Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование интегративных векторов для переноса клонированных генов в штаммы STREPTOMYCES

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Использование интегративных векторов для переноса клонированных генов в штаммы STREPTOMYCES"

• С 'Й^З

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

КУДРЯВЦЕВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ННТЕГРАТИВНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ПЕРЕНОСА КШРОВАНШХ ГЕНОВ В ШТАММЫ 8ТКЕРТОИПСЕ8

03.00.15 — Генетика

____________А В ТО- РЕ Ф.Е РА Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -т 1993

Работа выполнена в лаборатории генетики акти-номицетов и актинофагов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

- - Научный руководитель — доктор биологических наук профессор Ломовская Н. Д;

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Каменева С. В.; кандидат биологических наук Ухаботина Л. С.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи АМН РФ.

Здщита диссертации состоится .23 марта 1993 г, в • /У час. на заседании Специализированного

учетного совета Д.098.12,.01 при Всесоюзном научно-исслёдовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. ,

С диссертацией можно ознакомиться в библио--теке ВНИИгенетика.

Автореферат разослан_ Л! .февраля 1993 г.

Ученр1ц секретарь \ ...

Специализированного совета, кандидат биологических■ наук

В. И. ЩЕРБАКОВА,

n:v.UU X*i>AHWI!CTii!lA РАБОТЫ

ну. -¡'■'ft j ;

Г1:—pns-, Strf-г'r^vc*-« я* «wirf» продуцентами оолмшшства

iiv-i.'i c!!4 >• я. ; .i.. 1 v-irix , .нрушх !-ч ;:-i:'4 i.'i' 1 и*!--'" и ^ii

HU« i. .• » '"Ч:::".; :> Ii i!' ! •

iü.'fj! 1 ] !■■ ,|.> II: Ы15;:P■1 Г-"~'И"?i'"1 Г

. : р-.ч- t. ¡с:.. „¡ш:4" Г v;!.. n-HH'i ¡ui.r.- ii-;-i:;;>: ihiuiiv'»!"

IIHH L-I.I B!iOMM:iK)il ¿11 .11:'.', ''.M !'- !;i'ii."''i(/iJ-i''''

, i\ , r/i'H. 'iii:;::.. '4'n-:.ri . • ü.mü >" "г л* Л"!'';!1";?!':; in vi>"\

- . - •..:-'[>.■.■". -I i " ■ -НИ. n i". ' f"--- >1. , 4 1 : М-'Л .

Научение структуры, upi cuiHontiHii и- pv.i ¿.«¡<11.111 i-ii'-i:-! j- v-p поинтеза антиёиотикоь сноееГ^твует кглютрущюганип т'окоактнвных

Blu»i«,.i f4"4 ; limi ч<|ч>м рмпионгыштю Mi,iv«u

генной' шшриерни до.швяет п-'няяшмшнч ^ ij.

В генной инженерии продуцентов антибиотиков проблемой является виедение и стабильное поддержини* клонированных ти«ои п штаммах- продуцентах. Июр^Оиггньаъгоя системы, поаютяяити ронпш'еп'гнр -' му штамму стабильно наследоиатъ шюпиропанпме п-чш, тед^нны'.' ь хромосому но механизму сайт- специфичном рекомбинации: Это мояет сыграть важную роль в конструировании nur (««»активных иромишленпнх щюду рентой антибиотштон.

• WiK1!'4 -и HWIV, , р. 160ТЫ являются urrnvMH S4"f*pt отупев

• " ■ • ■ V ■ 11 ■ I ■ ii V , r -, 'P-'-'-;, "''"И'- TinllS M!TtJit И"

с!4 .f , Ы',-ч ,',':•■•.',ii i ■ . ;y . ■-n-.i'-n nt<:m. '«¡.'¡тг:^',' ч r,,^.-.-.^-'-j< Hl i! |!Г'!'":т> ,V!"TC! :ШП«П*0) f'i r 1111 i • • и:;

i ,MM ..-).. . и: ti' =!-.T> i! ']",')!i"i,!J'!J,,"V. И' " H ' '' V"'.4 <~' i'. '' i :•!•." M

i<i?.rtti fv¡no'rw н ;>ni>n'in w'CJnjioiwiH*.

tU'jii->< n:i'4n-li:t rt p.rvtil ЧР.тО'.чл. .»цчнт- >н.Ч0!У rv-,rf4M П-|>4' HI '.'<' КЖШН|Ч>|« «)1Н'Ч .VI' ! ОИЧИГ.: I I' Г '>•.•••«!! 'ЧГ44! н !•

игтамми-пролуц'^нп» ^и^да-К"4'^' Ii livsuл! и

S. vii idocbiumioirf-r Тп4У.1 В солтгпт'.ттк; о птей ц'-лю пядччями

l>r;t"> ' 1 ¡11'.'!:'.■'■ ' Т :

рл Р. ' ;.4 •! 4 IV i4 r/M II.''. |'-'Г.Ш"1'4 И гр » •••|'Ч"1 > ':•!> '! 4 1"" 4

S. virl'foi-M oucv.W" 41!и пцптомн !4i,r?;n'Hti4 tt«"Uli ■'> nvvavM S. bvvii о'хпрк-чг. /vi'CP'VC'r.

- dücipMüT. рчр,!.р"Т«4 H'iri'VHHo Н'.-ього Hin'^i-pavtirn'M'n п^еторч rC!T°" r. т '" г ии-м.лл» f: i iviil.-tii-44! тKfVI и пр!'ч?;Ш4 ноимолп..".41 ь

¡]р:!М:-Л-' !"'fl >"]•' К" "''.II11 -т* ■ Л' t* Г ''! ""Г' !>; '.и •(".(» ' !' 4 '

~ с. ~

- ввести ген устойчивости к биапафосу bar на интегративном векторе в хромосому модельного штамма S. lividans ТК64 и оценить уровень функционирования гена в одной копии в модельном штамме;

- клонировать Фрагмент кластера генов биосинтеза биалафоса втамма S. hygroscopicus ATCC2J705, включающий ген устойчивости к биалафосу, и оценить уровень устойчивости к антибиотику, придаваемый им модельному штамму;

•- ввести.в продуценты биалафоса гены устойчивости и биосинтеза антибиотика (в том числе на ингегратнйном ректоре) и изучить влияние клонированных генов на уровень устойчивости и продукции штаммов.

Научная новизна результата.

- разработана система клонирования на автономно-реплицирующихся плазмидных векторах в штамме-продуценте биалафоса S. V i г i dochromogenes ;

- разработана система межродового конъюгационного переноса клонированной ДНК из штамма Е. coli S17-1 в штамм-продуцент биалафоса S. hygroscopicus с использованием плазмидных векторов;

- Изучено взаимодействие нового иитегративного вектора pZATES с модельным штаммом S. Ii vi dans ТК64 и показано наличие хромосомных перестроек штамма в районе интеграции вектора;

- оценен уровень экспрессии гена устойчивости к бнапуфосу bar S. hygi oscopicus ATCCgl'/Oü, представленного в одной копии, в составе хромосомы модельного штамма S. lividons ТК64 при введении его на интегративном векторе;

- получено увеличение копийности гена устойчивости к бизла-фосу в хромосоме модельного штамма;

- в составе многокопийного плазмидного вектора p]J699 клонирована часть генов биосинтеза биалафоса штамма-продуцента S. hygroscopicus ATCCS.1705;

- показано,значительное увеличение резистентности к биалафосу штаммов S. Jividaris ТКБ4 и S. viridochromogenes Tu494 при введении клонированного фрагмента кластера генов биосинтеза биалафоса не мультикопийном векторе;

- в качественном тесте продемонстрировано повышение активности штамма-продуцента биалафоса S, viridochromog-enes при введет» в него клонированного фрагмента кластера генов биосинтеза биалафоса па мультикопийном векторе;

- оценено влияние дополнительной копии гена bai- на резистентность и продуктивность штамма О. hygroscopicus, при введения его i хромосому штамма на интегративном коньюгативном векторе pTOt.

Дпучеа-дашз-цчвьхы« рЛОЫ U »JfciWb'eWttS («Ш.»

'I , r . 4.1."';-,!."i .(, i".;!!">ч^с.илнкл i:ii':vrp;j ",!f.:i.;ru i'

::r?-rpnTWo-KoiaBraTiremji u :г.;:J:sts;>t.,11i:;i п.!!.; у^ ju.i

Г ' > : r " >■■ ■ 'ii fci-i: i;;.: И ¡.ТГЗГ'УЧХ-ПрпЛУиеНТах Olttl-

„,„.,...- .. :V ■ ' •;., i; i f. , ¡"-«"'-¡¡;!1'- n.1!'. >1 про

!•.<• с • " MX II ХРОМОСОМУ Ь ОГСуу: ТЬНИ ¡•«MtmitbifCi •

: :: ■ . 'Y";\ v:" ....'.'.. ' tl:' : A,:r: ;'.rr:;vp"n»«MI4X ге-

ний ji.pv.-. i¡-- i'- !i; .•: !:.?.;;.hiovhhhh i -л ¡'Ч-iCj i* ts<1 и >

щюшзлешшх стамшв- продуцентов и создании (iyavpmn.w<fntrou ¡ж-

я KtRjMuv-u../ rr......интегоативного вектора с селективным

».'•аркер-»» д.«-» u,»,n.nuuu^iV.z т%~ч1тчр»ннА ¡«'и»-^-

OijLi/tOHiie в состане многокотшной нлазмиды г»япч

устойчивости и биосинтеза бналафоса в модельный штамм S. livuians ТК54 н штаки-продуцчит S. virtdochromogenes Tu494 привело, соответственно, к повышенны устойчивости и продуктивности штаммов. Продемонстрирована возможность амплификации клонированного гена устойчивости к биалафоеу bm- в поставе хромосомы гетеролопгашго хозяина.

Пплучг-нщ'е результаты могут быть использованы при коиструиро-:.;'.:, v.i н^оп,.«-. гш продуцирующих биалафое.

(.Трьктня Н я(ги:Ч p<lC'!'i!,L

;ji\.v;r s i<■ ,-.■:■;•-:,т г~, с-.::-;1:.'-bry.;; iiiji-^fiin1.', liursui

¡¡¡'.л г ■;■: м v !'. (■• I'li;:, i.v, р.ч'у '<!'i ы "ЖоПср'/.ч^Н'пп!. ^сгулке i;''.'', !:"><■•„•" Г -t, '¡тури ; fzi£ НУНГлСПОХШШГ'' .

рагу-in' jOf vi , тгличал 3d рис и ■} :тл слиц Auvofiiinan

Геэули 'itw {.• morw докжшдиаяш:» ни семшгарах js iD<,i..-uupmt re нетики актнномицетов и актинофагов ВЬШ «шитмка, на 1:ткн.ц ? снде л.! 1.*\н- х р ТЧШИгвйетика, па Всероссийской конференции "ii 1 п.- ь ч:р ии.| '•(•..-.г-хнол»! ни" i I'vwmo, i . ), ип -V M®*.-ДУНИриДШ'Й r4UlM}..|.w!.Ii::tt ('• ! '-Н'. '1 !!•'.'■ 1! l*.j!t>cyji:lpH' Л Г.И .т ч И« 1!С

ЛеННМХ M11Kf:',ii'JprMI!Hr-:M:.ifl i РЛУМИШ'ТОН, ПОД, lilUiJ Г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭДЖИЕГИМЕНТОВ

i. Цссмдашиию cifcicuu плтшндиоН щюпсфсцщции спшип S. v i ri <lnclu<m.>ccnes l«eifi<>.

Оспоримо трудности при разработке методой кведешы рекомбй-нанткнх ДНК я штамми-нродуцкнтн Strept.omyee.-; сг.язаны с определением оптимальных уелоннй получения и fieiTiiepanmi протопластов, преодолением б.-фЬерОЛ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЫ реСТрИКЦИИ МОДИФИКаЦНИ и выбором лекторов. сиособйнх стабильно поддерхим^ьсл в тетках хозяина.

Для проведения генно-инженерных работ со штаммом S. virtdoclu-umotrene:? in литературных источников были ипвестнм оптимальные ус Л'-пня роста культуры п жилкой среде и наследующего про-тоиластиравашет (Е. 3trpuoh el' al, 1987). Это {»ост в среде S в течение 48 часов при концеитрииии глицина 1?.. лизис при 37 0 в течение 1 часа Р присутствии Я мг/м.п .пиаоцима и регенерация протопластов на R^YE-агаре. При проведении экспериментов по описанной методике титр получаемых протопластов бил Sx 10® кл/мл, результаты стабильно цосшюиа годились.

Лля трансформации штамма бплп внорзно несколько векторов: мул1/гм1'/ч1штип вектор pU'/O? ( репликон pl.ltOl. имеет широкий круг хозяев): г°ктор p'jni ( р-плигоп Я.М. 2. обычно имеет 4-Ь копий г. клетке хоаяииа) ; лектор plj 910 t f »Simmon L'CP!?*, i-й копии ) ; мультикошиНтй вектор pYGIOl (производит! плазмпдн рЗВГМ. 2 из ютаммч S. с'1Э1Юйч1ш:з) ; мультиконийннй вектор pV.iRKK» f№» основ» • плазмиды р,[V! из штампа 3. ptiaeoolii оморепез).

ЗДЧоктивность трансформации шпгмидоми, выделспиши из модельного штамма 3. 1 i vklan.-:, составила бхЮ'транс^ормпнгоп/1 mki-н.яазмндной ЛИК ( табл. I ). Очевидно, г. m гамм? 5. viridochromopenes деЯстгует мошлая система рестрикции'-модификации, так.как эффективность трансформации, теми же птапмилами штамма S. lividarre внп'е на 4-В порядков.

При трансформации протопластов S. v i г idooln отжеие^ немодифи-цчрог.аниымн п.язйми/шми , гиде ленными из модального штамма S. 1ividant и модифицированными плаамидамп из штамма S. v i i i dew! ir omocet «s. аффалтгность трансформации модиШшшропашюй Д/iK возросла в J ООО рас дли плзммид p[J702 и рУ'Л-?10У, I! и Н) раз для плазмид piJC-lifi и рУЫШ при одинаковом количеотье ЛИГ- (табл. I). Показано, что при трансформации авежепрпго+овлетия протопластов шдифициронздиой ялаиышчюй Л11К эффективность трансформации

- Г)

;,. - .. : .. - ■ :..--r , :* -itifi"

, v "Ч:\" :■ iiи.i Vii!!:;- ;<a лГ'■ if'¡n'uiTC! '•■'>■ и

; •; " —uv.-----г«» г»ял«ппялл изучить их ста* илькосд'ь яри

; ■ ■'■■'. ■:■";<>■ 1 : v.," л

,Vn -.'. <"•' '":Г-~Г [-!•; ■ .' ■-ч:,': ;

•. • г'""" лч, ( THi оР КОЛПИИЙ1 . 01.1У10

; мл <■ - • - Г.; '.: ••

6ИЛМ1М nmi-iv.nia |)wniui ч ¡'.»к Ii. : J ' \'i.\c'' • •..:>"•? i; (•!,:'•'

. .■• .. .:.. .--,■'. ;r<- ,!'•' - I.. B ««o»-

полностмо утрачивались na ö - о нассв«г»и н .vs.u:. у-..: •••и.>ч.

и«, п кгтлммй S. vlridochromoüenos модифицированные плаз-

»•}«"" m'HIICn'IR.mnu LW^l, V..V.C;™"'-' Пр". 14 «ТВЛСПиШт.»

условия;;, чем плазмиды из S. iividara.

Тс*л;ия образом, показано. что несмотря на дейстоутую к штамме S. vir;dachronofjeпоз систему рестрикции-модификации, воамояио осуществление успешного клонирования генов я штамма на • плазмидных векторах. Проблемой является нестабильность наследования пдазмид в штамме в неселектиш'нх условиях. 'Возможным решением этой проблемы молит быть применений интегративного вектора, который стабильно поддерживался бы в составе хромосомы штамма.

; I .. '.-;'••:!',:.• 1. 1 ¡■■auc'tr.r мании .„г.лмм.ч

: .....:"■ '1л ¡ч'.Ч'Ган;: п iii CT Li

О;:.-:.'н.-.ть .!•;/••/ ■ РН?'.?'."^ ; Hcci.-.'.^itT'.irHi,!:-:

Г-Ы-кт пьнос; ь'./

■ ' »4 --¡W!' ¡ФщчА'киш Стг.бн /'ьн::сть

i < 1 рая ! мкгДНК

¡.vr-: SO! i ! v! - l;ir 4 х 10г 40?.

S. v i r i docbromogenes 4 X IIP 60Х

U 'A' 5 ч 1С; i. 1 v ; ü-.tir- 3 х 10?. i ?0Л

v i r i сmci Ii oirnjgenes £ х 10s 0,1 - 1 7

Pi.l 702 c- 11 v idatir. 1 х Ix to'* %

v i r i d-'-hromopcrte4 2 < Ш1 <0.) - 1 %

pH 010 s. 1i v i dans ö x ш' 10 Z

Vi! l - !"> >r Ii)1- ' ?n 7

pl.l Gl 1 i v i dat is i x IG2 1Ю %

....... при ТИТР'"' 1)ПИТОШ1Ч''Т'!|', !> v 1,V? l;.!!/v.l.и

- с, -

' Чтобы показать возможность использования в штамме. S. vii itíochrcrnotifn<"3 вектора, интегрирующего в хромосому за счет наличия фрагмента ДНК умеренного актшгоФага фС31 с attP-сайтом и irit геном, было продемонстрировано наличие в хромосоме S. víridochromoírene:? аШЬсайта интеграции фага: проведена лизоге-низация фагом (¡CSl и его производным r{t!3lR3. Таким образом, возможно использование интегрлтивннх векторов с ínt-функцией ф«га (Ю31 в штамме S. vJri'JochromofreiK»:?.

Разработка систем клонирования в штамме S.'"V i г i dochi orrogenes показала, что штамм перспективен для работи методами генной инженерии. В н°м достаточно просто методически осуществляется трансформация, ц хромосоме вгамма присутствует аМВ сайт встраивания фага ф031. círo дает возможность клонировать ген устойчивости к антибиотику биалафосу и гени его биосинтеза не только на плазми-дах, реплицирующихся с клетках продуцента, но и на плэзмидах, сайт-специфически интегрирующихся в хромосому штамма.

2. Ипуюино ¡кншиалрЯствия ююя wnvspnrtwmso ncrnvixз pZATBS с иодальпш атомном S. i ividnra ШИ.

В последнее гремя особый интерес вшивают вектора, которые не реплицируются в клетках стрептомнцетов, а встраивается с помощью сайт-сиецифичсской рекомбинации в хромосому ктаммог, St.rept.onycea Это дает возможность стабильного наследования клони^отиних на таких векторах гсчюв, что для штаммов, использующихся и качестве промышленных продуцентов, чрезвычайно важно.

А. П. Болотиним била сконструирована подобная векторная нлаоми-да. Вектор, -названный pZAT22, бил любегчю предоставлен в паше распоряжение.

Шазмида pZAT22 (8.04 т. и. и.) (рис. 1} была сконструирована на основе вектора Escherichia coli pTZlO, на котором бил клонирован Kpnl-фрагмент умеренного актиномицетного фага ф031 размером 3. <12 т. п. н. с attP-сайтом и i ni. геном . Для отбора трансформпитов в Е. col i в составе плазмидн присутствует ген Ыа. который придает клеткам устойчивость к. ампициллину. В полилинкер получившейся плазмидн вставлен BcwiHl-Pst Г йпагмент с геном устойчивости к ти-острептону t.sr для отбора т[)анстформантов в 51гер(:отусе:л и ирА промотором.

Преимуществом вектора pZATKZ является невозможность его репликации в стрептомицетах. По им-.чыцимся данным, отсутствие стрепто-мицетного oriR делает интегратлвные вектора стабильными и повышает

rzmn- "ндеиерние малы.}.

r. Si ; Б к.";

- 7 -

li.si nr..; ¡.¡'.¿м>ю:з Si rapt 5. Проводить ,щчц T' ¡аегках F., col î бисгрен ичс:--п,:> ntrec^o'iyoes вводится у ¡ut ГОТОВОЙ л: {fcr>.".«•;;•!»!« згнпои rewm-misnht .»•?.-»*? ссч-

р--:!?сг!бйнчитного штамма, продуро'па анплиоч'нка. Ь'.ч-Л! бы ni» <'-,.&г..г.-гст'а->ш!:10 повздсчие нового вектора iZ/.ÏZÏ а

ОИАвлиЫ.'. î ;v i'Ku'!. -i DCiHC'.J.'jï(,«>iiiHil i'ipï (

.'.•p¡Tît^nunu пштоплас-?ой модель.'К'Го ви-амуз составияп К:'

-ni''.■ ,-;.'.-а;!7 >В/i Д1:К ¡¡рч i П'г 'р-'. 'ЛСХПим.'ПСТОЙ 1УШг КЛ./Мл. tif-u

проверке »i\cjxvi»<bv.an ь«?>пц)н ери pi.cri- т••{•.»»••: :.

««селективных условиях было проворено около £00 fp;im,.;> 'p : "С; >ы "'»ci-« huivw^c:::;? '?"тпованием, уколами и печатью на селективную среду}. ''•'■Huri^i.c прея?»ч.»м у?глйиипости к тнострептону во всех генерациях. Это t.-m^i^ueTr-ye'" » -ют. :гс плазмида действительно стабильно поддерживается в штамме без селективного давления антибиотика.

Чтобы показать, что плазмида действительно интегрировалась в хромосому штамма S.lividans, был проведен гибридизадионный анализ BamHI-рестриктов хромосомной ДНК отдельных колоний Из потомства десяти независимых трансформантов S. lividans (pZAT22).

Kcnf ^FtlV.Hi

iSc:!

, SrM

Hindta

açU Cla! И £<хг8У

"e^"--. ' $phl HlndW

I$rti \\ "" • - - -

■■ 1-е UViP

4 о Scat KOQl

Kpnl Sact Ecoiïl

Рис. 1. Рострикшюнно-геи'Пкческня карга, иитегрпгитюго п»ктора

f.;

Чтоб» непосредственно проанализировать рестрикцжжную карту интегрированной в хромосому ила.::.',иди и окрултдадх он Фрагментов хромосомной Д:!?.., был .'.'идол:!! В^П ¡-фрагмент хромосомной ДНК S. lividAns(pZAT?2) с интегрированной плазмидой, так как с?.йта рестрикции ферм-нта BgUI ист на векторе. Хромосомы каждой из дельных колоний S. Im dans (pZATSI-l), взятых для гибридизации, были рестрицнроЬшш ферментом Bßl! i и полученные Фрагменты лигированы сами на себя. Полученными препарата',¡и Кольцовых молекул трансформировали Е. coli. Предполагалось, что получен^ и трансформанты С.coli, устойчивые it ампициллину, будут содержать плаэмидные молекулы, в которых к pZAT22 по гибридным att-сайтам присоединены участки хромосомы S. lividans, вырезанные и лигированные no Bglll.

Б результате такой трансформации мы действительно получили из каддой рестрициропзнной стрептомнцетной хромосомы несколько трансформантов, оодерлмзих идентичные плаэмидные молекулы, отличные от вектора pZAT22. В результате их анализа была построена рестрикционная карта клаякиды, названной pVG222. Рестрикциошшй анализ плазмиды pVG222 позволил тпк«э построить рестрикцканнуто карту attB-области хромосомы S. lividans ГКО", (фрагмента длиной 8.6 Т. П. Н. ). (РИС.2)

BämHI

Hinälft Hindlil Sv

Pst I

ншш

EcoRf " Kpnl Hindlll

ВдШ

ВдШ

BümHI

BmmHi

BamHI ВдШ

Pstf в am Hi

etlBB'

ВатНЬ

1Kb

Рис.2. Рвстрикциоингм ка{»тг» клтошили pVfWZK и Фрагмента xjnmxvM ной ДНК S.li virtue/. ТК04 .с ai.Ui- -¡n'rvow йнтепчмдои Фига Ф031.

Яри Li.Jli- рее»рпктоь >.pon:>cow«u.t JüT. ur^-^i-iiux

колот,и sc потг-мстка кеыитинмчх траксйормкктов о эондоч - плаами-дсй pZAicH I ii5f,;:4ir!Ot!2.:!:cb йрагиегггы размером 5.1 и и; т.к.!!., чтс соответствует «остриенйии рострйкцнлшсй карте фрагмента хрочооом iujH ДНК S. 11 v гdar.s( p?"АТ!?У) с встроенной (piic. С).

5 - Яая/й Я - i'st: ü - Ssi.H w - HindiПК - !<рп; S - Süd ну - Haofiy

Рис. 3. Ресгрикционная юрта фрагмента хромосомной ДНК S. liviriaa.=;(pZAT22) с интегрированной ллазмидой pZAT22.

Таким образом, показано, что интегация вектора р2'ЛТ22 происходит в attB сайт хромосомы модельного Штамма S. lividahs ТК64, •-•то ¡фкесдит к стялилыюму »юдд^рлйиию п/а-уид;; п составе хромосомы штаима.

Интересно отметить, что ?. одном из экспериментов по трансформации модельного штамма S. livioans TKÖ4 векторной молекулой pZAT22 после анализа получении:: транс^ормантоя были подучены иеожидшшг» результаты.

Результаты гибридизации и Pntl- рестрнктов хромосомной

ДИК нескольких трансформантоя S. 1 iv:rians(pZ/u'22) с зондом - вектором pZAT22 »казались с>гличн«даи от предполагаемых. Вило высказано предположение о возникновении перестроек плаэмидиой или хромосомной ДНК S. lividans(pZATS2). Чтобы непосредственно проанализировать оестрикцисмную карту йнт^грир^иптгой в хромосому п.»чямидн на предмет возникновении перестроек ДНК, мы рестрицироьалк хромосому ид-ного.траноформаша S. livnians (pZAT22) ферментом BgIN и лигирон-д-ли полученные фрагменты сами на себя. Полученным препаратом кольцевых молекул трансформировали Е.coli. Предполагалось, как и ранее. что полученный трансформантн. устойчивые к ампициллину, будут содорхагь илмамидшк- молоку ли, » itoiорм* к р?.ЛГ2Р не гибридт*« att-сайтам присоединены уччогки хромосома s, livi.lan-.

В результате такой трансформации мы действительно получили плизмилных молекул. |» п рпкшюпиий аиа-пи;« кпгормх дал рлгдуипи"

результаты. Одна млазмидп ! идентичная pVG?.?£') содержала неизмененные Фрагменты at t-окрестности хромосомы S. lividans, остальные плазмиды делились на дне групгн. Ii первой принадлежали плазмиды (названные рУОЙЙЯ), в которых бми обнаружена делеция размером около 5 т. п. 1!. , которая захватывала часть хромосомной ДНК S. 1 ¡vi-Jans, attBP" и часть гена int. Ко второй группе принадлежали йлалмиды (наяяанни» pVM24), н которых аналогичная деления была более протяженной (около 4 т. П. н. ) (рис. 4).

При перетранс<1ярмациях плазмидой pVG22K и поддержании в нескольких генерациях клеток Е. со]i не было обнаружено вновь возникших перестроек ДНК плазмиды pVG.':'K2. Таким образом, ЛИК плазмиды pVÜ222 Не претерпевает каких-либо изменений в Е. coli.

При анализе хромосомной ДНК отдельных колоний из второй генерации потомстпа одного трансформанта все полученные при рестрикции хромосом по Rgl П и последующем лигироваиии трансформанты Е. coli содержали плазмиды, идентичные pVG??3, то есть содержащие делецию размером 2. Г> т. п. н. В то жо время при гибридизации этих хромосомных ДНК, рестрицировшпюй по Ват!)!, с зондом - плазмидой pZAT22 гибридизовалось два фрагмента, длина которых (12 т. п. н. и ?.. 5 т. п. н.) соответствуй' построенной рестрикционной карте при наличии делении в 2. 5 т. п. н.

Ташш образом, в хромосоме S. 1 svidarisipZAT22) действительно произошли перестройки н рчйс.п« гибридного attBP' сайта (рис.4).

Для характеристики плазмид pVHß22, pVG."23, pV6224 ими была поставлена трансформация модального штамма S. lividf-as ТК64 с контролем - плазмидой pZA'f2?. Трансформантов плазмндами с делециямй int-reHa.' (pVG?23 и pVRKiM) получено не Сило. Эффективность трансформации плазмидой pVfi-'2P составила 3x101 трансформантов/мкг ДНК,- что более чем на порядок ниже зфх^чгивностн трансформации плазмидой pZAT22.

ЭТот результат подтверждает тот факт, что ген int необходим для интеграции фага Ф031 п хромосому стрептомицстоп, и его тЛреж-дения приводят к отсутствию интегрантов. В то же время показана возможность возникновения интегрантов при встраивании плазмиды с гибридными attBP'и attPB' сайтами и промотором гена int, отделен-, ним от самого гена фрагментом хромосомы S. lividans (в случае pV6222). При этом, возможно, ген int считываетсл с промотора на фрагменте актиномицетной хромосомы, или происходят транскрипция гена с альтернативного собственного промотора.

fcKT возникновения в одной из трансформаций хромосомных перестроек рекомбиЯантного штамма S.lividans(pZAT22) нуждается в дополнительном подробном исследовании. Возможно, причину следует

/ / «о,,/3*"""

/ / Ч/М1/(Ч

•к Щ —4

I а Т "' ^

а->» ЫыИИ

' иш

Ра'» в

в Р

К

Еи И

РН

¡¡¡Н/|

а ! К-

«у/

оа> £.впО

(Не!

В - ВатН! И'Реи Е- ссош Н - ШШН Г. - ХрШ 8 - 8га Е1' - ВооП¥

Рис. 4. Рестрикциоинан карта плазмид рУСЗ?22, рУйййЗ, рУС224 и фрагмента хромосомной ЛИК 2. 1»V!с!пп?(ргАТР.й) о интегрированной плазми-Дой ргЛ!22 •• делениями.

искать в состоянии стрептомицетной культуры и условиях протоп-ластирования и трансформации, так как все трансформации проводили одним и тем те препаратом плаэмидноИ ЛИК pZA'i'22.

Таким образон, вектор pZA722 трансформирует модельный штамм S. lividans с высокой оффзктивнсстью и стабильно в ном поддерживается в интегрированной в хромосому хозяина форме. Вектор pZAT22 имеет сайты, удобные для клонирования, и он весьма перспективен для генно-инженерного конструирования рекомб)?нантних штаммов Streptomyces, в частности, продуцентов биолафюса.

3. Введение ингсгрггнптгхг вектора p'¿AT2'¿ а иташы S.coclicoior TKlti и S. vír>etocíiPwnotrencs Tu4ü4.

Для экспериментов na введению ттгегративного вектора в продуцент биалафос» был вмбра» штамм-продуцент S. viridochromogenes, так как для него раз работав а- система трансформации. Кроме того, для трансформации был вая-r штамм' 3. coel i color, как близкий родственник S. lividans и широко пспестный ооьект генных исследований.

Оффективиость трансформации плаомидой pZAT22 из Е. col i TGI штамма S. vir idochromo;:ei'e:- составила- F>x 10 трансФ-Н'мантоь/мкг ДНК. Такая низкая зфк'ктигноеть затрудняет клонирование в штамме с использованием этого вектора'. Уровень трансформации повышается при выделении плазмиды pZKX'¿'¿ к* штамма Е. col i dom-dem-. При этом трансформация 5. viridochromotrenes проходила с аФ^.-ктивностью 0x10* трансформантов/мкг ДИК при титре протопластов 1x10'®'кл./мл. Стабильность вектора при поддержании' штамма с плазмидой в неселективных условиях составила 1002..

Таким образом. вектор pZAT22 моулт реально использоваться для клонирования в штймме-продуценте биалафоса

S. viridóchromo(*enes Tu<í94.

П(1И трансформации интегратишгон плалмидой штамма S. coel i color ТК18 мы также отметили эФКкт повышения частоты трансформантов при выделении илазмиды из dam-dem- штамма Е. coli. Эффективность трансформации составила 2x10 трансформантов/мкг ДНК из штамма Е. coli TGI, и 5x1üJтрансформантов/мкг ДНК из dam-doш-штамма Е.col i. Стабильность вектора при поддержании штамма S. coel i colorí pZAT22) £ леселективних условиях -также составляла 100%.

4. Га:зр?июгк<ч стггены nn.yr.vwji imnwrnviwofo мгкярггипнояп вектора л S. hygro:x:opicu:i.

P л!-;т'>р,чл'.";,''' omvrm W'TC.'itfH fPfii-Hi'H плазмидной ДНК в штамм 'S. l.ygi oicopicuc Ti лнС'^ мл:;,;'-!'! ирглл:'Г'ЛТ'Л'. Пчпитки полудни:; протопластов этого штамма пл nnr»r"finft метолик° оказались безуспешными. поэтому лл:1 двния н.тсмилн ДЬК необходимо <5ыш искать альгераагиьныс пути.

НЛМИ '-!,'.'!; 1! ЛЛ;.'ЛМЛ Л И.' 'Л ">' ННЗ'ШП'1 Г). !т,Л;ГС i СМ" фаГОМ

t!'P! и то лг-лг !")дш«7 '>'"' ' >'11>1гч>\ч).пчг.ус-т о iiMimtn

at.tB-сайта фага п хромосоме ипамми. [«жим образом, для nrnum ? bv«rrn<irot> 1 ctis возможно использование nenrepon с int-областью фа-■ a djuii млл, Г.

Недавно била описана ме.чродовлн к-.(н*>;1»цт> ".coli Strept.om('c«'3 (Р. Ifeocher et al', 198®). P настоящее время существует целый класс ьектороп, имевших в сво"М госгаи? фрагмент с oriT плазмндп RK2. позроляийнх проводит/; конструирование в клетках Е. coli,' а затем переносить векторный конструкции из донора конъюгацией в ренилиентиий штамм Sti ерСотусея. Прсимуц^стп такого, метода очевидны: не нужно подбирать ус.чышг дли получения регенери-ругадах протопластов штаммов Strepiomvees ДЛИ проведения трансфор-•'-¡■"".i, для многих (игачмгж продуцентей является критическим мо-v-чт;

А iL !, -лог-.пш 1>м 'лллютругр'"''г1 tt ":'<"">пн") ¡-,?.г.дт,С1.'»рле1> нам !"л:л л> л, t ;л 1 •". '•;. ''ЧРЧ-лй длл '-о^чл-ния' г^глрл- лГ01 елулил нн-г-гр.и'И!,.'!:.:;: р'легор i>'■'.А >}'■ и- >■< и; ivyr<yrry? КчМ-Фрагмент размену 7ЛЛ :;.л. о; : i н." •р'.'идч ЕКГ'. -;Тп переносить вектор

Л. <Л0 1 'Л'-* ! '< ¡'I t .!>,".'! I Г ''' Г-Л ^Г 'Л? Л"" •"> Л.

По описанным п лиг"Р иур» K"rc;iHKW mit югннмк сектор вви-г,лл л; V моД"лып in втамм S. 1 ivt'imr, и н штамм-продуцент л. Л/л;г-л; лллл Д.п иоел-дн'-то методика кспиегашт Он па «одифшю-рована, при этом эффективность конъюгации йила повышена на Р. по-""""ч «. япгтиг,т.па 1х103рекомбиНантНнх клонов на чашке. Стабиль-':р|"г-,p'i в лксклнгг-гантлх Г-. hvtt! o--i-.epicus( pTOl) И

: - -л -л-1!; с.....гаплл- г h'i'.I Гштндг.-'-щип рои да - ллазмидн

pTOl и хромосомной ДНК S. hysji o^copicus pl'Ul, рестрИцированной iiep-ментами Rami) I и Kpul, показала, что вектор действительно включен в хромосому хозяина.

;.:л: л! : лллул- omnrmtttJM тчгг» спопубпм и транейюрмировай Ь'. cc.-i; ..Ml ир'.н шш-:м '1грпаллтом Fgl 11- гестригла хромосомной ДНК S. hygfosoupipubi pTuU , кы получили плазмиды. содеркадае фрагмент at • £-)Чл--<:1 v. :■:; .л.г 1лл:л Я fivRi o-sropicU:-. 'Cttnri псстроейв рестпйКЦИ-

>ii:iai!i

- u -

Kpni

Saqll Clul

Pi ah , 0».....

1 r

t~iifl£iitj___— A \

„-■W «HPP'

r.coHi \\

Hind 111

Pat I

or IT

O-Tkb

Pull

, .¿ssLmi'n________

ISiUYSP [j j\\<w№ T70romotjr A

"*ena2£ • .. If nm<t 4, Itrlmir V

Maai Xmnl

Kpni B<icl EcoRI

Puc. b. feci (mirnijoiii/o-reiieTH'Jecua« KapTa iuia3i,iH«u pTOl. Hinqilt

Kpni

BqmHIEcoRV Ceil

Hindltl EcoRI

Pat I

/ HindUl

Pull

Kmp-

Kpni.......// pHT3

la.ekb

Put! —^ril attPB'ff

Bamtil"-' n Kpni

Kpni

EcoRI Kpni Hindlll

Bglll BsmHI tiatnfil

EcotU

B&mHI BaniHI Bglll

Pall 6cofll

,.1L

Psil

Kpni Ps<l Ki>n,BamHI IPsil Kpni

Bglll

aftBB'

t kb

Pur. G. tVuTpiiKUm'iiiia:! Kapia u 'i-u'i-mjtu ij!U'3 tt ftpai'Meitta xpouiiuuMiio JI'IK iirraMMa live.1 iwiiirir; e .[<-runr■(.< ui'Tf-rpaumi dvna iI'MI,

сшит к ».чламия, "л,'10н'|,|'''1шых pHk-\ a на v ■ -ч им«км! • реет •

рПГЦИ' 'МЧ'чч Г;!'!'1. ! ' ''ЧЧЧЧк Ч:ЧГ Ч ' ? PV М f ' '.r p'l' Ч'1 '1 V 4 ff^f»TÍÍ ХРО"

vcomh штаммч S. iiv^í;-г:ч-, ер' '> ! " ч<ч< " >■ ". ч. н < ¡ rr. fi).

Ра~»,<»рм ч>-!Г'!.'Г! полученных т'ри j'f;:'í¡. í!.-'4!ií no "•""(!! и

Kfüi! и ги^ридпзугпчнх'::! с рейдом . г Г, i" т. '*. г и ' <~. i. ! т. П. и. ,

оССТВ?ТС'ПаИНО) . ПОЛНОСТЬЮ C'Pi'Tt,Г i»'' » .¡.у. ¡-.(.I, '■■Tuynia«

фрагмент"?», гассчи! vmv*. ¡r> !г«'тр<ччт.%и }к>«тр!«кчт-йкии capí».

Т; !);:■;■• ^'"■''М, П< 'ГЧЧ-ЧЧ' '<■>'- > ■. ^ г ■ ^ ( !"! " ,> ■ I

носз плаамилм на Е.cotí SI 7-1 ц ¡sr».r ". Кп ....... : .......*.•>*•

fV'-i Ь Üiicil "•<"*." Г «ninwwMItiHX ГСНСП Г прол?'!!"»'! '>'■!№№ «;fi. ¡¡.-¡.ХО.'ПДЧ

piOi ь xpí-M.tc"" "п-имма ;.'.'jn':"M " р''Сильно поддержи-

вается в л «••срл'-ктивт« yc.^.-r.:!,¡x.

5. СуСииюшцтмтю жни yctviruimTit к Стпл-Пчюу /vir на и«--гсг/итшшом гегс'го/»? (ЛЛТ22 и шплгнгг? о,--о » /^я^.ч^'И!' тлслыюго втпи«я S. / ft'/finas ПШ

Рр^Ж'ТарЛЧЛО интсррс определить УрОГЯЧЧ.- Ч!Г-!'рлССПН одной ко-ПЗ':т ..... » : — н »-Т'ЛЬ«' -М юга'».!« Г\ 1 i v j • 1. it 3fel "'ТОГ'.' ММ субГЛОНН-

,„,■..,•;< Ч'Н! '"Г' 141"''! ¡'lib..' р; ..rr.-'v" 1 i'./L'i CÍ'COpt CU?

/, p '|: vi " г "^.о-Ч''' i'', ль м'ег.рр/;,-ч |¡>: ■ • ч'; и >' ;7'T'', ,,<-:( p грЧч;1рер:1 г.т

;C ' -----, ¡. ,, ч' 1 ■ rp :TI'l4»-n: ¡44 ! ¡"'\( " " >'}'■'' "'И <rю-

w j j'1 , i; чr ч * * 'íu44 S. íi'.Mp'i'e-

П. ['ЧГ^'-'Ч" ¡ í' t"' ' И J" ^ í' /i И.Ч:?'"'1 '"¡"¡ЧЧ..''' "'^"'"OV*

!!•'( o|-,f •!•[!, . >••!!!'•• I'i»l|¡ ! -.¡p-ir»- ! С !• H ! 7, Т. II. Ч. ! !l 'Г 1Д! Ч'ЛЬ!

} ■ V t 'i! o n -личич'*' р"!'М чч''" Г'ч'.гог.ч Г. ; i ir ■' ■ i ri' ;;;,'4i:!!¡¡,4

»teя пла-м!<л'! ;i '"Ч" -р р ЛТ.-Г и>:«1» 'wet н • •;»•.•.•!' уп^пльемм

caiumV: ! •! ! ............j -ч.р 'р -; "•">!! 'i.:-*.".')>ч. |:г "■'"•>::;н:м!.;е для

ПОСЛ"ЛУ!г,,П«'Г') ЛПГИрСГанП)!. ВЫДОЛИЛ!»-' И.'' т-yt ü' «•• •«• "•Л- (СГ1»."{<!|>?ТИ-•!■ -'-"г t -«»ич г'естрикцнонноГ! смеси. Tai: гЛк uaiir y^üaüamtü рч" г '."'» : а; и >v..-:>iiah с ¡ iмГигг""^!! к ампициллину Ыа'

оОех ii.i-i.и,¡и;;, г' '¡ч ' !!'\iy"/-hhhx фр.г; " 'ü'"' "".рр,ч-'Л'мг'п.гч11;ц" щ;--гир'чппип с'.|'?тр"^ст»у»л!в1Х сайтов воил;цилЫ':г"": игтчпг устпйчк-р'.'ст!1 г амннциллииу, по которому и происходи.'! отбор трансформанхоз р (•' coli, i? реоульпго Ho.nyieHiHic транс:к'р!.<ант(.| действительно со-

.Ч"р ..........руЧ[ г? "Т^.'ИДу. НаЭИПтЩус.! f.'V'®" I ? (pile.?).'

■ ■ Н'Ч;! ;'!чр*''ч !■ : р iMe f"pM''.p(!ii ü >л\'ч->п« ft j!.!!"ntt¡t/H* штамма 5. Hv'-laiví ежчпшш Xxl0*трансу»п.и '?»-'• '! "rpe upo-

топпнет-'.п ixln' im./мл Устойчйпооть рекчм-'-ппан^иого it»« 5. 11 Vi'í Üгч. ¡1 .'■') е одной копией г->нч Ь»г р хр"!.! >ос!Г К биалЯ-

Фосу проверялась при титровании споровой суспензии нескольких не-эависимих клопов штамма на доза:-: бкалафэса от 0 до 60 мет/мл на минимальной среде (рис. 7].

На дозе 5 мкг/мл биалафоса выживаемость спор ре^мбшшнтиого штамма уменьшается в 10 раз по сравнению со средой без бкалафоса, на дозе 50 мкг/мд биалафоса титр выживших спор уменьшается в 100 раз по сравнении с исходным. На дозе биалафоса 50 мхг/мл одна копия гена bar в хромосоме обеспечивает модельному штамму такой хе уровень устойчивости к антибиотику, как и амплифнцировашшй в составе ■ МультикопшЫой плазмиды ген bar.

Kpni BamHI

WKMKV И» !!'>:•. '.•("'."," С |>'«,1|ШМК Л •.« ".<1! «'IV(Л:И"!' I.

Ter; !■:;-•)- !4«!Of 'Л1 .Vi ПО'С-ЗаМа ц'-.Г:Мо;\МеС?Ь !!'" [' -строек XpO"

i.v-Г. 1 ,vl.->r.- v ««тогопиии neteropa d'ZAI"¿Z, предстаьля-

ь :■•••- '-яг-'" • ■ ■ гт- м ■! s' i ' ч5 и гл"\"л><л">го г ;<рем"еому мо-

д^льао.'о гспо. л л-.

!'!•;•• •'.•'?!:•"- 'S. ' i«i'lan^' pVORP.) 2) последова-

тельно л--'. от а ;лл ;Vv мк.г/мл опала ¡у-ivi на иччродьчий 'среде,

нами ufcwio uivopiuio üo ¿анстипу С цонулициИ колоний - яотомиов от-

м- '.'Л 1Н'.":-." pM-;;!TOf. 'ЛкЛЛ-'i ЯМЫ" КЛ.ЧчПИП "Ор^ПП ГОС."!! >1 СПОру.чи-

p-'i 1 : .'.v.; ' ¡-/■J") '"ел. И'-'Л'ЛЛ ^лгалпо Рыле 'ч'чтть

емость их спор на тех ле доььл i>najiadwca, что Л кслсди-;!1'! нг1чтипгп штамма.

:_та:::"л, ««•.»•■•««•»• на поьпша^шЯп...; ¿о

згчх биалафлса. действительно оолндака- нмс-ко.; yc»o.Vsao::?l>s ыу антгоио!ику (рис.7). При концснтраиии биалафоса в среде до 50 мкг/мл ?•!*!'••• ктивность рассова спор этих штоммов равна единице, и лишь при ;-о vKr/мл гк'липаемоеть уменьшается у одного из вариантов на Л;4. (грч'.'икя Л. Iividnnsi pV'GESiS) N40 и U4V).

Гчг.ч проведена гибридизации Ibndl i!-рестрикто" хромосом двух исходи!« рекомоинантних штаммов S. 11 vidians (pVGB2J2 (1;S)) и двух un:u'.:.v.:i! с предполагаемой амплификацией (М 4G, 47) с зондом - плаа-■.---.—-л •:»<■• ¡'"«чгн хромосом. 'гийрВД'иаук^эття с вектором и

- : . •',•''. ■ 1 . i и;л: "■ Par 0, У..'■<

п.-. 1 у 1;-ок'¡резке; eirr ноу агамс-чп t;!| v-if.-.'i > ле;,: у

-■•/'..■¡■■'Г- ■ . V л":"Л! гчл1у"Т Of' ун"."1',П!И!1 Г'-ЛЧЛЛЛЛЛГЛ гена;' '-О'Л •и-л л ллг: :'.••■■.,' '.м", •■'"'ЧЛ'ПН'То л хромоес"'/ модального шгамма ' -'.I1' .-ос""'е им • рлтамчпго вектора. Гыл лл^г-дсн дополни-...■•,•'!'• - 'пслм'/л!; ■}}№, mw\w<uir:;) t::> д'егмг;; отд-'Льш.'х ,чп-лл-лл ;>!;■•■". . Л. i.u<fi ;Л'0НГ''':) fi-'-o. вгро'.-иих нч b'J мкг/мл оиллгг е : -ч г;,е!!о'-р ;мме аналогичной П!"рл;л:лллли р^стрнктоп таких "i ■•< '•].:■-» I.!. e'-^Tii'-'ieTbVfcNate ип'к'гвирснанное:.* вектору с геном bar. так,«о более кятеисиьны, чем у ¡»¡¡¿-ролы-ы:: вариантов. Таким Kw-.imn увеличение кспийности гена bar в хромосоме привело г. 'I г'.;.-, гссти модель него 'л л .. алтиОпетику.

: Ii" •• л-" г-[:'-чя проводится опал;;-' ■¡".r.vn\r« ачпiif^ttlKpoenff• кого фрагмента. По предварительным данным, в клетках 3. iividaic (pVGI-л i',]} происходят но крайней мерс два вида перестроек, длина и локализация которых различна, хотя обе они приводят к увеличению |"Л'Л.Л1' '-''И г- па i'i л /ром"'Сгл!?> ;:г-амма.

;аг.им и(.'ра:;см, reit устойчивости к биалафоеу bar был гвецеп В хромоее-му •.•.'-•д-'лън'.'го гтзима S. lividai^a в составе интегративиого

вектора: Показано, что он стабильно поддерживается и зиопрессиру-ется s одно;"! копии в хромосоме S. Jividans. Продемонстрирована возможность акаиЦ.шадции клонированного гена bai- в составе хромосомы гегерологичного хозяина.

С. Виздгикз дртяигсслъиоа нашш ост усчюйчиьаеги и б>ша-iozy tsar в хроноаоау tamtm-продуцент S. Iiygroscapicus.

Яш введения гена bar в штамм S. hy^roscopicus üua использовэд метод межродовой конъюгации ь системе Е. col i - Streptomyces с применением кощ,;сгат)шного интегративного вектора рТ01.

Субклонироваииз гена bar с мультикопийной плазмиды pV6B6 н< ннтегративный коньюгативнын вектор рТ01 проподлось по схема, аналогичной описанному нише переклшжроьа/шю гена bar на плазмид; pZAT22: ß результате была сконструирована плазмида, названна PVQÖ213 (ряс. 8) .

Было проведено скрещивание Е. coli S17-1 (pVGB213) S. hygroácopicus по модифицированной методике. При этом Частота по -явления эКсконыогвнтов S. hygroscop>cu3(pYGB213) оказалась значи телыю яиже, чем S. hygroscopicus(pTOí), соответственно 3x10 и 1x1 колоний на чайке. Возможно, эффект снижения Частоты конъюгащ-объясняется включением в плазмиду дополнительного фрагмента CTpe¡ томиЦетной ДНК. Бее полученные эксконьюганты S. hygroscopicus стг бильно поддеркивали признак устойчивости к тиострептону в неселе! тивиых условиях.

BamHt

Kpnl. ScoRVxbal

,_JL_/ , Pall

ecoRi

В

Smal Bmhi Xhat Patt SpM Hindlll Xbel

'Ш

ЙШШ

"Beul Xbel Hindlll EcofíV

Рис. R

рьотрикпирнио-генетическая карта плазмидм pVGKíiíí.

Hhi пи.'ридгсячии •!•.(» n.rrvw r>T01 с хоомосомиой ДНК

гам"а .v I vino '•'■!'!■- г! г ."Л'"! "') l> ""п '.1!|И1,пиа!Шой '[«рм""'мтами RapiH! Knrtl. было показано наличие мпсира pY'T?i3 л хромосом'.' штаячз.

¡[пи г!"'"1.-и. '- yoT'iiVniP'wrn и'.'луи'ПН!.! о г.окомбииактного 'птаг.ма к

1»'!ТГ-*ЧИ'!"У агпиоичгпку, кот-!!priH;?i'",lHWJb П'*ресеВ"М M'.UI'-ЛИЯ -, пф tin но 200 wrcr/мл Ым.ча(Ьаса я титрованием C!fop"p,u>:

!:■ v. ,г.н-i"1 '•' р-'Коч':чмач nniштамма на дозп:: 100 íi/сч ;'¡'t i-'Л*'-мм- >. !"i ür-' отм'.чи.'ч' ":a< Г' " г 1'° н.чо i 'о н кэличегтвечшепо гличия в росте штаммов 3. iiygi o^ccpicuo и

. f ivkí O^v^p i. UP ■■r'DO Thk»p мм не получили повышения уровня ¡,'¡Í ;,.:::; Ivpemiw»иианп.иы Г.'^у^г^^орк-ич! oVuCílo)

.> сравнении» с иехъпнни.

Ib пилимому, экспрессия одной дополнительной копии гена ре-ист^нтн^етн к собственному антибиотику вне единого согласованно егулиру-'мог о кластера генов биосинтеза недостаточна для повышения ровня устойчивости к антибиотику. Тают, возможно, интеграция ектора в хромосому продуцента происходит в области некоторых ге-ов, принимавших непосредственное или опосредованнее участие в би-П1НТЛМП ainибиотика, и при этом нарушается их функционирование. •—'•»:•.••.•••» • !• tj •• ур'пиы синтеза антибиотика от

. „, ; . ;,, • ...„■,,.г-,,, ■, t ,, ■ "1 ," ' ¡, ! ] ; Г. f I г| Г,-~ ' ■ ¡ С!,' С .

fLc:u;ax.'.'.mm >¿¡vi"w}fmt ¡azkwfn гг.::аг> Sntcainwn Uterus üuss. ••f fv.imvi >'•'!-:\jyt:f'!:r,:i h'/t<ro:=t:r.pi'.:r.:-, iUTC"(?0,4

•.!;'"i■ 'i¡ • Ггг1 ч:>. 'jn.-iaf'jeri картирован, известно ;y¡,n ч];.. 'Ч!--Ч!!И Mii'u »,•.')! -каину клеазами ( í. Marakara

i h-iy.*. шу'П'..ачич ньГа-ан Pctl11 - Фрагмент размером

.v т. и. и. . <:•';!"!'.•<;<:> пи ¡ гин 'ч«,':И!гг»э", и ецеп.'/'кпий с ииич ген стийчивости к Оиалафосу 1-аг, который одновременна является геном

:"'г ■ ■■■■■чу . í т':;:-,! ■!"■•!■ м-' V yr\>. "-i'-.:-caí.". Гестрицнропануи 'ндоиукл—.-и иЛ i i x¡ vт лч;: ■.•■ гамма 5. hyero wopf iT1 '1'!1Д".ченнуп препаративно, лигировапи с вектором - рест-ч!""! '.'1"!!!!)(.'и также но сайтам FgU! плазмидой plJ699. В качестве «чи'пиента тшользг^ата штамм S. livnfatn ТК54, мицелий Которого ...,..,, •:,.;( ,,: г .,., í'¡. , , 'r:> ; среде.

Ц'/'Н" Г (''ti' Г ',"»í'."¡ Г'.' Ч , УСТОЙЧИВ!" ГО К ТИРСТР°ПТОНУ .

.„т,>я,-,к г"'плик переносили на минимальную cpe.iv, содержашун 10 ,4-.!V ял 'гч'а.'г: ¡vea. < реди J -itxi тр-ансформан гоу ОМ отобран клон, об-'¡•i;¡a''!'.!HH I»-нотичом устойчивости к биала^осу. Гестрикционный анализ

pjKOMátfHíuiTHoft пя&шш i>Vi'!>'!, ьидиЛ'-лшой из клопа, пи^саь »,-víh-ЧП" «'.таили nLi:;Mt'¡'CM ?. o r.ü. и. , идентичной B^I I 1-фг>агм?нчу с гоном У,:-.y кластера генов огосингеза бкадафоеа хрл: ■;<■<■,м! S. hyirr и:, сор i 01<■_ I. pí',0. it).

Гиаридиа.чкия шш ~ нлшяты pVOBS и хромосомной ДНК ы'ал-.-л S. iiyí;ro:;f.opir:us, рестринираг.аниой но Fir i П . подтвердила iij-ohcxd» дение вставки на хрпмосомн S.hyR»02Copicir..

Вч шюннротимюм Фрагмент« находятся: ген Ыг, кодпр^'к.;:;!1:. фермент н-аиотклде^?ти.11'осфш10'гриц1«1т{ти1'.,^«раау и »доил«»)«*! од новремено геном устойчивости и ОпоашТеРн (Ib 10), ген йиоеингеа. биаллфзса (tío 6), кодирукдай чойчон^гглльалонатешггазу, ген ои ооинтеза (Но 12), ¡тадирувдй метилазу предшественника биахЛос М-адетиллеметилог.с«афоса и гены (Но и h, В) стадии акшилировани М-апетилдиметил^сФшготрицпка. Клонированный фрагмент мозглт Опт ислояьеован дли изучения ■ого влияния на устойчивость и уронен;, Он осчштеза штаммов-продуцентов бпалафоса.

Плазмидой pVGtfa был т|щн(.ч1ор|.шро»ан модельный што« S. 11vidcuis. »Активность трансформации составила Йг.Ю*' тргшефор маитос/мкг ДНК при титре протопластов бхШ кл/мд. Стабкльиост поддержиия плазмиды в 5. lividarts поели одного пересева спорами неселектлвних условиях составляет £ü?;.. Ллн оценки уровня уетойч! ьости к биалафоеу штамм поддерживался в селективных условиях i минимальной среде с тиоотрептонем.

Результаты титрования споротой суспензии S. Hvjiiaas с плазм! дой pVGBfl if а биалафос представлены на рис. 9. Введение на куль?» копиивой плазмиде фрагмента кластера генов биосинтеза биала^са геном bar (график S. lividans (pVGB8)) придает штамму более вквок; устойчивость. Чем ген bar в составе фрагмента размером 2 т.п.! (график S.lividaris(pVGB6)). На дозе 5 мкг/мл разница в пыжика* мости спор штаммов 5. J i v i dart s (pVGB5) и S. lividans (pVGB8) со era; ляет один порядок, а на дозе 50 мкг/мл - 2 порядка.

Плазмида pVGB8 была введена в штамм S. viridochromoi;enes, Д. которого разработана система трансформации плазмидными векторам Эфе.ктиг.ность Трансформации плаэмидой pVQB8, выделенной S. lívida»*, штамма 5. viridochromoKes составила 6x10 трансформа тов/мкг ЛИК при "титре протопластов 10^кл/мл. Из рекомбииаити клонов S. viridoch! omof;erie.'J( pVGB8) выделяли плазмидную ДНК и нос •ее идентификации повторно трансформировали шта S. viridocfiromoKenes. При этом эффективность трансформации повью лась Д'..' ш'трзнсформантов/мкг ДНК Стабильность плаамиды pVGE® штамме S. «ir idocliroinoííenes в неселектипиых условиях составля Q. 1%. Цозтому штамм S. vir idochromoi;enes(pVGB8j поддерживали на к

A

В

M ' "f № HMiil Pail \ /'

Bgtlt - ^

rccR'S ftaMHh

РЭГГ t !

— KCCfiV

Hindlt! : Xbai

•»r-f*

ёатН!

S.!Mdans(pV0g3J ■ S vlr!<ictñr«rr.ngenes(D VVB8}

S.hrQrvsccpkus

!" ; !

10

Ii

10

Ç. íMa'jnsfy VGS!>;

V " V nnrjrr-

14

75

- f 35

- f~ -■15

-4--V- -tt • • ! : ♦ ' 35 65 75 85 '95 ,

Рис q i ,\i ivcTinncimnniian капта п.лаамилн viVfîHS. (Ш Графики вижи-

Г'ча-м .,.. у, ! ívi'Sí'.r.s (КО-!. S. v i i <vf лс1ч

Я i-VÎT! • î S Hvt'bti?( PVQP6). Iivi-.bü^pVGB«),

3. ":t 1 1 -W при титровании riK>|«P 'rt .«улгнзии на

í.'imi'M":."! г;^"-1 " р'V! "vif дгнп^'И f?Haтаф^е^

нишлыюё среде с тиострептоноа.

При титровании спор игаша S. viridouiu-oaogönes (pVQfc») на рааличных дозах биа.тчфоса оша показано, что ашшф'.кшшн фрагмента кластера генов биосинтеза биалафоси с геном bar в составе ¡.¡удъ-тикопийкой ОАЧЬйИди pYGB.'? приводит к увеличении устойчивости ре-комбинапткого камма к собственному антиоиотшу большее, чем в 10 раз при концентрации 60 мкг/мл- бинла-роса и среде (рис. 9). Это позволило предположить яошшеииз продуктивности штамс.а S. V i г I dochiOTiügermsi рVGB8) по еравнешко с исходным ш'аыыом. Дли определения продуктивности штамма был испольаоБаи статистический анализ продуктивности выборки из :-.:00 индивидуальные клонов потомства транеформанта в сравнении с данными., полученным» на той ms выборке и в тех же условиях дли исходного нетранедормированниго штамма S. viridochromogenes после протопдастирования. Количество синтезированного антибиотика тестировалось по величине зоны подавления роста индикаторного газона p. subtil is 3366 при диффузии биа-лафоса на столбика в агар. Сравнение гистограмм свидетельство,ja.nc о том. что плазмидная амплификация фрагмента кластера генов биосинтеза биадафоса приводит к увеличению уровня биосинтеза антиби отика штаммом-продуцентом S. viridociroeenes. Гпстогрпшн били получены для нескольких независимых траисформацтных клонов и дал! сходные результаты.

Таким образом, результаты изучении штамма S. v п н'.оопгото'ь'епе (pVßBÖ) показывают, что клонирование и плазмидная ыыишфикшш протяженного фрагмента кластера генов биосинтеза Сиалафоеа с ¡чаю bar могут являться ауерс-ениинш этапом п процессе конструирован« продуцентов с высоким уровнем устойчивости к собственному антибио тику и продуктивности

выводы

1. Разр£(0о,1'ана система получения ретюрмрумш протопласте и трансформации штамма 3. viricluohronugtmes Ти41'4 " продуценте бис гербицида биалафоеа ш&змидннии векторными молекулами различно] типа. Показано, что дли стабильного поддержания клонировзшии ri нов в urravate перспективно использование плазмнднщ векторов, и 'тегрирукщихеи в хромосому штамма по механизму сайт-спеипфическ. рекомбшгшии.

Р. Рлзработгша систем.-; «ведения и.яаомшшой .'{Hl'.i; цродуце бичл.'.Ф 'Ca -• шамм Ь\уго/езрпчг'; Al'.iOi'JV'.ii- методом М'*г.родово скрещи в чшн с канипигиным нессиосо» пда-.миди из г. ooh oiv-l.

- -

Я i !{-\-т<г'1'о л-те/рине пнтегр-iriwi'cro вектора pZATc'E в

модальном стам;.'л. 1гч :•>!••■• ГКМ. П'Жазлна пеле.'ежноеть перестройки ГПТ7Т г, р-Псм- и-п-" грации вектора.

J. :!! ¡л:л"гре:ллл:'л* в<л'Т'.р^ р'У/НРР '"убк.тонирован ген устойчивости к оиплафоеу Ьн;. JJujia.3auu, что ген зкснрсссирутея в ео'тллр хромосомы мрл°.'<1Ь!!01'0 |итамма S. ! пчdaub ТКП4.

Г\ Г'К'Г'зпп ппзмолност'' получения амплификации гена 'bar хромосом* гетерологичного штамма S. lividciius TKG4 при введении его п o'-'ver.- ;»ii'i > грчгигног'• "екгора.

л. и н;п"г ратив.'пго и и.чтегратнвчо кюгггйтпвиогс

векторов клоннрованн фрагменты хромосомной ДНЙ итаммов S. iividaas и ч |)яя«л=чюм, соответственно, 8.5 и 10 т. п. н. , ВКЛЮ-

ЧИ мии» и! i.h-edwicl ritiifci pOiuin фага Ц.СС1.

'!. В составе мультиконнйного плазмидпого вектора plj699 клонирован фрагмент кластера генов биосинтеза биалаФоса размером 7. 5 т. и. в. . включасчпий ген устойчивости bar. Показано, что агалифици-ровонш! п составе плазмидного вектора Фрагмент придает устойчи вость к бинлнфосу штаммам S. lividaas и S. vlridochromogems pa уровне штамм- i - ироду] кчггп S. Ьукгозсср i ous. Показано, что присутствие ятого фрагмента в штамме-продуценте S. viriuocbio'rrwne-л на мультикопийной плазмиде приводит к иовыше-

crwM ¡■-■'•¡'иУ, ш ws /лccrrinüV;

I. :'•- лл"-- ■.. V . р-л.-л.ру у. Уч. . Ri t~vnpova I.V.. Kedrvamova ov-i.v-'"' Л. !\. . !!<. P. "'"'or,vor ?.f i ve otodv of

M..v-...... PvpTi oeoopieu:- ЛГГГ^ГТ'Л and

v-, i.. ~г,чГг..: м-Ю-1 [.'С'.1чо1Г£ ardiioorio - herbicide л! я|:'(|'л " \ ü'p. --I'" I . Product F'jnwl in I"1; r«ptc!nyce.T. 7-13 May 1ЭР0, Weimar GUR. '

?. грлпнов г. r . Ктаряшова (Кудрявцева) E. A. , Табаков В. ß , * л" л г ■ * л ". "" л'ольлоллни-'' i епа /л л'л hvsTi-^opic'T

: г ул ■> "лч"1'; '(-мптипического :.<арк<-ра при молекулярном зонировании генов биосинтеза биалафоса - экологически безопасного антибиотика- гербшшда". - Всесоюзная конференция "!?овые направления ешт^хиопогии", Г 4 октября 1Я90г., Пущина.

Л . ,. ?'. *;. , Taf—Т Р. р. K?nf>!»4'V»4 (Куярярряпа) Е-А. -

•у «.-г.т.,„, ,.•,,• к-¡'-ллл'' гт-гкто i она р^зиот'чгпн'сти л •'иалафосу bar в штаммах ¿licptwaycwa". Антибиотики и химиотерапия, т. 35 (1990), М 1Я

■ -¿к ■

4. Se&'inov Ö. V. , rn l-vilhovö I.V., ini и y.r.-i.ova

(Kudi yavi.sevalll. Д. , Tabahov V.Y u. , Mkrtumian N. f.t , 1.о:г.сА'л1.ауа !i. Ii. - "Ei;.[iloyimnt оf ¡.he «olßctilar ciorang ¡¡etliod.s n, Ibe studier of S. hygrosoopiciit' AWK17GÖ and S. vii idociiroiiiotiei.es ^u-i'Ji suams produi.itie ant »|j|0* lo her toicide bmlapl.os". - Я0 ?.?. Sup' en.Ua 1990, Rargrad, B'iifarja.

15. Седоки« 1. R , Табаков Ii. И, Кудр;ш>ьа (Кудрину на,) й. А. , Бирюкова U.Ii, домоьскач Ii. Д. - "Иеиольаоианпс- методов оиолагн-ческою геитнрора«кя и юлекртшрйого тшщ/оштн в исследовании штаммов St.reptopiyces hygrosoopicus ли!<"2Г;'0Ь И S. virnlootii onoitetios 1u494, образуй«)« аитиШртил-гербицид бпа.пефос". - Сборник трудов "Генетическая инженерия продуцентов антибиотиков" (иод ред. В. 1!. Днвилвнко, Я. Д Лимовекой), М. , 1992, с. 137-1Б0.

6. Yooykovn Т.Д., lsaeva I... М. , Bolot.ni А. Р. , lv.Kliycivth.eva Н. А. ,■ Mi;i um an U.M., l/jnovsl-.aya Ii. D. - "Pli.%'ß фСн! - the («odel юг

• [«leouiai -fjonef. sindies oi S* reptnmyres plvnies". - " Geriet in епк<пэегл;р of pioduoeis oi an1 hibiot ic.e", M , l9'.-i!i ( in ess).

7. Кудрявцева F„ А. , Табаков H. П , Колотив А. II , Вавилове E. Ю. , Ломсвкмая U. h. - "Разрапотка систем межродовой конъюгации

* Е. coli - 'Jt.i eploinyces в генной инженерии продуцентов ОиалафосЕ S. hygrofoopicus и хлортет'раптьчнма S. aui eoi acibti'.;". • V конференции 54- "Новые направления биотехнологии (R 22 мгч» i\<9:-:i\ , Кущи-но.

Р. K.udryavi.seva Е. А. , Tabakov V.Yu. , RoloMn AI'. . v.-wilovt Б. Yu , Lomovpbiva N. D. " In'ei g^mr- Oon pipal ien in (' -"bericfiic coli eiid pjodueers ot bial iplios. Strept omyoe:? »mn «>*чч<р toiic., uik CldorteUaeyel Hie. S. aurectaoiens". - Ah:~tt aet ol A-<M 1 '■ И <->i ep''e. Ploominglon,