Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональной исследование гена ДАГФ-синтазы хоризматмутазы Bacillus subtilis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональной исследование гена ДАГФ-синтазы хоризматмутазы Bacillus subtilis"

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

ХАЗАК ВЛАДИМИР ЭМИЛЬЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ДАГФ-СИНТАЗЫ ШЗШМУТАЗЫ

Насi Ulis sabtilis

03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На п. _ ж„ и

ДОосква — 1992 г.

Работа выполнена в секторе развития методологии Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель—кандидат биологических наук А. П. Болотин.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Д. А. Лерумов; кандидат биологических наук М. М. Гусятинер.

Ведущее учреждение — Институт общей генетики РАН.

Защита состоится 10 ноября 1992 г. в 1" час, на •заседании Специализированного совета Д 098.12.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИгенетика.

Автореферат разослан сисч^ос^ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Р. И. ЩЕРБАКОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тэмы. Шихиматний биосинтетичэсгай путь является осповпим источником образования ароматических соединений из карбогидратных предшественников в ¡гавоЯ пр1фоде. Конечными продуктака данной разветвленной цопи биохимических реакций являются в частности ароматические аминокислоты (фепилалашш, лгрозшт, трттофоп), a такта ряд важнейших метаболитов ароматической пртлрод:1, таких кеч гг;га!.готн Е и К, фоливвая кислота, :бихиноп и шгастохшон, ncicovjp«o гшталлохелатн (затерохолал). Порочислешшо клю вещества за стсу.'отошвы тирозина, образующиеся только в kxüti'.ix макроорганизмои и растений, относятся к груше П6зсмвттиы11а факторов питании. Учипгоал важность перечислешшс вита соедпгошМ .¡рематической природа для мэдиципи, вэтеринарш п сельского хозяйства, били,, разработаю; nj'c г/шсш.:: : технологии получения данных веществ , с использованием »'»^р^ргоцизмов. Среди использующихся дли этих излай различных гацек бактерий штам\ш бацилл, в частности и. ^ьшь, облздгм\ па пзш взгляд, определенными преинущасткаш: разработани технологии крупномасштабного выращивания бнокасси и виделигая Тчролуктов; штаммы в. subtil îs безопасны с точки зроты экологических требований ; по степени изученности с молеку.шф1ю-бяологичйской и генетической точек зрения отот организм устуггрет только е. coi i .

Организация пикиматного 6Hi.cifHT8Tir'ecj:c"o дути у в. subuiis обладает рядом характерам* особенностей. Ушшалышм отличием,

ошеаншшм Bentley, R. IOüO, ¡ШЛЯе'гСЯ СУЕ.ССТВОВаГОЮ у В. subtil ts

168 полиферментного комплекса, вкляпе^его ЛМ4* -«штазную, хоризматмутазнуга и ¡;:и;с.ыаткилазпул активности. Первые две фермептотшзгога активности расположены на одноЛ жшшептидноА цепи и кодируются а-оА aroG геном. ДАГФ-сингазэ ».тест особое значение поскольку катализирует первую реакцию M'rraOoj ;неского тикимапгого пути. Хоризчптмутаза, катализирующая njnr» мнение хсризмоть в префонат, обуславливает раздолешто общего бю'.'^тетическогс штока на отдэлыше пути баосиятеза: тиросила .и ' трлито^дакл

и изохоризмата. В отличии от ;1АГФ-синтиз др; гчх ¡Шлроо^геюгиог. я растений, ингибируюидасся по принципу обрсч-ц.-*'. связи одн'.й несколькими ароматическими аминокислотами, ДМЧ- :'*37ез:; р. =cbti.iis-168 ини'бируегся двумч шггермп чиатт-л; л1'о;,;лт1Г'е01''!Г0

Олосшггитаческого пути: профепатом и хоризматом.

По дашшм биохимических исследований, представленных

Llewellyn, D. et al. 1980, ДАГФ-СИПТаЗа ИЗ ШТЭНМа t3. subtllis at ГС 0051 Marburg, ИСХОДНОМ ДЛЯ В.subtil is 168, ЯВЛЯОТСЯ

монофункциональной. кодируется агод геном ц отличается по ряду параметров ингибировашя.

Прикладные задачи, сппзанше с повышением продуктивности шташюв-продуцонтов ароматических аминокислот, могут бить решэш путей yuojniHOiniíi оМективцости экспрессии генов, кодирующих (¡срментц "ключевых" этапов биосинтеза. Для биосинтеза ароматических аминокислот у в. subtnis такими ферментами на сегодняшний день принято считать ДАГФ-синтазу, хоризматмутазу и прэ^натдегидратазу (для фенилаллшша). Использование шсокоэффоктивных, Сларактершовашшх в клетках бацилл промоторов, а такжэ объединешю ''ключевих" гошш биосинтеза в едашю структуры искусственных опоронов под контролем "силышх" промоторов, можот бш'ь перспэктшзнкм подходом d решении подобных -пршслад:шх 'проблем«.

Таким образом, уникалыие особенности /ДОФ-скптазм хоризматмутази в. subtnis 168, существенные отличия у аналогичного бежа из исходного родительского штамма в. subtil is атсс gosi Harburg, а таюш практический интерес, обусловивший использованием свойств данного фермента при получении штаммов-продуцентов ароматических пгашокислот, определили наш шггсрес к изучению структурпо-фуикциональн;?х характеристик

aroA-aroé и агоА Г9Н0В, кодирующих эти ббЛКП.

Пель п задачи исследовашш. Цзлью работы било нзучегав структура, СВОЙСТВ Ц ЭКСЙреССИИ aroA-aroG гона В. subtnis 168 И агоА генз В. subtil Is ДТСС 6051 Marburg.

Для осуществления поставленной цели решали кладущие задачи:

- определение первичной нуклеотидной последовательности гонв

aroA-aroG В.bUbillls 168;

- изучение организации промоторнол Области гена arcA-aroG в. subtnis 168;

- сравнателышй анализ структур aroA-aroG гена В. subtil is 168 H агоЛ гена B.subtills АТСС 6051 Marburg;

- изучения свойств экспрессионной единицы ешезоэз из области

а

решясгэгща стрептококковой шюз'ядн psmisoss;

- изучение экспрессии гона ДЛГФ-сиптазм хортмэтмутязп в. subtiiis пол контролем ПЛ9035;

- получению плэзмид, содзряащих лкношшй собственного прсмоторо

reil aroA-aroG И pheA ГСП В. amyloliqusf acions U СОСТНВ9 искусстшзшшх ОПВрОПОВ rplU-cvrfX-rpmA* -aroA-aroG-pheA;

- кселодевзпяэ акспрессяп генэ ДйИЧаштозн ' злрязччтмушад в. subtiiis под 'контролем промотора 'рийосималытого

оперона rplU-orfX-rpmA" В. arnylol i quef aci en". ;

- изучопи? ВЛИЯНИЯ раЗДП'ПЕГ» факторов из OfrtüKTUiiHüCTb CKCl»fPCCH4 aroA-аг/З ГОЦЗ 13 ГОСТОЕВ ИСКуССТВОШОГО ОПСр'/iia.

Kay." ал яовжнк. и практическая зиачш.юсть. Определена взреичнал

ПуШЮОТЛДТ'Л нослслоиатель^ост7! ГОНП aroA-aroG В. subtiiis IG3, кодируемого ба^упкциоаалыагй ¡Гярмеш1 шшг.гмапюго биоиштотнчосного пут,! ДАГ5-сштззу горпзматму тазу. Охарактеризовала

структурно-^ук^'Гомальнал ергышзация продукта гена ,-гоЛ-агоа; сбпаругепа определенная гомология м-копцзвой часта б1ц>упхщ:энальпого фзрмзпта с хоризматмутазингли частя:,гл белков, кодарусглх tyrA И pheA гсна:,ы Е. coli п агоН ГВН0М В. subtiiis АТСС G031 Marburg; ШЯВЛС1Ю СУ»,ВСТЕЭППаЯ ГОМОЛОГИЯ С-КОИЦЗЕОЙ часта ДАГФ-синтэги тторизматмутазн с белком ДМОФ-спптазоЯ е. сои, катализирущач аналогичную с ДАГФ-сщтсзой в. subtius реакция альдольпой конденсации, но вевлечешим в путь биосинтеза клоточпой стонки е. сон . В результате клонирования и секвотгровсзшл показана функциональная и структурная идентичность продуется го поп

aroA-aroG B.sublilis I6Ö Л агоА ГвДЭ В. subtiiis /ЛСС 8031

Marburg. Оь-ределона точка старта транскрипции и предполагаемая организация промоториой области гена агод-агое в клотяах в.subtiiis. Охарактеризована зкспроссионная едашгцп ешоозз из области репликации стронтококковой шюзччдч psmiso3s. ешэозз использована при JT.jyie'Tfl' экспрессии агоА ГОНОВ Кч.1 Harburg штаммов в. subtü is. Реализована задача коиотру]|рования искусственного отроня, сс-доржащвго р(П гении иузи биосинтеза Зетигаланиия: агоА =; оо пл; в.зчы.ше п pheA ген в.««-yic-Hqi м»-tens под контролем промотора рибигомалыюго оперона

rpiU-i-.-f Хг-ртпА В. arnyloliqu«?Гас! ens. Г,'Vy'",;>;} tilin В рабОТО ПЛЯо1 П.ТУ ,

содержащие аМоктивио ззсмрессзру*.' рЗся геи ДАГф-сч,т.-;гы

хорпзматмутази, могут бить использованы при конструировании штаммов-продуцентов ароматических аминокислот.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из елодующих разделов: введение, материалы и метода, результаты и обсуждения ( Ш глав), выводы, список литературы ( -¿^наименования); и содержит ^Орисупков и ¿^таблиц. Объем работы -32.с.

Апробация работы. Результаты рабе-4! были представлепи на конференциях 'Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1988, 1992), "Структура и функции биополимеров" (Львов, 1989), 5-ой международной конференции по бациллам (Аполомарис, США., 1989), "Генетическая трансформация и экспрессия" (Кентербери, Великобритания, 1988), Ii-ом европейском симпозиуме по генетической трансформации (Будапешт, Венгрия, 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

I. Определение нуклеогидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего aroA-aroG Г6Н В. sübtilis 168.

Ген aroA-aroG В.subtllis 168 6UjT КЛОНИрОВаН *И0М8НТаС0М D. В.

(ВНИИгенвтике) в соствва плазмиды pbag7 (рис.1,в). Опредолепие гйтслеотидной последовательности aroA-aroG гена прободалось по модафщированному методу Сапгере с использованием ДНК-толимеразы фага Т7. Для этого • фрагмента .IHK плазшда pBag7 , ограниченные сайтами ЕсоРЛ , EccRI -Pr.tl и EcorV балл субклоаированы в составе 'ктевщщых фагов Mi3mpi8 и Mi3mpi9. Локализация гена aroA-aroG НЭ КЛОПИрОВаННОМ фрагменте ДНК хромосомы B.subtills 168 и стратэгия его секпэнирования приведены на рис.2. 95Ж первичной нуклеотидяоЯ последовательности исходного фрагмента ДНК хромосомы B.subtiHsl68 были определены по обоим ¡пггям. Полная посхьуоёзтвлъпость ДНК, определенная в энсперв"онтах по секвенкровашш, представлена на рис.З. Размер ирочитаяного фрагмента ДНК составил 2035 пар оснований. Он содержит 3 открытых ракш считывании: orfa- размером 324 п.о., orfb-pa;'mopom 375 п.о и orfc- размером IT02 п.о.. Поиск гомологии среди известных на сегоды&шний день последовательностей пептидов не выявил структур, имевших бли~-гео к кодируемым orfa и op.fb первичные аминокислотные последовательности.

he.I. fm;inïc»io-res«tne«ie i3¡irn виз«« pbi37{a), р!ш23(5|. pkp7(if. i, Ânlll; , fílll; S, bsiji; ï.ïcosi; í, kcosî; p, psi i

i > t* •-> i-> i—» i--> i-> i---*

i-->

. » E Г.

î^oo

«ч

fir ьшпш! i (fpjjeril cptbfffoks" srol-jtos геи f.nttllfs iii. ï, iccii; p, fjtí; i, irnït. 123 4 5 6 л (à с t

m

A С

1 Л A A* •Í С С Л A A A A

fie.«. CiFilfie»'? '»Ш tijpïâ грэшршп rfäa afcA-aro5 b.stibtilis 151 ! b.skbtihs. '» «cíate шзищи pbisl). 1, !, 3-íccTpDíia npaí«»ta 5f 3-2 3'-ТШШ:ТТШТШ1-5\ пбркшонмего t г¡4 itj»»í ч ' btius «ro№i isuaî recti, смерщего таз»»*) pf'¿;', *, 5, í-ioctpoíta 5p3-î, г»5?я«"'шиого с fí' 1<г»ч * s .'.il - аггИЗ)! les.*! iecl( ifbjsio/- temmul rcnjpon; 1, .,!,!■ mibest тазтд» peísi t иге к npjtiífj. tjpih ,.f :ff>" :4iei3»ii!uhttii vuc4i, niepiajero стзрт я г с ». т со гш

? wHSl's i5! tens imii tí."t:r"> о-" ».

■и l»

i.ict»ll«Vtcií«|»it|t»t»Ul'»"í:WCílt7ÍW*(«t(c»fi*4éiCíICCIG1ír«<Uji»ttí'i(if.*({,'"(?nf'lf4/ КС

ш г » i t r s i т » s % s í i i t i с » j с i > i a * t ( s i \ s к

«W * » I í i I ( S I r f f 1 I I i t s i 6 » f I f L I i : Г Г С f 1?

№S I I J Г l I I l l l f f í í f 1 С f l F 1 I I i i í Г f I £ С I I II OtfJ | S б « < f i l F I i r i * 4 i I I 1 f i ! t t i l i I I I f t S I 15

Otfl \ l ^ í í l » V * > t V t \ 1 * V 1 » I S I 5 l i 1 l I í f i i i I V ОШ f I i I ! I С F I I I i } fl I Г I I в I С I I l » Я T í i S к \ T i!

iltUiU(Ci(iiiuU'4;(|l:M(at(iii|!Ctlti(it4U(ilcii((i|i)((|Uii([(iiii(i:iti:ct:i:iti(t:iiiUi{ <C0 MFI. I I С t С I t I l I Г I 1 l ! I 9 9 t I t F g f t В 1

ОШ i i i i i í I t i UI

i(*i(cc(;l«tt{i|U(citt4t»tJtunu(c(UcH«UU4Ul(|ítcU;i-.".l|tMHitccc,.lii* iU(ccctc<c<lc«l SCI

•Ie»l> Jí

r.j((t[i(cttciU|UUcttutctettiui|((tU(((tMUu(ti('¡tlUtiUii«ttltit(Utt'.:»iti7r;i;ruiiuut 101

trimt ig-i

ireiiroi -II S'*c(f(tcc«t(t(ci(i(»uf<i ISITIIIIIIÍ! IJ

*ir» J 'Suri tlli "Ш"

irol <гоб ItllllllllblItltlfTlIltllllieíflI lí

1 4uimitumtn<ii-v

fñur ¡fl í

<rei irri í » f F 1 I I Г I t I I I J I I I P S P í I I S Г ¡ 8 I I f l I I ti

ittt<ice(t(te»4i(»ic(»(*tt|tUU(uttUáll(uk«.cu44ci{tKilU|u»kUtikt»Ucit:i'!iUtnii<|4iU til «r«i irtf Г I 4 í l I l « I t 9 I S I I l l F S I I I í Г I I Г I F » I I С I IU

tl[utit(({!lUii(cUc4lu(u|kUtti|t»u|ticl|clt|tcUc4(ii(uuu(tl|ti|iUcii!t(ll(iuttUi((4 I'íl C- hrbtrf «ni» 'ffíJS

f r i r 1С (7

mi uoi f I t ) t I 9 I I I f С P С I F ( $ ! t « Г | I F i i i J | M ( |<S

7iU

«rei-»roí llltl((lFirttSfT»f«Cltfl6lttVtltl 17» »tú tro«» I t P l I ! I S I J 1 I t l I I I | i V > T I I F 1 9 I ( I I I I M

« » t i i ; i i i t » i i i r t i i i i с i i i » i i i f i i i i ш

t(C*iMctl4Mtt|(t(ti4|c|<cc<|:|C(|t(iM**|(c<|t|cttct4H(c|c(|lett<ft|eMco(c(elutt4*UMt|<^c Ull

•|«¡J

i.ol irrf t Г f I t I S I I в » I l С I I С I I T f ( Г 1 t I I 1 l i $ S i l't t(ülicttcil|tctc«t(ftMl|i(ciHlU(«tt((t|i<(( ,{ul(i|iiciUI|ui(i|(ii;|t(ui(i;|cUU'tlllcutt U5F

* (t(cc(tUll{tMct4iu(|ritU(((iflcmitUil(lUc(ritt(«<ci(((rc(cc|l|iccl(tli*tt(C|«(((cttM|':|clt I(H ird iroC I I С I I С I I 4 I » I Г I f t t i i S 1.1 i б 9 9 1 t Г I F I I 10

ti<cfitcffl|ct(it<ít|i»»l(|;l|»|(t(c»<tetí»tcc|lcá|tf|MeUlf4«clíHcUu:<iil||r(i4c{l|M'.ic(»»«» ITM

•ftsll

49l-«r«e Г l I I l I f Я I I F I I Ш

«V]t(4wi|utlt»*|cc>iUtt(*'*<tciiC(:Utttl(Mt(il(ciiM((e(|C4l|ri(cctHltlt«'.(eltlcte|UUllU| i til J -trirlttri(tL|;|<»lt(|ltei:f-i' «::::t:::: r::::::::» *rU«( It С

) ■«•tu«cttici4(iut[r(ti((e $ friirr m-a

Pic.Mjriíü^.aai aocmsíiieiHoctv ípaneira |0S впзииа pBi3T( еодсгщего ircl-irtf reí l.^tlílj 153. Откы «ííü |)Шй:»1 rectru») AialII, tcell, Ico&f i PstI. ftizaocicietiix яэ^едоигпизсгь OíTi, 0Ш i iroi-ercS ipnexeei i еш^пшсх tm Ctp«itui вод втиеол^о» Bcttexo^terbiscrt» ебозянгеа шергсроипмг roitopv. Tmt старта т^знссрщи м?£Г r«ia ttok-ttoH crie^eai t. o^ucti -10 i -Ib trcá-sroS reu i ОШ внхек»

npooicbur CMw eissviaiif с prSocoian обоззачеви -ÍBS. Otie^gi trtuotuaji зиеза » npjznpe reu

troA-aroG B.sjltiiU IICC $051 Barbar«. Гмзаяк сшгтнеспе cJirosnieoriw IS-?, AS-C, Ai-И, SP3-2, icootnoBas^« z,i р'.ед^п мсперневго).

e

2. Анализ структур;« открытой рамки считываем c;cfc.

БйгсГ расположена в области lírayoy 644 Tí 1742 ; пуклвотздаш соквенировашюго фрагмента Д1П' (рис.З) и насчитывает в свое?! составе ЮРТ п.о.. Интересной оссбзнкоетыз данной oiitpuTofl рамки сч;гшвшгая явлксся существование 3 мэтеошшошх atg-кодопов па 5'-коицо структурной части рамки. В соотмтстг.ш с di^i возможно образрчяш'о трпх белков, насчитивеьвдпс споем сосеип Я58, 361 и обб огии-чоинслог соответсгвошто. Для гляспения вопроса какой из этих 1".дошв в действительности являотся шшцпирукзцзм Сил провэдэн апалкз ли.тарно" некодирущей области orfc.

»нализ час;".-," встречаемости кодопов в мРШ1 orfc позволяет сдоявть заключение о том, что существует зометпоо предпочтопко -р«ллетен. ж.юзхци?.; а-г в третьей позиции, перед спношшчпыма по сг.^елу трг^'лзтемл с охс. Этот факт предопределен общим ловшешшм содержаниям а+т в кодирующей частп раглаг. 'Исключение ii3 описапной

ЗСКОНОМерНОСТ'Л СОС13РДЯЯТ КОДОНЫ ДЛЯ Arg, Asn II Pho.

Гроведзптгй сравнительный анализ частот встрочаогюстгт кодонов у 12 генов, входящие в состав "ароматического супра-оперона" B.subtilis говорит о том, что кодоии, присутствующие в структурной части orfc, относятся к разряду наиболее часто используются СИНОНИМОВ.

Белок, предсквзешшй из сшшенсп crfc, имеет молекулярную массу, на 1,868 кДа прешяаицую мол.вес ДАГФ-сшггази хорзматмутасы, определешшй экспериментально. Длина белка, кодируемого открытой рамкой считавания orfc, превышает определенную экспериментально па 30 аминокислот. Количества ришокислотних остатков Lys, Arg, Asp, Glu, Pro, Gly, Ala, Val, Met, Leu, Туг, Phe, су- и Try били идентичны или отличались не более чем па три. Оудетгееншо различил били отмечены только для ты, ser и iso. Белок, кодируемый orfc, содержит на с-конце Ala, тогда как по экспериментальным данным с-концевой аминокислотой ДАГФ-синтазан хорпзматмутази B.si.htilis 168 является Arg. Таким ' ОбрР'Л м, несмэтрл на некого, и" отличил белок, кодируемый opfc, имеет близкий см^тсяислоътй состав и .молекулярную массу с данными, опубликованными ран^е.

н-концевая чисть белка, ■ кодируемого orfc от I до приблизительно 100 аминокислотного остатка имеет слонную гомологию ó хоризматмута-лшми частями ОиЬикционплышк ферментов, кодируемых соответственно pheA и tyTA гонами е.coït, а также с

монофункциональной хоризтатмутагой, кодируемой агон геном

В. subtilis Marburg 6051. ТвМ HB ЬШНЭО КЗ ОНЛО ОбНБруЖОНО

существенной гомологии с мопофушеуганальной хоризматмутазой

дрожжей Sacehrsromyces . cerevisiae. Б0Л6Э юго Нв сущэстшвэло

сколько нибудь определенного соотсагс-твия с другими хоризмат-угилизирукщими формантами, которыь образуют группу весьма близких по первичной аминокислотной последовательности белков. По-видимому, столь . необычайно широкое разнообразие первичных структур ферментов, позволяет им служить в качестве аффективных катализаторов для мутазннх превращений. Детальное множественное выравнивание хоризматмутузши частей балка, кодируемого orfc, хоризматмутаэы профеяатдегвдрЕтазы и хоризматмутаэы префепатдегндрогеназы е сои, а также монофункциональной хоризматмутезы В. subtilis Marburg АТСС 6051 ШЯВИЛ0 НЭИбОЛЬШУЮ степень гомологии в области 1-50 амишагаслоты белка orfc в.subtilis 168. Но наш взгляд, именно эта область может принимать участие в формировании активного центра, обеспечивающего превращение хоризмата в првфепат и одновременно являющегося сайтом для йнгибиропадая по принщпу обратной связи ДАГФ-сшггазы хоризматмутазы в. s^luus 168 хоризматом и префенатом.

ДАГФ-синта&а хоризматмутаза в.subtilis 168 обладает уникальной особенностью активировать другой фермент ароматического биосинтетического пути - шикиматкшазу. Этот фермент способен НОрМаЛЬЯО фуЯКЦИОНИрОЕаТЬ у в. subtilis только в состэрэ трифермеагного комплексе, включающего в себя бифункциональную ДАГ$-синтазу хоризмвгмутазу и шикиматкиназу-. Мягкий нротеолиз, приводящий к удеязито хоржматмутвзной и сохранению ДАГФ-синтвзнсй активности, обуславливал неспособность оставшейся части фермента активировать гпшшаткиназу. По-видимому, сайт активации шикиматкиназы. рьсполо^л в области 50 - 100 г»чшокисл'<тного оствтка бетаа, кодируемого orfc, поскольку данная область не имеет существенной т «"элегии с известными структурами других хоризматмутаз.

с-концевал 'и ать п*чяг>тсл)тяоЯ последовательности белка orf не имеет существенного сходства с известными аминокислотный последовательностями Jl/U'i1-( даунишх изофпрм .-.сои, но чроявляе определенную гомологии -, носледопатильност!

З-дезокси-о-манно-окту <юсоьт fociter cismaai: e.coi

(ДМОФ-силтазы). Детальйоу bjÄ . лче 'нц-¡вой чэотч беж?

а

кодируемого открытой рамкой считывания orfc в.subvins 168 и ДМОФ-сиптазы е.coii выявило наибольшую степень гомологии в области 150-220 аминокислотного остатка белка orfc.

З-дезокси-о-манно-октулосопат 8-фосфат синтеза осуществляет аналогичную с ДАГФ-спнтазой альдольяую конденсации, используя в качестве субстрата d-арабипозу 5-фосфат и фофосфоенолпируват, с образованием З-дезокси-о-манно-октулосонат 8-фосфата. В случав ДАГФ-синтаон в качестве одного из субстратов используются тот же самый фофосфоенолпируват и эритрозо-4-фосфат, предшествующий гомолог в семейство D-альдоз, содержащий 4 атома углерода в молекуле вместо 0 у ирабинозн. ДМОФ-синтаза кодируется kds-геном п катализирует одну из стадий биосинтеза наружной клеточной степкп

Е. coli.

Ряд шшзмид, полученных п дашюй работе и содержащих Фрагмент ДНК orfc, кодирующий только с-кояцевув часть балка, обуславливал знвчимнй уровень ДАШ-синтозиой активности, не ингибируемый префенатом в метках s.acMiUs .-годе.

Поскольку нарушение целостности окгс путем клонирования Фрагментов ДНК в p-.u или eccri сейт плпзлп1ди pbag7 рпводало к потвра aroA-aroG феНОТИПа у в. suhtilis ¿:-oGf>32 Л D. subtllis агоАб,

а также приведенной пнш анализ последовательности crfc позволяет нам сделать павод а том, что эта открывая рамко считывания представляет собой структурную часть гена aroA-aroG, кодирующего ДАГФ-синтазу хоризматмуп'зу b.subtnis 168.

Анализ первичной нукдеотидной последовательности, расположенной после orfc привод к обнаружению в этой области па расстоянии 10 яуклеотидов от торчиниругоцого стоп-кодона таа совершешого инвертированного псптора. Для данной структуры характерно наличие gc-богатой области циптялыюй симметрии , за которой следует блок из 4 т. Такие структуры способна выполнять роль р-кезависимых терминаторов в. subt.i 11 s.

3. Диализ области инициации трансляции aroA-aroG гона.

В области, с~ координатами 654 - 666 п.о. ?рис.З), была обнаружена последовательность, частично комплементарная 3'-концу I6s-pPHK в.subtilis. Данный rfiS-сяйт расположен перед третьим от начала метиошгювцм лто-кодоноч, находящимся в позиции 668. Это позволяет ii.'iM сделать вывод об инициирующей природе дашюго 'ATG-кодона.

Для последовательности Шайна-Додгзрно oefc характерно наличие 8 комплементарных оснований, причем 6 па них распололаэш непосредственно друг за другом. Расстояние между предполагаемым последним s в консенсусе ggagö и стартовны aus кодожм.: мРНК составляет 7 оснований. Спейсерная область не содержит оснований с и С. Расчет возможных вторичных структур, выполненный на ПЭВМ с помощью программы dna sun (ВНИИгетатика), не выявил в этой области наличия вторичных структур с высоким локальным потенциалом спаривания. Таким образом, данный rbs-сайт можзт обуславливать достаточно высокий уровень экспрессии гена в клэтках в. subtiiis.

4. Старт транскрипции aroA-aroG ГЭНа В. subtiiis 168.

Методом удлинения праймзра (Primer extentioro определена точка начала транскрипции гена ДАГФ-синтетазы хоризматнутазы в клетках

В.subtiiis 168.

Суммарную РНК выделяли из клеток штамма в.subtiiis агоеэзг,

leuAS. recE4, СОДбрЖаЩЭГО ПЛЭЗМИДУ pBAG7. Д8Л86 ПрОВОДИЛЭСЬ

стандартная процедура отжиге выделенной тотальной мРНК с мечешшм г^^р праймзром БРЗ-2 (рис.3), комплементарным последовательности структурной части aroA-aroG гена. С помощью обратной транскриптази в присутствии смеси -jntp достраивали праймэрную ДНК (процесс останавливается по достижении ферментом 5'-конца комплементарной првймеру мРНК, т.е. мРНК соответствующей структуре гена ДАГФ-синтазы хоризматмутазы в.subtiiis 168). На рис.4 представлен радиоавтограф геля, на котором параллельно реакциям достройки праймерЬ приводится сиквенс ДНК плазмщщ pbag7. Уникальная полоса, расположенная на расстоянии 98 нуклеотидов от. начала праймера, соответстювала a b позиции 625.

5. Промоторная область aroA-ar-oG Г6Н8 Б: subtiiis 168.

На расстоянии 7 нуклэотядов от старта транскрипции гена aroA-ar-oG раСПОЛОЖвНа Область TAagAT, 4 из 6 нуклеотидов которой идентичны блоку "-I0" канонического промотора, узнаваемого в клетках в.subtiiis холоферментом РНК-полимеразы Ео43. Если принять TAagAT за "-I0", то в качестве блока "-35" можно. рассматривать последовательность rrtcCA, расположенную ; на расстоянии 17 нуклеотидов от "-I0". Данная структура также имеет 4 идентичных нуклеотида из 6 с канонической -35 областью промотора, узнаваемого вегетативной с43 субъединицей РНК-полимеразы бацилл.

Для случал пдептафпциропопкого пвма промотора агод-агое гена Ат-содвржайио в области мезду -35 и -50 составило 80S, ат-содержашю в области мэзду последовательностями i -G и +1 -66,6%, а степень токологии тлэзду гозмоаной консепсусной последовательностью с центром в позиции -16 составила только I пз 5 ocHonamCi нсс.ютрл но значлтельнуи вкрождошгасть бокса. Важно отметить, что леречислэшпю ваше параметра оцеки оф-^октивностц использования прогжго^в <13 у бацилл то пгдеют явсткнх границ.

Данные цо уровпам ШЧ^снлтазной и хо риз гга тг.ту та зно Я активностей у в. - лниг агосззг (рвдо7э прэдставлоншб шов свидетельствуют, что собсгвенгшЯ ггрошгор лгоА-агов гэна несмотря на судаствопште отличия or "оптамальцой структур»", узнаваемой с/4Э-суС'ьедашщеа РНК-полишрозц в. subtiiis, обуславливает сравнит с лыго внсокую степень эИюктивности инициации транскрипции

in vivo у В. subtiiis.

G. Гйгу.'Ш'НЛ 31'« ЯрбССИЛ aroA-aroG Г0КВ У В. subtiiis.

Ряд к,шэт0№я ферментов Люсшггеза ароматических аминокислот itoHífoJiripyeTcn как нв уровне активности Зярманта, так и при пожодд измр нзшш ойш.типности аг.спроссии соатветствуигдх гонов. D

ЧАСТНОСТИ ДЛЯ aroA-aroG ГвИЭ П.subtiiis 160 Nester et al. 1060

било показано существование зйэкта репрессии, обуслоплшглого Со .дом, получившим назвшгаэ тир -зависимого опорепрессора.

В Б'кокцевоя нотрпнслируемой части aroA-aroG Г0НЭ В. subtiiis 103 в области -50-30 основания от точки старта транскрипции наш! б»ла обнаружена последовательность, содержащая нугсдеотидн g и с па расстоянии 14 пар оснований. Возможно данная область молекулы ДНК mos-Эт распознаваться TYR-зависимим апорепрассором и выполнять функции "тир-бокса". Подобние структуры "тир-боксов" били обипрузтпы тагае у ряд;) генов пксаматпого биосиитетического пути

П. rol i; arc", tyrR, ai nP, tyrl, tyrP. aroF, aroLM, aroF-tyrA.

Пкспрессия всех вшилшречист.гшшх генов e. œii подвержена репрессии при добявлешш н окрухяицую сроду '¡лрозиня.

Но падимиыу, с точки зре{ ил регуляции транскрипции важным

ИПЛЯОТГН 'Г'"!' '!экт, ЧЮ "ТИр-бЛ£С" ai оА-ас oö Г0Ш1 В. subtiiis J6ñ С

конца ü'i;, ..'огютгя с -35 областью прлмотора гена, а со стороны •V КОЛ.)', , V»cn 1J.OX4II шшосрпдсгнишю Cpli: ¡y ua Структурой iM-цчiiw»|»attr«ioiv> UiiL'ep'i'Hpoiiciíiiioi'i) tioBwpa (рис.G). Возможно, что jiac-ii 'iiijxi¡fi№ .íüiiiíiuiYi шшгфто/ювшиюго повтора в нигюсродствпшой

il ' ' . .

tat t-e t-a t-a t-a

9-t

g:| Ф -40 Ф -1

agtagag ttGtaUtcaataTTTCGAtnouaattacUatagTAAGATacataat -35 -10

mRNA start iy д __

Mal Sor Asn c=J>

AactacaaaataaaaaatgaatgtQcaggG^'/-QQAtgaaaaaaatgagcaac

RBS

fic.5. OpruiMui S'juepiol «Suai «rol-uoS reu B.siiUilis KS. Вщск» (¡un ipoiíTtpa, ivcroi спиши pi6ocoiaii, nmw* «coicpitiuro шерпромшго coircpa reu aroJ-jroî ¡.siiitiHi ICS. OcioJjmi í i C, mm DCetioutitiii crilitlPI '»(•liKi1 s rit« il ирешп, :/ч сирн rpaittpiami - «. Dptjctaiieia l-itiieiii «ci бШ1 tAIF-tiiU3i ирпшшга» B.sibtilii 1(1.

a).

2101 tttctgtgctgtttaqtqjjtgattaqcagaaatataqagagtaagattttaattaatta

2141 ttaqggggaqaaggagaqagtagcccgaaaacttttagttggcttggactqaacqaagtg

.-35

2221 agqqjaaqgctactaaaacqtcqaqqqqcaqtqaqaqcqaagcqaacacttqatct ttta

. -tO . -35 -35.

2281 aqttqctatettttataoqtcaataqaqtatacttatttqtcctattaattaqataacaq

. -10 .-10 . . . S.D. .

5341 tataatanc tttataqaqtagqtcatttaaqttgaacaUat agqaGGQTCCftGftTCTEGftTCC

ВЙИН1

BGLTI

2160 ггго ггво аз^о

S)

Pit ! Ifijitrijui locjíioHteiiiofTi »cipeccioiioi «jingi 101911» (i) Щеки ipemoiiriín« ошеп лроиг St-itcitiouTiiuicn, Clin пиши perrpirai Им!) • B(1!I; цицщин tiiraiiciil npn шящ fCB2m íilll; B, tail; l.lcoll; 1. IcoíV, P, fstl.

лизости от -35 области промотора aroA-ai о« гена обусловлено его частием в процессе инициации транскрипции в качества эгуляторного элемента.

. Создание искусственных систем экспрессии aroA-arc.G гена .subtilis 168 в бациллах.

Ген ДАГФ-синтазы хоризматмутази в. subtiiis 168 имеет сложную истему регуляции инициации транскрипции. Для изучения

Мективности экспрессии агоА-агов гена, расположенного- под энтролом экснрессиопих сигналов, лишенных подобной сложной ястемы регуляции, нами была использовала экепрессионная единица леозз стрептококковой плазмиды pSmiqo35.

.1. ЕШ9оз5 из области репликации стрептококковой плэзмвды

_____ . .

Ранее были описаны выделение и структура минимального фрагмента Ж плазмиды pSMi9035, определяющего ее способность реплицироваться клетках в.subtilis. в области, лежащей за белковой рамкой, эдируемой этим Фрагментом ДНК, были обнаружили несколько зследовательностей, напоминающих вегетативные промоторы в. subtnis сайт связывания с рибосомой (рис.б.а). Удобство расположения этой ■сспрессионной единицн навело нас на мысль о возможности ее ^пользования для экспрессии гетерологичных генов в в.subtilis. энная экспрэссиошгяя единица была казнена ешэозэ.

.?,. Изучение эффективности промоторов экспрессионной единицы

_____ .

Для характеристики эффективности предполагаемой промоторной 5ласти в клетках D.subtiiis в качестве гена-репортера был люльзован бес.промоторный ГОН «-амилазы в. amylollquefacieris. По зшим данным эф|вктнпность промоторов euiso35 в i,3-i,4 рэза выше [фективности собственного промотора гена а-амилазы smylol |'|Ч»Гяг jens. Клетки В. subtlIls 21, НЭСУЩИЭ ПЛЭЗМИДУ pAVAl. 5 Овацъмпторнни гегпч см -амилазы под контролем Ешаоэз, синтезируют :> !Ю0 мг активной с-амилазы на 1л среды ТУ.

.3. Изучение пфГективности работы RBS-сайта экспрессионной

Чтобй поверить, работает ли в в. subtiiis

SD-посдодоштелыюсть, пэресекащаяся с BamHi саЗто:' 'риг.б.п), попользовали фрагмент ДНК, кодирухщиа репрессор фаг.. > - xciss Источником этого фрагмента слуазл (,

m3tgi30CPrBamHIC1857Ifn/93PsLl . IlO ДЗНШМ SDS-алеКТрОфОр!

экстракта клеток B.subtnis 21. содержащих шгззшщу paski.s иутантниы геном лег es? под контролем ешэозз, продуй сх-рзпроссора в клетках в.subtiiis составляет около впугршашточн^го водорастворимого белка. \ae57 спосо« 'ифовать работу Pr-npoMGrop:: в птих клетках. ii шюзигдэ рсв22 (рис.б.и) встраивание по участкам узнавсп BamHi и Bgiti позволяет помещать оксттрессируешо облас т, кодирувдив белок, ка различнпх расстояниях от : последовательности.

8. Использование экапрессзгошгой единицы Ешеозз для изегнения уровня активности aroa-aroG гепа в клетках в.subtiiis.

ДЛЛ пзучэпия ЭНСВД)8ССЕЛ aroA-arcG ГоГЁ" ПОД Контролем EU1SO неш с пог-ю^ъэ штода полиморазной цешой рсткцш (ПЦР) С осуществлен сайт-иаправлоппнй мутагмюз гена ДйГР-гинта хоризыатадтази в. subtil i s 160. На основании дпшшх по цуклроют последовательности агод-агоз били "синтиеироваш д оетгоиуклоотада ag-h и ag-c2, флашгаруыцпь структурную часть /ен üíjiyií'iypa олигоцруюотндов представлена нп рис. Авдяп&стропашшй в ЩР эксперименте фрпп'.эиу гени ДАГ-Р-снята хорюматмутази бил лазен собствешого прошт.та и р-незавнепмо терминатора, расп jjiosouHoro за структур*?1 й частью агоА-аг (позиция I75G-I777, рис.З). Рекомбнначтная плазмяда рсва полученная в результате субклонироваиля ямплифнцироваяно фрагмента в составе вектора ревгг по Пдит сайт комплементаровахп агоее^г и агоАб мутации соответствующих гее штаммов t' subtiiis. Результирующ"т ДАГФ- г.итазпая хоризматмугазияя активности в клетках в. -.иы-шг. IG3 евчзг г<с срсвА?з представлены в Таблице Э. Уровень активности ДАГФ-нии'Гс

в клетаах в. subtiiis aro<393s rece4 cpcbavj приблизит^«

соответствовал активности ДАГФ -синтозн в клетках исходного nsrav в. subtiiis К®, Уроычь хоризматмутазпой активности у в.ьчын

MOG932 гес;Е4 СрСУА7Э КорреЛИруОТ С Д.1Ш1ШИ ПО ХОрИ'ЛМПТМ.уТИ'.Ч

активности, определяемой агоо геном л ь. subtil»s im.

1'4

Использование рибосомалыюго простора гена rpiu

. amyloHquefaclens ДЛЯ ЭКСПреССШ! aroA-aroS Гена У В. subtil!s.

Сравнительно П0ВЫСОКИЙ уровень экспрессш aroA-aroG гопа .subtiiis 1БЗ под контролем ЕШвозз навел нас па мысль об спользовашш плазмада рНЕдзгз, содзретдай одап пз "ключевых" епов биосинтеза ароматических аминокислот у B.subuiis pheA ген рефенатдегидратазы под контролем промотора рибосокального гена

plu В. amylollquefaciens. ОбЪвДШЮНЙВ ДВУХ (aroA-aroG И pheA)

ключевых" генов шпкиматпого бдасинтетичэского пути в составе скусствонного онерона на основе плазмиды рНЕАзгз, а также зучеше факторов, влияющих но эффективность экспрессии указанных енов в полученной оперонной структуре, явилось задачей, решенной а последующих этапах диссертационной работы.

0. Описание рекомбинантной плазмада рНЕдзгз.

Ген pheA кодирует фермент префенатдегидратазу - первый фермент последовательной цепи биохимических реакций, ведущих к енилвлагошу из общего для фенилаланина п тирозина предшественника префената. рьед-гон из . хромосома селекциопного штамма .amylollquefaclens (ВНШгеНвТЙКа ) С ЧЭСТИЧНО СНЯТЫМ

етроингибированием префенатдвгидратазы бил клонирован Иомантасом

1.B. (ВНШгенэтика) по комплементации рь«а мутации в штамме

. subi i lis pheAlia trpca recE4 В С0СТЭВ9 6.2 T.JI.O. фрЭГМВНТа

ЦК на векторе рсвго. На основании данных генетичоской карты . subtiiis 168 и полученных Иомйнтасом Ю.В. данных по внот.пескому картировании XpOMO.COM 1 В. amyloliquefaelens ГВНУ pheA родшествует ' следующая последовательность генов:

poivF-rpiu-rpmA-spoOB-pheA. . Известна нуклеотидная

оследовательность'этой области хромосомы у в. subtuis 168. Путем злещта 2.8 т.п.о. фрагмента ДКК,' ограниченного pgixi сайтами и рпдположительно содерлсщз^о spoOB-обласгь и- часть гена гртд, очантасом О.В. была сконструирована плазмидэ рНЕдзгз (рис.1,6).

Tsííhm образом, ген рьед был поставлен под контроль ибоеомального промотора в составе искусственного оперона екомбилантной плазмиды рНЕдзгз. Это привело го данным иохимических измерений .к увеличению активности рефенатдегидратазы в 1000 раз. . Высокая активность рофонатдегидратазы приводит к . появлению, феяотнзтаческой уксотрофности по ' тирозину у штаммд. в. subtilîs, содержащего

рНЕАзгз. Перед структурной частью рьед гона расположен уникальш сайт узнавания рестриктази ?gui.

ii. Конструирование искусственного оиорола на осноеэ гош

aroA-aroG B.subtiUs И pheA В. amyloliqusfaci-jns .

Для субшю11ир01заш1Я ii получения Бффёктивной экспресс!

aroA-aroG iJ pheA ГйЛОВ В СОСТЭВВ НСКуССТВбННОГО ОПврОНЭ I

плазмихч рНЕдзгз была проведена серил акспэраментов i сайт-няправлзшгаму мутагенезу гена ДАР1>-синтезы хоригматмута; в r.ubtiiis I6C. В качестве исходной использовалась плазму pTAElß, содержащая AvaUI-^p.jrneHi ДНК ШШЗМЛДН pBAG7 С агоЛ-аге геном.' субклошрованшст по s^ai сайту вектора ptzi9rjli . результате экспериментов с использованием полимеразной цепне реакция и синтетических олигонуюэотидов прэгатор , рпеположешп в 5' нетранслыруемой области, и терьезштор, как структура в I нетранслируемой области за структурной частью гена эгоА-агоз, бы; делатнрошны. Бледошше с помоцыэ moto;i'j ПНР BamHi саЗп фланкиругдиэ структуряуг) честь aroA-aroG, 6liJIJI ИСПОЛЬЗОВЭНЫ Д последующего субклонированля гена в состсио вектора рнеазйэ i BgUI сайту. Tai™ образом, ПМШШфИЦИроВаШШв aroA-aroG фраГ'КОЛ' были введены в искусстввнннй оиорон между г ртл- и рЬеА генаг

В. amyloliquefaciens. ДаШШО НО Структуре ПОДУЧОННЫХ ВврИОНТОП

использованные синтетические праймери представлены в Таблице I на рис.7. Подученные в результате рекомбинан-ише плазмиди pagps pAGP7 (рис.1,и) и pAgps имели различную структуру ДНК трансгенной aroA-aroG/-pheA 00Л8СТИ (рИС.7,В). PAGPS СОДЭрЖ8. природную структ>ру ДДГФ-синтазы хоризматмутазы, в то время го

ДЛЯ pAGР7 и PAGP9 г6н aroA-aroG кодировал бВЛОК, у KOTOpOJ

с—концевой штанин был замощен на гргинин и добавлено еще аминокислот. . Цели, поставленные нами при проведении подобш модификаций были: а) изучить влияние изменения расстояния мэац

СТОН-КОДОНОМ aroA-aroG И СТврТОВЫМ КОДОНОМ pheA ГОНОВ ]

пктигагсть ярефеиатдегидротазн, и б)проверить влияггле с-концаш облосттг ДАГФ-оиптазн хоризматмутазы ни ее активность.

' D. сбласти 'инициации трансляции агоаатоо гена в coctöi

плазм'угч рлег-г. по сравнению с pagps и рапрэ рлсиолож;

Д01КШПП..11ЫМЙ фрвГЧОНТ ДШ!. рЯЗМОрЭМ 39 и.о. (рис.7,0

Рекомбинияпюя плтомидя i-.vr.rr. -иосет сайт узняпэния ростриктп:

P-jIII D Области СТН1;:; Si оА -лг • -1 И рЬ-'-А П^'ЧК ГЭКРМбИНЮТИ

аблица 1.

Сайт-направленный мутагенез гена aroA-aroG.

использованные праймеры

Изменение Полученные рекомбинантные

. а-к пос-педовательности плаэмиди

гена aroA-aroG (pTZ19RJLl) (рНЕА323)

E.coii D.subtUia

AG-N AG-C2 нет PTARA7 pAGP5

AG-N + AG-Cl ala(367) -> arg + 9 AK PAR17 PAGP9

Fr-17+ AG-C2 ela(367) -> arg + O/U! РАНЮ PAGP7

о)

rptu onxrpnA* а«АG

Ъ.

РЬ«А

X

У

J—

piCFJ

rpti -> I l S f с t 6 I G I

.......к S I Г t l I I I i « I | l.,tMis

Ul- t>»tU{itccat(t[ci|i|iU(|>TCluiiairCa(ciiciC((ictt4irctttti<H«fUJin;ic/> -Hl

"B|1H/Iai!l <—E8S—»

piCft

rpd'i IlVreetLBlITIIIlIClSItl

(f ->arof.3

III- tilttUnttcCCAKCIlCCCTiCItClTUCIlMUJIUUUrSiiHtpainmWirSiiiiMHff« -Hl "In 1 . <--IIS-->

"IflK/BaiHI

piCfi

fp«i -» i t } г с i e i s t

« s I T I l I t l | 3 с I в ->4rcts

III- t«ii'ti|itccitit|cair|ii»||»!cijaiail7i;i/cjscjcai«iuii!ictttl!a(fc)fjij<c»fi-(j -HS "BillI/BaiBI <—HS")

1) P«6f5

aroW -> V К V И ft I

Я II V ->ptw»

1235- ilqii)9tciiC5Ctt«Blt4nmtctjumitttImqlri5jqcjUJ55Jjiiji^a5a»t«T6iln(c -1315

•Kiniiz г <—-ms—>

pWJ __'

jruftß -) V К V К В » I l 6 S G H I

И Г [ И I i E-)phtA I27S- qt!aii9tciaqc;tti)q<tctti9tqtcigqcq(]TAegqqii«^»<cATeMi;!cjgtUttt<9gtct<gi -U55

<—-m—>

pflSP? _

jroSS -) V t V « К И I L 5 S Б » l

* « 1 6 * t 6 P t-)phf»

(-—((85—)

Pic.T. Оргшщн Kijcci!«rsim «трои, м«рн««г« iril-troS ■ pksl'riinr. CSlai tuts cpn-iiäiii«! медом (i|. Срганици i'i'Kiui Шин mi-ireS mi i cccfitt ih»ii f.WPS, pIGPf, fiCM(6). Iniuit imnicmm тщтмшсп rpilT i l-ismiol uni II!f-ms-H3( i«[tmr«rri3i B.nbtilii. lutieti SD-gicit|out<int(Ti, нцицн« i мм-ндт, *»-тпгепм! tparieii )It gauiu plGPT. Оргинци uittnil odini irgl-troC • Mime uiHii piCPS, ptGFT, pKPJ(i|. iiuiui iiiiiurit'iii ницоитшт C-innitl ui-ii Sein OiiF-ciittia припиши ■ l-ioiqtinl o;ii <M"ttter')pm!>. luaiiiititnt »uttacitri i tituie {tut ircA-iroG Iii muim /Ю i tfJfl iw(fii|ii.

шшзмвда pAGPdeui содержит в сс..;гы:е искусственного опорона фрагмент aroA-aroG гена в.subtiiis Ibö, коднрупсй ДАГФ-с:ппазную часть бифункционального фермента (псзгагли 993-1744л.о. ряг,.3). Отбор КЛОНОВ В.subtiiis aroGQS2 leuAS госГ4 , ~он ЦИХ рекомбинвнтныо плазг.ыдч pagps, рАСР7, рлс^з п pagp.'sih, производился по способа з и этих клеток к рос--/ па агаризованной среда СпдцаЙ0о:«т, содержащей шялмо стандартах, компонентов 15 мкг/мл арстроклрша „ 50 истая лейцшю :: ЕП тарбэяна. Данные по ^мплимиитацг-з агс^лз и ыоАв мутащ.Л соотсзтсгйуадих стакг.'.оз ь.subtiiis írpoji.ciccor'ii в ТеЛисл

Увзулт-твтц х-зкгрвиий yp-.w,."'. aKT;iCjK/Ov.; ¿«Гй-сйНдазы, доркчю^мутрзи л 1гг1-1вн8тдегвдфпти.з:' в втекла* ь.subtiiis

ипЬЭ32 leuAS гесЕ4 ч И. bubtilis агеЛО гесЕ4, C0;'í р^аВДХ

полученные poiwjifflaH5"tö> ша-ьчядо, црвдетавло®! в Таблице 3. Активность прс*1«натаог^дратсзы в клетках е.subtiiis гговззг cpAS^oj, ерлораэ и Ср..гр7? с.ол'ахдала от ¿0-525 соотвэтстнуздеВ активности р клетках в -.uotiiis агоеэх. срНЕАзгз), что однако было достаточным для придания аугссттофностн по тирозину рэкембт.явцчтшм штатам. Уровни ДДГФ-с.ытагноЗ и хориэматмутазной активностей в клетках, о. subtiiis вгос; >ü, содержащих рекомбшшгпшг плазгглд"

pAGPÜ » pAGPS, были Hp¿n-«4tCKH ОДИНвКОПЛЕ! II СООгвеТС'ГВОВВЛ" уровши.. ...лйшоск рассматриваемого фермента р. клетках в. subtiiis. несуща плпзклду рсг;лг, к и роучтольском штаклз в.subtiiis /.тсс Gobi Marburg. Уровень ДАГФ-синта^нол и хорикматпутезшЛ жтаглостн в клетках в.sujUUs агоеэзг сpagfzj d срояиеы на ппря^'Н iip&p'wmji соответствующие уровни активности для вариантов рАСРР, рдзрэ и реил /, не пр^выша/ однако 30 -50% порога актиностсй ДАГФ-сьнтозы хорязматвдтазн у в.subtiiis аговэзг срг,до?:>.

Илзпса'м Фактом, на пап пзгляд, является значительное cinnwu:»n ypuoiuí ингибировагсп ДАГФ-скнтази хоризматмутазы в клп;:ох s.subtiii-, несуаа*. рекомбклантные плазмиды pagp7 и рлорэ. ID-P'tlíVO.yíMy. это явлыв'э обусловлено э(д©ктш«шм ороврх^цивм иреф^нтга в (¡енил-пировиногра иув кислоту высокоактивной префон^тдегмяр^лас^а, что гевлекло за собой сшганио пула пре1я;ювсч кислот (основного гопт.битора Д4ГФ-синтезы) ''Лпткгх ^.ir^wiuivt.jx WTWNOB.

имд 2.

пплипептяция признаков ауксотрофности у штапиа B.subtilis cG932>leuA9, гесЕ4 различными ррксшбинан гньши плазмидаяи

пил а Репликои Пени .юполмительные нгобкодииыо «оппоненты leu trp tyr phe

7 р0д91о arafíS + - - -

323 г3г119035 pheñ + + + - •

0 p5M19035 - 4 + +

ш pSM19035 aroAG.pheA + - -

s р5П1г035 aroAG,pheA + t -

7 pS!1l903S aroftu, píieA + — - •

7 PSM19035 arcAG, phriA + - + -

4IIЛ 3

■lepen ир активности ДАГФ-синтаэы, хориэпатпутаэы и префенатдегидратазь

1 МП -ubt i 1 is Плаэнида ДАГФ-синтаэа (+ 2,ti M ; ингибир. Cd + +) : nps ieliäTOn хоризпдт Î путала ! » 'префенат легилра-таэп

:ÓO5Í Г^дгЬигд - 10,9 ; 34 V. (229.1); 19 ! t 3.6

: rpL2 - 14.3 I 16.77. (311) : о. а : 2.7

г.-Е4 , pBAG7 рНЕДзгз рСВЙ7 pAGP5 pAGP7 pAGP7 pAGFdt?l 11 ( 6.0) : и.о. 702. : 34-/. 10.2. : 257. 11.0 : 347. 7.8 ; 927. 92. : 807. 149. : (13.6) ; 1007. о : 16.0 : о : 0.3 I 0.4 : 0.35 : 2.6 : £3.7 : и.о. : 4.5 5.0 4500 5.0 1832 2784 2736 1321 2280

,ГРГ pHEA323 pAGPV pAGPdel J.1 (2.1) ; 2 .011.0. (2.1) : и.о. 3.9 : и.о. (474) : (12,8) : и.о. : и и.о.; и.о. : и.о.: .о. ; 4540 3580 3600

12. Влияние вторичной структуры мРНК на инициацию трансляция

aroA-aroG Г8На В C0CT8B8 ПОЛУЧЭНЛЫХ ЙСКуССТВЭНННХ ОГЮрОНОВ.

Таким образом, на основании данных Таблицы 3 зЩекишча: трансляция aroA-aroG И pheA Г6НОВ В СОСТвВВ ИСКУССТВвННС'.'О OTOpOHi была достигнута в варианте с плазмвдой pagp?. Различия в уровня: ДАГФ-синтазной и хоризматмутазной активностей в тшетка в. subt-t lis, несущих рекомбинанташ плазмида с различии« вариантам искусственного оивронэ, обусловлены, на нош взгляд ситуацией с инициацией трансляции агоА-агье гена. К Докторам влияющим на эффективность инициации трансляции генов, н сегоднешний день относят: а) структуру облает;: связывания рибосомой, б расстояние между rbs и инициирующим atg кодоно;. в)нуклеотидный состав области между rbs и atg, г)расстояние мок; продыдущим стоп-кодоном и следуклцчл стартовым кодопом в онероннс структуре, д)вторичцуго структуру мРНК. В соответствии с данными i модифицированным структурам aroA-aroG генов и по организащ области гртА' в.subtiiis, нервно четыре фактора являшч постоянными, 8 первые три такими же, как и в природном гене. Hai была определена нервичнал иуглеоткднал последовательность

Обласг7! СООДИЯеНЯЯ rpmA1-aroA-aroG ГОНр В СОСТвВв ИСКУССТЕЭНН] оперонов плаз?,кц& pagps, рлору, pagp9 (рис.7,6). Гомология ывзг, послодовательшстоя гртА• генов В. subUlis IJ В. amyloli quefacie составила более 90%. в тоже время реглячия в 7и структуре мог влиять на характер вторичной структуры мРЖ в области инициац 'трансляции. Компьютврннй анализ нуклеотидной последовьгельнос ирнк в этой оЗлаоти для рокомбилантных плазмид pagps и pagp вшюлнонний с помощь® пакета программ dna sun, нпквзцве возможность формирования достаточно стабильных вторичныг лтрукту затрагивающих район RBS-сайта и aug кодона r>e¡n атд-агс Наиболее вероятные вторичные структуры мРНК для - -мантои рД5ре ра&рэ представлены нп рис.8,б. Изменение структуры ртой обласп нлазмидо рДГР7 пут-',- введения дополпктолышх 39 л.о. (рис.7 привело к увеличению аф^ективности трансляции гена. Аня. пт причин* структур мРУК д™ згого варианта, а та^жо для квг.-< области прэтодаого %-це ч составе ллэзмвдн рвдз,, указыпает ¡■'jcnoj'omnue области fbs и ко доим ivirá агод-ягов пнп воч.'.'гк шилечннх структур (рис.3,г>.

: >г>

RBS

liait

PBAG7, pASP7 с—о

o-c

G ■ -6.7 kkal/M u—a

a

О—с u~a

.... aoacniQoa ccgaou

с aaa

0e Qa u a g л

il .A

/-Л

pAGP5, c--g RBS pAGP9 ao-\

au-a* S- au~<4 ЧМЬМ/Мв-^

S).

H

. oaguuaca acacagrg.

(ici luiiiiit ntiitnt erprf Irpw ipk i оби et i iinuin tpi?;ii-ü irol-irofi reu l cictiii lifmi [!ASt ■ plGPTU), i i estrile piîPi, plSPJ (S|. 06UCTI US ciiroi efniai i fin«, tinumi iiHiiprf'lJ (И lejetrf. Ipm-дез« »ерш ofriiciiiti i;«jiiuriitii иорпш cifjttrp.

13. Клонирование re па ДАГФ-сгоггази из ctri.:.:b б. subtil i s атсс

(3051 Marburg.

Фермент-ДАГФ-синтаза B.subtiiis 168 ингЕбируотсп 1Ю принципу обратной связз двумя илтермеднаташг инккматпого бпосютотггюского пути: хоризматом и префенвтом. Штамм в. subtil is 168 был получен из штамма B.subtiiis атсс eosi Marburg путем кутагЬноза рентгеновским излучением. ОДНИМ ИЗ ОТЛИЧИЙ родительского штамыа B.subtiiis является присутствие вксокоактивной хордзмзтрдутаэи, кодпруоной аге.ч гвно'л. В то ге время на основании биохимических исследовапай бил сделан ВЫВОД, ЧТО ДАГФ-Синтаза у B.subtiiis АТСС COSÍ Harburg являете,л монофункциональным ферментом, • нэ обладкадм хоризмятг.'утаз!?,.'! активностью п нэингибгрувмш хоргзматом.

Описанные сгойства "исходной" ДАГФ-синтазы1 оцрзде.таля интерес к клонированию кодирующего ее гепа. На основании донных но НуКЛООТИДНОй последовательности гена агоА-агс<3 У В. subtilts leo в эксперименте с использованием' цепной полимеразной решении и • праймнров a и AG-сй (рис.3) бил акп.лифицирован фрагмэпт хромосомы штамма B.subtiiis атсс eosi ма.ьше из коллекции проф.

Дубину ■ (США). Амп-тофицкроганныв фрагмент:! ДНК саля субклг-нирпвяпы в составе вектора ревгг под контроль экспрессиолюй едичшн nui ос35. Полученная рекомбинантная 'плэзмида pcbaö коччличентировала aroc-азг мутацию соответствующего г рсЕ4 штвша

В. subU Ils. УрСЕОПЬ ДЖ.-С(и1Г£1НТЮЙ И ХОрИЗНЕ'ПЛУ ГПСПОЙ ВКТШШОСТИ В kjiotkic n.s-jftiiin cpca/.uo бил практически равкш

cooTuoîCT»yjœr»w урошя.. шглвшйсто в клетках того аш штоша,

неоуацк pbKvUínTíU'nyj рСВЛ? О агоА-агс,® Г0ПОЫ B.subUUs

iea.

14. C;öar)nc-ai>-"jn г." ¡с Л'П'-сЕГгаои г.cubuua атсс pcsi и-гьигд.

Для " i : ф iäraöS нук.'оотидоои поело''хЪЪГт&ч 'ста

клялиIicu»íoBüiUiu2 í);.;ar:.:?\jr тепа ДШм'.аптазы •>• «иьш < s люс eosi

t.'»ri)L.-g Cwî: в coctííbo г^кторэ рТ2! orju ъ кльтказ

е.coït. ДЕСС о ¿того илагмади ртдкл.о использовано

ti кач&отие ..уухаг.; ральчой мг."хад! в екснериюшах по сакьовс-шэлй j.v. ibj^raton илУюотодаая лоиледовэтвлыюсп структурной 4ü"T/i генг ргол оказалась идентичная тисовой у arc.A-i.-oG гоцр иты w б.sui.ни -, ]6В v.o шаилэшаюм »двдстчснпоО osMCd\ - с ¡ta г> .»; ноэ'/ц-гл lUiö (рал.З), по приводящей к изменения одаюлмхл), код 'рус«эй дышл трздлотом. Дапхн отлпио ыэжот бить сипаев кач со с^атйстачпс.поа. оапОкоЗ в ирцзссо цепной пол^ьрегп'«} pd'ii'u, raí; ir отра&да» изходцов отгачив агоА генов )ГТЛ»1-«0В. ÏJtSU осрозои, по освовшыи пэлучелвих Д8ШМХ можно rowi.'V- о ид-мтачносгн гонов ДАП>-олэтаз штамагв в. sutuiis 160 и г mJ.Mi^j м-; ео'л üvrL'.'Trj. а шта о проявлении ДАГФ-синтазой в;.г-'"'У«1 J ••jibtiiís .»тсс г,о:л Marburg згаризмзткутазиэй аКТШШЭСТЯ, ■что tjii'^mльешуег "б исходно;) Опй'якцаонольчой природе этого

ÎOp-'.-HTO.

aw:.

Т. Определена иарелчнчя нуклеот.щшя последовательность

aro/i-.iroG ГеЧЗ й.cubtilis JÇ .,

2. Ох^рактерхи^оч'л; npOMOTC р aroA-aroG Г9ПУ B.'sibtilis ICC, к^ощювано ТОЧКР ш^'дачии транскрипции.

3. Установлен«) с'гоу^гчрго-^ушсциональная организация продукта arc-A-aroG грне в.зиьинч i69. м-концевая часть белка, кодируемого ai о'- -¿roe геном, сч)ус. jimn<aeT хс-риялтмутазцуг аг^гизность rt.jj./iiKT^oiioibHoro tJepiOJiTn; -концечая часть ДА^1>-сгп.;?и хорязмчтмутвзи p. subtil is I'V3 определяет ДМ7~е;ш'п.>чу*>

ai'Ti'.Bi.-C'b.

4. Показана идентичность да сип-таз к л ß.subtius IG8 п ВХОДНОГО ДЛЯ 160 штамма В. subtil х; АТСС SO?l Marburg.

5. Охаракэрчзована oncnpocc:io!r-f ч одшпща Ешеозо из области -•^такацаи стрептококковой плазшда ,.-2Ч1.оозо.

6. Сконструирован ИСКУССТГОШиМ CiiepO't, СОДБрЖВЩИЙ агоЛ-агоС Ш В. subtilis 168 И pheA Г9Н В. anyb-liquofaciens ПОД КОЦТрОЛВМ ЮМОТОра rpiu гена в. amyloliquefr.cier.s .

7. Эффективность инициации УрСПСЛПЦНЛ aroA-aroG ГО 118 subtilis IG8 в составе искусстгюнузго опоропа определялась >шючешостью rds сайта l^im и его ишщлирущого aus кодом я ¡разовояие вторичшх структур »¿PKЛ.

СПИСОК РАБОТ, о;lybJ^ütODAfÜIUX 40 TEffi ДКССВГТАЦКИ

1. Хазак В.Э.,. Сорошш A.B.// Окспросспошюя гчд:пещ8 для юм-полоазггелышх бактерий. Тезиси ::o:ip.' "Ifctuз направления готехнологни", Пущпю, ISS8, С.29.

г. Сорокин A.B., Хазок В.Э.// Окспр?сспсниая ьдшг&ш з области щнкац;тл стрептококковой плазг.^тди р:~шеозз. Молокуляр. блология, Т.24, C.9S3-I000.

з. Хазак В.Э..Болотип А.И., Раш-мода It_.II., Иомантас Ю.В., ЗЛОВ Ю.И.// Срсвпитольша СИПЛЮ аго/.-ггоЗ ГвНЭ В. subtilis 163 Ii OA Г0И8 В. subtilis АТСС 60G1 Marburg-, ТвЗЬ'СЫ ¡СОК{'. "¡IOBU'3

правления биотэ.тпологий", Пущто, Id'JJ, 0.46.

1. Sorokin А. V. , Khazsk V. Е. . Velko V.V./s Uso of Lambda gulatory signals for Bacillus subtilis. Abstr. of Fifth tornational Conference? for Bacillus, Apolomari's, USA,

27.

'J. Sorokin A. V. , Khaz^k V. E. //Structure of pSt!lS033 Replication gion and MLS-Resi stance Gcno. Ojr.-atic Transformation and predion, Intercept Ltd, PO Box, AncL-var , Hants, SP10 i'iS, UK,

so, pp. tea-aei. ' '

6. Khazak V. E. , Sorokin A. V. Expression unit from replication 3ion of pSM1903S and its usage In Bacillus subtilis. Abstr. of :ond Workshop on G~nr. Manipulation in Bacilli. GDP, 1ЭЭ0, p. 23.

7. Bolotln A. P.. Khazak V. E. , Stoynova U.V., Ratmanova К. I. , nantas Y.V. , Koslov Yu. I , // Cloning and nucleotide structure of эА-aroG gene Ы D.iubtllis 168. Abstr. of 11th European Haetino