Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование, анализ и регуляция генов биосинтеза ароматических аминокислот: aroA-aroG, aroI гены Bacillus subtilis 168, кодирующие ферменты трифункционального комплекса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование, анализ и регуляция генов биосинтеза ароматических аминокислот: aroA-aroG, aroI гены Bacillus subtilis 168, кодирующие ферменты трифункционального комплекса"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 579.852.11 Для служебного пол Экз. N9 Таг

>го пользования

СТОЙНОВА Наталия Викторовна

КЛОНИРОВАНИЕ , АНАЛИЗ И РЕГУЛЯЦИЯ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ: aroA-aroG, arol ГЕНЫ Bacillus subtilis 168,

КОДИРУЮЩИЕ ФЕРМЕНТЫ ТРИФУНКЦИОНАЛЬНОГО КОМПЛЕКСА

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—1993

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Ю. А. К Йомантас

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д. А. Перумов; кандидат биологических наук М. Ы. Гусятинер.

Ведущая организация - Институт общей генетики РАН

Защита состоится '}/' д&а^^й^ 1993 г. в ¿V час. ¿¡¡¿?т& на заседании Специализированного Совета Д 098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и слекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БНИИГенетика.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

ОВШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Важнейшие метаболиты ароматической природы: витамины Е и К, фолиевая кислота, сидерофоры, некоторые антибиотики, ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) образуются в ходе реакций шикиматного биосинтетического пути. Часть этих соединений не синтезируется в клетках животных и относится к незаменимым факторам питания. Особый практический интерес представляет синтез микроорганизмами ароматических аминокислот, необходимых для нужд медицины и пищевой промышленности.

Применение генно-инженерных подходов" способствует решению практических задач по снятию негативного контроля, препятствующего сверхсинтезу, по обнаружению и устранению "узких мест" в пути биосинтеза ароматических аминокислот.

Характерной особенностью шикиматного пути в клетках В.subtilis является объединение ферментов З-дезокси-Д-арабиногеп-тулозо-7-фосфат-синтазы ( ДАГФ-синтазы), хоризмат мутазы и шккимат-киназы в трифункциональный комплекс. Этому комплексу принадлежит ключевая роль в системе аллостерического ингибирования, которая, в свою очередь, является основным механизмом в осуществлении негативного контроля за синтезом хоризмата, предшественника фенилала-нина, тирозина и триптофана

Дзе ферментативные активности комплекса (ДАГФ-синтазная и ши-кимат-киназная) ингибируются субстратом (хоризматом) и продуктом (префенатом) третьего фермента комплекса (хоризмат мутазы). Получить штаммы В.subtilis с десенсибилизированными формами первых двух ферментов до сих пор не удалось.

Таким образом, важная роль мультиферментного комплекса ДАГФ-синтаза - хоризмат мутаза - ¡пикимат киназа в синтезе ароматических аминокислот у В.subtilis определила наш интерес к изучению особенностей его регуляции, а также к исследованию структуры генов, кодирующих ферменты комплекса.

Основные цели нашей работы заключались в клонировании генов В.subtilis, кодирующих ферменты трифункционального комплекса ДАГФ-синтаза- хоризмат мутаза - шикимат киназа, анализе структуры клонированных фрагментов, а также в получении мутантов с измененной регуляцией активностей ферментов комплекса.

Научная новизна и прикладная ценность работы. В клетках

В.subtilis впервые клонированы гены aroA-aroG ( ДАГФ-синтаза - хо-ризмат мутаза) и ген arol (шикимат киназа) из В.subtilis 168. построены рестрикционные карты, проведен делеционный анализ клонированных фрагментов.

Получен и охарактеризован новый класс мутантов В. subtilis 158 с нарушениями в области arol гена, рос-т которых чувствителен к L-тирозину - tsg (L-tyrosine sensitive grovrth) мутанты. Показано, что рост на минимальной среде мутантного штамма В.subtilis tsg-36 чувствителен к очень низким (около 0,1 мкг/мл) концентрациям L-ти-розина и к повышенной С45-48'С) температуре (вне зависимости от присутствия тирозина).

Новая мутация tsg-36 картирована в области arol гена В. subtilis.

В опытах in vivo и in vitro показано, что у В. subtilis tsg-36 мутанта в присутствии L-тирозина инактивируется фермент общего пути синтеза фенилаланина и тирозина - хоризмат мутаза Тем самым продемонстрировано, что для получения функциональных изменений в одной полипептидной цепи мультиферментного комплекса ( ДАГФ-синтаз-ной - хориамат мухазной) можно использовать мутационные нарушения в гене, кодирующем другую его полипептидную цепь (шикимат киназ-ную).

Получен штамм В. subtilis tsg-36 amyE4 recE::cat, и в этот реципиент введены гибридные плазмиды, содержащие aroA-aroG ген и arol ген. Обнаружено, что как тирозин-чувствительность, так и тем-пературочувствительность роста исследуемого мутанта полностью ком-плементируются клонированным на ллазмиде геном arol (шикимат кина-зы) и частично - клонированным геном aroA-aroG ( ДАГФ-синтазы - хоризмат мутазы). Свойства новых tsg мутантов расширяют существующие представления о регуляции биосинтеза ароматических аминокислот в В. subtilis.

Клонированные гены aroA-aroG и arol введены в составе многокопийных плазмид в клетки селекционного штамма В. amyloliquefaciens А74. Показано, что введение гена aroA-aroG увеличивает продуцию фенилаланина.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введе-

ния, обзора литературы, экспериментальной части, включающей обсуждение результатов и выводы. Материал изложен на . стр. машинописного текста, включает рисунка и . таблиц. Список цитированной литературы содержит наименования.

Апробация . Результаты работы были представлены на II европейском симпозиуме по генетической трансформации (Будапешт, Венгрия, 1992), на семинарах отдела биотехнологии ВНИИ Генетика (ВНИИ Генетика, Москва, 1992), на научной конференции ВНИИ Генетика (ВНИИ Генетика, Москва, 1993), совместных семинарах с учеными фирмы "AJINCMDTO" (Москва, 1991-1993, Токио, 1992-1993).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы штаммы В. subtil is: 168 trpC2 (коллекция ВНИИ Генетика), BJ21 атуЕ4 гесЕ4 (-//-), 11-27 D-tyrr pFP^T. Ям-польская, ВНИИ Генетика), BD224 trpC2 thr-5 recE4 (Dubnau, США), QB936 aroG932 trpC2 ald-1 leuA8 (Dedonder, Франция), QB928 aroI906 dal-1 ригВЗЗ trpC2 (-//-), VB2281B aroA6 (Nester. США), 118 aroI116 amyE4 (Yuki, Япония); E. coli K-12: TG-lA(lac pro)thi strA supE endA sbcB hsdR'F'traD36 proAB lacIz4M15 (коллекция ВНИИ Генетика); В. amyloliquefaciens А46 pFPr( Г. Великжанина, ВНИИ Генетика), АЕ36 (Е. Абалакина, ВНИИ Генетика).

В работе использованы плазмиды: рСВ20 CA. Сорокин, ВНИИ Генетика), pJJ2 (Ю. Йомантас, ВНИИ Генетика), рВА483 (-//-), pUC19 (Yanish-Perron, Франция), рС194 (Erlich, Франция), pPL703 (Lovett, Франция), рВТ69 (Alonso, Германия).

Фаги . В работе использовали фаги Е40 (IQ Йомантас, ВНИИ Генетика) и AR9 (Р. Азизбекян, ВНИИ Генетика).

Среды . Для выращивания бактериальных культур использовали бульон Хоттингера или L-бульон. Минимальной средой для бацилл служила среда Спицайзена, а для Е. coli -среда Адамса Соответствующие тьердые среды содержали 1.5Х агара.

Для анализа продукции фенилаланина бациллы выращивали на среде следующего состава; от 80 до 130 г/л глюкозы, 20 г/л NH^Cl, 1 г/л КН2Р0ч, 2 г/л KCl, 0,4 г/л MeSOr7H20, 10 мг/л FeS047H»0, 1 г/л дрожжевого экстракта, 40 г/л СаС03, pH 7,0.

Трансформацию штаммов В. subtil is проводили по модифицированной ме-

•годике Анагностопулоса и Спицайзена (Anagnostopoulos and Spizizen, 1961) а Е. coli - по модифицированному методу Коэна (Kohen et. al., 1972).

Выделение хромосомной ДНК осуществляли по модифицированному методу' Клотса и Зимма (Klots and Zimm, 1972).

Выделение плазмидной ДНК проводили по модифицированному методу щелочной денатурации Бирнбойма и Доли С Birnboim and Doli, 1979).

При необходимости полученные препараты плазмидной ДНК очишали от Примеси хромосомы равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием (Маниатис и др., 1984). Рестрикционный анализ, лигирование и электрофорез ДНК проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др. , 1984). Активность хоризмат-мутазы определяли совместно с Т. Ямпольской по методу Лоренса и Нестера (Lorence and Nester, 1967). Активность ДАГФ-синтазы определяли совместно с Т. Ямпольской по модифицированному методу Голлуба и Залкина (Gollub and Zalkin, 1970). Активность шикимат-киначы была определена Л. Ивановской по методу Джайтонде и Джордона (Jaitonde and Jordon, 1958).

Для количественного определения фенилаланина использовали метод тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol UV254 в системе изопропанол : аммиак ( 7 : 3). и аминокислотный анализатор. Количественное определение триптофана проводили колориметрическим методом при помощи реакции Вуазене. К 2 мл пробы, содержащей триптофан (0,1 мг/мл) добавляли 50 мкл 2,57. формальдегида и 6 мл концентрированной HCl. После 10 минутной инкубации при комнатной температуре добавляли 0,5 мл 0,52 NaNOa. Оптическую плотность проб измеряли при 540 нм.

Антсаниловур кислоту тестировали флюориметрически при Л возбуждения 332 нм, А эмиссии 400 нм.

Ингибиоование роста штаммов на различных средах оценивали •качественно: по размеру и количеству колоний на агаризованной среде и количественно: по оптической плотности жидких культур. В последнем случае опыты проводили в условиях предварительного истощения внутриклеточного пула аминокислот по следующей схеме. Ночные культуры выращивали на минимальной среде, отмывали и разводили в 100

раз средой, содержащей все компоненты среды Спицайзена за исключением сульфата аммония ( источника азота), и инкубировали с аэрацией в течение 3-4 часов. После этого вносили необходимые добавки (способность которых к ингибированию или к снятию ингибирования мы анализировали) и сульфат аммония в обычной концентрации. Штаммы инкубировали с аэрацией 24 или 48 часов и измеряли оптическую плотность полученных культур.

УФ-мутагенез спор В. amylol îquefaciens проводили с помощью лампы БУФ-15 на расстоянии 60 см в течение 4-5 мин.

Трансдукцию фагом Е40 клеток В. arcyloliquefaciens проводили по методике Ю. Йомантаса ( ВНИИ Генетика).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .. Клонирование гена aroA-aroG из B.subtilis 168

Известно, что ген aroA-aroG кодирует бифункциональный фермент ДАГФ-синтазу - хоризмат мутазу. Этот фермент образует трифункцио-нальный комплекс с шикимат киназой. ДАГФ-синтаза считается ключевым ферментом в биосинтезе ароматических аминокислот, поскольку кодирует первую реакцию шикимового пути.

1.1. Получение реципиентных штаммов для клонирования aroA-aroG гена B.subtilis.

Клетки B.subtilis характеризуются высоким уровнем гомологичной рекомбинации, зависящей от RecE белка. Поэтому гибридные плаз-миды, содержащие гомологичные хромосомным фрагменты ДНК, могут стаб^лх^ю наследоваться только в гесЕ-дефектных штаммах В.subtilis. Для введения мутации гесЕ в штамм BG44 aroG932 1еиА8 и VB2281B агоАб использовали трансформацию хромосомной ДНК из B.subtilis BD224 trpC2 thr-5 гесЕ4 и конгрессию с пдазмидой рМХ39 (Em , repts). В результате мы получили штаммы B.subtilis BG5 aroG932 leuAfl госЕ4 и BG6 агоЛб rccFM, которые использовали в качестве реципиентов для клонирования гена aroA-aroG и делеционного анализа клонированного фрагмента.

1.2. Клонирование aroA-aroG гена ELsubtilis 168

Клонирование гена aroA-aroG осуществляли методом "shotgun". В качестве донора использовали штамм В. subtilis 168. Вектором служила плазмида pJJ2 (pC194(Cm)-pBR322). Хромосомную ДНК частично рестрицировали Sau3A. Векторную ДНК линеаризовали по BamHI сайту. Рестрикты лигировали и лигированной смесью трансформировали клетки В.subtilis BG5 aroG932 1еиА8 гесЕ4. Трансформанты отбирали на минимальной среде с лейцином и хлорамфениколом.

В результате рестрикционного анализа плазмид, выделенных из Аго+Стгклонов , была получена плазмида pBG41 с минимальным хромосомным фрагментом величиной 2,0 т. п. н. (рис.1). Мы сконструировали ряд делеционных вариантов этой плазмиды и протрансформировали ими Ree и Ree""штаммы с мутациями агоАб и aroG932 (рис.3). Оказалось, что плазмида с делецией 0,6 т. п. н. Sau3A-EcoRI хромосомного фрагмента не компдементирует ни агоАб, ни aroG932 мутации, а рекомбинация с хромосомой содержащегося в ней фрагмента aroA-aroG гена приводит к восстановлению роста на минимальной среде агоАб и aroG932 мутантов.

гоопм.

/ч^,, xnl

J tbamHI/Scm 3#]

Cßal £соПТ rsL1 ____________Hindu}

Рис. 1 Рестрикционно-генетическая карта плазмиды pBG41

Cßal 1 £со*Г

б

—« ZT

i§ =£43

Рис. 2 Рестрикционно-генетическая карт карта плазмид рВА48 («=м), 4,4 т. п. н и рВА91 (esezzzex), 4.9 т. п. н. , par -область, ответственная за сегрегационную стабильность

0.5 т.н.

Комплементация Рекомбинация агоАб aroG932 агоАб aroG932

Cb/sj

л * C&/5J

t

Lb/S]

L

р л ±=1

CB/S]

t

1

Рис.3 Делешонный анализ aroA-aroG гена В. subtilis 168. [B/SJ-[BamHI/Sau3Al, Р - PstI, R - EcoRI

Плавмида с делецией 0,9 т. п. н. PstI-Sau3A хромосомного фрагмента также не комплементирует мутации агоАб и aroG932. Рекомбинация с хромосомой содержащегося в ней фрагмента aroA-aroG гена восстанавливает функции этого гена только у aroG932 мутанта

Полученные данные позволяют локализовать мутацию агоАб внутри 0,5 т. п. н. PstI-EcoRI фрагмента, мутацию aroG932 - внутри 1,1 т. п. н. Sau3A-PstI фрагмента гена aroA-aroG. а сам этот ген -внутри 2,0 т. п. н. Sau3A фрагмента хромосомы, содержащегося в плаз-миде pBG41. Амплификация гена aroA-aroG в составе этой мультико-пийной плазмиды ведет к существенному (8-10-кратному) увеличению активностей кодируемого бифункционального фермента (табл.1).

Табл. 1. Удельная активность* ДАГФ-синтазы и хоризмат мутазы в клеточных экстрактах штаммов В.subtilis

Штамм

ДАГФ-синтаза

хоризмат мутаза

В. subtllis aroG932 leuAS recE4 .( реципиент)

0.6

,В.subtilis 168 trpC2 (донор)

6.7

0.8

В.subtilis aroG932 leuA8 recE4 + pBG41 (aroA-aroG)

47.1

9.6

+■

+

+

+

0

* в нMo ль образовавшегося продукта/мин/мг белка

1.3. Сегрегационно стабильный вектор РВА91 и его использование в конструировании рекомбинантных молекул, содержащих aroA-aroG геи

Применяемые для клонирования в бациллах векторы на основе стафилококковых и стрептококковых пдаэмид и, в частности, используемые в настоящей работе челночные векторы pJJ2 (pC194-pBR322) и рСВ20 (pUC18-delpSM19035), сегрегационно нестабильны в клетках В. subtilis и a arcvloliqiefaciens и теряются в отсутствие селективного давления. Ранее мы сконструировали векторы рВА48 и рВА91 на' основе криптической плазмиды В. amylol¡qiefaciens (рис. 2). Эти векторы стабильно поддерживается в клетках бацилл в течение не менее 40 генераций и способны к кониогационному переносу в клетках В. amyloliqiefaciens.

На векторе рВА91 был субклонирован содержаний aroA-aroG ген HindiII-SalGl фрагмент плазмиды pBG41, в результате получена плазмида pBAG7 (рис. 4).

Таким образом ген aroA-aroG В.subtilis 168, детерминируший бифункциональный фермент ДАГФ-синтазу - хоризмат мутазу, клонирован в составе двух бациллярных векторов: pJJ2( Cm) и pBA91(Em).

2. Идентификация промоторной области гена aroA-aroG

Активность ДАГФ-синтазы в клеточных экстрактах снижается в 3-4 раза при выращивании В. subtilis 168 в среде с избытком (более 100 мкг/мл) тирозина. Считается, что снижение активности ДАГФ-синтазы обусловлено репрессией синтеза этого Фермента (Nester et.al. , 1969).

Мы поставили перед собой задачу идентифицировать промоторную область гена aroA-aroG и продемонстрировать in vivo явление репрессии тирозином синтеза ДАГФ-синтазы.

Для идентификации промоторной области гена aroA-aroG был использован вектор pPL703 (Lovett, 1990), специально предназначенный для поиска промоторов. При клонировании в полилинкере вектора pPL703 фрагментов ДНК, содержащих промоторы, клетки с рекомбинакт-ной плазмидой приобретают устойчивость к хлорамфениколу. Мы осу- ■ ществляли поиск промоторов в районах, • фланкирующих ген aroA-aroG на плазмиде p8AG7: в 0,8 т. п. н. EcoRI .и 1,4 т. п. н. Pstl фрагмен-

тах. С этой целью оба фрагмента субклонировали на векторе pPL703. Клонирование проводили в штамме В.subtilis BG21 ашуЕ4 гесЕ4. Трансформанты отбирали на L-агаре с хлорамфениколом. В результате про-моторная области гена aroA-aroG локализована внутри 0,8 т. п. н. Sau3A-PstI хромосомного фрагмента илазмиды pAG410 (рис.4).

Установленное взаимное расположение промотора гена aroA-aroG и мутаций агоАб, aroG932 (рис.3 и 4) указывает на то, что по-видимому ДАГФ-синтазная активность определяется С-концевой, а хоризмат мутазная - N-концевой частью бифункционального фермента

3. Влияние тигхззина на экспрессию cat гена, находящегося под контролем aroA-aroG промоторной области

Мы попытались проанализировать влияние тирозина на экспрессию гена cat в составе плазмИды pAG410, где он находится под контролем промоторной области гена aroA-aroG.

Экспрессию гена хлорамфеникол ацетилтрансферазы оценивали качественно, по росту штамма с содержащей этот ген рекомбинантной плазмидой pAG410 на чашках с возрастающими концентрациями хлорам-феникола. Такой метод, в отличие от прямого измерения хлорамфеникол ацетилтрансферазной активности, давал возможность для отбора нечувствительных к тирозину вариантов.

Суспензию клеток В. subtil is BG21 amyE4 гесЕ4 (pAG410(Cm)) высевали (в количестве около 10 клеток на чашку) на агаризованные минимальные среды, содержащие различные концентрации Cm (от 5 до 20 мкг/мл) и на такие же среды, но с добавлением для создания условий репрессии 200 мкг/мл тирозина и 200 мкг/мл фенилаланина Было обнаружено, что в репрессивных условиях устойчивость клеток к хлорамфениколу не снижается.

Таким образом, мы не обнаружили явления репрессии тирозином синтеза хлорамфеникол ацетилтрансферазы, ген которой находится под контролем промотора aroA-aroG в составе многокопийной плазмиды PAG410.

4. Конструирование штамма B.subtilis 168-2. содержащего одну копии cat гена под контролем aroA-aroG промотора Плазмида pAG410 имеет репликон вектора pUBllO, способного поддерживаться в клетке в количестве 30-50 копий. При этом не исключено, что отсутствие репрессии тирозином синтеза хлорамфени-кол ацетилтрансферазы, ген которой находится в составе этой плазмиды под контролем aroA-aroG промоторной области, связано с разбавлением репрессора. Возникла поэтому необходимость в конструировании штамма, содержащего одну копии экспрессионной единицы (Р aroA-aroG - cat). Для этого мы осуществили интеграцию указанной экспрессионной единицы в хромосому В. subtil is 168.

4.1. Интегративный вектор PUG81

Фрагмент BamHI-BglII плаэмиды pAG410, содержащий начальную часть aroA-aroG гена с промотором, cat ген, экспрессирующийся с этого промотора, и часть плазмиды, не содержащую репликона, мы субклонировали на векторе pUC19. Вектор pUC19 (Ар) предназначен для EL coli и не реплицируется в бациллах. Конструирование интег-ративной плазмиды вели в штамме Е.coli К-12 TG1. Схема конструирования представлена на рис. 4. Полученную в результате плазмиду pUG3-(Ар, Cm) маркировали детерминантом устойчивости к эритромицину. Для этого в BamHI сайт pUG8 мы встроили 1,35 т. п. н. BamHI фрагмент плазмиды рМХ709, содержащий Em маркер стрептококковой плазмиды PSM19035.

В результате была получена плазмида pUGSl (рис.4). Она содержит 0,8 т. п. н. Sau3A-PstI хромосомный фрагмент B.subtilis 168 с начальной областью aroA-aroG гена, не реплицируется в бациллах и может быть использована в качестве интегративного вектора.

4.2. Интеграция плазмиды pUG81 в область aroA-aroG гена хромосо-

мы В. subtil is 168 Ген cat, экспрессируицийся с aroA-aroG промотора, мы интегрировали в хромосому B.subtilis в составе плазмиды pUG81. Для этого плазмидной ДНК pUG81 (в нативной форме) трансформировали штамм

il

a) D ÏS/B] p ! S ¿В]

--^

ю

&9

Л-

cat

LlL

в

&

A-

-Y7777k- ' ф—'

cet Wty

& p

&

S)

-£222-cat

—i

pBAG7 (pBA91 - aroA-aroG) Emu. rep pBASi B. subt.

pAG410 ( pPL703 - 0,8 t. п.н.

Pstî фрагмент pBAG?,' ЕлЛ rep pUBllO B. subt.

pUGB (pUC19 - 4.0 т.п. H. BamHI-BelII фрагмен pAG410) Ap11", rep pUC19 E. col î

pUGSl (pUG8 - Em )

Em54", rep pUC19 E. coli

ar û^-arpQ

хромосома В. subtilis 168

Pa-G,

cat

-ШЗ

агов-oroG-

хромосома В. subtil is 168-2

Рис. 4. Клонирование промоторной области aroA-aroG гена ( а) ; конструирование интегративного вектора pl)G81 (б); интеграция плазмиды pUG81 в хромосому В. subtilis 168 (в)-? А-6 - промотор агоА-аго& В - BamHI, S -Sau3A, Bg - BglII, P - Pstî.

B. subtilis 168 и отбирали Ешкклоны, то есть те трансформанты, у которых произошла интеграция в соответствии с механизмом Кзмпбелла плазмиды pUG81 в хромосому (рис.4).

Для доказательства интеграции плазмиды pUG81 (Em) в область гена aroA-aroG было проведено генетическое картирование маркера устойчивости к эритромицину в хромосоме одного из интегрантов В. subtilis 168-2. Для картирования использовали трансАукционное скрещивание штаммов В.subtilis 168-2 Aro+Emr(донор) и В.subtilis

WB2281B агоАб (реципиент) при помощи фага AR9. Трансдуктанты отбирали на минимальной среде. Прототрофные клоны анализировали на минимальной среде с эритромицином. Котрансдукция маркеров Аго+и Em®-составила 99% (99/100). Таким образом мы подтвердили, что в В. subtil is 168-2 плазмида pUG81 интегрирована в область гена aroA-aroG.

Сконструированный штамм В. subtilis 168-2 содержит одну копию под контролем aroA-aroG промотора Мы провели качественный анализ экспрессии cat гена в этом штамме. Было обнаружено, что в условиях репрессии (при добавлении в среду 200 мкг/мл тирозина и фенила-ланина) устойчивость клеток к хлорамфениколу не снижается.

Таким образом, мы не наблюдали репрессии тирозином синтеза 2at, при условии, что соответствующий ген интегрирован в хромосому л находится под контролем aroA-aroG промоторной области.

5. Клонирование гена arol В. subtilis

Как известно, кодируемый геном arol фермент шикимат-киназа катализирует одну из промежуточных реакций общего пути синтеза ароматических аминокислот и действует в комплексе с ДАГ^синтазой - хоризмат мутаэой (Huang et. al. ,1975).

В качестве исходного штамма при конструировании реципиента 1ля клонирования использовали В. subtilis 118 aro И16 ашуЕ4. Мута-даю гесЕ4 перенесли в этот штамм из В.subtilis BD224 trpC2 thr-5 -есЕ4 путем трансформации и конгрессии с плазмидой рМХ39. В результате был получен реципиентный штамм для клонирования гена arol • В. subtilis аго1116 атуЕ4 гесЕ4.

Клонирование осуществляли методом "shotgun". В качестве доно->а использовали-В. subtilis 11-27 - селекционный штамм В. subtilis 68, полученный Т. Ямпольской (ВНИИ Генетика). Векторную молекулу >СВ20 (Em) линеаризовали по Pst.I сайту. Хромосомную ДНК донора «стрицировали по Pstl. Рестрикты лигировали и полученной лигиро->анной смесью трансформировали клетки реципиентного штамма Транс-хэрманты отбирали на минимальной среде с эритромицином. Полученная i результате рекомбинантная плазмида pAR0I5 содержит ген irol в составе хромосомного фрагмента величиной 7,0 т. п. н.

Для более точного картирования гена arol был сконструирован >яд делеционных производных этой плазмиды ( рис. 5).

PAR0I5

14.6 т. п. н.

(рСВ20 - arol)

PAR0I52 14. О т. П. Н.

PAR0I20 11. 6 т. п. н.

PAR0121 10.6 т. П. Н.

PAR0I215 4. 4 т. П. Н. (рС194 - arol)

pBAROIl 6. 4 т. п. )

H

/F=t

В в

I -, . I,...

р р

H я

Комплементация arol116

Pv В н

' ' К

£т1

Рис. 5 Рестрикционная карта и делеционный анализ клонированной arol области В. subtilis. Длины фрагментов приведены в т. п. н. H - HindiII. Р - Pstl, R - EcoRI. Pv - PvuII, В -BspRI;

_______ai - вектор pCB20.2z вектор pC194,323вектор pBA91 .......

Ген arol локализован внутри 1,5 т. п. н. HindiII фрагмента, субкло-нированного на Бекторе рС194 (Cm). Полученная рекомбинантная плаз-мида названа-pAROP.l5. Содержапщй-аго1-ген HindlII фрагмент хромосомы был субклонирован также на сегрегационно стабильном векторе рВА91 ; в результате получена плазмида pBAROIl (рис.5).

Активность шикимат киназы в штамме, содержащем плазмиду PAR0I215, оказалась в три раза выше, чем в донорном В. subtilis 11-27.

Таким образом в клетках В.subtilis клонирован arol ген В. subtilis 168.

6. Получение и анализ свойств чувствительных к L-тирозину мутантов В. subtil is

Негативная регуляция синтеза аминокислот, препятствующая накоплению-избыточного их количества, происходит, как правило, с участием конечного продукта. В регуляции синтеза ароматических аминокислот у В. subtil is заметную роль играет тирозин (Nester et. al. , 1969). Поэтому интерес представляют мутанты, у которых изменены по сравнению с диким типом регуляторные механизмы с участием этого эффектора.

Мы получили чувствительные к L-тирозину мутанты В.subtilis из дефектных по пшкимат киназе ауксотрофных штаммов В.subtilis 118 аго1116 и В. subtilis QB928 aroI906. L-тирозин-чувствительные клоны были отобраны среди соответствующих прототрофных ревертантов. Ре-вертанты получались спонтанно на минимальной среде (для производных штамма QB328 ригВЗЗ trpC2 в минимальную среду добавляли аденин и триптофан). Чувствительность к тирозину анализировали на минимальной среде с добавлением 50 мкг/мл L-тирозина. Не растущие в присутствии тирозина прототрофы назвали tsg (L-tyrosine sensitive growth) мутантами.

Мы проанализировали более 100 tsg мутантов и отобрали среди них варианты с наименьшей частотой реверсии к дикому (Туг*-) типу.

Анализ роста tsg мутантов на минимальной агаризованной среде, содержащей добавки ароматических аминокислот в разных сочетаниях, позволяет разделить их на две группы.

У мутантов первой группы (аго1116 - Аго1+) чувствительность к тирозину снимается добавлением фенилаланина. Некоторые из них (tsg-36, tsg-4) не растут на минимальной среде при повышенной (45* С) температуре. Рост при 45°С восстанавливается при внесении тирозина, триптофана и .фенилаланина. Рост tsg мутантов второй группы (аго1906 - Aro*) ухудшается при температуре 30°С. Ни "холодочувст-вительность", ни тирозин-чувствительность не снимаются добавлением в среду фенилаланина, тирозина и триптофана. Можно полагать, что по крайней мере у tsg мутантов первой группы (аго111б - Aro*) тирозин-чувствительность связана с нарушением регуляции биосинтеза ароматических аминокислот. Свойства одного из таких мутантов,

В.subtilís tsg-36. рассматриваются в трех последующих разделах.

7. Генетическое картирование мутации tsg-36

Чувствительный к L-тирозину прототрофный штамм В. subtilis tsg-36 возник в результате реверсии ауксотрофной мутации агоШб. Поэтому возможным местом локализации мутации tsg-36 мог быть район arol гена. Ген arol картируется рядом с атуЕ геном, кодирующим фермент л-амилазу.

Для того, чтобы проверить сцепление мутаций атуЕ4 и tsg-36, штамм В.subtilis tsg-36 amyE4 трансформировали хромосомной ДНК, выделенной из штамма дикого типа В.subtilis 168, и отбирали тирозин-резистентные (Тугг) транс форманты. Число Ату* Ту гг клонов составило 36% (73/250) от общего числа Туггтрансформантов.

Мы обнаружили, таким образом, что мутация tsg-36 сцеплена с геном ошуЕ, го есть действительно картируется в районе гена шики-мат киназы (arol).

8. Свойства регуляторного мутанта В. subtilis tsg-36

В первую очередь мы попытались выяснить, инактивацией каких ферментов биосинтеза ароматических аминокислот определяется инги-бирование тирозином роста tsg-36 мутанта.

Для этого был проанализирован рост В.subtilis tsg-36 на минимальных твердых (табл.2) и жидких (табл.3) средах с добавлением ароматических аминокислот в разных сочетаниях. Полученные данные показывают, что мутант tsg-36 является прототрофом (Аго+), но, в отличие от штамма дикого типа В. subtilis 168, не растет на минимальной агаризованной среде, содержащей 50 мкг/мл тирозина. Эффект тирозин-чувствительности снимается добавлением фенилаланина. Присутствие в среде триптофана на тирозин-чувствительность не влияет.

Мы обнаружили, что 50% ингибирование роста мутанта tsg-36 в минимальной жидкой среде происходит при очень низкой (около 0,1 мкг/мл) концентрации L-тирозина, в то время как рост В. subtilis 168 нечувствителен к тирозину в рассматриваемом диапазоне концентраций (рис.6). Тирозин ухудшает рост штамма дикого типа в концентрации свыше 100 мкг/мл, как полагают, вследствие репрессии тиро-

Табл. 2. L-тирозин-чувствительноеть и температурочувствитель-ность мутантного штамма В.subtilis tsg-Зб *

Добавки к минимальной среде Спицайзена

Т,°С - tyr phe trp tyr tyr tyr

phe trp trp

phe

37 + + + + +

45 - - - - +

* рост на чашках в течение 48 часов; + - рост; - - отсутствие роста; I,-аминокислоты добавляли в концентрации 50 мкг/мл

Табл. 3. Ингибирование роста Ь-тирозином и снятие его 1-фенилаланином у мутантного штамма 8. эиЬиПэ Ьэ^-Зб в жидкой минимальной среде Спицайзена

Оптическая плотность 00 540 нм

Штамм Добавки к минимальной среде

- tyr tyr tyr phe phe trp

В. subtilis 168 4,8 4,7 4.4

В. subti lis tse-Зб 2,6 0.7 4,8 4.8

* во все указанные среды для В.subtilis 168 trpC2 добавляли также триптофан; L-аминокислоты добавляли в концентрации 50 мкг/мл

вином синтеза ДАГФ-синтазы. Столь малая (0,1 мкг/мл) величина ин-гибирующей концентрации не характерна для явления репрессии.

Б присутствии тирозина у рассматриваемого мутанта возникает ауксотрофность по фенилаланину. Сама мутация 1эе-36 картируется в области гена шикимат киназы, действующей в комплексе с ДАГФ-синта-зой - хоризмат мутазой. Мы предположили, что тирозин ингибирует активность хоризмат мутазы - единственного фермента общего пути синтеза фенилаланина и тирозина из хоризмата.

ОГ) 540 нм

Рис. 6 Ингибирование L-тирозином рос tsg-36 мутанта - В.subtilis 168 (дикий тип) —•— В. subtilis tsg-36 (мутант)

______ , , 0 1

lg концентрации L-tyr.ïKr/MI

Проведенные измерения активности хоризмат мутазы в грубых экстрактах мутантного ^£-36) штам> и иггамма дикого типа (табл. 4) подтвердили это предположение. Хоризмат мутаза КпиЬМЬБ 168 нечувствительна к тирозину, в то время как активность хоризмат мутазы В. БиЫЛПБ tsg-36 снижается на 75% в присутствии 0,25 мМ Ь-тирозина.

У. рассматриваемого мутанта наблюдалось также отсутствие рост; на минимальной среде при повышении температуры инкубации, начиная с 45°С (табл.2). Эффект температурочувствительности снимается добавлением в среду всех трех ароматических аминокислот. В следующе» разделе показано, что этот эффект, как и тирозин-чувствительность, связан с мутацией в области гена шикимат киназы.

Вменилось, что практически все прототрофные ревертанты, полученные из штамма В.БиЫШг аго1116, чувствительны к Ь-тирозину, количество тирозин-резистентных клонов составило менее 1%. Среди

Табл. 4. Удельная активность хоризмат мутазы (агоб) в штамме дикого типа В.subtilis 168 и в мутантном пггамме В. subtilis tsg-36

Удельная активность хоризмат мутазы

Концентрация ---------------------------------------------

В.subtilis 168 В. subtilis tsg-36

L-тирозина, ---------------------------------------------

нМ/мг/мин 7. нМ/мг/мин Z

ÏÏ ингибирования ингибирования

О 1,09 0.54

0,0025 1,09 0 0,49 8

0.25 1,09 0 0,13 75

евертантов, полученных из B.subtilis аго1116 гесЕ4 оказалось 872 yrsn 13Х Tyrr клонов. Таким образом, чувствительные к L-тироэину утанты образуются как в RecE", так и в RecE+iüTaMMax. Заслуживает нимания тот факт, что в результате реверсии аго1116 — Аго+обра-уются преимущественно тирозин-чувствительные варианта Это может значать существование у В. subtilis, как у Е. coli, дополнительного ена шикимат киназы, экспрессия которого в большей степени зависит г присутствия тирозина

Комплементация tsg-36 мутации клонированными генами агоГ и aroA-aroG, кодирующими ферменты трифункционального комплекса ДАГФ-синтаза - хоризмат мутаза - шикимат киназа

Мутацию tsg-36 мы картировали в области гена arol. Необходимо ?перь установить, ксмплементируется ли эта мутация интактным aroi •ном.

Для решения этой задачи потребовалось сконструировать штамм, котором стабильно наследовались бы гибридные плазмиды с клониро-шными гомологичными генами В.subtilis. В данном случае был при-

менен метод направленной инактивации гесЕ гена в хромосоме В. subtil i s tsg-36 amyE4. Ген гесЕ В. subtil i s кодирует мультифунк-циональный фермент с ДЕумя различными активностями: он действует как рекомбиназа, осуществляя рекомбинационную репарацию и генетические обмены, а также индуцирует группу несцепленных генов, участвующих в SOS-ответе. Этот ген был клонирован Гасселем и Алонсо (Gassei arid Alonso, 1989) в составе плазмиды рВТ61 (использован вектор, производный от pUBUO (Km ) с низким числом копий). В уникальный Clal сайт, локализованный в амино-концевой части гесЕ гена, они субклонировали 1,7 т. п. н. Clal ДНК фрагмент плазмиды рС194, содержащий ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы (cat) и получили таким образом плазмиду рВТ69 (Km', Cm ) с инактиьированным вставкой гесЕ геном. Мы использовали эту плазмиду для направленной инактивации хромосомного гесЕ гена Плазмиду рШб9 (Km , Cm ) линеаризовали, рестрицируя по единичному Pstl сайту. Рестриктом трансформировали штамм В. subtilis amyE4 tsg-36. Среди трансформантов, выросших на среде с Cm, отбирали чувствительные к митомицину С 1?ес"клоны. Отсутствие в них плазмиды проверяли на среде с кана-мицином.

Таким образом был получен вггамм В. subt.il i s amyE4 tsg-36 recE::cat, у которого в результате гомологичной рекомбинации по фланкирующим последовательностям гена гесЕ, маркер Стгвстроился в хромосому, инактивировав ген гесЕ.

Полученный штамм трансформировали ДНК плазмиды pAR0I5 (Em), содержащей клонированный ген шикимат киназы aroI. Трансформанты отбирали на среде с Em. Тот же реципиент трансформировали ДНК плазмиды pBAG7 ( Em), содержащей клонированный ( см. раздел 4.1 ) ген ДАГФ-синтаэы - хоризмат мутазы (aroA-aroG).

Анализ роста реципиентного и плазмид-содержащих штаммов (табл.5) показывает, что введение клонированного на плазмиде pAR015 гена arol восстанавливает рост штамма с мутацией tsg-36 на минимальной среде с добавлением тирозина и на минимальной среде при повышенной (45°С) температуре, то есть arol ген комплементиру-ет tsg-36 мутацию. Введение клонированного на' плазмиде pBAG7 aroA-aroG гена частично постанавливает рост исследуемого мутанта как в присутствии тирозина, так и при повышенной температуре (табл.5).

Следовательно, тирозин-чувствительность и температурочувстви-гельность tsg-Зб мутанта связаны с нарушениями в гене шикимат киназы (arol). Наши опыты in vivo и in vitro обнаруживают ингибиру»-щее воздействие тирозина на хоризмат мутазную активность. Это ин-гибирушее воздействие связано, по-видимому, с присоединением к ДАГФ-синтазе - хоризмат мутазе мутантной шикимат киназы. Тогда потеря хоризмат мутазной активности должна компенсироваться при увеличении количества копий ДАГФ-синтазы - хоризмат мутазы. Последнее согласуется с данными опыта: tsg-Зб мутация частично компле-' иентируется геном aroA-aroG, клонированным на мультикопийной плаз-vtMде pBAGV. Остается неясным, каким образом шикимат киназа воздействует на бифункциональный комплекс. Одно из объяснений заключается в том, что мутантная (tsg-Зб) шикимат киназа может изменять ассоциацию субъединиц ДАГФ-синтазы - хоризмат мутазы с переходом тоследней в менее активную форму. Другое возможное объяснение состоит в том, что мутантная шикимат киназа стерически ингибирует хоризмат мутазу, поскольку сайт активации шикимат киназы расположен гблизи хоризмат мутазного активного центра.

В случае, если присоединение мутантной шикимат киназы способно блокировать связывание субстрата хоризмат мутазным активным дентром (а он совпадает с сайтом ингибирования ДАГФ-синтазы хоризма гом и префенатом), можно предполагать возникновение наряду с потерей хоризмат мутазной активности десенсибилизации ДАГФ-синтазы. Это обстоятельство обуславливает практический интерес к охаракте-;изованному типу тирозин-чувствительных мутантов.

В заключение отметим, что спонтанные реверсии мутаций агоШб а затем и tsg-Зб) преимущественно генерируют образование новых слассов мутантов с фенотипическими свойствами, отличными от свой-:тв штамма дикого типа. Это может быть связано с особенностями гказанных мутаций, в частности, с тем, что они затрагивают весьма [увствительную область, кодирующую шикимат киназу - фермент, вхо-1ящий в состав полифункционального комплекса, играющего основную юль в системе аллостерическсй регуляции шикиматного пути. Кроме ого не исключено наличие в исходном штамме В.subtilis 118 агоШб утаторного гена, либо неидентифицированных мутаций, имеющих отно-ение к ароматическому биосинтезу.

Табл. 5. Комплементация тирозин-чувствительности и темпе рату-рочувствительности мутантного штамма В. subtilis tsg-36 при введении На плазмидах генов дикого типа*

Добавки к Рост на агаре Оптическая плотность Штамм минимальной 48 часов культур в жидкой среде

среде 37'С 4Ь*С ОИ 540 нм %

В. subt. tsg-36 гесЕ: : cat (реципиент) - + - 1.95 100

tyr - - 0.07 4

tyr, phe + - 2.35 121

tyr, phe, trp + + 2.70 138

В. subt. tsg-36 гесЕ: : cat +pAR0I5 (arol) - + + 2.00 103

tyr + + Z. 35 121

tyr, phe + + i. 90 97

tyr, phe, trp + + 1,90 97 .

В. subt. tsg-36 гесЕ: : cat +pBAG7 ( aroA-aroG) - -+ 2. 40 123

tyr -+ -+ 1.50 77

tyr, phe + -+ 2.00 103

tyr, phe, trp + + 3.15 162

* - - отсутствие роста; + - рост; -+ - неполное восстановление роста; Ь-аминокислоты добавляли в концентрации 50 мкг/мл; оптическую плотность анализировали после 48 часов инкубации при 37* С

10. Влияние амплификации клонированных на плазмидах генов aroA-aroG и аго! на продукцию фенилаланина клетками В. amvlol iqi^factens

На этом этапе работы мы попытались усовершенствовать накапливающий фэнилаланин сггамм В. amylol iqiefaciens, а также выяснить, как амплифицированные на плазмидах клонированные гены влияют на продукцию клетками фенилаланина

В качестве исходного штамма использовали мутант В. amvloliquefaciens А46, полученный Г. А. Великжаниной (ВНИИ Генетика) из В. amylol iquefaciens А50. Штамм А46 устойчив к 400 мкг/мл парафторфенилаланина (pFP), имеет префенатдегидратазу, частично десенсибилизированную к ингибированию фенилаланином, и накапливает в культуральной жидкости 3-4 г/л фенилаланина Однако штамм А46 имеет ряд неидентифицированных мутаций, блокирующих его споруляцию и ухудшающих выживаемость. Для удаления сопутствующих мутаций ген pheA, кодирующий префенатдегидратазу, мы перенесли из А46 в аук-сотрофный штамм В. amvlol iquefaciens А50 phe-36 при помощи трансакции фагом Е40. Трансдуктанты отбирали на минимальной среде. В результате был получен протрофный трансдуктант А400, который оказался устойчив к 400 мкг/мл pFP, накапливал 3-4 г/л фенилаланина й нормально спорулировал. Анализ продуктивности рекомбинантных штаммов А400 с гибридными плазмидами pBAG7 (aroA-aroG), pBG41 (aroA-aroG) и pAR0IZ15 (arol) (табл. 6) показал, что амплификация в этом штамме aroA-aroG гена в составе указанных плазмид незначительно (на 20%) увеличивает продукцию фенилаланина, амплификация гена arol оставляет ее неизменной.

При помоши ступенчатого УФ-мутагенеаа мы ввели в штамм В. aniylolíquefaciens А400 мутацию устойчивости к 1,5 мг/мл 5-фторт-риптофана (5FT), а затем мутацию trpE, в результате получили штамм А74 pFP''r'FTrtrpE74, накапливающий в культуральной жидкости 5 г/л

фенилаланина ------

Поскольку клетки В. amvloliquefaciens, в отличие от В. subtilis, неспособны к генетической трансформации, для введения в них гибридных плззмид использовали трансдукцию фагом Е40. Анализ продуктивности штамма А74, содержащего гибридную плазмиду pBAG7 (aroA-aroG) (табл.6) показал, что амплификация гена aroA-aroG в составе указанной плазмиды увеличивает продукцию 'фенилаланина штаммом А74 в два раза

Табл. 6. Синтез фенилаланина рекомбинантными штаммами В. amyloliquefaciens

Штамм Елазмида Характеристика Ф?нилаланин( г/л)

А 400 (реципиент) - pFP* 4.5

- // - рВ641 Cm; aroA-aroG 5,6

- // - PAR0I215 Cm; arol 4,8

- // - PAR0I215 и PBAG7 Cm; arol Em; aroA-aroG 5,6

А74 (реципиент) - pFPft 5FTR"trpE74 5,9 (3,4)

- // - pBAG7 Em; aroA-aroG v 11,4 (8,5)

* продукцию фенилаланина тестировали методом тонкослойной хроматографии, в скобках - данные аминокислотного анализатор?

ВЫВОДЫ

1. В клетках В. subtilis клонированы гены В. subtil is 168, кодирующие ферменты трифункционального комплекса ДАГ^синтаза - хоризмат му таза - шикимат • киназа:

- ген aroA-aroG (кодирует бифункциональный фермент ДАГФ-син таза - хоризмат мутаза);

- ген arol (кодирует шикимат киназу).

Построены рестрикционные карты, проведен делеционный анализ клонированных фрагментов.

2. Шлучены мутанты В.subtilis нового типа, рост которых ингибирует малыми (0,1 мкг/мл) концентрациями L-тирозина: tsg (tyrosine sensitive growth) мутанты. Мутация tsg-36 обусловливает помимо т розин-чуЕстЕительности также и температурочувствительность ростэ штамма в отсутствие ароматических аминокислот.

3. Мутация tsg-36 картирована в области гена шикимат-киназы (arol). Установлено, что мутация tsg-36 полностью комплементируется клонированным геном arol и частично - клонированным геном aroA-aroG.

4. Показано, что тирозин-чувствительность мутанта В. subtilis tsg-36 обусловлена инактивацией хоризмат мутазы - компонента трифункцио-ного комплекса ДАП-синтазы - хоризмат мутазы дикого типа и му-тантной шикимат киназы.

5. Обнаружено, что гибридные плазмиды, содержащие aroA-aroG ген, обеспечивают двукратное повышение продукции фенилаланина селекционным штаммом В. amyloliquefaciens А74.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А. Р. Во lot in, V. Е. Khasak, N. V. Stoynova, К. I. Ratmanova,

Y. A. V. Yomantas, Yu. I.Kozlov "Cloning and nucleotide structure of aroA-aroG gene of Bacillus subtilis 168" 11 European meeting on genetic transformation, DNA transfer and gene expression in microorganisns, Budapest, 1992, p. 89.

2. Козлов Ю. И. , Иомантас Ю. И. , Уланова Т. И. , Стойнова Е В., Народиц-кая В. А. "Вектор рВА48, предназначенный для клонирования в бациллах" Авт. свидетельство N 1615180, 1988

3. А. P. Bolotin, V. Е. Khasak, N. V. Stoynova. К. I. Ratmanova,

Y. А. V. Yomantas, Yu. I.Kozlov "Cloning and nucleotide structure of aroA-aroG gene of Bacillus subtilis 168" J. Bacterid. . 1993, (in press)

Отчеты по совместной российско-японской программе "A.JIN0GEN":

4. Report N. 2, Contract N 3910/90003-350. January - June. 1991, Moscow

5. Report N. 3, Contract N 3910/90003-350, June - January, 1991, Moscow

6. Report N. 4. Contract N 3910/90003-350, January - June, 1992. Moscow

7. Report N. 5, Contract N 3910/90003-350. June - December. 1992, Moscow.

Технический редактор С.К. Сведлова

Размножено с инв. № 296. ДСП 18.06.93

Подписано в печать 09.07.93. Формат 60x84/16 Уч.-изд. л. 1,3. Тираж 60. Заказ 16. ДСП

Отпечатано в РНЦ „Курчатовский институт"