Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы

Егорова, Татьяна Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы"

с/^

ЕГОРОВА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И БИОФИЗИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЧЕННЫХ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ МЕТАБОЛИТОВ И МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ: МЕТОДОЛОГИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.10- Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание учёной степени доктора химических наук

МОСКВА-2011

1 7 МДР 2011

4840827

Диссертационная работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В. Ломоносова, Россия, в отделе биофизической органической химии Лейденского Института Химии, в отделе биофизики Лейденского Института Физики Лейденского Университета и в отделе биохимии Центра молекулярых наук о жизни при Радбауд Наймегенском Университетском Медицинском Центре, Нидерланды

Научный консультант:

Академик РАМН, доктор химических наук, профессор Швец Виталий Иванович Официальные оппоненты:

Академик РАН, доктор химических наук, профессор Мясоедов Николай Фёдорович

Доктор химических наук Польшаков Владимир Иванович

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович

Ведущая организация: Институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича РАМН

Защита диссертации состоится 14 марта 2011 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М. В. Ломоносова (МИТХТ) по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан _ февраля 2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 212.120.01 кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Лютик Алла Игоревна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время возрастает необходимость ускорения и повышения эффективности процесса разработки новых лекарственных препаратов для борьбы с существующими, вновь рецидивирующими и возникающими заболеваниями. Наряду с этим растёт потребность в разработке новых профилактических фармакологических и диетических подходов и связанных с ними чувствительных тестов для ранней диагностики в целях предотвращения заболеваний. Для осуществления выпуска новых препаратов фармацевтические фирмы стремятся использовать более быстрые и эффективные методы их разработки и для обеспечения 4-8% годового роста продаж увеличить разработку лекарств, в среднем, от 1-1.5 до 3-5 в год. В связи с этим расширяются программы по разработке новых лекарств, которые включают высокоэффективный скрининг сотен тысяч потенциальных соединений в качестве их кандидатов, и важную роль приобретают подходы, основанные на знании структуры мишени, на которую направлены действия лекарств. Детальное определение трёхмерной структуры мишени, как полагают, сможет служить основой для моделирования in silico, докинга, виртуального скрининга и дальнейшего конструирования фармакологически подходящих соединений с определённой заданной или даже новой физиологической активностью.

Имеющиеся на сегодняшний день на рынке лекарства действуют на 500 мишеней, из которых более, чем 90% составляют белки. Причём более половины имеющихся на рынке лекарств действуют на мишени, представляющие собой мембранные белки класса G-белок сопряженных рецепторов (GPCR1). В то время, когда на сегодняшний день согласно базе белковых структур PDB, трёхмерное строение более, чем 10,000 водорастворимых белков известно и определено такими классическими методами как кристаллография и ЯМР с разрешением выше чем 3 А, пространственное строение установлено лишь для нескольких белков класса GPCR: родопсина в 2000 г., Рг и ßi адренорецепторов в 2007 и 2008 г., аденозинового рецептора Агд в 2008 г, хемокинового CXCR4 и дофаминового D3 в 2010 г.

В случае белков, кристаллы которых получить сложно, Ядерный Магнитный Резонанс (ЯМР) твёрдого тела является практически единственным возможным способом исследования. Преимуществом ЯМР является также возможность изучения белков в физиологическом окружении. Структурно-функциональный анализ с помощью ЯМР позволяет получить детальную информацию о трёхмерной структуре связанного с рецептором лиганда, о его участке связывания, о взаимодействии рецептор-лиганд, в том числе, Н-связывании, я-взаимодействии, электростатических эффектах и перераспределении зарядов. Для этих-%^

1 Список сокращений приведён на стр. 54

исследований требуются миллиграммовые количества высокоочищенных белков, меченных стабильными изотопами, такими как 13С,'5Ы или их комбинации. Белки могут быть получены экспрессией соответствующей копийной ДНК в выбранной клетке-хозяине.

В настоящей работе разрабатывались методологические подходы, связанные с созданием эффективных методов тотального мечения биомолекул стабильными изотопами, [и-а также структурно-функциональными исследований мембранных белков методами ЯМР и Фурье-ИК. Особое внимание уделено методам [и-вЕ,], позволяющим получить структурную информацию с помощью лишь одного образца.

Цель и задачи исследования заключалась в разработке мультидисциплинарного подхода и развитии ряда технологий для структурно-функциональных исследований мембранных белковых комплексов методами [и-81Ь] и последующего вклада в рациональное конструирование лекарственных препаратов. Особое внимание уделялось доступности [и-БЦ,] лигандов и [и-Б1Ц мембранных комплексов при эффективном использовании метаболических предшественников, полученных на базе меченных стабильными изотопами 13С, 'Ч 2Н различных природных источников (бактерии, дрожжи, грибы, водоросли, растения, клеточные линии насекомых и млекопитающих). В ходе исследования были поставлены задачи:

1. Разработать методы эффективного введения стабильной изотопной метки в различные прокариотические и эукариотические источники для последующего выделения целевых2 продуктов. При этом исследовать влияние комбинации выбора природного источника, методов и условий культивирования на выход целевого продукта.

2. Разработать ряд аналитических методов для контроля воспроизводимости получения биомасс, определения их химического состава и степени включения изотопной метки.

3. Решить проблему доступности меченых соединений при их получении в клеточных линиях эукариот. В связи с этим разработать питательные среды для эффективного [и-81Ц клеточных линий насекомых и млекопитающих. Исследовать биотехнологический потенциал дрожжевых экстрактов как компонентов питательных сред.

4. Выбрать фармацевтически важный белок-мишень, получить его в [и-БТЦ виде с использованием специально разработанных питательных сред, тем самым продемонстрировать возможность получения [и-БИ,] сложных белков-мишеней для получения структурной информации.

5. Исследовать возможности стратегии [и-81Ь] и показать её преимущества для дальнейшего применения в метаболомике, протеомике и структурной биологии с помощью

2 Целевым продуктом являются низкомолекулярные и высокомолекулярные соединения, такие как пигменты, липиды, жирные кислоты, стерины, углеводы, аминокислоты, пептиды, мембранные белки, а также различные экстракты, полученные из клеточных биомасс и приготовленные согласно разработанным протоколам с учётом условий их дальнейшего применения.

методов MAS ЯМР, ИК и МС. Для этого выбрать объекты и изучить как [U-SIL] лиганд в мембранно-белковом комплексе, так и [U-SIL] белковый комплекс в целом.

Научная новизна заключается в разработке на основе [U-SIL] и биофизических методов исследования ряда методологий для рациональной разработки лекарственных препаратов и для ранней диагностики. В европейском патенте 2003 г, заявленном в Европе, Российской Федерации, Японии, Канаде, США, Австралии и выданном в 2011 г в РФ и Австралии, отражены композиции и методы мечения молекул стабильными изотопами. Разработаны приёмы эффективного [U-SIL] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых.

Замена в синтетических питательных средах для клеточных линий насекомых и млекопитающих дорогостоящих меченных стабильными изотопами индивидуальных аминокислот, органических кислот и других компонентов экстрактами биомасс из различных источников позволяет уменьшить стоимость питательных сред, по крайней мере, в пять раз с учётом лишь стоимости аминокислот. Впервые было продемонстрировано рекомбинантное получение [U-SIL] фармакологически важного рецептора класса GPCR - гистаминового рецептора человека H1R в клеточной линии насекомых sf9 на основе разработанных питательных сред. Таким образом, открыты новые возможности для получения фармацевтически важных белков-мишеней с сохранённой биологической активностью в количествах, достаточных для структурных исследований с помощью ЯМР и получения информации для дальнейшего моделирования in silico при разработке лекарств, связанных с действием рецептора.

Эффективное биосинтетическое мечение стабильными изотопами позволяет снизить стоимость целевого продукта по сравнению со стандартными методами, тем самым обеспечивает доступность [U-SIL] биомолекул для широкого спектра исследований. Разработанные подходы включают рациональную конверсию метаболического предшественника в целевой продукт, многократное использование культуральной жидкости, создание установок по типу закрытых циркуляционных систем, контроль качества биомасс и степени обогащения. Доступность биомасс с высокой степенью обогащения позволила выделить различные меченные стабильными изотопами соединения, такие как аминокислоты, пептиды, липиды, мембранные белки, а также получить различные экстракты биомасс. Разработанные с помощью ИК и МС аналитические методы мониторинга роста, химического состава, оценки воспроизводимости партий биомасс, степени их изотопного обогащения позволяют изучать их химический состав, получать характеристики различных штаммов, проводить метаболическое профилирование. Это представляет собой отдельный интерес для протеомики и метаболомики в плане разработки продуктов для ранней диагностики в целях создания индивидуальных диетических программ и изучения их влияния на здоровье человека.

Практическая значимость. Показано, что специализированные [0-51Ь] образцы способствуют развитию методов ЯМР, позволяют проводить эксперименты на одном образце и сократить расходы, связанные с получением целого ряда специфически меченых образцов, с использованием оборудования и с затратой времени для исследований. Возможности стратегии [и-ЭГЬ] и ЯМР твёрдого тела продемонстрированы на примере фотосинтетических объектов. При этом была охарактеризована на атомном уровне роль кофакторов фотосинтетических белков в рамках изучения первичного процесса фотосинтеза. В ходе работы выполнены задачи разработки методологии для получения информации с помощью [и-Э1Ь] и ЯМР твёрдого тела. Доставка [и-ЭГЦ образцов в различные научные и коммерческие организации послужила дальнейшему развитию ЯМР технологий (новые импульсные последовательности, подходы для расшифровки сложных спектров, тестирования чувствительности и разрешающей способности высоких магнитных полей), ИК, МС, а также применению стратегий [и-БИ,] для биофизических и метаболических исследований. Фотосинтетические белки РЦ, СК2, СК1-РЦ использовали в Лейденском Университете и Университете г. Бохума для исследований методами ЯМР, Фурье-ИК и атомно-силовой спектроскопии.

Специализированные образцы были поставлены в Швейцарский федеральный институт технологии, Цюрих; Университет г. Бохум, Германия; Университет г. Ахус, Дания; Университет в Нотингаме, Великобритания; Вайцмановский институт науки, Израиль; Макс Планк Институт, Франкфурт, Германия; Университет г. Страсбург, Франция, Университет г. Лиеж, Бельгия, Лейденский Институт Химии, Наймегенский центр молекулярных наук о жизни, Университет Вагенинга и Лейден-Амстердам центр по исследованию лекарств, Нидерланды, Институт органической химии РАН им. Н.Д. Зелинского, Россия. Таким образом, новые методологии нашли применение для биомедицинских, метаболических, экологических, бионанотехнологических и фундаментальных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка метода получения меченных стабильными изотопами аминокислот из гидролизатов биомасс различных источников; получение меченных стабильными изотопами фармацевтически важных пептидов на примере зервамицинов, изучение влияние условий культивирования на биосинтез пептаиболов, их исследование методом масс спектрометрии.

2. Методология [и-ЭГЬ] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых и получение белка-мишени на примере гистаминового рецептора Н1Я человека.

3. Получение и биофизическое изучение с помощью методов ЯМР в растворе и в твёрдом теле [и-13С,151Ч] пигментов, таких как: хлорофилл (СЫ) а, феофитин (РЬео) а; бактериохлорофилл (ВСЫ) а, бактериофеофитин (ВРЬео) а.

4. Разработка рациональной и эффективной методологии получения структурной информации о лиганде в мембранно-белковом комплексе, о лиганд-белковом и лиганд-лигандном взаимодействии путём изучения электронной структуры, поляризации, протонирования. На примере бактериальных фотосинтетических мембранных комплексов, таких, как реакционные центры (РЦ) и светособирающий комплекс 2 (СК2) исследованы возможности: А) Методов [11-51Ц и двумерной (2Б) корреляционной ЯМР для характеристики атомной структуры лиганда в мембранном белковом комплексе; Б) Фурье-ИК для изучения [Ч-БГЦ лиганда в мембранном белковом комплексе, определения степени замещения лиганда в белковом комплексе и его взаимодействия с белковым окружением. Для этого разработаны условия фотонакопления Нд" в РЦ; В) Изучения кофактор-кофакторного взаимодействия в СК2.

5. Разработка эффективной методологии получения информации о структуре целого мембранно-белкового комплекса с помощью [и-БГЦ и 20 корреляционной ЯМР.

Личный вклад автора в диссертацию. Автором чётко выявлялась проблематика по вопросу, изучалась литература, определялись цели и задачи исследования, выбор пути их реализации, новизна, осуществлялось выполнение и анализ экспериментов, обсуждение результатов, их интерпретация и обобщение, формулирование основных положений и выводов.

Апробация работы. Материалы работы были доложены в ряде институтов и университетов, на 38 международных конференциях, съездах и конгрессах:

по стабильным изотопам: "2-я всемирная конференция по стабильным изотопам в питании и метаболических исследованиях", Ротердам, (Нидерланды, 1994); "14-й Американский пептидный Симпозиум", Колумбус, (США, 1995); "5-й Неапольский симпозиум по биологически активным пептидам", Капри, (Италия, 1996); "Конференция, посвященная 100 летию со дня рождения Преображенского", Москва, (Россия, 1996); "11-й международный симпозиум по каротиноидам", Лейден, (Нидерланды, 1996); "Х1-Й международный конгрессе по фотосинтезу", Будапешт, (Венгрия; 1998); "5-я Европейская конференции по биотехнологии водорослей", Потсдам, (Германия, 2003); "Симпозиум по Натепи1а ро1утогрИа", Алгеро, (Италия, 2004); "10-я международная конференция по прикладной фикологии", Кунминг, (Китай, 2005); "11-й интернациональный конгресс Фитофарм", Лейден, (Нидерланды, 2007); ЕШОМАЯ 2008, Санкт Петербург, (Россия, 2008);

по мембранным белкам: "7-я международная конференция по ретинальным белкам", Зихрон Яков, (Израиль, 1996); "Интернациональная конференция по мембранным белкам", Амстердам, (Нидерланды, 2000); "8-я международная конференция по кристаллизации биологических макромолекул", Сандестин, Флорида, (США, 2000); "Европейский колледж: Как получить белок?" Гронинген, (Нидерланды, 2003); "14-й Камерино-Нордвикерхаут симпозиум по прогрессу в области химии рецепторов", Камерино, (Италия, 2003);

"Международная конференция Биобизнес Азия", (Тайвань, 2005); "Нидерландский инновативный семинар", Пекин, Шанхай (Китай, 2005); семинар о технологиях PLI в Биосаенс парке Кэмбриджа, (Великобритания, 2005), "Международная конференция БиоАзия 2006", Хайдарабад, (Индия, 2006) и "БиоБангалор 2006", (Индия, 2006), "XVIII Менделеевский конгресс по прикладной и общей химии", Москва, (Россия, 2007);

по спектороскопическим методам: 39-я, 40-я и 41-я конференция по экспериментальной ЯМР, Азиломар, Калифорния, (США, 1998, 1999, 2000); "3-я Европейская конференция по ЯМР биомолекул, меченных стабильными изотопами", Оксфорд, (Великобритания, 1998); симпозиум "Перенос энергии в биологических системах", Оеирас, (Португалия, 1998); "3-й международный симпозиум по инфракрасной и рамановской спектроскопии", Вена, (Австрия, 1998); Лаборатория физической химии, Швейцарский Федеральный Институт Технологии, Цюрих, (Швейцария, 1999); Институт Ботаники Университета Мюнхен, (Германия, 1999); "Альпийская конференция по ЯМР твёрдого тела", Шамони МонБлан, (Франция, 1999); Симпозиум по внутреннему и внешнему переносу электрона, Вилдбад Креут, (Германия, 2000); международный симпозиум "Будущее ЯМР твёрдого тела в биологии", Лейден, (Нидерланды, 2000); Центр Томографии и Спектроскопии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Москва, (Россия, 2007), "EUROMAR 2008", Санкт Петербург, (Россия). Новые технологии по [U-SIL] и биофизическим исследованиям структуры и функций биомолекул были представлены на научном семинаре фирм Солвей Фармацевтикалз, Вейсп, (Нидерланды, 2004), ГлаксоСмисКляйн, Стивенэдж, (Великобритания, 2005) и на телеконференции Эли Лилли, (США, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 23 научные статьи, свыше 40 тезисов научных докладов, 2 публикации в книгах, Европейский патент, заявленный в РФ, США, Европе, Австралии, Канаде, Японии и выданный в 2011 г в РФ и Австралии.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах, содержит 25 таблиц, 77 рисунков, включает введение, 4 главы - От источника к целевому продукту: потенциал природного разнообразия и эффективность мечения стабильными изотопами (1); Меченные стабильными изотопами аминокислоты и пептиды (2); Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых и млекопитающих и белки-мишени (3); Структурно-функциональные исследования мембранных комплексов: стратегии тотального мечения стабильными изотопами (4); Выводы. В каждой из глав представлен обзор литературы, включающий новейшие данные, с общим библиографическим списком свыше 500 наименований. Работа выполнена при поддержке грантов NWO, проекта ZonMW 014-81-133 Т.А. Егоровой по программе по стимулированию инновационного исследования медицинских препаратов и предпринимательства в Нидерландах, компанией PLI, Лейден.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ГЛАВА 1. ОТ ИСТОЧНИКА К ЦЕЛЕВОМУ ПРОДУКТУ: ПОТЕНЦИАЛ ПРИРОДНОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 15С,

1.1. Потенциал меченных стабильными изотопами биологически активных соединений

Развитие разрешающей способности и детекции аналитических инструментов МС, ЯМР, ИК, Рамановской спектроскопии открывают новые перспективы для применения меченных стабильными изотопами 13С, 151Ч, 2Н, 180 целевых продуктов для решения задач в структурной биологии, протеомике, метаболомике. В данной работе рассмотрены вопросы специфики эффективного введения стабильной изотопной метки 1ЭС, 15Ы, 2Н для различных организмов, как прокариот (археи, бактерии), так и эукариот (грибы, водоросли, клеточные линии насекомых и млекопитающих), изучения химического состава биомасс, выделения целевых продуктов, определения степени обогащения и последующего биофизического исследования. Особое внимание уделялось разработке методик и подходов по эффективному [и-81Ц в клеточных линиях насекомых и млекопитающих, как наиболее перспективных для производства функциональных белков-мишеней и терапевтических белков, а также по получению экстрактов для метаболического профилирования. Выбор микробиологического источника и условий культивирования являлся определяющим параметром, приводящим к определённому составу биомассы для выделения различных биологически активных соединений (Рис. 1, Таб. 1). Полученные в работе соединения характеризовали и исследовали с помощью биофизических методов ЯМР, Фурье-ИК, МС.

1Светособирающий комплекс 2 —Реакционны* центры | —Аминокислоты"] —4 ВРЬеое"]

—4 Ам*1

—4 Стерины]

} Бастериородолсин [ ■ Аминокислоты

ЗорВ!

Компоненты

ростовых сред

"1 Дрожжи )

Р-кароту ^ РЬео а | —| СЫ« |

| Водоросли 'г--

Виолаксантим

—»||1.«арогин 1

->| РИеое, РНео ь ]

->[ СЫа.СЫь"]

Компоненты Компоненты 1, 1 Компоненты

ростовых сред ростовых сред

Разработка пи татепьных сред

для роста клеток насекомых и млекопитающих

Клеточные линии млекопитающих

Клеточн ые лин ии и «секо м ых~{

|_Гист«миновый рецептор человека Н1К ]

Рис. 1. Выборочные примеры получения целевых продуктов, меченных стабильными изотопами.

Таблица 1. Источники для получения (меченных стабильными изотопами) целевых продуктов

Таксономическая принадлежность Вид

Фототрофные пурпурные несерные бактерии (ЯЬскк^ртИеае) Rhodobacter sphaeroides R26 Rhodopseudomonas acidophila 10050 Rhodopseudomonas palustris 17001

Архея, экстремально галофильная архебактерия Halobacterium salmarum ATCC 29341

Метилотрофные облигатные бактерии Methylobacillus flagellatum ATCC 51484 Methylobacterium extorquens 8PM

Метилотрофные факультативные бактерии Brevibacterium melhyllicum B5652

Красные водоросли (Юю<1ор|1уШ) Cyanidium caldarium SAG 16.91 Galdiera suljuraria SAG 17.91 Porphyridium purpureum ATCC 50161

Диатомовая водоросль (ВасШапорЬу^а) Phaeodactylum tricornutum UTEX 640

Зелёные водоросли (СЫогорЬуШ) Chlorella viridus ATCC 16487 Scenedesmus obliquus ССАР 276/3C

Синезелёная водоросль (СуапорЬу1а) Spirulina plalensis UTEX 640

Бурые водоросли (РЬаеорЬусеае) Undaria pinnatiflda KU-206 Dictyota dichotoma KU-1070 Ectocarpus siliculosus K.U-1110

Растение (СЬепороШасеае) Chenopodium rubrum L

Метилотрофные дрожжи Pichiapastoris NRRL-Y-11430 Hansenulapolymorpha CBS 4732 Saccharomyces cerevisiae ATCC 13057

Гриб Emericettopsis salmosynnemata 336 IMI 58330

Клеточная линия насекомых Spodaptera fiugiperda 9 (Sß) CRL-1711

Клеточные линии млекопитающих Chinese hamster ovarian (CHO) ATCC CC1-61 Human embryonic kidney (HEK293) ATCC CRL-1573

Следует отметить растущую значимость потенциала водорослей как источника меченных стабильными изотопами биологически активных соединений. На примере культивирования бактерий была показана зависимость между условиями культивирования и выходом целевых продуктов, таких как мембранно-белковые компелексы. Были подобраны условия для получения автолизатов из биомассы дрожжей для их применения в качестве компонентов сред для клеточных линий насекомых и млекопитающих. Разработан мониторинг состава биомасс из различных природных источников с помощью анализа методом Фурье-ИК.

1.2 Водоросли для биотехнологии: от вида к продукту

В настоящее время растёт популярность выделения различных биологически активных веществ из водорослей. Водоросли исследуются как источники фармакологически активных соединений и других высокоценных молекул, как например, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), пигменты, такие как хлорофилл, ß-каротин, астаксантин и фикобилипротеины, стерины, витамины, такие как A, Bi, В2, В6, Bt2, С, Е, никотинат, биотин, фолиевая и пантотеновая кислоты, полисахариды, токсины и другие соединения. Известно применение экстрактов водорослей в медицинских целях. Водоросли, как, например, Chlamydomonas reinhardtii, представляют собой клеточные фабрики для производства терапевтических и биотехнологических белков. Ожидается растущий рынок новых лекарственных препаратов на основе водорослей. Фотосинтетическая природа и популярность водорослей позволяет производить на их основе меченную стабильными изотопами l3C, 1SN, 2Н биомассу из относительно недорогих неорганических молекул (13С02, 15NO;f' 2Н20) для последующего получения высокоценных молекул. С учетом того, что цена 13СОг ($34 за 1 г 13С02, $117 за 1 г 13С) ниже цены [U°C6] глюкозы ($140 за 1 г [и'3С6]-0-глюкозы, $350 за 1 г 13С), фотоавтотрофное получение меченых соединений из различных водорослей представляет собой экономический интерес.

Штаммы водорослей использовали из коллекции культур водорослей и простейших (ССАР), из коллекции культур Университета Техас, США, и Университета Кобе, Япония (Таб. 1). Выбор штамма водорослей был основан на составе их биомасс при заданных условиях выращивания с учётом потенциального применения различных продуктов на их основе: компонентов питательных сред для клеточных линий насекомых и млекопитающих, выделения индивидуальных аминокислот, пигментов, ПНЖК и фитостеринов. Водоросли культивировали в фотоавтотрофных условиях. В случае С. caldarium и G. sulphuraria в качестве источника 15N использовали ("NH^SO,», 15N 99%, ("Cambridge Isotope Laboratories", США), и в качестве источника 13С -13С02,13С 99%, ("Gas-Oil", Калининград, Россия). Эксперимент по 15М-мечению проводили в ёмкостях объёмом 10 л каждая, а для введения 13С и 13С, 15N использовали специальные установки, представляющие собой две соединённые между собой с помощью силиконового шланга колбы пеницилинового типа ("Scott Duran") объёмом 8 л каждая или 8 колб объёмом 1 л. В обоих случаях использовалась качалка Gio Gyrotory, "New Brunswick Scientific", выращивание проводили при температуре 27°С при 40 об/мин. Освещение подавалось от 12 ламп Osram HQL-A 80 W, закреплённых на специальном каркассе сверху культур, на расстоянии 60 см, и составляло 8000 Люкс. 13СОг поступал в систему из резинового балона ("Oxford Instruments", Великобритания) с помощью насоса (Anker, типа N853 КТЕ). Перед выполнением экспериментов через всю систему пропускали аргон.

Инокулят выращивали при температуре 25°С и интенсивности света 3000 Люкс, его использовали в объёме 0.05% для выращивания биомассы. Процесс проводили в течение нескольких месяцев, что позволяло получать в лабораторных условиях более 1 кг влажной [U-SIL] биомассы. Примеры включают получение биомасс S. obliquus, G. sulfuraría, С. caldarium. На Рис. 2 показано определение степени обогащения [U-I5N] С. caldarium методом LC-MS/MS.

Рис. 2. Оценка введения изотопной метки 15N в [U-,SN] биомассу С. caldarium. По результатам LC-MS/MS анализа трипсинового лизата биомассы, степень обогащения ,SN составляет 99% в случае [U-15N] биомассы, что соответствует теоретическим расчётам изотопного распределения.

Белковые экстракты природной и [U-l5N] биомасс обрабатывали трипсином ("Roche Diagnostics") и анализировали методом LC-MS/MS с использованием системы UltiMate 3000 Proteomics MDLS ("Dionex") и системы ионных ловушек amaZone ("Bruker Daltonics"). Идентификацию белков проводили на природном образце с использованием Mascot 2.2, ("Matrix Sciences Inc") и базы данных NCBI. На Рис. 2 в качестве примера обозначены пики 761.8 m/z (М+2Н)2+ и 770.3 m/z (М+2Н)2+, соответствующие пептиду с последовательностью "GEFLSNTQLDALSK" из природной и [U-15N] биомассы.

Для проведения контролируемого процесса использовали фотобиореактор (0.14 м х 0.56 м, 0.01 м3) с рециркуляцией газа при низком давлении с помощью насоса. В биоректоре выращивали микроводоросль P. tricornutum и получали [U-I5N], [U-I3C] и [U-15N,13C] биомассы. Свежую среду приготавливали из морской воды, из которой удаляли углерод. Инокулят выращивали при искуственном свете (230 цЕ-м"2сек-1) и температуре 20°С на среде Мана и Майера и использовали в объёме 5% для засева в фотобиореакторе. Для получения [U-15N] биомассы использовали Na15N03, 15N 98%, ("Isotec", США) в качестве источника 15N. Реактор функционировал в полунепрерывном режиме при периодическом отборе культуры и замене её свежей средой с производимостью 0.3 г/л биомассы в день. С помощью данного процесса

получили более 160 г [U-SIL] биомассы. Для повышения эффективности использования меченых субстратов, осуществляли реутилизацию неорганического углерода из супернатанта с помощью процесса подкисления/десорбции, а также использовали Na15N03 в минимальных концентрациях. Биомассу собирали после исчерпывающего использования 15NOj".

По данным элементного анализа конверсия 13СС>2 в биомассу составила 89.2%, а его количество в супернатанте составило 6.9%. Эффективность конверсии l5N в биомассу составила 97.8%, а содержание в супернатанте - 1.3%. Эффективность введения изотопной метки 13С определяли после метилирования свежей биомассы по уровню мечения жирных кислот с помощью GC-MS с использованием колонок Agilent CG-6890N и MS-5973N размером 30 м х 0.25 мм, покрытых 5% фенилметилсиликоном и Не в качестве газа-носителя. Степень обогащения жирных кислот составляла для 14:0 98.6%, 16:0 99.3%, 16:1 98.7%, 18:1 99%, 20:5 99.1%. Пример масс-спектров для С14:0 приведён на Рис. 3. Эффективность использования меченых субстратов составила 90%, эффективность мечения стабильными изотопами l5N и 13С выше 96%, что позволяет выделять различные соединения с высокой степенью обогащения в целях их применения для медицинских и биохимических исследований.

Примеры включают получение [U-SIL] гидролизатов для последующего выделения индивидуальных аминокислот (глава 2), получение экстрактов для составления питательных сред в целях эффективного мечения клеточных линий млекопитающих и насекомых (глава 3), получение стеринов, жирных кислот, а также хлорофилла и феофитина в целях изучения лиганд-белковых взаимодействий в фотосинтетических мембранных комплексах (глава 4).

Рис. 3. GC-MS спектр С14:0 жирных кислот, выделенных из биомассы P. tricornutum: природной и [U-'3C] (|3С 98%).

Таким образом, нами учитывалась взаимосвязь между выбором вида водоросли, влиянием условий культивирования на выход целевого продукта, а также эффективность конверсии меченных стабильными изотопами предшественников. Всё большую актуальность приобретают [U-SIL] соединения из водорослей в качестве стандартов для исследований, как в экологии, так и в диагностике. Помимо этого, разработка методов эффективного [U-SIL] является весьма актуальной в связи с прогнозируемым увеличением количества лекарств на основе водорослей.

250000 200000 |150000 §100000 50000 О

2SOOOO 200000 8 150000

13С, природное

jvrfr

30 60 90 120 150

210 240 270 300

О l3C, 98%

з г s I i 135 -150 165 ISO i Я 8 Hi

ill ■1 i I I I I I 11, i, ,

210 240 270 300

1.3 Археи и бактерии

Изучение пигментов и мембранных белков фотосинтетических бактерий методами ЯМР и ИК обсуждается в главе 4. Использовали пурпурные несерные бактерии Rps. palustris, Rps. acidophila, Rb. sphaeroides, принадлежащие к a Proteobacteria. [U-13C,15N] биомассу из Rps. palustris получали культивированием на среде, содержащей [U-13C,15N] гидролизат водорослей (EMBL). [U-13C,15N] биомассу Rps. acidophila получали при росте на среде, содержащей [U-I3C,15N] гидролизат водорослей и [U-I3C,I5N] сукцинат аммония.

Rps. acidophila культивировали анаэробно при температуре 35°С и различной освещённости. После 4 дней культивирования при достижении клетками при X 860 нм OD 250 см"1 или 270 см"1 при освещённости 1000 люкс и 3000 люкс соответственно клеточную биомассу собирали центрифугированием при 4500 об/мин в течение 10 минут. СК2 и СК1-РЦ выделяли по стандартной методике и концентрировали с помощью Centricon Plus-20 на фильтровальной установке (Biomax 100, 100.000 NMWL, "Millipore") до достижения OD 300500 см"1 при 850 нм для СК2 и 880 нм для СК1-РЦ. Мембранные комплексы хранили при температуре -80 °С. Чистоту белков характеризовали определением соотношения ODB850/OD270 для СК2 и ODB880/OD270 для СК1-РЦ, которое составило 3.2-3.5 и 1.7-2.2 соответственно в зависимости от расположения фракций вдоль градиента. Изменение интенсивности света при культивировании позволяло изменять соотношение между комплексами. Было найдено, что, соотношение между СК2 и СК1-РЦ изменялось от 8:1 до 4:1 при интенсивностях света 1000 Люкс или 3000 Люкс. При изучении стабильности было показано, что СК2 более устойчив к изменению температур по сравнению с СК1-РЦ, в случае СК1-РЦ наблюдали, что при 4 "С соотношение ODH8kc/OD27o уменьшалось вплоть до 0.5 за 24 часа. Это учитывали при выделении мембранных комплексов и их изучении.

Было уделено особое внимание эффективности введения SIL, а также масштабированию

процесса. Пример оценки введения 2Н в [U-2H] биомассу В. methylicum показан на Рис. 4.

Рис. 4 ИК спектры биомассы В. methylicum: [U-2H] (а) и природной (б). Обозначен сдвиг вибрационных полос С-Н в области 2800 см'1 в область 2260 см"1 в результате С-2Н. Введение изотопной метки 2Н составило не мене 96%.

Примером служит получение [U-2H] биомасс Я salinarum в биореакторе объёмом 0.5 л культивированием на среде, содержащей 2Н20 (I.E. 99,85%, "Изотоп", РФ) и [U-2H] автолиз ат М. flagellatum, с выходом биомассы не менее 6 г/л. Степень 2Н обогащения оценивали методом MALDI MS по содержанию 2Н в 2,3-ди-О-дифитанил-глицерине, которое составило 96,6%. Получение пурпурных мембран и [U-2H] бактериородопсина расширяет возможности для их использования в бинанотехнологии.

imt зм :sh im ism

Длина волны (см*1)

1.4 Дрожжевые экстракты как компоненты питательных сред

Известен целый ряд клеточных фабрик для производства терапевтических белков и белков-мишеней. Примерами являются бактерии, как Е. coli, дрожжи, клеточные линии насекомых и млекопитающих. Также описана экспрессия белков в растениях и фотосинтетических бактериях. Успешно развивается система бесклеточной экспрессии генов для водорастворимых белков, но её применение для эукариотических мембранных белков ограничено. Питательные среды для клеток-хозяинов отличаются составом и метаболическими предшественниками, необходимыми для достижения высокой степени SIL. Системы экспрессии, обеспечивающие как милиграммовые количества функциональных белков, так и доступное [U-SIL], основаны на Е. coli и дрожжах, поскольку питательные среды для их роста характеризуются простым составом и содержат 13N соли аммония и 13С глюкозу, метанол, или ацетат в качестве источника азота и углерода. Однако, получение белков в функциональном виде в этих клетках-хозяинах, в том числе большинства мембранных белков, является непростой задачей ввиду агрегации с телами включения, требованиями шаперонов для фолдинга или отсутствия соответствующей поспрансляционной модификации. Наиболее часто для этих целей используются клеточные линии насекомых и млекопитающих, но для их культивирования требуются питательные среды довольно сложного состава.

Прямое замещение индивидуальных аминокислот и других метаболических предшественников в средах известного состава на меченные стабильными изотопами аналоги привело бы к стоимости сред от 20,000 до 100,000 Eur за один литр. Это представляет собой финансовый барьер для [U-SIL] эукариотических мембранных белков, особенно с учётом их сравнительно низкого уровня экспрессии в функциональном виде и необходимостью получать миллиграммовые количества очищенных белковых препаратов для структурных исследований. Использование бакуловирусной системы экспрессии (BVES) для клеточных линий насекомых, например, позволяет достичь функциональные уровни экспрессии от 0.1 мг/л для рецептора аденозина человека AI, до 5 мг/л для гистаминового рецептора человека H1R. Похожий уровень экспресси наблюдается и в клетках млекопитающих.

В связи с этим возникает необходимость в разработке эффективного и доступного метода для мечения эукариотических мембранных белков стабильными изотопами. Наш подход для клеток насекомых и млекопитающих основан на составлении сред, содержащих высококачественные [U-13C,15N] дрожжевые экстракты в качестве более дешёвых компонентов по сравнению с индивидуальными аминокислотами и органическими кислотами. С использованием контролируемых условий выращивания в биореакторе было проведено сравнение трёх штаммов дрожжей Я. polymorpha (АТСС #34438), P. pastoris (АТСС #76273) и S. cerevisiae (АТСС #13057) с учётом конверсии глюкозы в биомассу, выхода экстрактов и их

влияния на рост клеток насекомых и млекопитающих. Оценку воспроизводимости партий

биомасс и контроль их качества проводили методом ИК. Введение изотопной метки

определяли с помощью Фурье-ИК (Рис. 5) и LC-MS/MS (Рис. 6).

Рис. 5. ИК спектры биомассы Н. polymorpha: [U-15N] (a), [U-13C,1SN] (б) и природной (в). Коррекция базовой линии выполнена при 1950 см"1. Введение изотопной метки составило не менее 98% по ,5N и 99% по 13С.

Значительные сдвиги амида I (в основном, представляющие валентные колебания СО, 1620-1680 см"1) и/или амида II (деформационные колебания пептидной связи NH и CN, 1520-1560 см'1) в ИК спектре свидетельствуют о высокой степени изотопного

О 08 х 07

3 0.6' о

Е 0.5 □

£ 0.4

§ 0.3 ш

5 0,2

S 0.1

s о

• »

S ¡в

/V > %

I А

/ / \ в

/ ft. ФХ'Ььг <3

/ / ' \ а

Jf./

1700 16» 1500 14« Длина волны (см'1)

обогащения 13С и 15N. На примере [U-15N]Hp показан заметный сдвиг амида II и на примере [U-13C,15N]Hp показан заметный сдвиг как амида I, так и амида И по сравнению с колебательными полосами для природной Hp (Рис. 5).

Дрожжи культивировали с использованием среды "Invitrogen" и среды, описанной Хайне и соавторами для 15N мечения. Поскольку наличие молочной кислоты в составе этой среды не оказывает значительного влияния на выход биомассы, при проведении 13С и 15N, 13С экспериментов её исключали из состава, и в качестве источника 13С использовали [U-13Ce] глюкозу (13С 99%, "CIL"). Источником 15N служил 15NH4C1 (1SN 98%+, "Sigma Aldrich"). В качестве основы для приготовления новых сред использовали супернатант предыдущей клеточной культуры, при этом компоненты среды, за исключением 15NH4C1, добавляли в концентрациях, соответствующих среде Хайне. Среды автоклавировали в течение 50 минут при 121°С. Биопроцесс проводили при температуре 30°С в биореакторе (Bioflo3000; "New Brunswick Scientific") объёмом 5 л с контролируемыми параметрами. Биореактор засевали 510% культурой. Использовали статический режим и его комбинацию с режимом с подпиткой. Мониторинг роста клеток производили измерением OD при 600 нм и веса влажной биомассы. Режим с подпиткой инициировали после фазы статического режима при добавлении в культуру 50% (вес/об) раствора глюкозы со скоростью 3.64 мл/ч в режиме градиета от 1 до 10% в течение 2 часов с последующим добавлением 10% глюкозы до её полного усвоения и последующего роста в течение 3-12 часов. Биомассу собирали центрифугированием в течение 15 минут со скоростью 5000 х g. Супернатант отделяли, биомассу промывали 20 мл miliQ воды и центрифугировали в течение 15 мин при 5000 х g. Биомассу хранили либо в замороженом виде при 20°С или лиофилизованном виде. Выход биомассы составлял 12-18 г/л, конверсия глюкозы - 38-44 % в пересчёте на сухой вес, причём выход в режиме с подпиткой был на 2535% выше по сравнению со статическим.

Рис. 6. Оценка введения изотопной метки 15N и 13С в [U-ISN], [U-1SN,13C] биомассу Я. polymorpha. По результатам LC-MS/MS анализа трипсиновых лизатов биомасс, степень обогащения составляет 99% для ,5N и 99% для 13С, что соответствует теоретическим расчётам изотопного распределения. Пики 830.4 m/z, 839.4 m/z и 877.0 m/z соответствуют пептиду "IINEPTAAAIAYGLDK." из природной, [U-1!N] и [U-1SN,I3C] биомасс. Пик 763.9 m/z присутствует во всех спеирах и относится к пептиду фермента трипсина ("Roche Diagnostics"), который использовали для гидролиза.

Для экстракции дрожжей использовали 12 г влажной биомассы, суспендированной в 30 мл milliQ в ёмкости объёмом 50 мл ("Greiner") с последующим озвучиванием в течении 5 мин ультразвуком. Экстракцию проводили 2% (об/об) этанолом при температуре 50°С в течение 14 часов при pH 8. Супернатанты фильтровали через 10,000 cut-off мембранный фильтр, а затем лиофилизовали. Экстракты получали с выходом 32-37%. Экстракты, приготовленные из биомасс, полученных в режиме с подпиткой, имели наилучшие показатели в качестве компонентов питательных сред. За основу была выбрана описанная методика их приготовления при начале режима подпитки после 16 ч культуры в стационарной фазе. При этом в целом использовалось 22.5 г глюкозы при 20 ч выращивании, и конверсия глюкозы в биомассу составляла 34-37%.

Клеточные линии бабочки-совки S. frugiperda S£9 и млекопитающих (яичников китайского хомячка, СНО, и почек эмбриона человека, НЕК 293) использовали для тестов дрожжевых экстрактов как компонентов среды. Использовали бессывороточные среды известного состава: IPL-41 для Sf9 и DMEM/F12 для С НО и НЕК-293 ("Invitrogen"), где коммерческий дрожжевой экстракт в среде IPL-41 или индивидуальные аминокислоты и органические кислоты в среде DMEM/F12 заменяли приготовленным согласно разработанной

методике дрожжевым экстрактом. Для определения оптимальных концентраций тестировали различные концентрации экстракта: 0.10%, 0.40%, 0.80%, 1.00% и 1.20%. Каждую лунку 96-луночных планшет заполняли Sf9 клетками в среде X-press ("Lonza Benelux") или СНО или НЕК 293 в DMEM/F12 при плотности 2x104 клеток на ячейку. Клеточные линии Sf9 и НЕК293 инкубировали 12 ч в увлажнённом контейнере при температуре 27°С или 37°С соответственно. Затем среду заменяли 100 мкл среды на основании IPL-41 или DMEM/F12 с добавлением экспериментального экстракта и инкубировали в течение 3 дней. Клеточную жизнеспособность и рост определяли добавлением 10 мкл реагента WST-1 ("Roche Diagnostics"). По истечении 0.5, 1, 2 и 4 ч измеряли OD при 450 нм, в качестве стандарта использовали OD при 655 нм. Наилучший рост Sf9 отмечался при использовании 0.4% экстракта из Я. polymorpha (Рис. 7). Для роста НЕК 293 оказались подходящими экстракты из Я. polymorpha и S. cerevisiae (Рис. 8).

Рис. 7. Сравнение влияния дрожжевых экстрактов на рост клеточной линии SS. Экстракты P. pastoris (1), Н. polymorpha (2), S. cerevisiae (3) исследовались при концентрациях 0.1%, 0.4%, 0.8%. Скорость роста в среде IPL-41 с коммерческим экстрактом ("Sigma Aldrich") принята за 1. Представлены средние значения трёх независимых экспериментов.

Рис. 8. Влияние дрожжевых экстрактов на рост НЕК 293. Использовали среды следующего состава: 1-ОМЕМ/Р12; 2-ОМЕМ/Р12 с коммерческим экстрактом. 3-ВМЕМ/Е12 с экстрактом из Н. ро1утогрЬа\ 4-ОМЕМ/Р12 с экстрактом из Р. рая1от; 5-ОМЕМ/Р12 с экстрактом из сггеушае. Экстракты добавляли в концентрациях 0.1% и 0.4%. Представлены средние значения пяти независимых экспериментов. Сходные результаты были получены для СНО.

Таким образом, разработан метод получения экстрактов и исследовано их использование в качестве компонетов питательных сред. Показано, что экстракты на основе Я. ро1утогрЬа оказали наибольший положительный эффект при выращивании 81Э, а для СНО и НЕК293 наилучшие свойства проявили экстракты на основе 5. сегеушае и Я. ро1утогрка. Экстракты из биомассы, полученной в режиме выращивания с подпиткой и при её сборе в конце логарифмической фазы роста, проявляли наилучшие свойства. Аналитические исследования по скринингу открыли новые возможности для эффективного мечения в эукариотических клетках-хозяевах в целях производства белков-мишеней и фармацевтически важных молекул. Например, замещением индивидуальных аминокислот в среде ОМЕМ/Т12 на 0.1% автолизат Я. ро1утогрка уже можно достичь сокращения расходов по формулированию питательных сред для [и-БЩ], по меньшей мере, в пять раз, основываясь лишь на стоимости индивидуальных аминокислот.

"0.1%

C.Vio.34

Концентрация экстрактов дрожжей, %

12 3 4 5 Питательные среды для НЕК 293

1.5 Мониторинг состава биомасс из различных источников с помощью ИК

При работе с микробиологическими источниками важен аналитический метод контроля качества партий биомасс, а также метод определения их химического состава. Основные классы биомолекул (белки, липиды, углеводы) могут быть охарактеризованы с помощью колебательной спектроскопии ввиду их поглощения в различных частотных диапазонах средней ИК области, за счёт характерных полос поглощения колебаний характеристических групп: 1500-1700 см"1 для полос амида I (валентных колебаний СО) и амида II (деформационных колебаний NH и валентных CN амидной группы пептидов); 1700-1750 см"1 для валентных колебаний С=0 групп сложных эфиров липидов и 2800-3000 см "' для валентных колебаний СН ацильных цепей липидов; 1000-1200 см'1 для колебаний С-ОН и С-О-С групп углеводов. По сравнению с дальней ИК областью, большее количество полос и с лучшим разрешением может быть получено в средней ИК области. В результате исследований разработан ИК метод для определения состава биомасс из различных источников.

Биомассы были предоставлены компанией "Protein Labelling Innovation" (PLI), Нидерланды. В качестве стандартов использовали креатин фосфокиназу из мышцы кролика, ЕС 2.7.3.2 ("Boehringer"), яичный фосфатидилхолин ("Avanti Polar Lipids") и солодовый экстракт из крахмального гидролизата (CAS 8002-48-0, "Sigma-Aldrich"). Выбор основан на схожести соответствующих областей спектров стандартов и биомасс. Например, при выборе белка-стандарта сравнивали ИК спектры биомассы со спектральной библиотекой белков с известной вторичной структурой, основанной на данных кристаллографии. Схожесть амидной области в ИК спектрах креатин фосфокиназы и биомасс изучаемых источников показана на Рис. 9. С помощью стандартов получали калибровочные кривые.

структуры белков в образце. Полоса амида II служит основанием для количественного определения содержания белка. Более того, она характеризуется лучшим линейным ответом, особенно для белков с высоким содержанием а-спиральных сегментов.

Рис. 9. Сравнение ИК-спектров биомасс и стандарта: креатин фосфокиназы (а); Сс (б); Нр (в). Выявлены колебательные полосы амида I и амида II в области 1655 и 1545 см"1. Основные различия около 2900 и 1240 см"1 связаны с вкладом липидов в препаратах различных биомасс. На спектре в) показана углеводная полоса в области 1080 см"'.

4000 3SCJ0 ЗООО 2SÛÛ 2000 1SOO 1000

Длина волны (сми)

В ИК спектрах преобладают колебательные подосы амида I и амида II в области 1658 см"1 и 1545 см"1 соответственно, форма которых зависит от вторичной

Как правило, 0.5 мг измельчённой лиофилизованной биомассы суспендировали в 0.4 мл воды и наносили на кюветы с окнами из AgCl ("Fisher Scientific"), с последующим упариванием воды в течение 2-3 ч с помощью изопотенциальной спиновой сушки и получением сухой плёнки. Поскольку получение гомогенного препарата имеет решающее значение, образцы готовили также в виде сухой плёнки путём равномерного распределения суспензии объёмом 150 мкл на AgCl окнах для достижения кругового распределения образца диаметром 12.3 мм с последующим высушиванием в вакууме над силикагелем ("Merck"). ИК спектры были получены при комнатной температуре на спектрометре Mattson Cygnus 100 FT-IR ("Madison Instruments", США), оборудованном узкополостным МСТ детектором, охлаждаемым жидким азотом. Использовали следующие параметры: разрешение, 2 см"1; число суммарных интерферограм, 256; скорость движения зеркала, 1.27 см/сек; диапазон волновых чисел, 4000-750 см"1. Получение и обработку результатов спектрального анализа проводили с использованием программного алгоритма обработки данных EXPERT IR (Mattson), для проверки применяли OPUS-NT 5.0 ("Bruker"). Статистический анализ выполняли с использованием MATLAB 7.3.0 ("The Matworks Inc."). ИК-метод компьютеризирован и требует менее двух минут для регистрации спектра. В Таб. 2 представлены результаты ИК-исследований состава биомасс из источников различной таксономической принадлежности.

Таблица 2. Результаты ИК анализа состава биомассы из различных источников. Представлены средние значения трёх независимых экспериментов. Для образцов, измеренных элементным анализом, количество N (%N*6.25) указано в скобках.

Источники Сокращённое название Белки, % Липиды, % Углеводы, %

С. caldarium Cc 61 ±2 (72) 18+2 21±4

G. sulfuraria Gs 68±3 7+1 25±2

С. viridus Cv 22±1 18+2 61±4

S. obliquus So 33+3 24±2 43+2

P. tricornutum Pt 41 ±3(40) 29±2 30+2

S. plalensis Sp 12+1 (27) 15+2 69+7

M. extorquens Me 75+2 (77) 16±2 9±2

H. polymorpha Hp 52+2(39) 18+3 30+5

P. pastoris Pp 11±2 (14) 10±1 79±3

S. cerevisiae Sc 48±2(50) 18+2 34+2

Содержание белка определяли по площади под профилем полосы амида II в области 1545 см"1. Ввиду гетерогенного состава липидов в различных источниках, их содержание определялось интегрированием популяции колебаний С-Н в области между 2984 и 2780 см"'. Содержание углеводов определялось интегрированием полос С-ОН в области 1180 и 1133 см"1. В результате линейного регрессионного анализа были получены калибровочные графики, в

соответствии с которыми анализировали состав биомасс. С учётом коррекций базовой линии и последующим интегрированием в области колебаний 1590 и 1477 см"1 на образцах с известным содержанием креатин фосфокиназы была получена калибровочная линия (Рис. 10). Интеграционные пределы выбирали с учётом возможности измерения SIL белков.

Количественный анализ липидного содержания проводили путём определения площади под полосой при 2854 см"1 (симметричные С-Н валентные колебания -СН2- групп, в основном, в липидной ацильной цепи). Применяли двухточечные коррекции интервала базовой линии в области от 2880 до 2830 см"1 для предотвращения перекрытия с небольшими вкладами в поглощение симметричных валентных колебаний связей метальных групп. Поскольку в некоторых случаях полоса при 2854 см"1 проявляется слабо в виде неразрешённого плеча, была использована полная область С-Н валентных колебаний (2984-2780 см"1), представленная колебательными полосами групп СН2- и -СН3. На основании спектра креатин фосфокиназы (Рис. 11) видно, что колебания белка вносят вклад в область от 2984 до 2780 см"1, в основном, за счёт колебаний метальных групп в боковых цепях нейтральных аминокислот. В результате липидная фракция может быть несколько переоценена. Из соотношения площади области 2780-2984 см"1 и области амида II в спектре креатин фосфокиназы определили, что вклад белковой части в область С-Н колебаний в спектрах биомасс составляет 40±10% от области амида II. Содержание липидов определяли вычитанием вклада белковой части из общей интегрированной площади в области 2780-2984 см"1 (Рис. 11).

Присутствие углеводов в образцах биомасс оценивали на основании сложной, но характерной группы полос в области между 1185 и 950 см"1 (Рис. 12). В связи с перекрытием многих полос в этой области, трудно достичь более детального соотнесения сигналов. Хотя для количественного определения углеводов известно использование основной колебательной полосы в области 1080 см"1, этот подход не является подходящим в качестве общего метода, поскольку в этой же области выявлены -РО2- симметричные колебания фосфолипидов и ДНК, а также Si-O колебания, характерные, например, для биомасс диатомовых водорослей. В ИК спектре наблюдается характерная полоса в области 1150 см"1 С-0 валентных колебаний. Несмотря на то, что состав углеводов в биомассах сильно варьирует, в ходе исследования был проведён полуколичественный анализ. Интегрирование полосы при 1151 см"1 в области между 1180 и 1133 см"1 с использованием двухточечного интервала привело к высокому коэффициенту корреляции. Значение погрешности составили +0.06 (Рис. 12). Первоначально общее количество белков, липидов и углеводов принимали за 100%, при этом не учитывали содержание аминокислот, нуклеиновых кислот и других метаболитов. Данные ИК сравнивали с результатами CHNOS элементного анализа.

3000 2800 О 0.S 1

Длина волны (сиг1) Содержание липидов (мг)

Рис. 10. А) Характерные полосы амида I и амида II в ИК спектрах для креатин фосфокиназы (а); Сс (б); Нр (в). Основное отличие в области 1450 и 1740 см'1 объясняется вкладом липидов в препаратах биомасс. Вертикальные линии показывают границы интегрирования и их положение на базовой линии. Б) Калибровочный график для определения содержания белка в препаратах биомасс. Показана зависимость площади под полосой амида II в области от 1580 и до 1485 см"1 от количества белка в образце (в мг).

Рис. 11. А) Характерные полосы С-Н валентных колебаний в ИК спектрах для яичного фосфатидилхолина (а) (полоса при 3015 см'1 представляет С-Н колебания в eis ненасыщенных ацильных цепях, в спектре биомасс эта полоса практически не выражена); Сс (б); Нр (в). Вертикальные линии показывают интегральные границы и их положение на базовой линии. Б) Калибровочный график для определения содержания липидов в препаратах биомасс. Площадь под полосами между 2984 и 2780 см"1 отражает количество липидов в образце (в мг).

3 3«

л 1 А

/ ?М ä j

•i 1 04 /

\а I«

Рис. 12. А) Характерные полосы валентных С-О и О-Н деформационных колебаний углеводов в ИК спектрах для гидролизата крахмала (а); Сс (б); Нр (в). Вертикальные линии показывают границы интегрирования. Б) Калибровочный график' для определения содержания углеводов в биомассах. Площадь под полосами между 1180 и 1133 см'1 отражает количество углеводов в образце (в мг).

1200 1100 1C0Q D 32 0.4 0в

Дли на волны {см') Содержание углеводов (иг)

Выявили, что для большинства биомасс (П, Ме, Рр и Эс) данные ИК находятся в хорошем согласии с элементным анализом, но для Нр, Сс и Бр наблюдали некоторые отклонения (10-16%). В случае, когда присутствуют значительные количества других азотсодержащих соединений, таких как, например, короткие пептиды, аминосахара, хлорофиллы, фосфолипиды и нуклеотиды, белковое содержание может быть переоценено. ИК метод позволяет селективно определять содержание белка с воспроизводимостью ± 3%, в зависимости от выбора стандарта. Было найдено, что содержание белка в Сс, Ов и Ме превышает 60%, а Р(: и Бо содержат сравнительно много липидов. Также показали, что для негомогенных образцов более подходящим является метод АТЯ.

Таким образом, был разработан довольно простой и быстрый полуколичественнный ИК метод определения химического состава биомасс, который позволяет осуществлять контроль воспроизводимости партий биомасс, выбирать источники, изменять условия выращивания в зависимости от целевого назначения биомассы, например, для выделения аминокислот из белковых гидролизатов, или ПНЖК из биомасс с их высоким содержанием в липидной фракции. Метод применим к биомассам, меченным стабильными изотопами (15Ы, 13С, 2Н).

ГЛАВА 2. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ АМИНОКИСЛОТЫ И ПЕПТИДЫ ДЛЯ ПРОТЕОМИКИ И СТРУКТУРНОЙ БИОЛОГИИ

2.1. Меченные стабильными изотопами аминокислоты

Доступность меченных стабильными изотопами аминокислот расширяет возможности их использования для протеомики при различных стратегиях мечения, таких как SILAC, U-SIL, а также для структурной биологии. Нами был разработан новый метод препаративного выделения индивидуальных аминокислот в миллиграммовой шкале, основанный на ОФ-ВЭЖХ с использованием предколоночной модификации с помощью карбобензоксихлорида (Z-C1). Метод тестировали на примере гидролизата уреазы из соевых бобов и применяли для препаративного выделения Z производных аминокислот из гидролизатов биомасс различного микробиологического происхождения: водорослей, галофильных и метилотрофных микроорганизмов. Например, [U-2H] аминокислоты со степенью обогащения 2Н 97-98% выделяли из биомасс М. flagellatum. Введение изотопной метки оценивали на Finnigan МАТ -144 S спектрометре (США) с использованием метода ионизации электронным ударом. Независимо от биологического источника белка, аминокислоты выделяли с выходом 68-89% и хроматографической чистотой 96-99%. С помощью разработанного метода выделяли Phe и Leu из культуральной жидкости микроорганизмов-продуцентов. Выделение аминокислот проводили в два этапа: с использованием градиентной элюции и рехроматографии полученных фракций в изократическом режиме. Для аналитической хроматографии использовали колонки Econosil С18, 5 мкм; 4.6 х 250 мм и элюенты вода/ТФУ 100/0.5 (об/об) и ацетонитрил/ТФУ 100/0.5 (об/об); для препаративной - колонку Silasorb С18 5 мкм; 4.6 х 250 мм.

Разработанный метод позволяет получать 2Н, 13С, 1SN, 180 аминокислоты из различных источников. Индивидуальные SIL аминокислоты могут быть использованы для пептидного синтеза, а также в качестве компонентов питательных сред, как для селективного мечения белков, например, бактериородопсина, так и в [U-SIL] стратегиях.

2.2. Меченные стабильными изотопами пептаиболы

Пептиды, образующие ионные каналы, такие как зервамицин, похожи по функциональности на более сложные белки, образующие ионные каналы. Для изучения структуры и функции зервамицинов, их взаимодействия с мембраной и молекулярного механизма ионной проводимости методами ЯМР и ИК были получены специфически SIL пептаиболы зервамицины в результате культивирования гриба Е. salmosynnemata. Для введения метки выбрали два ароматических аминокислотных остатка Тгр-1 и Phl-16, поскольку предполагается, что эти N- и С- концевые аминокислоты могут играть важную роль в

механизме открытия и закрытия каналов (Рис. 13). Поскольку питательные среды для роста Е. salmosynnemata содержат глюкозу, крахмал, мелассы, пептон, дрожжевой экстракт и неорганические компоненты, они не могут быть применены для специфического введения стабильной изотопной метки. Поэтому была разработана специальная синтетическая среда, содержащая меченые метаболические предшественники в повышенных концентрациях для предотвращения de novo биосинтеза.

Зервамицин - 1С: Ac-Trp*-Ile-Glu-Iva-Ile-Thr-Aib-Leu-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-PU*

Зервамицин - IIA: Ac-Trp*-IIe-Gln-Aib-Ue-Thr-Aib-Leu-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phl*

Зервамицин - IIB: Ас-Тф*-11е-С1п-1уа-11е-ТЬг-А1Ь-Ьеи-Нур-01п-А|Ь-Нур-А|Ь-Рго-РЫ*

Рис. 13. Первичная структура пептидных антибиотиков зервамицина 1С, ПА и IIB. Iva D-изовалнн, Aib аминоизобутановая кислота, Hyp - гидроксипролин, Phi - фенилаланинол. Аминокислоты, меченные стабильными изотопами, обозначены*.

В качестве метаболических предшественников использовали [2lb]L-Phe в случае [2H3]L-Phl-16; [2H5]L-Trp или [l'-15N]- антраниловую кислоту для получения [2H5]L-Trp-1 или [Г-15N]L-Trp-1 соответственно. Зервамицины выделяли экстракцией метанолом и бутанолом с последующей гельфильтрацией и ОФ ВЭЖХ. Для гельфильтрации использовали колонку Sephadex LH-20 (1.5 х 55 см). В качестве элюента служил метанол, детекцию фракции зервамицинов проводили при 280 нм. ВЭЖХ выполняли на приборе Pharmacia LKB 2248. Результаты аналитической ВЭЖХ представлены на Рис. 14.

Рис. 14. Хроматограмма, полученная в результате ОФ-ВЭЖХ для зервамицинов 1С, IIA, IIB. Колонка SuperPac Spherisorb ("Pharmacia") ODS 5 мкм, 250 х 4 мм, мобильная фаза Me0H/CH3CN/H20 (62.5/22.5/15.0 об/об/об); изократический режим, скорость 0.4 мл/мин; флуоресцентное детектирование Хе\ 287 нм, Хеш 348 нм.

71 8

J J

г te 1 1 ... 1!_ ?Е А

, i

Для препаративного разделения использовали колонку Europrep 60-10 Cl8 10 мкм, 250 х 4 мм. В результате изократической элюции были получены зервамицин 1С и смесь зервамицинов IIA и ИВ. Контроль специфического введения метки проводили с помощью метода FAB-MS на JEOL JMX SX/SX 102А спектрометре (Япония). В спектре в Время, мин " области низких масс регистрируются пики 58 (Aib), 70 (Pro), 72 (Iva), 86 (Ile и Hyp), 101 (Gin), 120 (Phi), 201 (ацетил-Trp). В области спектра высоких масс, показанных на Рис. 15, чётко видны моноизотропные пики пептидов IIA и IIB в катионной форме при 1847 и 1861, а также ряд пиков типа B-последовательных ионов.

SU ».М 311.1 ИМ <10.i 9».] <11.1 lil.l SI« Я.С", »>.2 313.i «7».J Ml.) iU.t ?>}.<

0. e, a, a, a, B.

10M.5 llil.S

»л—с.-«—с»"«

.. »! Ml <i tí r* t

—O».«-; j»-Oí-e-¡-JJ— C—C-'-^e»-«-:-»-»-«-;**--^--1e—

•«"OS CM» OS K-©S «СОН О 1111« os os ft os os

—C—«•

f» ""Vе-

ЧГ as

1171.« 1571.7 ¡X.JUI* ■ 1147.«

Ult.l гнал t«.Mt" • UÍ1.Ü

Bit a..

i i ;

! Г»! J fii

—СтИ- у-с ■— - •

15?6.Э 13Э0.9

_r«2

I |'П P " 171»

' I 1-Ч

' '1 'Г ' »1 1" I'll

I37B.8 13«.1

jÁL.

"1 I' I 'I I

->Г»г

isas

itet.r l06?-s

668.Э .

7GS.S

<h J, i

i^m

a Jf

iUii.ti.iin. i, i i

Рис. 15. Масс спектр смеси зервамицинов IIA, IIB, полученный с применением метода FAB-MS, с характерной ионизацией ионов по типу В. Пики типа В-последовательных ионов характеризуют наличие в образце зервамицинов IIA и IIB и подтверждают последовательность аминокислот в полипептидной цепи.

Результаты MS/MS спектра подтверждают аминокислотную последовательность в каждом из пептидов. Что касается Leu, Не и Hyp, то их идентификация произведена на основе вторичной фрагментации, с учётом разрыва Ср-Ст связи в случае Leu и Не. В MS для зервамицинов НА и IIB обнаружены моноизотопные пики [M+Na]+ 1852 (IIA) и 1866 (ZIIB) соответственно (Рис. 16). Изотопное обогащение определялось соотношением между интенсивностью пика [M+Na]+ природного соединения и пиками [15N] или [2Н5] меченых соединений с учетом коррекции вклада, приходящегося на соединения, присутствующие в среде. Из проведенного анализа видно, что мечение стабильными изотопами L-Phe определяется вкладом на 68% [2Н5], 27% [2Ht], 5% [2Нз]; а в случае для L-Trp вкладом на 67% [2Hs], 28% [2Hi], 5% [2Нз]. Это соответствует степени мечения ароматических колец для обеих аминокислот 92.5%. С учётом того, что интенсивности пиков природного зервамицина при 1861 (92%) и полностью меченого пептида при 1866 (92.5%) примерно равны, и, принимая во внимание точность определения стабильной изотопной метки 2%, можно считать, что интенсивность пика зервамицина IIB при 1866 представлена вкладом [2Hs]-, [2Н4]-, и [2Нз]-

Рис. 16. Масс спектр зервамицина IIA и IIB А) с природным содержанием изотопов и Б) [2,3,4,5,6, -*Н5] -Phl-16.

Провели ряд экспериментов со средами, содержащими различные концентрации

метаболических предшественников. Было вьивлено, что при высоких концентрациях глюкозы (160 мг на 100 мл среды) вместо меченых по Тгр-1 зервамицинов 1С, IIA, IIB основными продуктами являлись немеченые [Leu-1, Aib-4]- и [Leu-1, Iva-4]-зервамицины, о чём свидетельствует появление пиков при 1774 и 1787 соответственно. Различная эффективность введения меченых метаболических предшественников объясняется de novo метаболическим биосинтезом из немеченых предшественников, содержащихся в среде. Таким образом, в ходе работы были получены зервамицины типа 1С, IIA и IIB (Рис. 13), меченные стабильными изотопами по следующим аминокислотным остаткам: [2', 4', 5', 6', 7 - 2H5]L-Trp-1 (2Н; 78%), [1* -,5N]L-Trp-1 (lsN, 55%) и [2',3',4',5',6'- 2H5]L-PhI-16 (2Н; 82%); при этом разбавления стабильной изотопной метки по другим аминокислотным остаткам не наблюдалось.

1847.1

„ 1861.2

m/z

1852.2 1866.2

m/z

ГЛАВА 3. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВ-МИШЕНЕЙ

3.1 Меченные стабильными изотопами клеточные линии млекопитающих

Существует ряд коммерческих сред для клеточных линий млекопитающих и насекомых, включающий как среды с добавлением эмбриональных сывороток телят, так и синтетические бессывороточные среды. В настоящей работе исследовалась возможность замены дорогостоящих метаболических предшественников, в первую очередь, аминокислот и органических кислот в синтетических средах на специально приготовленные экстракты, полученные из биомасс различных микробиологических источников. Было выбрано и исследовано более 30 различных типов микроорганизмов, получено и проанализировано более 700 различных автолизатов, гидролизатов и экстрактов. При этом был изучен биотехнологический потенциал природных источников различных таксономических классов и проведены расчеты по себестоимости производства меченых биомасс с учётом стоимости метаболических предшественников и их конверсии в целевой продукт. Воспроизводимость состава биомасс контролировали методом ИК. Исследовали различные условия гидролиза и экстракции. Аминокислотный анализ (ОФ-ВЭЖХ, БМОС) использовался для качественной и количественной оценки аминокислот. Выявили, что комбинация компонентов сред на основе дрожжей и красных водорослей приводила к наилучшим результатам. Результаты успешного замещения индивидуальных аминокислот на дрожжевые экстракты в питательных средах для клеточных линий СНО и НЕК 293 описаны в главе 1.4. На Рис. 17 приведено сравнение роста клеточной линии СНО в различных средах.

0.6 -

0.4 -

0.2 -0.0

Рис. 17. Сравнение роста клеточной линии СНО в различных питательных средах: 1-Ех-Се11 302 ("JRH"); 2-DMEM/F12; 3-модифицированная DMEM/F12 без аминокислот; 4-модифицированная DMEM/F12 без аминокислот, с дрожжевым экстрактом; 5- PLI m

2.0 1.8 1.6 -X 1.4 ■ ° 12 5 1.0 -

§ 0.8 - 3 1 J j Питательные среды нового состава PLIm

|| II поддерживают рост СНО и НЕК 293 с

« * I !

|_ — I ; % использованием в их составе комбинации 0.1% -

' Питательная3^ ДЛЯ СНО5 °"2% автолизата дрожжей с 0.05% гидролизатом или

автолизатом водорослей. Степень введения изотопной метки определяли по 151Ч, поскольку сдвиг колебаний по амиду II легко детектируется с помощью ИК. На Рис. 18 показана область ИК спектра с основными пиками белка для немеченых и [и-15М] мембран СНО, полученных из клеток, выращенных на немеченой и [и-15Ы] среде PLIm. После проведения трёх пассажей клетки осаждали центрифугированием, получали мембранные плёнки, которые анализировали методом ИК.

Рис. 18. Определение эффективности l5N мечения с помощью ИК. В то время, как для колебаний амида I (С=0) при 1650 см"1, не наблюдаются сдвиги, связанные с 15N мечением, полоса амида II (C-N-H) характеризуется сдвигом от 1546 см"1 в немеченых мембранах до 1528 см"1 в [U-15N] мембранах, что свидетельствует об эффективности введения 15N выше 90 %. Плечо у полосы амида I представляет вклад '^-содержащих групп боковых остатков аминокислот Arg, Lys, Trp, Pro, Asn, Gin, His и аминогрупп фосфолипидов.

Длина волны (см-1)

С помощью замены индивидуальных аминокислот и органических кислот в среде DMEM/F-12 на меченые автолизаты дрожжей и водорослей достигается значительное уменьшение расходов по мечению стабильными изотопами. С учётом того, что стоимость 13С, 15N меченых экстрактов составляет 4,000 Eur за г и что в состав питательной среды входит 0.10.2% экстракт, а также на основании стоимости индивидуальных аминокислот и органических кислот, был сделан вывод о 8-кратном уменьшении расходов для питательной среды в случае СНО и 6-кратном в случае НЕК 293. В случае для [U-15N] оценили 3-4- кратное уменьшение расходов. Выбор клеточной линии зависит от функционального уровня экспрессии выбранной молекулы, включая белок мишень или молекулу терапевтического действия. С помощью разработанных сред возможно также селективное мечение в специальных условиях, путём добавления к питательной среде избытка тех индивидуальных аминокислот в немеченом виде, которые предполагается иметь в немеченом виде. Экстракты клеток млекопитающих могут быть использованы для метаболического профилирования при разработке новых профилактических фармакологических и диетических подходов для чувствительных тестов при ранней диагностике в целях предотвращения заболеваний.

Таким образом, [U-SIL] в клетках млекопитающих открывает новые перспективы для решения задач в структурной биологии, протеомике, метаболомике.

3.2 Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых.

Для мечения клеточных линий насекомых доступно лишь несколько питательных сред (BioExpress 2000, "CIL"), но информация об их составе неизвестна. Наша методология основана на разработке питательных сред, скрининге оптимальных условий роста клеточных линий насекомых и накопления белка. На основе разработанной методологии с использованием BVES в клеточной линии Sf9 был получен фармакологически важный белок-мишень, [U-15N] H1R человека (Рис. 19).

Рис. 19, Схема получения белков-мишеней для ЯМР и конструирования новых лекарственных препаратов. Получение [U-SIL] H1R человека.

Использовали клеточную линию SI9, которую постепенно адаптировали из бессывороточной питательной среды Xpress ("Lonza") к условиям роста в среде с 95% IPL-41 и 5% Xpress в Тгз-колбах (25 см2, "Greiner"). Эти же условия использовали для поддержания культуры в проточной культуре. Адаптацию проводили сначала в адгезивной культуре, а затем во вращающихся колбах. Исследовали уменьшение концентрации аминокислот в IPL-41 с шагом 10% по сравнению с исходной и вплоть до 10% от начальной концентрации. Наблюдали, что при концентрации аминокислот в среде менее, чем 10-20% от их содержания в IPL-41, клетки продолжали расти, но производство рекомбинантного белка значительно уменьшалось. Этот процесс может быть частично восстановлен путём добавления 0.8% автолизата дрожжей. Дня контроля роста клеток и производства белка использовали анализ с помощью 96 лунных плашек в периодическом и непрерывном режиме. Адаптацию клеток и накопление белка в непрерывной культуре сравнивали для ряда коммерческих сред фирм "Gibco", "Sigma", "JRH", "Spectra Gases" ("CIL"), "Hyclone", "Perbio", "Cambrex". Для демонстрации накопления мембранного белка выбрали белки класса GPCR: пигментные белки родопсин (Rh), опсин "зелёных" колбочек (GC) со сравнительно хорошей экспрессией в активном виде и фармацевтически важный белок-мишень H1R. Мембранные белки получали в препаративных количествах в колбах и в биореакторе. Единственный известный аналог [U-SIL] среды поддерживал рост клеток незначительно, но при этом целевой белок не производился.

Для мечения стабильными изотопами в sf9 в качестве основной питательной среды была выбрана среда IPL-41 с известным составом. В разработанной нами среде для [U-I5N], [U-13C] или [U-1SN,13C] мечения состав и концентрация микроэлементов, солей и витаминов соответствовала их составу и концентрации в IPL-41; в случае 13С мечения использовали NaH13CC>3. Исследовали возможность замены сахарозы и мальтозы глюкозой, а также роль

витаминов и органических кислот. Было показано, что добавление витаминов в концентрации, превышающей 4-кратную, не оказывает влияния на рост 819, и что сахароза и мальтоза может быть заменена 7.74 мМ глюкозой. Также все органические кислоты среды 1РЬ-41 могут быть исключены из её состава при наличии в ней 0.4% дрожжевого экстракта. Било установлено, что липидные экстракты водорослей улучшали рост клеток и накопление белка. С использованием разработанных питательных сред удалось достичь уровня производства НШ, равного 2-6 мг/л. В качестве демонстрации, для получения Н1Я человека с введённым на С-конец полигистидином (Ш-ШЯ) использовали среду РЫ-1п1, содержащую 0.4% [11-15М] экстракт из Н. ро!утогрИа, 0.1% [и-15К] автолизат из водоросли С. саЫапит и N11(01 в качестве источника 15Ы, а также индивидуальные аминокислоты в концентрации, варьирующей в пределах 10-20% от их состава в 1РЬ-41. В питательную среду добавляли липидный экстракт водоросли С. саМапит в концентрации 5 мл/л, экстракт готовили растворением 50 мг липидной фракции в 1 мл этанола. рН питательной среды устанавливали до 6.2 и осмолярность поддерживали при 340 мосмоль кг"1 с помощью №С1. Среду стерилизовали через 0.22 микронный фильтр и хранили при 4СС. Сравнение различных питательных сред для Б£9 показано на Рис. 20. При тестировании компонентов разработали протокол скрининга с использованием У/БТ-! реагента для измерения плотности клеток.

2.0 1.1 1.1

Рис. 20. Влияние питательных сред на рост 1.4-1 клеточной линии sf9. 1-Insect Xpress; 2- IPL-41; 3- IPL-41,

| 1.2 -

<? 1.0

6 0.8 ■ о

£ 06

| 0.4 ■

< 0.2 0.0

без дрожжевого экстракта; 4- PLI-Inl; 5-BioExpress-2000

j ? Рекомбинантный бакуловирус, содержащий к-

..J

j j ,-т- ДНК, кодирующую Ht-HIR человека, получали по

......... •---j |

J"" з 4 5 известной методике, очищали с помощью анализа Питательные среды для Sf9 бляшкообразования и амплифицировали с помощью

стандартных методов. Адаптированные Sf9 вьфащивали в 75 мл колбах, содержащих разработанную среду PLI-Inl, до достижения плотности 4-6 х 106 кл/мл, инфектировали рекомбинантным бакуловирусом при факторе множественной инфекции 2.0. На 4-й день клетки собирали центрифугированием (10 мин, 5000 g) и температуре 4°С. Функциональность проверяли радиологическим анализом с использованием 14С-мепирамина. Рекомбинантный Ht-H1R очищали с помощью металлоаффинной хроматографии с использованием Ni2+ Ni-NTA ("Qiagen") (Рис. 21). Ht-HIR человека элюировали 150 мМ имидазолом и хранили в замороженном виде при -80°С. Уровень продукции [U-15N] H1R составлял 3-6 мг/л, чистота выше 90%. В целях улучшенной стабильности получали протеолипосомы путём смешивания с липидами сои с использованием циклодекстриновой экстракции.

кОа !

Рис. 21. Электрофорез H1R человека на SDS/PAGE (12%) с последующим иммуноанализом. Использовали методы выделения H1R, разработанные 75 i i. Ч" нидерландскими партнёрами группы профессора Де Грипа.

50 Из мембранных препаратов выделили около 10 мг [U-1SN] H1R

30 человека. Процесс может быть масштабирован с получением заданных

количеств меченого рецептора. Степень обогащения стабильными изотопами

определяли с помощью ИК, при разрешении 8 см'1 и спектральном диапазоне

4000-800 см"1 квантифицированием сдвигов колебательных полос спектра. Для уменьшения

расходов, связанных с дорогостоящими меченными стабильными изотопами аминокислотами,

использовали среду, содержащую 10-20% немеченых аминокислот в соответствии с IPL-41,

производство белка было инициировано помещением клеток в среду с [U-15N] или [U-!3C,15N]

экстрактом дрожжей. В случае однократного выращивания введение изотопной метки в

клеточный белок составило 30-40%, но при повторных пассажах уровень мечения составлял

75-85%. Для получения более высокого уровня обогащения необходимо проведение 5-10

пассажей и полное замещение 10-20% индивидуальных аминокислот на меченые аналоги. Для

анализа ЯМР твёрдого тела клеточные мембраны, содержащие 5 мг [U-15N] H1R, помещали в 4

мм CRAMPS ротор и спектры регистрировали на спектрометре Bruker 750 МГц при 200 К и

скорости вращения 8-12 кГц. Анализ спектров ЯМР твёрдого тела на ядрах 15N подтвердил

введение изотопной метки в H1R (Рис. 22): в спектре чётко выражено введение 13N в

пептидный скелет и боковые группы аминокислотных остатков пептидной цепи.

Рис. 22. 1SN ID MAS ЯМР спектр клеточных мембран Sf9, содержащих [U-15N]H1R человека. Спектр зарегистрирован на 750 МГц спектрометре Bruker AV-750 с MAS частотой 10 кГц, число сканирований 5000, Использовали ТРРМ протоновую развязку при поле силы 80 кГц rf и CP 'H-'sN времени смешивания 2 мсек. Основной резонанс при 120 м.д. представляет сигналы 1SN пептидного скелета, его боковые • полосы от вращения обозначены как*.

jj^J I '-д ji л Остальные резонансы представляют собой

■» -v резонансы 15N боковых цепей аминокислот. В

"350—зад—250—5»—150—Йо—50-0—-50 -too качестве свидетеля использовали резонанс азота

ррш глицина при 34.3 м.д.

Таким образом, было продемонстрировано получение [U-15N] H1R человека в клеточной линии Sf9 с использованием BVES и новой питательной среды PLI-Inl, позволяющей достичь 8-10 кратного уменьшения стоимости. Разработанная методология представляет возможности для эффективного получения [U-SIL] белков-мишеней в миллиграммовых количествах, что является решающим для разрешения 3D структуры методом ЯМР твёрдого тела и для использования при рациональном конструировании лекарств.

ГЛАВА 4. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ КОМПЛЕКСОВ: СТРАТЕГИИ ТОТАЛЬНОГО МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ

4.1 Характеристика [U-13C, 1SN] пигментов: химические сдвиги 13С ,'Н, 15N в растворе и твёрдом теле

BChl а, производное многоконтурного хромофора порфирина, представляет собой один из основных пигментов пурпурных бактерий. Он отличается от Chi а тем, что содержит в пиррольном кольце ацетильную группу вместо винильной; а второе пиррольное кольцо его восстановлено (Рис. 23). Другим важным пигментом в фотосинтетической цепи переноса электрона является BPheo я, который отличается от BChl а отсутствием Mg2+ и наличием двух протонов. BPheo а может быть получен из BChl а в кислых условиях. Возможность получения информации о структуре лиганда и лиганд-лигандным или лиганд-белковом взаимодействии была изучена на примере этих фотосинтетических пигментов. Выбор пигментов объясняется, как лёгкостью их получения, так и их значением в фундаментальных исследованиях, технике и в медицине. Для проведения MAS ЯМР исследований пигментов в мембранном комплексе необходимо было, прежде всего, охарактеризовать пигменты в свободном виде (Рис. 21). Определение их структуры на атомном уровне путём характеристики химических сдвигов резонансов атомов 'н, 13С и 15N служит основой изучений лиганд-белковых взаимодействий.

Рис. 23. Химическое строение ВСЫ а (А) и ВРЬео а (Б) РЬео а (В) по номенклатуре ШРАС. Бактериальные пигменты выделяли из [и-13С,15М] (13С, 99%, 98%) биомасс Я/«.

Пигменты экстрагировали при 4°С ацетоном при мягком озвучивании в течение 2 мин с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 5400 х g. Супернатант содержал каротиноиды, а осаждённую фракцию экстрагировали метанолом с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 5400 х g и высвобождением ВСЫ а в супернатант. Экстракт фильтровали через 0.45 мкм тефлоновую мембрану (ТОБОЙ Н-25-5), концентрировали на роторе при низком давлении, растворяли в н-гексан/2-пропанол/метанол

А)

Б) В)

V0* „

palustris, выращенных на среде с использованием [U-13C,UN] гидролизатов водорослей (EMBL).

100/3/3 об/об/об. Пигменты выделяли с помощью НФ-ВЭЖХ с использованием колонки Sensupak, 1251-N, (250 х 4.6 мм внутр. диаметр), элюент - смесь н-гексан/2-пропанол/метанол 100/3/3 об/об/об. Основным пигментом является BChl а с фитильной цепью. [U-15N,13C] пигменты были выделены с чистотой 99% в количестве 80 мг, охарактеризованы оптической, ЯМР и ИК спектроскопией и использовались дня различных исследований.

Выделение [U-SIL] пигментов, как растительных, Chi а и Pheo а, так и бактериальных, BChl а и BPheo а, позволило полностью охарактеризовать их в растворе и твёрдом теле и определить химические сдвиги атомов 13С, 15N и 'Н. Измерения ЯМР в растворе проводились с помощью образца, содержащего 3 мг микрокристаллического пигмента, растворенного в 0.7 мл 2Нб-ацетона и помещённого в 5 мл ЯМР ампулу. Образцы для ЯМР твёрдого тела были приготовлены путём помещения 7 мг пигмента в центр 4 мм CRAMPS ротора ("Broker") для улучшения гомогенности. Условия проведения ЯМР исследований приведены на рисунках соответствующих спектров. Ранее было опубликовано отнесение химических сдвигов для Chi а и BChl а в растворе, которое по мере роста разрешающей способности ЯМР и разработки схем мечения стабильными изотопами периодически пересматривалось. Наше исследование позволило впервые произвести полное отнесение химических сдвигов в ЯМР спектрах пигментов, как в растворе, так и в твёрдом теле, что было достигнуто именно ввиду доступности [U-SIL] исследуемой молекулы, специализированного приготовления образцов для ЯМР исследований и применения высоких полей.

Преимуществом [U-SIL], при котором все атомы природного углерода замещены на 13С и все атомы природного азота замещены на 15N, является то, что ЯМР спектры регистрируются с применением лишь одного образца. Это позволяет не только наиболее рационально подойти к использованию времени и затрат труда для приготовления образцов, но и эффективно использовать дорогостоящее время ЯМР измерений. Исследования пигментов выполнялось на Bruker 600 МГц DMX-600 и Bruker 750 МГц DSX-750. Были получены одноядерные 2-D 13С-13С и гетероядерные 'Н-13С, 'H-1sN спектры; в случае ЯМР твёрдого тела применяли MAS ЯМР. Корреляционные спектры чётко позволяют наблюдать взаимодействие соседних атомов в молекуле. Для отнесения химических сдвигов сигналов 13С в растворе применяли методику COSY корреляционнной спектроскопии; в случае ЯМР твёрдого тела - методику RFDR. Для отнесения химических сдвигов сигналов 'Н в растворе применяли методику PFG HMQC, в случае ЯМР твёрдого тела применяли CP/MAS корреляционную спектроскопию с методикой радиочастотного возбуждения FS-LG во время эволюции ядер 'Н. Для отнесения химических сдвигов резонансов 15N в растворе использовали HMQC; в случае ЯМР твёрдого тела использовали ТРМ. В ЯМР в растворе и твёрдом теле сначала было проведено отнесение химических сдвигов сигналов 13С на основе диполярных корреляционных спектров. Это

послужило основой для определения химических сдвигов сигналов 'Н в 2-0 'Н-13С в гетероядерном корреляционном эксперименте (Рис. 24, 25).

Рис. 24. Карта срезов 2D 13С-13С MAS ЯМР диполярного корреляционного спектра [U-13C,15N]BChl а (А) и [U-'3C,lsN]BPheo а (Б), зарегистрированного в магнитном поле 14.1 Т при комнатной температуре, спиновой скорости 9000 ± 3Гц, времени поляризационного переноса 1 мсек. Линиями показана связь между последовательными ближайшими корреляциями между атомами

Поскольку химические сдвиги 13С довольно чувствительны к изменениям плотности атомного заряда, они служат источником информации об электронной структуре молекулы на атомном уровне. Химические сдвиги 'Н, в свою очередь, служат основой для отнесения химических сдвигов 1SN в 2-D 15N-'H спектре. Использование высокой частоты вращения в ЯМР позволяет свести до минимума эффект вращательного резонанса и перекрывание между корреляционными пиками и боковыми полосами от вращения. При коротком времени переноса корреляции в MAS ЯМР спектрах вызваны ближайшими соседними атомами молекулы. Например, для [U-13C,I5N] BChl а выявлены цепочки корреляционных связей для 13С: С1-С2-СЗ-С4-С5-С6-С7-С8-С9-С10-С11-С12-С13; С14-С15-С16-С17; С18-С19-С20-С1. Наряду с этим, видны корреляции С2-С21 и СЗ-СЗ'-СЗ2 в кольце I; С12-С121 в кольце III; С13-С131-С132-С133 в кольце V: В фитильной цепи наблюдаются корреляции между pl-p2-p3-p4-p5-р6-р7-р8 и рЗ-р17. Хотя не наблюдается сильно выраженых корреляции между С7-С8; С8-С81; С7-С71; С18-С181; С17-С171; С17'-С172, эти сигналы чётко видны на диагонали.

А)

65 60 55 sc

Рис. 25. Карта среза 2-D 'Н-|3С FS-LG MAS ЯМР спектра [U-l3C,15N]BChl а (А) и [U-13C,15N]BPheo а (Б) (образец в виде кристаллической пудры), зарегистрированного в магнитном поле 14.1 Т при комнатной температуре, спиновой скорости 13кГц±ЗГц, времени поляризационного переноса 1 мсек.

Интерпретация спектров ЯМР в твёрдом теле на ядрах 'Н довольно сложна в связи с комбинацией очень сильных гомоядерных диполь-дипольных взаимодействий между ядрами 'Н и незначительной дисперсией их химических сдвигов. Хорошее разрешение может быть получено в 'Н-13С корреляционной спектроскопии с учётом значительной дисперсии химических сдвигов °С. Применение высоких магнитных полей и высоких частот вращения наряду с FSLG во время 'Н эволюции позволяет достичь хорошего разрешения 'Н резонансов. Полный анализ химических сдвигов 13С, 'Н, l5N в растворе и твёрдом теле атомов пигментов представлен в Таблицах 3-5. При сравнении 'Н химических сдвигов в твёрдом теле и в растворе, например, для BChl а, существенная разница наблюдается для С2'-СНз и что обусловлено эффектом кольцевых токов, связанных с образованием агрегатов в твёрдом теле. При сравнении химических сдвигов сигналов в спектрах двух пигментов в твёрдом теле наблюдаются следующие различия: в кольце I для С1 (-16.6), С2 (-5), С21 (-3.6), СЗ (-8.6), С4 (16.0); в кольце II для С9 (4.7); в кольце III для CI 1 (-11.2) и для С14 (-14.7); в кольце IV для С16 (-9.0); и в кольце V для С131 (-3.6). Для метановых углеродов разница составляет: СЮ (-3.0), С5 (-2.4), С20 (-2.2). Результаты показывают, что структура и электронные состояния пигментов значительно зависят от наличия центрального иона магния в молекуле BChl а.

Таким образом, в работе проведено полное отнесение химических сдвигов ядер 13С, 15N, 'Н в растворе и в твёрдом теле с помощью одного [U-SIL] образца, что демонстрирует возможности получения полной информации о структуре молекулы с помощью применения методов ЯМР и [U-SIL]. Для BChl а в растворе пересмотрены значения химических сдвигов для семи 13С в и впервые отнесены одиннадцать 13С резонансов, которые выделены в Таб. 3.

Таблица 3. Отнесение химических сдвигов резонансов ядер 13С для [U-13C,15N]BChl а и [U-i3C,1!N] BPheo а. 5*(м.д.) - химические сдвиги в ацетоне-(1«-метаноле-<14 согласно Brereton et al. (1983) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1,435 с коррекциями Oh-hama et al. (1985) Arch. Biochem. Biophys. 237(1), 72. С помощью 'обозначены хим. сдвиги согласно Brereton et al., ьобозначены хим. сдвиги, пересмотренные Oh-hama et al., и 'обозначены хим. сдвиги, пересмотренные Egorova-Zachernyuk et al. (2008) Magn. Res. Chem. 46, 1074. Химические сдвиги в acetone-d« и в твёрдом теле, определённые в результате данной работы для обоих [U-SIL] пигментов, обозначены, как 8 (м.д.) и 8SS (м.д.) соответственно. Точность химических сдвигов в ЯМР твёрдого тела составляет -0,5 м.д.

Позиция BChl а BChl а BChl а BPheo а BPheo а

Ь* 5 8SS 5 8ss

8г 9.1 10.5 11.0 11.5 11.0

12' 10.3 11.9 8.7 11.5 4.9

2' 12.0 13.5 10.9 13.9 7.3

р17 14.1 16.1 16.3; 16.7 16.3 16.5

pis 21.2; 18.3" 20.5 20.5 20.5 21.5

р19 20.1; 19.8 20.0 19.8; 20.0 20.0

р20 20.0 20.0 20.0 20.0

р16 22.9 23.0 22.8 22.0

18' 21.2 22.8 23.0 22.9

3! 32.9 30.0 34.0 29.3

7' 21.2 23.4 23.0 23.7

Р5 23.8 25.3 25.0 25.3 27.0

р9 23.6 24.9 27.5 24.9 26.5

р13 23.2 25.5 25.0 25.0 26.5

17' 31-27 29.4 32.5 31.5 31.5

17' 31-27 30.5 30.5 31.3 31.0

8' 31-27 30.8 30.0 30.7 31.0

Р7 31.6; 31.4, 31.1' 33.3 33.5 33.2 34.5

pli 31.0 31.5 33.2 34.0

р15 28.6 31.0 28.6 29.0

р4 38.2;38.5" 40.2 39.4; 40.2 40.2 41,0

рб 37.6 37.5 37.6 38.0

р8 38.5 39.0 37.9 38.5

рЮ 36.2; 35.3 38.0 38.0 38.5 38.0

р12 37.8 38.0 38.5 38.0

р14 39.8 39.0 39.8 38.0

7 46.7 48.3 47.3 49.6 49.5

18 48.0 49.5 49.1 50.9 47.6

17 49.0 50.5 49.6 51.4 49.5

13' 50.8 52.3 51.5 52.8 52.5

8 54.0 55.8 52.9 55.4 53.0

Позиция BChl а BChl а BChl о BPheo а BPheo а

6* 8 Sss 8 Sss

pi 59.8 61.7 60.3 61.7 60.3

131 65.0 65.7 63.3 65.5 62.4

20 94.2 (95.6") 96.3 93.9 97.2 96.1

5 97.6(99.0") 99.9 98,9 97.9 96.5

10 99.9(101.6") 102.4 99.7 100.2 96.7

15 107.1 (109.4") 109.7 105.8 110.3 107.9

Р2 117.2 119.3 119.9 119.4 120.3

2 127.6 142.0 • 140.9 138.5 135.9

12 135.1 124.0е 120.0 121.3 117.3

13 130.6 124.1 129.2 125.5

3 122.3 137.7' 135.7 135.0 127.1

рз 141.2 142.4 139.6; 141.9 143.0 142.1

И 147.9 149.5 147.1 139.3 135.9

4 147.9(149.7") 150.0 151.9 138.1 135.9

1 150.2 151.2 153.5 139.7 136.9

16 166.1' (160.2") 152.0е 150.2 158.7 158.7

14 143.8(158.1") 160.8' 160.6 148.7 145.9

9 140.6 (151.7") 158.5 е 157.7 164.3 162.4

19 164.9' 167.3 168.8 171.7 171.7

6 140.6 168.9 е 170.0 172.4 168.9

13' 170.7 171.6 169.9 170.2 171.1

171 171.7 173.4 174.5 173.0 173.4

13' 187.5 189.0 188.4 189.3 184.8

З1 197.6 199.3 194.6 199.2 192.2

Таблица. 4. Отнесение химических сдвигов (м.д.) резонансов ядер l5N для [U-"C,'5N]BChl а и [U-'3C,'5N] BPheo а. 5* (м.д.) - химические сдвиги в ацетоне согласно Limantara et а/., (1995) Chem. Phys. Lett. 236, 71. Химические сдвиги в растворе 5 (м.д.) и твёрдом теле 5М (м.д.) получены в данной работе для обоих [U-SIL] пигментов.

Позиция BChl а BChl о BChl а BPheo a BPheo a

8» 8 5SS 8 Sss

N-I 189.6 192.63 191.76 129.4 127.2

N-1H 191.5 194.46 196.87 135.7 132.5

N-П 258.5 259.14 258.28 299.2 296.07

N-IV 259.1 261.71 258.28 308.3 303.17

Таблица. 5. Химические сдвиги сигналов ядер 'H [U-15C,l5N]BChl а и [U-l3C,15N]BPheo а в растворе и твёрдом теле (м.д.). Химические сдвиги в ТГФ при 60°С (согласно Brereton et al. (1983) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 423) обозначены 5*(м.д.). Химические сдвиги в растворе 5 (м.д) и твёрдом теле 5SS (м.д.) получены в данной работе для обоих [U-SIL] пигментов. Точность химических сдвигов в твёрдом теле - 0.2 м.д.

Позиция BChl a BChlo BChl a BPheoo BPheoa

S»_б_5я_5_Sss

5 9.00 8.81 6.75 9.05 7.04

10 8.46 8.40 5.50 8.66 5.10

20 8,36 8.36 5.89 8.73 5.80

13! 4.33 5.92 4.31 6.10 4.59

7 4.09 4.24 3.06 4.35 2.73

17 4.01 3.92 2.45 3.99 2.73

18 4.35 4.32 2.45 4.41 2.45

8 4.03 2.17 4.07 2.22

8' 2.37/2.12 2.08 0.96 2.07 1.20

2' 3.46 3.40 -0.84 3.5

3: 3.03 3.01 0.96 2.07 1.18

7' 1.73 0.85 1.80 0.85

81 1.15 1.09 -0.78 1.09 0.34

12' 3.38 3.29 -1.02 3.20

18' 1.68 1.65 0.86 1.70

13' 3.71 3.76 3.46 3.76 4.07

17' 2.53 2.37 0.96 2.40

171' 2.33 2.45

17J 2.42 2.45 0.96 2.30

17r 2.13 2.04

Pi 4.51 4.39 4.26 4.26 4.84

P2 5.24 5.13 5.45 5.20 5.80

pI7 1.63 1.58 1.44 1.50 1.83

И 1.95 1.91 1.49; 1.67 1.93 2.15

P5 1.43 1.35 1.02 1.45 1.18

pl5 1.17; 1.04 0.96 1.25 1.18

P6 1.04 1.09 0.79 1.17;1.04 1.27

p8 1.09 1.49 1.09 1.27

plO 1.13 1.49 1.09 1.27

pl2 1.13 1.49 1.09 1.27

pl4 1.11 1.49 1.04 1.27

P7 0.88 0.89 1.07 1.35;1.26 1.56

pll 0.86 0.89 0.96 1.28 1.56

P9 0.84 1.28 1.02 1.21 1.18

pl3 1.21 1.02 1.21 1.18

pl6 0.84 0.86 0.84 1.14

pl8 0.81 0.40 0.82 1.06

pl9 0.81 0.40 0.82 1.06

p20 0.83 0.40 0.92 1.14

4.2 [и-13С, 15>| лиганд в мембранном белковом комплексе: лиганд-белковые взаимодействия

Получение [и-БЦ,] лигандов и отнесение химических сдвигов 13С, 'Н, 15Ы в растворе и твёрдом теле позволило изучать лиганд-белковые взаимодействия. Объектами изучения были выбраны фотосинтетические мембранные комплексы, РЦ из ЯЬ. 5р11аего1с1ез Л2б и СК2 из Ярз. ас1с!ор/и!а. РЦ получали как с встроенным растительным, так и с бактериальным феофитином: [и-13С]РЬео а и [и-13С,15М]ВРЬео а (Рис. 26). СК2 изучали с встроенным [и-13С,15М]ВСЫ В800 (Рис. 27). Исследования включали: выделение очищенного мембранного белка с солюбилизацией в детергенте; замещение лиганда в мембранном комплексе на [1.1-51 Ц лиганд, приготовление образцов для ЯМР и ИК, их исследование и, наконец, интерпретация данных.

Рис. 26. Схема получения [и13С,15^ кофакторов (СЬ1 а, РЬео а, ВРЬео а) и исследования лиганд-белкового взаимодействия в фотосинтетических РЦ из ИЬ. %рЬаего'1с1е$ 11-26.

Рис. 27. Схема получения а) СК2 из асШорИИа 10050 с [и13С,'5Ы] ВСЫ а В800 и б) [и'3С,15М] СК2 из Д/м. ас'к1орЫ1а 10050.

4.2.1. Фотосинтетические РЦ с [U-13C] Pheo а

В структурной биологии для понимания фотосинтеза на атомном уровне важно

охарактеризовать электронную структуру кофакторов и опредилить их роль в молекулярном

механизме конверсии фотохимической энергии. Хотя кристаллическая структура Rb.

sphaeroides R26 РЦ определена с разрешением 2.65 Ä, некоторые фундаментальные вопросы о

механизме разделения зарядов и цепи переноса электрона не выяснены. Два BPheo в РЦ

химически идентичны, но только один (На), функционирует как промежуточный акцептор

электрона во время переноса электорна от донора (специальной пары BChl) к первичному

электронному акцептору хинону цепи А, а второй, находящийся в цепи Б (Нв), не вовлечен

активно в перенос электрона. В связи с этим представляло особый интерес изучить

электронные состояние покоя BPheo кофакторов, потенциально вовлеченных в нарушение

симметрии между А и Б цепями в переносе электрона.

Рис. 28. Организация кофакторов в РЦ Rb. sphaeroides R26 согласно Ermler et al. (1994). Structure. 2, 925. Как обозначено схематично, кофакторы BPheo а, замещены на [U-15C] Pheo а.

Хорошо известны такие подходы к изучению лиганд-белкового взаимодействия как сайт специфический мутагенез, модификация пигментов. В настоящей работе представлен новый подход, основанный на мультиспиновом мечении и 2D MAS ЯМР, при этом определяли электронные плотности индивидуальных атомов кофакторов на основании данных химических сдвигов пигмента в белковом кластере размера 1 кДа (Рис. 28). Этот подход позволяет полностью охарактеризовать лиганд в мембранном комплексе без необходимости привлечения сложных схем органического синтеза и получения целого ряда образцов, меченных стабильными изотопами по определённым положениям.

[U-13C]Pheo а, наряду с другими пигментами, такими как ß-каротин, лютеин, Chi a, Chi b, Pheo b, виолаксантин и неоксантин, выделяли из [U-13C] биомассы С. rubrum с использованием колоночной хроматографии, силикагеля как носителя, а в качестве элюента гексана с последующей элюцией с помощью смеси гексан-ацетон. Чистоту характеризовали с помощью спектров поглощения, ВЭЖХ и ЯМР. РЦ выделяли обработкой хроматофоров с помощью LDAO и последующей очисткой на DEAE-Sephacel согласно известному протоколу. Замещение BPheo а в РЦ на [U-13C]Pheo а проводили инкубированием 22 порций по 10 мл каждая, содержащих 14 мкМ РЦ, 50 мкМ [U-13C]Pheo а, 0.1 % LDAO, 1мМ EDTA, 10 мМ Tris, pH 8 в 10% ацетоне в течение 90 мин при 42±0.5°С. После последующего охлаждения на ледяной бане денатурированный белок удаляли центрифугированием в течение 10 мин при

ШГ

Вд ■

ршШШ

~р. Ж/**-"х ьтОКЬл.....

\УМ,

6000 g, супернатант нагружали на колонку DEAE-Sephacel, промывали бОмМ NaCl, 0.1% LDAO, 10 мМ Tris, рН 8, 1 мМ EDTA. РЦ смывали с колонки с помощью 400 мМ NaCl, проводили диализ в течение 12 ч vs 0.025% LDAO, ЮмМ Tris, рН 8 и 1мМ EDTA, повторно нагружали на колонку и удаляли в градиентном режиме 0-500 мМ NaCl, 0.025% LDAO, ЮмМ Tris, рН 8, 1мМ EDTA, затем диализовали, после чего концентрировали с помощью 100 кДа фильтра. Выход РЦ с [U-13C]Pheo а составил 10%. Наличие трёх субъединиц (L,M, Н) в РЦ подтверждали SDS-PAGE. Образец готовили помещением 40 мг РЦ в 4 мм MAS ротор.

Степень замещения на [U-13C]Pheo а контролировали с помощью оптических спектров поглощения (Рис. 29). В замещённом образце полоса поглощения при 535 нм, характерная для Нв, отсутствует, и полоса 545 нм, характерная для На уменьшена, что говорит, практически, о полном замещении Нв и частичном замещении НА. На основании соотношения поглощения при 676 нм (Pheo а) и 890 нм (Р, специальной пары BChl а) можно заключить, что 90% общего BPheo а замещено на [U-13C]Pheo а. Неспецифично связанный или свободный Pheo а также поглощает при 676 нм, полоса при 760 нм показывает, что общее количество незамещённого BPheo а менее 20%. Таким образом, на основании оценки замещения при 676 нм и 760 нм можно заключить, что в образце содержится менее 10% несвязанного [U-13C]Pheo а.

А)

Рис. 29. (А) Спектры поглощения нативных РЦ и РЦ с [U-,3C] Pheo а, полученные при температуре 10К; (Б) Разностный спектр поглощения состояния P QA" при 10 К, зарегистрированный через 1 мсек после возбуждения лазерной вспышкой при X 890 нм.

400 500 600 700 900 900 1000 Длина волны (нм)

Б)

В 0.5 <

® 0.0

а>

Í-0.S

С «1.0

Дополнительную информацию представляют изменения в поглощении в РЦ с |Х1-13С]РЬео а в связи с образованием Р+<За" в результате освещения. Отрицательный пик при 549 нм, характерный для случая, когда оба На и Нв замещены на РЬео а, и смещение полосы при 675 нм являются наилучшим обоснованием для оценки степени замещения. Сравнение изменения

S20 540 5ВО 700 800 900 Длина волны(нм)

поглощения при 549 нм относительно выцветания при 895 нм привело к выводу, что в образце присутствует 12% нативного BPheo а. На основании амплитуды сдвига полосы поглощения при 675 нм по сравнению с выцветанием при 895 нм был сделан вывод о замещении 75% BPheo а. Таким образом, в результате анализа спектров пришли к выводу, что весь бактериофеофитин в цепи Нв и 65% ±5% НА был замещён на [U-13C]Pheo а.

ID CP/MAS ЯМР спектры, зарегистрированные на Bruker MSL-400, позволи отнести резонансы сигналов С5, СЮ, С15, С20 и С131. На основании 2D 13С-13С спектров были

охарактеризованы химические сдвиги Pheo а и использованы для изучения электронной структуры, поляризации и протонирования (Рис. 30). В спектре белка прослеживаются следующие корреляционные связи в молекуле Pheo кластера: С14(151)-С15(107)-С16(161)-С17(52)-С171(32);С13(133)-С13'(190)-С132(64)-С133(171); С4(137)-С5(97)-С6(156)-С7(136)-C71(ll);C3(136)-C31(129)-C32(121);C9(150)-C10(105)-Cll(138)-C12(128)-C12l(12). В фитильной цепи наблюдаются корреляции С172(29)-С 1173)-р 1 (59)-р2( 117>-рЗ( 144)-р4(41 ), рЗ-р17(17). Для нахождения корреляций С172—С173 и рЗ/р17 использовалась спиновая скорость 10 кГц. Концы фитильного остатка не задетектированы, вероятно, они едва упорядочены в образце.

Рис. 30. Карта среза 2D ,3С-|3С MAS ЯМР диполярного корреляционного спектра РЦ Rb. sphaeroides R26 с [U-13C]Pheo а. Спектр зарегистрирован при температуре 230 К и спиновой скорости 8000 ± 3 Гц при использовании времени смешивания т =1 мсек.

Хотя разница индивидуальных химических сдвигов небольшая, их систематическое наблюдение в отдельных областях молекулы позволяет выявить части молекулы, взаимодействующие с белком. Согласно данным ЯМР анализа, наблюдалось слабое взаимодействие пигментов с белком, которое затрагивает углерод в положении 172 кольца IV и, возможно, кольцо V лиганда. Возможно также, что углероды в положении pi и р2 фитильного остатка слегка разупорядочены за счёт окружающего белка. Не замечено влияние Glu L104 на перетрубацию пигмента с активной стороны переноса электрона. Состояния протонирования оказались одинаковыми и можно заключить о большом сходстве в поведении двух Pheo а с точки зрения плотностей атомных зарядов для углеродов порфириновой структуры, что интересно наблюдать с учётом ассиметрии процесса первичного разделения заряда в фотосинтезе.

4.2.2. Фотосинтетические РЦ с [U-13C,1SN] BPheo а

РЦ с [U-13C,'5N]BPheo а получали по известному протоколу, но вместо детергента LDAO использовали TRITON Х-100. Разработали новые экспериментальные условия фотонакопления в присутствии восстановителя и медиатора: дитионита натрия и цитохрома с или дитионита натрия и красителей, индиготетрасульфоната натрия и толуелена красного. Состояние На" характеризовали спектрами поглощения и с помощью ИК. Эксперименты фотоаккумуляции выполняли в растворе, а также в виде плёнки, полученной на CaF2 окне.

измеренном при низких температурах.

Например, при приготовлении плёнки, 35 мкл 0.2 мМ РЦ с [U- C,15N]BPheo а, солюбилизованных в ЮмМ Tris-HCl (рН 8.0)/0.1% Triton Х-100, 6 мкл 2 мМ ITS в воде и 6 мкл 4 мМ NR в воде, помещали на СаБг окно и частично высушивали в токе азота. Затем добавляли б мкл 0.2 М Na?S204 раствора в 1 М Tris буфере (рН 8) и после частичного высушивания в атмосфере азота образец накрывали вторым CaF2 окном (Рис. 31).

•я

1, 71

Ai? I thfv .

j ví i m

ïi.41 M¡

\!Í & §

vv"

• - ¿f . «g m

Sji M ? îî rsM-

1ЙУ / I

Рис. 31. Индуцируемые светом Нд"/Нд ИК разностные спектры для природных РЦ (а), РЦ с [U-'3C,15N]BPheo а (б) и двойной разностный спектр (в). Просуммировано 5000 интерферограм. Спектры измерялись при температуре 22°С

ИК спектры регистрировались на Bruker IFS 66 V, снабжённом МСТ детектором. Разностные спектры получали между спектрами, зарегистрированными во время освещения светом с X выше 700 нм, и состоянием в темноте. Основными

ю га « « w» ISC ™ характеристиками являются отрицательные

Длина волны (сми) .... ,

полосы при 1745, 1732, 1674 (с плечом при

1684 см"1), 1656 и 1623 см"1, свидетельствующие об исчезновении нейтрального состояния На,

и положительные полосы при 1703 и 1590 см"1, свидетельствующие о появлении На". Оба

состояния включают изменения в электронном акцепторе и его связывании с белком, а также

возможные изменения BChl и самого белка. Спектры характеризуются воспроизводимостью

отрицательных полос при 1395 см"1 и положительных полос при 1466, 1373, 1347 и 1333 см"'.

Уменьшение интенсивности полос при 1590 см"1 и 1466 см"1 на более, чем 50% свидетельствует

о замещении фотоактивного На на [U-nC,15N] BPheo а с эффективностью 50%. Выход РЦ с U-

[13C,'5N] BPheo а составлял 15%. Разностный спектр состояния НА"/НАв РЦ с [U-13C,15N]BPheo

позволил найти отнесение сигналов BPheo а на фоне белковых сигналов.

4.2.3 СК2 с [Ц- С, Х]ВСЫ а. Электронная структура кофакторов, кофактор-кофакторные и кофактор-белковые взаимодействия

Наконец, с помощью [и~81Ь] исследовали электронную структуру кофакторов ВСЫ а В800 и ВСЫа В850 в СК2. Отнесение химических сдвигов [11-'3С,15К|ВСЫ а и и-13С,15М]ВСЫ а В800 в СК2 послужило основой для дальнейшего отнесения химических сдвигов для В800 и В850 в [и-13С,15И]СК2 при помощи расчётов функциональной теории плотностей. СК2 с [и-13С,151Ч]ВС111 а получали путём селективного замещения природного кофактора В800 на [II-

13C,l5N]BChl a B800 по известной методике. [U-'3C,15N]CK2 выделяли из биомассы, выращенной на среде, содержащей [U-13C,'5N] гидролизат водорослей, 13С4 янтарную кислоту или суцинат аммония. После выделения СК2 его концентрировали до объёма 10

мкл с использованием Centricon 100 кДа фильтра. Концентрированный образец переносили в CRAMPS ротор, содержащий 10 мг изучаемого белка. ЯМР спектры регистрировали на Bruker AV-750. На Рис. 32 показаны 13С-13С корреляции для кофакторов В800, аВ850 и РВ850. Найдено электронное сходство между кофакторами В800, аВ850 и (5В850 в поляризации по оси бактериохлоринового кольца параллельно переносному дипольному моменту. Значительный сдвиг полосы Qy В850 по сравнению с Qy В800, объясняется, главным образом, перекрыванием бактериохлориновых колец В850 в СК2.

13 с (ррт)

Рис. 32. Карта среза MAS 2D 13С-'3С RFDR ЯМР спектра [U-13C,I5N] СК2. Данные получены при 223 К со спиновой скоростью 13 кГц и RFDR временем смешивания 2.5 мсек. Корреляции химических сдвигов атомов углерода В800, аВ850 и ßB850 обозначены в соответствии с IUP АС, как а и ß.

Поскольку эффекты

химических сдвигов

распределены по хлориновому кольцу, а не локализованы на отдельных положениях

углеродов, поляризация между кофакторами и белком происходит по механизму нелинейного диэлектрического ответа. Таким образом, с помощью [U-SIL] и 2D корреляционной ЯМР описали электронную структуру лигандов в белковом комплексе и изучили лиганд-белковое взаимодействие, тем самым продемонстрировали преимущества [U-SIL] для решения задач структурной биологии.

4.3. Тотально меченный стабильными изотопами мембранный белковый комплекс

Следующей демонстрацией преимуществ [U-SIL] для решения задач структурной биологии явилось изучение 13C,15N корреляций в интегральном белковом комплексе размером 150 кДа, [U-13C,15N] СК2 Rps. acidophila 10050. Кристаллическая структура СК2 разрешена и он состоит из трёх асимметричных единиц, каждая из которых содержит три протомерных комплекса, состоящих из а и р апобелков, содержащих 53 и 41 аминокислотных остатка соответственно (Рис. 33), трёх молекул BChl, одного родопин-глюкозидного каротиноида и молекулы Р-октилглюкозидного детергента Трансмембранные хеликсы девяти а апобелков упакованы с образованием цилиндра с радиусом 18 Á, а девять Р апобелков организованы таким образом с а апобелками, что образуют внешний цилиндр 34 Á.

a: m'nogkjwtvv'°npaigipall2°gsvtviailv3°hlailshttw*0fpaywoggvk50kaa

N-конец Мембрану пронизывающая часть С-конец

р: atlta£osee'°lhkyvidgtr20vflglalvahmFLAFSATPWL40h N-конец Мембрану пронизывающая часть С-конец

Рис. 33. Аминокислотная последовательность а и р белковых субьединиц в СК2 Rps. acidophila 10050. Кристаллическая структура СК2 определена McDermott el al (1995) Nature. 374, 517. Отнесение сигналов полученных на [U-SIL] образце выделено подчёркиванием.

[U-13C,15N]CK2 выделяли из биомассы Rps. acidophila по известным методикам, очищали гель-фильтрацией, чистоту проверяли SDS-PAGE и характеризовали оптическими спектрами поглощения. Солюбилизированный белок концентрировали до объема 30 мкл и образец в количестве 10 мг помещали в 4 мм CRAMPS ротор. Спектры ЯМР твёрдого тела регистрировали на спектрометре Bruker 750 МГц DSX-750, что позволило достичь повышенного разрешения и чувствительности по сравнению с использованием стандартного оборудования. Использовали 4 мм трёхканальный MAS датчик. Применяли MAS спиновые частоты 8 и 12 кГц и температурные диапазоны от -10°С до -50°С. При повышении температуры наблюдали незначительное повышение разрешения.

На Рис. 34 изображены резонансы пептидного скелета N¡COí-i, и NiCa¡. В NCO спектрах наблюдается, по меньшей мере, 10-15 разрешённых пиков в области 120 м.д. (химические сдвиги для 15N). В NCA спектрах детектируется целый ряд разрешённых резонансов ввиду дисперсии Са. В спектре наблюдаются пики с разрешением 1.2 и 1 м.д. для l5N и 13С соответственно. Таким образом, чётко наблюдаетя 35-40 максимумов пиков, что соответствует количеству аминокислотных остатков мембранной части аир апобелка. Особый интерес в NCA спектре (N¡-CaO представляют пики при 42-46 м.д. и 47-49 м.д. для 13С, которые отнесены к остаткам Gly и Ala соответственно. Также, отнесены Са при 63.2 и 63.6 м.д. остатков Pro.

N.CO,'.,

Б)

N¡CA,

Рис. 34. Гетероядерные (N,C) корреляционные спектры

ípmii i

вР: [и-13С,151Ч]СК2. "с несущая частота применена вне СО и Са области |3С спектра. Показаны корреляции для трёх Р (1-111).

140

} . . ..... ........... .... ..г ; —..........

ISO 173 ITS 174 1 72 170 168 ¡ppmi 86 64 62 60 58 56 54 52 50 43 4ö [ppfnä

«S* - ■■ -

Для обоих Pro наблюдаются резонансы С5 и коррреляции (Nj-COi.i) Pro предыдущих аминокислотных

■ (ppt'í

—t, остатков а апобелка.

Наблюдается дополнительная слабовыраженная корреляция типа NCa (147 м.д. и 62.5 м.д.), которая может быть отнесена к третьему остатку Pro в С-части мембранного белка. На основании статистических данных химических сдвигов в растворе, были отнесены Ca сигналы Val, lie, Ser, Thr. Ca резонансы S, Т, G, V, I и Р обозначены пунктирными лияниями. В целом, наблюдаются корреляции для трёх Pro, а также дополнительно С5 и СО корреляции Pro с предыдущим аминокислотным остатком a апобелка.

Дополнительная информация была получена в результате 2D NCC экспериментов (Рис. 35), когда NCC корреляции комбинированы с элементом гомоядерного поляризационного переноса. Например, химический сдвиг 15N при 90 м.д. характерен для Arg. Согласно первичной структуре, имеется лишь один Arg остаток с позицией 20 в ß апобелке. Таким образом, было найдено отнесение сигналов для R20s (56,2 м.д.) и R20T (31.6 м.д.) (Рис. 35). Также отнесли R206, R207, R20p при 157.3 м.д., 32 м.д., 28.5 м.д. соответственно. Корреляция резонансов для R20 прослеживается и в CaCßCy области спектра. С помощью сравнения области CaCßCy или с помощью дополнительных гомоядерных СС корреляционных экспериментов проводили идентификацию аминокислотных остатков и находили химические сдвиги для 13С аминокислот в пептидной последовательносим белка. На основании интенсивности сигнала Arg найдено отнесение сигналов для 4-х Gly. Что касается Thr, то для них часто характерен химический сдвиг Ср при 60 м.д. и С, при 20 м.д. Как видно из спектра, для значений 15N наблюдается три группы пиков 107-111 м.д., соответствующих корреляциям Thr-Ca-y. Количество групп соответствует количеству остатков Thr. Различие между Ser и Thr было достигнуто на основании различной топологии их боковых цепей, в результате чего обнаружили 2-3 Ser корреляции. Наблюдали, что в случае мембранного комплекса разница в химических сдвигах по 15N составляет около 5 м.д. по сравнению с глобулярными белками; а химические сдвиги для 13С твёрдого тела схожи с химическими сдвигами в растворе.

15N[ppmf

15N[ppmí

110-

Рис. 35. 2D NC-CC спектры [U-l3C,l5N]CK2. Выявлены N-C-C корреляции боковых цепей (Рис. А) и скелета (Рис. Б). SPECIFIC CP перенос использовался для отделения резонансов углерода в области 50 м.д. Время спиновой диффузии т(СС) 8 мсек позволяет в пептиде перенос по двум дополнительным связям типа СцСрС,. На рисунке А) выявлены резонансы боковой цепи R. На рисунке Б) обозначены корреляции в скелете пептида.

120-

130

Дополнительные корреляции в области 20 м.д., вероятно, соответствуют Ala и Ие. В общей сложности, чётко выявлено более 14 корреляций для этих 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 [ppmj двух хипов аминокислот в части белка,

' с

пронизывающего мембрану. На основании характерной информации по химическим сдвигам боковых цепей, найдены корреляции для Act,ß и 1а-у2 при 15N 115 и 119 м.д. соответственно. Характерные сдвиги для l5N Pro позволяют отнести области их сигналов. Наконец, наблюдается закономерность по отношению к химическим сдвигам для Val„, Ие„, 11ер и Valy,. N,(CÄCBCG)m

11sNEppmf

Рис. 36. Комбинированный NC-CC 2D эксперимент переноса

[U- С, 13N]CK2.

Примененяли

SPECIFIC CP перенос к резонансам СО около 178 м.д. Время спиновой диффузии г(СС) 8 мсек позволяет перенос по дополнительным связям в пептиде типа CO-C„Cs. А или Т содержащие пары (i,i+l) обозначены в виде S(Caj)/AM, T(Cpi)/Vi+1 и A(Ca.pi)/Ti+1. Корреляционная область для трёх пар обозначена AW

На Рис. 36, где показана алифатическая область N-CO-Ca-Ср, выявлены выраженные корреляции, включающие G р субединицы (G18T19). Показано отнесение сигналов для G'5!16, G21S22 а- и G24L25 Р" апобелка. Корреляции в области 20 м.д. преимущественно отнесены к остаткам с А: А36Т37 мембраннопронизывающей части и А*Т2 N-концевой части р белкового сегмента. Характерные химические сдвиги позволяют отнести S35A36 и проиндентифицировать Тр при 66 м.д. сегмента V23T24V25 а апобелка. На спектре видно 6 дополнительных АХ пар, которые соответствуют 3AI, 2AL и одной AF паре в мембране. Полное рассмотрение

информации на основании описанных спектров и результатов ЭД-(СОСаСР)м позволяет найти последовательную связь между аминокислотными остатками. N00 перенос позволяет наблюдать топологию предыдущих аминокислотных остатков полипептидной цепи (Таб. 6).

Таблица 6. Основные химические сдвиги "С и резонансов аминокислотных остатков в СК2.

Остаток NH Са CP Су Сд

аминокислоты (м.д.) (м.д.) (м.д.) (м.д.) (м.д.)

Р12 133.4 63.1 27.9 26.0 46.0

G15 107.8 45.0

116 118.8 59.1 31.6 30.5 14.0(у2)

Р17 137 63.6 27.5 25.6 46.5

G2I 106.8 43.8

S22 115.5 58.2 56.8

T24 108.4 58 66.8 18.2

V2J 121.8 64.8

018 107.5 44.9

Т19 107.3 59.5 67.2 17.8

R20 124.5 56.4 28.5 31.6 56.2

G24 110.5 45.1

L25 121.2

S3 5 114.5 60.2

А36 118.8 48.2 19.5

Т37 109.9 57.6 67.1 19.5

В результате подготовлена почва для экспериментов, связанных с когерентными шагами 13С-'3С переноса, 3-х мерной корреляционной спектроскопией и схемами гетероядерных NC спин-спиновых развязок, которые должны привести к более детальному анализу. Улучшение разрешения может быть достигнуто с применением более высоких спиновых скоростей или более сильных полей. Дополнительная информация может быть получена на основе мультиквантовых экспериментов. На примере фотосинтетических объектов показано, что MAS ЯМР позволяет проводить структурные исследования в целых мембранных белковых комплексах и получать информацию, которую в настоящее время невозможно получить другими спектроскопическими методами.

Таким образом, в ходе работы показаны возможности и преимущества методологий [U-SIL] и MAS ЯМР для получения информации о лиганд-белковом и лиганд-лигандовом взаимодействии с использованием одного образца, а также продемонстрирована возможность получения белка-мишени, [U-I5N] H1R человека в липосомальной форме в миллиграммовых количествах, что решает проблему доступности меченных стабильными изотопами белков-мишеней. Это вносит существенный вклад в дальнейшую разработку методологий для определения 3-х мерной структуры белка-мишени методом ЯМР и использования информации для последующего моделирования in silico при конструировании новых лекарственных средств. Наши исследования позволяют получать как терапевтические белки, так и белки-мишени в клеточных линиях насекомых и млекопитающих, и открывают новые возможности для разработки лекарственных препаратов и для протеомики.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Разработан мультидисциплинарный инструмент для рационального конструирования лекарственных препаратов, состоящий из следующих элементов: технологий мультиспинового мечения как лиганда, так и белкового комплекса, высокой степени эффективности введения изотопной метки в целевой продукт, аналитических методов определения степени обогащения стабильными изотопами, а также методов контроля химического состава биомасс. Внесён вклад в развитие методологий ЯМР и Фурье ИК для структурно-функциональных исследований белковых комплексов, включая фармацевтически важные белки-мишени. Наряду с вкладом в разработку лекарственных препаратов, созданы новые возможности для разработки фармакологических и диетических подходов и ранней диагностики.

1. Исследованы возможности стратегии [U-SIL] и показаны её преимущества для структурно-функционального изучениия лиганд-белковых взаимодействий в мембранных комплексах с помощью методов MAS ЯМР и ИК. Выбраны объекты и изучены как [U-SIL] лиганд в мембранно-белковом комплексе, так и целый [U-SIL] белковый комплекс.

2. Изучена эффективность биосинтетического введения 13С, 15N в различные прокариотические и эукариотические источники. Примерами являются получение [U-13C,1SN] биомасс представителей трёх доменов организмов - бактерий, архей и эукариот: метилотрофных, фототрофных бактерий, галофильных архей, грибов, дрожжей, водорослей, клеточных линий насекомых и млекопитающих. Изучен биотехнологический потенциал микробиологических источников и исследованы условия культивирования для получения биомасс с определенным химическим составом. Оценена конверсия метаболических предшественников в конечный продукт.

3. Разработан анализ химического состава биомасс с помощью ИК, который позволяет оценивать воспроизводимость, проводить качественную оценку состава биомассы без привлечения экстракции, а также количественно определять уровень введения стабильной изотопной метки.

4. Разработаны методики выделения аминокислот из гидролизатов биомасс различных природных источников в виде карбобензоксипроизводных и в свободном виде. Доступность меченых аминокислот расширяет возможности их использования для протеомики и структурной биологии в различных стратегиях мечения, таких как SILAC, U-SIL.

5. Из экстрактов биомассы и культуральной жидкости Е. salmosynnemata выделены пептаиболы зервамицин 1С, IIA и IIB, меченные по следующим аминокислотным остаткам: [2',4', 5',6',7'-2H5]L-Trp-l, [l'-15N]L-Trp-l и [2',3',4,,5',6'-2H5]L-Phl-16. Выявлено, что Tip может синтезироваться из метаболического предшественника антраниловой кислоты, а фенилаланиол

из Phe. Разработанный метод является основой для получения меченных стабильными изотопами 13С, 15N и 2Н зервамицинов по позициям Тгр-1 и Phl-16 или их комбинации. Изменение концентрации глюкозы в питательной среде оказывает значительный эффект на суммарный выход зервамицинов и на соотношение между IIA:IIB. Найдено, что при повышенных концентрациях Тгр в питательной среде основными продуктами являлись зервамицины [Leu-1; Aib-4]- и [Leu-1, Iva-4],

6. На основе экстрактов биомасс природного происхождения разработаны составы новых питательных сред PLIm для эффективного и экономичного мечения стабильными изотопами в клеточных линиях млекопитающих СНО и НЕК 293. PLIm позволяет уменьшить стоимость цен питательных сред в 4-8 раз для СНО и в 3-6 раз для НЕК-293 в случае 15N и 13C,15N соответственно с учётом цен индивидуальных аминокислот. Тем самым созданы возможности для получения в клеточных линиях млекопитающих меченных рекомбинантных белков, как белков-мишеней, так и терапевтических белков.

7. На основе экстрактов биомасс природного происхождения разработаны составы новых питательных сред PLI-Inl для эффективного и экономичного мечения стабильными изотопами в клеточных линиях насекомых. Показано, что комбинация компонентов сред на основе дрожжей и красных водорослей даёт наилучшие результаты и позволяет достичь 8-10 кратного уменьшения стоимости сред. На основании PLI-Inl в клеточной линии Sf9 получен функциональный [U-'5N]H1R человека. Доступность его в миллиграммовых количествах (7-10 мг) открывает возможности для анализа с помощью ЯМР твёрдого тела и ИК в целях получения информации об атомной структуре белка-мишени.

8. Получены и охарактеризованы с помощью ЯМР в растворе и в твёрдом теле [U-С, N]BChl а, [U-l3C,15N]BPheo а. Для BChl а в растворе пересмотрены опубликованные

ранее другими авторами значения химических сдвигов для семи атомов 13С в и впервые отнесены одиннадцать 13С резонансов, что достигнуто на одном образце с применением [U-SIL]. Полное определение химических сдвигов резонансов атомов 'Н, 13С, 15N в молекулах этих соединений создало фундаментальную основу для изучения последующих лиганд-белковых взаимодействий в фотосинтетических белках, что представляется важным с точки зрения применения порфириновых производных в медицине.

9. Разработана новая концепция использования мультиспинового мечения стабильными изотопами и ЯМР твёрдого тела, которая позволяет относить химические сдвиги меченых кластеров лигандов в белковом комплексе с помощью одного образца. Преимущества продемонстрированы на фотосинтетических объектах для характеристики кофактора и его взаимодействия с белком на примере РЦ из Rb. sphaeroides R26 с [U-13C] растительным Pheo а и с [U i3C,'5N] бактериальным BPheo а; а также на примере СК2 из Rps. palustris с [U-13C,15N]

BChl a B800 для характеристики кофактора и его взаимодействия с белком и кофактор-кофактор взаимодействий в случае [U-13C,1SN] СК2. При этом:

а) Разработан новый метод определения эффективности замещения BPheo а на [U-13C,15N] BPheo с помощью ИК. В связи с этим разработаны новые экспериментальные условия фотонакопления На", и охарактеризован пигмент. Эффективность замещения определена на основании уменьшения интенсивности ИК полос при 1590 см"1 и 1466 см"1 в спектре На/На и составила выше 50%. Метод позволил отделить вибрационные полосы пигмента от поглощения белкового окружения.

б) Исследовано поведение двух кластеров феофитинов размером около 1 кДа в мембранном белковом комплексе размером 100 кДа. Наблюдалось лишь слабое взаимодействие пигментов с белком, затрагивающее углерод в положении 172 кольца IV и, возможно, кольцо V лиганда. Влияния Glu L104 на перетрубацию Pheo а со стороны активной цепи переноса электрона не замечено. Состояния протонирования пигментов оказались одинаковыми, что указывает на большое сходство двух феофитинов с точки зрения плотностей атомных зарядов для углеродов порфириновой структуры, а это вызывает особый интерес, принимая во внимание асимметрию процесса первичного разделения заряда в фотосинтезе.

в) При исследовании электронной структуры кофакторов BChl а В800 и BChl а В850 в СК2 найдено электронное сходство между В800, аВ850 и РВ850 в поляризации по оси бактериохлоринового кольца параллельно переносному дипольному моменту. Значительный сдвиг полосы Qy В850 по сравнению с Qy В800, объясняется, главным образом, перекрыванием бактериохлориновых колец В850 в СК2. Поскольку эффекты химических сдвигов распределены по хлориновому кольцу, а не локализованы на отдельных положениях углеродов, поляризация между кофакторами и белком происходит по механизму нелинейного диэлектрического ответа.

10. Изучены гетероядерные l3C-15N корреляции в [U-SIL] мембранном белковом комплексе методом MAS ЯМР на примере СК2 из Rps. acidophila 10050 размером 150 кДа. Отнесение химических сдвигов в результате анализа спектров ЯМР твёрдого тела (NCO, NCa; Ni(Ca,Cp)i; Ni(C„,Cp,C,)i; Ni(Ca,Cp,Cy)i.i, связано, в основном, со спиральной частью мембранного комплекса, что позволило получить новую структурную информацию и внести существенный вклад при определении 3-х мерной структуры белковой части комплекса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ

1. Егорова Т.А., Ерёмин С.В., Мицнер Б.И., Звонкова Е.Н, Швец В.И. Метод препаративного выделении аминокислот в виде бензилоксикарбонилпроизводных из белковых гидролизатов. //Биотехнология. -1993.- 5,24-32.

2. Егорова Т.А., Мосин О. В, Ерёмин С.В., Карнаухова Е.Н., Мицнер Б.И., Звонкова Е.Н, Швец В.И. Препаративное выделение аминокислот в виде бензилоксикарбонильных производных из белковых гидролизатов из различных источников. //Биотехнология. -1993.- 8,21-25.

3. Egorova Т.А., Eremin S.V., Mitsner B.I., Zvonkova E.N., Shvets V.I. Isolation of individual amino acids from various microbiological sources using reversed-phase high performance liquid chromatography. //J. Chromatogr.-Biomed. -1995.-665, 53-62.

4. Egorova-Zachernyuk T.A., Shvets V.I., Versluis K., Heerma W., Creemers A.F.L., Nieuwenhuis S.A.M., Lugtenburg J., Raap J. Preparation of site-specifically labelled zervamicins, the antibiotic peptaibols produced by Emericellopsis salmosynnemata. //J. Pept. Sci. -1996.- 2, 1-10.

5. Мосин O.B., Складнее Д.А., Егорова T.A., Юркевич A.M., Швец В.И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibactermm methyiicum во время роста на дейтерированной воде. //Биотехнология. - 1996.- 3,3-12.

6. Мосин О.В., Егорова Т.А., Складнее Д.А., Юркевич А.М., Швец В.И. Получение бактериородопсина меченного стабильными изотопами по аминокислотным остаткам ароматических аминокислот. //Биотехнология. -1996.- 4,27-34.

7. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т. А., Швец В.И. Оценка степени обогащения аминокислот, меченных стабильными изотопами 2Н и |3С полученных из бактериальных объектов, с помощью масс спектрометрии. //Биоорганическая химия. -1996.- 22 (10), 861-874.

8. Мосин О.В., Складнев, Д.А., Егорова Т. А., Швец В.И. Методы получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, |3С, l5N, ,80. //Биотехнология. -1996.-10,24-40.

9. Складнев ДА., Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии - источники аминокислот, меченных стабильными изотопами D и |3С. //Биотехнология. -1996,- 5,25-34.

10. Egorova-Zachernyuk Т.А., van Rossum В., Boender G-J., Franken E., Ashurst J., Raap J., Gast P., Hoff A., Oschkinat H., DeGroot H.J.M. NMR Characterization of protein-pheophytin interactions in Rhodobacter sphaeroides R-26 photosynthetic reaction centers, from multispin pheophytin enrichment and 2-D MAS NMR dipolar correlation spectroscopy. //Biochemistry-US. -1997.- 36, 7513-7519.

11. Egorova-Zachernyuk T.A., Remy A., Shkuropatov A.Ya., Gast P., Hoff A.J., Gerwert K.., DeGroot H.J.M. Efficient conditions for the photoaccumulation of HA" in the photosynthetic reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R-26 with uniformly labelled bacteriopheophytin monitored by Fourier transform infrared difference spectroscopy. //Vibr. Spectrosc. -1999.- 19, 347-352.

12. Matysik J., Alia, Hollander J.G., Egorova-Zachernyuk T. A., Gast P., DeGroot H.J.M. A set-up to study photochemically induced dynamic nuclear polarization in photosynthetic reaction centres by solid-state NMR. //Indian J. Biochem. Biophysics. -2000.- 37(6), 418-423.

13. Egorova-Zachernyuk T.A.,Hollander J., Frazer N.. Gast P., Cogdell R., Hoff A.J., DeGroot H.J.M., Baldus, M. Backbone correlations in a folly labelled membrane protein complex at ultra high magnetic fields. Hi. Biomol. NMR. -2001.- 19,243-253.

14. Egorova-Zachernyuk T.A., Hollander J., Frazer N., Gast P., Cogdell R., Hoff A.]., DeGroot H.J.M., Baldus, M. MAS NMR on a [U-13C, 1!N] light-harvesting complex from Rps. acidophila 10050. //In: The Future of Solid State NMR in Biology. -2001.- Kluwer Publisher. P. 171

15. Remy A., Boers R.B., Egorova-Zachernyuk T.A., Gast P., Lugtenburg J., Gerwert K. Assignment of methoxy vibrations of ubiquinone-10, QA and QB in the reaction centre of Rhodobacter sphaeroides by means of FT-IR spectroscopy and specific isotopic labelling. //Eur. J. Biochem. -2003.- 270(17), 3603-3609.

16. van Gammeren A.J., Hulsbergen F.B., Kiihne S., Hollander J.G., Buda F., Egorova-Zachrnyuk T.A., Frazer N, Cogdell R., DeGroot HJ.M. Selective chemical schift assignment of both B800 and B850 bactieriochlorophylls in uniformly [13C, 15N] labeled light harvesting complex from Rhodopseudomonas acidophila strain 10050 by solid state NMR at ultra-high magnetic field. Hi. Am. Chem. Soc. -2005.- 3213-3219.

17. Acien Fernandez F.G., Fernandez Sevilla J.M. Egorova-Zachernyuk T.A., Molina Grima E. Cost-effective production of 13C, 15N stable isotope labeled biomass from phototrophic microalgae for various biotechnological applications. //Biomol. Eng. -2005. - 22, 193-200.

18. Egorova-Zachernyuk T.A., van Rossum В., Erkelens K., DeGroot H. Characterization of unformly 13C, 1SN enriched bacteriochlorophyll a and bacteriochlorophyll b in solution and in solid state: assignment of the "С, H and "N chemical shifts. //Magn. Reson. Chem. -2008.- 46, 1074-1083.

19.Egorova-3a4epHK>K T.A., Складнев Д.А., Швец В.И. Биотехнологическое получение высокодейтерированных пурпурных мембран галобактерий для нанобиотехнологии. //Биотехнология. -2008.- 6,60-72.

20. Pistorius A., DeGrip W.J., Egorova-Zachernyuk Т.А. Monitoring of biomass composition from microbiological sources by means of FT-IR spectroscopy. //Biotechnol. Bioeng. -2009.- 103,123-129.

21. Egorova-Zachernyuk T.A., Bosnian G., Pistorius A., DeGrip W.J. Production of yeastolates for uniform stable-isotope labelling in eukaryotic cell culture //Appl. Microbiol. Biot. -2009,- 84,575-581.

22. Егорова-Зачернюк Т.А., Босман Г.Й.С.Г.М., ДеГрип В.Й., Швец В.И. Введение стабильной изотопной метки в гистаминовый рецептор человека H1R: перспективы для рациональной разработки лекарств. //Доклады Академии Наук. Биохимия, биофизика, молекулярная биология. -2010,- 433(2), 257-261.

23. Egorova-Zachernyuk Т.А., Bosman G J.G.C.M., DeGrip W.J. Uniform stable-isotope labelling in mammalian cells: formulation of a cost-effective culture medium. //Appl. Microbiol. Biot. -2011.- 89, 397-406.

ПАТЕНТНАЯ ЗАЯВКА

WO 2005/005616 A3; приоритет от 11.07.2003 г. PCT/NL03/00514. Egorova-Zachernyuk, Т.А. Compositions and methods for stable isotope labelling of biological compounds. Патенты в Российской Федерации RU 2409657 С2 и в Австралии AU 2004256368 выданы в 2011 г.

ОСНОВНЫЕ ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ (ОБЩЕЕ ЧИСЛО 42)

1. Egorova Т.A., Eremin S.V., Zvonkova E.N., Shvets V.I. Preparative isolation of individual amino acids from various microbiological sources by means of RP HPLC. //2-nd World Conference. Stable Isotopes in Nutritional and Metabolic Research. Rotterdam, The Netherlands. -1994,- P. 11.

2. Egorova T. A, Shvets V.I., Versluis K., Heerma W., Lugtenburg J., Raap J. Specifically stable isotope labelled peptide antibiotic zervamicines produced by EmericeHopsis salmosynnema. //14-th American Peptide Symposium, Columbus, Ohio, USA. -1995-. P.264.

3. Egorova-Zachernyuk T.A., Ogrel Al., Raap J. Stable isotope labelled peptaibol zervamicin. Biosynthesis and chemical synthesis. //Конференция, посвященная 100 летию со дня рождения Преображенского. -1996.- Москва. Российская Федерация. Р.153-155.

4. Egorova-Zachernyuk Т.А., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biotechnological preparation of deuterium, nitrogen-15 stable isotopically double labelled bacteriorhodopsin. //7-th International Conference on Retinal Proteins, Zichron Yaacov, Israel. -1996-. P.56.

5. Egorova-Zachernyuk T.A., Raap J., Oschkinat H., Gast P., Frank H., DeGroot H.J.M. Investigation of B-carotene/chlorophyll a interactions in solution by 1-D and 2-D NMR correlation spectroscopy. //11-th International Symposium on Carotenoids. Leiden, The Netherlands. -1996-. P. 122.

6. Egorova-Zachernyuk T.A., van Rossum В., Boender G-J., Raap J., Gast P., Hoff A., Oschkinat H., DeGroot H.J.M. Characterization of cofactors in a membrane protein with multispin enrichment and l3C MAS NMR dipolar correlation spectroscopy. //The 39-th Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference. The Asilomar conference Center. Pacific Grove, CA. USA. -1998,- P.38.

7. Egorova-Zachernyuk T.A., Remy A., Shkuropatov A.Ya., Gast P., Hoff A. J., Gerwert K., DeGroot H.J.M. Efficient conditions for the photoaccumulation of HA" in the photosynthetic reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R-26 with uniformly labelled bacteriopheophytin monitored by FT-IR in Photosynthesis: Mechanisms and Effects. Volume II. // Proceedings of the XI International Congress on Photosynthesis. Budapest, Hungary. -1998.- Kluwer Academic Publishers. P.755-758.

8. Egorova-Zachernyuk, T.A., Fraser, N., Cogdell, R., Gast, P., Hoff ,A., DeGroot H.J.M. Characterization of bacteriochlorophyll B800 in CK2 of Rhodopseudomonas acidophila with 2-D 13C MAS NMR dipolar correlation spectroscopy. //The Alpine Conference on Solid State NMR. Chamonix-Mont Blanc, France. -1999.- P. 101.

9. Egorova-Zachernyuk T.A., Hollander J., Fraser N., Cogdell R., Gast P., Hoff A., DeGroot H.J.M., Baldus M. Backbone and sidechain correlations of a uniformly l3C,15N labelled membrane protein complex at ultra-high magnetic fields. //41 Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference. Asilomar, CA, USA. -2000.- P 201//8-th International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules. Sandestin, Florida, USA. -2000,- P.201.

10. Egorova-Zachernyuk T.A. Structure Based Drug Design: Perspectives of Solid State NMR.//Camerino-Noordwijkerhout Symposium, Camerino, Italy. -2003.- P.25.

11. Egorova A.D., van Wyk L., Willems H.J.J., Egorova-Zachernyuk T.A. Design of novel media for membrane protein production in photosynthetic bacteria. //5-th European workshop on Algal Biotechnology- Potsdam, Germany -2003.-P.6.

12. Egorova-Zachernyuk T.A. Application of stable isotope labelled products from algae: new opportunities for structure based drug design and solid state NMR. //The 10-th International Conference on Applied Phycology. -2005.-Kunming, China, P.43.

13. Egorova-Zachernyuk T.A., Pistorius A.M.A., DeGrip W.J. Determination of stable isotope incorporation by Fourier transform infrared spectroscopy: new opportunities for proteomics and metabolomics. //Phytopharm 2007. 11-th International congress, Leiden, The Netherlands. -2007.- P13.

14. Egorova-Zachernyuk T.A., Willems H., Lamers E., Bosman G.J.G.C.M., DeGrip W.J. Stable isotope labelling of drug targets for structure based drug design: the human histamine HI receptor. Мечение стабильными изотопами белков-мишеней для рациональной разработки лекарственных препаратов: гистаминовый рецептор H1R человека. //XVIII Международный Менделеевский конгрес, Москва, Россия. -2007,- Р.472.

15. Egorova-Zachernyuk Т.А., DeGrip W.J. Stable isotope labeling of drug targets and protein therapeuticals in insect and mammalian cells. //Euromar. St. Petersburg. Russian Federation. -2008.- P. 473.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ATR (attenuated total reflection) - смягчённое полное отражение

APCI (atmospheric pressure chemical ionization) - химическая ионизация под атмосферным давлением CID (collision induced dissociation) - вызванная столкновениями диссоциация CD (circular dichroism) - круговой дихроизм

COLOC (correlated spectroscopy via long range couplings) - корреляционная спектроскопия через спин-

спиновое взаимодействие удалённых атомов

COSY (correlated spectroscopy) - корреляционная спектроскопия

CP (cross polarization) - кросс-поляризация

Cw (continues wave) - стационарная развёртка частоты

DFT (density functional theory) - теория функциональной плотности

DRIFT (diffuse reflectance infrared Fourier transform) - диффузионный отражательный инфракрасный Фурье перенос

ESI (electrospray ionization) - электроспреевая ионизация

ENDOR (electron nuclear double Tesonance) - электронно-ядерный двойной резонанс

FAB (fast atom/ion bombardment) - бомбардировка быстрыми атомами

FS-LG (frequency-switched Lee-Goldburg) - переключение частоты no Jlu-Голдбургу

FT-IR (Fourier transform infrared) - инфракрасная спектроскопия с Фурье преобразованием

FTICR (Fourier transform ion cyclotron resonance) - Фурье трансформ ионно-циклотронный резонанс

FSD (Fourier self-deconvolution) - Фурье самодеконволюция

GPCR (G-protein coupled receptors) - G-белок сопряженные рецепторы

HMBQ (heteronuclear multiple-bond correlation) - гетероядерная корреляционная спектроскопия через несколько связей

HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence) - гетероядерная корреляционная спектроскопия с многоквантовым переносом когерентности

НОНАНА (homonuclear Hartmann Hann) - гомоядерная корреляционная спектроскопия с использованием эффекта Хартмана-Хана

ISD (isopotential spin-drying) - изопотенциальная спиновая сушка

LC (liquid chromatography) - жидкостная хроматография

LSI (liquid secondary ionizatio) - вторичная жидкостная ионизация

MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) - лазерная десорбция/ионизация, индуцированная с помощью матрицы

MAS (magic angle spinning) - вращение под магическим углом

NMR (nuclear magnetic resonance) - ядерный магнитный резонанс (ЯМР)

NOESY (nuclear Overhauser effect spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера

RFDR (radio-frequency-driven dipolar recoupling) - биполярная развязка, вызванная радиочастотами

PFG (pulsed field gradient) - импульсный градиент магнитного поля

RIA (relative isotope abundance) - относительное изотопное распространение

ROESY (rotational nuclear Overhauser effect spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта

Оверхаузера во вращающейся системе координат

SILAA (stable isotope labelling amino acids) -меченные стабильными изотопами аминокислоты SILAC (stable isotope labelling with amino acids in cell culture) - мечение стабильными изотопами с помощью аминокислот в питательной среде

TOCSY (total correlation spectroscopy) - полная корреляционная спектроскопия

ТРРМ (two pulse phase modulation) - двухимпульсная фазовая модуляция

U-SIL (uniform stable isotope labelling) - тотальное (всеобщее) мечение стабильными изотопами

[U-i3C,15N] - тотальное (всеобщее, по всем положениям углерода и азота) мечение стабильными

изотопами "С, "N

ZQ (zero quantum), нуль-квантовый

Chla a (chlorophyll а) - хлорофилл а

Pheo a (pheophytin а) - феофитин а

BChl a (bacteriochlorophyll а) - бактериохлорофилл а

BPheo a (bacteriopheophytin а) - бактериофеофитин а

СК2 (light harvesting complex 2) - светособирающий комплекс 2 (СК2)

РЦ (reaction centers) - реакционные центры (РЦ)

H1R (histamine 1 receptor) - гистаминовый рецептор первого типа

Подписано в печать 03.02.2011 Формат 90x88 1/16 Объём 1.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 903 Отпечатано в типографии "Гелиопринт" 119602 г. Москва, ул. Академика Анохина, д. 38, корп.1

Содержание диссертации, доктора химических наук, Егорова, Татьяна Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОТ ИСТОЧНИКА К ЦЕЛЕВОМУ ПРОДУКТУ:

ПОТЕНЦИАЛ ПРИРОДНОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 13С,

1.1 Потенциал меченных стабильными изотопами, биологически активных соединений.

1.2 Водоросли для битехнологии: от вида к продукту.

1.3 Археи и бактерии.

1.4 Дрожжевые экстракты как компоненты питательных сред.

1.5 Мониторинг состава биомасс из различных источников методом ИК.

ГЛАВА 2. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ АМИНОКИСЛОТЫ И ПЕПТИДЫ ДЛЯ ПРОТЕОМИКИ И СТРУКТУРНОЙ БИОЛОГИИ

2.1 Меченные стабильными изотопами аминокислоты.

2.2 Меченные стабильными изотопами пептаиболы.

ГЛАВА 3. МЕЧЕННЫЕ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ

НАСЕКОМЫХ И МЛЕКОПИТАЮЩИХ. ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВ-МИШЕНЕЙ

3.1 Меченные стабильными изотопами клеточные линии млекопитающих.

3.2 Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых.

ГЛАВА 4. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ КОМПЛЕКСОВ: СТРАТЕГИИ ТОТАЛЬНОГО МЕЧЕНИЯ ' СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ

4.1 Характеристика [и-|3С,15М] пигментов: химические сдвиги 13С, 15Ы в растворе и твёрдом теле.

4.2 [и-13С,,5М] лиганд в мембранном белковом комплексе: лиганд-белковые взаимодействия.

4.2.1 Фотосинтетические РЦ с [и~13С]РЬео а.

4.2.2 Фотосинтетические РЦ с [и-13С,15М]ВРЬео а.

4.2.3 Фотосинтетические СК2 с [и-13С,15М] ВСЫ а В800 и [и-13С,15Ы] СК2. Электронная структура кофакторов, кофактор-кофакторные и кофактор-белковые взаимодействия.

4.3 Тотально меченный стабильными изотопами мембранный белковый комплекс.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы"

Имеющиеся на сегодняшний день на рынке лекарства действуют на 500 мишеней, из которых более, чем 90% составляют белки. Причём более половины имеющихся на рынке лекарств действуют на мишени, представляющие собой мембранные белки класса G-белок сопряженных рецепторов (GPCR1). В то время, когда на сегодняшний день согласно базе белковых структур PDB, трёхмерное строение более, чем 10,000 водорастворимых белков известно и определено такими классическими методами как кристаллография и ЯМР с разрешением выше чем 3 Á, пространственное строение установлено лишь для нескольких белков класса GPCR: родопсина в 2000 г., 02 и Pj адренорецепторов в 2007 и 2008 г., аденозинового рецептора А?л в 2008 г, хемокинового CXCR4 и дофаминового D3 в 2010 г.

1 Список сокращений приведён на стр. 265 числе, Н-связывании, я-взаимодействии, электростатических эффектах и перераспределении зарядов. Для этих исследований требуются миллиграммовые

1"Я количества высокоочищенных белков, меченных стабильными изотопами, такими как С, 15Ы или их комбинации. Белки могут быть получены экспрессией соответствующей копийной ДНК в выбранной клетке-хозяине.

В настоящей работе разрабатывались методологические подходы, связанные с созданием эффективных методов тотального мечения биомолекул стабильными изотопами, [и-БГЦ, а также структурно-функциональными исследованиями мембранных белков методами ЯМР и Фурье-ИК. Особое внимание уделено методам [Ц-БГЦ, позволяющим получить структурную информацию с помощью лишь одного образца.

Цель и задачи исследования заключались в разработке мультидисциплинарного подхода и развитии ряда технологий для структурно-функциональных исследований мембранных белковых комплексов методами [и-БГЬ] и последующего вклада в рациональное конструирование лекарственных препаратов. Особое внимание уделялось доступности [и-ЭГЬ] лигандов и [Ц-ЭЛ,] мембранных комплексов при эффективном использовании метаболических предшественников, полученных на базе меченных стабильными изотопами 13с, 15ы, 2Н различных природных источников (бактерии, дрожжи, грибы, водоросли, растения, клеточные линии насекомых и млекопитающих). В ходе исследования были поставлены задачи:

3. Решить проблему доступности меченых соединений при их получении в клеточных линиях эукариот. В связи с этим разработать питательные среды для эффективного [и-БШ] клеточных линий насекомых и млекопитающих. Исследовать биотехнологический потенциал дрожжевых экстрактов как компонентов питательных сред.

2Целевым продуктом являются низкомолекулярные и высокомолекулярные соединения, такие как пигменты, липиды, жирные кислоты, стерины, углеводы, аминокислоты, пептиды, мембранные белки, а также различные экстракты, полученные из клеточных биомасс и приготовленные согласно разработанным протоколам с учетом условий их дальнейшего применения.

4. Выбрать фармацевтически важный белок-мишень, получить его в [U-SIL] виде с использованием специально разработанных питательных сред, тем самым продемонстрировать возможность получения [U-SIL] сложных белков-мишеней для получения структурной информации.

5. Исследовать возможности стратегии [U-SIL] и показать её преимущества для дальнейшего применения в метаболомике, протеомике и структурной биологии с помощью методов MAS ЯМР, ИК и МС. Для этого выбрать объекты и изучить как [U-SIL] лиганд в мембранно-белковом комплексе, так и [U-SIL] белковый комплекс в целом.

Научная новизна заключается в разработке на основе [U-SIL] и биофизических методов исследования ряда методологий' для рациональной разработки лекарственных препаратов и для ранней диагностики. В европейском патенте 2003 г, заявленном в Европе, Российской Федерации, Японии, Канаде, США, Австралии и выданном в 2010 г в Австралии и в 2011 г в РФ, отражены композиции и методы мечения молекул стабильными изотопами. Разработаны приёмы эффективного [U-SIL] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых.

Замена в синтетических питательных средах для клеточных линий насекомых и млекопитающих дорогостоящих меченных стабильными изотопами индивидуальных аминокислот, органических кислот и других компонентов экстрактами биомасс из различных источников позволяет уменьшить стоимость питательных сред, по крайней мере, в пять раз с учётом лишь стоимости аминокислот. Впервые было продемонстрировано рекомбинантное получение [U-SEL] фармакологически важного рецептора класса GPCR - гистаминового рецептора человека H1R в клеточной линии насекомых sf9 на основе разработанных питательных сред. Таким образом, открыты новые возможности для получения фармацевтически важных белков-мишеней с сохранённой биологической активностью в количествах, достаточных для структурных исследований с помощью ЯМР и получения информации для дальнейшего моделирования ш silico при разработке лекарств, связанных с действием рецептора.

Эффективное биосинтетическое мечение стабильными изотопами позволяет снизить стоимость целевого продукта по сравнению со стандартными методами, тем самым обеспечивает доступность [U-SIL] биомолекул для широкого спектра исследований. Разработанные подходы включают рациональную конверсию метаболического предшественника в целевой продукт, многократное использование культуральной жидкости, создание установок по типу закрытых циркуляционных систем, контроль качества биомасс и степени обогащения. Доступность биомасс с высокой степенью обогащения позволила выделить различные меченные стабильными изотопами соединения, такие как аминокислоты, пептиды, липиды, мембранные белки, а также получить различные экстракты биомасс. Разработанные с помощью ИК и МС аналитические методы мониторинга роста, химического состава, оценки воспроизводимости партий биомасс, степени их изотопного обогащения позволяют изучать их химический* состав, получать характеристики различных штаммов, проводить метаболическое профилирование. Это представляет собой отдельный интерес для протеомики и метаболомики в плане разработки продуктов для ранней диагностики в целях создания индивидуальных диетических программ и изучения их влияния на здоровье человека.

Практическая значимость. Показано, что специализированные [Ц-БТЬ] образцы способствуют развитию методов ЯМР, позволяют проводить эксперименты на одном образце и сократить расходы, связанные с получением целого ряда специфически меченых образцов, с использованием оборудования и с затратой времени для исследований. Возможности стратегии [И-БШ] и ЯМР твёрдого тела продемонстрированы на примере фотосинтетических объектов. При этом была охарактеризована на атомном уровне роль кофакторов фотосинтетических белков в рамках изучения первичного процесса фотосинтеза. В ходе работы выполнены задачи разработки методологии для получения информации с помощью [Ц-БП,] и ЯМР твёрдого тела. Доставка [и-БГЬ] образцов в различные научные и коммерческие организации послужила дальнейшему развитию ЯМР технологий (новые импульсные последовательности, подходы для расшифровки сложных спектров, тестирования чувствительности и разрешающей способности высоких магнитных полей), ИК, МС, а также применению стратегий [и-БЩ] для биофизических и метаболических исследований. Фотосинтетические белки РЦ, СК2, СК1-РЦ использовали в Лейденском Университете и Университете г. Бохума для исследований методами ЯМР, Фурье-ИК и атомно-силовой спектроскопии.

Специализированные образцы были поставлены в Швейцарский федеральный институт технологии, Цюрих; Университет г. Бохум, Германия; Университет г. Ахус, Дания; Университет в Ноттингеме, Великобритания; Вайцмановский институт науки, Израиль; Макс Планк Институт, Франкфурт, Германия; Университет г. Страсбург, Франция, Университет г. Лиеж, Бельгия, Лейденский Институт Химии, Наймегенский центр молекулярных наук о жизни, Университет Вагенинга и Лейден-Амстердам центр по исследованию лекарств, Нидерланды, Институт органической химии РАН им. Н.Д. Зелинского, Россия. Таким образом, новые методологии нашли применение для биомедицинских, метаболических, экологических, бионанотехнологических и фундаментальных исследований.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка метода получения меченных стабильными изотопами аминокислот из гидролизатов биомасс различных источников; получение меченных стабильными изотопами фармацевтически важных пептидов на примере зервамицинов, изучение влияния условий культивирования на биосинтез пептаиболов, их исследование методом масс спектрометрии.

2. Методология [U-SIL] в клеточных линиях млекопитающих и насекомых и получение белка-мишени на примере гистаминового рецептора H1R человека.

3. Получение и биофизическое изучение с помощью методов ЯМР в растворе и в твёрдом теле [U-13C, 15N] пигментов, таких как: хлорофилл (Chi) а, феофитин (Pheo) а; бактериохлорофилл (BChl) а, бактериофеофитин (BPheo) а.

4. Разработка рациональной и эффективной методологии получения структурной информации о лиганде в мембранно-белковом комплексе, о лиганд-белковом и лиганд-лигандном взаимодействии путём изучения электронной структуры, поляризации, протонирования. На примере бактериальных фотосинтетических мембранных комплексов, таких, как реакционные центры (РЦ) и светособирающий комплекс 2 (СК2) исследованы возможности: А) Методов [U-SIL] и двумерной (2D) корреляционной ЯМР для характеристики атомной структуры лиганда в мембранном белковом комплексе; Б) Фурье-ИК для изучения [U-SIL] лиганда в мембранном белковом комплексе, определения степени замещения лиганда в белковом комплексе и его взаимодействия с белковым окружением. Для этого разработаны условия фотонакопления НА~ в РЦ; В) Изучения кофактор-кофакторного взаимодействия в СК2.

5. Разработка эффективной методологии получения информации о структуре целого мембранно-белкового комплекса с помощью [U-S1L] и 2D корреляционной ЯМР.

Апробация работы. Материалы работы были доложены в ряде институтов и университетов, на 38 международных конференциях, съездах и конгрессах: по стабильным изотопам: "2-я всемирная конференция по стабильным изотопам в питании и метаболических исследованиях", Роттердам, (Нидерланды, 1994); "14-й Американский пептидный Симпозиум", Колумбус, (США, 1995); "5-й Неапольский симпозиум по биологически активным пептидам", Капри, (Италия, 1996); "Конференция, посвященная 100 летию со дня рождения Преображенского", Москва, (Россия, 1996); "11-й международный симпозиум по каротиноидам", Лейден, (Нидерланды, 1996); "Х1-й международный конгрессе по фотосинтезу", Будапешт, (Венгрия; 1998); "5-я Европейская конференции по биотехнологии водорослей", Потсдам, (Германия, 2003); "Симпозиум по Hansenula polymorpha", Алгеро, (Италия, 2004); "10-я международная конференция по прикладной фикологии", Кунминг, (Китай, 2005); "11-й интернациональный конгресс Фитофарм", Лейден, (Нидерланды, 2007); EUROMAR 2008, Санкт Петербург, (Россия, 2008); по мембранным белкам: "7-я международная конференция по ретинальным белкам", Зихрон Яков, (Израиль, 1996); "Интернациональная конференция по мембранным белкам", Амстердам, (Нидерланды, 2000); "8-я международная конференция по кристаллизации биологических макромолекул", Сандестин, Флорида, (США, 2000); "Европейский колледж: Как получить белок?" Гронинген, (Нидерланды, 2003); "14-й Камерино-Нордвикерхаут симпозиум по прогрессу в области химии рецепторов", Камерино, (Италия, 2003); "Международная конференция Биобизнес Азия", (Тайвань,

2005); "Нидерландский инновативный семинар", Пекин, Шанхай (Китай, 2005); семинар о технологиях PLI в Биосаенс парке Кэмбриджа, (Великобритания, 2005), "Международная конференция БиоАзия 2006", Хайдарабад, (Индия, 2006) и "БиоБангалор 2006", (Индия,

2006), "XVIII Менделеевский конгресс по прикладной и общей химии", Москва, (Россия,

2007); по спектороскопнческим методам: 39-я, 40-я и 41-я конференция по экспериментальной ЯМР, Азиломар, Калифорния, (США, 1998, 1999, 2000); "3-я Европейская конференция по ЯМР биомолекул, меченных стабильными изотопами", Оксфорд, (Великобритания, 1998); симпозиум "Перенос энергии в биологических системах", Оеирас, (Португалия, 1998); "3-й международный симпозиум по инфракрасной и рамановской спектроскопии", Вена, (Австрия, 1998); Лаборатория физической химии, Швейцарский Федеральный Институт Технологии, Цюрих, (Швейцария, 1999); Институт Ботаники Университета Мюнхен, (Германия, 1999); "Альпийская конференция по ЯМР твёрдого тела", Шамони МонБлан, (Франция, 1999); Симпозиум по внутреннему и внешнему переносу электрона, Вилдбад Креут, (Германия, 2000); международный симпозиум "Будущее ЯМР твёрдого тела в биологии", Лейден, (Нидерланды, 2000); Центр Томографии и Спектроскопии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, Москва, (Россия, 2007), "EUROMAR 2008", Санкт Петербург, (Россия). Новые технологии по [U-SIL] и биофизическим исследованиям структуры и функций биомолекул были представлены на научном семинаре фирм Солвей Фармацевтикалз,

Вейсп, (Нидерланды, 2004), ГлаксоСмисКляйн, Стивенэдж, (Великобритания, 2005) и на телеконференции Эли Лилли, (США, 2007).

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 275 страницах, содержит 25 таблиц, 77 рисунков, включает введение, 4 главы - От источника к целевому продукту: потенциал природного разнообразия и эффективность мечения стабильными изотопами (1); Меченные стабильными изотопами аминокислоты и пептиды (2); Меченные стабильными изотопами клеточные линии насекомых и млекопитающих и белки-мишени (3); Структурно-функциональные исследования мембранных комплексов: стратегии тотального мечения стабильными изотопами (4); Выводы. В каждой из глав представлен обзор литературы, включающий новейшие данные, с общим библиографическим списком свыше 500 наименований. Работа выполнена при поддержке грантов нидерландской организацией по научным исследованиям (NWO), европейского научного общества (ESF), проекта ZonMW 014-81-133 Т.А. Егоровой по программе по стимулированию инновационного исследования медицинских препаратов и предпринимательства в Нидерландах, компании PLI, Лейден, и явилась частью демонстрационного проекта В104-СТ97-2101 комиссии Европейских обществ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Егорова, Татьяна Анатольевна

Выводы

Нами изучалась эффективность использования SIL субстратов при получении SIL биомассы фототрофных водорослей. При этом использовали как оборудование лабораторного типа для получения, например, Galderia, Cyanidium, Scenedesmus, так и биореактор для получения Phaeodactylum. Особое внимание уделялось исследованию эффективных путей получения биомассы фототрофных организмов в биореакторе. В основе процесса лежит фотобиореактор с рециркуляцией газа при низком давлении. Получены [U-13C], [U-15N] и [U-I3C,15N] биомассы. Для получения U-13С биомассы, в качестве источника углерода использовали 13СОг. Для [U-15N] биомассы использовали Na15N03 в качестве источника азота. Реактор функционировал в полунепрерывном режиме с производительностью 0.3 г/л биомассы в день. Для повышения эффективности использования SIL субстратов осуществляли реутилизацию неорганического углерода из супернатанта с помощью подкисления/десорбции, 15ЫОз" использовали в минимальных концентрациях. По данным элементного анализа, конверсия СОг в биомассу составила 89.2%, а его количество в супернатанте составило 6.9%. Что касается 15N, то его конверсия в биомассу составила 97.8%, его содержание в супернатанте составило 1.3%. Эффективность введения изотопной метки определяли методами GC-MS, LC-MS/MS, PIK, при этом наблюдалось хорошее соответствие. Определили, что степень обогащения жирных кислот в Р. tricornntum достигает 96%-99%, а эффективность 15N мечения белков в G. sulfuraria составляет 99%. Таким образом, получили более 160 г SIL биомассы. Биореактор может быть использован для SIL различных фототрофных организмов.

Разработанные процессы позволяют получать [U-SIL] биомассы различных фототрофных организмов и использовать их, как для получения экстрактов и гидролизатов, так и для выделения индивидуальных соединений. Примеры включают выделение аминокислот для протеомики и структурной биологии (глава 2), получение экстрактов для составления питательных сред для клеточных линий насекомых и млекопитающих (глава 3), получения хлорофилла и феофитина для изучения лиганд-белковых взаимодействий в фотосинтезе (глава 4). Таким образом, нами учитывалась взаимосвязь между выбором вида водоросли, влиянием условий культивирования на выход целевого продукта, а также эффективность конверсии меченных стабильными изотопами предшественников. Всё большую актуальность приобретают [U-SIL] соединения из водорослей в качестве стандартов для исследований, как в экологии, так и в диагностике. Помимо этого, разработка методов эффективного [U-SIL] является весьма актуальной в связи с прогнозируемым увеличением количества лекарств на основе водорослей.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Егорова, Татьяна Анатольевна, Москва

1. Spolaore P., Joannis-Cassan С., Duran Е., Isambert A. Commercial applications of microalgae. //J. Biosci. Bioeng. -2006.- 101(2), 87-96.

2. Jensen G.S., Ginsberg D.I., Drapeau M.S. Blue-green algae as an immuno-enhancer and biomodulator. //J. Am. Nutraceut. Assn. -2001,- 3, 24-30.

3. Borowitzka M.A., Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. //J. Biotechnol. -1999.- 70. 313-321.

4. Morweiser Mi, Kruse O., Hankamer В., Posten C. Developments and perspectives of photobioreactors for biofuel production. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2010.- 87(4), 1291-301.

5. Raja R., Hemaiswarya S., Kumar.N.A., Sridhar S., Rengasamy R. A perspective on the biotcchnological potential of microalgae. //Crit .Rev. Microbiol. -2008.-34(2), 77-88.

6. Stephens E., Ross I.L., Mussgnug J.H., Wagner L.D., Borowitzka M.A., Posten C., Kruse O., Hankamer B. Future prospects of microalgal biofuel production systems. //Trends Plant Sci. -2010.-15(10), 554-64.

7. Pulz O., Gross W. Valuable products from biotechnology of microalgae. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2004,- 65, 635-648.

8. Cohen Z. Chemicals from microalgae. //Talor & Francias LTD. -1999.9. Becker W. Microalgae in human and animal nutrition. In Richmonds A. (Ed). Handbook of microalgal culture. Blackwell Oxford. -2004.- 312-351. 1

9. Borowizka M.A. Microalgae as sources of pharmaceuticals and other biologically active compounds. // J. Appli. Phycol. -1988.- 7, 3-15.

10. Chisti Y. Biodiezel from microalgae. //Biotechnol. Adv. -2007.- 25, 294-306.

11. Stolz P., Obermayer B. Manufacturing microlagae for skin care. //Cosmetics Toiletries. -2005.- 120, 99-106.

12. Sun S.S. Application of agricultural biotechnology to improve food nutrition and healthcare products. //Asia Рас. J. Clin. Nutr. -2008.- 17(1), 87-90.

13. Blunt J.W., Copp B.R., Hu W.P., Munro M.H., Northcote P.T., Prinsep M.R. Marine natural products. //Nat. Prod. Rep. -2011,- 28(2), 196-268.

14. Meireles L.A., Guedes A.C., Malcata F.X. Lipid class composition of the microalga Pavlova lutheri: eicosapcntaenoic and docosahexaenoic acids. //J. Agric. Food Chem. -2003.- 51(8), 2237-41.

15. Wen Z.Y., Chen F. Geterotrophic production of eicosapentaenoic acid by microalgae. //Biotechnol. Adv. -2003.- 3 (4), 273-94.

16. Harwood J.L., Guschina I. A. The versatility of algae and their lipid metabolism. //Biochimie. -2009.-91(6), 679-84.

17. Singh S., Kate B.N., Baneqee U.C. Bioactive compounds from cyanobacteria and microalgae: an overview. //Crit. Rev. Biotechnol. -2005.- 25(3), 73-95.

18. Bhosale P. Environmental and cultural stimulants in the production of carotenoids from microorganisms. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2004.- 63(4), 351-61.

19. Del Campo J.A., García-González M., Guerrero M.G. Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2007.- 74(6), 1163-74.

20. Volkman J.K. Sterols in microorganisms. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003.- 60(5), 495-506.

21. Kaku K., Hiraga Y. Sterol composition of a cultured marine dinoflagellate, Hctcrocapsa circularisquama. //Nat. Prod. Res. -2003.- 17(4), 263-267.

22. CarbaJlo-Cárdcnas E.C, Tuan P.M., Janssen M., Wijffels R.H. Vitamin E (alpha-tocopherol) production by the marine microalgae Dunaliella tertiolecta and Tetraselmis suecica in batch cultivation. // Biomol Eng. -2003.- 20(4-6), 139-47.

23. Borowitzka M.A., Vitamins and fine chemicals from microalgae. In Borowitzka, M.A., Borowitzka, L.J. Micro-algal biotechnology. //Cambridge University Press. Cambridge. -1988.-153, 196.

24. Stabler S.P., Allen R'.H. Vitamin B12 deficiency as a worldwide problem. //Annu. Rev. Nutr. -2004.24, 299-326.

25. Bilan M.I, Usov A.I. Polysaccharides of calcareous algae and their effect on calcification process. // Bioorg. Khim. -2001.- 27(1), 4-20.

26. Van Dolah F.M., Ramsdell J.S. Review and assessment of in vitro detection methods for algal toxins. //J. AOAC Int. -2001.- 84(5), 1617-25.

27. Oien A., Gunde-Cimcrman N. Mycosporines and mycosporine-like amino acids: UV protectants or multipurpose secondary metabolites? // FEMS Microbiol. Lett. -2007.- 269 (1), 1-10.

28. Villar R., Laguna M.R., Calleja J.M., Cadavid I. Effects of Phaeodactylum tricornutum and Dunaliella tertiolecta extracts on the central nervous system. //Planta Med. -1992.- 8(5), 405-409.

29. Mayfield S.P., Manuell A.L, Chen S., Wu J., Tran M„ Siefker D., Muto M., Marin-Navarro J. Chlamydomonas reinhardtii chloroplasts as protein factories. //Curr. Opin. Biotechnol. -2007.- 18(2), 12633.

30. Harris W.S., Miller M., Tighe A.P., Davidson M.H., Schaefer E.J. Omega-3 fatty acids and coronary heart disease risk: Clinical and mechanistic perspectives. //Atherosclerosis. -2008.- 197(1), 1224.

31. Bourre J.M. Effect of increasing the omega-3 fatty acid in the diets of animals on the animal products consumed by humans. //Med. Sci (Paris). -2005.- 21(8-9), 773-9.

32. Bourre J.M. Omega-3 fatty acids in psychiatry. //Med. Sci. (Paris). -2005.- 21(2), 216-21

33. Rupp H., Wagner D., Rupp T., Schulte L.M., Maisch B. Risk stratificationby the "EPA+DHA level" and the "EPA/AA ratio" focus on anti-inflammatory and antiarrhythmogenic effects of long-chain omega-3 fatty acids. //Herz. -2004.- 29(7), 673-85.

34. Stahl L.A., Begg D.P., Weisinger R.S., Sinclair A .J. The role of omega-3 fatty acids in mood disorders. //Curr. Opin. Investig. Drugs. -2008.- 9(1), 57-64.

35. Metting F.B. Biodiversity and application of microalgae. //J. Ind. Microbiol. -1996.- 17, 477-489:

36. Chen G.Q., Chen F. Growing phototrophic cells without light. //Biotechnol. Lett. -2006.- 28(9), 60716.

37. Lebeau T., Robert J.M. Diatom cultivation and biotcchnologically relevant products. Part I: cultivation at various scales. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003.- 60(6), 612-23.

38. Cox J., Kyle D., Radmer R., Delente J. Stable-isotope-labelled biochemicals from microalgae. TIBETCH. -1988.- 6, 279-282.

39. Berthold H.K., Hachey D.L., Reeds P.J., Thomas O.P., Hoeksema S., Klein P.D. Uniformly 13C labeled algal protein used to determine amino acid essentially in vivo. //Proc. Natl. Acad. Sci. -1991.- 88, 8091-8095.

40. Acicn F.G., Brindley C., Sánchez J.A., Fernández J.M., Ibáñez M.J., Molina E. Production of 13C polyunsaturated fatty acids from the microalga Phaeodactylum tricornutum. //J. Applied Phycology -2003,- 15, 299-237.

41. Egorova-Zachernyuk T.A. Application of stable isotope labelled products from algae: new opportunities for structure based drug design and solid state NMR. //The 10-th International Conference on Applied Phycology. Thesis. -2005. Kunming, China, P 43.

42. Acien F.G., Fernandez J.M., Egorova-Zachernyuk T.A., Molina E. Production of 13C, 15N labelled biomass from phototrophic microalgae art commercial scale. //The 10-th International Conference on Applied Phycology. Thesis. -2005.- Kunming, China, P 109.

43. Bequette B.J., Sunny N.E., El-Kadi S.W., Owens S.L. Application of stable isotopes and mass isotopomer distribution analysis to the study of intermediary metabolism in nutrients. //J. Anim. Sci. -2006.- 84, 50-59.

44. Emken E.A. Stable isotope approaches, applications and issues related to polyunsaturated fatty acid metabolism studies. //Lipids. -2001.- 36 (9), 965-973.

45. Crespi H.L., KatzJJ. Preparations of deuterated proteins and enzymes. In Hirs C.H.W., Timasheff C.N., Eds. //Methods Enzymol. Academic Press, Dordreclit-Holland. -1972.- 26, 627-637.

46. Sorensen P.', Poulsen F.M. A simple and economical algal culture system for stable isotope labelling. //J. Biomol. NMR. -1992.- 2, 99-101.

47. Patzelt H., Keüler B., Oschkinat H., Oesterhelt D. The entire metabolite spectrum of the green alga' Scenedesmus obliquus in isotope-labelled form. //Phytochemistry. -1999.- 50, 215-217.

48. Lugtenburg J., Creemers A.F.L., Verhoeven M.A., van Wijk A.A.C., Verdegem P.J.E., Monnee M.C.F., Jansen F.J.H.M. Synthesis of 13C labelled carotenoids and retinoids. //Pure Appl. Chem -1999.71,2245-2251.

49. Yongmanitchai W., Ward O.P. Screening of algae for potential alternative sources of eicosapentaenoic acid. //Phytochemistry. -1991.- 30(9), 2963-2967.

50. Boyle-Roden E., German J.B., Wood B.J.B. The production of lipids alternately labelled with carbon-13. //Biomol. Engineering. -2003.- 20, 285-/289.

51. Mann J.E., Myers J. On pigments, growth, and photosyntheis ogf phaeodactylum tricornutum. //J. Phycololgy. -1968.-4, 349-355.

52. Cawse P. A. The determination of nitrate in soil solutions by ultraviolet spectrophotometry. //Analyst. 92-1967.- 311-315.

53. Lepage G., Roy C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. //J. Lipid Research -1984.- 25, 1391-1396.

54. García Sánchez J.L., Molina Grima E., García Camacho F., Sánchez Pérez J.A., Giménez Giménez A. Cuantiíicación de ácidos grasos a partir de biomasa microalgal. //Grasas y Aceites. -1993.- 44(6), 348353.

55. Sun M.Y. Mass spectrometric characterizations of 13C-labeled lipid tracers and their degradation products in microcosm sediments. //Org. Geochem. -2000.-31, 199-209.

56. Molina Grima E., Acién Fernández F.G., García Camacho F., Camacho Rubio F., Chisti Y. Scale-up of tubular photobioreactors. //J. Appl. Phycol. -2000.- 12, 355-368.

57. Takeda, H. Cell wall sugars of some Scenedesmus species. //Phytochemistry. -1996.- .42. (3), 673675.

58. Gross W., Schnarrenberger C. Heterotrophic Growth of Two Strains of the Acido-Thermophilic Red Alga Galdieria sulphuraria. //Plant Cell Physiol. -1995.- 36, (4) 633-638.

59. Oesterhelt C., Gross W. Different Sugar Kinases Are Involved in the Sugar. Sensing of Galdieria sulphuraria. //Plant Physiol. -2002,- 128(1), 291 299.

60. BoenziD., deLuca P., TaddeiR. Fatty acids inCyanidium. //Giorn.Bot. Ital. -1977.- Ill, 129-134.

61. Seckbach J., Dean R., Ringelberg D., White D. Sterols and phylogeny of the acidophilic hot springs algae Cyanidium caldarium and Galdieria Sulphuraria. //Phytochemistry. -1993.- 34(5), 1345-1349.

62. Nagaschima H. Natural products of the Cyanidiophyceae. In (Seckbach: J. ed) Evolutionary Pathways and Enigmatic algae: Cyanidium caldarium (Rhodophyta) and related cells. -1994.- 201; 214.

63. Gravcrholt O.S., Eriksen N.T. Heterotrophic high-cell-density fed-batch and continuous-flow cultures of Galdieria sulphuraria and production of phycocyanin. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2007.- 77(1), 6975.

64. Meyer H. //Naturwissenschaften -1936.- 22, 346.

65. Katz J., Crespi'H., in Collins, C.J., Browman, N.S. Eds. Isotope effects in reaction rates. Van NostrandReinhord. New York. USA. -1971.- Ch. 5.

66. Blake M.I., Crane F.A. Uphaus R.A. Katz J.J. Can Jt J. Effect of deuterium oxide on the growth of peppermint (Mentha piperita L.). Morphological study. //J. Pharm. Sei. -1964.-53, 79-83.

67. Uphause R.A., Blake M.I., Katz J.J. Deuterium isotope effects in Nicotiana tabacum. //Can. J. Bot. -1975.- 53,2128-2133.

68. Dolnikowski G.G., Sun- Z., Grusak M.A., Peterson J.W., Booth S.L. HPLC and GC/MS determination of deuterated vitamin K (phylloquinone) in human serum after ingestion of deuteriumlabeled broccoli.//J. Nutr. Biochem. -2002.- 13(3), 168-174.

69. Putzbach K., Krucker M., Albert K., Grusak M.A., Tang G., Dolnikowski G.G. Structure determination of partially deuterated carotenoids from intrinsically labeled vegetables by HPLC-MS and 1H NMR. //J. Agric. Food. Chem. -2005.- 53(3), 671-677.

70. Lienau A., Glaser T., Tang G., Dolnikowski G.G., Grusak M.A., Albert K. Bioavailability of lutein in humans from intrinsically labeled vegetables determined by LC-APCI-MS. //J. Nutr. Biochem. -2003.-14(11), 663-70.

71. Mesnard F., Ratcliffe R.G. NMR analysis of plant nitrogen metabolism. //Photosynth. Res. -2005. 3(2), 163-80.

72. Osaki M., Shirai J., Shinano T., Tadano T. 15N-Allocation of 15NH4-N and 1SN03-N to nitrogenous compounds at the vegetative growth stage of potato plants. //Soil Sei. Plant Nutr. -1995.- 41, 699-708.

73. Dyckmans J., Flessa H., Influence of tree internal N status on uptake and translocation C and N in the beech: a dual 13C, 15N labelling approach. //Tree Physiol. -2001.- 21, 395-401.

74. Ippel J.H., Pouvrcau L., Kroef Т., Gruppen H., Versteeg G., van den Putten P., Struik P.C., van Mierlo, C.P.M. In vivo uniform 15N isotope labelling of plants: Using the greenhouse for structural proteomics. //Proteomics. -2004.- 4, 226-234.

75. Husemaim W., Barz W. Phototrophic growth and photosynthesis in cell suspension cultures of Chenopodium rubrum. //Physiol. Plant. -1977.- 40, 77-81.

76. Hall R.D., Brouwer I.D., Fitzgerald M.A. Plant metabolomics and its potential application for human nutrition. //Physiol Plant. -2008,- 132 (2), 162-175.

77. Усов А.И., Смирнова Г.П., Клочкова Н.Г. Полисахариды водорослей. 55. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки. //Биоорганическая химия. -2001.- 27(6), 444-468.

78. Shulaev V., Cortes D., Miller G., Mittler R. Metabolomics for plant stress response. //Physiol Plant. -2008,- 132(2), 199-208.

79. Holtkamp A.D., Kelly S., Ulber R., Lang S. Fucoidans and fiicoidanases-focus on techniques for molecular structure elucidation and modification of marine polysascharides. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2009.- 82, 1-11.13. Археи и бактерии.1. Введение

80. Условия выращивания фотосинтетических бактерий

81. После разделения было чётко видны три полосы: нижняя соответствующая СК1-РЦ,средняя — GK2 комплекс, и; верхняя, содержащая другие белки и свободные пигменты.

82. Рис 1.3.1 Спектр поглощения фотосинтетических мембранных комплексов, выделенных из биомассы Rps. acidophila. А) СК2 и Б) СК1-РЦ.

83. Рис. 1.3.2. ИК спектры биомассы В. methylicurrr. U-2H. (а) и природной (б). Обозначен сдвиг вибрационных полос С-Н в области 2800 см-1 в область 2260 см"' в результате С-2Н. Введение изотопной метки составило не мене 96% по 'Н.

84. Список литературы к Главе 1.3

85. Taylor M.W., Radax R., Steger D., Wagner M. Sponge-associated microorganisms: evolution, ecology, and biotechnological potential. //Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2007.- 71(2), 295-347.

86. Debbab A., Aly A.H., Lin W.H., Proksch P. Bioactive compounds from marine bacteria and fungi. // Microb. Biotechnol. -2010.- 3(5), 544-63.

87. Liebezeit G. Aquaculture of "non-food organisms" for natural substance production. //Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.- 2005.- 97, 1-28.

88. König G.M., Kehraus S., Seibert S.F., Abdel-Lateff A., Müller D. Natural products from marine organisms and their associated microbes. //Chembiochem. -2006,- 7(2), 229-38.

89. Foster J.A., Moore J. Microbiome studies: psb 2011 special session introduction. //Pac. Symp. Biocomput. -2011.- 118-20.

90. Hölzl G., Dörmann P. Structure and function of glycoglycerolipids in plants and bacteria. //Prog. Lipid Res. -2007,- 46(5), 225-43.

91. Kumar A.S., Mody K., Jha B. Bacterial exopolysaccharides- a perception. //J. Basic Microbiol. -2007.-47(2), 103-17.

92. Volkman J.K. Sterols in microorganisms. //Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003.- 60(5), 495-506.

93. Nichols D.S. Prokaryotes and the input of polyunsaturated fatty acids to the marine food web. //FEMS Microbiol. Lett. -2003.-219(1), 1-7.

94. Bremus C., Herrmann U., Bringer-Meyer S., Sahm H. The use of microorganisms in L-ascorbic acid production. //J. Biotechnol. -2006,- 124(1), 196-205.

95. Newmann D.J., Hill R.T. New drugs from marine microbes: the tide is turning. //J. Ind. Microbiol. Biotechnol. -2006,- 33, 539-544.

96. Dunlap W.C., Battershill C.N., Liptrot C.H., Cobb R.E., Bourne D.G., Jaspars M., Long P.F., Newman D J. Biomedicinals from the phytosymbionts of marine invertebrates: a molecular approach. //Methods. -2007,- 42(4), 358-76.

97. Bryant D.A., Frigaard N-U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. //Trends Microbiol. -2006.-14 (11), 488-496.

98. Chew A. G. M., Bryant D.A. Chlorophyll biosynthesis in bacteria: the origins of structural and fundamental diversity. //Annu. Rev. Microbiol. -2007.- 61, 113-129.

99. Woese C., Kandier O., Wheelis M. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1990.- 87 (12), 4576-9

100. Wang M., Yafremava L.S., Caetano-Anolles D., Mittenthal J.E., Caetano-Anolles G. Reductive evolution of architectural repertoires in proteomes and the birth of the tripartite world. //Genome Res. -2007.- 17(11), 1572-85.

101. Valentine D.L. Adaptations to energy stress dictate the ecology and evolution of the Archaea. // Nat. Rev. Microbiol. -2007.- 5 (4), 316-23.

102. DeLong E.F., Pacc N.RI Environmental diversity of bacteria and archaea. //Syst. Biol. -2001.- 50 (4), 470-8.

103. Karner M.B., DeLong E.F., Karl D.M . Archaeal dominance in the mesopelagic zone of the Pacific Ocean. //Nature. -2001.- 409 (6819), 507-10.

104. Schiraldi C., Giuliano M., De Rosa M. Perspectives on biotechnological applications of archaea.// Archaea. -2002.- 1(2), 75-86.

105. Breithaupt H. The hunt for living gold. The search for organisms in extreme environments yields useful enzymes for industry. //EMBO Rep. -2001.- 2 (11), 968-71.

106. Synowiecki J., Grzybowska В., Zdzieblo A. Sources, properties and suitability of new thermostable enzymes in food processing. //Crit. Rev. Food Sci. Nutr. -2006,- 46 (3), 197-205.

107. Egorova K., Antranikian G. Industrial relevance of thermophilic Archaea. //Curr. Opin. Microbiol. -2005.- 8 (6), 649-55.

108. Norris P.R, Burton N.P., Foulis N.A. Acidophiles in bioreactor mineral processing. //Extremophiles. -2000,- 4 (2), 71-6.

109. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Исследование физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде. // Биотехнология. -1999.- 4,21-31.

110. Диканская Э.М., Долгая М.Б., Калунянц Н.П., Родионова Г.С., Фишер П.Н., Кондратьева Е.Н., Нетрусов А.И., Ивановский Р.Н. Штам облигатно метилотрофной бактерии Methylobacillus Methylophillus BCB-792.SU 989867. 3.12.80.

111. Skladnev D.A., Egorova T.A. Isotopically labelled bacteriorhodopsin for computers. 7th bitrernational Conference on Retinal Proteins. Zichron Yaacov. Israel. -1996,- 55.

112. Егорова-Зачернюк Т. А., Складнее Д.А., Швец, В.И. Биотехнологическое получение униформно дейтерированных пурпурных мембран галобактерий для нанобиотехнологии. //Биотехнология. -2008.- 6, 60-72.

113. Crespi H.L. The isolation of deuterated bacteriorhodopsin from fully deuterated Halobacterium halobium. //Method. Enzymol. 1982, 88(1), 3-12.

114. Katz J.J., Crespi H.L. Deuterated organisms: cultivation and uses. //Science. 1966, 151(715), 1187-94.

115. Grishko V.L., Duley W.W. Infrared absorption spectra of deuterated amorphous carbon. //Astrophys. J. -2003.- 583, 43-45.

116. Gazi E., Garder P., Lockey N.P., Hart C.A., Brown M.D., Clarke N.W. Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy. //J. Lipid Res. -2007.-48(8), 1846-1856.

117. Дрожжевые экстракты как компоненты питательных сред Введение

118. Культивирование дрожжей в колбах

119. Культивирование дрожжей в биореакторе

120. Мечение стабильными изотопами

121. Рис. 1.4.1. ИК спектры биомассы Н. ро1утогрИа: и-15М. (а), [и-'3С, 15Ы] (б) и природной (в). Коррекция базовой линии выполнена при 1950 см"'. Введение изотопной метки составило не менее 98% по |5Ы и 99% по '3С.

122. Автолизаты как компоненты питательных сред

123. Процесс в колбах и биореакторе

124. Оптимизация получения дрожжевой биомассы

Информация о работе

Егорова, Татьяна Анатольевна
доктора химических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение и биофизическое исследование меченных стабильными изотопами метаболитов и мембранных белков: методологии и перспективы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы