Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование пространственной структуры хромосом методом тритиевой планиграфии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование пространственной структуры хромосом методом тритиевой планиграфии"

Г* ^

г I

3 0,1

На правах рукописи

г • I - I!

I и КИМ МЩРЕЯ АЛЕКСЕЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ХРОМОСОМ МЕТОДОМ ТРИТИЕВОИ ПЛАНИГРАШИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1996

Работа выполнена в Институте ядерной физики АН РУз и в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

Н.Д.Беляев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Е.И.Каракин кандидат химических наук, Н.Д.Кобец

Ведущая организация - Институт молекулярной биологии РАН

имени В.А.Энгельгардта

Защита состоится 1 ддб г.

заседании диссертационного совета К 003.52.01 в институте биоорганической химии СО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан

-яг- 1996 Г.

а{£

в —/ часов на Новосибирском

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность проблемы. Несмотря на интенсивные исследования структуры хромосом, изучение их морфологии с помощью электронной микроскопии, определание белкового состава хромосом, структурной организации их остова - скэффолда, митотического аппарата, топография хромосомных белков остается малоизученной. При этом определение наружных белков оставалось практически не изученным. Также слабо изученным является вопрос о взаимодействии белков в составе хромосом клеточными ферментами - протеинкиназами и фосфатазами. Поэтому применение нового метода в исследовании структуры хромосом - метода тритиевой планиграфии, позволяющего детектировать компоненты наружной поверхности, расположенные в слое толщиной 3-5 Кис разрешением около 1 8, представляется весьма перспективным. При этом исследование поверхности этим методом возможно только для выделенных и очищенных метафазных хромосом. Исследование поверхности метафазных хромосом также представляется весьма актуальным в связи с широким применением выделенных хромосом в модельных исследованиях в системах in vitro.

цель работы, целью настоящей работы явилось исследование наружной поверхности метафазных хромосом, выделенных различными методами, определение белков, локализованных на их поверхности, исследование наружных белков конденсированных и ЭДТА-деконденсированных хромосом, а также исследование наружных фосфобепков конденсированных и ЭДТА-деконденсированных хромосом и определение их взаимодействия с казе-инкиназой 2 и щелочной фосфатаэой.

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые применен метод тритиевой планиграфии в исследованиях хромосом. Исследованы возможности применения этого метода дпя получения хромосом, меченных по поверхности без нарушения морфологической структуры и с сохраненной протеинкинаэной активностью.

Обнаружено, что белки фракции скэффолда составляют наружную поверхность полиаминных и Са-хромосом, как в конденсированном, так и в ЭДТА-деконденсированном состояниях. Идентифицированы полипептиды, лежащие на поверхности хромосом, в том числе и фосфополипептиды. Показано взаимодействие наружных фосфополипептидов с казеинкиназой 2 и щелочной фосфатазой.

Настоящая работа дополняет и уточняет современные представления о структуре хромосом и скэффолда хромосом в частности. Показана возможность получения хромосом с меченными наружными белками для дальнейшего использования их в исследованиях in vitro для определения

взаимодействия структурированных хромосомных белков с растворимыми цитоплазматическими ферментами - фосфатазами и киназами.

объем и структура работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 17 рисунков и 1 таблицу, список использованной литературы (210 ссылок). Работа состоит из следующих разделов: Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение, Выводы, Список литературы.

публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ. Из них - 3 статьи, 3 - тезисы докладов. Результаты исследований были доложены на Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), на III Всесоюзном совещании "Физиологически активные вещества, меченные радиоактивными и стабильными изотопами" (Звенигород, 1991) и на Французско-Российском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (Новосибирск, 1995).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Метод тритиевой планиграфии основан на реакции замещения водорода органических молекул термически активированным тритием. При этом глубина проникновения реакционно-способных атомов трития в конденсированной фазе не превышает 3-5 X. Такое равномерное, неселективное мечение позволяет детектировать все молекулы сложных надмолекулярных структур, локализованных на наружной поверхности.

Электронная микроскопия меченных тритием хромосом.

■поскольку перед проведением процедуры тритиевого мечения хромосомы' подвергаются лиофилизации, что может приводить к нарушению целостности структуры, то необходим контроль нативности структуры. Электроннной микроскопией было показано, что морфологическая струк-

1П К!

н т

Рис.1. I. Электронная микроскопия выделенных метафазных полиаминных хромосом. 11 .Электронная микроскопия выделенных метафазных Са-хромосом. А - до мечения, Б - после мечения тритием.

тура полиаминных (выделенных в присутствии полиаминов) и Са-хромосом

2 +

(выделенных 8 присутствии Са ) после лиофилиэации и мечения не меняется (рис.1, I и II). В меченных тритием хромосомах не наблюдалось разрушений и деконденсации структуры. Этот тест на структурную на-тивность не может исключить не регистрируемые электронной микроскопией более тонкие нарушения при приготовлении образца, однако взаимное расположение макромолекулярных элементов хромосом, по-видимому, не меняется.

Анализ меченных тритием белков полиаминных хромосом.

Были исследованы наружные белки полиаминных хромосом, очищенных центрифугированием через 0,3 М и 1,5 И сахарозу. Анализ наружных белков полиаминных хромосом показал наличие двух фракций экспонированных белков - слабо связанных с хромосомами белков и белков фракции скэффолда.

Было обнаружено, что все меченные тритием белки полиаминных хромосом, очищенных центрифугированием через 0,3 М сахарозу, снимаются с хромосом и остаются в супернатанте при регидратации и последующей промывке лолиаминным буфером. 8 супернатанте обнаружено более десяти меченных тритием полипептидов, с мажорным полипептидом 45 кДа (рис.2, указано стрелками).

Рис.2. ЗОБ-электрофорез в 12,5Х гепе меченных тритием белков полиаминных хромосом, очищенных центрифугированием через 0,3 М сахарозу (флюорограм-ма блоттинга). Дор.1 - Суммарные хромосомные белки; дор.2 - сулернатант с меченных полиаминных хромосом.

В полиаминных хромосомах, очищенных через 1,5 М сахарозу, также обнаружена фракция слабо связанных меченных тритием полипептидов, которая снимается с хромосом при регидратации и промывке. В супернатанте было обнаружено(рис.3, дор.1) около десятка полипептидов с мажорным полипептидом 45 кДа. Во фракции белков, экстрагируемых нук-леазным гидролизом и 2 М №01- 10 шМ ЭДТА, меченные тритием полипептиды отсутствовали (рис.3, дор.2). Во фракции скэффолда обнаружено более десятка меченных тритием полипептидов с мажорными полосами 34 кДа и 29 кДа (рис.3, дор.З). Во фракции скэффолда полипептид с мол. массой 45 кДа практически отсутствует (рис. 3, дор.З). При этом восемь меченных тритием полипептидов в супернатанте и во фракции скэф-

5

фолда совпадают по мол. массам (рис.3, дор.1 и дор.З - указано треугольниками)- это может быть обусловлено либо тем, что это одни и те же бепки с разной степенью ассоциированности с хромосомами, либо тем, что это разные белки с одинаковыми мол. весами. Было обнаружено, что экстракция белков с помощью дииодсалицилата лития (LIS) удаляет меченный тритием полипептид 34 кДа из фракции скэффолда.

Рис.3. SDS- электрофорез в 12,5а; геле

А Ь *

меченных тритием белков полиаминных хромосом, очищенных центрифугированием череа 1,5 М сахарозу. А - Флюорограмма блоттинга. Дор.1 -супернатант с меченных полиаминных хромосом; дор.2 - фракция белков, экстрагированных 2 М NaCl-10 mM ЭДТА и нуклеазным гидролизом; дор.З -фракция скэффолда. Б - флюорограмма с того же блоттинга с большим временем экспозиции.

Не было обнаружено меченных тритием полипептидов с мол. массой более 100 кДа. Меченный тритием полипептид 45 кДа (вероятно, актин) удаляется при регидратации лиофилизированных хромосом. 8 полиаминных хромосомах этот полипептид, очевидно, весь расположен на поверхности и снимается при регидратации лиофилизированных хромосом. Поскольку реакция мечения термически активированным тритием происходит только в тонком слое толщиной не более 3-5 )?, то мы можем предположить, что 45 кДа полипептид более или менее равномерно покрывает поверхность выделенных полиаминных хромосом.

Анализ меченных тритием конденсированных Са-хромосом.

Поскольку бепки наружной поверхности полиаминных хромосом сипь-но экранированы слабо связанной фракцией белков, что не позволяет полностью исследовать белки хромосом, то для дальнейших исследований использовались Са-хромосомы. Эти хромосомы имеют еще и дополнительное преимущество в том, что хорошо изучена их деконденсация с помощью ЭДТА.

При фракционировании меченных хромосом нами было обнаружено, что тритий присутствует во всех анализируемых фракция (табл.1).

В Са-хромосомах не удалось обнаружить меченных тритием полипептидов, снимающихся регидратацией с промывкой меченных хромосом, как в случае с полиаминными хромосомами. Весь спектр меченных полипептидов оставался связанным с хромосомами после промывки.

6

Таблица 1. Распределение радиоактивности во фракциях хромосом, фракция Удельная активность

(имп/мин на мкг)

Фракция белков, экстрагируемых 0,3 М NaCl 785

Фракция белков, экстрагируемых 2М NaCl 13Э7

Фракция белков скэффолда, не экстрагируемых 2М NaC1 5480

ДНК 1399

Электрофоретический анализ меченных тритием Са-хромосом, очищенных через 0,3 М сахарозу, показал следующее распределение трития в белках (рис.4):во фракции белков, экстрагируемых нуклеазным гидролизом и 2М МаС1-10 мМ ЭДТА (дор.З), обнаружено 5 меченных полипептидов - 76, 74, 45, 34 и 28 кДа, эта фракция содержит негистоновые белки и гистоны, но среди экспонированных белков не обнаружено гис-тонов Н2В, Н2А, НЗ и Н4. В суммарной фракции белков хромосом (дор.2), как и во фракции белков скэффолда (дор.4) обнаружено более 10 меченных тритием полипептидов. Также как и в полиаминных хромосомах, не обнаружено меченных тритием полипептидов с мол. массой более 100 кДа.

Поскольку белки скэффолда определяются только по процедуре выделения, то необходимо иметь уверенность, что препарат хромосом, используемый в эксперименте, не содержит белковых примесей, которые могут интерферировать с собственно хромосомными белками. Мы сравнили спектры белков меченных тритием хромосом, очищенных через 0,3 М и 1,5 М сахарозу. Было обнаружено, что спектры белков практически одинаковы, за исключением нескольких низкомолекулярных полипептидов (рис.5). Эти полипептиды могли быть потеряны при разделении в 12,5 % ПААГ за счет их движения с фронтом электрофореза. Эти низкомолекулярные полипептиды остаются во фракции скэффолда, следовательно, не могут быть отнесены к гистонам и НМЗ-белкам. Таким образом, используемый препарат хромосом не содержит примесных цитоплазматических и мембранных белков, связанных с хромосомами гидрофобными взаимодействиями или, опосредованно, поливалентными катионами.

Для проверки равномерности мечения тритием всех белков хромосом были помечены суммарные снятые белки хромосом. Было обнаружено, что меченные тритием белки хромосом имеют примерно равную удельную активность при их равной экспонированности. Эти данные подтверждают вывод о том, что белки, метящиеся тритием в составе хромосом, лока-лизойаны на наружной поверхности хромосом. Было обнаружено, что при переносе белков, меченных тритием, из геля на мембрану не происходит потерь высокомолекулярных (более 100 кДа) и низкомолекулярных поли-

7

пептидов. При этом может сохраняться небольшая вариабельность результатов, вносимая процедурой блоттинга.

67 i f

57*. 67

SS — S7

22 45

2{

4Í-—Í

Рис.4. SDS- электрофорез в 12,5* геле меченных тритием белков Са-хромосом, очищенных через 0,3 М сахарозу, с последующим блоттингом и флюорографией. Дор.1 - суммарная фракция белков хромосом(окраска Кумасси BBR-250); дор.2 - суммарная фракция белков хромосом(флюоро-грамма); дор.З - фракция белков, экстрагируемых 2 М NaCl -10 мМ ЭДТА и нуклеазным гидролизом (флюорограмма); дор.4 - фракция белков скэффолда (флюорограмма).

Поскольку при мечении тритием хромосом возможно образование радикальных форм и образование ковалентных связей между белками и ДНК, то для проверки возможности таких радикальных реакций из меченных хромосом выделяли ДНК, подвергали ее нуклеазному гидролизу и наличие белков во фракции ДНК анализировали эпектрофорезом. Белки обнаружены не были, следовательно, вероятность реакции, обеспечивающей ковалентные сшивки, очень мала.

Так же как и в полиаминных хромосомах, в Са-хромосомах не было найдено меченных тритием полилелтидов с мол. массой более 100 кДа. В Са-хромосомах полипептид 45 кДа также является мажорным по тритию, но он остается связанным со скэффолдсм. Исходя из этих данных можно предположить, что негистоновый хромосомный полипептид 45 кДа локализован на поверхности полиаминных и Са хромосом, но степень его связанности с хромосомами различна. Также было обнаружено, что полипептид с мол. массой 57 кДа, обнаруживаемый мажорной полосой по окраске Кумасси в конденсированных хромосомах, не включает тритий и, следовательно, полностью экранирован (Рис.4, дор.1 и 2, показано треугольником).

Исходя из этого, мы можем утверждать, что белки фракции скэффолда локализованы на поверхности полиаминных и Са-хромосом. Но при этом количественный и качественный состав поверхностных белков варь-

S

ирует в зависимости от метода выделения хромосом. Белки, экстрагируемые 2 М ЫаС7-10 мМ ЭДТА и нуклеазным гидролизом, в незначительной мере экспонированы на поверхности Са-хромосом, в полиаминных хромосомах эти белки практически не экспонированы на поверхности.

Рис.5. вОЭ- электрофорез в градиентном 6-25* геле меченных тритием белков Са-хромосом, очищенных через 1,5 М сахарозу. А - Окраска Ку-масси. Б - Флюорограмма блоттиига. М- маркеры; Дор.1 - супернатант с меченных Са-хромосом; дор.2 - суммарные хромосомные белки; дор.3 -фракция белков скэффолда; дор.4 - фракция белков, экстрагируемых 2 М N801 - 10 мМ ЭДТА и нуклеазным гидролизом.

Белки меченных тритием ЗЩА-дбконщжировшш. Са-хромосом.

Чтобы проверить, формируют ли наружные белки скэффолда только

наружный чехол метафазных хромосом, хромосомы обрабатывали 5мМ ЭДТА.

2 +

Удаление Са ,как известно, приводит к деконденсации хромосом до хроматиноподобных фибрилл и освобождению части белков. Деконденсиро-ванные таким образом хромосомы также метили термически активированным тритием и анализировали электрофорезом. Оказалось, что фракция белков, экстрагируемых 2 М МаС1-10 мМ ЭДТА содержит гораздо меньше радиоактивности, чем фракция белков скэффолда. Было обнаружено (рис.6, дор. 2), что набор меченных тритием полипептидов в солеэкс-трагируемой фракции почти идентичен (за исключением минорной полосы 74 кДа) набору меченных полипептидов аналогичной фракции конденсированных хромосом. В суммарной фракции белков деконденсированных хромосом (рис.6, дор. 1), также как и во фракции белков скэффолда (рис.6, дор. 3), обнаружено более 10 меченных полипептидов.

При сопоставлении спектров меченных полипептидов конденсированных и деконденсированных хромосом мы обнаружили, что меченные тритием полипептиды конденсированных хромосом( по крайней мере, мажорные

9

полосы) могут быть обнаружены в спектре меченных тритием полипептидов деконденсированных хромосом. При этом степень включения трития в белки ( а, следовательно, степень экспонированности) в этих двух спектрах несколько различается (рис.6,дор.1; рис.4,дор.2 - указано стрелками). Наиболее интенсивно меченными в деконденсированных хромосомах оказались полипептиды в регионе 45-55 кДа (Рис.6, дор 1). Эти полипептиды, очевидно, становятся более экспонированными при деконденсации.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что некоторые из белков, относящихся к белкам скэффолда, лежат на наружной поверхности как конденсированных, так и деконденсированных хромосом.

Поскольку в деконденсированных хромосомах наружная поверхность представлена хроматиноподобными фибриллами, а наиболее экспонированными оказываются белки скэффолда, вероятнее всего, экспонированные белки скэффолда формируют наружную поверхность хроматиноподобных фибрилл деконденсированных хромосом. Исходя из того, что в конденсированных хромосомах также наблюдается максимум включения трития в белки скэффолда (следовательно, максимум экспонированности), и при этом набор меченных тритием полипептидов конденсированных хромосом во многом сходен по мол. массам с набором меченных тритием полипеп-тидое деконденсированных хромосом, можно предположить, с некоторой осторожностью, что наружная поверхность конденсированных хромосом, сформированная скэффолдом, представляет собой не наружный чехол, а поверхность хроматиноподобных фибрилл, из которых формируются хромосомы .

Изложенные выше результаты позволяют предположить, что понятие скэффолд носит не только операционный характер, но является структурой, сохраняющей высокий уровень структурной организации после экстракции высокими концентрациями солей и нуклеазного гидролиза, т.е., тесно связанной с ДНК, а также формирующей наружную поверхность как

Рис.6. SDS-электрофорез в 12,Ей геле меченных тритием белков ЭДТА-деконденсиро-ванных Са-хромосом. Флюорограыма блот-

тинга. Дор.1 - суммарная фракция хромосом; дор.2 - фракция белков, экстрагируемых 2 М МаС1-10 мМ ЭДТА и нуклеазным

гидролизом; дор.З - Фракция белков скэффолда.

конденсированных, так и декондеисировг-пых хромосом. Следовательно, скэффолд хромосом представляет собой «обильную наружную структуру хроматиноподобных фибрилл как в конде- :ированном, так и в деконден-сированном состоянии.

фосфорилирование меченных тритием хроматина. конденсированных и щ'а-деконденсированкнх са-хромосомт

Метод мечения термически активирсганным тритием включает в себя 3 процедуры, способные повреждать хромг~ин и хромосомы - лиофилиза-цию, световое облучение и само включе--'е трития. Поэтому было исследовано влияние этих факторов на прс" «инкинаэную активность хрома-

32

тина. Контролем служил спектр 'р-ме^-шых полипептидов хроматина,

фосфорилированного в системе in- vitro рис.7, дор.З). При этом нами

32

было обнаружено, что спектр Р-меченн* - полипептидов меченного тритием хроматина и хроматина лиофилизирс,данного со световым облучением, но без включения трития, лрактичес* идентичны (рис.7, дор.1,2), следовательно, мы можем сделать вывод том, что само включение трития не нарушает протеинкиназной активности. В сравнении с контролем в этих спектрах исчезает 4 минорные п'-.юсы - 46, 51, 54 и 58 кДа.

Рис.7. SDS-электрофорез в 12,5% геле

•э р

Р-ме-гнных белков хроматина. А -окраска Кумасси BBR-250; Б - автограф с "еля.м - маркеры; дор.1 -фосфора жирование лиофилизированного со све'звым облучением хроматина; дор.2 - фосфорилирование меченного тритие» хроматина;дор.3 - контроль -фосфорилирование хроматина.Стрелками указан^ фосфополипептиды, исчезающие после гиофилизации.

вывод о том, что лиофилиэация наруша-хроматина, но эти нарушения не очень значительны по сравнению с общей кинаэиой активностью.

Поскольку в выделенных и очищенны/ хромосомах и хроматине про-теинкиназы и их субстраты должны находиться в структурированном состоянии, то нарушение их активности может происходить либо вследствие инактивации протеинкиназ, либо вследствие нарушения структуры. Следовательно, оценка протеинкиназной акткености может служить косвенным тестом на сохранение нативности структуры.

Использование тритиевого мечения в сочетании с фосфорилировани-ем хромосомных белков в системе in vitro позволило нам обнаружить 9 фосфополипептидов, меченных тритием и " Р, что свидетельствует об их

£25 32S

§2 ez

*г 'Г L. ss

гг F ~ !Z

Таким образом мы можем сделать ет протеинкиназную активность

н I г з

наружной локализации на поверхности выделенных метафазных конденсированных хромосом. Эти полипелтиды имеют следующий мол. вес, определенный по данным электрофореза - 14, 28, 35, 45, 52, 57, 67, 84 и 87

кДа. 8 ЭДТА-деконденсированных хромосомах мы обнаружили 10 фосфопо-

32

липептидов, меченных тритием и Р - 14, 28, 29, 35, 45, 57, 67, 68, 84 и 87 кДа. За исключением полипептидов 29, 52 и 68 кДА спектры наружных фосфобелков конденсированных и ЭДТА-деконденсированных хромосом совпадают. Поскольку ранее было показано, что меченные тритием полипептиды в основном относятся к белкам скэффолда как конденсированных, так и ЭДТА-деконденсированных хромосом, то мы можем также отнести большинство из этих наружных фосфополипептидов к белкам фракции скэффолда.

л б в

1*

32

Рис.8. вОЗ-электрофорез в 12,5« геле Р-меченных белков конденсированных Са-хромосом. А - автограф с геля; Б - флюорограмма блоттинга.

32

В - флюорограмма блоттинга после полного распада Р. Дор.1 - меченные тритием хромосомы; дор.2 - фосфорилирование меченных тритием хромосом; дор.З - фосфорилирование хромосом.

32

Треугольник - фосфополипептид с уменьшенным включением Р после

32

мечения тритием. Стрелки - полипептиды, меченные тритием и Р.

32

Также было обнаружено, что наборы Р-меченных полипептидов конденсированных Са-хромосом до и после тритиевого мечения практически одинаковы (рис.8А, дор.2,3; рис.ЭБ дор. 2,3). После мечения

32

тритием наблюдается меньшее включение Р в минорный фосфополипептид

68 кДа (немеченный тритием). Уменьшение активности составляет около

1% от суммарной активности. При фосфорилировании меченных тритием

деконденсированных хромосом также было обнаружено, что наборы 3 2

Р-меченных полипептидов до и после мечения одинаковы (рис.ЮБ, дор.2,3), за исключением минорного фосфополипептида 48 кДа (немечен-ного тритием), который исчезает после мечения тритием. Поскольку исчезает фосфорилирование в минорных белках, немеченных тритием, то,

вероятнее всего, нарушения происходят вследствие лиофилизации, а не самого включения трития. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что после мечения тритием конденсированных и ЭДТА-деконденсированных хромосом в целом сохраняется протеинкиназная активность .

ь 6

¡2 ■я У — 2

£2 Ж* tí

££ р 2

Ир—»*«

32

Рис.9. ЗОЗ-электрофорез в градиентном 6-25% геле Р-меченных белков конденсированных Са-хромосом. А-окраска Кумасси; Б - автограф с геля; В - флюорограмма блоттинга. М - маркеры. Дор.1 - меченные тритием хромосомы; дор.2 - фосфорилирование меченных тритием хромосом;

дор.З - фосфорилирование хромосом. Треугольник - фосфополипептид с 32

уменьшенным включением Р после мечения тритием. Стрелки - полипеп-

32-

тиды, меченные тритием и Р.

По литературным данным известно, что in vivo происходит интенсивное взаимодействие между структурированными хромосомными белками и растворимыми ферментами и субстратами. Нам кажется вполне вероятным, что обнаруженные нами 9 наружных фосфополипептидов конденсированных хромосом являются наиболее вероятными претендентами на взаимодействие с растворимыми протеинкиназами и фосфопротеинфосфатаза-ми. При этом наружные фосфополипелтиды хромосом должны участвовать в процессах, регулируемых фосфорилированием и дефосфорилированием белков.

Таким образом, изложенные выше результаты показывают, что мече-ние хромосом термически активированным тритием не нарушает их морфологической целостности, при этом процедура мечения практически не нарушает нативности протеинкиназ в составе хромосом, что является косвенным свидетельством сохранения целостности структуры хромосом.

Результаты нашего исследования показывают возможность применения тритиевой планиграфии для получения хромосом, меченных тритием по поверхности с неизмененной морфологической структурой и протеин-

13

киназной активностью. Меченные таким образом хромосомы могут найти широкое применение в модельных системах in vitro для изучения участия белков поверхности хромосом в постмитотических событиях.

ъ i

! » а . «lis

Т.

w Г-

32

Рис.10. SDS-электрофорез в градиентном 6-25% геле Р-меченных белков ЭДТА-деконденсированных Са-хромосом. А- окраска Кумасси; Б -

32

автограф геля, В - флюорограмма блоттинга после полного распада Р. Дор.1 - меченные тритием хромосомы; дор.2 - фосфорилирование меченных тритием хромосом; дор.З - фосфорипирование хромосом. Треугольник

32

- фосфополипептид с уменьшенным включением Р после мечения трити-

32

ем. Стрелки - полипептиды, меченные тритием и Р.

Фосфорилирование конденсированнных Са-хромосом казеинкиназой 2.

Для того, чтобы проверить доступность фосфобелков Са-хромосом

для экзогенной протеинкиназы, было использовано фосфорилирование

Са-хромосом иммобилизованной казеинкиназой 2 из печени кролика. Было

32

обнаружено, что спектры Р-меченных полипептидов хромосом и хромосом с казеинкиназой 2 в растворе практически одинаковы по набору пептидов и по интенсивности включения фосфора. В случае с иммобилизованной казеинкиназой мы обнаружили тот же набор фосфополипептидов,

32

но при этом наблюдались различия по интенсивности включения Р в

32

полипептиды. Во фракции скэффолда наблюдалось большее включение Р

в полипептиды 57, 43, 37 и 20-28 кДа. В то же время в солеэкстраги-

32

руемой фракции наблюдалось несколько меньшее включение Р в белки.

Идентичность спектров фосфобелков в контроле и при добавлении в реакционную смесь раствора казеинкиназы 2 может быть обусловлена тем, что фосфобелки хромосом могут быть конформационно не доступны для казеинкиназы 2, поскольку по литературным данным известно, что очищенная казеинкиназа 2 может аггрегировать и образовывать фила-ментные структуры при низкой концентрации ЫаС1.

а ь

32

Рис. 11. SDS-электрофорез в 12,556 геле Р-белков конденсированных Са-хромосом, фосфорилированных каэеинкиназой 2. Автограф геля. Дор.1,3 - фракция скэффолда; дор.2,4 - фракция белков, экстрагируемых 2 М NaCI- 10 мМ ЭДТА и нуклеазным гидролизом, дор.1,2 - фосфорилирование хромосом в системе in vitro (контроль); дор.3,4 - фосфорилирование хромосом в той же системе с иммобилизованной казеинкинаэой 2.

Фосфорилирование полипептидов фракции скэффолда с мол. массой 57, 43 и 37 кДа подтверждает полученные ранее результаты об экспони-рованности белков фракции скэффолда на наружной поверхности хромосом.

Фосфорилирование полипептидов с мол весом 28 кДа и ниже - гис-тонов во фракции скэффолда -подтверждает литературные данные о том, что фракция скэффолда содержит весь набор гистонов после экстракции 2М NaCI и нуклеазного гидролиза. Очевидно, эти скэффолд-прикрепленные гистоны экспонированы на поверхности, что подтверждается тритиевым мечением, и доступны для казеинкиназы 2, хорошо их фосфорилирующей.

Дефосфоридироваше конденсированных Са-хромосом щелочной

Ф0СФАТА30ЙТ

Была исследована доступность фосфобелков метафазных хромосом,

выделенных из меланосаркомы L41 для щелочной фосфатазы из кишечника

теленка. Хромосомы фосфорилировали в системе in vitro в присутствии 32

[у - Р]АТФ. Фосфорилированные хромосомы дефосфорилировали щелочной фосфатазой в растворе и щелочной фосфатазой, иммобилизованной на нитроцеллюлозе. Было обнаружено, что щелочная фосфатаза в растворе дефосфорилирует практически весь спектр фосфобелков, за исключением гистонов. При применении иммобилизованной щелочной фосфатазы эффект

15

дефосфорилирования также наблюдался, но в меньшей степени. Эти данные показывают, что часть фосфобелков метафазных хромосом, фосфори-лируемых в системе in vitro, локализована на поверхности хромосом.

Дефосфорилирование иммобилизованной щелочной фосфатазой является вторым независимым методом идентификации фосфобелков, локализованных на наружной поверхности конденсированных хромосом. Результаты дефосфорилирования полностью подтверждают результаты, полученные с помощью тритиевой планиграфии и фосфорилированид иммобилизованной казеинкиназой 2. Некоторые различия вполне естественно объясняются различиями между лиофилизированной и гидратированной структурой хромосом, конформационными различиями и субстратной специфичностью ка-зеинкиназы 2 и щелочной фосфатазы.

Рис. 12. SDS-электрофорез в 12,5% ге-д б ле дефосфорилированных Са- хромосом.

А - автограф геля; Б - автограф с удвоенным временем экспозиции. Дор.1 - хромосомы, фосфорилированные in

А _ „

~ *» vitro; дор.2 - фосфорилированные

хромосомы, дефосфорилмрованные щелоч-* ~ ной фосфатазой а растворе; дор.З -

g g _ фосфорилированные хромосомы, дефосфо-

рилированные иммобилизованной щелочной фосфатазой. Стрелками указаны полипептиды, не дефосфорилируемые фосфатазой.

Идентификация белков.

Поскольку было обнаружено, что тритий включается в полипептиды с мол. массой менее 100 кДа как в попиаминных, так и в Са-хромосомах в конденсированном и ЭДТА-деконденсированном состояниях, то можно уверенно исключить из числа наружных белков хромосом мономерные белки с мол. массой более 100 кДа.Наиболее изученным белком скэффолда является топоизомераза II с мол. массой 170 кДа. Вероятнее всего, этот белок экранирован и не находится на поверхности хромосом. Этот результат подтверждает литературные данные о том,что в конденсированных хромосомах топоизомераза II практически недоступна для антител.

Проблема загрязнения выделенных хромосом цитоплазматическими белками подробно обсуждалась в литературе. Lewis и Laetnml i было показано, что хромосомы содержат цитоскелетные белки, при этом основными загрязняющими белками являются актин /45 кДа/ и белки промежу-

16

точных филаментов: виментин /57кДа/ и прекератин /52 кДа/, Поскольку среди меченных тритием полилептидов как конденсированных, так и де-конденсированных хромосом наблюдаются полипептиды с теми же мол. массами, а полипептид 45 кДа является мажорным по тритию, то можно предположить, что они являются цитоскелетными белками, экспонированными на поверхности хромосом. При этом необходимо обратить внимание на то, что эти попипептиды относятся к фракции белков скэффолда и остаются связанными со скэффолдом как в конденсированных., так и в ЭДТА-деконденсированных хромосомах. Остальные меченные тритием полипептиды можно отнести к собственно белкам хромосом.

Несмотря на то, что было обнаружено, что гистоны (экстрагируемые 2М NaCl ) практически не экспонированы на поверхности хромосом (за исключением лолипептида 28 кДа - предположительно гистон Н1), нельзя полностью исключить возможности экспонированности гистонов в составе скэффолда как полиаминных, так и Са-хромосом, поскольку в литературе описано существование в хромосомах сильно связанной фракции гистонов, не экстрагируемых 2М NaC1.

Поскольку часть белков, локализованных на поверхности Са-хромосом, является фосфобелками, то этот факт несколько облегчает идентификацию этих белков. Применение тритиевой планиграфии представляется перспективным для дальнейшей идентификации наружных белков хромосом с помощью иммунохимических методов, а также определения белков, окружающих наружные белки с помощью методов сшивки белков. Несмотря на то, что полная идентификация не входила в задачу данной работы, мы можем соотнести наши данные с белками, описанными в литературе.

Поскольку в литературе описана миграция негиотоновых хромосомных белков из хромосом после митоза и, наоборот, миграция белков ядерного матрикса, ядерных белков и хроматиновых белков в состав конденсированных хромосом, то нельзя исключить вероятности присутствия этих белков на поверхности конденсированных хромосом.

По литературным данным известны полипептиды - антигены кинето-хора. Один из этих антигенов, 18 кДа полипептид, экстрагируется вместе с гистонами и ДНК после обработки гепарином и нуклеазного гидролиза. Другой антиген, полипептид 80 кДа, остается связанным с хромосомным скэффолдом даже после обработки 2М мочевиной. Попипептиды кинетохора 14, 20, 23 и 34 кДа могут быть отвественными за связывание микротрубочек. Белки кинетохора 77 кДа и 110 кДа присутствуют в выделенных хромосомах и негистоновых скэффолдах. Поскольку идентификация белков кинетохора проводилась с помощью антител, то мы можем предположить с большой вероятностью, что белки кинетохора, принадлежащие к фракции скэффолда и доступные для антител, могут быть среди

17

меченных тритием полипептидов.

Сохранение протеинкинаэной активности хромосом после мечения термически активированным тритием позволяет сделать предположение о возможности получения хромосом, меченных тритием по поверхности, с неизмененными другими ферментативными активностями, например, ферментами, вовлеченными в метаболизм ДНК и РНК, которые были обнаружены во фракциях ядерного матрикеа {альфа и бета ДНК-полимеразы, топо-изомераэы 1 и 2, РНК-полимераза 2, поли(А)-полимераза, ДНК-метилаза и ДНК-праймаза). Не исключено, что часть этих ферментов может быть локализована также в скэффопде метафаэных хромосом. Применение меченных тритием по поверхности хромосом в модельных системах открывает уникальную возможность изучать локализацию ферментов хромосом на их поверхности и взаимодействие ферментов хромосом с цитоплазмати-ческими субстратами.

Функциональная роль белков наружной поверхности мета фазных хромосом.

В ряде работ показано, что хроматин и метафазные хромосомы инициируют сборку ядерной оболочки в бесклеточной системе in vitro, при этом наружная поверхность хромосом может быть ответственна за инициацию образования ядерной оболочки. Было показано, что ламины А и С ассоциируют с поверхностью метафазных хромосом и что сборка ламины ускоряется с помощью хромосом. Также было показано, что липосомы вызывают деконденсацию конденсированных хромосом. При этом было показано, что в липосомы переходит негистоновый хромосомный белок 33 кДа, который может вызывать слияние хромосом. В ряде работ было показано, что конденсированные и ЭДТА-деконденсированные хромосомы вызывают in vitro слияние фосфолипидных липосом и что везикулы мито-тических экстрактов могут взаимодействовать с хроматином и образовывать ядерную оболочку.

Таким образом было показано, что поверхность метафазных хромосом является наиболее активной зоной взаимодействия хромосом с цито-плазматическими компонентами в течение сложных многоступенчатых постмитотических процессов.

Исходя из результатов нашей работы мы можем предположить, что белки фракции скэффолда, формирующие поверхность метафазных хромосом, могут принимать активное участие в вышеперечисленных процессах и также активно взаимодействовать с растворимыми цитоплазматическими компонентами.

выводы

1. Впервые было показано, что процедура мечения термически активированным тритием не нарушает морфологической целостности и протеиики-назной активности конденсированных метафазных хромосом, выделенных двумя различными методами. Таким образом, метод тритиевой планигра-фии является перспективным в исследовании структуры хромосом и позволяет получать хромосомы, меченные тритием по поверхности, с неизмененной ферментативной (протеинкиназной) активностью.

2. Впервые был исследован весь спектр белков, локализованных на наружной поверхности метафазных хромосом и было обнаружено, что в хромосомах, выделенных двумя методами, белки фракции скэффолда являются основными белками, экспонированными на поверхности хромосом. Фракция гистонов в значительно меньшей степени экспонирована на поверхности хромосом.

3. были исследованы спектры наружных белков конденсированных и ЭДТА-деконденсированных Са-хромосом. Было обнаружено, что в обоих спектрах 9 наружных полипептидов совпадают. Поскольку основное включение трития в белки в обоих случаях происходит в белки фракции скэффолда, то полученные результаты позволяют предположить, что белки скэффолда формируют наружную поверхность как хроматиноподобных фибрилл ЭДТА-деконденсированных хромосом, так и наружную поверхность конденсированных метафазных хромосом.

4. Показано, что часть наружных бепков хромосом является фосфобелка-ми. При этом было обнаружено, что в спектрах наружных фосфололипел-тидов конденсированных и ЭДТА-деконденсированных хромосом 9 фосфопо-пипептидов с мол. массами 14, 28, 35, 45, 57, 67, 84 и 87 кДа совпадают .

5. Было обнаружено, что фосфобелки фракции скэффолда доступны для иммобилизованных казеинкиназы 2 и щелочной фосфатаэы, что подтверждает их наружную локализацию.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1.Беляев Н.Д., Будкер в.Г., Дубровская В.А., Ким A.A., Киселева Е.В., Сидоров В.Н. Локализация белков, формирующих наружную поверхность выделенных митотических хромосом// X симпозиум "Структура и функции клеточного ядра" Гродно.- 1990.- С.131.

2.Be1ayev N.D., Budker V.G., Dubrovskaya V.A., Kim A.A., Kiseleva E.V., Sidorov V.N. Localization of proteins, forming the outer surface of isolated metaphase chromosomes// American Journal Human Genet 1С.-1 990.- V.47.- N3, Suppl.- P.746-749.

3.Ким A.A., Кит Ю.Я., Сидоров В.H.,Беляев Н.Д., Будкер В.Г. , Дуброа-

екая В.А. Двойной радиохимический подход в исследовании пространственной организации сложных надмолекулярных структур на примере ми-тотических хромосом// 1П Всесоюзная конференция по проблеме "Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами", Звенигород.-1991.- С.60.

4.Беляев Н.Д., Будкер В.Г., Дубровская В.А., Ким А.А., Киселева Е.В., Сидоров В.Н. Локализация белков, формирующих наружную поверхность выделенных митотических хромосом//. Доклады Академии Наук СССР.- 1991,- Т.318.- N3.- С.746-749.

5.Belayev N.D., Budker V.G., Dubrovskaya V.A., Kim A.A., Kiseleva E.V., Sidorov V.N. Localization of proteins, forming the outer surface of metaphase chromosomes// FEBS Letters.- 1992.- V.297.-P.43-45.

6.Kim A.A., Belyaev N.D., Budker V.G., Takhtobin K.S. The perspectives of tritium planigraphy using for nuclear and chromosomal protein kinases research// French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression. Novosibirsk, Russia, July 1-5,- 1995.- P.20.