Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков

Тимербаева, Рина Харисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков"

На правах рукописи

Тимербаева Рина Харисовна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ-ПРОБИОТИКОВ

03.00.07-микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа - 2005

Работа выполнена в сывороточном цехе филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014 г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала «Иммунопрепарат» Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450014 г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

Туйгунов Марсель Маратович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карташова Ольга Львовна; доктор медицинских наук, профессор Габидуллин Зайнулла Гайнулинович

высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится

Автореферат

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из достижений конца XX века явились разработка и внедрение в жизнь концепции «пробиотики и функциональное питание» [Шендеров Б. А., 2002]. Практическая реализация данной концепции способствует решению проблемы массового оздоровления населения, так как реальные и потенциальные потребности отечественного рынка про-биотиков обусловлены широкой распространенностью нарушений естественного микробиоценоза человека.

Приоритетным направлением современной промышленной микробиологии являются многоплановые исследования в области разработки эффективных средств коррекции биоценозов, усовершенствовании выпускаемых форм препаратов, интенсификации и повышении экономической эффективности производства [Алешкин В. А., 2002; Поспелова В. В. и др., 2002; Бон-даренко В. М. и др., 2004; Collins M. D., Gibson G. R., 1999; Cummings J. H. et al., 2001; Floch M. N.. Hong - Curtiss J., 2001].

Прогноз, основанный на анализе экономических и технологических тенденций в сфере производства отечественных пробиотиков, позволяет сделать вывод о том, что в условиях ограниченных инвестиционных возможностей минимизация затрат, необходимая для развития производства в соответствии с требованиями GMP, может быть достигнута лишь при повышении эффективности технологических процессов [Казьянин А. В. и др., 2002]. Одним из стратегических направлений развития индустрии препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами является усовершенствование методологии промышленного получения биомасс кислотообразующих микроорганизмов - пробионтов, в частности, требуют дальнейшего разрешения вопросы обоснования и регламентации характеристик питательных сред для крупномасштабного культивирования лакто- и бифидобактерий [Лазарева Г. И., 1991; Критская И. В. и др., 1996; Андреева М. А. и др., 1998; Степаненко П. П., 1999; Ганина В. И., 2001; Тихомирова Н. А., 2001; Петров Л. Н., 2002; Poch M., Bezkorovainy A., 1988; Gibson G. R., Fuller R., 2000].

щих потребностей высших животных [Stanier R. Y., 1979]. Но, в то же время, анализ литературы не позволяет сделать достоверные выводы о влиянии аминокислотно-пептидного состава ферментативных белковых гидролизатов на накопление биомасс лакто- и бифидобактерий вследствие разноречивости данных о наиболее пригодных для них формах азотистого питания [Рахимова Н. Г., 1969; Воронкина И. М., 1970; Эрвольдер Т. М. и др., 1980; Назарова А. А., 1991; Работнова И. Л, 1993; Андреева М. А., 1998; Степаненко П. П., 1999; Stanier R. ^ et al, 1979; Jeremija L et al., 1983; De Feo J. A., 1985]. Регламентированные технологии производства питательных сред для культивирования лакто- и бифидобактерий предусматривают использование гидролизата казеина с высокой степенью конверсии белка после гидролиза в течение 5-7 суток [Рахимова Н. Г. и др., 1975].

Исходя из этого, одним из актуальных направлений создания препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами являются разработка методов направленного гидролиза биологического сырья для получения белковых гидролизатов и дрожжевых автолизатов с заданными свойствами, в частности, с увеличенным содержанием фракций, обладающих ростстимулирующим действием на изучаемые культуры микроорганизмов, и конструирование на их основе питательных сред с высокими ростовыми свойствами для накопления биомасс лакто- и бифидобактерий [Терновская Л. Н. и др., 1993; Критская И. В. и др., 1996; Ильина Р. М. и др., 2000; Ганина В. И., 2001].

Цель исследования: разработка питательных сред, обеспечивающих высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто- и бифидобактерий.

Задачи исследования:

1 Оптимизировать промышленные способы получения основных компонентов питательных сред - ферментативных белковых гидролизатов и дрожжевых автолизатов.

2 Изучить влияние качественных и количественных характеристик ами-нокислотно-пептидного состава ферментативных белковых гидролизатов на скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто- и бифидобактерий.

3 Сконструировать питательные среды с высокой ростстимулирующей активностью для культивирования лакто- и бифидобактерий.

4 Охарактеризовать производственные штаммы лакто- и бифидо-бактерий по совокупности биологических свойств: антагонистической, кисло-топродуцирующей, адгезивной активности, антибиотикорезистентности, устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта.

5 Изучить скорость роста и стабильность основных биологических свойств подобранных производственных штаммов лакто- и бифидобактерий в сконструированных питательных средах.

Научная новизна.

Впервые выявлено ростстимулирующее действие фракций белковых гидролизатов с различной степенью конверсии белка на накопление биомасс

лакто- и бифидобактерий. На основании изучения потребностей микроорганизмов в наиболее усвояемых формах азотистого питания оптимизированы условия гидролиза подобранных многосубстратных белковых основ, обеспечивающие эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотно-пептидным составом.

Предложена двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизи-рующих дрожжей, обеспечивающая получение ферментативного гидролиза-та с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот и витаминов группы В.

Новизна проведенных исследований подтверждена решением № 2002132307 о выдаче патента на изобретение «Способ получения панкреатического белкового гидролизата и питательная среда для культивирования бифидобактерий с его использованием» от 26.11.2004 г.

Научно-практическая значимость работы.

1 Оптимизированы промышленные способы производства ферментативных белковых гидролизатов с дифференцированными для лакто- и би-фидобактерий степенью конверсии белка и аминокислотно-пептидным составом.

2 Разработан способ реакторного получения ферментативного дрожжевого гидролизата с индуцированными условиями ведения процесса, последовательной активацией эндогенных и экзогенных ферментов, обеспечивающий получение продукта с высокой ростстимулирующей активностью в отношении лакто- и бифидобактерий.

3 Сконструированы рецептуры питательных сред для культивирования производственных штаммов лакто- и бифидобактерий, обеспечивающие высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств бактериальных популяций.

4 Дана сравнительная характеристика производственных штаммов лак-то- и бифидобактерий, используемых в иммунобиологической и молочной промышленности, по совокупности биологических свойств, определяющих расширение спектра традиционных регламентированных требований: антагонистической, кислотопродуцирующей, адгезивной активности, антибиоти-корезистентности, устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта.

5 Изучены скорость роста и стабильность основных биологических свойств бактериальных популяций подобранных штаммов лакто- и бифидо-бактерий, полученных в новых питательных средах.

Внедрение результатов исследования в практику.

По материалам исследований составлена и утверждена нормативно-техническая документация:

1. Регламент производства № 1195-02 Лактобактерин сухой

2. Регламент производства № 1165-02 Бифидумбактерин сухой

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Оптимизированные способы направленного гидролиза многосубстратных белковых основ обеспечивают эффективные макрокинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотно-пептидным составом.

2 Ферментативные белковые гидролизаты, полученные оптимизированными способами с учетом дифференцированных потребностей лакто- и би-фидобактерий в наиболее усвояемых формах азотистого питания, влияют на удельную скорость роста и прирост (урожай) бактериальных популяций.

3 Разработанная двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизи-рующих дрожжей обеспечивает максимальный выход ферментативного дрожжевого гидролизата с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот и витаминов группы В.

4 Сконструированные питательные среды обеспечивают высокую скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто- и бифидобактерий.

5 Бактериальные популяции производственно-ценных штаммов L plantarum 8P-A3, Ь fermentum 90T-C4, В. bifidum 1 и В. adolescentis MC-42, полученные в сконструированных питательных средах, обладают высокой специфической активностью и стабильностью основных биологических свойств.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа, 2000), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), Международном научно-практическом семинаре «Вопросы вакцинопрофилактики и иммунокор-рекции» (г. Ташкент, 2004), заседании Ученого совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ «Иммунопрепарат» (протокол № 4 от 24.11.2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, получено положительное решение № 2002132307 о выдаче патента на изобретение (2004 г.).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 150 страницах, иллюстрирована 38 таблицами, 15 рисунками и 4 технологическими схемами производства. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического списка, включающего 130 отечественных и 87 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Сырье и реактивы для производства ферментативных белковых гидролизатов и дрожжевых автолизатов: в качестве субстратов протео-лиза использовали казеин (молотый) импортный (Meggle GMBN, Германия), фарш-отжим мяса говяжьего (ГОСТ 779-87, высший сорт), печень крупного рогатого скота (ГОСТ 19342-73) производства ОАО «Уфимский мясоконсервный комбинат», хлебопекарные дрожжи прессованные (табл. 1).

Таблица 1

Перечень дрожжей хлебопекарных, используемых в производстве питательных сред_

Наименование дрожжей Производитель ГОСТ или ТУ Срок годности, сут Примечание

«Осо- -бые» г. Ростов-на-Дону ТУ 9182-023-00371185-98 18 Высокая ферментативная активность

«Эффект» г. Ростов-на-Дону ТУ 9182-023-00371185-98 15 Содержание каротина

«Люкс» г. Курган ТУ 9182-018-00371185-97 24

«Новинка» г. Нижний Тагил ТУ 9182-001-44669477-98 24 Высокая мальтазная активность

г. Самара ГОСТ 171-81 12

г.Уфа ГОСТ 171-81 24

«Удача» г. Кукуштан, ГОСТ 171-81 12

Для научных исследований на основании результатов сравнительного анализа ростовых свойств дрожжевых автолизатов, полученных из сырья разных производителей (2000-2003 гг.), использовали сырье производства Кукуштанского дрожжевого завода (Пермская обл.).

Ферментные препараты и ферментосодержащее биологическое сырье: железы поджелудочные крупного рогатого скота (ГОСТ 11285-93) производства ОАО «Уфимский мясоконсервный комбинат», панкреатин производства фирмы ICN Biomedicals с удельной протеолитической активностью 83 USP u/mg, пепсин импортный производства фирмы «BioFAC А/С» с удельной про-теолитической активностью 1:14000 NF, террилитин сухой (ФС 42-3270-96).

Индукторы автолиза, хлороформ (ГОСТ 20015-88, или ТУ 2631-01044493179-98), толуол (ГОСТ 5789-78), спирт этиловый (ГОСТ Р 51652-2000), уксусная кислота (ГОСТ 61-75).

Производственные штаммы микроорганизмов-пробионтов: в качестве объектов исследований были выбраны штаммы родов Lacto bacterium и Bifidobacterium, используемые в иммунобиологической и молочной промышленности: L fermentum 90T-C4, L plantarum 8P-A3, L acidophilum K3-III24, L acidophilum 100 АШ, L delbrueckii subsp. bulgancum 8-79 и В. bifidum 1, В. bifidum ЛВА-3, В. bifidum 791, В. adolescentis MC-42.

Микроорганизмы для контроля антагонистической активности штаммов лакто- и бифидобактерий: коллекция музейных культур, депони-

рованная в музее ГИСК им. Л. А. Тарасевича и включающая индикаторные тест-штаммы различных таксономических групп: St. aureus 209, Е coli 157, Pr. mirabilis Н-237 и Pr. vulgaris 177, Sh. sonnei5063, Sh. flexneri 170 и 337.

Питательные среды для культивирования и изучения биологических свойств лакто- и бифидобактерий: МРС (ФСП 42-0061-277802), казеиново-дрожжевая (РП № 1195-02 Лактобактерин сухой), Блаурокка (ФС 42-3947-00), казеиново-дрожжевая № 5 (РП № 1165-02 Бифидумбакте-рин сухой).

Белковые основы для конструировании питательных сред: панкреатический гидролизат казеина (РП № 625 Бифидумбактерин сухой), мясной гидролизат Хоттингера (РП № 954-00 Бактериофаг поливалетный очищенный жидкий), дрожжевой автолизат (РП № 625 Бифидумбактерин сухой) и ферментативные белковые гидролизаты, полученные оптимизированными способами (РП № 1165-02 Бифидумбактерин сухой, РП № 1195-02 Лактобак-терин сухой).

Питательные среды для контроля стерильности и отсутствия роста посторонних микроорганизмов и грибов: агар Сабуро (ФС 42-3729-99), МПА (ФС 42-0048-00), питательный агар, содержащий 9 % натрия хлорида (ФСП 42-0061-277802), агар Эндо (ФС 42-3504-98), питательный агар, содержащий 0,5 % глюкозы (ФС 42-3947-00).

Методы: Оценку качества белковых основ и питательных сред (цветность, прозрачность, содержание общего, аминного азота, пептидов, хлоридов, рН, нуклеиновых компонентов) осуществляли в соответствии с ФС 42-3874-99 «Физико-химические, химические, физические и иммунохими-ческие методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов» и Государственной фармакопеей XI изд.

Аминокислотный состав белковых гидролизатов определяли с помощью аминокислотных анализаторов LG-300 фирмы «Биотроник» и «ChromuLan ААА-400». Разделение гидролизатов на фракции осуществляли методом гель-фильтрации на колонке (25x250 мм) с биогелем Р-2. Пики на хромато-грамме характеризовали с помощью калибровочных графиков, построенных по стандартным маркерам молекулярной массы. Протеолитическую активность по казеину изучали по модифицированному методу Ансона (1971), субстратную специфичность ферментов изучали по методу Егорова (1971). Степень конверсии белка определяли по соотношению общего и аминного азота в продуктах гидролиза.

Содержание витаминов группы В в белковых гидролизатах и дрожжевых автолизатах определяли флюориметрическим методом (Bi, Вг), фотоэлек-троколориметрическим (В5) методами и методом колоночной гель-хроматографии

Качество питательных сред по чувствительности, эффективности, скорости роста (ростовые свойства среды) оценивали согласно «Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по биологическим показателям» (М., 1980), «Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по параметрам роста микроорганизмов в процессе их культивирования» (М., 1980) и ФС на питательные среды.

Биомассу лакто- и бифидобактерий получали методами динамического и статического периодического гомогенного глубинного культивирования [Баснакьян И. А. и др., 1985; Баснакьян И. А., 1992]. Концентрацию микробных клеток в 1 мл культуральной жидкости определяли визуально по отраслевому стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-29-86П) и по показателям фотометра фотоэлектрического КФК-3 при измерении оптической плотности при длине волны (540±10) нм.

Содержание жизнеспособных клеток лакто- и бифидобактерий контролировали бактериологическим методом, отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов определяли бактериологическим и бактериоскопическим методами в культуре лактобактерий (ФСП 42-0061-277802), бифидобактерий (ФС 42-3947-00). Активность кислотообразования определяли титриметриче-ским методом [Лянная А. М., Гончарова Г. И., 1975].

Чувствительность штаммов к антибиотикам выявляли диско-диффузионным методом при использовании стандартных дисков, пропитанных антибиотиками [Биргер М. О., 1982; Меньшикова В. В., Воропаева С. Д., 1987]. Адгезивную активность микроорганизмов определяли методом цитад-гезии на эритроцитах барана [Брилис В. И. с соавт., 1984, 1986] и энтероци-тах кишечника крыс [Горская Е. М. и др., 1989]. Антагонистическую активность лакто- и бифидобактерий в отношении индикаторных тест-штаммов определяли методом отсроченного антагонизма на плотном агаре МРС-5 [Muriana P.M., Klaenhammer T.R, 1987]. Устойчивость лакто- и бифидобактерий к биологическим жидкостям определяли по изменению количества живых бактерий после совместной (1 мл культуры и 9 мл биологической жидкости) 2-часовой экспозиции при температуре 37 °С [Несчисляев В. А., 2004].

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами вариационной статистики [Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962] и по программе «Statistica 5,0» Windows 95. Результаты представлены в виде М±т, где М - средняя арифметическая, m - стандартная ошибка средней арифметической. Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимизация способа получения ферментативных гидролизатов с высокой ростстимулирующей активностью в отношении лакто- и бифидобактерий

Одним из направлений современной биотехнологии является разработка методов направленного гидролиза белков с целью увеличения содержания фракций, оказывающих ростстимулирующее действие на микроорганизмы. В качестве источника азотистого питания микроорганизмов мы рассматривали аминокислоты и пептиды, получаемые в результате гидролитического расщепления естественных субстратов животного происхождения, безопасных с эпидемиологической точки зрения, обладающих алиментарной специфичностью и высокой биологической ценностью.

На моделях производственных штаммов _. р1ап!агит 8Р- А3 и В. ЫШит 1 провели ряд экспериментов с целью выявления ростстимули-рующей активности фракций белковых гидролизатов (БГ), отличающихся степенью конверсии субстрата. Для этого мы проанализировали ростовые свойства фракций БГ с различным аминокислотно-пептидным составом, полученных при изменении времени гидролиза сырья.

Гидролиз останавливали изменением рН в смеси до 4,5-4,6 и термоинактивацией ферментов с последующей очисткой продукта углем активным осветляющим. Готовый продукт (контроль) получили в разработанной двух-стадийной модели гидролиза с дробным введением фермента через 5 ч и завершением процесса через 24 ч.

На рисунке 1 представлены результаты содержания аминного азота и пептидов в пробах БГ, полученных при варьировании времени гидролиза.

II III IV (К)

Пробы белкового гидролизата

Рис. 1 - Уровень накопления аминного азота (ряд 1) и пептидов (ряд 2) в зависимости от времени гидролиза

I - гидролиз субстрата в течение 1,5 ч

II - гидролиз субстрата в течение 2,5 ч,

III - гидролиз субстрата в течение 3,5 ч,

IV - гидролиз субстрата в течение 24 ч (К)

* - различие с контролем статистически значимо (р<0,001)

Так как идентификация ростстимулирующих соединений БГ очень затруднительна вследствие огромного разнообразия химического состава ростовых факторов, мы провели биологические испытания при посеве маточных культур лакто- и бифидобактерий в чувствительные культуральные системы на основе БГ, стандартизированные по содержанию аминного азота в пределах (0,15±0,01) %. Оценку ростстимулирующей активности БГ с разной степенью конверсии белка осуществляли через (12±1) ч роста культуры лак-тобактерий и (23±1) ч роста культуры бифидобактерий в условиях статического культивирования без коррекции рН и подачи углеводов. Результаты контроля представлены в таблице 2.

Таблица 2

Параметры роста культур лакто - и бифидобактерий в белковых гидролизатах с разной степенью конверсии субстрата

Пробы БГ, разведенные до содержания аминного азота (0,15+0,01)% п -коли че-ство опытов Параметры роста культуры лактобактерий Параметры роста культуры бифидобактерий

Содержание клеток в 1д к концу роста в 1 мл культуры (М+т) Максимальная удельная скорость роста, Цтах>4 (М±т) Содержание клеток в 1д к концу роста в 1 мл культуры (М±т) Максимальная удельная скорость роста, (М±т)

1 2 3 4 5 6

1 (гидролиз 1,5 ч) п=5 6,68±0,02" 0,18±0,05** 6,53±0,04* 0,35+0,02

2 (гидролиз 2,5 ч) п=5 7,83±0,03** 0,23±0,04" 7,85±0,05** 0,49±0,04**

3 (гидролиз 3,5 ч) п=5 8,12+0,03* 0,34+0,05* 5,09±0,04 0,29+0,05

4 (К) (гидролиз 24 ч) п=5 8,60±0,02 0,56+0,03 4,46+0,03 0,30+0,04

Примечание - * - различие с контролем статистически значимо (р<0,05).

**- различие с контролем статистически значимо (р<0,01).

На основании изучения роста бактериальных популяций установлено, что максимальной ростстимулирующей активностью в отношении лактобак-терий обладают БГ с глубокой степенью конверсии белка, в отношении бифидобактерий - гидролизаты со средней степенью конверсии белка. Учитывая только основные результирующие процессы жизнедеятельности производственных штаммов лакто- и бифидобактерий (удельную скорость роста |Лглах и прирост (урожай) биомассы), мы получили статистическую значимость различий между показателями кинетики роста и накопления бактериальных популяций в БГ с разной степенью конверсии субстрата, в частности, выявили, что рост лактобактерий стимулируют БГ с содержанием аминного азота 0,8-0,9 %, рост бифидобактерий - БГ с содержанием аминного азота 0,40-0,45 %.

Поиск оптимальных условий ведения процесса гидролиза проводили с применением стандартных методов планирования эксперимента. Направление поиска было направлено в сторону повышения эффективности процесса (обогащения гидролизуемой смеси и увеличения выхода БГ). В качестве критерия оптимизации был выбран один показатель - выход ферментативного БГ, оцениваемый по увеличению содержания свободных аминогрупп, а в качестве переменных факторов - четыре управляемых количественных параметра процесса, имеющих непрерывный характер изменения в заданных пределах (количество субстратов, фермента, степень разведения смеси, продолжительность процесса).

Для обогащения гидролизуемых смесей и получения многосубстратных БГ, обладающих, как известно, более высокой биологической ценностью, составы казеинового БГ, являющегося основным компонентом регламентиро-

ванных казеиново-дрожжевых сред, и мясного гидролизата Хоттингера, основы многих универсальных питательных сред, оптимизировали введением утилизируемой после приготовления сред Блаурокка и МРС печеночной ткани с крупными желчными протоками. Сравнительный анализ аминокислотного состава мясо-печеночных гидролизатов (МПГ) и казеино-печеночных гид-ролизатов (КПГ) с БГ, полученными без введения печеночной ткани, позволил выявить в составе многосубстратных БГ статистически значимое нарастание практически всех незаменимых аминокислот - основных лизина и аргинина (р<0,01), нейтральных аланина и лейцина (р<0,01), треонина, изолей-цина, валина (р<0,05), ароматических аминокислот фенилаланина, триптофана и иминокислоты пролина (р<0,01).

Обработка экспериментальных данных, полученных при изучении кинетики ферментативных реакций и выхода ферментативных БГ, позволила сконструировать модель двухстадийного гидролиза многосубстратных белковых основ с подобранными степенью разведения гидролизуемой смеси, состоянием белкового субстрата (нативное или денатурированное), схемой дробного введения ферментосодержащего сырья Известно, что в модельных системах глубина гидролиза значительно меньше, но дробное введение ферментов в начале гидролиза и через 5 ч явилось пусковым механизмом в начале ингибирования ферментативных реакций. Предварительное демаскирование полипептидных цепей при термоденатурации белка и последовательная атака ферментами в разные временные интервалы процесса позволяют приблизить условия гидролиза к естественным, протекающим in vivo в желудочно-кишечном тракте, где происходит тотальный гидролиз белка до аминокислот.

Оптимальная для роста бифидобактерий степень конверсии белка достигалась через 2,5 ч гидролиза. Готовый продукт характеризовался:

- степенью конверсии белка в пределах 36-40 %;

- содержанием аминного азота - 0,40-0,45 %;

- аминограммой с соотношением незаменимых аминокислот к их общему содержанию в пределах 74-75 %.

Оптимальная для роста лактобактерий степень конверсии белка достигалась через 24 ч в двухстадийной модели гидролиза. Готовый продукт характеризовался:

-степенью конверсии белка в пределах 73-75 %;

- содержанием аминного азота - 0,8-0,9 %;

- аминограммой с соотношением незаменимых аминокислот к их общему содержанию в пределах 65-70 %.

Выход ферментативных КПГ и МПГ с глубокой степенью конверсии субстратов, оцениваемый по увеличению содержания аминного азота, превысил контрольные показатели на 50 - 60 %.

В таблице 3 приведены результаты контроля химического состава мясных и казеиновых БГ, полученных регламентированными способами, и опытных МПГ и КПГ после гидролиза в течение 2,5 и 24 ч.

Таблица 3

Характеристика химического состава панкреатических БГ, полученных оптимизированным и регламентированным способами

Наименование БГ (п - количество опытов) Количество субстрата в 1 л смеси, г Контрольные параметры

общий азот, % (М±т) аминный азот, % (М±т) триптофан, мг/мл (М±т)

основной субстрат печень КРС

1 2 3 4 5 6

КПГ с глубокой степенью конверсии п=5 60 40 1,09±0,03 0,80±0,02" 1,37±0,03*

КПГ со средней степенью конверсии п=5 60 40 1,09+0,04 0,42+0,02 0,98±0,04

Казеиновый (К) п=5 100 - 1,08+0,04 0,52+0,03 0,95±0,04

МПГ с глубокой степенью конверсии п=5 250 40 1,16±0,03 0,85±0,03~ 1,42±0,02*

МПГ со средней степенью конверсии п=5 250 40 1,18+0,03 0,43+0,02 1,10+0,05

Мясной (К) п=5 330 - 1,15+0,02 0,55+0,02 1,02+0,04

Примечания -

1 В качестве основных субстратов протеолиза использовали казеин и фарш-отжим

2 * - различие с контролем статистически значимо (р<0,05)

** - различие с контролем статистически значимо (р<0,01)

Как видно из результатов таблицы, установлена статистическая значимость различий в содержании аминного азота и триптофана между опытными образцами БГ и образцами КПГ и МПГ с глубокой степенью конверсии субстрата, полученных через 24 ч гидролиза.

Сравнительный анализ аминокислотного состава серий МПГ и КПГ с глубокой степенью конверсии белка позволил установить, что общее содержание аминокислот в МПГ на 23 % превышает сумму содержания аминокислот в КПГ, причем преимущественно за счет кислых аминокислот (на 36-54 %), нейтральных глицина и аланина (на 50-70 %), изолейцина, треонина (на 30-35 %), основных лизина и аргинина (на 25-45 %). Статистически значимых различий между содержанием нейтральных валина, лейцина, се-рина, серосодержащей аминокислоты метионина в сериях МПГ и КПГ не выявили, а содержание ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина в КПГ на 6-10 % превышало их содержание в МПГ.

Установлено, что общее содержание аминокислот в МПГ с глубокой степенью конверсии белка, полученном через 24 ч гидролиза (сумма аминокислот (57,57±0,02) мг/мл) превышает содержание аминокислот в контрольном казеиновом БГ, полученном регламентированным способом через 5 сут гидролиза (сумма аминокислот (28,06±0,02) мг/мл) на 105 % (р<0,001).

Аминокислотный состав контрольных мясных БГ и МПГ с разной степенью конверсии белка представлен в таблице 4.

Таблица 4

Аминокислотный состав белковых гидролизатов, полученных регламентированным и оптимизированным способами

Гидролизаты п=5 Аминокислота мг/мл МПГ с глубокой степенью конверсии субстрата (М±т) МПГ со средней степенью конверсии субстрата (М±т) Мясной гидролизат (контроль) (М±т)

Алифатические

Глицин 1,944±0,022* 0,364+0,008" 1,408±0,013

Алании 3,606+0,028" 1,313+0,025" 2,160+0,023

Валин 3,579+0,023* 1,430±0,03Г 2,825±0,026

Лейцин 5,618+0,029" 3,685±0,026 3,244+0,028

Изолейцин 3,433+0,026** 1,464+0,018* 2,451+0,017

Гидроксиаминокислоты

Серии 3,317+0,014* 0,779+0,019** 2,725±0,018

Треонин 2,Э64±0,026" 0,713+0,013" 2,104±0,026

Дикарбоксильные

Асларагиновая к-та 2,827+0,027" 0,518+0,007" 1,684±0,009

Глютаминовая к-та 4,543±0,032* 0,750+0,010** 3,657+0,025

Аминокислоты с катионообразующими группами в боковых цепях

Гистидин 2,484+0,025* 1,340+0,019* 2,236±0,024

Лизин 5,623±0,022** 2,959±0,024* 3,696±0,031

Аргинин 4,081+0,029" 1,719+0,020* 2,229+0,023

Серосодержащие аминокислоты

Цистеин

Метионин 2,013+0,027* 1,406±0,015 1,554±0,023

Ароматические аминокислоты

Фенилаланин 3,174±0,028" 2,088±0,022 2,001 ±0,019

Тирозин 1,220+0,014" 2,999±0,015* 0,692+0,007

• Триптофан 5,112±0,025* 2,783+0,024* 3,987+0,031

Иминокислота

Пролин 2,026±0,020" 0,247±0,007" 1,036+0,015

Сумма 57,567±0,020 26,557±0,018 36,889±0,020

Примечание - *- различие с контролем статистически значимо (р<0,05);

** - различие с контролем статистически значимо (р<0,01).

Содержание отдельных аминокислот в конечном продукте через 24 ч гидролиза превышало содержание тех же аминокислот в МПГ со средней степенью конверсии белка в 1,4-8,2 раза в зависимости от групп, что позволило установить закономерности выхода отдельных аминокислот в реакционную смесь. В первую очередь происходил выход основных аминокислот, затем ароматических, причем содержание тирозина в МПГ со средней степенью конверсии белка в 2,4 раза превышало его содержание в конечном продукте. Аминокислоты по скорости отщепления от белков можно расположить в следующей последовательности: основные > ароматические > серосодержащие > нейтральные > кислые > иминокислота пролин. Таким образом, через 2,5 ч гидролиза в БГ установили высокое содержание основных,

ароматических, серосодержащих и нескольких нейтральных аминокислот (лейцина, изолейцина, аланина, валина).

Общее содержание аминокислот в МПГ со средней степенью конверсии белка уменьшилось на 28-30 % в сравнении с контрольными сериями мясных БГ и на 54 % в сравнении с МПГ с глубокой степенью конверсии белка.

Оценка роста бактериальных популяций лакто- и бифидобактерий в МПГ и КПГ с подобранными степенью расщепления белка и аминокислотно-пептидным составом в сравнении с показателями урожая и скорости роста лакто- и бифидобактерий в контрольных образцах БГ, позволила выявить статистически значимую разность показателей роста изучаемых культур (р<0,01).

Таким образом, на основании изучения аминокислотного состава фракций МПГ с разной степенью конверсии белка установлены последовательность отщепления аминокислот от белков в процессе гидролиза и качественно-количественные характеристики фракций, обладающих высокой рост-стимулирующей активностью в отношении производственных штаммов лак-то- и бифидобактерий.

Разработка способа получения ферментативного дрожжевого гидролизата с высокой ростстимулирующей активностью в отношении лакто- и бифидобактерий

Одним из перспективных источников для крупномасштабного получения смесей аминокислот, низкомолекулярных пептидов, нуклеиновых компонентов, витаминов и других органических «ростовых факторов» являются дрожжи рода БассИаготусеэ в физиологически активном состоянии, представляющие собой доступный субстратный источник в связи с практической неисчерпаемостью ресурсов для выращивания дрожжей [Белоусова И. Н., Гор-диенко С. В., 1990]. Наиболее эффективным способом переработки биомассы дрожжей с целью выделения из нее биологически активных веществ является индуцированный автолиз [Науменко Н. И. и др., 1985, 1990; Белоусова Н. И. и др., 1990; Латов В. К., Бабаян Т. Л. и др., 1990].

Регламентированный статический способ промышленного производства дрожжевых автолизатов (ДА) в бутылях без растворения в водной среде и использования плазмолизирующих реагентов препятствует максимально возможному выходу питательных веществ, являющихся нутриентами для потребления микроорганизмов. Полученные ДА характеризуются содержанием аминного азота в пределах (0,17±0,2) % и низкой удельной активностью автолиза.

Для ускорения автолиза использовали вещества, интенсифицирующие процесс автолиза, обладающие плазмолизирующим действием и препятствующие развитию посторонней микрофлоры. На основании проведенных исследований по изучению процесса автолиза при воздействии различных индуцирующих реагентов в качестве индуктора для промышленного применения подобрали хлороформ в концентрации 1,5 % в реакционной смеси. Установлено, что индуцирование автолиза дрожжей хлебопекарных подобранным

видом плазмолизирующего реагента позволило значительно ускорить кинетику ферментативных реакций и получить за 6 ч процесса больший выход растворимой части автолизованных дрожжей, чем в контроле за 24 ч автолиза (р<0,001)

При изучении рН автолизируемой биомассы дрожжей в ходе технологического процесса в течение 24 ч установлено, что показатели рН реакционной смеси находились в интервале слабокислых величин - от 4,5 до 5,8 в зависимости от использования разных партий дрожжей (п=50). Полученные нами результаты изучения рН автолизируемой биомассы в процессе автолиза не согласуются с данными литературы о самопроизвольном изменении рН смеси в ходе автолиза. В ходе процесса автолиза установлено незначительное изменение рН реакционной смеси в интервале 0,1-0,3 ед. от начальных показателей рН. Учитывая рН-оптимумы ферментативного профиля автолизирующих дрожжей [Неклюдов А. Д. и др., 1993], мы предположили, что при кислом рН реакционной смеси эндо- и экзопептидазы дрожжей не проявляют специфического протеолитического действия в достаточной степени, так как рН реакционной смеси в ходе всего технологического процесса при регламентированной технологии автолиза дрожжевой биомассы является оптимальным только для определенной группы эндопептидаз типа папаи-на с оптимумом действия при рН 4,5-5,5.

Мы оптимизировали технологию производства ДА с учетом последовательной активации ферментативного профиля автолизирующих дрожжей, для чего через 6 ч автолиза провели направленное изменение рН автолизи-руемой биомассы. В качестве контроля использовали серии ДА, полученные при тех же условиях, но без направленного изменения рН (рис. 2).

350

1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Время автолиза ч

Рис. 2 - Зависимость накопления аминного азота от времени при различных рН

автолизируемой биомассы Примечания - ряд I - автолиз биомассы дрожжей при рН 5,5-5,7 (К),

ряд II - автолиз биомассы дрожжей с коррекцией рН 7,0 после 6 ч процесса.

При сравнительном анализе степени конверсии дрожжевого белка собственными ферментами с направленной коррекцией рН до слабо-щелочных величин и без коррекции рН мы выявили статистически значимые различия в

накоплении аминного азота (р<0,05). Изменение рН до нейтральных величин через 6 ч автолиза позволило увеличить степень конверсии субстрата на 10 % и получить концентрацию аминного азота в реакционной смеси выше контрольных величин в разных временных интервалах процесса (через .8 ч автолиза - на 15 %, через 24 ч - на 20 %).

При дальнейшей оптимизации процесса гидролиза дрожжевого белка выявлено, что при введении порции экзогенного фермента (панкреатина) в реакционную смесь через 24 ч автолиза после завершения стадии активации дрожжелитических ферментных систем, содержание аминного азота за следующие 6 ч гидролиза возрастает до 0,37-0,38 %, т.е. на 25 % выше содержания аминного азота в дрожжевом автолизате, полученном оптимизированным способом с введением индуктора автолиза и направленным изменением рН и на 100-120 % выше содержания аминного азота в ДА, полученном регламентированным способом через 48 ч автолиза (К).

В таблице 5 приведены сравнительные характеристики химического состава контрольного ДА и опытных образцов ДА, полученных при индуцировании процесса автолиза хлороформом, и образцов ФДГ после завершения технологического процесса.

Таблица 5

Характеристика дрожжевых автолизатов и гидролизатов, полученных оптимизированными и регламентированным способами

Наименование дрожжевых полуфабрикатов (п - количество опытов) Контрольные параметры

общий азот, % М±ш аминный азот, % М±т триптофан, мг/мл М±т нуклеиновые компоненты, мкг/мл М±т

ФДГ п=3 0,40+0,02 0,38±0,0Г 1,15+0,04* 1042,8±31,4"

ДА, полученный с хлороформом п=3 0,40±0,02 0,29*0,01" 1,06+0,05* 910,2+29,6*

ДА (контроль) п=3 0,40+0,03 0,17±0,02 0,85*0,05 704,6+35,5

Примечание - * - различие с контролем статистически значимо (р<0,01) ** - различие с контролем статистически значимо (р<0,001)

При контроле накопления триптофана в реакционной смеси мы отметили максимальное накопление триптофана через 20 ч автолиза до (1,15±0,04) мг/мл в контрольных вариантах триптофан максимально накапливался через 30 ч автолиза до (0,85±0,05) мг/мл. Сравнительная характеристика содержания витаминов группы В в дрожжевых полуфабрикатах позволила отметить, что в сериях ФДГ увеличено содержание витамина В2 (рибофлавина) в 5 раз (р<0,001), витаминов В^, Вз, В5- в 1,7-3,2 раза в сравнении с контролем (р<0,01). Общее содержание аминокислот в ФДГ на 40-45 % больше содержания аминокислот в контрольном ДА.

Таким образом, нами разработана технологическая схема производства ферментативного дрожжевого гидролизата в условиях термостатируемого реактора, снабженного паровой рубашкой и мешалкой двухлопастной с частотой вращения 0,75 с1, с подбором оптимальных условий для ведения управляемого процесса и стандартизации получаемого продукта.

Конструирование питательных сред для культивирования производственно-ценных штаммов лакто- и бифидобактерий

На основании сравнительного изучения биологических свойств лакто- и бифидобактерий, используемых в качестве промышленных штаммов в иммунобиологической и молочной промышленности, установлена целесообразность использования приоритетных штаммов - пробионтов с учетом результатов исследований свойств, контроль которых не заложен в нормативно-технической документации (адгезивность, антибиотикорезистентность, устойчивость к биологическим жидкостям) Охарактеризованы антагонистически активные, адгезивные штаммы лактобактерий, устойчивые к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта - 1_ р!а^агит 8Р-А3 и 1_ fermentum 90Т-С4, антибиотикорезистентные штаммы 1_. р!а^агит 8Р-А3, 1_ ааСсрИНит 100 АШ, антагонистически активные, адгезивные, устойчивые к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта штаммы В. ЫШит 1 и В. аСЫевсепйэ МС-42.

Далее мы изучили параметры роста подобранных штаммов при культивировании в сконструированных средах, питательная основа которой была составлена из белковых гидролизатов, полученных оптимизированными способами Основу казеиново-мясо-дрожжевой среды (КМД) для получения биомасс подобранных штаммов лакто- и бифидобактерий составили из мясо-печеночного и казеино-печеночного гидролизатов с оптимальной для каждого рода бактерий степенью конверсии белка, и ферментативного дрожжевого гидролизата

Рис. 3 - Динамика роста культуры 1_ р!аМагит 8Р-А3 в питательных средах КД (I) и КМД (II)

Примечание - * - различие с контролем статистически значимо (р<0,01)

Кинетика роста микробной популяции характеризовалась наличием всех фаз роста Анализ кинетических кривых роста культуры лактобактерий в среде КМД позволил установить укорочение лаг - фазы роста в 2 раза (0-1 ч), фаза экспоненциального роста продолжалась 4 ч (1-5 ч), фаза замедления роста - 3 ч (5-8 ч) и через 8 ч роста культура лактобактерий переходила к стационарной фазе. Таким образом, при культивировании лакто-

бактерий в среде КМД в 2,5 раза увеличивалась удельная скорость роста (р<0,001), в 2,4 раза сокращалось время генерации бактериальной популяции, сокращалась длительность процесса (с 10-11ч до 8,5-9 ч) В целом, бактериальная популяция лактобактерий, полученная в среде КМД, характеризовалось статистически значимым увеличением концентрации микробных клеток (млрд/мл), высоким содержанием жизнеспособных клеток (КОЕ/мл), стабильностью основных биологических свойств при хранении.

Рис. 4 - Динамика роста культуры В. bifidum 1 в питательных средах КД (I) и КМД (II)

Примечание - * - различие с контролем статистически значимо (р<0,01)

Анализ кинетики роста бифидобактерий в сконструированной питательной среде позволил также выявить все закономерности роста бактериальной популяции. Задержка роста и размножения бифидобактерий (лаг-фаза), как следствие физиологической адаптации их к условиям свежей питательной среды, сокращалась с 3 ч (в контроле) до 1,5 ч. В опытной среде культура достигала фазы экспоненциального роста через 4 ч (4-9 ч), стационарная фаза наступала через 18-19 ч роста (в контроле - через 7 ч и 22-24 ч).

Проведенные исследования подтверждают справедливость концепции замены основы питательной среды из регламентированных гидролизата казеина и дрожжевого автолизата в составе питательных сред КД на основу из подобранных соотношений мясо-печеночного, казеино-печеночного и ферментативного дрожжевого гидролизатов, полученных оптимизированными методами. Высокие ростовые свойства данной среды обусловлены много-компонентностью источников азотистого питания лакто- и бифидобактерий с оптимальной для каждого рода микроорганизмов степенью конверсии белка и рациональным подбором составных компонентов.

Питательная основа сред из белковых гидролизатов, полученных по совокупности разработанных биотехнологических способов, позволяет сократить расход полуфабрикатов в 2,5 - 3 раза. Популяции лакто- и бифидобак-терий, выращенные в питательных средах КМД, обладают хорошей жизнеспособностью, соответствуют предъявляемым требованиям при морфологической проверке, стабильны при хранении В таблице 6 приведены показа-

тели параметров роста подобранных штаммов лакто- и бифидобактерий в сконструированных и контрольных питательных средах.

Таблица 6

Сравнительная характеристика параметров роста производственных штаммов лакто- и бифидобактерий

Штамм Питательная среда Способ культивирования Парамет эы роста культуры

Содержание живых клеток в lg к концу роста (М±т) Максимальная удельная скорость, Цтах.Ч"1 (М+т) Время генерации, tcLn ч (М±т)

1 2 3 4 5 6

L. plantarum 8Р-АЗ кмд Динамический 10,12+0,02* 1,79±0,02" 0,39+0,04"

КД(К) Динамический 9,80±0,03 0,71 ±0,02 0,97+0,03

L. fermentum 90Т-С4 кмд Динамический 10,09±0,03* 1,16±0,03** 0,60±0,02**

кд (Ю Динамический 9,69±0,04 0,55±0,02 1,26+0,05

В. bifidum 1 кмд Статический 9,30±0,03" 0,54+0,01* 1,28±0,03*

КД(К) Статический 8,66±0,04 0,35+0,03 1,98±0,06

В. adolescente МС-42 КМД Статический 9,56+0,03** 0,56+0,02* 1,24+0,03*

КД (К) Статический 8,68±0,02 0,39±0,02 1,78±0,03

Примечание - * - различие с контролем статистически значимо (р<0,05);

** - различие с контролем статистически значимо (р<0,01).

Таким образом, в результате проведенных исследований оптимизированы способы получения основных компонентов питательных сред - ферментативных белковых гидролизатов и дрожжевых автолизатов, обладающие высокой ростстимулирующей активностью в отношении производственных штаммов лакто- и бифидобактерий. Разработанная рецептура питательной среды, белковая основа которых составлена из подобранных соотношений БГ, обеспечивает высокие показатели чувствительности, эффективности и скорости роста подобранных производственно-ценных штаммов лакто- и бифидобактерий.

Выводы.

1 Оптимизированы промышленные способы производства ферментативных белковых гидролизатов, обеспечивающие получение продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотно-пептидным составом:

- двухстадийная модель гидролиза многосубстратных белковых основ способствует ускорению кинетических параметров процесса - сокращает продолжительность процесса в 5 раз (для лактобактерий) и 48 раз (для бифидобактерий), увеличивает степень конверсии белка на 25-30 %, выход свободных аминокислот - на 35 -105 %;

- двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизирующих дрожжей ускоряет кинетику ферментативных реакций, способствует увеличению степени конверсии белка на 50 %, содержания свободных аминокислот - на

70 %, нуклеиновых компонентов - на 30 %, витаминов группы В - на 40-350%.

2 Подобраны степень конверсии белка и аминокислотно - пептидный состав белковых гидролизатов, увеличивающие скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто- и бифи-, добактерий. Максимальный ростстимулирующий эффект на микроорганизмы рода Lactobacterium оказывают белковые гидролизаты с глубокой степенью конверсии белка, полученные через 24 ч гидролиза, на микроорганизмы рода Bifidobacterium - белковые гидролизаты со средней степенью конверсии белка, полученные через 2,5 ч гидролиза.

3 Сконструированы питательные среды с высокой ростстимулирующей активностью для накопления бактериальных популяций производственных штаммов лакто- и бифидобактерий на основе органических субстратов, полученных по совокупности разработанных промышленных способов.

4 Подобраны производственно-ценные штаммы L. plantarum 8P-A3, L. fermentum 90T-C4, В. bifidum 1, В. adolescentis MC-42 на основании изучения биологических свойств, расширяющих спектр традиционных регламентированных требований.

5 Изучены скорость роста и стабильность основных биологических свойств бактериальных популяций производственных штаммов лакто- и бифидобактерий, полученных в сконструированных питательных средах. Накопление бактериальных популяций в разработанных питательных средах характеризуется увеличением удельной скорости роста и высоким содержанием жизнеспособных клеток.

Практические рекомендации.

1 Белковые гидролизаты с заданными степенью конверсии белка и ами-нокислотно-пептидным составом используются в составе белковых основ при конструировании питательных сред для накопления бактериальных популяций лакто- и бифидобактерий.

Для культивирования лактобактерий рекомендуется использование мясо - печеночного и казеино-печеночного гидролизатов с глубокой степенью конверсии белка, содержанием аминного азота (0,85±0,05) %, соотношением незаменимых аминокислот к общему содержанию аминокислот в пределах 65-70 %.

Для культивирования бифидобактерий рекомендуется использование мясо-печеночного и казеино-печеночного гидролизатов со средней степенью конверсии белка, содержанием аминного азота (0,425±0,025) %, соотношением незаменимых аминокислот к общему содержанию аминокислот в пределах 74-78 %.

2 Ферментативный дрожжевой гидролизат рекомендуется использовать в качестве компонента белковой основы при конструировании питательных сред для накопления бактериальных популяций лакто- и бифидобактерий вследствие высокой ростстимулирующей активности в отношении лакто- и бифидобактерий, обусловленной аминокислотно-пептидным составом, высоким содержанием нуклеиновых компонентов, витаминов группы В и углеводов.

3 Питательные среды, сконструированные согласно разработанным рецептурам с учетом биологической ценности входящих в состав гидролизатов, рекомендуются для крупномасштабного периодического глубинного культивирования подобранных производственных штаммов лакто- и бифидобакте-рий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

, , 1 Усовершенствование технологии получения лактобактерина / Р. X. Тимербаева, Н. Н. Ворошилова, Т. А. Баталова [и др.] // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: матер. Всерос. науч. конфер.-Уфа, 2000.-Ч. 1.-С. 193-198.

2 Разработка модифицированной питательной среды для производства лактобактерина / Р. X. Тимербаева, Т. А. Баталова // Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и лечения инфекционных и аллергических заболеваний: матер, науч.- практ. кон-фер. посвященной 100-летию Казанского НИИЭМ. - Казань, 2000. -С. 31.

- 3 Разработка комплексного препарата «Лактоферон» для профилактики и лечения гинекологических воспалительных заболеваний различной этиологии / Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, Т. А. Баталова [и др.] // Там же. - С. 90-91.

4 Конструирование питательных сред для производства препаратов - пробиотиков/ Р. X. Тимербаева, Т. А. Баталова // Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем: матер. Ill Международ, науч.-практ. конфер. - Махачкала, 2001. - С. 20-21.

5 Подбор микроорганизмов - пробионтов для конструирования комплексных бактерийных препаратов / Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, Т. А. Баталова // Медицинская наука - 2003: матер. Республ. конфер. молодых ученых. - Уфа, 2003. - С. 87-88.

6 Изучение биологических свойств лактобактерий при разработке суппозиториев «Лактоферон», применяемых для профилактики и лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта // Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, Т. А. Баталова// Там же. - С. 89-90.

7 Использование микроорганизмов - пробионтов в составе комплексных бактерийных препаратов/ Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, Т. А. Баталова // Человек и лекарство: матер. XI Российского национального конгресса- Москва, 2004. - С. 482.

8 Разработка способа получения панкреатических белковых гидролизатов для производства пробиотиков / Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, Т. А. Баталова // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии: матер. Всерос. науч. конфер. -Уфа, 2004. - С. 191-194.

9 Сравнительное изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов - пробион-тов / Р. X. Тимербаева, Т. Н. Кузнецова, Т. А. Баталова [и др.] // Там же. - С. 194196.

10 Сравнительное изучение пептидного и аминокислотного состава панкреатических белковых гидролизатов / Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, Т. А. Баталова [и др.] //Там же. -С. 196-199.

11 Оптимизация процесса автолиза дрожжей хлебопекарных / Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, Т. А. Баталова // Там же. - С. 265-268.

12 Биотехнологические аспекты конструирования питательных сред для культивирования лактобацилл / Р. X. Тимербаева, Е. В. Бобкова, М. М. Туйгунов // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: матер. Всерос. науч. конфер. - Томск, 2004. - С. 133-136.

13 Способ получения панкреатического белкового гидролизата и питательная среда для культивирования бифидобактерий с его использованием / Р. X. Тимербаева, Т. А. Баталова// решение № 2002132307 о выдаче патента на изобретение от 26.11.2004 г.

Тимербаева Рина Харисовна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ-ПРОБИОТИКОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ответственный за выпуск Р К. Каримова

Подписано в печать 20.01.05 г. Бум. офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Anal Суг». Отп. на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 111.

РИО филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, тел: (3472) 213-214

ï '

¡•г.Ъ

г Г "

HА 1476

с i / ■

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Тимербаева, Рина Харисовна

Список сокращений и условных обозначений

Введение

Обзор литературы

Глава 1 Биотехнологические аспекты ферментативного гидролиза биологических субстратов

1.1 Принципы гидролиза биологического сырья для получения продукта с заданными свойствами

1.2 Принципы автолиза дрожжевого сырья для получения продукта с заданными свойствами

Глава 2 Конструирование питательных сред для культивирования лакто- и бифидобактерий

Глава 3 Биологические производственно-ценные свойства промышленных штаммов лакто - и бифидобактерий

Собственные исследования

Глава 4 Материалы и методы исследований

Глава 5 Оптимизация способа получения ферментативных казеиновых и мясных гидролизатов с высокой ростстимулирующей активностью в отношении лакто- и бифидобактерий

5.1 Изучение степени конверсии модельного белкового субстрата при использовании различных ферментных препаратов и ферментосодержащего биологического сырья

5.2 Изучение кинетики ферментативных реакций и химического состава ферментативных белковых гидролизатов при конструировании двухстадийной модели гидролиза

5.3 Изучение влияния степени конверсии субстрата и аминокислотного состава ферментативных белковых гидролизатов на накопление биомасс лакто- и бифидобактерий

5.4 Изучение химического состава и выхода панкреатических • 1 белковых гидролизатов, полученных разработанными способами

5.5 Изучение скорости роста и стабильности основных биологических свойств лакто- и бифидобактерий на моделях панкреатических белковых гидролизатов, полученных разработанными способами

Глава 6 Разработка способа получения ферментативного дрожжевого гидролизата с высокой ростстимулирующей активностью в отношении лакто- и бифидобактерий

6.1. Изучение качественной характеристики дрожжей хлебопекарных прессованных разных производителей 856.2. Изучение влияния условий автолиза и плазмолизирующих реагентов на скорость и степень конверсии дрожжевого сырья

6.3 Конструирование двухстадийной модели гидролиза дрожжевого сырья при последовательном воздействии эндогенных и экзогенных ферментов

6.4 Изучение химического состава и выхода дрожжевых автолизатов и ферментативных гидролизатов

6.5 Изучение скорости роста и стабильности основных биологических свойств лакто- и бифидобактерий на моделях дрожжевых автолизатов и ферментативных гидролизатов

Глава 7 Конструирование питательных сред для культивирования лактои бифидобактерий

Глава 8 Сравнительное изучение биологических свойств производственных штаммов лакто - и бифидобактерий 132 8.1 Антагонистическая активность исследуемых штаммов лакто-и бифидобактерий

8.2 Активность кислотообразования исследуемых штаммов лакто-и бифидобактерий

8.3 Адгезивная активность исследуемых штаммов лакто-и бифидобактерий

8.4 Антибиотикорезистентность исследуемых штаммов лакто-и бифидобактерий

8.5 Устойчивость исследуемых штаммов лакто- и бифидобактерий к биологическим жидкостям (желудочному соку, желчи)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков"

Актуальность проблемы

Одним из достижений конца XX века явились разработка и внедрение в жизнь концепции «пробиотики и функциональное питание» [Шендеров Б.А., 2002; Roberfroid М.В., 1998; Kenings W.N., 2000]. Практическая реализация данной концепции способствует решению проблемы массового оздоровления населения, так как реальные и потенциальные потребности отечественного рынка пробиотиков обусловлены широкой распространенностью нарушений естественного микробиоценоза человека.

Приоритетным направлением современной промышленной микробиологии являются многоплановые исследования в области разработки эффективных средств коррекции биоценозов, усовершенствовании выпускаемых форм препаратов, интенсификации и повышении экономической эффективности производства [Алешкин В.А., 2002; Поспелова В.В. и др., 2002; Бонда-ренко В.М. и др., 2004; Collins M.D., Gibson G.R., 1999; Cummings J.H. et'al., 2001; Floch M.N., Hong - Curtiss J., 2001].

Прогноз, основанный на анализе экономических и технологических тенденций в сфере производства отечественных пробиотиков, позволяет сделать вывод о том, что в условиях ограниченных инвестиционных возможностей минимизация затрат, необходимая для развития производства в соответствии с требованиями GMP, может быть достигнута лишь при повышении эффективности технологических процессов [Казьянин А.В. и др., 2002]. Одним из стратегических направлений развития индустрии препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами является усовершенствование методологии промышленного получения биомасс кислотообразующих микрооргаиизмов-пробионтов, в частности, требуют дальнейшего разрешения вопросы обоснования и регламентации характеристик питательных сред для крупномасштабного культивирования лакто- и бифидобактерий [Лазарева Г.И., 1991; Критская И.В. и др., 1996; Андреева М.А. и др., 1998;

Степаненко П.П., 1999; Ганина В.И., 2001; Тихомирова Н.А., 2001; Poch М:, Bezkorovainy А., 1988; Gibson G.R., Fuller R., 2000].

Известно, что потребность микроорганизмов в питательных веществах является фенотипическим выражением их генома. Формирование чрезвычайно ограниченных синтетических способностей лакто- и бифидобактерий филогенетически обусловлено их обитанием в естественных нишах биоценоза, где нутриенты значительно гидролизованы пищеварительными ферментами макроорганизма [Бойцов А.Г. и др., 1990; Работнова И.Л, Позмогова И.Н., 1993; Степаненко П.П., 1999]. При изучении питательных потребностей лакто- и бифидобактерий, адаптировавшихся к комплексным органическим субстратам, выявлена необходимость наличия в составе питательных сред аминокислот, витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, аминосаха-ров и других ингредиентов, к примеру, известно, что молочнокислые бактерии неизменно нуждаются в витаминах группы Вив значительном количестве аминокислот, потребности в которых гораздо шире соответствующих потребностей высших животных [Stanier R. Y., 1979]. Но, в то же время, ана-. лиз литературы не позволяет сделать достоверные выводы о влиянии амйно-кислотно-пептидного состава ферментативных белковых гидролизатов на на,-копление биомасс лакто- и бифидобактерий вследствие разноречивости данных о наиболее пригодных для них формах азотистого питания [Рахимова Н.Г., 1969; Воронкина И.М., 1970; Эрвольдер Т.М. и др., 1980; Назарова А.А., 1991; Работнова И.Л, 1993; Андреева М.А., 1998; Степаненко П.П., 1999; Stanier R.Y. et al, 1979; Jeremija L. et al., 1983; De Feo J.A., 1985]. Регламентированные технологии производства питательных сред для культивирования лакто- и бифидобактерий предусматривают использование гидролизата казеина с высокой степенью конверсии белка после гидролиза в течение 5-7 суток [Рахимова Н.Г. и др., 1975].

Исходя из этого, одним из актуальных направлений создания препаратов и продуктов функционального питания с пробиотическими свойствами являются разработка методов направленного гидролиза биологического сырья для получения белковых гидролизатов и дрожжевых автолизатов с заданными свойствами, в частности, с увеличенным содержанием фракций, обладающих ростстимулирующим действием на изучаемые культуры микроорганизмов, и конструирование на их основе питательных сред с высокими ростовыми свойствами для накопления биомасс лакто- и бифидобактерий [Тер-новская JI.H. и др., 1993; Критская И.В. и др., 1996; Ильина P.M. и др., 2000; ГанинаВ.И., 2001; D.Dai, W.A.Walcer, 1999].

Задачи исследования:

1 Оптимизировать промышленные способы получения основных компонентов питательных сред - ферментативных белковых гидролизатов ' и дрожжевых автолизатов. ' i

2 Изучить влияние степени конверсии субстратов, качественных и количественных характеристик аминокислотного состава ферментативных белковых гидролизатов на скорость роста и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто- и бифидобактерий.

4 Охарактеризовать производственные штаммы лакто- и бифидобактерий по совокупности биологических свойств: антагонистической,"ки-слотопродуцирующей, адгезивной активности, антибиотикорезистентности, устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта':

Научная новизна.

Впервые выявлено ростстимулирующее действие фракций белковых гидролизатов с различной степенью конверсии белка на накопление биомасс лакто- и бифидобактерий. На основании изучения потребностей микроорганизмов в наиболее усвояемых формах азотистого питания оптимизированы условия гидролиза подобранных многосубстратных белковых основ, обеспечивающие эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотным составом.

Предложена двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизи-рующих дрожжей, обеспечивающая получение ферментативного гидролизата с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот и витаминов группы В.

Научно-практическая значимость работы.

1 Оптимизированы промышленные способы производства ферментативных белковых гидролизатов с дифференцированными для лакто- и бифидобактерий степенью конверсии белка и аминокислотным составом.

2 Разработан способ реакторного получения ферментативного дрожжевого гидролизата с индуцированными условиями ведения процесса, последовательной активацией эндогенных и экзогенных ферментов, обеспечивающий получение продукта с высокой ростстимулирующей активностью в'Ьт-ношении лакто- и бифидобактерий.

4 Дана сравнительная характеристика производственных штаммов лакто- и бифидобактерий, используемых в иммунобиологической и молочной

• Mr промышленности, по совокупности биологических свойств, определяющих расширение спектра традиционных регламентированных требований: антагонистической, кислотопродуцирующей, адгезивной активности, антибиоти-корезистентности, устойчивости к биологическим жидкостям желудочно-кишечного тракта.

5 Изучены скорость роста и стабильность основных биологических свойств бактериальных популяций подобранных штаммов лакто- и бифидобактерий, полученных в новых питательных средах.

Внедрение результатов исследования в практику.

По материалам исследований составлена и утверждена нормативно-техническая документация:

1. Регламент производства № 1195-02 Лактобактерии сухой

2. Регламент производства № 1165-02 Бифидумбактерин сухой

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Ростстимулирующее действие на накопление биомасс лакто- и бифидобактерий оказывает степень конверсии белковых субстратов. Максимальный ростстимулирующий эффект на штаммы лактобактерий оказывают гид-ролизаты с глубокой степенью конверсии белка, содержащие (0,85±0,05) % аминного азота, на штаммы бифидобактерий - гидролизаты со средней степенью конверсии белка, содержащие (0,425±0,025) % аминного азота.

2 Оптимизированные способы направленного гидролиза многосубстратных белковых основ обеспечивают эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотным составом. ' 1,1

3 Разработанная двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с индуцированными условиями автолиза и последовательной активацией ферментативного профиля дрожжей обеспечивает максимальный выход ферментативного дрожжевого гидролизата с высоким содержанием аминокислот, производных нуклеиновых кислот и витаминов группы В.

5 Бактериальные популяции производственно-ценных штаммов L. plantarum 8Р-АЗ, L. fermentum 90Т-С4, В. bifidum 1 и В. adolescentis МС-42, полученные в новых питательных средах, обладают высокой специфической активностью и стабильностью основных биологических свойств.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 95-летию Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова ГУП «Иммунопрепарат» (Уфа, 2000), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004), Международном научно-практическом семинаре «Вопросы вакцинопрофилактики и иммунокор-рекции» (г. Ташкент, 2004), заседании Ученого совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и CP РФ «Иммунопрепарат» (протокол № 4 от 24.11.2004 г.).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 185 страницах, иллюстрирована 40 таблицами, 16 рисунками и 4 технологическими схемами производства. Работа состоит из введения, обзора лите

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тимербаева, Рина Харисовна

Выводы

1 Установлена оптимальная для микроорганизмов родов Lactobacte-rium и Bifidobacterium степень конверсии белковых субстратов, оказывающая ростстимулирующее действие на накопление биомасс. Максимальный ростстимулирующий эффект на штаммы лактобактерий оказывают гидролизаты с глубокой степенью конверсии белка, содержащие (0,85±0,05) % аминного азота, 65-70 % незаменимых аминокислот, на штаммы бифидобактерий - гидролизаты со средней степенью конверсии белка, содержащие (0,425±0,025) % аминного азота, 74-78 % незаменимых аминокислот.

2 Оптимизированы промышленные способы производства панкреатических белковых гидролизатов из субстратов биологического происхождения, обеспечивающие получение продукта с заданной степенью конверсии.

Примененная двухстадийная модель гидролиза многосубстратных белковых основ увеличивает степень конверсии белка на 25-35 %, выход свободных аминокислот - на 35 -105 %, способствует ускорению кинетических параметров процесса: сокращает продолжительность в 5 раз для лактобактерий и 48 раз для бифидобактерий.

Двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с индуцированными условиями автолиза и последовательной активацией ферментативного профиля дрожжей ускоряет кинетику ферментативных реакций в 2 раза, способствует увеличению степени конверсии белка на 50-55 %, содержания свободных аминокислот - на 70 %, нуклеиновых компонентов — на 30 %, витаминов группы В - на 40 — 350 %.

3 Разработаны рецептуры экономически перспективных питательных сред с высокой ростстимулирующей активностью в отношении лакто- и бифидобактерий, основы которых в качестве источников азотистого питания содержат многосубстратные гидролизаты белковосодержащих отходов иммунобиологической промышленности.

4 По результатам исследования биологических свойств, определяющих расширение спектра традиционных регламентированных требований, установлены в качестве перспективных производственно-ценные штаммы L. fermentum 90Т-С4, В. adolescentis МС-42.

5 Разработанные питательные среды обеспечивают увеличение удельной скорости роста, высокий урожай бактериальных популяций и стабильность основных биологических свойств производственных штаммов лакто-и бифидобактерий.

Практические рекомендации

Для получения экономически перспективных панкреатических белковых гидролизатов рекомендуется двухстадийная модель гидролиза многосубстратных белковых основ, обеспечивающая эффективные кинетические параметры процесса и максимальный выход продукта с заданными степенью конверсии белка и аминокислотным составом.

Для конструирования многосубстратных основ рекомендуется использование белковосодержащих отходов иммунобиологической промышленности.

Для культивирования лактобактерий рекомендуется использование мясо-печеночного и казеино-печеночного гидролизатов с глубокой степенью конверсии белка, содержанием аминного азота (0,85±0,05) %, соотношением незаменимых аминокислот к общему содержанию аминокислот в пределах 65-70 %.

Для увеличения выхода питательных нутриентов хлебопекарных дрожжей (аминокислот, нуклеиновых компонентов, витаминов группы В) рекомендуется двухстадийная модель биотрансформации дрожжевого сырья с последовательной активацией ферментативного профиля автолизи-рующих дрожжей и воздействием экзогенного ферментного препарата.

Питательные среды, сконструированные согласно разработанным рецептурам с учетом биологической ценности входящих в состав гидролизатов, рекомендуются для крупномасштабного периодического глубинного культивирования подобранных производственно-ценных штаммов лакто-и бифидобактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Тимербаева, Рина Харисовна, Уфа

1. Айзенман, Б.Е. Антибиотические свойства бактерий / Б.Е.Айзенман. -К.: Наук. Думка, 1973. 183 с.

2. Андреева, М. А. и др. Питательная среда для производства жидкого концентрата бифидобактерий / М.А.Андреева, В.И.Байбаков,

3. A.В.Молокеев и др.// Биотехнология. 1998. - № 4. - с. 76-80.

4. Андрейчин, М.А. Антимикробные свойства желчи и желчных кислот / М.А.Андрейчин // Антибиотики. 1980. - Т. 25, № 12. - С. 936-939.

5. Артеменко, В.Д. Разработка и стандартизация питательных сред /

6. B.Д.Артеменко, В.П.Ненашев. -М.: Медицина, 1980. С. 83-88.

7. Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция: Сб. науч. тр. / под ред. И.Н.Блохиной, К.Я.Соколовой.- Горький: Мед.институт, 1988.- 144 с.

8. Ахапкина, И.Г. Питательные среды как искусственная среда роста и развития микроорагнизмов / И.Г.Ахапкина, Л.Р,Блинкова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2001. - № 6. — С. 99-108.

9. Бабаян, Т.Л. Способ оценки протеиназной активности комплесного ферментного препарата по данным кинетики протеолиза модельного белкового субстрата / Т.Л.Бабаян, В.К.Латов // Биотехнология. 2003. - № 6. -С. 47-51.

10. Баснакьян, И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / И.А.Баснакьян. М.: Медицина, 1992.- 169 с.

11. Беликов, В.М. Аминокислотный состав препаратов из автолизатов пекарских дрожжей / В.М.Беликов, С.В.Гордиенко, В.К.Латов и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1978. - т. XIV. - вып. 1. — С. 60-66.

12. Беликов, В.М. Кинетика гидролиза казеина протеолитическими ферментами / В.М.Беликов, Т.В.Антонова, Б.А.Квасов // Биоорганическая химия. 1979. - Т. 5, № 3. - С. 449- 457.

13. Белоусова, Н.И. Получение смесей аминокислот на основе автолизатов дрожжей Saccharomyces, выращенных на этаноле или сахарах / Н.И.Белоусова, С.И.Гордиенко, В.К.Ерошин и др. // Биотехнология. 1990. -№ 3. - С. 6-9.

14. Богатков, С.В. Оптимизация гидролиза белков щелочной протеина-зой Bacillus subtilis / С.В.Богатков, Т.Т.Фролова, И.М.Грачева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1982. - т. XVIII. - вып. 1. - С. 71-75.

15. Большаков, О.В. Проблемам здорового питания государственный статус / О.В.Большаков // Молочная промышленность. - 1998. - № 2. -С. 4-6.

16. Бондаренко, В.М. Дисбактериозы кишечника у взрослых / В.М.Бондаренко, Н.М.Грачева, Т.В.Мацулевич // М.: 2003. -114 с.

17. Бондаренко, В.М. Микроэкологические изменения кишечника и их коррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов / В.М.Бондаренко и др. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. -2003. №4. С. 66-75.

18. Бондаренко, В.М. Пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов / В.М.Бондаренко, Н.М.Грачева // Фарматека.- 2003.- № 7.- С.56-63.

19. Бондаренко, В.М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / В.М.Бондаренко, А.А.Воробьев // Журн. микробиологии. 2004. -№ 1.- С. 84-92.

20. Бондаренко, В.М. Дисбактериозы кишечника, их диагностика и терапия / В.М.Бондаренко // Лабораторная диагностика.- 2004: — № 3. -С. 14-18

21. Брилене, Т.А. Влияние половых гормонов на цитадгезию лактоба-цилл влагалища / Т.А.Брилене // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. Горький, 1988. - с.59-64.

22. Варфоломеев, С.Д. Биокинетика / С.Д.Варфоломеев, К.Г.Гуревич. — М.: Фаир-пресс, 1999.- 720 с.

23. Витт, С.В. Аминокислотный состав автолизатов и гидролизатов пекарских дрожжей и некоторых промышленных аминокислотных смесей / С.В.Витт, М.Б.Сапоровская, Е.А.Пасконова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. - т. XI. - вып. 3. - С. 418-422.

24. Воробьев, М.М. Химические превращения пищевых полимеров / М.М.Воробьев, В.М.Беликов. Калининград: Калининградский технический институт рыбной промышленности и хозяйства. 1991. - С. 20.

25. Воробьев, М.М. Исследование начальной кинетики гидролиза белков молока химотрипсином / М.М.Воробьев, И.Ю.Левчева, В.М.Беликов // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - т. 32 № 2. - С. 237-241.

26. Воробьев, А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А.Воробьев, Е.А.Лыкова // Журн. микробиологии. 1999.- № 6.- С.102-105.

27. Ганина, В.И. Изучение антагонистической активности и идентификация бифидобактерий и молочнокислых палочек, рекомендуемых для получения продукта лечебно-профилактического назначения и пробиотиков

28. В.И.Ганина, А.М.Лысенко, Ю.В.Гуреева и др. // Биотехнология. 1999.- № 2. С. 15-21.

29. Ганина, В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии / В.И.Ганина. М.: МГУПБ, 2001.- 169 с.

30. Гизатулина, С.С. Способ оценки состояния микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных бактерий и типу адгезинов / С.С.Гизатулина, М.О.Биргер, Л.И.Кулинич и др. // Клиническая микробиология. -№ 4.-1991.- с. 21-23.

31. Горелов, Л.В. Адгезия клинических изолятов Campilobacter jejuni к эпителиальным клеткам кишечника in vitro / Л.В.Горелов, Е.М.Горская, В.П.Жуховицкий // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 1990. -№ 7. -С. 32-34.

32. Горская, Е.М. Адгезия микробов к эпителиальным клеткам кишечника / Е.М.Горская // Антибиотики и микроэкология человека и животных.- 1988.-С. 79.

33. Горская, Е.М. Методические рекомендации по определению адгезии бактерий кишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого и толстого кишечника / Е.М.Горская, И.М.Манохина, А.В.Горелов и др. -М., 1989.-7 с.

34. Горская, Е.М. Адгезивные свойства бактерий кишечного происхождения / Е.М.Горская, Х.П.Ленцнер, А.А.Ленцнер и др. // Журн. микробиологии. № 4. - 1991,- с. 5-8.

35. Горская, Е.М. Биологическая характеристика штаммов лактоба-цилл, перспективных в качестве эубиотиков / Е.М.Горская, Н.Н.Лизько, А.А.Ленцнер и др. // ЖМЭИ. № 3. - 1992.- с. 17-20.

36. Григорьева, В.М. Чувствительность к антибиотикам бифидобактерий и лактобактерий, используемых для приготовления бифидумбактерина и лактобактерина / В.М.Григорьева, Л.Н.Астанина, С.В.Лесняк и др. // Антибиотики. 1983. - Т. 28. № 6. - С. 418-421.

37. Григорян, А.Н. Ферментативные дрожжевые гидролизаты как основа приготовления питательных сред / А.Н.Григорян, Г.Л.Головкина, О.Х.Тинякова // Матер, симп. по биотехнологии и биоинженерии. — Рига: Зинатне, 1978.-С. 15-16.

38. Дисбактериоз кишечника / Под. ред. М.Х. Турьянова // Лабораторные тесты. Микробиологическая и вирусологическая диагностика. Ч. 2. — М.: Каппа, 1995.-С. 58-66.

39. Донских, Е.Е. Качественный и количественный состав кислот, образуемых бифидобактериями / Е.Е.Донских, Г.И.Гончарова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1988. -№ 7. - С. 11-15.

40. Ермоленко, Е.И. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл / Е.И.Ермоленко, В.А.Исаков, С.Х Ждан-Пушкина и др. // Журн. микробиологии. 2004. - № 5. - С. 94-98.

41. Иванов, И.В. Питательная среда на основе солянокислотного гидролизата куриных эмбрионов для культивирования клеток животных. II. Отработка режима очистки гидролизата и состава питательной среды /

42. И.В.Иванов, С.Е.Строгов,Е.Ю.Коновалова и др. // Биотехнология. 1991. -№5.-С. 59-62.

43. Карпов, A.M. Оптимизация процесса культивирования бактерий Lactobacillus acidophilus в мембранном биореакторе // А.М.Карпов, Н.С.Каданцева, В.Ю.Ракитин и др. // Биотехнология. 1991. - № 2. -С. 41-43.

44. Карпушина, С.Г. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерий из кишечника человека / С.Г.Карпушина, М.В.Тюрин, А.А.Иванов и др. // Биотехнология. 1998. - № 2. - С. 28-36.

45. Келети, Т. Основы ферментативной кинетики: Пер. с англ. / Т.Келети.- М.: Мир, 1990. 350 с.

46. Козлов, Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии / Ю.А.Козлов.- М.: Медгиз.- 1950. 252 с.

47. Конькова, Н.К. Сравнительные характеристики питательных сред, используемых в качестве основы ветеринарных эубиотиков /

48. Н.К.Конькова, И.С.Горлова, Г.И.Григорьева // Проблемы ветеринарии на рубеже веков: Мат. науч.-практ. конфер. Н. Новгород, 2001. - С. 297-300.

49. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология / А.И.Коротяев, С.А.Бабичев // Учебник для медицинских ВУЗов. 2-е изд., испр. - Спб.: СпецЛит, 2000.- 591 с.

50. Коршунов, В.М. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованием гнотобиологической технологии / В.М.Коршунов, З.А.Уртаева, В.В.Смеянов и др. // Журн. микробиологии. 1999. - № 5. - С. 72-75.

51. Коршунов, В.М. Характеристика биологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника / В.М.Коршунов, Б.А.Ефимов, А.П.Пекина // Журн. микробиологии. 2000. - № 3 - С. 86-91.

52. Красникова, Л.В. Бифидобактерии и их использование в молочной промышленности (обзорная информация) / Л.В.Красникова, И.В.Салахова, В.И.Шаробайко и др. М.: АгроНИИТЭИММП, 1991. - 32 с.

53. Крестьянова, И.Н. Ферментные препараты для изучения белковых гидролизатов и смесей аминокислот, не содержащих пептидов / И.Н.Крестьянова, Л.И.Васильева, Е.К.Денякина и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. - т. XXI. - вып. 1. - С. 48-57.

54. Критская, И.В. Разработка питательной среды для накопления биомассы Bifidobacterium bifidum в процессе непрерывного культивирования в биореакторе / И.В.Критская, И.А.Баснакьян, Е.С.Гиршович и др. // Биотехнология. 1996. - № 5. - С. 81-83.

55. Крупянко, В.И. О выборе концентрации субстрата для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости ферментативной реакции / В.И.Крупянко, П.В.Крупянко // Прикладная биохимия и микробиология. — 1999. т. 35, № 2. - С. 133-136.

56. Курашвили, В.А. Опыт использования комплексного пробиотиче-ского препарата для профилактики и лечения заболеваний /

57. В.А.Курашвили, И.В.Высочин // Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: Мат. Международ. науч.-практ. конфер. М., 2002. - С. 48.

58. Лазарева, Г. И. Изучение физиологических свойств и структурно-функциональной организации бифидобактерий: Автореф. дис. канд. биол. наук: 14. 00. 07 / Институт микробиологии БССР.- Минск, 1991. -28 с.

59. Лихачева, А.Ю. Специфическая активность лактобацилл при совместном культивировании нескольких штаммов / А.Ю.Лихачева, Е.М.Горская // Новое в практике лабораторных исследований. — Нижний Новгород, 1991.- С.33-37.

60. Лыкова, Е.А. Антибактериальная резистентность штаммов, входящих в состав пробиотиков / Е.А.Лыкова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 2000. № 2. — С. 63-66.

61. Лянная, A.M. Кислотообразующие и антагонистические свойства бифидобактерий / А.М.Лянная, Г.И.Гончарова // Эпидемиология, диагностика и профилактика кишечных респираторных и природно-очаговых инфекций. -М., 1975. -С. 92-93.

62. Максимов, В.И. Кислотность кишечника как защитный фактор хозяина / В.И.Максимов, В.Е. Родоман // Журн. микробиологии. 1998,- № 4. -С. 96-101.

63. Маянский, А.Н. Дисбактериоз: иллюзии и реальность / А.Н.Маянский // Наука. 1999. - № 5.

64. Микробиологический контроль гидролизно-дрожжевого производства. М.: Экология, 1991. - 150 с.

65. Минушкин, О.Н. Дисбактериоз кишечника / О.Н.Минушкин, М.Д.Ардатская, В.Н.Бабин и др. // Российский медицинский журнал.- 1999. -№ 3. с. 40-44.

66. Митрохин С.Д. Дисбактериоз: современный взгляд на проблему. // Инфекции и антимикробная терапия. -2000. -№5. -Т.2.

67. Многотомное руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней: Общая микробиология / Под ред. проф. Н.Н.Жукова-Вережникова. М.: Медгиз, 1962. - Т. 1.-730 с.

68. Молохова, Е.И. Лекарственные препараты-пробиотики на российском фармацевтическом рынке / Е.И.Молохова, В.Н.Тарасевич // Фарма-ция.-2000.- № 3.-С.55-58.

69. Науменко, Н.И. Изучение автолиза дрожжей Saccharomyces сеге-visiae, выращенных на этаноле / Н.И.Науменко, С.В.Гордиенко // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. - т. XXI. - вып. 6. - С. 719-722.

70. Неклюдов, Д.А. Получение белковых гидролизатов с заданными свойствами (обзор) / Д.А.Неклюдов, С.М.Навашин // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. - т. XXI. - вып. 1. - С. 3-17.

71. Неклюдов, Д.А. Ферментативный профиль автолизирующих дрожжей / Д.А.Неклюдов, Н.В.Федорова, В.П.Илюхина и др. // Прикладная биохимия и микробиология. — 1993. — т. 29. — вып. 5. С. 734-743.

72. Неклюдов, Д.А. Гидролизующая способность дрожжевых протеаз по отношению к белковым субстратам / Д.А.Неклюдов, В.П.Илюхина, Г.И.Мосина и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. — т. 32 №2.-С. 231-236.

73. Неклюдов, Д.А. Оптимизация процесса гидролиза белковых субстратов дрожжевыми протеазами Saccharomyces carlsbergensis / Д.А.Неклюдов, А.Н.Иванкин, Г.И.Мосина и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - т. 34. - вып. 4. - С. 394-397.

74. Паршина, С.Н. Изучение автолиза дрожжей Candida guilliermondii, выращенных на средах с Н-алканами / С.Н.Паршина, В.Э.Стеркин, М.А.Гулько // Прикладная биохимия и микробиология. 1983. - т. XIX. -вып. 1.-С. 92-97.

75. Пат. 2080376 С1 РФ, С 12 N 1/20. Питательная среда для культивирования бифидобактерий / Л.Н.Терновская, Т.Э.Калинина, Н.И.Костина и др. Заявл. 02.12.93; Опубл. 27.05.97 // БИПМ. - 1997.

76. Пат. 2170763 С2 РФ, 7 С 12 N 1/20. Способ получения основы микробиологических питательных сред / С.В.Водолажская, Е.Э.Куприна, Г.Г.Няникова и др. Заявл. 21.07.1999; Опубл. 20.07.2001 // БИПМ. - 2001. - № 20.

77. Пат. 2104706 С1 РФ, 6 А 61 К 35/74, А 23 С 9/127, С 12 N 1/20. Способ получения бифидосодержащих препаратов / В.И.Байбаков, А.В.Молокеев, Л.Г.Никулин и др. Заявл. 10.09.96; Опубл. 20.02.98 // БИПМ. - 1998.

78. Пат. 2169763 С1 РФ, С 12 N 1/20. Молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий /Р.М.Ильина, А.В.Молокеев, В.И.Байбаков и др. Заявл. 26.06.00; Опубл. 27.06.01 // БИПМ.-2001.

79. Пат. 2087532 С1 РФ, 6 С 12 N 1/20. Питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий / Н.Н.Лищенко. Заявл. 15.06.94; Опубл. 20.08.97 //БИПМ.- 1997.

80. Пат. 2104014 С1 РФ, С А 61 Л 35/74. Состав питательной среды для роста бифидобактерий / Р.С.Рахманов Заявл. 06.04.95; Опубл. 10.02.98 // БИПМ. - 1998.

81. Пат. 1167198 С1 РФ, С 12 N 1/20. Питательная среда для культивирования бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 1 / И.П.Ефимова, А.М.Ивакина, Г.Д.Борискина и др. Заявл. 03.06.83; Опубл. 15.07.85 // БИПМ. - 1985.

82. Пат. 94026139 А1 РФ, 6 С 12 N 1/20. Питательная среда для культивирования бифидобактерий / В.В.Ткаченко. Заявл. 14.07.94; Опубл. 10.05.96//БИПМ. - 1996.

83. Пат. 2053781 С1 РФ, 6 А 61 К 35/74. Препарат из живых лактобактерий / В.В.Поспелова, Н.Г.Рахимова, Н.Н.Ворошилина и др. Заявл. 28.12.93; Опубл. 10.02.96 // БИПМ. 1996.

84. Пат. 2103345 С1 РФ, 6 С 12 N 1/00. Способ получения гидролизатов и использование их при изготовлении питательных сред для культивирования микроорганизмов / В.И.Ситьков, В.И.Заерко, А.П.Сурмило и др. -Заявл. 25.06.96; Опубл. 27.01.98 // БИПМ. 1998.

85. Пат. 2212902 С2 РФ, А 61 L 15/36, А 61 F 13/15. Продукт и препарат, содержащий молочнокислые бактерии / Р.Андерссон, Б.Рунеман, У.Форсгрен-Бруск и др. Заявл. 08.10.1998; Опубл. 27.09.2003 // БИПМ. -2003.

86. Пат. 2005119 С1 РФ, 5 С 12 N 1/20, А 23 С 9/12, А 61 К 35/74. Способ получения биомассы бифидумбактерий / Н.А.Абрамов, А.Г.Ланских, Д.Г.Иванов и др. Заявл. 30.06.92; Опубл. 30.12.93 // БИПМ. - 1993. - № 47-48.

87. Пат. 2160594 С1 РФ, А 61 К 35/74. Способ получения бифидумбактерина / А.Г.Храмцов, С.Е.Виноградская, С.А.Рябцева и др. Заявл. 09.08.1999; Опубл. 20.12.2000 // БИПМ. - 2000.

88. Пат. 2040539 С1 РФ 6 С 12 N 1/20. Питательная среда для культивирования бифидобактерий и лактобактерий «Гидроселат» / И.Г.Ермишина, Т.Ф.Власова, Ш.Т.Сафарян. Заявл. 28.01.92. - Опубл. 27.07.95 // БИПМ. - 1995. - №21.

89. Пат. 2039814 С1 РФ 6 С 12 N 1/20. Питательная среда для культивирования бифидобактерий и лактобактерий «Эпидермат» / И.Г.Ермишина, Т.Ф.Власова. Заявл. 30.03.92. - Опубл. 20.07.95 // БИПМ.- 1995.-№20.

90. Пат. 2158302 С2 РФ, С 12 N 1/20. Питательная среда для роста би-фидо- и лактобактерий / Р.С.Рахманов Заявл. 11.03.1996; Опубл. 27.10.2000 // БИПМ. - 2000.

91. Петров, Jl. Н. Основы конструирования пробиотиков повышенной терапевтической активности / Л.Н.Петров // Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: Мат. Международ, науч.-практ. конфер. М., 2002. С. 12.

92. Пикина, А.П. Первичный скрининг штаммов бифидобактерий с целью разработки на их основе эффективных препаратов-пробиотиков /

93. A.П.Пикина, В.В.Смеянов, Б.А.Ефимов // Журн. микробиологии. 1999.- № 6. С. 34-48.

94. Поспелова, В.В. Принципы разработки фармакопейных бактерийных препаратов для коррекции микрофлоры организма человека /

95. B.В.Поспелова, Н.Г.Рахимова, Г.И.Ханина // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. — Горький, 1988. с.85-92.

96. Постникова, Е.А. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов / Е.А.Постникова, Б.А.Ефимов, Н.Н.Володин и др. // Журн. микробиологии. 2004. - № 2. - С. 64-69.

97. Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: Мат. Международ, науч.-практ. конфер. - Москва, 2002. - 88 с.

98. Промышленная микробиология / З.А.Аркадьева, А.М.Безбородов, И.Н.Блохина и др.; Под ред. Н.С.Егорова. Москва: Высшая школа, 1989. -688 с.

99. Пучковская, Л.Ю. Питательная среда для выращивания В. bifidum 1 / Л.Ю.Пучковская, В.Н.Кикалишвили, Н.М.Абушвили и др. // Бифидо-бактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве: Сб. науч. тр. — М., 1986. С. 76-78.

100. Работнова, И.Л. Питание микроорганизмов / И.Л.Работнова, Н.Н.Позмогова // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1993.-№Ю.-С. 112-116.

101. Рахимова, Н.Г. Эпидемиология, клиника, профилактика и лечение острых и хронических кишечных заболеваний / Н.Г.Рахимова. М.: Медицина, 1975. - т. 15. - 116 с.

102. Рогов, И.А. Идентификация и отбор культур Lactobacillus для биотрансформации молочного сырья / И.А.Рогов, В.И.Ганина, М.М.Данилова и др. // Биотехнология. 2003. -№ 4. - С. 45-51.

103. Семихатова, Н.М. Хлебопекарные дрожжи / Н.М. Семихатова. М.: Пищевая промышленность, 1980. - 199 с.

104. Семихатова, Н.М. Производство хлебопекарных дрожжей / Н.М. Семихатова, М.Ф.Лозенко, Л.Д.Белова и др. М.: ВО «Агропромиздат», 1987.-272 с.

105. Смирнова, Г.А. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред / Г.А.Смирнова, Б.М.Раскин, В.А.Мельников и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1985. - № 12. - С. 22-26.

106. Смирнов, В.В. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных / В.В.Смирнов, С.Р.Резник, И.Б.Сорокулова и др. // Журн. микробиологии.1992.-№ 6.-С. 82-94.

107. Степаненко, П.П. Микробиология молока и молочных продуктов / П.П.Степаненко.- Сергиев Посад: ООО «Все для вас Подмосковье», 1999. -415с.

108. Сундукова, М.Б. Антибиотические свойства бифидобактерий / М.Б.Сундукова, В.Ф.Семенихина, В.И.Ганина и др. // Молочная промышленность. 1985. -№ 8. - С. 36-38.

109. Телишевская, Л.Я. Изучение ростстимулирующих компонентов гель-фильтрационных фракций панкреатических белковых гидролизатов / Л.Я.Телишевская, Н.Н.Максимюк, А,А,Комаров и др. // Биотехнология.1993.-№ 11-12.-С. 33-38.

110. Тихомирова, Н.А. Технология продуктов лечебно профилактического питания / Н.А.Тихомирова.- М.: МГУПБ, 2001.- 242 с.

111. Тюрин, М.В. К механизму антагонистической активности лакто-бацилл / М.В.Тюрин, Б.А.Шендеров, Н.Г.Рахимова и др. // Журн. микробиологии. 1989. - № 2. - С. 3-8.

112. Тюрин, М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: Дисс. . канд. мед. наук: 03.00.07 / Всесоюзный НИИ антибиотиков. — Москва. 1990. - 149 с.

113. Уголев, A.M. Пищеварительно-транспортный конвеер / А.М.Уголев, Л.Ф.Смирнова // Физиология всасывания. М.: Медицина, 1977.-С. 489.

114. Филатов, А.Н. Белковые гидролизаты / А.Н.Филатов, З.А.Чаплыгина, М.Е.Депп. Ленинград: Медицина, 1968.- 184 с.

115. Филиппова, М.М. Биоорганическая химия / М.М.Филиппова, А.А.Карелин, В.Д Иванов. 1997. -Т. 23. - С. 388 - 409.

116. Филиппова, Н.К. Разработка интенсивной технологии аэробного культивирования чистой культуры спиртовых дрожжей Saccharomyces сег-evisiae / Биотехнология. 2002. -№ 1. - С. 49 - 53.

117. Черников, М.П. Протеолиз и биологическая ценность белков / М.П.Черников. М: Медицина, 1975. - 79 с.

118. Шкляр, Б.Х. Оболочка дрожжевой клетки как индуктор ферментов, вызывающих ее лизис / Б.Х.Шкляр, Л.А.Шукан // Прикладная биохимия и микробиология. 1975. - т. XI. - вып. 3. - С. 331-335.

119. Эль-Регистан, Г. И. Явление автолиза у микроорганизмов. Г. И. Эль-Регистан / Обзорн. информ.// М.: ЦБНТИ Минмедбиопрома СССР, 1987.-Вып. 2. С. 52.

120. Эрвольдер, Т.М. Воздействие ферментативных гидролизатов на накопление биомассы бифидобактерий / Т.М.Эрвольдер, А.В.Гудков, Л.П.Семенова и др. // Молочная промышленность. — 1980. № 12. С. 15-17.

121. Anders, R.F / R.F.Anders, D.M.Hogg, G. R.Jago et al. // Appl. Microbiol.- 1970. -Vol. 19.-P. 608-609.

122. Brashears, M.M. Antagonistic action of cells of Lactobacillus lactis toward Escherichia coli 0157: H7 on refrigerated raw chicken meat / M.M. Brashears, S.S.Reilly, S.E.Gilliland // J. Food. Protection. 1998. - Vol. 61. - P. 166-170.

123. Canganella, F. A microbiology investigation on probiotic pharmaceutical products used for human health / F.Canganella, S.Paganini, M.Ovidi // Microbiol. Res. 1997. - Vol. 152. - P. 171-179.

124. Charteris, W.P. Antibiotic susceptibility of potencially probiotic Lactobacillus species / W.P.Charteris, p.M.Kelly, J.K.Collins et al. // J. Food. Protection. 1998. - Vol. 61. - P. 1636-1643.

125. Cherian, M. Production of hydrolysate in ultrafiltration-enzymereactors / M.Cherian, W.D.Deeslic // Polym. Sci. Technol. 1980. -Vol. 13.-P. 591-601.

126. Dai, D. Protective nutrients and bacterial colonization in the im-munature human gut / D.Dai, W.A.Walcer // Adv. Pediatr. 1999. - 46. - P. 353-382.

127. De Waard, H. Voedingsmiddelentechnologie / H.De Waard, J.Stadhouders // 1983 . - Vol. 16. - № 22/23. - P. 141-145.

128. Eaton, N.R. Methods in microbiology / N.R.Eaton, J.R.Norris, D.W.Ribbons // Acad. Press. 1972. - Vol. 6B. - P. 321-346.

129. Elmer, G.W. Biotherapeutic agents. A neglected modulity for the treatment and prevention of selected intestinal and vaginal infections / G.W.Elmer, C.M.Surawicz, L.V.McFarland // JAMA. 1996. - Vol. 11. - P. 870-876.

130. Farley, P.C. The purification and properties of yeast proteinase В from Candida albicans / P.C.Farley, M.G.Shepherd, P.A.Sullivan et al. // Biochem. J. 1986. - Vol. 236. - P. 177-184.

131. Fooks, L.J. Prebiotics, probiotics and human gut microbiology / L.J.Fooks, R.Fuller, G.R.Gibson // Inter. Dairy J. 1999. - Vol. 9. - P. 53-61.

132. Fuller, R. Probiotics in man an animals / R.Fuller // J. of Appl. Bacte-riolog. 1989. - Vol. 66. - P. 365-378.

133. Functional Foods. Ed. By I. Goldberg. Charman and Hall, NY. 1994.- 572 p.

134. Fujishiro, K. Purification and characterization of yeast protease В / К. Fujishiro, Y.Sanada, H.Tanaka et al. // J. Biochem. (Tokyo). 1980. - Vol. 87.-P. 1321-1326.

135. Ganzle, M.G. Effect of ecological factors on the inhibitory spectrum and activity of bacteriocins / M.G.Ganzle, S.Weber, W.P.Hammes // Int. J. Food. Microbiol. 1999. - Vol. 46. - P. 207-217.

136. Ganzle, M.G. Charaterisation of reuterocyclin produced by Lactobacillus reuteri LTH 2584 / M.G.Ganzle, A.Holtzel, J.Walter et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - 66 (10). - P. 4325-4333.

137. Gastaldi, E. Effect of Controlled Casein Hydrolysis on Rheological Properties of Acid Milk Gels / E.Gastaldi, N. Trial, C. Guillaume et al. // J. Dairy Sci. 2003. - Vol. 86. -P. 704-711.

138. Gibson, G.R. Aspects of In Vitro and In Vivo Research Approaches Directed Toward Identifying Probiotics and Prebiotics for Human / G.R.Gibson, R.Fuller // Use. J. Nutrition. 2000. - Vol. 130. - P. 391-395.

139. Gyosheve, B. Characteristics of the bulgarian yogurt lactic acid bacteria. Metabolism of lactose / B.Gyosheve, I.Petrova, M.Mutafchieca // Nahrung.- 1996. Vol. 40. - № 2. - P. 68-71.

140. Gusils, C. Lactobacilli isolated from chicken intestines: potential use as probiotics / C.Gusils, A.Perez Chaia, S.Gonzalez et al. // J. Food. Protection.- 1999. Vol.62. - P. 252-256.

141. Homma, N. Bifidobacteria microflora / N. Homma. 1988. - Vol. 7. -P. 35-43.

142. Johansson, M.L. Survival of Lactobacillus plantarum DSM (299v) and effect on the short-chain fatty acid content of faeces after ingestion /

143. M.L.Johansson, S.Nobaek, A.Berggren // Int. J. Food. Microbiol. 1998. - Vol. 42.-P. 29-38.

144. Johnson J.L. Nucleic acids in bacterial classification. Bergey's manual of sistematic bacteriology / J.L.Johnson, N.R.Eds Krieg, J.G.Holt // Baltimore: Williams and Wilkins. - 1984. - P. 8-11.

145. Kato, A. Food proteins structure and functionality / A.Kato, K.Komatsu, K.Fujimoto et al. // J. Agric. Food. Chem. 1985. - Vol. 33. - № 5. -P.931-934.

146. Kato, A. Food proteins structure and functionality / A. Kato // Ed. K.D. Schwenke and R. Mothes. VCH. Germany. 1993. P. 16-28.

147. Kandler, J. Genus Lactobacillus Beiyrinck 1901. Bergey's Manual of Systemic bacteriology / Eds. N.R. Krieg, J.G.Holt. Baltimore: Williams and Wilkins. - 1986. - Vol. 2. - P. 1220-1229.

148. Kenings, W.N. Lactic acid bacteria: the bugs of the new millenium / W.N.Kenings, J.Kok, O.P.Kuipers et al. // Cur. Opin. Microbiol. 2000. - 1. -P. 276-282.

149. Kirjavainen P.V. The ability of probiotic bacteria to bind to human intestinal mucus / P.V.Kirjavainen, A.C.Ouwehand, E.Isolauri et al. // FEMS Microbiol. 1998.-Vol. 167.-P. 185-189.

150. Klein, G. Taxonomy and physiology of probiotic lactis acid bacteria / G. Klein, A.Pack, C.Bonoparte et al. // Int. J. Food. Microbiol. 1998. - Vol. 41.-P. 103-125.

151. Knorr, D. An enzymic method for yeast autolysis / D.Knorr, K.J.Shetty, Kinsella J.E. // J. Food. Ski. 1979. - Vol. 44 № 5. - P. 1362-1365.

152. Koga, T. Antibacterial activity of Lactobacillus species against Vibrio species / T.Koga, T.Mizobe, K.Tacumi // Microbiol. Res- 1998. Vol. 153. -P. 271-275.

153. Kominami, E. The substrate specificity of proteinase В from Baker's yeast / E.Kominami, H.Hoffschulte, L.Leuschel et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1981.-Vol. 661.-P. 136-141.

154. Ladds, G. Identification of proteases with shared functions to the pro-protein processing protease Krpl in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe / J.Davey, G.Ladds // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 839-853.

155. Lasch, J. Untersuchung zur hydrolyse von proteinen durch immobilis-ierte enzyme / J.Lasch, R.Koelsch, P.Roth et al. Acta Biol. Med. Germ. -1976.-B. 35.-S. 735-743.

156. Lidbeck, A. Lactobacillus and the normal human intestinal microflora / A.Lidbeck, C.E.Nord// Clin. Infect.Dis. 1993. - 1;16. P. 181-187.

157. Liming Y. Biofilm-Specific Cross-Species Induction of Antimicrobial Compounds / Y.Liming, G.B. Kenneth, R.A.David // Appl. and Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69. - № 7. p. 3719-3727.

158. Linderstrom-Lang, K. Protein and enzymes / Lane Med. Lect., Stanford // Stanford Univ. Press. 1952. - Vol. 6. - P. 50-65.

159. Magnusson, J. Lactobacillus coryneformis subsp. Coryneformis Si3 produces a broad -spectrum proteinaceous antifungal compound / J.Magnusson, J.Schnurer // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - 1 (67). - P. 1-5.

160. Mardh, P.A. In vitro interactions between lactobacilli and other microorganisms occurring in the vaginal flora / P.A.Mardh, L.V.Soltech // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 1983. - 3. - P. 47-51.

161. Marshall, V.M. // J. Soc. Dairy Technol. 1993. - Vol. 46. - № 2. - P. 49-56.

162. McGroarty, J. A. Detection of a lactobacillus substance that inhibits Escherichia coli / J.A.McGroarty, G.Reid // Can. J. Microbiol. 1988. - 134. - P. 974-978.

163. Mechler, B. Biogenesis of the yeast lysosome (vacuole): biosynthesis and maturation of proteinase / B. Mechler. H.H.Hirsch, H.Muller et al. // EMBO J. 1988.-Vol. 7.-P. 1705-1710.

164. Mechler, B. In vivo biosynthesis of the vacuolar proteinases A and В in the yeast Saccharomyces cerevisiae / M.Muller, H.Muller, F.Meussdoerffer et al. // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257. - P. 11203-11206.

165. Meisel, H. Nahrung / H.Meisel, S.Gunter. 1998. - Vol. 42. - P. 175180.

166. Moehle, C.M. Protease В of Saccharomyces cerevisiae: isolation and regulation of the PRB1 structural / C.M.Moehle, M.W.Aynardi, M.R.Kolodny et al. // Genetics. 1987. - Vol. 115. - P. 255-263.

167. Moehle, C.M. Protease В of the lysosomelike vacuole of the yeast Saccharomyces cerevisiae is homologous to the subtilisin family of serine proteases / C.M.Moehle, R.Tizard, S.K.Lemmon et al. // Mol. Cell. Biol. 1987. - Vol. 7. - P. 4390-4399.

168. Mistra, A.K. Bifidobacteria in food and health / A.K.Mistra, S.Sarkar //Ind. Dairy. 1996.-Vol.48.-№6.-P. 13-16.

169. Muriana, P.M. Conjugal transfer of plasmid-encoted determinants for bacteriocin production and immunity of Lactobacillus acidophilus 88 / P.M. Muriana, T.R. Klaenhammer // Appl. Environ. Microbiol. -1987. 53. -P. 553-560.

170. Naidu, A.S. Probiotic spectra of lactis acid bacteria (LAB) / A.S.Naidu, W.R.Bidlack, R.A.Clemens // Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 1999. -Vol. 39.-P. 13-126.

171. Naik, R.R. Regulation of the proteinase В in Saccharomyces cerevisiae / R.R.Naik, V.Nebes, E.W.Jones et al. // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. -P. 1469-1474.

172. Naik, R.R. In Handbook of Proteolytic Enzymes 1 edn // A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner et al. / Academic Press, London. 1998. -P. 317-320.

173. Narahashi, Y. Studies on proteolytic enzyme. Inature and proprrties of the proteolytic enzime system / Y.Narahashi, M.Yanagita // J. Biochem. 1967. -Vol. 62. - № 3. - P. 633.

174. Nebes, V.L. Activation of the proteinase В precursor of the yeast Sac-charomyces cerevisiae by autocatalysis and by an internal sequence / V.L. Nebes, E.W.Jones // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - P. 22851-22857.

175. Orrhage, K. Bifidobacteria and Lactobacilli in human health / K.Orrhage, C.E.Nord // Drugs Exp. Clin. Res. 2000. - Vol. 26. - № 3. -P. 95-111.

176. Osset, J. Assessment of the capacity of Lactobacillus to inhibit the growth of uropathogens and block their adhesion to vaginal epithelial cells // J.Osset, R.M.Bartolome, E.A.Garcia // J. Infect. Dis. -2001.- 183 (3). P. 485491.

177. Ouwehand, A.C. Probiotics: mechanismus and estabished effect / A.C.Ouwehand, P.V.Kirjavainen, C.Shortt et al. // Int. Dairy J. 1999. - Vol. 9. - № 1. - P. 43-52.

178. Pihlanto-Leppala, A. Hydrolysis of 'альфа's2.-casein in solution by chymosin, plasmin, trypsin and Lactobacillus-proteinases / A.Pihlanto-Leppala, E.Pahkala, M.Kahala // Agr. Sci. Finl. 1993. -Vol. 2. - № 2. - P. 133-139.

179. Pre- , pro- and synbiotics / Fortified future for functional foods. M. Byrne//Eur. Ed. 1997.-P. 121.

180. Poch, M. / Poch M., Bezkorovainy A. // J. Dairy Sci.- 1988.- № 12. -P. 3214-3221.

181. Reid, G. The scientific basis probiotics strins of Lactobacillus / G.Reid // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65. - P. 3763-3766.

182. Roberfroid, M.B. Prebiotics and synbiotics: concepts and nutritional properties / M.B.Roberfroid // Br. J. Nutr. 1998. - Vol. 80. - P. 197-202.

183. Roberfroid, M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? / M.B.Roberfroid // Am. J. Clin. Nutr. 2000. - Vol. 71 (Suppl. 6). -P. 1682-1987.

184. Salminen, S. Gut flora in normal and disordered states / S.Salminen, E.Isolauri, T.Onnela // Chemotherapy. 1995. - Vol. 41 (1). - P. 5-15.

185. Salminen, S. Clinical application of probiotic bacteria / S.Salminen, A.C.Ouwehand. E.Isolauri // Int. Daily J. 1998. - Vol. 8. - № 5-6. -P. 563-572.

186. Sanders, M.E. Development of consumer probiotics for the US market / M.E.Sanders // Br. J. Nutr. 1998. - Vol. 80. - P. 213-218.

187. Scardovi, V. IX Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Baltimore. 1986. -2. P. 1209-1234.

188. Scardovi, V. Bergey's Manual of Systemic bacteriology. V. 2 / Eds. P.H.A.Sneath et al. Baltimore: Williams and Wilkins. - 1986. - P. 1418-1435.

189. Schillinger, U. Isolation and identification of lactobacilli from novel-type probiotic and mild yoghurts and their stability during refrigerated storage / U.Schillinger // Int. J. Food. Microbiol. 1999. - Vol. 47. - P. 79-87.

190. Shornicova, A.V. Lactobacillus reuteri as a therapeutic agent in acute diarrhea in young childern / A.V.Shornicova, I.A.Casas. E.Iaolauri // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 1997. - Vol. 24. - P. 399-404.

191. Silverman, S.J. Proteinase В is, indeed, not required for chitin synthetase 1 function in Saccharomyces cerevisiae / S.J.Silverman, J.A.Shaw, E.Cabib et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - Vol. 174. -P. 204-210.

192. Smith, I. S. Hillier A. I., Lees G. I. J. Daiiy Res, 1975. - Vol. 42. — P.123-138208 (Stanier, R.Y.) Стейниер, P. Мир микробов: Пер. с англ. / Р.Стейниер, Э.Эдельберг, Дж. Ингрем. 3 том. - М.: Мир, 1979. - 486 с.

193. Tuomola, E.M. Adhesioh-ef'some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures / E.M.Tuomola, S.J.Salminen // Int. J. Food. Microbiol. 1998. - Vol. 41. - P. 45-51.

194. Verlaeds, M.C. Interference in initial adhesion of pathogenic bacteria and yeasts silicone rubber by a Lactobacillus acidophilus / M.C.Verlaeds, B. van der Belt, H.C. van der Mei // J. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 49. - P. 790-794.

195. Ziemer, С J. An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept: perspektives and future strategies / C.J.Ziemer, G.R.Gibson // Int.Dairy J. 1998. - Vol. 8. - P. 473-479.

Информация о работе

Тимербаева, Рина Харисовна
кандидата медицинских наук
Уфа, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков"

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Тимербаева, Рина Харисовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Тимербаева, Рина Харисовна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Тимербаева, Рина Харисовна, Уфа

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация технологии получения препаратов-пробиотиков
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология