Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Питательные среды для культивирования бифидобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Питательные среды для культивирования бифидобактерий"

На правах рукописи

КАЛИНИНА Татьяна Эдуардовна

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ

(БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К КОНСТРУИРОВАНИЮ)

03.00.07 — микробиология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 1995

Работа выполнена в Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор медицинских наук, доцент Терновская Л.Н.

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент Академии Естествознания, доктор медицинских наук, профессор Шепелев А.П.

доктор медицинских наук, профессор Васильева Л.И.

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Свечникова Л.В.

Ростовский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится «22» декабря 1995 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 084.53.01 при Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванс-кий, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского госуда1 ственного медицинского университета.

Автореферат разослан « ^» 1995 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Н.Я. Корганов

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Дефицит бифидобактерий в составе ки-гечной микрофлоры людей различных возрастных групп возникает следствие действия многих факторов (использование антибиотичес-их, химиотерапевтических и других фармакологических препаратов, ромышленные химические вещества, пестициды, радиация, перене-энные инфекционные и соматические заболевания и др.) и ведет не олько к развитию заболеваний желудочно-кишечного тракта, но и к арушению функций других органов и систем организма человека (Б.А. Тендеров и др.. 1993; Б.Г. Дорофеичук и пр.. 1330, «I. Но^аН я1. 993 и др.). Основным средством восстановления нарушенною лгакро иоценоза является использование, как с лечебной, так и с профилак-ической целью, бактериальных препаратов из представителей нор-;альной микрофлоры. Среди последних ведущее место принадлежит убиотическим препаратам, содержащим бифидобактерии, которые мо-ут применяться в разных формах: лиофильно высушенные во флако-ах, ампулах, таблетках, свечах и как добавки к продуктам питания, [арастающее экологическое неблагополучие требует увеличения вы-уска бифидосодержащих эубиотиков, но оно сдерживается из-за от-утствия дешевых питательных сред, отвечающих физиологическим отребностям бифидобактерий. Используемые в настоящее время для ультивирования бифидобактерий в промышленных условиях пита-ельные среды (среда Блаурокка, казеиново-дрожжевая [КД-5], гидро-изованное молоко [ГМ]) готовятся на основе натуральных пищевых родуктов, что существенно влияет на себестоимость готовых препа-атов.

В последние годы проводятся работы по получению питательных ред для культивирования бифидобактерий из продуктов неимеющих ысокой пищевой ценности (отходов мясокомбинатов, вторичного мо-очного сырья). В качестве субстратов для приготовления питатель-ых сред используют желудки и печень кроликов, мясокостный фарш юленей, мышечную ткань плодов овец, коров, свиней, аминокровин, ывороточный лошадиный альбумин и др. (Л.А. Назарова, 1991; И.А. ьритская и др., 1992; И.Г. Ермишина и др., 1993; И.Н. Блохина и др., 991; Е.Ф. Завгородняя и др., 1989; Н.П. Ефимова и др., 1986; О.С.

Рязанцева и др., 1993).

На опытно-экспериментальном предприятии РНИИМП в процесс получения лечебного препарата лактоглобулина из молозива коров поел удаления лактосыворотки остаются отходы, состоящие из казеина мс лозива с примесью 9-12% остаточной лактосыворотки — молозивна казеиново-сывороточная масса (молозивный творог). Известно, что мс лозиво является идеальной средой для формирования бифидофлоры организме новорожденных млекопитающих и в том числе человекг Белки молозива по своему составу занимают промежуточное положс ние между белками молока и сыворотки крови. Они содержат замени мые и незаменимые аминокислоты (И.И. Грачев, 1973). В молозив содержатся вещества, обладающие бифидостимулирующей активность] (Стейси М., Варкер С., 1965). В доступной нам литературе мы не ш шли сообщений об использовании молозивных белков для получени питательных сред, пригодных для культивирования бифидобактерий

Цель работы.

Используя биохимические методы исследования, разработать по; ходы к конструированию питательных сред для выращивания биф! добактерий из молозивной казеиново-сывороточной массы (отходов прс изводства лактоглобулина).

В соответствии с поставленной целью в задачи исследования вход!

ло:

1. Разработать способы гидролиза молозивной казеиново-сыворото* ной массы отходов производства лактоглобулина.

2. Изучить физико-химические свойства гидролизатов.

3. Отработать способы контроля качества гидролизатов, определяй щие возможность их использования в качестве основы сред для кул] тивирования бифидобактерий.

4. Сконструировать питательные среды для культивирования бифид< бактерий с учетом бифидостимулирующих свойств исходных тщ ролизатов.

5. Изучить закономерности развития популяции бифидобактерий штаг ма В.Ы^6итп-1 на разработанных средах.

6. Определить биологические свойства бифидобактерий штамма В.1 Цйитп-1, выращенных на новых средах, и соответствие их требов;

ниям ФС-42-132 ВС-88 «Бифидумбактерин сухой». ". Выяснить возможность использования разработанных сред для культивирования микробов-эубиотиков других видов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

* Впервые показана возможность использования для приготовления питательных сред, пригодных для выращивания бифидобак-терий, молозивной казеиново-сывороточной массы отходов производства лактоглобулина.

* Установлена яиии«-.имоси» йоксплстттт;» «иомяосы бифидобакте-рий от степени гидролиза белков молозивной казсппотсо-еъшоро-точной массы. Выявлено, что лучшими ростовыми свойствами обладают гидролизаты молозивной казеиново-сывороточной массы с низкой степенью расщепления белков.

* Разработан новый критерий определения качества гидролиза-тов молозивной казеиново-сывороточной массы, основанный на определении содержания в них лактаминовой кислоты, свидетельствующей о бифидостимулирующей активности гидролизатов.

* Предложены три варианта питательных сред для культивирования бифидобактерий, разработанных с учетом биохимических показателей качества гидролизатов молозивного творога.

* Показано, что бифидобактерии, выращенные на новых средах, по своим морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим свойствам и биологической активности соответствуют требованиям, изложенным в ФС 42-132 ВС-88 «Бифидумбактерин сухой».

* Показана принципиальная возможность использования глюкоз-

ного варианта новых сред для выращивания лактобактерий разных видов.

Практическая значимость работы.

' Разработана технология утилизации отходов производства лактоглобулина для приготовления питательных сред, пригодных для выращивания микробов-эубиотиков.

* Разработан способ гидролиза молозивной казеиново-сывороточ ной массы отходов производства лактоглобулина (получена при оритетная справка № 94-018305/13).

* Разработаны питательные среды для культивирования бифидо бактерий (положительное решение на патент от 7.0б.95г. «Пита тельная среда для культивирования бифидобактерий»).

* Внесены изменения в действующий регламент производства би фидумбактерина, позволяющие снизить стоимость готового препа рата (утверждены Ученым Советом РНИИМП, протокол № 10 о 23.12.93г.). Изготовленные по новой технологии серии бифидум бактерина сухого прошли предварительный контроль в ГИСК им Л.А.Тарасевича.

* Разработан новый лабораторный регламент на производство би фидумбактерина (утвержден Ученым Советом РНИИМП, протс кол № 1 от 08.02.95г.), сокращающий время технологического про цесса.

" Разработан лабораторный регламент на новую питательную сред для культивирования бифидобактерий (утвержден Ученым Сове том РНИИМП, протокол № 1 от 08.02.95г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

* Отходы производства лактоглобулина (молозивная казеиновс сывороточная масса) представляют собой ценное сырье для пол^ чения питательных сред, пригодных для культивирования бифн добактерий. При гидролизе молозивной казеиново-сывороточно: массы получены гидролизаты с низкой степенью расщепления бел ков, с содержанием свободных аминокислот, превышающим и наличие в среде Блаурокка.

* Критерием оценки качества гидролизатов молозивной казеине во-сывороточной массы, наряду с содержанием аминного азот< должен быть показатель, отражающий наличие в гидролизатах ла! таминовой кислоты, свидетельствующей о бифидогенной актш ности гидрализатов.

В зависимости от содержания лактаминовой кислоты в гидро-лизатах молозивной казеиново-сывороточной массы, составляющих основу питательных сред, в состав сред вводятся дополнительные ингредиенты, что позволило рекомендовать 3 варианта питательных сред, пригодных для культивирования бифидобактерий.

* Бифидобактерии штамма В.Ы/1йит-1, выращенные на новых средах с основой из гидролизатов молозивной казеиново-сывороточной массы, по морфологическим, тинкториальным, культураль-пым ст^гтря™ и биологической активности соответствуют требованиям ФС 42-132 ВС-88 «Кифидумпиктерин сухой*.

* Варианты питательных сред с основой из гидролизатов молозивной казеиново-сывороточной массы, содержащие глюкозу в качестве источника углерода, могут быть использованы для культивирования лактобактерий разных видов.

Апробация работы.

Результаты исследований были доложены на заседаниях проблемой комиссии РНИИМП в 1993-1994г.г., на научных конференциях отрудников РНИИМП в 1993-1994г.г., на совместном заседании ла-оратории клинической микробиологии с сотрудниками РПЧИ в 1995г.

Публикация материалов исследования. Материалы исследования публикованы в 3 печатных работах, одном патенте, двух заявках на [атенты.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123-х

траницах печатного текста. Состоит из введения, обзора литературы, 'писания материалов и методов исследования, результатов собствен-[ых исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа [ллюстрирована 25-ю таблицами и 5-ю рисунками. Список литерату-1Ы включает 166 источников, из которых 108 отечественных и 58 за-»убежных авторов.

Материалы и методы исследования.

В работе были использованы отходы производства лактоглобулина - молозивная казеиново-сывороточная масса (молозивный творог).

Казеиново-сывороточная масса (молозивный творог) имеет бело-жел тый цвет, кислый вкус, приятный кисломолочный запах. Соотноше ние казеин/сыворотка в большинстве серий массы составляет 7:3, рЕ колеблется от 3,1 до 4,6. В работу брали казеиново-сывороточную мае су со значением рН не ниже 3,9. Казеиново-сывороточную массу ис пользовали либо сразу после получения с предприятия, либо хранил* в замороженном состоянии при температуре (—25±2) °С в течение ( месяцев, используя по мере надобности.

Исследования проводили со штаммами микроорганизмов BMfidum 1, Lb.plantarum 8Р-АЗ, Lb.fermentum 90Т-С4, полученными из ГИСЬ имени Л.А.Тарасевича, Lb.acidophilus n.v.Ep 312/402, предоставлен ным профессором В.С.Крамарь.

Гидролиз молозивной казеиново-сывороточной массы осуществля ли по разработанному нами методу (приоритетная справка № 94-018305, 13). В гидролизатах определяли содержание аминного и общего азот; по методикам, изложенным в ФС 42-344 ВС-90 «Физико-химичес кие, химические, физические и иммунохимические методы контролз медицинских иммунобиологических препаратов», степень гидролиз; белков в гидролизатах вычисляли по отношению NH2/N (аминный азот, общий азот), при этом считали, что гидролизаты с высокой степень» расщепления белков имеют показатель NH2/N более 70%, средняя сте пень гидролиза соответствует величине до 40%, низкая степень гидро лиза выявляется при величине ниже 40% (Л.Г.Бендас и др. 1984) Хроматографический анализ гидролизатов проводили на колонке, ис пользуя в качестве сорбента молселект G-25 (интервал фракциониро вания — молекулярная масса < 5000Д), а в качестве буфера — дистил лированную воду. Калибровку колонки осуществляли использование! веществ с известной молекулярной массой, находящейся в облает! молекулярных масс соединений, которые могут присутствовать в гид ролизатах. На основании полученных хроматограмм определяли про центное содержание фракций в исследуемых пробах гидролизатов.

Содержание свободных аминокислот в гидролизатах проводили н; автоматическом анализаторе аминокислот «339 микротехна» (Прг га,ЧССР). Количество аминокислот в пробах выражали в мкг/мл. Сс держание свободных аминокислот в гидролизатах сопоставляли с и количеством в средах Блаурокка и КД-5, применяемых для культив*

ования бифидобактерий. О наличии в гидролизатах бифидостимули-ующих веществ судили по количеству в них лактаминовой (Ы-аце-ил-нейраминовой) кислоты, которую определяли по методике, изложенной в работе П.Н.Шараева с соавторами (1993), позволяющей вы-влять свободные сиаловые кислоты, сиалоолигосахариды и сиалогли-опротеиды, пользуясь тиобарбитуровым методом. Калибровочную ривую строили с помощью калибровочных растворов, содержащих О, 30 и 50 мкг ацетилнейраминовой кислоты.

Ростовые свойства гидролизатов разных серий оценивали микроби-логическим мртолом. оппеделяя количество жизнеспособных бифи-обактерий через 24 и 48 чяспк инкубации их б тсрг.тсгтяте при «мие-атуре (38+1) °С, пользуясь методом титрования, изложенным в ФС 2-132 ВС-88 «Бифидумбактерин сухой», раздел «Специфическая ак-ивность». Биологические свойства бифидобактерий, выросших на раз-аботанных средах, проверяли по следующим показателям: морфоло-ические, тинкториальные, культуральные, биохимические свойства этношение к желатину, образование газа, продукция каталазы, сбраживание Сахаров), кислотообразующая и антагонистическая активность, езвредность.

Изучали динамику развития популяции бифидобактерий на разра-отанных средах, учитывая концентрацию биомассы по величине оп-ической плотности культуры на ФЭКН-57 в кюветах с расстоянием гежду гранями 10 мм и количество жизнеспособных клеток в популя-(ии методом титрования через определенные интервалы времени пос-[е посева. Рассчитывали удельную скорость роста культуры и время енерации (К.И.Марков, 1965; И.Ю.Ильницкая и др., 1986).

Для выяснения возможности использования разработанных сред в [роизводстве бифидумбактерина выращивали культуру ВМ/1с1ит-1 на говых средах и выросшую бакмассу высушивали лиофильно на маши-[ах КС-30 и Ъг-45.27. Готовый сухой бифидумбактерин проверяли на оответствие его свойств требованиям ФС 42-132 ВС-88 «Бифидумбак-ерин сухой».

При изучении возможности использования разработанных сред для (ыращивания лактобактерий изучали динамику развития популяции [актобактерий на новых средах, биологические свойства культур 'jb.planta.rum 8Р-АЗ, ЬЬ./егтеШит. 90Т-С4 и их соответствие требова-

ниям ФС 42-252 ВС-89 «Лактобактерин сухой».

Статистическую обработку экспериментальных данных проводил! общепринятыми методами (Г.Ф.Латин, 1980). О достоверности отли чий учитываемых показателей судили по t-критерию Стьюдента. Ста тистически достоверными считали различия, соответствующие оценю ошибки вероятности Р<0,05. Наличие корреляционной связи междз признаками оценивали методом параметрической и непараметричес кой корреляции.

Результаты исследования и их обсуждение.

Получение гидролизатов молозивной казеиново-сыво-роточной массы.

Учитывая, что бифидобактерии являются анаэробами, а для выра щивания анаэробов рациональнее использовать кислотные гидролиза ты казеина (Матвеев К.И.,1964), была изучена возможность получе ния гидролизатов молозивного творога методом кислотного гидроли за. Полученные три варианта кислотных гидролизатов молозивноп творога различаются между собой по степени расщепления белков Соотношения показателей NH2/N составляли соответственн< (46,1+2,4)%, (51,9+1,6)% и (34,4+2,1)%. Хроматографический ана лиз гидролизатов обнаружил наличие в них четырех фракций, разли чающихся по молекулярной массе (крупные пептиды или малогидро лизованные белки, средние пептиды, пептиды с малой массой и сво бодные аминокислоты). Сопоставление количества фракций в гидро лизатах выявило, что они практически не отличались друг от друга п1 содержанию крупных, средних и мелких пептидов, но статистичесю достоверно разнились по количеству свободных аминокислот. Опреде ление ростовых свойств гидролизатов по отношению к бифидобактери ям штамма B.bifidum-1 установило четкую зависимость между степень! гидролиза белков и накоплением биомассы бифидобактерий: гидроли заты с показателем гидролиза (51,9+1,6)% вообще не давали рост бифидобактерий, при степени гидролиза с отношением NH2/N, рав ным (46,1±2,4)% накопление бифидобактерий достигало в средне1 2 • 103, а при отношении NH2/N (34,4+2,1)% количество бифидобакте рий составляло 10б. Полученные данные показывают, что лучшие pd

:товые свойства отмечаются у гидрализатов с низкой степенью гидрогаза белков. Однако все кислотные гидролизаты не давали хорошего 1акопления биомассы бифидобактерий, число жизнеспособных бифи-(обактерий на них не достигало количеств, требуемых ФС 42-132 ВС-

«Бифидумбактерин сухой», кроме того все кислотные гидролизаты хмели темно-коричневую окраску, что существенно затрудняло кон-'роль за ростом культуры. Поэтому было решено изучить возможность доведения ферментативного гидролиза молозивного творога с помощью 1анкреатина. Использование трех способов ферментативного гидроли-(а моло.чивного творога (гидролиз молока по Богданову, способ гидрогаза обрптя молок я и кяяеина. иокомепдовапш.то ррглпмннч-нм ¡шоио-юдства «Бифидумбактерин сухой») позволило получить гидролизаты молозивного творога, значительно различающиеся по содержанию амин-юго азота. Сопоставление их ростовых свойств по отношению к бифи-1,обактериям выявило ту же закономерность, что и при использова-гаи кислотных гидролизатов: лучшие ростовые свойства определяют-:я у гидролизатов с низкой степенью расщепления белков и показате-1ями содержания аминного азота от 0,96% до 1,4%. Но и эти гидро-шзаты не способствовали достаточному накоплению биомассы бифи-;обактерий. Наибольшее количество жизнеспособных бифидобактерий, шределяемое на питательной среде с основой из полученных гидроли-¡атов, достигало 106. Учитывая все эти данные, нами был разработан ,'вой способ гидролиза молозивного творога. Основные отличия разработанного нами способа заключались в том, что для гидролиза исполь-ювали малые дозы панкреатина (0,3 — 0,5 г на 1 литр смеси творога ; дистиллированной водой), гидролиз вели в течение 3-х — 4-х часов три температуре 45° С, а коррекцию рН смеси осуществляли 25% во-щым раствором аммиака. Использование малых доз панкреатина и короткий срок гидролиза позволили получить гидролизаты с низкой степенью расщепления белков, а использование 25% водного раствора шмиака сохраняло в них Ь-цистин, обладающий ростовой активностью т,ля бифидобактерий. Показатели, характеризующие расщепление бел-сов в гидролизатах, полученных нашим способом, приведены в таблице 1.

При данном способе гидролиза получали гидролизаты с низкой сте-генью расщепления белков. Содержание в них аминного азота колеба-

Таблица 1.

Показатели расщепления белков в гидролизатах молозивного творога.

Показатели Число серий (%±т)

Показатели гидролиза Содержание аминного азота 19 1,36±0,30

Содержание общего азота 19 3,76+0,82

Степень гидролиза 19 35,1±5,05

Количественный состав белковых фракций (хроматографический анализ) Крупные пептиды 15 10,9±4,4

мелкие и средние пептиды 15 47,52±4,9

аминокислоты 15 41,6±3,1

лось от значений 0,9% до 1,46%, в среднем составляя (1,36+0,3)%. При хроматографическом анализе в них стабильно выявлялись три фракции, соответствующие крупным пептидам, средним и мелким пептидам и аминокислотам.

Характерная хроматограмма гидролизатов молозивного творога приведена на рис 1.

Определение аминокислотного состава гидролизатов молозивного творога показало, что они содержат как заменимые, так и незаменимые

динокислоты. Количество свободных аминокислот в гидролизатах бо-эе соответствовало их наличию в среде КД-5, значительно превышая эличество аминокислот в среде Блаурокка, особенно Ь-цистина.

Изучение ростовых свойств полученных гидролизатов молозивного зорога выявило, что они способствуют хорошему накоплению био-ассы бифидобактерий. Число жизнеспособных клеток в разных сери-х гидролизатов колебалось от 10б до 109. Было обнаружено, что такой оказатель качества гидролизатов, как содержание в них аминного зота, не всегда соответствует их ростовым свойствам в отношении ифидобактерий. Так, одни серии гидролизатов с содержанием амин-ого азота в пределах (1,07 1 нр мянили накии.юшх.т бпо"г^т-.т

ифидобактерий в количествах 108 — 10у, другие серии с практически аким же содержанием аминного азота обеспечивали рост бифидобак-врий до показателей 109. Причиной подобного состояния может быть азличие гидролизатов по содержанию бифидостимулирующих факто-ов, находящихся в молозиве коров, сохраняющихся в молозивном вороге и гидролизатах. Одной из субстанций, обеспечивающей рост ифидобактерий, содержащейся в коровьем молозиве, является К-аде-ил-Б-глюкозамин. В его состав входит лактаминовая (Ы-ацетил-не-раминовая) кислота, соединенная с остатком галактозы (Стейси М., •аркер С., 1965). Количество лактаминовой кислоты, содержащейся в идролизатах, может указывать на наличие в них бифидостимулирующих веществ.

Определение содержания лактаминовой кислоты в гидролизатах мо-озивного творога показало, что ее количество в разных сериях гидро-изатов различно, с колебаниями от 10 мкг/мл до 85 мкг/мл. В зави-имости от наличия в гидролизатах молозивного творога лактамино-ой кислоты все изученные серии гидролизатов были разделены на 4 руппы — с низким (до 10 мкг/мл) количеством лактаминовой кислота, средним количеством (до 20 мкг/мл и до 40 мкг/мл) и высоким свыше 40 мкг/мл). Сопоставление ростовых свойств для бифидобакте->ий гидролизатов молозивного творога с разным содержанием лакта-шновой кислоты установило четко выраженную зависимость накоп-[ения жизнеспособных клеток в биомассе бифидобактерий от содер-Кания в гидролизатах лактаминовой кислоты. Гидролизаты, в которых определялось до 10 мкг/мл лактаминовой кислоты, способствова-

ли увеличению числа жизнеспособных бифидобактерий в биомассе ] среднем до 103, содержание лактаминовой кислоты до 20 мкг/мл при водило к возрастанию числа жизнеспособных бифидобактерий стабиль но до 107 и в некоторых сериях до 108, гидролизаты с количество! лактаминовой кислоты до 40 мкг/мл давали нарастание бакмассы 1 содержанием бифидобактерий в 1 мл до 108, а при наличии лактами новой кислоты свыше 40 мкг/мл бифидобактерии определялись в 109 Эти результаты заставляют считать, что для оценки качества гидроли затов молозивного творога, их пригодности для приготовления пита тельных сред для культивирования бифидобактерий помимо такоп показателя, как содержание в гидролизатах аминного азота, в опреде ленной степени указывающего на степень гидролиза белков, необхо димо определять количество лактаминовой кислоты.

Конструирование питательных сред.

Гидролизаты молозивного творога представляют основу питатель ных сред и являются источником белков для бифидобактерий. В ка честве источника углеводов в состав большинства питательных сред применяемых при культивировании бифидобактерий, используется лактоза. Известно, что входящая в состав питательных сред лактоза разлагается на глюкозу и галактозу, из которых последняя обладае1 способностью стимулировать рост бифидобактерий. Однако при куль тивировании бифидобактерий применяются и глюкозосодержащие сре ды. Было проведено изучение возможности использования глюкозы ] лактозы как углеводных компонентов в составе питательных сред < основой из гидролизатов молозивного творога. Результаты этой сери] опытов представлены на рисунке 2. Обнаружено, что хорошее нара щивание биомассы бифидобактерий при наличии в среде культивиро вания глюкозы происходит только в тех случаях, когда в гидролиза тах молозивного творога содержится большое количество (свыше 4 мкг/мл) лактаминовой кислоты, достаточное, но не стабильное коли чество бифидобактерий вырастает в средах с глюкозой при средне] содержании в них лактаминовой кислоты (не менее 20 мкг/мл). Пр низком содержании в гидролизатах лактаминовой кислоты yглeвo^ ный компонент в средах должен быть представлен лактозой, котора обеспечивает размножение и развитие бифидобактерий. На рисунке приведены графические данные, отражающие влияние пептона и I

Рис. 2. Влияние углеводного компонента на накопление биомассы бифидобактерий на средах с основой из гидролизатов молозивного творога.

пептон Ьцистин без

пептона и Ь-цистина

Рис. 3. Влияние пептона и Ь-дистина на ростовые свойства питательных сред с основой из гидролизатов молозивного творога.

цистина на накопление биомассы бифидобактерий к питательным сре дам с основой из гидрализатов молозивного творога с разным содержа нием лактаминовой кислоты. Углеводным компонентом сред с содер жанием лактаминовой кислоты до 20 мкг/мл была лактоза, при коли честве лактаминовой кислоты свыше 20 мкг/мл — глюкоза. Бьин выяснено, что гидролизаты со средним и низким количеством лакта миновой кислоты для обеспечения хорошего роста бифидобактерий нуж даются в введении в состав сред таких компонентов, как Ъ-цистин ] пептон.

Анаэробный тип дыхания бифидобактерий предполагает наличие : составе питательной среды компонентов, способных связывать кисло род и его активные радикалы. С этой целью в состав питательных сре, были введены вещества, обладающие антиоксидантной и прооксидан тной активностью: аскорбиновая кислота и сернокислое железо. До бавление этих компонентов в состав питательных сред с основой и гидролизатов молозивного творога с разным содержанием лактамино вой кислоты способствовало накоплению биомассы бифидобактерий доводя количество жизнеспособных особей стабильно до 1010 в 1 м. бакмассы во всех вариантах.

Изучение возможности использования диметилсульфоксида как сти мулятора роста бифидобактерий выявило, что малые его концентра ции в питательной среде (от 0,125% до 1,5%) действительно стимули руют размножение бифидобактерий, однако при этом происходит су щественное нарушение морфологических и культуральных свойств мик роорганизмов. Это обстоятельство не позволило использовать диметил сульфоксид как компонент питательных сред.

На основании проведенных исследований было разработано три ва рианта питательных сред на основе гидролизатов молозивного творог для культивирования бифидобактерий. Основным критерием для вы бора варианта среды является такой показатель, как содержание лак таминовой кислоты в гидролизатах молозивного творога (заявка н патент).

Вариант 1. (ГТ). Основа среды — гидролизаты молозивного творог с высоким (свыше 40 мкг/мл) содержанием лактаминовой кислоты. ] состав среды входят: глюкоза как источник углеводов, хлористый ж трий для создания изотоничности среды, аскорбиновая кислота и се^

икислое железо как субстанции, связывающие кислород и его актив-ые радикалы, агар-агар для создания полужидкой консистенции.

Вариант 2. (ГТ1). Основу среды составляют гидролизаты с содержа-ием лактаминовой кислоты не ниже 20 мкг/мл. В среду в качестве уточника углеводов входит глюкоза, изотоничность и консистенция )еды обеспечиваются соответственно хлористым натрием и агаром, заэробные условия — аскорбиновой кислотой и сернокислым желе-)м, а в качестве дополнительных стимуляторов роста используются эптон и Ь-цистин.

Вариант 3. (ГТ2). Низкое содержание лактаминовой кислоты в гид-улиянге мажынлшо ¿ворога (для«* 20 мкг/чл) г;жмун>* шедшия боль юго количества стимулирующих рост бифидобактерий веществ, позему углеводным компонентом в этом варианте является лактоза, в ачестве стимуляторов роста используются пептон и Ь-цистин, все ос-шьные компоненты соответствуют вариантам 1 и 2.

Необходимость разработки всех трех вариантов питательных сред эусловлена возможностью более полной утилизации отходов произ-эдства лактоглобулина — молозивной казеиново-сывороточной мас-В процессе проведения исследований было отмечено, что разные зрии молозивной казеиново-сывороточной массы, также как и соот-этствующие им разные партии молозива, содержат неодинаковое ко-ичество бифидогенных субстанций. Более полноценным по содержа-ию бифидогенных субстанций является молозиво осеннего сбора («пас-Зищное»), значительно снижено количество бифидогенных субстан-ий в молозиве и, соответственно, в остающихся отходах весеннего эора («силосное») сырье. Так как даже «силосная» казеиново-сыворо-эчная масса представляет ценное дешевое сырье для приготовления итательных сред, способных существенно снизить стоимость бифидо-эдержащих эубиотических препаратов, целесообразность ее исполь-эвания не вызывает сомнений.

Изучение закономерностей развития популяции бифи-добактерий на новых питательных средах.

Развитие популяции бифидобактерий штамма В.Ы11йит-1 в перио-ической культуре на всех трех вариантах сред (ГТ, ГТХ, ГТ2) выявило, то изменения численности жизнеспособных клеток в популяции со-

ответствуют кривой, характерной для развития микроорганизмов н жидких питательных средах. Во всех трех случаях отмечали наличи лаг-фазы, экспоненциальной фазы, фазы снижения скорости размнс жения, стационарной фазы и фазы отмирания культуры. Бифидоба* терии, высеянные на среды ГТ и ГТ1 развивались практически одинг ково. Продолжительность лаг-фазы составляла около 2 часов, экспс ненциальная фаза продолжалась 18-22 часа, 4-6 часов занимала фаз снижения скорости роста. Длительность стационарной фазы соответ ствовала 20-ти часам и она приходилась на 24-44 час от момента пос< ва культуры, к 48 часам культивирования количество жизнеспосоС ных клеток несколько снижалось. Максимальное число жизнеспосоС ных клеток в популяции достигало 1010. Развитие бифидобактерий н среде ГТ2 шло несколько медленнее: лаг-фаза составляла около 4-часов, около 24 часов продолжалась экспоненциальная фаза, стацис нарная фаза соответствовала 30-44 часу от момента посева культурь К 48 часу культивирования, так же, как на средах ГТ и ГТ^ отмечг лось уменьшение жизнеспособных клеток. Более медленное развити популяции бифидобактерий на среде ГТ2 подтверждалось и при аналр зе основных параметров, характеризующих развитие микробной пощ ляции: константе скорости роста (число клеточных делений за 1 час времени генерации, скорости роста в экспоненциальную фазу. Но сс поставление этих показателей выявило и наличие различий в разв* тии популяции бифидобактерий на средах ГТ и ГТГ Наибольшее чи( ло клеточных делений происходило на среде ГТ (0,69), несколько мен! ше их было на среде ГТ1 (0,62) и значительно меньше на среде П (0,41). Время генерации соответственно составляло (1,4; 1,6 и 2,4 Эти данные могут служить косвенным доказательством влияния ла! таминовой кислоты на развитие бифидобактерий и подтверждением б бифидогенной активности.

При посевах культур бифидобактерий штамма В.Ы^ёит.-1 на ра: ные варианты сред с основой из гидролизатов молозивного творога м; ни в одном случае не отмечали разницы в их морфологических, кул! туральных и биохимических свойствах. Культуры бифидобактери представляли собой палочки средних размеров с утолщением или ра: двоением одного из концов. Они окрашивались по Граму положител] но, в мазках располагались кучками, напоминая китайские иероглг

ы. В средах росли в виде рыхлой массы с выраженной зоной анаэро-жоза, отдельные колонии имели форму комет. Они обладали типич-ыми для этого вида микробов биохимическими свойствами: не обра-эвывали каталазы, не разжижали желатин, не продуцировали газ при осеве в столбик печеночного агара, сбраживали глюкозу и лактозу, е свертывали молоко, но закисляли его до (55-70) °Т.

Одним из способов оценки пригодности питательных сред для вы-ащивания бифидобактерий является оценка качества сухого препа-ата бифидумбактерина, выращенного на этих средах, в соответствии требованиями ФС 42-132 ВС-88 «Бифидумбактерин сухой». При от-аботке рс?ки?-та теульттшрорзния йи<|>иптт« пчрий на средах ¿lo ;ид олизатов молозивного творога были учтены основные закономернос-и развития популяции бифидобактерий на средах ГТ, ГТ5 и ГТ2 и в эответствии с ними внесены изменения в технологический процесс, озволившие существенно сократить время, необходимое для получе-ия сухого препарата, количество расходуемой среды и материалов, [зменения к регламенту производства бифидумбактерина сухого ут-ерждены Ученым Советом РНИЙМП (протокол № 10 от 23.12.93г.), эрии препарата, приготовленные по измененной технологии прошли редварительные испытания в ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Готовый, иофильно высушенный во флаконах, содержащих по 5 доз, бифидум-актерин соответствовал требованиям, изложенным в ФС 42-132 ВС-8 «Бифидумбактерин сухой». Средние показатели специфической ктивности 19-ти лабораторных серий бифидумбактерина составляли ±1 • 10° живых клеток бифидобактерий в 1-й дозе сухого препарата, го кислотообразующая способность превышала 90 °Т. Изучение анта-онистической активности по отношению к патогенным и условно-па-огенным микроорганизмам (штаммы возбудителя дизентерии, энте-опатогенных кишечных палочек, протеев, золотистого стафилокок-а) обнаружило, что зоны подавления роста тест-микробов превышали 0 мм, что указывало на выраженные антагонистические свойства би-шдобактерий, выращенных на средах из гидролизатов молозивного ворога. Так как в последние годы участились случаи дисбактериозов детей и взрослых, обусловленных клебсиеллами, была проведена нтагонистическая активность лабораторных серий бифидумбактери-а к 54 штаммам клебсиелл, выделенных от детей с кишечными забо-

леваниями и выявлено, что антагонистическая активность лаборато! ных серий несколько превышала антагонистическую активность 6i фидобактерий, выращенных на среде Блаурокка (коммерческие серии Сухой бифидумбактерин, полученный путем культивирования на ср< дах с основой из гидролизатов молозивного творога, сохранял сво: активность в течение года.

Так как питательные среды, используемые для культивировани бифидобактерий (ГМ, КД-5, Блаурокк), применяются и для определ« ния количества бифидобактерий в 1 мл бактериальной массы, был изучена возможность применения сред из гидролизатов молозивног творога для этих целей. Параллельное титрование 10 серий бифид( бактерина на среде Блаурокк и средах из гидролизата молозивног творога дали совпадающие результаты. Так же совпадающие резул] таты были получены и при использовании сред на основе гидролиз; тов молозивного творога и среды Блаурокка для определения кислотс образования.

Мы не ставили своей целью применить разработанные нами сред для выделения бифидобактерий из материала, полученного от бол: ных. Однако, исследования проведенные аспирантом Э.А.Гаевой пр обследовании микрофлоры кишечника у больных токсакарозом пок; зали, что количество бифидобактерий, выделяемых из фекалий бол] ных при использовании сред FTj и ГТ2, соответствуют их количеству высеваемому на среде Блаурокк.

Так как среды, используемые для промышленного культивиров! ния бифидобактерий, в частности среду КД-5, применяют и при выр; щивании лактобактерий, была изучена возможность выращивания лш тобактерий штаммов Lb.plantarum 8Р-АЗ, Lb.fermentum 90Т-С4 и Lb.ас dophilus n.v.Ep 312/402 на глюкозных вариантах сред из гидролиз; тов молозивного творога.

Lb.plantarum 8Р-АЗ при культивировании на среде TTj давали xi рактерный для этого вида микроорганизмов рост в виде равномернс мути с белым осадком на дне пробирки. Отдельные колонии имел вид «комет» с хорошо выраженным «хвостом». Выросшие на сре; микроорганизмы имели характерную морфологию: грамположител ные палочки средних размеров, располагающиеся беспорядочно или виде коротких цепочек. Развитие популяции лактобактерий на ере,

Гj достигало своего максимума к 20-22 часу. Был получен сухой пре-арат лактобактерин из штамма Lb.plantarum 8Р-АЗ и изучены его зойства в соответствии с требованиями ФС 42-252 ВС-89 «Лактобак-эрин сухой». Исследования 6 серий сухого лактобактерина показало, го специфическая активность препарата составляла в среднем 2,3 млрд. :ивых микробных клеток в одной дозе, активность кислотообразова-ия достигала (230+15) °Т. Препарат обладал выраженной антагонис-ической активностью по отношению к патогенным и условно-пато-энным тест-культурам (шигеллы Флекснера и Зонне, протеи, золо-нстый стафилококк, энтеропатогенные эшерихии). Сопоставление нташпшлической актшзпссн? .тя*оряторчмх «ж^ий лакюСакюрина. п оммерческого препарата лактобактерина производства ГНИИУМ ноз-олило говорить о соответствии антагонистических свойств коммер-еских и лабораторных препаратов. Аналогичные данные были полу-ены и в отношении штамма лактобактерий Lb.fermentum 90Т-С4.

Изучение возможности использования среды ГТ и FTj для получе-ия маточной культуры штамма Lb.acidophilus n.v.Ep 312/402Нари-э»), выявило, что разработанные среды пригодны для этой цели. Ко-ичество жизнеспособных Lb.acidophilus n.v.Ep 312/402 при культиви-овании в течение 24 часов при температуре (37±1) °С достигало 3+4) • 109. Микроорганизмы имели типичную морфологию и высокую ислотообразующую активность (110±16)°Т. Биологические свойства юлочного продукта, полученного при использовании данной маточ-ой культуры, соответствовали гигиеническому сертификату № 111/ 88 на молочнокислый препарат «Наринэ». Изучение свойств штамма ¿.acidophilus n.v.Ep 312/402, выращенного на среде ГТ^ и получение .исломолочного продукта, соответствующего гигиеническому серти-шкату качества, позволяет считать, что среды ГТ и TTj, можно реко-[ендовать для получения маточных культур при выращивании этих гикроорганизмов.

Выводы.

. Молозивная казеиново-сывороточная масса (молозивный творог), являющаяся отходом производства лактоглобулина, представляет ценное сырье для получения питательных сред, пригодных для культивирования бифидобактерий, так как содержит наряду с белковы-

ми веществами естественные стимуляторы роста бифидобактерий

2. Разработан способ гидролиза молозивного творога, отличающийс тем, что расщепление белков, входящих в молозивный творог, ocj ществляется щадящим методом с использованием малых доз nai креатина.

3. Разработан принципиально новый способ оценки качества гидрол! затов, отличающийся тем, что помимо содержания аминного азот в гидролизатах определяют количество лактаминовой кислоты, я] ляющейся показателем их бифидогенной активности.

4. В зависимости от качества исходного сырья разработаны три вар* анта питательных сред, различающихся по содержанию лактам! новой кислоты, углеводного компонента (глюкоза или лактоза) веществ, обладающих бифидостимулирующей активностью (пепто! L-цистин). Разработанные среды могут быть использованы для oi ределения специфической активности и кислотообразования эубис тических бифидосодержащих препаратов, а также для культивирс вания лактобактерий разных видов.

5. Бифидобактерии, штамма B.bifidum-1, выросшие на разработанны питательных средах, имеют типичные морфологические, культ} ральные, биохимические свойства, соответствующие данному вид микроорганизмов. Сухой препарат, «Бифидумбактерин» получе! ный путем культивирования на разработанных средах, по свои свойствам соответствует требованиям ФС 42-132 ВС-88 «Бифидуь бактерии сухой».

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Зависимость накопления биомассы бифидобактерий от степени ги; ролиза казеина в питательной среде (Межова И.В., Терновская JI.H Костина Н.И., Шепелев А.П.). — // Тезисы конференции «Разр; ботка и производство препаратов медицинской биотехнологии». -Махачкала, 1992. — С.115-116.

2. Биологические свойства бифидобактерий, культивируемых на cpi де из отходов производства лактоглобулина (Малина H.A., Терно екая JI.H.). — // Материалы докладов Всероссийской научно-пра: тической конференции «Принципы и практика борьбы с холерой республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микроби

логических питательных сред и тест-систем». — Махачкала, 1994. — С.128.

Химические свойства гидролизатов из отходов производства лак-тоглобулина (Малина H.A., Терновская JI.H.). — // Материалы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Принципы и практика борьбы с холерой в республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тест-систем». — Махачкала, 1994. — С.104.

Питательная среда для культивирования бифидобактерий (Терновская JI.H., Костина Н.И., Межова И.В.). — // Положительное решение от 7.06.У5г.

Способ получения гидролизатов для приготовления питательных сред (Терновская JI.H., Шепелев А.П., Костина Н.И., Малина H.A.). — //Приоритетная справка № 94-018305/13.