Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения

Мосин, Олег Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения"

На правах рукописи

МОСИН ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ, АМИНОКИСЛОТ И НУКЛЕОЗИДОВ, МЕЧЕННЫХ 2Н (Б) И 13С, С ВЫСОКИМИ СТЕПЕНЯМИ ИЗОТОПНОГО ОБОГАЩЕНИЯ.

03.00.23-Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва -1996

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, член корреспондент РАМН, В. И. ШВЕЦ, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Д. А. СКЛАДНЕВ.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Н. Ф. МЯСОЕДОВ. кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Б. М. ПОЛАНУЕР.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ

"ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛОК ".

Защита диссертации состоялась 24 мая 1996 г в 15.00 на заседании Диссертационного совета Д 063. 41. 01 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 187571, Москва, пр-т Вернадского, дом 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1.

Автореферат разослан___апреля 1996 г

Учёный секретарь Диссертационного Совета, Кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А. И. ЛЮТИК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами, в частности дейтерием 2Н (D) и углеродом 13С, которые незаменимы для разнопрофильных биомедицинских и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения клеточного метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС) с использованием стабильных изотопов.

Тенденции к применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие этих современных методов за последние годы позволило усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Зачастую для данных исследований необходимо, чтобы молекулы синтезируемых БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС с высокими степенями изотопного обогащения является очень актуальной задачей для современной биотехнологии и отечественной микробиологической промышленности. С развитием новых биотехнологических подходов в последнее время появилась возможность получать разнообразные стабильно меченные соединения за счёт биологической конверсии сравнительно дешёвых дейтерированных субстратов дейтерометанола и тяжёлой воды CD3OD/D2O в генетически сконструированных штаммах бактерий (О. В. Мосин, Д .А. Складнее). Однако подобные процессы редко применяются в биотехнологии из-за наличия ряда трудностей, связанных с клеточной адаптацией к тяжёлой воде (D2O).

Явление адаптации к тяжёлой воде интересно не только с научной точки зрения, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии. Вышеперечисленные данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным таксономическим родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium meihylicurn, облигатные

метилотрофные бактерии Methylobacillus flagellatum, галофильные бактерии Halobacterium halobium и бациллы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Настоящая работа выполнена на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках научно-технической программы "Наукоёмкие химические технологии ".

Целью данной работы была разработка методов биотехнологического получения молекул аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения.

Поскольку биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счёт конверсии тяжёлой воды к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, в рамках работы представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах содержащих тяжёлую воду для синтеза меченных целевых продуктов. Для этого были разработаны специальные биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации комплексного использования химических компонентов биомассы полученных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных производств по получению изотопно-меченных молекул БАС на их основе.

Научная новизна работы заключается в следующих

аспектах:

1. Предложен метод получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к максимальным концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде.

2.Показана перспективность использования суммарных химических компонентов биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных в результате многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для биосинтеза дейтерий-меченных молекул аминокислот, белков и нуклеозидов.

3. Разработаны методы получения изотопно-меченных молекул БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с высокими концентрациями тяжёлой воды. Получены с высокими выходами индивидуальные дейтерий- и углерод-меченные 13С - аминокислоты (степени изотопного включения в молекулы составляют до 97,5% от общего количества атомов водорода в молекуле), [1,3',4',2,8-Б5]-инозин (степень включения дейтерия в молекулу 62,5% от общего количества атомов водорода в молекуле) и дейтерий-меченный бактериородопсин с селективным и униформным характером включения метки в молекулу.

4. Разработаны общие принципы масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения мультикомпонентных смесей аминокислот

при данном способе введения метки за счёт применения прямой обработки (дериватизации) культуральной жидкости и белковых гидролизатов дансилхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.

Практическая значимость: Полученные в работе результаты могут быть использованы для создания новых безотходных производств по синтезу изотопно-меченных молекул БАС. В частности, основанных на использовании биологической конверсии дешёвых меченных низкомолекулярных субстратов в дорогостоящие клеточные БАС.

На способ получения униформно-меченного дейтерием Ь-РЬе имеется положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче авторского свидетельства № 055610 от 17.11.1995 г на заявку № 930558240 от 15.12.1993 г. На способ получения [1 ,3 ,4 ,2,8-Б5]-инозина оформлена заявка № 95118778 от 14.11.1995 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Подбор условий получения биомассы штамма факультативных метилотрофных бактерий БгвуШаМегшт т^НуНсит с униформным характером обогащения клеточных БАС дейтерием. Использование гидролизатов дейтеро-биомассы данного штамма для биосинтеза дейтерий-меченного инозина и бактериородопсина.

2. Методы получения дейтерий- и С -аминокислот, [1 ,3 ,4,2,8-Б5]-инозина и бактериородопсина за счёт биологической конверсии дейтерометанола/13С метанола СБзОБ/13СНзОН и тяжёлой воды Б20.

3. Метод прямой химической модификации интактных культуральных жидкостей дансиллхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном. Применение данного метода для масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе мультикомпонентных смесей при данном способе введения изотопной метки в молекулы.

Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 3-м международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и их аналогам (Вена, август, 1993), на 4-й Всероссийской научной конференции " Проблемы теоретической и

экспериментальной химии"(Екатеринбург, апрель, 1994), 6-й международной конференции по ретинальным белкам (Ляйден, июнь, 1994), 7-м международном симпозиуме по генетике промышленных штаммов микроорганизмов (Монреаль, июль, 1994), 8-м международном симпозиуме по микробному росту на ^-соединениях (Сан-Диего, август, 1995), Евроазийском симпозиуме по современным направлениям в биотехнологии (Анкара, ноябрь, 1995).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано девять печатных работ и шесть тезисов научных конференций.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, выводов. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериал ьн ые штаммы и питательные среды.

Исследования проводили с генетически маркированными штаммами-продуцентами аминокислот, белков и нуклеозидов:

Штамм Ml. - Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652 (leu), штамм факультативных метилотрофных бактерий, продуцент L-фенилаланина.

Штамм M2. - Methylobacillus flagellatum КТ (ile), штамм облигатных метилотрофных бактерий, продуцент L-лейцина.

Штамм №3. - Bacillus subtilis (his, tyr, ade, ura), штамм граммотрицательиых бактерий, продуцент инозина.

Штамм №4. - Bacillus amyloliquefacien ade, ura), штамм грамм отрицательных бактерий, продуцент тимидина.

Штамм №5. - Halobacterium halobium ET 1001, пигментсодержащий штамм галофильных бактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

В настоящей работе использовали следующие питательные среды.

1. Минимальная среда М9 (Miller J., 1976). Среду использовали для ферментации штаммов №1 и №2 и выделения отдельных колоний.

2. Комплексная ферментационная среда (ФМ-среда) (Казаринова Л.А, 1980). Среду использовали для ферментации штаммов №3 и №4.

3. Синтетическая среда TS (Gibson Т., 1962). Среду использовали для ферментации штамма №5.

Условия адаптации и культивирования бактерий на

дейтерий-содержащих средах. Адаптацию клеток к дейтерию проводили на твёрдых агаризованных средах (2 %-ный агар), с тяжелой водой. При этом использовали как простой рассев культур до отдельных колоний на средах, приготовленных из 99,9 ат.% тяжёлой воды, так и многостадийную адаптацию бактерий на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды.

Для биосинтеза меченных БАС использовали среды тех же составов, приготовленные на основе тяжёлой воды и дейтерометанола D2О/СD3ОD с использованием безводных реагентов. Полученную таким образом биомассу В. mehylicum гидролизовали в DCI и использовали в качестве источника суммарных химических компонентов для культивирования штаммов №3 и №5 соответственно.

13С-аминокислоты были получены за счёт конверсии 13СН3ОН в метилотрофных бактериях.

Для введения дейтерия в молекулу бактериородопсина использовали селективную

синтетическую среду TS, в которой ароматические аминокислоты -L-Phe, L-Tyr и L-Тгр были замещены их дейтерированными аналогами - L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp.

Методы выделения и анализа изотопно-меченых БАС.

Экстракцию липидов проводили смесью хлороформ-метанол (2:1) по методу Блайера и Дайера (Bligh E.G, Dyer W.J, 1959).

Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом (Beyrich Т., 1965).

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 по методу Остерхельда и Стохениуса (Oesterhdt О., & Stohenius, 1976).

Гидролиз белка проводили с использованием 4 н. Ва(ОН): и 6 н. DC1 ( в D2О)(110°С,24ч).

Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали в ходе реакции Шоттена-Баумана (GreensteinJ., Winitz M., 1961).

Дансильные производные аминокислот получали по методу Греема и Хартли (GreemB., Hartly В, 1963).

Метиловые эфиры дансил-аминокислот получали по

методу Физера (Fiser J., 1963).

Аналитическое и препаративное разделение бензилоксикарбонильных производных аминокислот проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т.А., 1993).

Разделение метиловых эфиров дансил-аминокислот проводили на жидкостном хроматографе "К^^г" (ФРГ), снабженным УФ-детектором "2563" и интегратором "C-R ЗА" (Shirnadzu, Япония). Неподвижная фаза: Separon SGX С 18,1 мкм, 150 х 3,3 мм (Kova, Чехословакия). Использовали градиентное элюирование растворителями:

(A) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и

(B) - ацетонитрил (от 20% В до 100% В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин),

Ионнообменную хроматографию проводили па приборе "Biotronic LC 500!" (ФРГ), 230x3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч, детекция при 570 нм и 440 нм.

Масс-спектры электронного удара получены на приборе "МВ-80А " (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Масс-спектры FAB были получены на приборе " MBA " (Hitachi, Япония) при ионном токе 0,6-0,8 мА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ БАС, АДАПТИРОВАННЫХ К РОСТУ И БИОСИНТЕЗУ НА СРЕДАХ С

МАКСИМАЛЬНЫМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ ТЯЖЁЛОЙ ВОДЫ.

Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum. В связи с важностью препаративного аспекта получения дейтерий-меченных соединений в рамках данной работы была изучена возможность адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту на средах с максимальными концентрациями тяжелой воды (D2O). Для этого были проверены представители различных таксономических групп метилотрофных бактерий, имеющихся в коллекции ГосНИИ Генетики: L-лейцин-продуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum (ileu), реализующий 2-кето-3-дезокси-6-фосфогдюконат-альдолазный (КДФГ) вариант рибулёзо-5- монофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода и L-фенилаланин-продуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum (leu), ассимилирующий метанол по РМФ- циклу.

Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации тяжёлой воды в ростовых средах, так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к тяжёлой воде будет оказывать благоприятный эффект на скорость роста культуры. При этом штамм М. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование роста бактерий наблюдалось при концентрациях D2О в среде 74,5 об.%. Роста бактерий на более высокой концентрации тяжёлой воды достичь не удалось. В связи с этим, в экспериментах по изучению уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали препараты культуральной жидкости и биомассы М. flagellatum, полученные со среды, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Концентрация экзогенного дейтерометанола CD3OD составляла, как обычно, 1 об.%.

Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum. Попытки адаптировать штамм В. methylicum к росту при сохранении способности к биосинтезу L-фенилаланина на максимально дейтерированной среде привели к желаемому результату. К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специально разработанный нами подход по адаптации, который заключался в серии из пяти адаптационных пассажей исходной культуры на агаризованных средах (с добавкой 2 об. % дейтерометанолом CD3OD) при ступенчатом увеличении концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 0; 24,5; 49,0;

73,5 об% до 98 об% D2O) и последующей селекции устойчивых к тяжёлой воде клонов бактерий. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих тяжёлую воду. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированности, включая среду с 98 об.% тяжёлой водой (степень выживаемости бактерий на конечной полностью дейтерированной среде составляет не более 40%).

Полученный результат в опытах по адаптации В. methylicum к тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты его биомассы, а также саму биомассу, полученную в ходе многоступенчатой адаптации к D2O в качестве полноценных ростовых субстратов для выращивания бациллярных штаммов В. subtillis и В. amytoliquefaciens, а также штамма галофильных бактерий Н. halobium ET1001.

Адаптация бацилл В. subtittis и В. amyloliqucfaciens. В следующих опытах была исследована способность к росту на тяжёлой воде бациллярных штаммов В. subtillis (his, tyr, ade, ига), и В. amyloliquefaciens (ade, ига), продуцентов инозина и тимидина, соответственно. Мы предположили, что замедление роста бактерий на минимальных средах, содержащих тяжёлую воду могло быть обусловлено появлением ауксотрофности по отдельным ростовым факторам. Чтобы проверить это предположение, в дальнейшем мы использовали комплексные среды. Как и предполагалось, обе культуры удалось адаптировать к дейтерию путём рассева на твёрдые среды, приготовленные из 99,9 ат.% тяжёлой воды. Они сразу обнаружили нормальный рост на тяжёлой воде. У штаммов В. subtilis и В. amyloliquefaciens при росте на тяжёлой воде было отмечено сохранение высокого уровня продукции по инозину и тимидину (3,9 и 3,0 г/л соответственно).

Адаптация галофильных бактерий Н. halobium ET 1001. В случае с Н. halobium ET 1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% тяжёлую воду путём рассева штамма до отдельных колоний, так и на жидкой среде с тяжёлой водой. В обычных для этой бактерии условиях культивирования (37°С, на свету) в клетках синтезировался фиолетовый пигмент по всем характеристикам не отличающийся от нативного бактериородопсина.

2. ИЗУЧЕНИЕ РОСТА И БИОСИНТЕЗА БАС

ПОЛУЧЕННЫМИ ШТАММАМИ

Изучение ростовых характеристик М./lagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O, а также 13СНзОН. Данные по росту штамма М. flagellatum на минимальных средах с добавкой 1 об.% метанола СН3 ОН

и его меченных аналогов (СБзОБ/13СНзОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся

концентрации тяжёлой воды приведены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола - дейтеро-

13 13

метанол СБзОБ и С-метанол СИзОИ, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% тяжёлой водой выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол СНзОН (табл. 1, опыты 1,3,8). Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась лишь в среде, содержащей 74,5 об.% тяжёлой воды. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости роста бактерий.

Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост штамма M. flagellatum.

Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время

опыта лаг-фазы биомассы

генерации Н2О Б2О СНзОН СБзОБ часы % ч

1 99,0 0 1,0 0 0 100 1,1

2 99,0 0 0,5 0,5 0,2 91,0 0,8

3 99,0 0 0 1,0 0,8 81,0 1,0

4 49,5 49,5 1,0 0 2,4 76,0 1,4

5 49,5 49,5 0,5 0,5 5,7 75,0 1,2

6 49,5 49,5 0 1,0 6,7 70,0 1,3

7 24,5 74,5 1,0 0 5,6 29,0 1,4

8 99,0 0 1,0 13СНзО 0 0,1 72,0 1,0

Как и следует из литературных данных (Складнее Д. А, 1990), введение стабильного изотопа углерода 13С не приводит к летальным последствиям для клетки, что мы и наблюдали в случае с М. flage/talum. В целом, полученные для М. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями их метаболизма. Кроме этого, из таблицы 1 следует, что данный подход можно эффективно использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (дейтерий- и изотоп углерода 13С).

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик Б. те^уНеит на средах, содержащих СИ3ОИ/СВ3ОВ и Б2О. Данные по росту исходного и адаптированного к тяжёлой воде штамма В. те^уНеит и максимальному уровню накопления Ь-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% метанола и его дейтерированного аналога СН3ОН/СБ3ОБ, содержащих ступенчато

увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2.

Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (см. табл. 2, опыт 1). С увеличением концентрации тяжёлой воды в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% тяжелой водой и 2 об.% СБ3ОБ (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).

Таблица 2.

Влияние изотопного состава среды на рост штамма В. methylicum и уровень накопления Ь-фенилаланина в культуральной жидкости*.

Номер Компоненты среды, об% лаг-фаза Выход Время Выход опыта биомассы генер. Ь-РИе, Н2 О Б2О СН3ОН СБ3ОБ ч % ч

1 98 0 2 0 24,0 100 2,2 100

2 98 0 0 2 30,3 92,3 2,4 99,1

3 73,5 24,5 2 0 32,1 90,6 2,4 96,3

4 73,5 24,5 0 2 34,7 85,9 2,6 97,1

5 49,0 49,0 2 0 40,5 70,1 3,0 98,0

6 49,0 49,0 0 2 44,2 60,5 3,2 98,8

7 24,5 73,5 2 0 45,8 56,4 3,5 90,4

8 24,5 73,5 0 2 49,0 47,2 3,8 87,6

9 0 98,0 2 0 60,5 32,9 4,4 79,5

10 0 98,0 0 2 64,4 30,1 4,9 71,5

10' 0 98,0 0 2 39,9 87,2 2,9 95,0

'Данные (1-10) приведены для В. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия. Данные 10' приведены для адаптированного В. methylicum.

Как видно из табл. 2, опыт 2, дейтерометанол СБ3ОБ не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выход микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% тяжёлой водой микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и 2 об.% дейтерометанола СБзОБ, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза по-сравнению с контролем. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления Ь-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к тяжёлой воде штамма В. inethylicum в полностью дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 12,8% и 5% соответственно (табл. 2, опыт 10').

За счёт использования данного штамма В. methylicum

удалось выделить порядка 1 г Ь-РЬе из 1 л среды.

Исследование биосинтеза Ь-фенилаланина

штаммом В. те(куНеит. Общей особенностью биосинтеза

Ь-РЬе в протонированных средах было значительное

увеличение его продукции на ранней фазе экспоненциального

роста В. те(куИеит, когда выход микробной биомассы был

незначителен (рис. 1).

Накопление Ь-РЬе в КЖ г/л

20 40 60 80 ЮО

Время культивирования, ч

Рис. 1. Динамики роста В. те(куНеит (1а, 10'а, 10а) и накопления Ь-РЬе в культуральной жидкости (16, 10'б, 106) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б - исходный микроорганизм на протонированной среде М9; 10' а, б -адаптированный В. теМуНеит на полностью дейтерированной среде; 10 а,б - еадаптированный микроорганизм на полностью дейтерированной среде.

Во всех изотопных экспериментах наблюдалось ингибирование биосинтеза Ь-фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов, наблюдаемый характер динамики секреции Ь-РЬе не коррелировал с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции.

Скорее всего, накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза, что отмечено в работах других авторов (Ворошилова Э. Б., Гусятипер М. М., 1989). Данные по исследованию культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) показали, что кроме Ь-фенилаланина данный штамм В. methylicum синтезирует и накапливает в культуральной жидкости другие метаболически-связанные аминокислоты (аланин, валин, лейцин, изолейцин), четко детектируемые масс-спектрометрическим анализом (см. след, главу).

Изучение качественного и количественного состава внутриклеточных сахаров В. subtilis. В ходе выполнения работы был изучен качественный и количественный состав внутриклеточных сахаров при росте В. subtilis на среде с 99,9 ат.% тяжёлой воды (см. табл. 3). Как видно из таблицы 3, в гидролизатах биомассы данного штамма фиксируются глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза, сахароза и мальтоза. Содержание внутриклеточных сахаров при росте на тяжёлой воде меняется незначительно, за исключением лишь сахарозы , которая в дейтерированном образце не детектируется.

Таблица 3.

Качественный и количественный состав внутриклеточных Сахаров В. subtШs при росте на 99,9 %тяжёлой воде.

Компонент Содержание в биомассе, % Рост на Н2О Рост на 99,9% D2O

Глюкоза 20,01 21,40

Фруктоза 6,12 6,82

Рамноза 2,91 3,47

арабиноза 3,26 3,69

Мальтоза 15,30 11,62

Сахароза 8,62 -

Изучение аминокислотного состава биомассы метилотрофных бактерий В. methylicum

Аминокислотный состав суммарных белков биомассы В. methylicum, полученного в ходе многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде показан в таблице 4. Результаты исследования показали небольшое снижение содержания в дейтерированном белке Ala, Leu и ffis по сравнению с белком, полученным на обычной воде, что может быть объяснено метаболическим воздействием тяжёлой воды на биосинтез (табл. 4).

Таблица 4.

Качественный и количественный состав аминокислот общих белков биомассы В. methylicum.

Аминокислота Содержание в белке, % Рост на Н2О Рост на 98% Б20

01у 8,03 9,69

А1а 12,95 13,98

Уа1 3,54 3,74

Ьеи 8,62 7,33

4,14 3,64

РИе 3,88 3,94

Туг 1,56 1,82

Азр 7,88 9,59

01и 11,68 10,38

Ьу8 4,37 3,98

3,43 3,72

ТИг 4,81 5,51

Ме1 4,94 2,25

А^ 4,67 5,27

Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. subtilis на средах, содержащих тяжёлую воду и гидролизаты метилотрофных бактерий. Кривые, отражающие динамику роста, ассимиляции глюкозы и накопление инозина в культуральной жидкости штаммом В. subtilis в условиях протонированной среды и среды, с 99,9 ат.% тяжёлой воды представлены на рис. 2.

Как видно из рис. 2, при переносе клеток со стандартной на дейтерированную среду выход микробной биомассы, продолжительность лаг-фазы и длительность времени клеточной генерации в целом изменяются незначительно. При росте исходного штамма В. subtilis на среде, содержащей обычную воду уровень накопления инозина в культуральной жидкости достигал величины 17,3 г/л после пяти суток культивирования (рис. 2). Уровень накопления инозина на дейтерированной среде был снижен в 4,4 раза по-сравнению с исходным штаммом на протонированной среде (рис. 2). Низкие уровни секреции инозина на дейтерированной среде коррелируют со степенью конверсии глюкозы в этих условиях. Так, кривая конверсии глюкозы на полностью дейтерированной среде имела меньший угол наклона, чем на среде с обычной водой, что свидетельствует о том, что при росте на дейтерированной среде скорость ассимилиляции глюкозы несколько замедляется (рис. 2).

Накопление инозина в 1QK, г/л

20 н

Конверсия глюкозы, г/л

120"

Титр клеток, кл/мл

20 40 60 80 100

Время культивирования, ч

Рис.2. Динамики роста B.subtilis (1a, 2a), конверсии глюкозы

(1б,2б) и накопления инозина в культуральной жидкости (1в,2в) на средах с различным изотопным составом: 1 а,б,в-В. subtilis на обычной протонированной среде; 2 а, б, в-B.subtilis

на полностью дейтерированной среде с гидролизатом дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий.

Полученные для исследуемых микроорганизмов данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация клетки к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к тяжёлой воде клетки возвращаются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время обратимость роста на D2O/H2O-cpeдax теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в тяжёлой воде, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. Можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют функциональной реорганизации работы ферментных систем в тяжёлой воде. Также не исключено, что наблюдаемые при адаптации эффекты связаны с образованием в тяжёлой воде более прочных и стабильных связей, чем связей с участием водорода. По теории абсолютных скоростей разрыв С-Н-связей может происходить быстрее, чем C-D-связей, подвижность дейтерия D+ меньше, чем подвижность протия Н+, константа ионизации D2O в 5 раз меньше константы ионизации Н2О (Crespy J., Kalz H.H., 1979). С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене протия на дейтерий могут оказаться аппарат биосинтеза

макромолекул и дыхательная цепь, т. е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей.

3. ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНЕЙ ВКЛЮЧЕНИЯ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ и УГЛЕРОДА 13С в МОЛЕКУЛЫ ЭКЗОГЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ B. methylicum и М.

flagellatum.

Получение лиофилизованных препаратов культуральных жидкостей, содержащих экзогенные дейтерий - и 13С-аминокислоты. Дейтерий-меченные аминокислоты были выделены в составе препаратов лиофилизованных интактных культуральных жидкостей, свободных от белков и полисахаридов, при росте штамма В. methylicum на минимальных средах с добавкой 2 об% метанола СНзОН и с различным содержанием тяжёлой воды. 1 С-аминокислоты были получены за счет культивирования штамма М. flagellatum на среде, содержащей обычную воду и

1 об% 13С -метанол 13СНзОН. Данные по степеням включения дейтерия и 13С в молекулы экзогенных аминокислот двух исследуемых штаммов приведены в таблице 5. Во всех анализируемых образцах культуральной жидкости независимо от рода штаммов методом масс-спектрометрии электронного удара были обнаружены аланин, валин, лейцин/изолейцин и фенилаланин (табл. 5). В масс-спектрах дериватизованной культуральпой жидкости M. flagellatum в дополнение к вышеобозначенным аминокислотам также фиксировался глицин.

Получение метиловых эфиров дансил-и карбобензокси-производных аминокислот. Степени включения изотопов дейтерия и мзотопа углерода 13С в мультикомпонептные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом высокочувствительной масс-спектромстрии электронного удара метиловых эфиров БпБ-аминокислот или в виде 2-производных аминокислот после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ОФ ВЭЖХ.

Аналитическое и препаративное разделение 2-производных аминокислот проводили методом ОФ ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т. А., 1993). Степени хроматографической чистоты выделенных из культуральных жидкостей В. methylicum и М. flagellatum 2-й

Ош-производных дейтерий- и С-аминокислот составили 9395%, а выходы 65-87% соответственно.

Рис.3. Фрагментация производных аминокислот. а) метиловый эфир дансилфениалаланина; б) карбобензоксифениаланин

Предложенная нами модификация метода получения производных аминокислот заключалась в прямой химической обработке препаратов культуральной жидкости, полученной после отделения клеток, БпвО (и 2С1) и СК2И2. Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении опбс1 (2С1) -аминокислота, равным 5:1 (см. схему ниже).

Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с моно-производными было характерно образование ди-2-(Бпв)-производных: ди-2,(Бпв)-лизина, ди-2,(Бпв)-гистидина, О,К-ди-2,(Бпв5)-тирозина, О,К-ди-2,(БпБ)-серииа, 0,К-ЛИ-2,(Бп8)-Треонина и К,Б-ди-2,(БпБ)-цистеина (на схеме эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-2,(Впв)-аргинин.

4 н. NiiOH

RCI + H2N—СН—СООН —--— R—HN—СН —СООН (схема)

Ri -HCl 'ri

где R=

(HjC)aN

Rl=aминoкиcлoтный радикал

I— CHr

-со

Летучесть Dns-и Z-производных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана в качестве этерифицирующего реагента был связан с необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих обратный изотопный (H-D- обмен в ароматических аминокислотах. При использовании диазометана происходило дополнительное N-метилирование по a-NH2 rpynne аминокислот, в результате чего в масс-спектрах метиловых производных аминокислот фиксировались дополнительные пики, соответствующие соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных.

Исследование степеней включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина В. methylicum, полученного со сред с тяжёлой водой. Как видно из данных таблицы 2, рост данного штамма метилотрофных бактерий на средах с возрастающими концентрациями тяжёлой воды сопровождался снижением уровней накопления клеточной биомассы, увеличением времени генерации бактерий и продолжительности лаг-фазы при сохранении способности синтезировать и накапливать L-фенилаланин в ростовой среде. Поэтому было интересно изучить, как изменяются степени включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина и других аминокислот В. methylicum в этих условиях.

Во всех опытах наблюдалось специфичное возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при ступенчатом увеличении концентраций тяжёлой воды в ростовой среде (табл. 5). Так, для индивидуальных аминокислот культуральной жидкости В. melhylicum, количество включённых атомов дейтерия по скелету молекул варьирует в пределах 49%-ной концентрации D2O и составляет для Phe 27,5%, Ala -37,5%, Val - 46,3%, Leu/Ile - 47% (табл. 5). Аналогичное увеличение молекулярной массы аминокислот в зависимости от концентрации тяжёлой воды в среде было зафиксировано во всех экспериментах.

Таблица 5.

Степени включения дейтерия- и изотопа углерода С в молекулы секретируемых аминокислот В. melhylicum* и

M. flagellatum **.

Аминокислоты Содержание :Н2О в среде, об% 24,5 49,0 73,5 13СН3ОН 1 %

Gly - - - - 60,0

Ala 24,0 37,5 62,5 77,5 35,0

Val 20,0 46,3 43,8 58,8 50,0

Leu/Ile 15,0 47,0 46,0 51,0 38,0

Phe 15,0 27,5 51,3 75,0 95,0

* Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. methyticum при росте на средах, содержащих 2 об.%

СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O. **Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СНзОН и 99 об.% Н2О.

Исследование степеней включения дейтерия в сопутствующие аминокислоты В. meihylicum на средах с тяжёлой водой. В масс-спектрах всех исследуемых образцов культуральной жидкости B. methylicum кроме основной секретируемой аминокислоты (фенилаланин) были обнаружены примеси, метаболически с ней связанных аланина, валина и лейцина/изолейцина {на уровне 3-5 мМ). В опыте, где концентрация тяжёлой воды в среде составила 49 об.% (таблица 5, опыт 5), изотопный состав фснилаланина характеризовался увеличением молекулярной массы на 4,1 единицу, аланина на 2,5 единицы, валина - 3,5 единицы, а лейцина/изолейцина - на 4,6 единиц. Таким образом, в отличии от фенилаланина, количество включенного дейтерия в последних трех аминокислотах сохраняет стабильное постоянство в довольно широком интервале концентраций экзогенной тяжёлой воды (от 49 об.% до 98 об.%).

В связи с тем, что штамм - продуцент фенилаланина В. methylicum был ауксотрофом по лейцину, эту аминокислоту в немеченном виде добавляли в ростовую среду, содержащую 98 об.% тяжёлой воды. Как показали наши исследования по включению дейтерия к молекулы экзогенных аминокислот, в условиях ауксотрофности по лейцину степень изотопного обогащения лейцина, а также метаболически связанных с ним аминокислот немного ниже, чем для других аминокислот. Так, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды и немеченный L-Leu, степени включения дейтерия в Leu составили 51,0%, Ala -77,5%, Val - 58,8% (табл. 5). Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о сохранении минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом лейцина de novo. Другим логическим объяснением наблюдаемого эффекта может быть ассимиляция клеткой немеченного лейцина из среды на фоне биосинтеза меченного изолейцина de novo.

Исследование степеней включения дейтерия в L-Phe В. methylicum в максимально дейтерированной среде. Мы предположили, что за счёт ауксотрофности штамма В. methylicum по лейцину, уровни включения дейтерия в секретируемыи фенилаланин на фоне максимальных концентраций тяжёлой воды могут быть ниже теоретически допустимых вследствие

функционирования в клетке ряда биохимических реакций, связанных с ассимиляцией протонированного лейцина

извне. Как мы и ожидали, отмеченная особенность лучше всего проявлялась при биосинтезе фенилаланина на дейтерированной среде, в которой единственным протонированным соединением, кроме метанола, являлся лейцин (см. табл. 5, опыт 9). В этом опыте степень дейтерированности L-фенилаланина составила 75%, т.е. только шесть атомов (из восьми в углеродном скелете) в молекуле фенилаланина биосинтетически замещены на дейтерий. Согласно данным масс-спектрометрического анализа, атомы дейтерия распределены по положениям Ci-C6 ароматической части фенилаланина и сопредельному положению ß, причем, как миниум четыре из них могут быть локализованы в самом бензольном кольце молекулы фенилаланина. Результат по получению L-Phe с данным характером включения метки очень важен для биотехнологического использования и имеет существенные преимущества по-сравнению с химическим (Н-О)-обменом (Griffiths D. V., 1986).

Исследование степени включения дейтерия в молекулу фенилаланина за счёт конверсии дейтерометанола CD3OD в В. methylicum.

Контроль за включением дейтерия в молекулу L-Phe за счет конверсии дейтерометанола CD3OD при росте бактерий на среде, содержащей обычную воду и 2 об.% дейтерометанол CD3OD (соответствуют опыту 2, табл. 1) показал незначительное количество дейтерия, которое поступает в молекулу L-фенилаланина вместе с углеродом CD3OD, Процент дейтерирования фенилаланина был вычислен по величине пика с m/z 413 за вычетом вклада пика примеси природного изотопа (не более 4%). Полученный результат может быть объяснён разбавлением дейтериевой метки за счёт протекания как биохимических процессов, связанных с распадом дейтерометанола CD3OD при его ассимиляции клеткой, так и реакциями изотопного обмена и диссоциации в тяжёлой воде. Так, из четырёх атомов дейтерия, имеющихся в молекуле CD3OD, лишь один атом дейтерия при гидроксильной группе -OD самый подвижный и поэтому легко диссоциирует в водной среде с образованием CD3OH. Три оставшихся атома дейтерия в составе CD3OH входят в цикл ферментативного окисления метанола, который, в свою очередь, мог привести к потере дейтериевой метки за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. В частности, такое включение дейтерия в молекулу L-фенилаланина подтверждает классическую схему ферментативного окисления метанола до формальдегида в клетках метилотрофов, который лишь после этого ассимилируется у данного штамма метилотрофных бактерий РМФ-путем фиксации углерода (Nesvera J., 1991).

Исследование степеней включения изотопа углерода 13С в молекулы экзогенных аминокислот М. flagellatum за

счёт биоконверсии 13СНзОН.

Наши исследования подтвердили, что для получения 13С-аминокислот за счет микробной конверсии 13СНзОН предварительная адаптация не является лимитирующим этапом, поскольку этот., субстрат не оказывает негативного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические характеристики метилотрофов. При росте М. flagellatum на среде, содержащей 99 об.% воду и 1 об.% 13СНзОН клетка продуцирует лейцин, a также глицин, аланин, валин и фенилаланин. Как видно из таблицы 5, уровни изотопного включения 13С в Gly, Ala, Val и Phe составляют 60, 35, 50 и 95% соответственно. При этом низкая степень включения изотопа углерода 13С в метаболически связанные с изолейцином аминокислоты обусловлена эффектом ауксотрофиости бактерий в изолейцине, который добавляли в ростовую среду в немеченном виде.

4. ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНЕЙ ВКЛЮЧЕНИЯ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ и УГЛЕРОДА 13С в АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ СУММАРНЫХ БЕЛКОВ M. methylicum и М. flagellatum.

Выделение дейтерий- и 1 С-аминокислот из белковых

гидролизатов. Поскольку при работе с микробной биомассой возникают проблемы, связанные с очисткой от сопутствующих компонентов, было необходимо применять специальные подходы при выделении фракции суммарных белков из бактериальных источников.

При выделении фракции суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий (В. methylicum, M. flagellatum) учитывалось наличие в них углеводов. Мы использовали богатые по белку штаммы бактерий со сравнительно небольшим содержанием углеводов в них, гидролизу в качестве фракции суммарных белков подвергали остаток после исчерпывающего отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями (метанол-хлороформ-ацетон}.

Во всех случаях гидролиз белков проводили в 6 н. растворе DC1 (3 масс.% фенола в D2O) или в 4 н. растворе Ва(ОН):для предотвращения реакций обратного изотопного обмена (H-D) в ароматических аминокислотах и их разрушения.

Дейтерий- и С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов суммарного белка биомассы были разделены методом ОФ ВЭЖХ со степенью хроматографической чистоты 93-96% и выходами 75-89% в условиях, аналогичных таковым для разделения секретируемых аминокислот (табл. 6). Хотя в таблице 6 приведены данные только для 10 аминокислот, очевидно, что в остальных аминокислотах уровни изотопного включения сопоставимы, хотя они не детектируются данным методом. Это предположение подтверждается

данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методом ионнообменной хроматографии на колонке "Biotronic LC 5001", где детектируется уже 15 аминокислот (см. рис. 4).

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. methylicum па средах с

тяжёлой водой.

Общие принципы изучения степени изотопного обогащения молекул аминокислот при данном способе введения метки продемонстрированы на примере анализа включения дейтерия в мультикомпонентные смеси аминокислот, полученные после гидролиза суммарных белков биомассы в 6 н. DCl и 4 н. Ва(ОН).

Во всех -экспериментах по научению содержания дейтерия в аминокислотных остатках белка наблюдалась корреляция между степенью изотопного насыщения среды и уровнями включения дейтерия в аминокислоты (табл. 6), Например, для индивидуальных аминокислот белковых гидролизатов количество включенных атомов дейтерия по скелету молекулы варьирует незначительно в пределах 49%-ной концентрации тяжёлой воды и составляет для Ala 45%, Val - 36,3%, Leu/Ile - 42%, Phe -37,5%.

Таблица 6.

Степени включения Б и С в аминокислотные остатки общих белков биомассы В. теШуиеит* и М. flagellatum**.

Аминокислоты Содержание D2O в среде, об% 24,5 49,5 73,5 13СНзОН 1 об%

Gly 15,0 35,0 50,0 90,0 90,0

Ala 20,0 45,0 62,5 97,5 95,0

Val 15,0 36,3 50,0 50,0 50,0

Leu/lie 10,0 42,0 45,0 49,0 49,0

Phe 24,5 37,5 50,0 95,0 80,5

Туг 20,0 48,8 68,8 92,8 53,5

Ser 15,0 36,7 47,6 86,6 73,3

Asp 20,0 36,7 60,0 66,6 33,3

Glu 20,0 40,0 53,4 70,0 40,0

Lys 10,0 21,1 40,0 58,9 54,4

'Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. теШупеит при росте на средах, содержащих 2 об.% СНзОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% Б20. **Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О.

Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки белка В. теШуиеит на максимально дейтерированной среде. Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения дейтерия в аминокислотные остатки белков за счет адаптации

культуры В. melhyiicum к росту и биосинтезу на среде с максимальной концентрацией тяжёлой воды. Как видно из таблицы 6, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% тяжёлой воды, степени включения дейтерия в остатки Gly, Ala и Phe составляют 90, 97,5 и 95%, т.е. уровень мечения можно считать униформным. Низкие степени включения дейтерия в молекулы лейцина (49%), а также в метаболически связанных аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированной форме. Полученный результат по разбавлению дейтериевой метки в лейцине может быть объяснён сохранением доли минорных реакций в биосинтезе лейцина de novo.

Рис. 4. Хроматограмма гидролизата суммарных белков B. methylicum, полученных при росте бактерий на среде с 2 об.% СD3OD и 98 об.% D^. Неподвижная фаза: "Biotronic LC 5001", 230x3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; элюент: натрийцитратный буфер; скорость подачи буфера 18,5 мл/ч;

нингидрина 9,25 мл/ч. 1 - Asp; 2 - Thr; 3 - Ser; 4 - Glu; 5 Gly; 6 - Ala; 7 - Val; 8 -Met; 9 Ile; 10 - Leu; 11 - Tyr; 12 - Phe; 13 - His; 14 - Lys; 15 -

NH3; 16 - Arg.

Исследование степеней включения изотопа углерода I3C в аминокислотные остатки белка М. flagellatum за счёт биоконверсии 13СН3ОН.

В экспериментах по включению изотопа углерода С в молекулы белков за счёт биоконверсии 13СН3ОН метилотрофными бактериями М. flagellatum была показана эффективность мечения аминокислот изотопом

углерода 13С. Так, в Phe детектировалось 80,5 % метки, в Ala - 95 %, в Gly - 90% (см. табл. 6).

Во всех экспериментах степени включения дейтерия и изотопа углерода 13С в метаболически связанных аминокислотах обнаружили определённую коррелляцию. Так, степени изотопного обогащения валина и лейцина (семейство пирувата), фснилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот} совпадают (табл. 6). Степени изотопного включения глицина и серина (семейство серина), аспарагиповой кислоте и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Сравнивая данные таблицы 5 и 6, можно заключить, что степени изотопного обогащения экзогенных аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка, в целом, также коррелируют.

Как и в случае с экзогенными аминокислотами, низкие степени включения изотопа углерода 13С в остатки Leu при росте на 1 об.% 13СНзОН обусловлены ауксотрофностью бактерий в этой аминокислоте. Таким образом, нам удалось достичь максимальных уровней включения стабильных изотопов в суммарные белки биомассы метилотрофных бактерий. Именно поэтому мы посчитали возможным использовать гидролизаты их биомассы для биосинтеза других изотопно - меченных БАС.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГИДРОЛИЗАТОВ БИОМАССЫ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В. methyicum в

КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ [1,,3,,4,,2,8-Б5]-ИНОЗИНА.

Получение [1',3',4',2,8-D5]- инозина. В следующих экспериментах было апробировано использование дейтеро-компонентов биомассы метилотрофных бактерий B. methylicum, полученных в условиях многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для синтеза

высокодейтерированных нуклеозидов (на примере инозина). [Г,3',4',2,8-05]-инозин был получен биосинтетически за счёт использования штамма-продуцента В. subtilis и выделен из культуральной жидкости по методике, включающей адсорбцию инозина на активированном угле, десорбцию спиртово-аммиачным раствором и перекристаллизацию из метанола. ТСХ инозина, с детекцией при 249 нм показала наличие в анализируемом образце единственного пятна с Rf = 0,55, -соответствующего по подвижности чистому инозину.

Особенности разработанного метода получения [1',3',4',2,8-Б5]-инозина заключаются в следующих аспектах:

1. В способности высокоактивного штамма В. subtilis

к росту и биосинтезу инозина на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды;

2. Замене глюкозы и аминокислот, необходимых для роста этого штамма-ауксотрофа на гидролизаты дейтеро-биомассы В. methylicutn. При последующих ферментациях в качестве источника ростовых факторов можно использовать ту же дсйтеро-биомассу метилотрофных бактерий, либо биомассу самого штамма-продуцента, содержащую в своем составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых факторов;

3. В практически полном отсутствии отходов: согласно схеме, дейтеро-биомасса базового штамма, после гидролиза в 6 н. БС1 возвращается в цикл в качестве ростовых факторов;

4. В высокой степени изотопного обогащения дейтерий-мсченного инозина (62,5% атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий);

5. В высоких выходах (3,9 г/л) меченного продукта.

Рис. 5. Места локализации дейтерия в молекуле инозина

Исследование уровня дейтерированности инозина.

Места локализации дейтерия в молекуле инозина, были исследованы с помощью масс-спектрометрии FAB и спектроскопии ПМР.

При анализе степени дейтерированности инозина учитывались следующие аспекты. Во-первых, вследствие того, что протоны в Ci-C'5 положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, мы предположили, что характер биосинтетического

включения дейтерия в рибозную часть молекулы инозина определяется, в основном, функционированием ряда процессов гексозо-моно-фосфатного (ГМФ) шунта, связанных непосредственно с ассимиляцией глюкозы и других сахаров. Во-вторых, многочисленные обменные процессы и внутримолекулярные перегруппировки, происходящие с участием тяжёлой воды могли также привести к специфическому включению метки по определенным позициям в молекуле инозина. Такими доступными позициями в молекуле инозина признаны, прежде всего, гидроксильные протоны -ОН и протоны при гетероатомах -NH (последние могут обмениваться на дейтерий в тяжёлой воде за счет кето-енольной таутомерии). Три атома дейтерия в рибозном остатке молекулы инозина могли происходить за счет функционирования многочисленных реакций ГМФ-шунта, два атома дейтерия а гипоксантинс также могли синтезироваться de novo (схема).

6. РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ БИОСИНТЕТИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙТЕРИЙ-МЕЧЕНН01 О БАКТЕРИОРОДОПСИНА

Получение дейтерии-меченного бактериородопсина.

В качестве другой модельной системы для введения стабильной изотопной метки в белки, использовали бактериородопсин (bR), синтезируемый в клеточной мембране H. halobium ET 1QOL. Для включения дейтериевой метки в bR использовали два принципиально отличных подхода: сайт-специфическое введение отдельных аминокислот: L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp в bR и униформное мечение бактериородопсина дейтерием путем выращивания П. halobium ET 1001 на среде, содержащей 99,9 ат.% тяжёлую воду и дейтеро-гидролизаты В. methylicum.

Бактериородопсин выделяли из пурпурных мембран Н. halobium ET 1001 солюбилизацией в 0,5 %-ном растворе додецилсульфата натрия (ДСН) с последующим осаждением белка метанолом. Гомогенность очищенного bR была потверждена электрофорезом в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии 0,1% ДСН.

ОФ ВЭЖХ метиловых эфиров Dns-, и Z-производных аминокислот, полученных после гидролиза bR в 4 н. Ва(ОН)2 или 6 н. DCI (3 масс.% фенола, в тяжёлой воде) показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей небелковой природы в гидролизатах bR. Согласно данным по разделению дериватизованных гидролизатов bR методом ОФ ВЭЖХ, степени хроматографической чистоты выделенных дейтерий-меченных Dns-Phe-OMe, Dns-Tyr-OMe и Dns-Trp-OMe

составили 96, 97 и 98% соответственно.

Исследование степени дейтерироваиности бактериородопсина. Оба подхода показали хорошие результаты по введению дейтериевой метки в молекулу bR. Например, в масс-спектре гидролизата

электрофоретически чистого bR, полученного с селективной среды, содержащей L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp, после прямой обработки реакционной смеси Dns-Cl и CN2H2 фиксируются пики, соответствующие молекулярным ионам обогащённых дейтерием Dns-Phe-OMe с М+. при m/z 417 (вместо m/z 412 в контроле), Dns-Tyr-OMe с М+. при m/z 429 (вместо m/z 428) и Dns-Trp-OMe с М+. при m/z 456 (вместо m/z 451).

В случае с униформным мечением bR, метка включалась равномерно по всем положениям углеродного скелета в аминокислотных остатках белка.

ВЫВОДЫ:

1.Подобраны условия для проведения адаптации штаммов B. melhylicum, H. halobium, В. subiilis и II. amyloliquefaciens к росту на D^-средах. Селекционно отобраны штаммы, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические характеристики на средах с максимальными концентрациями тяжёлой воды.

2. Показана принципиальная возможность использования суммы химических компонентов дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum в качестве источников ростовых субстратов для синтеза дейтерий-меченных БАС.

3. Изучено влияние меченных субстратов - D2O, CD3OD и 13СН3ОН на ростовые и биосинтетические параметры различных штаммов -продуцентов БАС. Показано, что униформные уровни включения дейтерия в молекулы синтезируемых БАС можно получить, используя высокодейтерированные среды (D20 и СН3ОН), а в случае с 13С-мечением того же результата можно достигнуть за счёт использования 13СНзОН.

4. Предложена дамсильная модификация препаратов культуральной жидкости для изучения степеней изотопного обогащения аминокислот методом масс-спектрометрии электронного удара. Метод позволяет проводить анализ изотопного состава мультикомпонентных смесей аминокислот, как свободных аминокислот из культуральной жидкости, так и аминокислот в составе гидролизатов суммарных белков биомассы.

5. Проведено сравнительное изучение степеней включения дейтерия и изотопа углерода 13С в молекулы экзогенных аминокислот, так и в аминокислотные остатки суммарных белков штаммов метилотрофных бактерий

в условиях их роста на средах, содержащих ступенчато увеличивающие концентрации тяжёлой воды.

6. Определена чёткая корреляция между уровнем включения изотопной метки в молекулы аминокислот и концентрации тяжёлой воды в ростовых средах.

7. Разработана схема получения дейтерий-меченных БАС с высокими степенями изотопного обогащения, основанная на использовании гетеротрофных микроорганизмов - продуцентов соответствующих БАС. Данная схема проверена на примере получения дейтерий-меченных инозина и бактериородопсина.

8. Исследованы методы сайт-специфического и униформного введения дейтериевой метки в бактериородопсин. Показано, что включение отдельных дейтерий-меченных аминокислот в молекулу бактериородопсина носит селективный характер, а использование адаптированного к D2O Н. halobium ET 1001 на средах с меченными субстратами и 99,9% D2O позволяет получать униформно меченный бактериородопсин.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ.

1. Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. Биосинтетическое получение дсйтерий-мсченного L-фенилалаиина, секрстируемого метилотрофным мутантом Brevibaclerium methylicum Биотехнология. 1993. №9. С. 1620,

2. Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В-, Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Препаративное разделение аминокислот белковых гидролизатов в виде бензилоксикарбонильных производных // Биотехнология. 1993. № 8. С. 21-25.

3. Беккер Г. Д., Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н. Аминокислоты, меченные стабильными изотопами: получение и масс-спектро метрически и контроль. (Тезисы докл. 4-й Всероссийской научной конференции "Проблемы теоретической и экспериментальной химии")-Екатеринбург. 20-22 апрель 1994. С. 127-128.

4. Мосин О. В.. Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Л., Цыганков Д, Ю. Штамм Brevibacterium methylicum - продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.

5. Казаринова Л. А., Королькова Н. В., Миронов А. С., Мосин О. В.. Складнев Д. А., Юркевич А. М. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.

6. Karnaukhova Е. N. Mosin О. V.. and Reshetova О. S. Biosynthetic production of stable isotope labeled ammo acids using methylotroph Methylobacillus JlageUattan // Ammo

Acids. 1993. V. 5. № 1. P. 125.

7. Mosin O. V.. Karnaukhova E. N., Pshenichnikova А.

B., Reshetova O. S. Electron impact spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin. 6th International Conference on Retinal Proteins. 19-24 June 1994. Leiden. The Netherlands. P. 115.

8. Mosin O. V,. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labeled amino acids. 7th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. 26 June 1994. Quebec. Canada. P. 163.

9. Matveev A. V., Mosin O.V.. Skladnev D. A., Yurkevich A. M., and Shvcts V. Melhylolrophic adaptation to highly deuterated substrates. 8th International Symposium on Microbial Growth on Ci-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 49.

10. Mosin O. V.. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A., and Shvets V. I. Preparation of D-and L-amino acids via bioconvertion of Ci-substrates, 8lh International Symposium on Microbial Growth on G-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 80.

11.Shvets V. I., Yurkevich A. M., Mosin O. V.. Skladnev D. A. Preparation of deuterated inosine suitable for biomedical application // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V. 8. № 4. P. 231-232.

12.Мосин О. В.. Складнее Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. II Биотехнология. № 3. 1996. С. 32-37.

13.Мосин О. В.. Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Получение бантериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана // Биотехнология. № 3. 1996. С. 14-20.

14.Мосин О.В. Казаринова Л. А., Преображенская Е.

C., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. // Биотехнология. № 4. 1996.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Мосин, Олег Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Использование БАС, меченных стабильными изотопами 2H(D), 13С, l5N (обзор литературы).

1.1. Использование БАС, меченных стабильными изотопами 2H(D), 13С, 15N.

1.1.1. Использование БАС в биохимических исследованиях

1.1.2. Использование меченных БАС в химических синтезах и в диагностике

1.1.3. Использование меченных БАС в структурно - функциональных исследованиях

1.2. Методы получения изотопно-меченных БАС

1.2.1. Химические синтезы изотопно-меченных БАС

1.2.2. Изотопный обмен (H-D) в молекулах БАС

1.2.3. Биотехнологический метод получения изотопно-меченных БАС

1.2.4. Использование микроводорослей для получения изотопно-меченных БАС

1.2.5. Использование гетеротрофных бактерий для получения изотопно-меченных БАС

1.2.6. Использование метилотрофных бактерий для получения изотопно-меченных БАС

1.2.7. Сериновый путь ассимиляции Ci-соединений

1.2.8. Рибулёзо-5-монофосфатный путь ассимиляции Ci-соединений

1.2.9. Получение изотопно-меченных БАС за счёт биоконверсии |3СНзОН или CD3OD в метилотрофах

1.2.9.1. Получение дейтерий-меченных БАС

1.2.9.2. Методы получения |3С-БАС

1.2.9.3. Использование ауксотрофных мутантов бактерий для получения изотопно-меченных БАС

1.2.9.4. Генно-инженерные методы получения изотопно-меченных БАС

1.3. Выделение изотопно-меченных БАС из гидролизатов бактериальной биомассы.

1.3.1. Ионнообменная хроматография изотопно-меченных БАС

1.3.2. Выделение изотопно-меченных БАС методами обращённо-фазовой ВЭЖХ

1.4. Химико-ферментативный метод получения изотопно-меченных БАС.

1.4.1. Использование ферментативных систем для получения стабильно-меченных аминокислот

1.4.2. Получение дейтерий-меченных аминокислот за счёт изотопного обмена (Н-D) в ферментативных системах

1.4.3. Использование а-аминокислот в качестве интермедиантов при получении дейтерий-меченных аминокислот

1.4.4. Получение дейтерий-меченных аминокислот из их низкомолекулярных предшественников

1.4.5. Получение изотопно-меченных ароматических аминокислот

1.4.6. Получение 15Н-аминокислот

1.5. Исследование биосинтеза БАС в гетеротрофных бактериях.

1.5.1. Исследование биосинтеза аминокислот, Сахаров, липидов и нуклеозидов

1.5.2. Биосинтез аминокислот

1.5.3. Биосинтез Сахаров

1.5.4. Биосинтез липидов

1.5.5. Биосинтез нуклеозидов

1.6. Методы исследования БАС, меченных стабильными изотопами 2H(D), 13С, !5N

1.6.1. Исследование структуры БАС методами ЯМР

1.6.2. Спектроскопия ЯМР твёрдого тела

1.6.3. Исследование пространственной структуры белка методом дифракции рентгеновских лучей

1.6.4. Исследование пространственной структуры белка методом дифракции нейтронов

1.6.5. Исследование изотопно-меченных БАС методом спектроскопии комбинационного рассеяния

1.6.6. Исследование изотопно-меченных БАС методом масс-спектрометрии

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение.

2.1. Получение штаммов-продуцентов БАС, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с максимальными концентрациями экзогенной D2O.

2.1.1. Адаптация облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum

2.1.2. Адаптация факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum

2.1.3. Адаптация бацилл В. subtilis и В. amyloliquefaciens

2.1.4. Адаптация галофильных бактерий Н. halobium ЕТ

2.2. Изучение роста и биосинтеза БАС полученными штаммами.

2.2.1. Изучение ростовых характеристик М. flagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD/13СНзОН и DzO

2.2.2. Получение штамма В. methylicum, продуцента L-Phe

2.2.3. Исследование биосинтеза L-Phe метилотрофными бактериями В. methylicum

2.2.4. Изучение влияния D2O на ростовые и биосинтетические характеристики В. methylicum

2.2.5. Исследование роста адаптированного штамма В. methylicum и биосинтеза L-Phe в максимально дейтерированной среде

2.2.6. Изучение качественного и количественного состав аминокислот суммарных белков биомассы В. methylicum

2.2.7. Сравнительный анализ состава белков при росте В. methylicum в максимально дейтерированной среде

2.2.8. Изучение ростовых и биосинтетических характеристик В. subtilis на средах, содержащих D2O и гидролизаты метилотрофных бактерий

2.2.9. Изучение состава внутриклеточных Сахаров В. subtilis

2.2.9.1. Изучение липидных профилей В. subtilis

2.3. Анализ природы адаптационных процессов к D2O в клетке.

2.3.1. Теоретический анализ процессов адаптации клетки к D2O

2.4. Изучение уровней включения дейтерия и 13С в молекулы секретируемых аминокислот В. methylicum и М. flagellatum.

2.4.1. Получение препаратов культуральных жидкостей, содержащих секретируемые дейтерий и 13С-аминокислоты

2.4.2. Получение метиловых эфиров Dns-аминокислот и Z-производных аминокислот

2.4.3. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот В. methylicum

2.4.4. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот В. methylicum на D2O-coдержащих средах

2.4.5. Исследование степеней включения дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот В. methylicum на средах, содержащих максимальные концентрации D2O

2.4.6. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислоты за счёт конверсии CD3OD

2.4.7. Исследование степеней включения 13С в секретируемые аминокислоты М. flagellatum за счёт конверсии 13СНзОН

2.5. Изучение уровней включения дейтерия и 13С в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы В. methylicum и М. flagellatum

2.5.1. Выделение дейтерий и 13С-аминокислот из белковых гидролизатов

2.5.2. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков В. methylicum на ЭгО-содержащих средах

2.5.3. Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков В. methylicum на средах, содержащих максимальные концентрации D

2.5.4. Исследование степеней включения 13С в аминокислоты М. flagellatum за счёт биоконверсии 13СНзОН

2.6. Исследование возможности использования гидролизатов дейтерий-меченной биомассы В. methylicum в качестве субстратов для получения [Г,3',4',2,8 -Оз]-инозина.

2.6.1. Получение [l',3',4',2,8-Dsj-инозина

2.6.2. Исследование степени дейтерированности инозина

2.7. Разработка способов получения дейтерий-меченного бактериородопсина.

2.7.1. Получение дейтерий-меченного бактериородопсина

2.7.2. Гидролиз дейтерий-меченного bR

2.7.3. Исследование степени дейтерированности L-Phe, L-Tyr и L-Trp в бактериородопсине

2.7.4. Исследование степени дейтерированности L-Phe, выделенного из гидролизата bR

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть.

3.1. Материалы

3.2. Бактериальные штаммы

3.3. Условия адаптации

3.4. Питательные среды

3.5. Методы

3.6. Очистка полученных соединений

3.7. Идентификация полученных соединений

3.8. Методы анализа полученных БАС 95 ВЫВОДЫ 98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения"

В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами 2H(D), 13С, 15N, |80(|70), которые необходимы для разнопрофильных биохимических и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС). Тенденции к предпочтительному применению стабильно-меченных соединений по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией (МС). Развитие этих методов анализа позволило за последние годы значительно усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Комплексная реализация методов биосинтетического введения изотопной метки в организм за счет ассимиляции меченных субстратов и ее последующей детекцией в компонентах биомассы и секретируемых БАС (аминокислоты, белки, сахара, нуклеозиды), позволяет осуществлять систему биологического мониторинга стабильно-меченных соединений в организме. Зачастую, для данных исследований необходимо, чтобы синтезируемые БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС, меченных стабильными изотопами с высокими степенями изотопного обогащения является актуальной задачей для современной биотехнологии. Стоимость биосинтетически полученных изотопно-меченных природных соединений значительно ниже, чем химически синтезированных, что представляет интерес для поиска новых промышленных штаммов - продуцентов БАС.

С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность получать разнообразные стабильно-меченные соединения за счёт биологической конверсии CD3OD/D2O в генетически сконструированных штаммах бактерий. Это позволило расширить круг применяемых для этих целей штаммов- продуцентов БАС за счёт использования новых перспективных микробных объектов, прежде всего метилотрофных бактерий, способных ассимилировать метанол и другие одноуглеродные субстраты. В последнее время эти бактерии привлекают внимание исследователей, как источники дешёвых микробного белка и аминокислот. Однако микробиологические процессы редко применяются в биотехнологии, вследствие наличия ряда трудностей, связанных с адаптацией и культивированием клеток на средах с максимальными концентрациями экзогенной D2O. Поэтому целый ряд вопросов, которые касаются принципиальной возможности использования различных штаммов-продуцентов БАС для роста и биосинтеза на средах, содержащих экзогенную D2O, решение которых необходимо для целенаправленного культивирования организмов, остаются до конца невыясненными.

Самостоятельной проблемой, требующей скорейшего разрешения является изучение процессов физиологической адаптации клетки к дейтерию при росте организма на средах, содержащих максимальные концентрации D2O. Это связано с тем, что метаболизм организма на D2O может существенно отличаться от такового на обычной воде. Явление адаптации к D2O интересно не только само по себе, но оно также позволяет получать уникальный биологический материал, очень удобный для решения задач молекулярной организации клетки с помощью метода ЯМР-спектроскопии. Эти данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших экспериментах. Ими являлись генетически маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к различным родам микроорганизмов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium methylicum, облигатные метилотрофные бактерии MethylobacUlus flagellatum, галофильные бактерии Halobacterium methylicum ЕТ 1001 и бациллы Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Целью настоящей работы была разработка методов биотехнологического получения аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных 2Н (D) и |3С, с высокими степенями изотопного обогащения.

Этапы исследования включали:

4. Исследование процессов адаптации различных штаммов-продуцентов БАС к росту и биосинтезу на средах с максимальными концентрациями D2O.

2. Изучение уровней включения дейтерия и 13С в молекулы экзогенных аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий, полученных за счёт биологической конверсии СБзСЮ/13СНзОН и D2O.

3. Исследование принципиальной возможности использования суммы химических компонентов дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий, полученных в ходе многоступенчатой адаптации к D2O, в качестве субстратов для синтеза высокообогащённых дейтерием бактериородопсина и инозина.

Поскольку биотехнологический потенциал исследуемых штаммов при росте на тяжёлой воде к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах, содержащим максимальные концентрации D2O для синтеза дейтерий-меченных аминокислот, белков и нуклеозидов. С этой целью было необходимо применить специальные биотехнологические подходы для получения меченных БАС, что позволило подойти к решению комплексного использования суммарных химических компонентов меченной биомассы полученных штаммов-продуцентов и к созданию новых безотходных биотехнологических процессов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Мосин, Олег Викторович

ВЫВОДЫ:

1. Подобраны условия для проведения адаптации штаммов В. methylicum, Н. halobium, В. subtilis и В. amyloliquefaciens к росту на ЭгО-средах. Селекционно отобраны штаммы, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические характеристики на средах с максимальными концентрациями экзогенной D2O.

3. Изучено влияние меченных субстратов - D20, CD3OD и 13СНзОН на ростовые и биосинтетические параметры различных штаммов -продуцентов БАС. Показано, что униформные уровни включения дейтерия в молекулы синтезируемых БАС можно получить, используя высокообогащённые дейтерием среды (D20 и СНзОН), а в случае с 13С-мечением того же результата можно достичь за счёт использования 13СНзОН.

4. Предложена дансильная модификация препаратов культуральной жидкости для изучения степеней изотопного обогащения аминокислот методом масс-спектрометрии электронного удара. Метод позволяет проводить анализ изотопного состава мультикомпонентных смесей аминокислот, как свободных аминокислот из культуральной жидкости, так и аминокислот в составе гидролизатов суммарных белков биомассы.

5. Проведено сравнительное изучение степеней включения дейтерия и 13С в молекулы секретируемых аминокислот, так и в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы штаммов метилотрофных бактерий в условиях их роста на средах, содержащих ступенчато увеличивающие концентрации D20. Определена чёткая корреляция между уровнем включения изотопной метки в молекулы аминокислот и концентрации D20 в ростовых средах.

6. Разработана схема получения дейтерий-меченных БАС с высокими степенями изотопного обогащения, основанная на использовании гетеротрофных микроорганизмов -продуцентов соответствующих БАС. Данная схема проверена на примере получения дейтерий-меченных инозина и бактериородопсина.

7. Исследованы методы сайт-специфического и униформного введения дейтериевой метки в бактериородопсин. Показано, что включение отдельных дейтерий-меченных аминокислот в молекулу бактериородопсина носит селективный характер, а использование адаптированного к D20 Н. halobium ЕТ 1001 на средах с меченными субстратами и 99,9% D20 позволяет получать униформно меченный бактериородопсин.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Мосин, Олег Викторович, Москва

1. LeMaster D. Deuterium labeling in NMR structural analysis of larger proteins. II Quartely Rev. Biophys., 1990, V. 23, No. 2, pp. 133-174.

2. LeMaster D. Uniform and selective deuteration in two-dimentional NMR of proteins. // Annu. Rev. Biophys., 1990, V. 19, pp. 243-246.

3. Bax A. & Weiss M. A. Simplification of two-dimensional NOE spectra of proteins by 13C labelling. Hi. Magn. Reson., 1987, V. 71, pp. 571-575.

4. Motil K. J., Montandon С. M., Thotathuchery M., and Garza C. Dietary protein and nitrogen balance in lactating and nonlactating women. II Am. J. Clin. Nutr., 1990. V. 51, pp. 378-384.

5. Hruby V. J. Synthesis and use of specific isotopically labelled peptide hormons for studying of conformation dynamics and hormon-protein interactions. // Synth, and Appl. Isot. Label. Compounds, 1985, V. 4, pp. 287-292.

6. Nelson J. E., Ruo Т. I. Assay of stable isotope labeled urea in biological fluids by selected ion monitoring. II Clinica Chemica Acta, 1988, V. 175, pp. 59-65.

7. Gregory R. B, and Rosenberg A. Protein conformation dinamics measured by hydrogen isotope exchange techniques // Methods in Enzymol, 1986, V. 131, pp. 448-508.

8. Murphy R. C., Anderson F. S., Clay K. L. In vitro and in vivo studies of amino acids labeled with 180 at the carboxyl moiety. // in Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference, Ed by Klein E. R., Academic Press, New York, 1979, pp. 139-146.

9. Samuel D. Methodology of oxyden isotopes. In oxygenases, M. Hayaishi, Ed., Academic Press, New York, 1972, pp. 31-86.

10. Kaptein R., Boelens R., Scheek R. M., and van Gunsteren W. F. Protein Structures from NMR. // Biochemistry, 1988, V. 27, No. 15, pp. 5389-5395.

11. Rothschild, K. J., Braiman, M. S., He, Yi-Wu., Marti, Т., and Khorana, H. G. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants. // J. of Biol. Chem., 1990, V. 28, pp. 16985-16991.

12. Argade, P. V., Rothschild, K. J., Kawamoto, A. H„ Herzfeld, J., and Herlihy, W. C. Resonance Raman spectroscopy of specifically s-l5N.Iysine-labeled bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, V. 78, No. 3, pp. 1643-1646.

13. Vetter, W. in: Biochemical Applications of mass-spectrometry (Walles G.R., and Dormor O.C.). 1980, First supplementary volume, Wiley Interscience, New York, USA, p. 439.

14. Daub, G. H. Syntheses with stable isotopes. II in Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference, Ed by Klein, E. R., Academic Press, New York, 1979, pp. 3-10.

15. Варшавскийб Я. М. О распределении изотопа углерода 13С в биологических системах. // Биофизика, 1988, V. 33, № 2, pp. 351-355.

16. Dhara К. P., Yamamoto Е., Bokelman G. Н., Wooten J. В. Incorporation of 2-13C.-ferulic acid, a lignin precursor in L. leucocephala etc. // J. C. S. Chem. Commun., 1988, pp. 1626-1628.

17. Wright A. D., Sampson M. В., Michalczuk L., Slovin J. P., Cohen J. D. Indole-3-acetic acid biosynthesis in the mutant maize orange pericarp, a tryptophan auxotroph. II Science-Washington, 1991, V. 254, No 5034, pp. 998-1000.

18. Michalczuk L., Ribnicky D. M., Cooke T. J., Cohen J. D. Regulation of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures. // Plant-Physiology, 1992, V. 100, No 3, pp. 1346-1353.

19. Kliender R. Studies on the incorporation of (2S, 3R)-4,4,4-2H3. valine and (2S, 3S)-[4,4,4-2Нз] valine into p-lactam antibiotics. //J. Am. Chem. Soc., 1974, V. 96, No 12, pp. 4054-4056.

20. Cardillo R. Pattern of incorporation of leucine samples asymmetrically labelled with 13C inthe Cs- isopropyl unit of Echiruline and flavoglaucine. // J. of Chem. Soc. D., 1977, pp. 474-476.

21. Griffiths, D. V., Feeney, J., Roberts, G. С. K., and Burgen, A. S. V. Preparation of selectively deuterated aromatic amino acids for use in NMR studies of proteins. II Biochim. et Biophys. Acta, 1976, V. 446, pp. 479-485.

22. Kinsey, R. A., Kintanar, A., and Oldfield, E. Dynamics of amino acid side chains in membrane proteins by high field solid state deuterium nuclear magnetic resonance spectroscopy. //J. Biol. Chem., 1981, У. 256, No. 17, pp. 9028-9036.

23. Mcintosh, L. P., and Dahlquist, F. W. Biosynthetic incorporation of 15N and 13C for assignment and interpretation of nuclear magnetic resonance spectra of proteins. // Quarterly Reviews of Biophysics, 1990, V. 23, pp. 1-38.

24. LeMaster, D. M., and Cronan, J. E. Biosynthetic production of 13C-labeled amino acids with site-specific enrichment. //J. of Biological Chemistry, 1982, V. 257, No. 3, pp. 1224-1230.

25. Cox, J., Kyli, D., Radmer, R. Stable isotope labeled biochemicals from microalgae. // Trends

26. Biotechnol., 1988, V. 6, pp. 279-282.

27. Patel, G. В., Sprott, G. D., and Ekiel, I. Production of specifically labeled compounds by Methanobacterium espanolae grown on H2-CO2 plus 13C.acetate. // Appl. and Environ. Microbiol., 1993, V. 59, pp. 1099-1103.

28. Fukuzaki, S., Nishio, N., and Nagai, S. Kinetics of the methanogenic fermentation of acetate. //Appll. Environ. Microbiol., 1990, V. 56, pp. 3158-3163.

29. Daniels, L., Sparling, R., and Sprott, G. D. The bioenergetics of methanogenesis. // Biochim. Biophys. Acta, 1984, V. 768, pp. 113-163.

30. Patel., G. В., Sprott, G. D., and Fein, J. E. Isolation and characterization of Methanobacterium espanolae sp. nov., a mesophilic, moderately acidiphilic methanogen. II Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, V. 40, pp. 79-82.

31. McFadden, В. A. Assimilation of One-Carbon Compounds, in: The Bacteria, a Treatise on Structure and Function, Ed., Ornston, L. N., and Sokatch, Academic Press, New York, 1978, V. 4, pp. 219-290.

32. Colby, J., Dalton, H., and Whittenbury, R. Biological and biochemical aspects of microbial growth on Ci compounds. //Ann. Rev. Microbiol., 1979, V. 33, pp. 481-517.

33. Anthony, C. Bacterial oxidation of methane and methanol, in: Advances inMicrobial Physiology, Academic Press, New York, USA, 1986, V. 27, pp. 113-203.

34. Karnaukhova, E. N., Reshetova, O. S., Semenov, S. Y., Skladnev, D. A., and Tsygankov, Y. D. 2H-and 13C-labeled amino acids generated by obligate mthylotrophs Biosynthesis and MS monitoring.//Amino Acids, 1994, V. 6, pp. 165-176.

35. Brown-Mason, A., Dobson, M., and Woodworth, R. C. Efficient incorporation of deuterated amino acids into quail egg white proteins for nuclear magnetic resonance studies. // J. of Biolog. Chem., 1981, V. 256, No. 4, pp. 1506-1509.

36. Crespi, H. L. Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins, in: Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd., Ed., Muccino, R. R., 1986, Elsevier, Amsterdam, pp. 111-112.

37. Skladnev, D. A., and Tsygankov, Y. D. Conversion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass, 6 th Eur. Conf. on Biomass for Energy, 22-26 April 1991, Athens, Greece, p. 234.

38. Daboll, H. F., Crespi, H. L., and Katz, J. J. Mass cultivation of algae in pure heavy water. // Biotechnology and Bioengineering, 1962, V. 4, pp. 281-297.

39. Crespy, H. L. Stable Isotopes in the Life Sciences, International atomic energy agency, Vienna, 1977, pp. 111-121.

40. Oh, В. H., Westler, W. M., Darba, P & Markley, J. L. Protein carbon-13 spin systems by a single two-dimentional nuclear magnetic resonance experiment. // Science, 1988, V. 240, pp. 908-911.

41. Stockman, B. J., Reily, M. D., Westler, W. M., Ulrich, E. L. & Markley, J. L. Concerted two-dimentional NMR approaches to hydrogen-1, carbon-13, and nitrogen-15 resonance assignments in proteins. // Biochemistry, 1989, V. 28, pp. 230-236.

42. Yu, L. P., Smith, G. M. 15N and 'H NMR studies of Rhodospirillum rubrum cytochrome сг.Н Biochemistry, 1988, V. 27, pp. 1949-1956.

43. Sprott, G. D., Ekiel, I, and Patel, G. B. Metabolic pathways in Methanococcus jannaschii and other methanogenic bacteria. // Appl. and Environ. Microbiol., 1993, V. 59, No. 4, pp. 1092-1098.

44. Umbarger, H. E. Amino acid biosynthesis and its regulation. // Ann. Rev. Biochem., 1978, V. 47, pp. 533-606.

45. Bachmann, B. J. Linkage map of Eschericia coli K-12. // Microbiol. Rev., Edition 7, 1983, V.47. pp. 180-230.

46. Griffey, R. H„ Redfield, A. G., Loomis, R. E. & Dahlquist, F. W. // Nuclear magnetic resonance observation and dynamics of specific amide protons in T4 lysozyme. // Biochemistry, 1985, V. 24, pp. 817-822.

47. Muchmore, D. C., Mcintosh, L. P., Russel, С. В., Anderson, E. E. & Dahlquist, F. W. // Meth. Enzymol., 1990, V. 77, pp. 346-354.

48. Torchia, D. A., Sparks, S. W. and Bax, A. Staphylococcal nuclease: sequential assignments and solution structure. // Biochemistry, 1989, V. 28, pp. 5509-5524.

49. Marion, D., Kay, L. E., Sparks, S. W., Torchia, D. A. & Bax. Three-dimensional heteronuclear NMR of 15N-labeled proteins. II J. Am. Chem. Soc., 1989, V. 3, pp. 1515-1517.

50. Senn, H., Euguster, A., Otting, G., Suter, F. & Wuthrich, K. Nitrogen- 15-labeled P22C2 repressor for nuclear magnetic resonance studies of protein DNA interactions. II Eur. Biophys. J., 1987, V. 14, pp. 301-313.

51. LeMaster, D. M. & Richards, F. M. 'H-15N heteronuclear NMR studies of Escherichia coli thioredoxyn in samples isotopically labeled by residue type. // Biochemistry, 1985, V. 24, pp. 7263-7268.

52. Lapidot, A. & Irving, C. S. 15N nuclear magnetic resonance as a probe of residual structure in the backbone of unfolded hemoglobin. // J. Am. Chem. Soc., 1977, V. 99, pp. 5488-5493.

53. Leighton, P & Lu, P. X cro repressor complex with Огз DNA: 15N NMR observations. // Biochemistry, 1987, V. 26, pp. 7262-7271.

54. Campbell, B. S., Papastavros, M. Z., McCormick, F. & Redfield, A. G. Identification of resonances from an oncogenic activating locus of human N-ras P21 protein using isotope edited NMR. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, V. 86, pp. 817-820.

55. Gelfand, D. H. & Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. // J. Bacteriol., 1977, V. 130, pp. 429-440.

56. Cronan, J. E., and Batchelor, J. G. Studies of lipid biosynthesis by E. coli K-12 mutant. // Chem. Phys. Lipids., 1973,11, pp. 196-202.

57. LeMaster, D. L. & Richards, F. M. Preparative-scale isolation of 13C-labeled amino acids with site-specific enrichment. // J. Biol. Chem., 1982, V. 257, pp. 1224-1230.

58. Cohen, J. S., and Putter, I. The isolation of deuterated amino acids. II Biochim. et Biophys. Acta, 1970, V. 222, pp. 515-520.

59. Jensen R. A. & Calhoun D. H. Intracellular roles of microbial aminotransferases: Overlap enzymes across diffrent biochemical pathways. II Crit. Rev. Nicrobiol., 1981, Vol. 8, pp. 229-238.

60. Kanana, Z. E., and Lapidot, A. Biosynthesis of L-I5N. aspartic acid and L-[I5N] alanine by immobilized bacteria, 1982, V. 126, pp. 389-393.

61. Пшеничникова А. Б., Карнаухова E. H., Звонкова E. H., В. И. Швец. Методы получения дейтерированных аминокислот. // Биоорганическая химия, 1995, Т. 21, No 3, сс. 163-178.

62. Lee К. М., Ramalingam К., Son J. К., Woodard R. W. // J. Org. Chem., 1989, V. 54, No 13, pp. 3195-3198.

63. Faleev N. G., Ruvinov S. В., Saporovskaya M. В., Belikov V. M., Zakomyrdina L. N. Preparation of a-deuterated amino acids by E. coli cells containing tryptophanase. // Izv. Akad. Nauk USSR, Ser. Khim., 1989, V. 10, pp. 2341-2343.

64. Darmaun D., Robert J. J., Bier D. M., Mathews D. E., Young V. R. Study in vivo of the metabolism of non-essential amino acids using stable isotopes. // Annales-d' Endocrinologie., 1985, V. 46, No 4/5, pp. 355-356.

65. Jordan P. M., Akhtar M. // Biochem. J., 1970, V. 116, pp. 277-286.

66. Wong С. H., Whitesides G. M. Enzyme-catalyzed organic synthesis: regeneration of deuterated nicotinamide cofactors for use in large-scale enzymatic synthesis of deuterated substrates. //J. Amer. Chem. Soc., 1983, V. 105, No 15, pp. 5012-5014

67. Field S. J., Young D. W. // J. Chem. Soc. Chem. Communs. 1979, pp. 1163-1165.

68. Fuganti, C., Ghiringhelli, D., Giangrasso, D., Grasselli, P. II J. Chem. Soc. Comm., 1974, pp. 726-730.

69. Busujima U. K., Shimiba S., Narita K., Okada S. Biosynthesis with deuterated microorganisms. //Chem. Pharm. Bull., 1988, V. 36, pp. 1828-1832.

70. Moore, A. C., Ph. D. Dissertation, University of California USA, Berkeley, 1976, pp. 13-38.

71. Enei, H., Matsui, H., Nakazawa, H., Okumura, S., Yamada, H. Culture conditions for the preparation of cells containing high tyrosine phenol lyase activity // Agric. Biol. Chem., 1973, V. 37, No 3, pp. 493-498.

72. Kumagai H., Kashima N., Torii H., Yamada H., Enei H., Okumura S. //Agric. Biol. Chem., 1972, V 36, pp. 472-475.

73. Walker, Т. E., and Matheny, C. An efficient cmemomicrobiological synthesis of stable isotope-labeled L-Tyrosine and L-Phenylalanine. // J. Org. Chem., 1986, V. 51, pp. 1175-1179.

74. Nagasawa Т., Utagawa Т., Goto J., Kim C., Tani Y., Kumagai H., Yamada H. // Eur. J. Biochem., 1981, V. 117, pp. 33-40.

75. Hadener A., Tamm C. // J. Labelled Compounds and Radiopharm. 1987. V. 24, pp. 1291-1306.

76. Bogusky, M. J., Schiksnis, R. A., Leo, G. C. & Opella, S. J. Protein backbone dynamics by solid-state and solution ,5N NMR spectroscopy. //J. Magn. Res., 1987, V. 72, pp. 186-190.

77. Kahana, Z. E., and Lapidot, A. Adaptation of biotechnological processes for preparation of compounds labeled with stable isotopes, in: Synthesis and Applications of Isot. Label. Compounds, ed. Muccino, R. R., Elsevier, 1986, pp. 511-512

78. Kahana, Z. E., and Lapidot. Microbial production of L-15N.glutamic acid and its gas chromatography-mass spectrometry analysis. // Analyt. Biochem., 1983, V. 132, pp. 160-164.

79. Ekiel, I., Smith, I. C. P., and Sprott, G. D. Biosynthetic pathways in Methanospirillum hungatei as determined by 13C nuclear magnetic resonance. // J. Bacterid., 1983, V. 156, pp. 316-326.

80. Ekiel, I., Smith, I. C. P., and Sprott, G. D. Biosynthesis of isoleucine in methanogenic bacteria: a 13C NMR study. // Biochemistry, 1984, V. 23, pp. 1683-1687.

81. Bender, D. A. Amino Acid Metabolism, 2nd edn., New York: John Wiley & Sons., 1985, pp. 34-52.

82. Fuchs, G., and Stupperich, E. Acetyl CoA, a central intermediate of autotrophic CO2 fixation pathway in Methanobacterium thermoautotrophicum. /I Arch. Microbiol., 1980, V. 127, pp. 267-272.

83. Weimer, P. J., and Zeikus, J. G. Acetate assimilation pathway of Methanosarcina barkeri. II J. Bacteriol., 1979, V. 137, pp. 332-339.

84. Jansen, K., Stupperich, E., and Fuchs, G. Carbohydrate synthesis from acetyl CoA in the autotroph Methanobacterium thermoautotrophicum. I/ Arch. Microbiol., 1980, V. 132, pp. 355-364.

85. Charon, N. W., Johnson, R. C., and Peterson, D. Amino acid biosynthesis in the spirochete leptospira: evidence for a novel pathway of isoleucine biosynthesis. // J. Bacteriol., 1974, V. 117, pp. 203-211.

86. Kisumi, M., Komatsubara, S., and Chibata, I. Pathway for isoleucine formation from piruvate by leucine biosynthetic enzymes in leucine-accumulating isoleucine revertants of Serratia marcescens. II J. Biochem., 1977, V. 82, pp. 95-103.

87. Vollbrecht, D. Three pathways of isoleucine biosynthesis in mutant strains of Saccharomyces cerevisiae. II Biochim. Biophys. Acta., 1974, V. 362, pp. 382-389.

88. De Rosa, M., De Rosa, S., and Gambacorta, A. 13C NMR assignments and biosynthetic data for the ether lipids of Calderiella. II Phytochemistry, 1977, V. 16, pp. 1909-1912.

89. Henderson, R. The structure of purple membrane from Halobacterium halobium analysis of the X-ray diffraction patterns. // J. Mol. Biology, 1975, V. 93, No. 2, pp. 123-132.

90. Michel, H., & Oesterhelt, D. Three-dimentional crystals of membrane proteins: bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, V. 77, No. 3, pp. 1283-1285.

91. Clore, G. M. & Gronenborn, A. M. Determination of three-dimentional structures of proteines in solution by nuclear magnetic resonance spectroskopy. // Protein Eng., 1987, V. 1, pp. 275-288.

92. Stenart, P. L., Valentine, K. G., Opella, S. J. Structural analysis of solid-state NMR measurements of peptides and proteins //J. Magn. Reson., 1987, V. 71, No. 1, pp. 45-61.

93. Griesinger, C., Sorensen, O. W. & Ernst, R. R. Three-dimentional Fourier spectroscopy. Application to high-resolution NMR. // J. Magn. Res., 1989, V. 84, pp. 14-63.

94. Griesinger, C., Sorensen, O. W. & Ernst, R. R. Novel three-dimentional NMR techniques for studies of peptides and biological macromolecules. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 7227-7228.

95. Randall, M., Kathleen, S. M., Stanley, J. O. Selectively deuterated amino acid analoques. Synthesis, incorporation into protein and NMR properties. // Biochim. Biophys Acta., 1977, V. 497, pp. 1-5.

96. Griesinger С., Sorensen О. W. & Ernst R. R. Novel three-dimentional NMR techniques for studies of peptides and biological macromolecules. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 7227-7228

97. Kaptein R., Boelens R., Scheek R. M., and van Gunsteren W. F. Protein structures from NMR. // Biochemistry, V. 27, No 15, pp. 5389-5400.

98. Stuhermann, H. B. Methods of isotopic and spin contrast variation in biology. // Physica В., 1989, V. 156, pp. 444-451.

99. Лакович, Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986. с. 15-19.

100. Fesik, S. W., Luly, J. R., Erickson, J. W. 7 Abad-Zapatero, C. Isotope-edited proton NMR study on the structure of a pepsin/inhibitor complex. // Biochemistry, 1988, V. 27, pp. 8297-8301.

101. Fesik, S. W., and Zuderweg, E. R. P. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy of isotopically labeled biological macromolecules. // Quarterly Rev. Biophys., 1990, V. 23, No. 2, pp. 97-131.

102. Smith, R. L. Dynamic structure of membranes by deuterium NMR. // Science, 1984, V. 225, No. 4559, pp. 280-288.

103. Senn, H., Otting, G. & Wuthrich, K. Protein structure and interactions by combined use of sequential NMR assignments and isotope labeling. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 1090-1092.

104. Davis, J. H. Deuterium nuclear magnetic resonance of exchange-labeled gramicidin in an orinted lyotrophic nematic phase. // Biochem., 1988, У. 27, No. 1, pp. 428-436.

105. Oas, T. G„ Hartzell, C. J., Dahlquist, F. W. & Drobny, G. P. The amide l5N chemical shift tensors of four peptides determined from 13C dipole-coupled chemical shirt powder patterns. // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, pp. 5962-5967.

106. Gronenborn, A. M., Bax, A., Wingfield, P. T. & Clore, G. M. A powerful method of sequential proton resonance assignment in proteins using relayed l5N-'H multiple quantum coherence spectroscopy. II FEBS Lett., 1989, V. 243, pp. 93-98.

107. Bolton, H. P. Heteronuclear relay transfer spectroscopy with proton detection. // J. Magn. Reson., 1985, V. 62, pp. 143-146.

108. Weber, P. L. & Muller, L. Use of 15N labeling for automated three-dimentional sorting of cross peaks in protwin 2D NMR spectra. // J. Magn. Res., 1989, V. 81, pp. 430-434.

109. Roux, M., Seigneuret, M., and Rigaud, J. L. 31P NMR study of the interaction of cations with purple membrane and of the purple-blue transition. // Biochemistry, 1988, V. 27, pp. 7009-7015.

110. Keniry M. A., Gutowsky H. S., Oldfield E. Surface dynamics of the integral membrane protein bacteriorhodopsin. // Nature, 1984, V. 307, No 5949, pp. 383-386.

111. Harbison G. S., Smith S. 0., Pardoen J. A., Mulder P. P. J., Lugtenburg J. Solid-state 13C NMR studies of retinal in bacteriorhodopsin. // Biochemistry, 1984, V. 23, No. 12, pp. 2662-2667.

112. Widnell С. C., and Pfenninger К. H. in: Essential Cell Biology, Williams & Wilkins, Baltimore, 1990, pp. 32-33.

113. King G. I., Schoenborn B. P. Neutron scattering of bacteriorhodopsin. // Methods Enzym., 1982, V. 88, pp. 241-248.

114. Jubb J. S., Worcester D. L., Crespi H. L., Zaccai G. Retinal location in purple membrane of Halobacierium halobium'. a neutron diffraction study of membranes labeled in vivo with deuterated retinal. // EMBO J., 1984, V. 3, No. 7, pp. 1455-1461.

115. Seift F., Wallat I., Ermann P., Heyn M. P. A neutron diffraction study on the location of the polyene chain of retinal in bacteriorhodopsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985, V. 82, No. 10, pp. 3227-3231.

116. Juong Y., and Lewis A. Determination of the absolute orientation of the retinylidene chromophore in purple membrane by a second-harmonic interference technique. // Biophys. J., 1989, V. 55, pp. 835-842.

117. Fesik S. W., Gampe R. T. & Zuiderweg E. R. P. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy. Natural abundance 13C chemical editing of 'H-'H COSY spectra. // J. Am. Chem. Soc., 1989, V. Ill, pp. 770-772.

118. Vuister G. W., Boelens R. & Kaptein R. Nonselective three-dimentional NMR spectroscopy. The 3D NOE-HOHAHA experiment. // J. Magn. Reson., 1988, V. 80, pp. 176-185.

119. Fesik S. W., Gampe R. Т., Xuiderweg E. R. P., Kohlbrenner W. E. & Weigl D. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy applied to CMP-KDO synthetase (27,5 kD). // Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, V. 159, pp. 842-845.

120. Montelione G. Т., Wionkler M. E., Rauenbuehler P. & Wagner G. Accurate measurements of long-range heteronuclear coupling constants from homonuclear 2D NMR spectra of isotope-enriched proteins. //J. Magn. Reson., 1989, V. 82, pp. 198-204.

121. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. J1. Биосинтетическое получение дейтерий-меченного L-фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum li Биотехнология. 1993. № 9. С. 16-20.

122. Karnaukhova Е. N, Mosin О. V., and Reshetova О. S. Biosynthetic production of stable isotope labeled amino acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum // Amino Acids. 1993. V. 5. № l.p. 125.

123. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Ерёмин С. В., Швец В. И. Метилотрофные бактерии источники изотопно-меченных D- и 13С-аминокислот. // Биотехнология. № 4. 1996. (в печати).

124. Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Препаративное разделение аминокислот белковых гидролизатов в виде бензилоксикарбонильных производных // Биотехнология. 1993. №8. сс. 21-25.

125. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Д., Цыганков Д. Ю. Штамм Brevibacterium methylicum продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.

126. Мосин О. В., Складнее Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. // Биотехнология. № 3. 1996. сс. 3-12.

127. Казаринова Л. А., Королькова Н. В., Миронов А. С., Мосин О. В., Складнее Д. А., Юркевич А. М. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.

128. Shvets V. I., Yurkevich А. М., Mosin О. V., Skladnev D. A. Preparation of deuterated inosine suitable for biomedical application // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V. 8. №4. pp. 231-232.

129. Мосин О. В, Казаринова Л. А., Преображенская Е. С., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высоко дейтерированной среде. // Биотехнология. № 4. 1996 (в печати).

130. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Получение бактериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана // Биотехнология. № 3. 1996. сс. 14-20.

131. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. Из-во Мир, М.: 1965, сс. 392-403.

132. Полюдек-Фабини Р., БейрихТ. Органический анализ. Л. Химия.: 1981, сс. 515-516.

Информация о работе

Мосин, Олег Викторович
кандидата химических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы