Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus mucogenes M75

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus mucogenes M75"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ЦИТОЛОГИИ

Р Г Б од

2 3 от г;:;.!

УДК 676.244:579.841.11

ДОЕРОЖИНЕЦКАЯ ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА

РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ У ОБЛИГАТНЫХ МЕТИЛОТРОТНЫХ БАКТЕРИЙ METHYLOBACILLUS MUCOGENES Ш5

03.00/15 - генетика

Автор е'ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1995

Работа выполнена в НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии Белорусского государственного университета

Научные руководители -доктор медицинских наук, профессор Ю.К.Фомичев кандидат биологических наук, Н.П.Максимова

Официальные оппоненты -доктор биологических наук, профессор Ю.Д.Цыганков кандидат биологических наук, ст.науч.сотр. Е.Н.Воронина

Оппонирующая организация -Институт микробиологи)! АНБ, г. Минск

Защита диссертации состоится 17 ноября 1995 года в Ю00 на заседании совета -по защите, диссертаций на соискание уче ной степени доктора биологических наук Д 01.31.01 в Институте генетики и цитологии АНБ по адресу: 220072, г.Минск, ул.Ф.Скорины, 27

С диссертацией молено ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я.Коласа

Автореферат разослан 6 р/с.7. 1995 года

Ученый секретарь совета по защите диссертаций

кандидат биологических наук^.-'^'Л;.... Е.В. Лобанок

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Метшютрофные бактерии, способные использовать в качестве источника углерода и энергии метанол и другие восстановленные (^-соединения, привлекают внимание не только особенностям« своей физиологии, биохимии, но и реальными перспективами использования в биотехнологии и генной инженерии. В связи о этим более подробное изучение метаболизма данной группы бактерий бактерий, включая процессы биосинтеаа биологически активных соединений, может способствовать решению актуальной проблемы промышленного применения микроорганизмов, утилизирующих в качестве дешевых и легкодоступных субстратов метанол и его производные.

В атом плане особенно перспективными представляются разработки, ведущиеся на основе штаммов метилотрофных бактерий, обди-гагно потребляющих данные субстраты. Бактерш! этой группы отличаются высокой скоростью роста и выхода .биомассы на метаноле, в связи с чем могут являться источником высококачественного белка и использоваться в микробиологическом синтезе как эффективные продуценты важнейших соединений (аминокислот, органических кислот и альдегидов, витаминов, полисахаридов, ферментов, биополимеров, цитохромов, убихинонов и др.)| как биотрансформанты различных полимеров , ■а также могут служить хорошей основой для конструирования штаммов-продуцентов с использованием методов генетической инженерии.

Учитывая то, что природные штаммы микроорганизмов не способны к сверхоинтезу значительных количеств клеточных метаболитов, в тем числе и ароматических аминокислот, продуценты фениладанина, тирозина и триптофана могут быть созданы путем дерегуляции их биосинтеза. В связи с этим изучение путей синтеза этих соединений и особенностей их регуляции в клетках облигатных метилотрофных бактерий является необходимым условием для целенаправленного конструирования штаммов-продуцентов.

Биосинтев ароматических аминокислот, а также контроль синтеза и активности ферментов, обеспечивавших его функционирование, достаточно подробно изучены у бактерий различных систематических групп, в то Еремя как облигатныэ метилотрофные бактерии в этом

отношении практически не исследованы.

Связь работы с крупными научными программами, темами.. Работа свявана о разработками, которые выполнялись по темам:

1. Тема 01860067021. Исследование биохимических особенностей метилотрофных бактерии.

2. Тема 01912235948. Изучение генетической регуляции и ферментативного контроля синтеза биологически активных соединении ароматической природы (аминокислоты, антибактериальные вещества, сидерофоры) клетками граштрицательных бактерий.

3. Теш 01860002420.,. Изучение генетической организации гра-мотрицателышх фитопатогенйых бактерий и С стерий, утилизирующих одно- и двууглеродные соединения.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось изучение регуляции биосинтеза ароматических аминокислот у облигатных метилотрофных бактерий Methyloba-oillus muoog'enes W5.

В соответствии с основной целью исследования были определены следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать новый штамм облигатных метилотрофных бактерий, обладающий высоким уровнем активности ключевого фермента ароматического пути - З-дезокси-Б-арабиногептулозо-нат-7-фосфат-синтазы (ДАГФ-синтазы). Изучить пути ассимиляции метанола у выделенных бактерий и определить перспективы их практического использования.

2. Создать на основе штамма M.mucogenes М75 коллекцию зависимых по ароматическим аминокислотам мутантов для изучения регуляции синтеза фенилаланииа, тирозина и триптофана.

3. Используя полученные ауксотрофные мутанты, исследовать контроль синтеза ферментов ароматического пути у бактерий М.muco-genes М75.

4. Изучить регуляцию активностей ключевых ферментов биосинтеза фенилаланина, тирозина, триптофана и определить изофермент-ный состав ДАГФ-синтазы у бактерий М.muoog'enes М75.

5. Получить регулятс ные мутанты M.mucogenes Ш5, характеризующиеся повышенной продукцией триптофана, которые могут быть использованы для последующей направленной селекции высокоэффективных продуцентов.

Научная новизна работы. В ходе исследований выделен, описан

и идентифицирован до вида новый штамм облигатных метилотрофных бактерий ilmucogenes М75, у которого осуществлен анализ путей первичного и промежуточного метаболизма метанола. С учетом особенностей метаболизма данных бактерий разработана методика получения и идентификации ауксотрофных и регуляторных мутантов, в результате чего создана представительная коллекция ауксотрофных по ароматическим аминокислотам мутантов. Впервые у облигатных метилотрофных бактерий идентифицированы ауксотрофные мутации в генах trpE, trpD, trpF, trpA, trpB, tyrA и pheA.

Изучен характер регуляции синтеза фенилаланина, тирозина и триптофана у M.mucog-enes М75. Установлено, что ДАГФ-синтаэа этих бактерий регулируется посредством ингибировакия всеми тремя аро-матичскими аминокислотами, хориэматыутазз - с помощью репрессии синтеза тирозином, а префенатдегидратаза - также на уровне репрессии синтеза тирозином и ретроингибирования фенилаланином. Составлена обищя схема регуляции биосинтеза ароматических аминокислот у данных бактерий. Получены и охарактеризованы регуляторныа мутанты M.mucogenes Kt?5, продуцирующее триптофан.

Практическая значимость работы. Полученные результаты создают базу для промышленной разработки на основе бактерий штамма M.mucog-enes М75 чувствительной тест-системы для определения метанола в среде, а также методов высокоэффективной дестругахии данное го соединения. Разработан метод получения и идентификации мутантов, который может быть применен и к другим облигатным метилотро-фам. Использование данной методики позволило получить регулятор-ные мутанты, которые являются исходным материалом для направленного конструирования штаммов-продуцентов триптофана, а также белка одноклеточных, обогащенного этой аминокислотой.

Экономическая значимость подученных результатов. Полученные результаты могут быть использованы для создания на основе бактерий штамма M.mucogenes М75 коммерческого препарата для определения присутствия метанола в среде, а такде для микробиологического синтеза триптофана.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- выделен и идентифицирован новый штамм облигатных мег.лот-рофных бактерий M.rnucogenea Ш5;

- изучаемые бактерии утилизируют метанол о использованием

кетодезоксифосфоглюконатальдолагного варианта рибулоаомоно^осфат-ного пути;

- первый этап биосинтеза ароматических аминокислот катализируется тремя изоферментами ДАГФ-синтезы, регуляция гаторой осуществляется аллостерически. Регуляция синтеза ДАГФ-синтазы у М. гписо^епез Ш5 не зарегистрирована;

- биосинтез фенилаланина и тирозина в клетках бактерий м.гли-соеепеэ КТ75 регулируется на уровне репрессии синтеза хоризматму-тазы и префенатдегидратазы, а также посредством ретроингибиро-вания активности префенатдегидратазы;

- контроль биосинтеза триптофана у С стерий М.тисо£епеэ м?5 осуществляется за счет репрессии генов 1:грЕ, 1грБ и 1грС, а такае путем ретрошгибирования ключевого фермента этого участка ароматического пути - антранилат-синтаэы.

Личный вклад автора в выполнение работы. Материалы, положенные в основу диссертации, получены и проанализированы автором самостоятельно. Исключение' составляет газохроматографический анализ содержания метанола в среде, проведенный к. б.н., ст. науч. сотр. Института микробиологии АНБ Щерба В.В. Результаты совместных исследований опубликованы в печати. Существенная методическая помощь в выполнешш биохимической части работы оказана автору сотрудником НИЛ молекулярной генетики бактерий, к.б.н., ст. науч. сотр. Олехновичем И.Н.

Апробация результатов диссертации. Результаты работы представлялись на конференции молодых ученых (Москва, МГУ, 1988), а также на семинарах НИЛ молекулярной генетики бактерий при кафедре микробиологии Белгосуниверситета (1992-1994).

Опубликованность результатов: по теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и обьем работы. Дис зртация состоит из введения, общей характеристики работы, 3 глав, выводов и списка использованных источников. Работа изложена на 88 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 22 таблицами. Список использованных источников е шочает 271 название, из которых 230 не иностранных языках. Общий обьем рукописи составляет 11В страши машинописного текста.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЛАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Бзктепии. В рзботе использованы 15 коллекционных штаммов ые-тшютрофных бактерий, относящихся к родам Methylobacillus, Methy-lomicrobium, Methylobacter, Pseudomonas, Achromobacter, Blasto-bacter, Microcyclus, Xanthomonas, и 120 штаммов облигатных мети-лотрофных бактерий, выделенных из природных источников, а также бактерии штаммов E.coli ТА, Pseudomonas putída, Aerobacter aero-genes, Rhodotorula rubra. Микроорганизмы получены иа Коллекции Микроорганизмов Еелгосуниверситета (Минск), ВКМВ (Москва), от д.б.н. Троценко Ю.А. (ИЕФМ, Пущино), от проф. Цыганкова Ю.Д. (ВГНИИгенетика, Москва), от проф. Ждановой Н.И. (ВГНИИгенетика, Москва).

Среды. Для культивирования ыетилотрофных бактерий использовали жидкую и агаркгованкую среды, содержащие 1 об. 7. метанола с использованием в качестве минеральной основы среды Канеда (Kaneda T.Sr Roxburg F.", 1959).

Выделение ДНК. Хромосомам,ную ДНК выделяли по методу, разработанному . J . Mannur (1961).

Получение мутантов. Мутанты M.inucog;enes М75 получали путем обработки бактерий Н-метил-N'-китро-М-нитроэогуанидином в концентрации 500 мкг/мл в цитратном буфере (pH 5,5) при 30°.С в течение 60 мин.

Определение ароматических аминокислот и их предшественников проводили с использованием спектрофотометрического метода (Ya-nofsky С., 1956; Udenfriend S., 1957).

Выделение и очистку ДАГФ-оинтазы и индол-3-глицерофоо-фат-синтавы проводили по методам, предложенным R.Jensen & E.Nester (1966) и T.Creig-hton & C.Yanofsky (1970).

Получение субстратов ферментативных реакций. Хориэмат выделяли- иб культура» ной жидкости Aerobacter aerogenes 62-1 (Gibson F., 1970). Эритроэо-4-фосфаг синтезировали по методу, предложенному С.Ballou (1963), 1-(о-карбоксифениламино)-1-деэоксирг"уло-зо-Е-фосфат и индол-3-глицерофосфат - по методу, описанному T.Creighton í C.Yanofsky (1970), 6-фосфоглюконат - по методу,

- е -

разработанному A.Kornberg- et al. (1955).

Активность ДАГФ-синтазы определяли общепринятым методом (Jensen R. & Nester E.t 1966).

Активность хориэматмутазы и префенатдегидратазы определяли по методу, предложенному N.Patel et al. (1977).

Активность префенатдегидрогенаэы определяли с использованием методики, разработанной C.Cotton & F.Gibson (1967).

Аминотрансферазную активность антранилат-синтазы и активность антранидат-5-фосфорибозилтрансфераэы определяли флуоримет-рически (Ito К. fr Crawford I., 19Б5).

Активности а- и о-су.Ььединиц триптофз"-сннтази регистрировали по образованию либо исчезновению индола (Smith 0. & Yanofsky е., 1962; creiehton Т. fr Yanofsky С., 1970).

Активность 3-гексулоаофосфат-синтазы определяли по методике, предложенной Т.Ferenci et al. (1974).'

Активности дегидрогеназ глюгаэо-6-фосфата и 6-фосфогликопата определяли с использованием методцки, описанной A.Romberg et al. (1955).

Активность глпкозо-б-фосфатизомераэы определяли по методу, предложенному F.Reitel et al. (1966).

Активность 2-кето-3-дегокси-6-фосфоглзоконатадьдолазы определяли спектрофотомэтрически (Keele В. et al., 1970).

Удельную активность ферментов выражали в пМ/шш мг белка. Белок определяли по общепринятому методу (Lowry О. et al., 1952).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

■ 1. Характеристика облигатных метшютрофных Бактерии М.шсосепез М75

Для изучения характера регуляции биосинтеза ароматических аминокислот из 124 штаммов облигатных метшготрофных бактерий и 11 штаммов факультативных и ограниченно-факультативных метилотрофных бактерий был отобран штамм, обладающий наиболее высоким уровнем активности ключевого фермента ароматического пути - ДАГФ-синтазы. Было установлено, что бактерш1 данного штамма являются облигатны-ми метилотрофами, использующими в качестве единственного источни-

ка углерода и энергии метанол либо метиламин, и имеют морфологические, культуральные, физиолого-биохимические и генотипические свойства, характерные для бактерий рода Methylobacillus. Наряду с общими для бактерий этого рода свойствами (короткие грамотрица-тельные палочки, не образующие спор, растущие на одноуглеродных субстратах, которые ассимилируют через рибулозомонофосфатный путь; в составе клеток присутствуют фосфолипиды I группы; в жир-нокисяотном составе преобладают пальмитиновая и пальмитолеиновая кислоты, а в составе убихинонов - система типа Q-8, молярное содержание ГЦ в ДНК 50-56 X), бактерии изучаемого штамма имеют существенные отличия: перитрихиальное расположение жгутиков, низкий температурный оптимум (28-30°С), образование большого количества слизи, содержащей полисахаридный компонент (галактоза, фруктоза, глюкоза), соотношение пальмитиновой и палъмитолеиновой кислот в клетках 2:1. Полученные данные позволили отнести выделенные бактерии к виду Methylobacillus mucogenes.

Изучение путей первичного и промежуточного метаболизма метанола показало, что бактерии M.mucogenes М75 обладают высокими активностями 3-гексулоэофосфат-синтазы, глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы, б-фосфоглюконатдегидрогеназы, а также 2-кето-З-дезок-си-5-фосфоглюконатальдолавы (табл.1). Представленные данные свидетельствуют о реализации ими кетодезоксифосфоглюконатальдолазно-го варианта рибулоэомонофосфатного пути, который является для об-лигатных цетилотрофных бактерий основным источником, эритро-ао-4-фосфата и фосфоенолпирувата,- являющихся предшественниками ароматических аминокислот.

2. Получение аутеотрофных мутантов M.mucogenes М75

Для изучения регуляции синтеза фенилаланина, тирозина и триптофана у бактерий M.mucogenes М75 были получены 20 мутантов с Тгр~-, 5 мутантов с Phe~- и 2 мутачта с Туг~-фенотипом. С учетом особенностей метаболизма облигатных метилотрофов для них разработана методика получения ауксотрофных мутантов и подобраны сл ;ую-щие оптимальные условия для мутагенеза:

- концентрация N-метил-N'-нитро-И-нитроэогуанидина соответствовала 500 мкг/'мл, время обработки мутагеном - 60 мин. При этом

Таблица 1

Активности ферментов первичного и промежуточного метаболизма метанола в экстрактах клеток М.шсодепез М75

Ферменты Удельная активность

(нМ/мин-мг белка)

3-гексулозофосфат-синтаза 2 460

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа НАД* 4 700

НАДФ+ 580

б-фосфоглюкснатдегидрогеназа НДЦ+ 1 200

• НАДФ+ 260

глпкозофосфатизомераза 1 200

2-кето-З-деэокси-б-фосфоглшонатальдолаэа 1 200

выживаемость бактерий не превышала величины 0,1-1,ОХ, а мутанты появлялись с частотой 5-Ю"5 - 1-Ю"4;

- культивирование бактерий после мутагенеза в течение 4-5 ч для более яркого фенотипического проявления мутаций;

- использование высоких концентраций ароматических аминокислот (до 500 мкг/мл) для выращивания полученных ауксотрофных мутантов, отличающихся повышенными потребностями в соответствующих аминокислотах. При этом потребности мутантов в этих аминокислотах варьировали в зависимости от состава минеральных сред, используемых при культивировании бактерий.

3. Регуляция шикиматного пути у М.тисодепеэ М75

Регуляцию вшкиматного пути у Ы.шисогепез М75 изучали на уровне ДАГФ-синтазы с использованием ранее полученных мутантов, зависимых по ароматическим аминокислотам с блоками отдельных этапов ароматического пути (табл. 2).

Регуляцию синтеза ДА" Е-синтазы изучали путем измерения ее активности у мутантов, выращенных в условиях избытка и лимита соответствующей аминокислоты. Было показано, что уровень активности этого фермента, независимо от концентрации аминокислот в среде,

Таблица 2

Характеристика ауксотрофных по ароматическим аминокислотам мутантов М.шисогепеэ М75

■■ 1 Мутанты| 1 1 Фенотип| 1 | 1 Питательные потребности! 1 • 1 Дефектный! фермент| | Обозначение мутаций

М751 РЬе" фенилаланин ПДТ рИе А1

М7Б5 Туг" тирозш ццг 1уг А7

М757 Тгр" триптофан АС 1гр Е5

Примечание: ПДТ - префенатдегидратаза; ВДГ - префенатдегид-рогеназа; АС - антранилат-синтаза.

одинаков (табл. 3), что свидетельствует о конститутивном характере его синтеза.

Показано, что активность ДАГФ-синтазы у М.тисо^епез М75 ин-гибируется всеми тремя ароматическими аминокислотами, а также их предшественниками - фенилпируватом, хоривматом и антранилатом (табл.'4).

Таблица 3

Активность ДАГФ-синтазы мутантов М.гшсаеепеБ Ш5, выращенных в условиях лимита и избытка ароматических аминокислот в среде

Мутанты Концентрация аминокислот в среде (мкг/цл) • Удельная активность (нМ/мин-мг белка) *

рЬе751 фенилаланин (150)" 2,5

фенилаланин (500)** 2,0

Ьуг755 тирозин (200)* 3,1

тирозин (500)** 2,5

1гр757 триптофан (80)* 3,0

триптофан (500)** 2,4

Примечание; * - концентрация аминокислоты, лимитирующая рост мутантов; ** - избыток аминокислоты в ростовой реде.

Изучение иэоферментного состава ДАГФ-синтазы М.тисо^епез М75 выявило присутствие трех изоферментов ДАГФС-СРЬе1, ДАГФС-СТуг] и

ДАГФС-ЕТгр], при этом доминирующим являлся ДАГФС-[Й19], ьа дола которого приходилось 557. общей активности фермента (рис. 1).,зг

Л549 0.9

о. а 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

3

1

^ .л 2 .

Агао 1.8 1.6 1.4 1. 2 1,0 0,8 о, е

0.4

0. 2

20 40 60 80 100 IZO 140 ¡, фракщш

Рио.1. Профили элюции ДЛ№-синтазы M.mucog'enes М75 при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Примечание: 1 - ДАГОС-.СТугЗ; 2 - ДАГФС-[Тгр]; 3 -ДАТОЙ-tPhe]; вертикальная линия обозначает начало градиента KCl от 0 до О,5М.

Таблица 4

Ретрошгкбировашга ферментов ароглатического пути у M.mucogenes М75

Ингибиторы

Ингибирование активности (X) -1-

т

ДАГФ-синтезы

ХМ

ПДТ

фенилаланин

тирозин

триптофан

антранилат

фенилпируват

хоризмат

72 46 50 44

35 "Ч

О О О

о о о

84 О О О 23 5

Примечание: ХМ - хоризматмутаза; ПДТ - префенатдегидратаза.

4. Регуляция биосинтеза фенилаланина и тирозина у M.mcogenes Ш5

При исследовании регуляции синтеза хориэматмутазы и префе-натдегидратагы было установлена, что он подвержен репрессии тирозином (табл. 5). При лимите этой аминокислоты в ростовой среде активность хориэматмутазы возрастала примерно в 3 раза, а префе-катдегидратавы - в 6 раз.

Таблица 5

Активности хоризматмутазы и префенатдегидратазы у мутантов M.rtnicouerms М7Б при лимите и избытке ароматических аминокислот

------1-1-;

Мутанти | Концентрация аминокислот | Удельная активность I в среде (мкг/мл) - | (нМ/мин»мг белка)

I I-1-

I I ХМ i ПДТ

j______L__:_L

phe751 фенилалзнии (150)" 4,8 н.о.

фешшаяанин (600)"* 6,7 . н.о.

tyr755 тирозин (200)* 13,5 17,3

тирозин (500)"* 5,4 ,. 2,6

trp757 триптофан (80)" 4,3 2,1

триптофан (500)** 3,0 1,7

Примечание; то ле, что в табл. 4.

Установлено, что активность хоризматмутазы не регулируется ароматическими аминокислотами и их предшественниками, тогда как активность префенатдегидратазы подвержена ингибированию фенилала-нином, причем внесение его в реакционную смесь в сочетании о тирозином обуславливает снижение ингибирущего эффекта на 20% (см. табл. 4).

б. Регуляция биосинтеза триптофана у М.mucogenes М75

Для изучения биосинтеза триптофана была создана коллекция Тгр~~мутантов бактерий M.mucogenGS W?5. По способности к росту в

присутствии антранплата и индола, а также по накоплении в среде промежуточных продуктов биосинтеза триптофана полученные мутанты были предположительно распределены на фенотшшчески различающиеся группы. Окончательная идентификация Тгр'-мутантов была проведена после определения у них активностей ферментов биосинтеза триптофана, что подтвердило наличие 5 групп мутантов.

Изучение характера регуляции Тгр-оперона у М.шисогепез М^б о использованием полученных мутантов выявило наличие репрессии генов 1грЕ, 1грБ и 1:грС, ответственных за синтез антранилат-синтезы II, фосфорибозаптрансферазы и индол-3-глицерофосфат-синтазы, соответственно (табл.6). При лишите триптофана в ростовой среде ак-

Таблица 6

Активности ферментов триптофанового пути в состоянии репрессии и дерепрессии у Тгр"-мутантов М.тисовепез М75

-г-1-

| Ь-трип- | Относительная активность

Штамм ( тофан (-г~-1-1-1-

| (мкг/мл) | АС II | ФРТ | ИнГФС | ТС-А | ТС-В

_:_I_I__]_1_I_I__

Дикий тип Б00 0,06 1,76 6,5 0,1 3,8

trpE2 600 0 0,3 2,9 0,11 3,9

50 0 1,72 6,7 0,09 3,7

trpD6 500 0,09 0 4,2 0,16 4,3

100 1,7 о! 19,2 0,15 4,5

trpF14 Б00 0,08 0,13 1,5 0,15 ' 4,6

50 1.8 1,30 4,4 0,17 4,5

trpAlû 500 0,06 0,21 3,5 0 5,9

50 1,5 1,5 11 0 6,7

trpB9 500 0,1 0,4 4,7 0,09 0

100 2,0 1,9 9,3 0,1 0

Примечание: ACII - антранилат-синтаза II; ФРТ - фосфорибозилт-рансфераза; ИнГФС - индол-3-глицерофосфат-синтаза; ТС-А - триптофан- синтаЗа А; ТС-Б - триптофан-синтаза Б.

тивность антранилат-синтааы возрастала по сравнению о дшшм типом

примерно е 20 раз, индол-3-глицерофосфат-синтазы - в 3 раза, а фосфорибогилтрансферазы - в 5 раз. Гены 1грГВА у данных бактерий функционируют конститутивно.

Помимо репрессии, синтез триптофана у М.тисодепез М75 контролируется посредством ингибирования активности антранилат-синтазы триптофаном. 607.-ное ингибирование активности этого фермента наблюдалось при концентрации триптофана в реакционной среде 10~4 тМ.

На основании полученных данных составлена схема регуляции биосинтеза ароматических аминокислот у бактерий М.шсоЕепеэ М75 (рис.2).

Рис. 2. Схема регуляции синтеза ароматических аминокислот у

М-шисо^епез 1,175. Примечания: - ретроингиОирование;

- репрессия; цифрами обозначены ферменты: 1 -ДАГФ-синтаза; 2 - хоризматмутаза; 3 - префенатдегидра-таза; 4 - антранилат-синтаза; 5 - фосфорибозилтрано-фераза; б - индол-3-глицерофосфат-синтаза; ФЭП - фос-фоенолпируват; Эр-4-Ф - эритрозо-4-фосфат.

ФЭП

Эр-4-Ф

+

6. Получение и характеристика регуляторных мутантов М.шсогепез КГ75, продуцирующих триптофан

В результате ступенчатого мутагенеза были получены регудя-торные мутанты М.тисоеепеэ М75, устойчивые к токсическому аналогу триптофана - 5-метилтриптофану (5МТ) и продуцирующие до 40 мг/л триптофана.

С целью выяснения причин сверхсинтеза триптофана клетками регуляторных мутантов были изучены активности ДАГФ-синтазы и ин-дол-З-глицерофосфат-синтазы^у двух наиболее продуктивных мутантов - М31 и М62. Активность ДАГФ-синтааы у этих штаммов по сравнению с диким типом не изменилась, тогда как возрастание активности ин-дол-3-глицерофосфат-синтазы в 2 раза свидетельствовало о дерен-рессии ее синтеза. Кроме того, показано, что продукция триптофана у этих мутантов связана со снятием ретроингибирования ДАГФ-синтезы. При этом чувствительность фермента к ингибирующему действию фенилаланина и тирозина была снижена на 307., а к триптофану полностью отсутствовала (табл.7). Полученные регуляторные мутанты мо-

Таблица ?

Ретроингибирование активности ДАГФ- синтазы у Б-МТк-мутантов М.тасс^елез КГ?5

Ингибиторы (0,5 пМ) •

Ингибирование (%)

дикий тип 1

М31

М32

фенилаланин тирозин триптофан антранилат

68 35 40 45

25 20 О 20

26 9 О

Я

гут быть использованы для ступенчатой селекции высокоэффективных продуцентов- данной аминокислоты.

ВЫВОДЫ

1. Изолирован и описан новый штамм облигатных метилотрофных бактерий, который может быть использован как перспективный обьект в области биотехнологии. Наряду о общими для бактерий рода Methylobacillus свойствами (короткие грамотрицательные палочки, не образующее спор, растущие только на одноуглеродных субстратах, ассимилируемых рибулозомонофосфатным путем; J3 составе клеток присутствуют фосфолипиды I группы; в жирнокислотном составе преобладают пальмитиновая и пальмитолеиновая кислоты; обладают системой убихинояов типа Q-8; молярное содержание ГЦ в ДНК 50-55%), у бактерий изучаемого штамма выявлен ряд существенных отличий: перит-рихиальное лгутикование, низкий температурный оптимум (28-30°С), образование Г-лыиого количества слизи, содержащей полисахаридный компонент (галактоза, фруктоза, • глюкоза), соотношение пальмитиновой и паяьмитолешовой кислот в клетках 2:1, что позволило отнести штамм к самостоятельному виду Methylobacillus mucogenes И75.

2. При изучении путей метаболизма метанола М.mucogenes Ki75 показано, что бактерии обладают высокими активностями 3-гексуло-эофосфат-синтазы, гдюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы, гликозофосфатизомеразы и 2-кето-3-дегокси-б-фос~ фоглюконатальдолазы, что свидетельствует об использовании ими типичного для облигатных метилотрофных бактерий кетодезоксифосфог-люконатальдолазного варианта рибулозомонофосфатного пути.

3. С учетом особенностей метаболизма бактерий М.mucogenes М75 разработана оригинальная методика получения и идентификации ауксотрофных и регулпторных мутантов. Идентифицированы ауксотроф-ные мутации в генах trpE, trpD, trpF, trpA, trpß, а такие pheA и tyrA. Создана коллекция ауксотрофных по ароматическим амшгокисло-там мутантов.

4. Установлено, что регуляция шикиматного пути у бактерий М.шисовепез М75 осуществляется о помощью ретроингибировання ДАГФ-синтазы фенилаланином, тирозином и триптофаном. Репрессии синтеза данного фермента не зарегистрировано. Показало, что ДАГФ-сингаза состоит их трех иэоферментов: ДАГФС-tFhei, ДАГФС- С Туг] и ДАГФС- СТгрЗ, причем доминантным среди них является ДАГФС-tPhei, на долго которого приходится 55Х общей активности

фермента.

5. Изучен биосинтез фенилалаяина и тирозина у бактерий М.ти-содепеБ М75. Зарегистрирована репрессия синтеза коризыашутази и префенатдегидратазы тирозином, а таюке ретроингибирование префе-натдегидратазы фенилаланином.

6. При исследовании регуляции биосинтеза триптофана установлено, что она осуществляется на уровне репрессии генов ЬгрЕ, 1гр0 и 1грС триптофаном, а также с помощью ретроингибирования антршш-лат-синтазы. 507.-ное ингибирование фермента наблюдается, при концентрации триптофана в реакционной смеси 10_4тМ.

7. Получена серия аналогрезистентных мутантов Ы.тисодепеэ М75, устойчивых к 5-метилтриптофану, у которых установлена дереп-рессия синтеза индол-3-глицерофосфат-синтазы и снятие ретроинги-бирования ДАГФ-синтазы. Среди мутантов отобран штамм М31, характеризующийся повышенной продукцией триптофана (до 40 мг/л), на основе которого путем ступенчатой'селекции может быть сконструирован высокоэффективный продуцент данной аминокислоты.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. ДоброАинецкая Е.В. Регуляция биосинтеза фенидаланика у облигатных метилотрофных ЫеЧЬу1оЬасШиз 1,(75// Проблемы современной биологии. - М.: Изд. МГУ, 1988.- С. 53-56.

2. Максимова Н.П., Доброжинецкая Е.В., Фомичев Ю.К. Регуляция биосинтеза фенилаланина у облигатного метилотрофа МеМ>у1оЬа-сШиз М75// Молек. генетика, микробиол. и вирусол.- 1990.- N10.-С.25-28.

3. Доброжинецкая Е.В., Максимова Н.П..Характеристика нового облигатного метилотрофа МегМ1у1оЬасШиз М75// Вести. ЕГУ. Сер.?.. - 1994.- N3.- С.32-36.

4. Доброжинецкая Е.В., Щербз Б.В., Максимова Н.П. Использование бактерий МеЬЬу1оЬасШи5 шисодепез КГБ для утилизации метанола-'/ Биотехнология.- 1995.- и 5-6.- С.30-32.

РЕЗЮМЕ

ьяенз Валерьевна Доброжинецкая "Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у облигатных метилотрофных бактерий Ме^уХоЬасШиэ тисовепеэ М75"

Ключевке слова: биосинтез, ароматические аминокислоты, ферменты, репрессия, ретрогагибирование, продукция, триптофан, фенилала-нин, тирозин, метанол, утилизация.

Изучена регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у об-, лигатиьк метилотрофных бактерий Ме1Ьу1оЬао111из тисо^епеэ >,175. Исппльрованы генетические, биохимические и микробиологические методы исследования. Представлены физиолого-биохимическая характеристика п биотехнологические показатели данных бактерий. Разработана методика получения мутантов у облигатных метилотрофных бактерии, с пег -льзованием которой создана коллекция ауксотрофных и регуляторных мутантов. Идентифицированы мутации в генах <:грЕ, ЬгрО, ЬгрГ, 1грА, 1:грВ, 1угД я рЬеА. Установлено, что ДАГФ-сиита-за М. гписгаг епег М75 регулируется посредством ретроиигибирования фенилалашшом, тирозином и триптофаном, хернзматмутаза - путем репрессии синтеза тирозином, а префенатдегвдрзтаэз - путем репрессии синтеза тирозином и ретроиигибирования феиилаланином. Получены и охарактеризованы регуляторные мутанты, продуцирукшще триптофан.

Результаты, представленные в работе, создаст базу для биог-ехнологической разработки на основе бактерий М.тисоцепез Ш5 тест-спстеш для определения метанола в среде, а также эффективных методов разложения этого соединения. Полученные регуляторные мутанты являются исходным материалом для направленного конструирования штаммов-продуцентов триптофана и белка одноклеточкых, обогащенного этой аминокислотой.

РЭЗЮМЗ

Алена Валер' еуна Дабражынецкая "Рэгудяцш бшохнтззу араыатычных ам1нак1слот у абл1гатных метылатрофных бактэрый Ме1Ьу1оЬаоШиз тисо^епез М?5"

Ключавыя слоеы: б!ясз.нтэз, араматычныя амшакх слоты, ферменты, рэпрэс1я, рэтраз.нг1б1раванне, прадукцыя, трыптафан, фен1лапан1н, тыраэ!н, метанол, утыл1зацин.

Даследавана рэгуляцыя (Нясхнтэзу араматычных ам1нак1слот у аблхгатных метылатрофных бактэрый Ме1Ьу1сЬаоИ1из шисо^епез \Х7Ъ. Выкараотаны генетычныя, б1ях1м1чныя г мшраб1ялаг1чныя метады даследаванняу. Прадотаулены ф!э1елага-б1яхш1чныя характеристик! гатых бактэрый 1 С1итэхнадаг1чныл пакааальнжх. Раслрацавана методика атрымання мутантау абл1гатных метылатрофных бактэрый, а дапамогай якой зроблена калекцыя мутантау дадзенай групы бактэрый. Устаноулена, что ДАГФ-сантаза гэтых бактэрый рэгулюецца ва кошт рэтрах нг1б1 равання фенхладаншам, тыраз1нам х трыптафанаы, харызматмутаза - шляхам рэпрэсП схнтэау тыраз1нам, а прэфенатдэ-Идратаза - шляхам рзпрзсН сннтэзу тыразхнам 1 рэтра1нг1б1раван-ня фенхлалашнвм. Атрыманы 1 ахарактзрЫзаваны рэгуляториыя мутанты М.шисо^епез М?5, вдольныя да прадукцЕй трыптафана.

Прадстауленыя у дыаертацых рэзультаты з'яуляюода асновай для прамысловай распрацоук1 на базе штама М.тисоеепез М75 таот-сштэ-мы для выяулення ыенанолу у асяродда1, а таксама эфектыуных мета-дау утьшзащл гэтага злучэння. Атрыманыя у рабоце рэгуляторныя мутанты э' яулшоцца першапачатковым матэрыялам для мэтанаюрааана-га канструявання штамау-прадуцэнтау трыптафана 1 бялку аднакле-тачных, узбагачаных гэтай атнак!слатой.

summary

Elena Valerjevna Dobrozhinetskaya "Regulation of aromatic

amino aoids biosynthesis by obligate methylotrophic bacteria Methylobaoillus mucogenes W75"

Key words: biosynthesis, aranatic amino acids, enzymes, repression, feedback inhibition, production, tryptophan, phenyalani-ne, tyrosine, methanole, utilization.

The regulation of aromatic amino aoids biosynthesis by obligate methylotrophic bacteria Mehtylobaoillus mucogenes N75 was investigated. Genetical, biochemical and microbiological methods were used. Physiological and biochemical characteristics and bio-technological indexes of this bacteria were presented. The mutants on trpE, trpD, trpF, trpA, trpB, tyrA and pheA genes were obtained. was shown that DAHP-synthase activity is inhibited by aromatic amino aoids, while the prephenate dehydratase activity is inhibited by phenylalanyne. Repression of chorismate mutase synthesis and prephenate dehydratase by tyrosine was detected. Regulatory mutant of M.mucogenes N75 were obtained. They are able to produce (40 mg/1) tryptophan into the growth medium.

The results of this work are the base for biotechnological use of this bacteria for indication of methanole in the different media and their destruction. Regulatory mutants of M.muoogeneg M75 can be used for obtaining of tryptophan-producing strains and single-cell protein, enriching of tryptophan.

Подписано к печати ££.09.1995 г. Фермат 60 84/16 Бумага тип. N 3.

Печать офсетная. Усд.печ.л. 1,1. Тираж 100 8КЗ. Заказ N-Бесплатно. Белгосуниверситет, 220050, Минск, пр. Ф.Скоринн, 4. Отпечатано на ротапринте Еелгосуниверситета. 220050, Минск, ул. Бобруйская, 7.