкафу при 105° С.

Бактериологические методы.

Для контроля качества экспериментальной среды были использовань следующие тесты:

-чувствительность среды к росту тест-штаммов,

-количество живых клеток в 1 мл культуры бифидобактерий, выращен-

ной в экспериментальной среде (эффективность),

-стабильность биологических свойств ( типичность морфологии коло ний; морфологических и тинкториальных свойств клеток; кислотообразова ние; антагонистическая активность в отношении некоторых патогеннь тест-штаммов энтеробактерий; наличие ферментов: желатиназы, каталазь способность к газообразованию).

- клинические испытания среды проводились по методикам, изложен ным в "Методах диагностики дисбактериозов кишечника " (Москва 1986 г) • Определение показателей роста микроорганизмов при периодическом непрерывном культивировании.

При культивировании с помощью прибора "Bioscreen", применяли рг бочую программу, в которой оптическая плотность культуры выражалас коэффициентом поглощения световых лучей - абсорбцией (ABS).

При культивировании в колбах и ферментерах оптическую плотное! культуры определяли с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК-56М) при з( леном светофильтре и выражали в единицах экстинкции (ext; lg ext).

Длительность лаг-фазы и экспоненциальной фазы определяли граичес ки и измеряли в часах. Максимальную удельную скорость роста и миш мальное время генерации микроорганизмов определяли по общепринят! формулам.

Количество живых клеток определяли в разные сроки периодическоз и непрерывного культивирования по числу КОЕ (колониеобразуюищх един: в 1 мл суспензии.

Биологические свойства препарата, полученного в результате пер» дического и непрерывного культивирования, характеризовали по морфол< гии, антагонистической и ферментативной активностям.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Выбор сырья и характеристика технологии приготовления сух питательных основ "Бактофок-ПГ" и "Бактофок-МП".

Для конструирования питательных сред для выделения и наработ биомассы бифидобактерий вначале необходимо было изучить качество и ходного сырья - питательных основ серии "Бактофок". Нами были изуче 10 экспериментальных производственно партий препарата "Бактофок-П объемом около 20 кг каждая. Осуществлен контроль качества препарата физико-химическим и биологическим показателям.

Как показали проведенные испытания высокое качество исходно

¡ырья позволяет получить стандартную полноценную основу, обеспечиваю-цдо рост достаточно широкого спектра микроорганизмов.

Объяснением высокой питательной ценности "Бактофок-ПГ" лв-

шется наличие в нем набора аминокислот, составляющих белковую и пептидную основу препарата. Экспериментальными исследованиями усгановле-ю, что препарат "Бактофок-ПГ" содержит достаточно широкий спектр ами-юкислот. Количество такой аминокислоты, как цистин (одной из самых зажных для жизнедеятельности бифидобактерий) превышает таковое в им-юртных основах). По физико-химическим показателям сухая основа питательных сред "Бактофок-ПГ" соответствует всем требованиям , предъявляемым к подобным препаратам.

Источником сырья для получения сухой питательной основы "Бакто-£ок-МП" является смесь мяса и печени (мясо-печеночный фарш).

При разработке технологии получения питательной основы были приготовлены и охарактеризованы по биологическим показателям три варианта составления фарша. В процессе работы изменяли соотношение мяса и печени тюленя - 25%\75%; 50%\50% и 75%\25% (соответственно). Все варианты питательных основ были охарактеризованы по биологическим и физиологическим показателям на модели питательной среды для бифидобактерий. Опыты показали, что оптимальным соотношением сырья мясо\печень являлось равное содержание частей или соотношение 75\25%. Исходя из соображений экономической эффективности, нами была выбрано следующее соотношение сырья мяса - 75Х, печени - 25% по весу.

2.2. Разработка рецептуры питательной среды для выделения бифидобактерий при анализах на дисбактериоз и изучение ее свойств.

Для количественного подбора питательных компонентов был выбран метод варьирования навесок питательных основ серии "Бактофок". Основным критерием оценки качества среды в опытах являлась чувствительность ее к росту тест-штаммов.

Результаты экспериментов показали, что оптимальными диапазонами концентраций питательных основ являются 12-15 г "Бактофок-ПГ" и 12-15 г

"Бактофок-МК"на 1 литр среды , так как при этом достигается максимальная чувствительность среды и не изменяется морфология и размеры клеток по сравнению с контролем. При изменении концентрации указанных компонентов ниже 12 г уменьшается чувствительность среды, клетки утончаются, гранулируются, исчезает бифуркация и типичная форма. Для приготовления питательной среды для удобства в дальнейшем мы брали равное

- Ю -

содержание питательных основ (по 13 г на 1 литр среды).

В табл. 1 показана чувствительность сред с основами "Бактофок-М! и "Бактофок-ПГ" разных серий в сравнении с контрольной модифицировав ной средой Блаурокка. Как видно из табл.1 их чувствительность не отл: чается, а в ряде случаев превосходит таковую контрольных сред. То ; можно сказать и в отношении количества жизнеспособных клеток (КОЕ) 1 мл экспериментальной и контрольной сред) , выросших за определен» время в одинаковых условиях. Величина КОЕ практически во всех случа на экспериментальной среде превышала контрольную на 1 порядок (таб, 2).

Для подтверждения полученных результатов были изучены физиолог: ческие показатели роста тест-штамма В.МПскт 791 при культивирован: в термальной камере прибора "В1озсгееп". Для проведения эксперимен1 готовили питательные среды с разным соотношением питательных осн< "Бактофок-ПГ" и "Бактофок-МК" , подбирая навески так, чтобы аминн азот готовой среды оставался на уровне 155+5 мг%.

Прописи экспериментальных питательных сред (г/л):

Среда 1 Среда 2 Среда 3

Бактофок-МК - 13 г Бактофок-ПГ - 23 г Бактофок-МК - 8 г

Бактофок-ПГ - 13 г Лактоза - 10 г Бактофок-ПГ - 17 г

Лактоза 10 г NaCl - 5 г Лактоза 10 г

NaCl 5 г Агар-агар - 0,75 г NaCl 5 г

Агар-агар 0,75 Агар-агар 0,75

Контролем служила модифицированная среда Блаурокка.

Количество повторностей каждого варианта среды при культивиров, нии - 10. На экран выводилась одна усредненная кривая из 10 повторно' тей, по которой производили все расчеты. Анализировали следующие пок затели - тангенс угла наклона прямолинейного участка кривой в фа максимальной скорости роста (slope), характеризующий скорость рос микроорганизма , разность между минимальными и максимальными показав лями оптической плотности растущей суспензии микроорганизмов (накопл' ние биомассы).

Все данные, полученные при рассчетах были сведены в табл.3 , к торая наглядно показала преимущество первого варианта питательной ср< ды.

Следующим этапом работы было изучение возможности использован: основы "Бактофок-ПГ" в диагностических питательных средах для выдел> ния бифидобактерий при исследованиях на дисбактериоз и сравнение вые

Таблица 1.

Чувствительность питательной среды для выделения бифидобактерий к росту тест-штаммов В. МИс1ит 791, ВЛоп^ит 379М, В. асЫез^Бсепиэ ГО-13

Среда Серии питательных основ Минимальное разведение дающее рост тест-штаммов

БФ-МК БФ-ПГ В.ВШсНлп 791 В. 1оп(тш 379М В. 1опвш я-з В.ас1о1. ГО-13

Экспериментальная питательная среда 041092 020192 020192 020192 020192 050293 050293 050293 050293 040792 050493 060493 040593 050593 050294 060994 021094 031094 10"8 ю-« 10® Ю.8 ю 8 ю в 10 8 10"8 10 9 ю:8 10 9 ю-8 10"я 10 9 ю-8 10 9 ю-8 10"8 10 9 10 8 10 8 10 9 ю-8 ю-9 10 9 ю-8 ю-8 •Ю'8 10 в ю-8

Модифицированная среда Блау рокка ю-8 ю-8 10~8 10 8

Таблица 2.

Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий и кислотообра-зование на экспериментальной и контрольной средах.

Тест-штамм Количество живых клеток в 1мл культуры и кислотообразование на

Экспериментальной среде Контрольной среде

Количество живых клеток в 1 мл Кислотообразование Количество живых клеток в 1 мл Кисло- тообра- вание

В.МШшп 791 2 х 109 3 х 10? 1 х Ю10 107°Т 110°Т 125°Т 3 х 10? 8 х 10° 1 х 109 97°Т 100°Т 105°Т

ВЛоп^иш 379М 5 х 108 2 X 109 8 х 109 100°Т 120°Т 128°Т 3 х ю| 7 х 108 4 х 103 93°Т 105°Т 102°Т

В.асЫегсеп-ИБ ГО-13 3 х 109 2 х 10? 1 х Ю10 150°Т 150°Т 155 Т 1 X 109 3 х 108 8 х 109 140°Т 145°Т 135°Т

Таблица 3

Показатели роста бифидобактерий на экспериментальных и контрольных средах при выращивании в термальной камере прибора "Би-оскрин"

Наименование показателей роста Значения показателей роста микроорганизмов

Среда 1 Среда 2 Среда 3 Контроль

Slope* 0,050 0,026 0,045 0,030

Максимальное значение абсорбции (ABS) 0,920 0,610 0,717 0,839

Накопление * биомассы(ABS) 0,472 0,235 0,382 0,379

*-объяснение в тексте на стр.'0.

Таблица 4

Частота выделения и количественное содержание бифидобактерий у различных групп обследованных

Группы обследованных Число обследованных Частота выделения (в числителе- абс. величина в знаменателе-^) Количество больных, ( в %) у которых бифидобактерии обнаружены в разведениях

Ю"7 Ю-8 10"9

Здоровые беременные женщины 17 17/100 11,0 18,4 70,6

Здоровые беременные женщины 14 12/85,7 0 14,3 71,4

Лети с различной патологией желудочно-кишечного тракта 250 248/99,2 54,0 15,6 29,6

ВСЕГО: 281 277/98,6 48,7 16,4 33,7

ваемости бифидобактерий на среде с основой "Бактофок-ПГ" и на обычно применяемой в данных исследованиях среде Блаурокка в модификации Г.И.Гончаровой.

Клинические испытания среды проводились на базе лаборатории МНИ-ИЭиМ им.Г.И.Габричевского. Среда использовалась для выделения бифидобактерий из фекалий больных и здоровых людей. Всего проведено 50 посевов. Как показали проведенные исследования среда не уступала, а в ряде случаев являлась более чувствительной, чем контрольная (увеличивается процент высеваемости бифидобактерий). Полученные результаты позволили включить питательную среду для выделения бифидобактерий в целый ряд исследований на кишечный дисбактериоз. Обследуемый контингент был представлен здоровыми беременными женщинами с поздними сроками беременности (исследования проводили на базе СЗС городов Волоколамска и Калуги), а также детьми в возрасте от 1 месяца до 14 лет (исследования проводились на базе консультационно-диагностического отдела НПЦ "Гидробиос". Всего был обследован 281 человек. Результаты проведенных исследований показаны в табл.4.

Как видно из табл.4, высеваемость бифидобактерий на среде с основой "Бактофок-ПГ" была высокой и достигала 85-100 %, причем бифидобак-терии высевались в высоких титрах - 10-7-10~9. В мазках наблюдали грамвариабельные палочки типичной морфологии. Таким образом, среду можно было считать пригодной для выделения бифидобактерий при исследованиях на дисбактериоз кишечника.

2.3. Разработка питательной среды для культивирования бифидобактерий.

Питательую среду для культивирования бифидобактерий мы разрабатывали с использованием новой питательной основы "Бактофок-МП".

Основа "Бактофок-МП" представляет собой панкреатический гидроли-зат мяса и печени тюленя, гидролизуемых одновременно в соотношении мя-со\печень 75\25.

Однако для применения этой питательной среды в различных процессах культивирования необходимо было иметь четкие представления о зависимости кинетики роста микроорганизма от ее состава.

Целью настоящего раздела работы являлось изучение кинетики роста производственного штамма В.ЫНскт 791 в средах с различным содержанием сухой питательной основы Бактофок-МП.

Питательные среды готовили непосредственно перед постановкой опы-

тов, варьируя навеску препарата Бактофок-МП от 14 до 30 г на лит{ (14,16,18,20,22,24,26,28,30 г/л). Для культивирования использовали варианты сред, содержащие 3 г/л и 5 г/л поваренной соли.

Изучали такие показатели как удельная скорость роста (р.), величина времени удвоения биомассы (td) и ее прирост за все время инкубацш -(урожай).

Для изучения кинетики роста микроорганизма в средах различное состава мы использовали автоматизированный микробиологический анализатор "Bioscreen" ("Labsystems" Финляндия).

В работе применена программа "Bioscreen" версия 4.1 со следующим] изменяемыми параметрами:количество процессов-ячеек - до 200, объе! ростовой среды в ячейках - 400 мкл (инокуляция в соотношении иноку-лят-среда - 1:40), время культивирования 24 ч, температура инкубации • 37*,5 С, количество повторностей каждого варианта среды - 5. На диспле] выводилась одна усредненная кривая из пяти повторностей, что позволял! судить о достоверности результатов.

Автоматически на экран выводились следующие показатели: танген угла наклона прямолинейного участка кривой в фазе линейного роста, ко торый использовали при дальнейшем определении удельной скорости роста минимальные (на 0-1 ч ) и максимальные ( на 24 ч ) значения оптическо: плотности растущей суспензии микроорганизмов, значения оптическо: плотности и времени начала и конца линейной фазы роста. Оптическа плотность выражалась коэффициентом поглощения световых лучей - абсорб цией (ABS).

В результате проведенных исследований были получены кривые рост бифидобактерий во всех вариантах питательных сред. Эти кривые был сведены в один общий график, наглядно отражающий зависимость тангенсо углов наклона прямолинейных участков кривых в фазах линейного роста ( следовательно и скоростей роста микроорганизма) от величины навесок пи тательной основы ( рис.1).

Для конкретных расчетов всех показателей роста были использован методики, которые приведены ниже на примере одного из вариантов пита тельных сред.

Пример расчетов показателей роста B.bifidum 791 при вырашивании одном из вариантов питательной среды

Пропись питательной среды (г/л) :

Бактофок-МП - 26 г/л

Лактоза - 10 г/л

Рис 1. Кривые роста бифидобактерий на средах»с различным содержанием препарата "Бактофок-МП"

1- 14 г/Л; 2- 16 Г/л; 3- 18 г/л; 4- 20 г/Л; 5- 22 г/л; 6- 24 г/л; 7- 26 г/л; 8- 28 г/л; 9- 30 г/л.

По оси абсцисс - время процесса (ч.)

По оси ординат - оптическая плотность в ед. ABS.

NaCl - 5 г/л

Агар-агар - 0,5 г/л

РН - 7.1

аминный азот - 160-170 мг%.

Кривая роста выводилась на дисплей (рис.2).

Приводим значения показателей роста, вычисленные компьютером анализатора по построенной кривой и выведенные на дисплей: ABSwm ~ 0.56S (точка 1) - значение оптической плотности в начале культивирована (0-1 ч) ; ABSMax- 1,464 (точка 4) - значение оптической плотности i конце культивирования (24 ч) ; ABSstart " 0,741, TIMEstart " 5,ОС (точка 2) - значения оптической плотности и времени в начале фазы линейного роста); ABSend - 0,948, TIMEend - 6,33 (точка 3) значения оптической плотности и времени в конце фазы линейного роста); Slope -0,155 ( тангенс угла наклона прямолинейного участка кривой к оси абсцисс в фазе линейного роста).

Для определения прироста биомассы (ABS+) находили разность межд} максимальным (ABSMax) и минимальным (ABSMm) значениями оптическо* плотности в начале и в конце культивирования:

ABS+ = 1,464 - 0,562 = 0,902

Для определения прироста биомассы в процентах (ABS+%) рассчитывали процент прироста от максимального значения оптической плотности i этом варианте:

0,902 ' 100

АВЗ+% = -------------= 61,6%

1,464

Удельную скорость роста в линейной фазе определяли по формуле:

БХ 1 ( где за X принимали оптическую плотность ц= - • - суспензии растущей культуры)

Ш х

Так как тангенс угла наклона прямолинейного участка кривой в линейной фазе роста численно равен отношению разности значений оптической плотности в начале и конце фазы линейного роста ко времени ее продолжительности

ABSer,d - ABSstart ЬХ

Slope = - , или — , удельную скорость

Timeend" Timestart lit

роста рассчитывали по формуле: 1

р. = Slope • - , где X - значение оптической плотности X

Рис 2. Кривая роста B.bifidum 791, выведенная на дисплей прибора "Bioscreen" По оси абсцисс - время процесса (ч) По оси ординат - оптическая плотность в ед. ABS

произвольно выбранной точки (при наших расчетах срединной) на прямолинейном участке кривой

1

Отсюда: м- = 0,155 • - = 0,179 ч"1

0,867

Время удвоения биомассы (td) рассчитывали по формуле: 0,693 0,693

td = - = - = 3,84 ч

ц 0,179

Таким образом рассчитывали ростовые показатели B.bifidum 791 всех вариантах сред.

Значения рассчитанных приведенным способом ростовых показател были сведены в таблицы, по которым построены графики, наглядно отраж ющие зависимость изменения удельной скорости роста, прироста биомас и времени ее удвоения от количества питательной основы в среде.

Как видно из представленных графиков (рис.3), по мере увеличен навески питательной основы в среде закономерно увеличивались значен накопления биомассы бифидобактерий (ABS+) (рис.3.1), прироста биома сы, выраженное в процентах (ABS+%) (рис.3.2), удельной скорости рос (гл) (рис. 3.3) и уменьшалось время удвоения биомассы (td) (рис. 3.4 Причем значимые изменения всех учитываемых показателей роста отмеча только до достижения определенной навески питательной основы Вакт фок-МП (26 г/л). Затем, по мере дальнейшего увеличения содержания п тательной основы изменения всех перечисленных показателей либо прекр дались либо были незначительными. Таким образом, полученные результа позволили выбрать в качестве оптимальной навеску питательной оснс Бактофок-МП в среде - 26 г/л.

Для подтверждения полученных данных был проведен рандомизирова ный анализ результатов и определена зависимость показателей рос культуры от состава среды.

Исследовалось влияние следующих факторов: Xi- содержание сух питательной основы "Бактофок-МП" и Xz~ содержание поваренной соли.

Результаты анализа экспериментальных данных позволили заключить

1. В исследуемых диапазонах концентрация поваренной соли ( 3 г или 5 г/л) не влияет ни на один из параметров роста модели.

2. Все показатели модели роста зависят только от концентрации с хой питательной основы "Бактофок-МП".

3. Чем больше концентрация сухой питательной основы, тем боль

MS4

a40° ' W' 'lb'1 W 1Ъ'1Ч* 1 'А'1 'А'1 "эЬ

490 ,V ' 'Л'' 'Л'1 У/1 '¿'' Уч

U

Бамрфрк-тл 'Vnj

/

г'б ' '£ь ВссчлсИрок М/1

(У")

............II I и-!«

4 if ' lb' ' "Л - П 24 26 Й 30

б&ктярох- ШП (г/лJ

/ /

//

'jb' ' H ' W ' 'г'б' ' '¿в''

БашФй* мл

Ь/А)

концентрация NaCl в среде - 5 г/л концентрация NaCl в среде - 3 г/л

>ис 3. Зависимости прироста биомассы (АВЗ+) в единицах абсопбпии и1 5 процентах, от максимального значения (2) впем?™ ^пот,^«,^, С -1, ■ХЛ) ч (3),. удельной скорости роста(д ч^1 (4) даш в «¿зелиней .ого роста от концентрации субстрата Бактофок-Ш Гпитатель1ой

66.0

«1.0

56.D-

51.0

максимальная удельная скорость роста (л/тах) и тем меньше экспоненци

Таким образом, исходя из результатов проведенных исследований на ми была оптимизирована пропись питательной среды для культивировали, бифидобактерий (г/л):

Вода дистиллированная - 1000 мл

рН - 7,0-7,3

Оптимизированную питательную среду использовали в двух процесса! периодического культивирования бифидобактерий в колбах. Питательнук среду инокулировали в соотношении инокулят-среда - 1:40. Каждый час инкубации измеряли оптическую плотность растущей культуры. По полученным данным строили кривые роста, по которым определили максимальнук удельную скорость роста (М!^) и минимальное время удвоения биомассь ^а) в экспоненциальной фазе, а также удельные скорости роста (р.) у. время удвоения биомассы (1с1) в фазе линейного роста. Полученные значения всех ростовых показателей были достаточно высокими, что позволило сделать вывод о возможности использования сконструированной среды для накопления биомассы бифидобактерий в процессе периодического культивирования.

2.4.Разработка непрерывного управляемого процесса культивирования бифидобактерий и изучение полученной биомассы.

Успешное проведение периодического процесса культивирования бифидобактерий в новой среде позволило нам перейти к более прогрессивному способу - непрерывно-проточному культивированию микроба в биореакторе.

Непрерывный процесс культивирования проводили в биореакторе "Ан-кум" (Россия). В связи с особенностями ростовых потребностей бифидобактерий как анаэробных микроорганизмов, растущую культуру обогащали газообразным азотом.

На рис. 4 представлены 2 процесса непрерывно-проточного культивирования бифидобактерий в биореакторе Анкум 2М.

Для того, чтобы определить скорость разбавления (Б), вычисляли максимальную, удельную скорость роста в предшествующие пуску среды 2-3 часа. В разных процессах значения этих показателей были в пределах

альная фаза (^0г) и минимальное время генерации (дт1П)-

Еактофок-МП

Лактоза

NaCl

Агар-агар

- 26,0 г

- 10,0 г

- 3,0-5,0 г

- 0,75 г

-х\-

■ о

о

_)

•3.000 п

2.500

г.ооо -

I I I Ч I I Ц I I I I I t I 1 I I Ч I I I М 11^ I I I I I I I I I м I и м и " м i 4 6 Й 10 12 14 16 18 20 ¿2 24 2"

26

О О

2.000 -

1.500 -

4 /

'-V

<у' '¿'' Ч'' '¿'' a ' Vo' 12' i'-t' Ye' iB' гЬ'' a' W' ite

Рис.4 Кинетика роста бифидобактерий в процессах периодического и непрерывно-проточного культивирования

По оси абсцисс - время культивирования (ч).

По оси ординат - оптическая плотность культуры (lg 100 Ext)

а) - процесс N 1; б) - процесс N 2

пуск потока питательной среды j- прекращение потока питательной среды

0,40-0,44 ч-1. После пуска потока питательной среды со скоростью разбавления D = 0,4 ч"1 наблюдали режим, при котором оптическая плотное] культуры составляла 2,19-2,34 ед. 0D. Эти значения соответствовав числу колониеобразующих единиц (КОЕ) от 1хЮ9 до 5х109 на 1 мл микро( ной суспензии. Режим непрерывно-проточного культивирования в первс эксперименте (рис.4а) продолжали 6 часов, во втором (рис 46) - 9 Сере наблюдения).

После прекращения пуска потока в обоих случаях наблюдали продо; жение экспоненциальной фазы роста прерванного периодического процесс; Об этом свидетельствовало значение ц , соответствующее таковому в н< чальной экспоненциальной фазе. Фаза экспоненциального роста пос. прекращения потока продолжалась еще в течение 2-3 часов, после чез началось замедление скорости роста и переход к максимальной стациона! ной фазе, которая характеризовалась максимальными значениями оптиче< кой плотности культуры.

Для подтверждения результатов этих экспериментов и изучен] свойств полученной биомассы был осуществлен еще один непрерывно-пр< точный процесс культивирования бифидобактерий.

Культивирование проводили в ферментере "Marubishi" (Япония). 3; висимость оптической плотности от времени культивирования (кривая рос та) показана на рис.5. Как видно из приведенной кривой через 4 часа < начала культивирования началась фаза экспоненциального роста. Макс; мальная удельная скорость роста составляла 0,30 ч-1. Перед пуском ш тока была добавлена свежая питательная среда (до объема среды в фе; ментере 5 л), что стимулировало культуру к продлению экспоненциальна фазы. Через 10 часов от начала культивирования был пущен поток со сю ростью 0,24 ч-1. Однако оптическая плотность культуры продолжала ув личиваться и скорость разбавления была увеличена в 2 раза. Этот реж поддерживали в течении 5 часов. За это время дважды брали пробу д контроля чистоты культуры и числа колониеобразующих единиц (КОЕ). Не мотря на медленное снижение оптической плотности, число КОЕ культу оставалось на уровне 1-2 х 109 клеток. Это связано, повидимому с по тепенным вымыванием старых и погибших клеток.

Через 19 часов от начала культивирования скорость разбавления б ла снижена до 0,24 ч-1. После этого культура оставалась в стабильн состоянии еще 8 часов (stady state). За это время дважды брали про биомассы, которую разливали мерно по 1 мл (1 доза) в стерильные ампу и лиофильно высушивали.

Рис 5. Кривая роста B.bifidum 791 при непрерывно-проточном культивировании в биореакторе "Marublshl" По оси абсцисс - время процесса (ч, j

По оси ординат - оптическая плотность в Lg 100 Ext.

Бьшо проведено исследование биомассы бифидобактерий, полученной результате непрерывно-проточного культивирования, и лиофильно высушен ной для длительного хранения. Испытания проводили, как сразу поел проведения процесса, так и после хранения в течение 1 года. Как пока зали результаты проведенных экспериментов, в конце срока хранения к изменялись количественные и биологические показатели культуры. Поэток далее приводится характеристика биомассы после 1 года хранения в лис фильно высушенном состоянии при температуре (4 + ?)°С (в условиях кок натного холодильника). В качестве контроля использовали коммерчески бифидумбактерин серий 521 и 523 производства ДП "Биофаг" НПО "Иммуног репарат" г.Уфа. Срок выпуска коммерческого препарата соответствовг требованиям годности (январь 1996 г, что на время проведения экспер! мента соответствовало менее 1/2 г хранения).

Испытания биомассы, полученной при непрерывно-проточном культив^ ровании (далее "экспериментальный препарат") проводили с использован! ем следующих тестов:

- определение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 дозе пре парата,

- типичность морфологии клеток,

- типичность морфологии и размера колоний,

- кислотообразование,

- ферментативная активность микроорганизма (наличие желатиназь каталазы, газообразования,

- антагонистическая активность препарата в отношении тест-штаммс некоторых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Биомасса бифидобактерий, полученная в эксперименте, обладала бс лее интенсивными ростом и антагонистической активностью по сравнению контролем (табл 5). Это связано, по нашему мнению, с тем, бифидобакт« рии, полученные при периодическом культивировании ( коммерческий биф! думбактерин), находились в стационарной фазе и в фазе отмирлнид.

С этим связано большое количество неактивных и мертвых клеток. Пс этому такой культуре требуется больше времени для активизации всех м< таболических процессов и размножения. Бифидобактерии, полученные сш собом непрерывно-проточного культивирования, находились в активной ф; зе роста и при внесении в питательную среду сразу начинали актив! размножаться выделяя при этом кислые продукты и антимикробные субста] ции.

Таблица 5

Антагонистическая активность экспериментального бифидосодержаоцего препарата в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий

Наименование тест-штаммов Выживаемость тест-штаммов (%) патогенных и условно-патогенных бактерий после совместной инкубации с бифидобактериями.

24 часа инкубации 48 часов инкубации

тест-штамм тест-штамм+ коммерческий бифидумбак-терин тест-штамм+ экспериментальный препарат тест-штамм тест-штамм+ коммерческий бифидумбак-терин тесг-штамм+ экспериментальный препарат

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Е.coll АТСС 25922 (F-50) 100 100 100 100 55 67 65 100 0 0,2 0 0 0 0,1

S.typhi Н901 ГДР/ГИСК 100 100 100 100 45 39 43 100 0 0 0 0 0 0

S.flexneri la 8516 100 92 100 100 34 36,8 39 100 0,1 0,2 0 0 0 0

S.marcescens 1 100 15 18 18 3,2 3,5 2,8 100 0,2 0,1 0,3 0 0 0

P.aeruginosa 27/99 100 100 100 100 32 35 35 100 0 0 0 0 0 0

-М-выводы

1. Разработана новая эффективная питательная среда для выделения бифидобактерий при исследованиях на дисбактериоз. В основу этой средь входят стандартные ферментативные гидролизаты печени и мяса тюленг (препараты серии "Бактофок").

2. Показано, что разработанная питательная среда обеспечивает хороший рост широкого спектра тест-штаммов бифидобактерий со стабильным! биологическими свойствами.

3. Доказано в ходе клинических испытаний , что экспериментальна5 среда повышает качество исследований на дисбактериоз, увеличивая процент высеваемости бифидобактерий в высоких титрах.

4. Разработана питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий, в состав которой входит препарат "Бактофок-МП". Показано что эта среда обеспечивает высокий выход клеток со стабильными биологическими свойствами.

5. Разработан процесс непрерывно-проточного культивирования бифидобактерий в новой питательной среде с основой "Бактофок-МП".

6. Показано, что биомасса бифидобактерий, полученная в результат' разработанного процесса непрерывного культивирования обладает боле высокой ( по сравнению с коммерческим бифидумбактерином) ростовой, ан тагонистической и кислотообразующей активностями, что повышает ее ка чество и защитные свойства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1."Питательная среда для выделения бифидобактерий"- Авторско свидетельство N1705341. Приоритет изобретения 8.12.91.

2. "Питательная среда для выделения бифидобактерий"//ЖЭД-1995, б, стр.87-88/ Критская И.В., Гиршович Е.С., Рязанова Л.А.6 Бевз Н.И. Бордашевская-М.А., Гончарова Г.И.

3. "Конструирование питательной среды для культивирования бифидс бактерий B.bifidum 791"//Сб. "Научные основы технологии промышленног производства ветеринарных биологических препаратов"-Тезисы докладов Всерос.конф.- 14-17 мая 1996 г., стр.118-120 / Критская И.В., Танир бергенов Т.Б., Саканян Л.Н., Баснакьян И.А., Маслак A.A.

4. "Оптимизация состава питательной среды для культивирования Bi fldobacterium bifidum 791"// Ж."Биотехнология"-1996, N3, стр.33-К Критская И.В., Танирбергенов Т.Б., Саканян Л.Н., Баснакьян И.А., Мае

-л -

ак A.A.

5."Разработка питательной среды для накопления биомассы Bifido-acterium bifidum в процессах непрерывного культивирования в биореак-оре"// ШЭИ,- 1996, N5, стр.81-84, Критская И.В., Баснакьян И.А.6 иршович Е.С., Танирбергенов Т.Б.

/