Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности распределения альфа-сателлитной ДНК человека альфаR1-6 в акроцентрических хромосомах у индивидуумов с нормальным кариотипом и при трисомии 21

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности распределения альфа-сателлитной ДНК человека альфаR1-6 в акроцентрических хромосомах у индивидуумов с нормальным кариотипом и при трисомии 21"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ MEДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР АМН СССР

На правах рукописи' УДК 575.1

СЕЛИВАНОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-САТЕЛЛИТНОЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА АЛЬФАМ.-6 В АКРОЦЕНГРИЧЕСМХ ХРОМОСОМАХ У ИНДИВИДУУМОВ С НОРМАЛЬНЫМ КАРНОТИТОМ И ПРИ ТРИСОМИИ 21

03.00.15 Генетика

АВТОРЕ диссертации на соискание медицинских

Ф Е Р А Т

ученой степени кандидата наук

Москва 1991

л

-■л f

У 1

Работа выполнена в лаборатории цитогенетики Всесоюзного научного центра психического здоровья АМН СССР и на кафедре медицинской генетики Центрального ордена Ленина института усовершенствования врачей МЗ СССР

'Научные руководители - доктор медицинских наук,

профессор С.И.Козлова доктор биологических наук Ю.Б.Юров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.А.Ляпунова доктор медицинских наук Л.З.Казанцева

Ведущее учреждение - кафедра генетики 2 Московского медицинского института им.1 Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится "". И^/Г^Л-... 1991г. в ¿Р.час. на заседании Специализированного Совета Д.001.16.01 Всесоюзного научного медико-генетического центра АМН СССР по адресу: 115478 Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра. .

Автореферат разослан "...и..............1991г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Л .Ф. Курило

■. | Актуальность проблемы. Одной из важных проблем современной генетики является выяснение связи полиморфных вариантов хромосом с патологией развития у человека.

За последние 15 лет классическими цитогенетическими методами проведено большое количество разносторонних исследований хромосомного полимофизма у человека как в норме, так и при различных патологических состояниях. При этом обращает на себя внимание неоднозначность и противоречивость полученных результатов. Так при изучении С-полиморфизма у индивидуумов с нарушением нормального развития, а таете у супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом по сравнению с контролем одними авторами никаких существенных различий не обнаружено (Hemming and Burns, 1979; Ward et al., 1980; Trochet-Royer et al. , 1981; Diettrich et al., 1983; Maes et al. , 1983; Fryns et al. , 1984; Киви и co-авт. , 1987), но ряд авторов отмечает, что среди перечисленного контингента лиц достоверно чаше, чем в контроле встречаются носители таких С-вариантов хромосом, как инверсии, гетероморфизм, С-сегменты с повышенным содержанием гетерохроматина (Цветкова, 1980; Каретникова, 1981; Korsak, 1981; Ford et al. , 1982; Harrison et al. , 1984; Цветкова и др., 1988).

Исходя из того, что гетерохроматиновые районы хромосом сформированы различными типами повторяющихся последовательностей ДНК, можно предположить, что к нарушению развития у человека могут быть причастны отдельные семейства повторяющихся последовательностей, в частности, альфа-сателлитная ДНК. Поэтому для решения вопроса о возможной связи вариабельности в количестве аль-фоидной ДНК с патологией развития у человека необходимо оценить полиморфизм хромосом по содержанию этого типа последовательное-

тей как в норме, так и при различных формах патологии. Обзор литературных данных показывает, что исследования в этой области немногочисленны. Полиморфизм по количеству отдельных последовательностей альфа-сателлитной ДНК показан для хромосом 3, 11, 17, 18, X (Юров, 1987; Yurov et al. , 1988;); 1, 5, б, 19 (Цветкова И др., 1989). Из группы акроцентрических хромосом подобные исследования проводились для хромосом 14 и 22 (Цветкова и др. , 1989). Совсем отсутствуют в литературе данные о полиморфизме по количеству альфоидной ДНК в хромосомах 13 и 21 как в норме, так и при различных формах патологии, в том числе, и при таких наиболее известных трисомиях, как болезнь Дауна и синдром Патау. В связи с этим представляется важным оценить полиморфизм акроцентрических хромосом 13 и 21 человека по количеству альфа-сателлит-ной ДНК как у индивидуумов с нормальным кариотипом, так и у лиц с синдромом Дауна.

Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось изучение с помощью метода гибридизации in situ особенностей распределения клонированной последовательности альфа-сателлитной ДНК человека альфаИ-б, формирующей гетерохроматиновые районы хромосом 13 и ,21. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выявить особенности распределения альфа-сателлитной ДНК альфаМ.-6 в акроцентрических хромосомах человека.

2. Оценить возможность использования клонированной последовательности альфа-сателлитной ДНК человека, специфичной для хромосом 13 и 21, для изучения полиморфизма гетерохроматиновых районов акроцентрических хромосом у индивидуумов с нормальным ка-

-з-

риотипом и у пациентов с болезнью- Дауна.

3. Разработать способ определения происхождения дополнительной хромосомы 21 при синдроме Дауна на основе метода гибридизации in situ специфичной для хромосомы 21 последовательности альфоидной ДНК человека альфаИ-б.

4. На основе полученных данных оценить возможную связь не-расховдения хромосом при болезни Дауна с количеством альфа-са-теллитной ДНК альфаИ.-6 в хромосоме 21.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые с помощью метода гибридизации in situ изучены особенности распределения специфичной для хромосом 13 и 21 альфа-сателлитной ДНК альфаИ.-6 в акроценгрических хромосомах индивидуумов с нормальным кариотипом и у пациентов с трисомией по хромосоме 21. Показано, что гетерохроматиновые районы хромосом 13 и 21 человека характеризуются выраженным полиморфизмом по количеству альфа-са-теллитной ДНК альфаК1-б. Выявленный у многих индивидуумов гетероморфизм гомологичных хромосом 13 и 21 пар достигал 5-ти и более раз.

Обнаружено, что каждый индивидуум характеризуется специфичным распределением метки по хромосомам, и это связано с различиями в количестве альфа- сателлитной ДНК человека альфаИ-б в ак-роцентрических хромосомах.

Впервые показано, что метод сравнения асимметричности мече-ния гомологичных хромосом дает дополнительную информацию о происхождении лишней хромосомы 21 при болезни Дауна, а совместное использование морфологических и радиоавтографических критериев позволяет значительно повысить процент установления родительско-

го происхождения трисомии 21 (более 80%). Предложена : работе метод учета степени асимметрии мечения гомологичных хромосом может быть использован для анализа происхождения хромосом при три-сомиях.' Гетероморфизм гомологичных хромосом также можно' использовать как дополнительный генетический маркер для различения материнского или отцовского происхождения хромосом при проведении анализа сцепления. . -

Излученные в работе данные об отсутствии корреляции мезду нерасхождением и количеством альфа- сателлитной ДНК альфам.-6 в гомологичных хромосомах 21 пары представляют интерес для медико-генетического консультирования.

Результаты работы и разработанные в ходе исследования методические приемы молекулярно-цигогенетического анализа хромосом используются в лаборатории цитогенетики ЕНЦ ПЗ АМН СССР.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 23-м симпозиуме по цитгенегике (Карловы Вары, 1990); на конференции молодых ученых Центрального ордена Ленина института усовершенствования врачей МЗ СССР (январь, 1990); на семинаре кафедры " медицинской генетики и заседании Совета педиатрического факультета Центрального ордена Ленина института усовершенствования врачей (декабрь и март, 1991); на научном семинаре отдела цитогенетики Всесоюзного научного медико-генетического центра АМН СССР (апрель,-1991).

Публикации. По теме диссертации опубликована 1 работа.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материала и методов исследования, результатов и их обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы. Текст изложен на 159 страницах и содержит 10 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 57 работ отечественных авторов и 299 зарубежных.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Гетерохроматиновые районы акроцентрических хромосом 13 и 21 человека характеризуются полиморфизмом по количеству аль-фа-сателлитной ДНК альфаИ-б.

2. Вариабельность рисунка распределения метки по хромосомам разных пар в пределах каждого индивидуума объясняется случайными вариациями.

3. Количество альфа-сателлитной ДНК альфаИ-6 в гомологах 21 пары хромосом не оказывает существенного влияния на процесс нерасхождения хромосом в мейозе родителей.

4. Метод сравнения степени мечения гомологичных хромосом дает дополнительную информацию о происхождении дополнительной хромосомы 21 при синдроме Дауна.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Объектом исследования явились члены 37 семей, имеющих ребенка с синдромом Дауна. Всего 113 человек. Группа из 37 детей с болезнью Дауна состояла из 34 детей с регулярной трисомией 21 и троих детей с возникшей de novo транслокацией 21/21. Группа из 76 индивидуумов с нормальным кариотипом состояла из 72 человек - родителей детей с синдромом Дауна и 4-х здоровых сибсов. Возраст родителей составлял; у матерей - от 18 до 38 лет; у отцов - от 17 до 44 лет.

Щтогенетическое обследование пациентов. Материалом исследования явилась цельная периферическая кровь, которую культивировали согласно общепринятой методике (Hungerford, 1965). Фиксацию клеток проводили на 72 часу от начала культивирования. Колхицин вводили за 90 мин до фиксации в конечной концентрации 0,25 мкг/мл. Гипотонизация и фиксация осуществлялись в соответствии со стандартным протоколом. Приготовленные хромосомные препараты окрашивали по методу Шварцзахера (Schwarzacher, 1974) - Q-метод окраски и красителем Гимзы на фосфатном буфере - G-метод окраски (Захаров с соавт., 1982). Кариотипический анализ проводили под микроскопом Ortoplan ("Leitz", Австрия) с последующей зарисовкой и фотографированием.

Гибридизация ДНК на мегафазных хромосомах. В работе использовали последовательность альфа-сагеллитной ДНК человека аль-фаИ.-б, клонированную в плазмиде pBR325 по EooRl-сайту А.Яковлевым (Яковлев, 1983).

Гибридизацию ДНК на метафазных хромосомах in situ проводили по методу .Голла и Пардью (Gall, Perdue, 1971) с модификациями, предлоленными IQ Б. Юровым (Юров, 1987), позволяющими добиваться эффективной гибридизации повторяющейся последовательности ДНК и проводить дифференциальное 6-окрашивание хромосом через слой ра-диоавтографичекой эмульсии с целью идентификации хромосом человека.

Хромосомную ДНК денатурировали в растворе О,07N NaOH (рН 13) Шследовательность альфа-сателлитной ДНК альфаИ.-6, меченную

тритиевой меткой (средняя удельная радиоактивность составляла q

около 1,25 х 10 распадов в мин в расчете на 1 мкг ДНК), денату-

рировали прогреванием при 100°С в течение 5 мин в гибридизаци-онной смеси, состоящей из 2xSSC, 50% формамида, 10% декстран-сульфата-500. Готовую гибридизационную смесь раскалывали на препараты хромосом в количестве 15-20 мкл и инкубировали в течение 18 час при температуре 42°С. Радиоавтографы хромосом готовили с использованием ядерной эмульсии типа "М" (ГосНИИХимФотоПроект, Москва). После проявления препараты окрашивали красителем Райта (рН 6,8) и анализировали не менее 10 метафазных пластинок.

Статистическая обработка цифровых данных. Результаты количественного анализа распределения радиоактивной метки по хромо- . сомам обрабатывали на ЭВМ. Для статистического сравнения эмпирического распределения с теоретическим, а также для сравнения нескольких эмпирических распределений использовали критерий

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Хромосомная локализация клонированной последовательности альфа-сателлитной ДНК альфаЯ1-б в геноме человека

Использование "жестких" условий гибридизации in situ позволяет добиваться четкой и надежной локализации исследуемой последовательности альфаМ-б на метафазных хромосомах человекак, а также получать воспроизводимые от опыта к опыту картины распределения метки по хромосомам в серии независимых гибридизаций последовательности. Клонированная последовательность альфа-са-теллитной ДНК альфаИ.-б у всех проанализированных индивидуумов интенсивно гибридизовалась с прицентромерными участками только

хи-квадрат

хромосом 13 и 21 и в меньшей степени - с хромосомами 14, 15, 22 (см. рис.1). В связи с этим мы проводили подсчет зерен серебра только на акроцентричес ких хромосомах, идентифицированных с помощью G-окрашвания через слой фотоэмульсии, а также определяли общую сумму зерен метки над остальными хромосомами без раздельного учета последних. Поскольку число гомологов хромосомы 21 различается у родителей с нормальным кариотипом и их детей с синдромом Дауна, то для сравнения степени мечения хромосом у индивидуумов с разным числом хромосом рассчитывался относительный уровень мечения, т.е. отношение числа зерен метки над каждой из указанных хромосомных групп (хромосом) к числу зерен серебра, приходящемуся на "постоянную" часть генома, т. е. на весь карио-

г

тип за исключением хромосомы 21, умноженный для удобства на 10 .

Возможность использования метода гибридизации in situ для исследования хромосомного полиморфизма по количеству альфойдной ДНК альфаМ.-6 При анализе результатов гибридизации на хромосомах in situ было обнаружено, что число и распределение зерен серебра в разных клетках кавдого индивидуума неодинаково. В связи с этим было необходимо выяснить, является ли такая неоднородность распределения метки по хромосомам следствием чисто случайных отклонений или же отражает реально существующие межклеточные различия. Для ответа на этот вопрос была проверена однородность похромосомного

распределения зерен серебра в разных клетках каждого индивидуу-

г

ма Сравнение проведено методом ^ по формуле: 2 ■

f-(m-l)Ck-l); Ni-Jxij; nj-JX^j(Pearson, 1932),-

О

13 14 15 21 22 ост.

б)

13

и

~2Г

п

о о •

О ' О '

Ш

¿г ост.

в)

ГЦ

№

13 14 15 21 22 ост.

Рис.

ТТ

г)

ТТ

ТС

-р-

№

ост.

I." Результаты анализа распределения последовательности аль-фаВ1-6 в хромосомах членов одной семьи..По оси ординат отложен относительный уровень мечения (на одну хромосому

о

указанной группы) х Ю (см. объяснения на стр.8 ); по оси абсцисс - номера хромосом.

а) отец (46,ХУ); б) мать (46,XX); в) ребенок с синдромом Дауна (47,XX,+21); г) сибс (46,ХУ).

3

О

к - число проанализированных клеток; п>=6 - число учитываемых хромосом (хромосомных групп); ху- число зерен в j-той хромосоме (группе) в i-той клетке; Ni. - общее число зерен в i-той клетке; nj- суммарное число зерен в j-той хромосоме (группе) по всем клеткам; Е^- ожидаемое число зерен в j-той хромосоме (группе) в i-той клетке; f - число степеней свободы.

В случае малых ожидаемых отдельные пары хромосом объединялись с группой "неакроцентрические" хромосомы таким образом, чтобы минимальное ожидаемое превышало 0,5 (Slakter, 1966). При числе степеней свободы свыше 30 использовалась нормальная аппроксимация: _j _

u - V^C "V2r " (Fisher, 1954).

В результате проведенного статистического анализа показано,

что для всех исследуемых индивидуумов значение и не превысило

2

критического (за исключением одного случая: ^=98,54; f-129;

и—1,99; Р-0,05), то есть наблюдаемые различия в распределении

метки между разными клетками в пределах отдельных индивидуумов

статистически недостоверны и объясняются случайными вариациями.

При объединении значений для всех исследуемых индивидуумов, ис-

2.

пользуя свойство аддитивности (Nelson, 1966), получено: 2, ■ > ' ^ =5863,3; f=6086; u=-2,03; Р-0,96 (для одностороннего теста).

Таким образом, проведенный анализ свидетельствует об отсутствии межклеточных различий в распределении альфа-сателлитной ДНК альфаШ.-б со спецификой для хромосом 13 и 21, а также о том, что метод гибридизации на хромосомах in situ с последующим поде-

четом числа зерен серебра в эмульсии может быть использован для изучения полиморфизма хромосом человека при использовании хромо-сомоспецифичных последовательностей альфа-сателлитной ДНК.

Полиморфизм акроцентрических хромосом человека по содержанию альфа-сателлитной ДНК альфаШ-6 Следующей задачей исследования явился анализ межиндивидуальных различий распределения альфоидной ДНК альфаИ.-6 в акроцентрических хромосомах человека. Для этого проведено сравнение распределения метки в хромосомах различных индивидуумов с использованием тех же статистических процедур, которые были применены для проверки гомогенности рисунков мечения разных клеток одного индивидуума При этом все исследуемые индивидуумы были разделены на три группы в соответствии с их кариотипом. Первую группу составили 34 ребенка с регулярной трисомией 21; вторую -76 их ближайших родственников с нормальным кариотипом; третью -три ребенка с возникшей de novo транслокацией 21/21. В связи с тем, что хромосомы X и Y практически не метились, мы посчитали возможным при статистической обработке результатов не учитывать половые различия, считая, что при объединении неакроцентрических хромосом в единую группу незначительные различия между Х- и Y-хромосомами не могут сколько-нибудь заметно повлиять на общие выводы. В результате проведенного анализа в каждой из указанных трех групп индивидуумов выявлена значительная гетерогенность рисунков мечения. Эти различия обнаруживаются и при попарном сравнении индивидуумов. В таблице 1 приведены результаты подсчета зерен серебра над метафазными хромосомами 10 индивидуумов с нормальным кариотипом и 10 индивидуумов с регулярной трисомией

Таблзта I

Анализ распределения зерен серебра над матафазными хромосомами 10 индивидуумов с нормальный кариотипом и 10 индивидуумов о регулярной трисоиией 21 после гибридизации In. tiiiv о клонированной .. последовательностью <¿£1-6, специфичной для хромосом 13 и 21,

Номер индивиду-Относитальный уро-ума вень мечения (на I

Кариотнп хромосому данной группы) I 10^

13 14 15 21 22 ост

Ia 4б;хх 89 25 9 69 13 20 80,89 88 1152 -0,50 0,56 231

Iö 46 ,ХУ 114 26 8 98 10 19 81,08 66 1217 1,28 0,2 23'

2а 46.ХХ 96 27 8 59 14 20 39,86 56 661 -1,60 0,1 id

За 46,XX 92 28 7 77 14 20 55,15 75 1157 -1,70 0,08 20-

3d 46 ДУ 77 20 3 74 17 21 24,50 39 452 -1,77 0,08 14 \

4а 46,XX 96 24 5 61 16 20 70,95 80 876 -0,99 0,5 21

46 46,ХУ 82 25 6 62 13 21 55,25 60 931 -0,39 0.7 21

4с 46,XX 92 22 6 76 10 21 49,20 54 624 -0,42 0,69 19

5а 46,XX 96 26 3 43 2 21 32,37 36 665 -0,38 0,7 13

56 46,ХУ 99 28 8 72 14 20 90,76 88 1218 0,24 0,8 23

I; 47,И,+21 81 23 9 80 7 21 36,62 42 793 -0,55 0,6 15

2; 47,И,+21 99 24 5 57 8 20 52,85 69 1248 -1,42 0,16 €4

3; 47,ХУ,+21 81 24 II 60 18 20 61,30 65 626 -0,28 0,8 14

4; 47.ХУ.+21 117 24 5 69 II 19 54,52 60 802 -0,46 0,6 21

5; 47,XX,+21 86 29 5 65 6 21 30,96 42 664 -1,24. 0,2 15

6; 47.ХУ.+21 72 29 10 64 9 21 57,30 45 720 1,27 0,2 10

7; 47,XX,+21 84 27 4 67 9 21 86,53 80 1293 0,54 0,6 21

8; 47,X/ ,+21 87 23 2 63 7 21 25,25 30 706 — 0,7 II

9; 47,XX,+21 НО 30 8 84 9 19 35,64 27 615 -- 0,15 ГО

10; 47,ХУ,+21 89 19 6 91 15 21 38,20 48 687 -1,00 0,29 13

общее число

Р число проан

с л зерен ., h лияир

сереб и-' Г ванцы

ра мета-

-1321.

Таким образом, анализ распределения исследуемой последовательности альфа-сате'ллитной ДНК альфаИ-б по хромосомам разных индивидуумов показывает, что каждый индивидуум характеризуется достаточно своеобразным рисунком распределения метки. Видимо, это своеобразие связано с различиями в количестве альфоидной ДНК альфаИ-б в хромосомах человека.

Анализ распределения зерен серебра по хромосомам у всех проанализированных индивидуумов позволяет разделить акроцентри-ческие хромосомы на три группы. В первую группу вошли хромосомы > 13 и 21, метившиеся во всех случаях наиболее интенсивно. В большинстве случаев хромосома 13 содержала над прицентромерным участком большее число зерен, нежели хромосома 21. Однако в некоторых случаях имела место обратная ситуация, когда хромосома 21 была достоверно более интенсивно меченной, чем хромосома 13 (см. рис. 2). Вторую группу составили хромосомы 15 и 22, которые содержали значительно меньше метки над прицентромерным районом, чем неакроцентрические хромосомы. Среди этих двух хромосом 22-ая, как правило, метилась сильнее. Однако в нескольких случаях достоверно более меченной была 15 хромосома. И, наконец, третья группа представлена хромосомой 14, содержащей в большинстве случаев несколько большее число зерен серебра, чем неакроцентрические хромосомы. В то же время имели место случаи, когда уровень мечения хромосомы 14 был либо значительно выше, либо достоверно ниже, чем в среднем у неакроцентрических хромосом.

В изученной выборке с высокой частотой встречались случаи с ярко выраженными различиями между гомологами 13 и 21 пар по ин-

I03A

130 120 ПО 100 90 80 70 60

50 40 30,

20

10

Примеры разнообразия рисунков меченая хромосом у индивидуумов с нормальным кариотипом после гибридизации in situ с последовательности«альфа-сателлитной ДНК альфаШ-6 человека

13 14 15 21 22 ост.

Рис.2. Разнообразие рисунков мечения хромосом 13 и 21 у 3-х отдельно взятых индивидуумов с нормальным

кариотипом. По оси ординат отложен относительный уровень мечения на одну хромосому каждой группы, по оси абсписс - номера хромосом. * - максимальные и минимальные показатели относительного уровня мечения для каждой из указанных хромосом в группе индивидуумов с нормальным кариотипом. индивидуум №66: хромосомы 13 и 21 метятся одинаково.

п

щ

(П1

индивидуум №20а: хромосома 13 метится гораздо интенсивнее, чем хромосома 21. индивидуу №360: хромосома 21метится интенсивнее, чем хромосома 13,

Учет наличия или отсутствия особенностей строения спутнично-го района, позволяющих отличить друг от друга хромосомы одной группы, позволил провести анализ связи морфологических особенностей акроцентрических хромосом с количеством альфоидной ДНК альфаИ-б.

Согласно нуль-гипотезе о том, что наличие четко видимого

спутника не связано с изменением количества альфа-сателлитной

ДНК альфаИ-б, спутничная хромосома с равной вероятностью должна

метиться как сильнее, так и слабее своего гомолога. При проверке

этой гипотезы не обнаружено статистически значимых отклонений от _

г.

ее предсказаний (за исключением одного случая: -6,67; Г-2; Р =0,05): спутничная хромосома по количеству зерен метки над ее прицентромерной областью у гомологов и 13, и 21 пар практически с равной вероятностью оказывалась и более, и менее плотно меченной, а среди трех гомологов хромосомы 21 у детей с синдромом Дауна она практически равновероятно занимала любое из трех мест по количеству метки. Суммарные значения ^ по всем проанализированным вариантам соотношения меченности хромосом различной морфолог

гии равняются: -8,72; Г-7; Р-0,3.

Таким образом, полученные результаты поаволяют сделать вывод о том, что количество альфа-сателлитной ДНК человека альфам.-6 не связано явным образом с наличием морфологических различий в строении коротких плеч акоцентрических хромосом.

Анализ связи нерасхоздения с количеством альфа-сателлитной ДНК человека альфа)?!-6 в гомологах 21 пары хромосом Исходя из предположения о том, что количество альфа-сател-

лнтной ДНК альфаИ-6 влияет на вероятность нерасхождения хромосом, следует ожидать, что количество исследуемой последовательности альфаИ-б и распределение ее по гомологам 21 пары будет отличаться у родителей, передающих дополнительную хромосому 21 в одном из делений мейоза, и у родителей, не участвующих в нерасхождении. С целью выяснить, какие по количеству альфоидной ДНК человека альфаЯ1-б варианты хромосомы 21 (максимальные или минимальные) чаще вовлекаются в нерасхождение, сравнивались различные интервалы коэффициента асимметрии мечения гомологов 21 пары в следующих группах индивидуумов: учитывая тот факт, что вероят- . ность нерасхоадения хромосомы 21 различна у мужчин и женщин, в группе родителей детей с болезнью Дауна имело смысл сравнить между собой мужчин и женщин с нормальным кариотипом; в семьях с установленным происхождением трисомии сравнивались родители, передающие дополнительную хромосому 21 в первом мейотическом делении, с родителями, предающими лишнюю хромосому во втором делении мейоза, а также и те, и другие сравнивались с группой родителей, не участвующих в передаче дополнительной хромосомы 21. Учитывая' также, что изучаемая последовательность альфоидной ДНК альфаИ-б входит в состав гетерохроматинового района хромосомы 13, и нерасхождение хромосом группы Б, как правило, связано именно с хромосомой 13, представлялось целесообразным провести подобные сравнения и для этой хромосомы. Для гомологов 13 пары сравнение проводилось в выше перечисленных группах индивидуумов, а также было возможным сравнить интервалы коэффициента асимметрии мечения у родителей и их детей. Сравнение проводилось при помощи точного критерия Фишера для слабо заполненных 4-х-польных таблиц

сопряженности (Fisher, 1954). При этом сравниваемые выборки индивидуумов разбивались на группы по принципу больше или меньше, нежели произвольно выбираемая наш величина коэффициента асимметрии мечения А (например, больше или меньше 2-кратной; 2,5-кратной и т.д.).

В результате проведенного анализа ни для одного значения коэффициента асимметрии мечения А ни в одном сравнении не выявлено статистически значимых различий. Так, например, при сравнении между собой мужчин и женщин с нормальным кариотипом из группы родителей детей с синдромом Дауна; родителей, передающих допол- -нительную хромосому 21 в первом делении мейоза, с родителями, не участвующими в нерасхождении; родителей, передающих лишнюю хромосому 21 во втором мейотическом делении, с родителями, не передающими лишнюю хромосому 21; а также при сравнении между собой родителей, передающих дополнительную хромосому 21 в первом и втором делениях мейоза, значения Р для А£2 соответственно равнялись: Р-0,16; Р-0,23; Р-0,37; Р-0Д9.

Таким образом, проведенный анализ позволяет сделать вывод о • том, что количество альфа-сателлитной ДНК человека альфаК1-6 не оказывает существенного влияния на процесс нерасхождения хромосом в мейозе родителей.

Анализ происхождения дополнительной хромосомы 21 с использованием молекулярно-цитогенетичеекого подхода

Использованный в работе метод сравнения интенсивности мечения гомологичных хромосом позволил во многом дополнить информацию о происхожцении лишней хромосомы 21, полученную первоначаль-

но на основе учета цитологических различий гомологов (см. табл. 2). Ни в одном из 34 случаев результаты радиоавтографии не противоречили данным морфологического анализа В 10-ти из 34-х случаев с установленным на основании цитологических особенностей происхождением трисомии результаты радиоавтографического анализа полностью подтвердили полученные данные. В 14-ти случаях, где анализ морфологических особенностей группы из трех гомологов позволил лишь исключить одну или две возможности происхождения трисомии, с помощью радиоавтографии удалось в двух семьях исключить еще одну возможность происхождения лишней хромосомы 21, а в -6-ти семьях - четко установить это происхождение. Среди 10-ти семей, в которых морфология хромосом не позволяла сделать вообще никакого вывода относительно происхождения лишней хромосомы 21, примененный в работе метод позволил в 5-ти семьях исключить отдельные возможности происхождения трисомии.

Так, в семье N13 (см.рис. За) очевидно, что при нерасхождении в любом делении мейоза отца ребенок получил бы две хромосомы, не имеюдае явно выраженного спутника. Поэтому на основании морфологии хромосом можно с очевидностью исключить первое и второе деления мейоза отца Следовательно, трисомия в данном случае имеет материнское происхождение. Остается выяснить, в каком делении мейоза произошло нерасхождение. Так как выраженная степень асимметрии мечения (А - коэффициент асимметрии мечения) хромосом матери сохраняется и у ребенка, следовательно, он получил от матери два генетически разных гомолога в результате нерасхождения в первом делении мейоза

В семье N20 (см. рис. 36) на основании морфологии хромосом

Таблица №2

Анализ происхождения дополнительной хромосомы 21 в 34-х семьях, имеющих ребенка с регулярной трисомией 21, при совместном использовании морфологических и радиоавтографиче'ских критериев

Используемый метод: Анализ морфологических особенностей гомологов

Степень информативности Количество индивиду- : Из них методом анализа гетероморфизма гомологов метода мов получено:

установлено исключен еще один дополнительной происховде- возможный вариант информации не , ние происхождения получено м

————— - оо

Происхождение установ- 10 10 - 1

лено полностью

Исключен один (два)

возможных варианта 14 6 2 6

происхождения

Неинформативно 10 0 5 5

Суммарно по двум методам

16

13

5

Семья #13

Семья №20

=4,5 А2_з - нет решения

а) 6}

Рис.3 . Определение происхождениядополнительной хромосомы 21 в семьях, имеющих ребенка с синдромом Дауна, при совместном использовании морфологических и радиоавтографических критериев.

А - коэффициент асимметрии мечения гомологов (см. объяснения в тексте).

можно исключить только второе деление мейоза у отца. Если бы одна из спутничньи хромосом ребенка была отцовского происхождения, го тогда его хромосома, не имеющая явно выраженного спутника не могла бы оказаться наиболее плотно меченной. Следовательно, обе несущие спутники хромосомы ребенка имеют материнское происхождение. Однако у матери выявляется резкая асимметрия мечения гомологов, тогда как у ребенка обе спутничные хромосомы метятся с одинаковой интенсивностью. Это позволяет предполагать, что несущие спутники хромосомы ребенка генетически идентичны и, следовательно, трисомия в данном случае является следствием нерасхождения во втором делении мейоза у матери.

В таблице N3 приведены данные, показывающие информативность примененного в настоящем исследовании молекулярно-цитогенетичес-кого подхода по сравнению с информативностью используемых в настоящее время методов для установления происхождения дополнительной хромосомы 21. Из таблицы видно, что предложенный в работе метод сравнения степени.мечения гомологичных хромосом позволил в 47% случаев полностью определить происхождение трисомии, а в 38% - исключить отдельные возможности происхождения лишней хромосомы 21. •

Таким образом, предложенный в работе способ сравнения ин- ' тенсивности мечения гомологичных хромосом может быть использован для анализа происхождения лишней хромосомы при трисомии 21.

Заключение

Настоящее исследование проведено с целью изучить с помощью метода гибридизации in situ особенности распределения альфа-са-

Таблица

Информативность используемых патогенетических и молекулярных методов анализа происхождения дополнительной хромосомы 21 при синдроме Дауна по собственным и литературным данным

Исследователь, Количество Использованный метод анализа Информативность

Год исслдеования семей Дифференциальные ПДО Молекулярно- по всем использован-

окраски хромосом цитогенетический ^^ мзтодам ^

+ ++ +++ + ++ +++ + ++ +++ + ++ +++

Стюарт и соавт. 5 2 I 2 4 0 I 100$ 0 0

(1988)

Радд и соавт. 20 - - 9 0 II - - 45% 0 55$

(1988)

Брикарелли и соавт.х 37 30 4 3 23 8 6 _ 94,6 % 5,4$ 0

(1988)

Голт и соавт. 33 - - - 12 0 21 - - - 36$ 0 64$

(1989)

Настоящее иссле- 34 10 14 10 - - - 16 13 5 47$ 38$ 15$

дование

Примечание: + - происхождение дополнительной хромосомы 21 установлено полностью;

++ - исключен один или два возможных варианта происхождения трисомии 21; +++ - неинформативно, х - выборка неслучайная.

теллитной ДНК человека альфаИ-б по акроцентрическим хромосомам у лиц с нормальным кариогипом и у пациентов с синдромом Дауна, чтобы выяснить значение различных по количеству альфоидной ДНК альфай-б вариантов хромосомы 21 как фактора риска в предрасположенности к трисомии 21.

В результате проведенного анализа распределения исследуемой последовательности альфа-сателлитной ДНК альфаЯ1-б по хромосомам разных индивидуумов показано, что каждый индивидуум характеризуется достаточно своеобразным рисунком распределения метки. Видимо, это связано с различиями в количестве альфоидной ДНК аль- . фаИ.-б в хромосомах человека. Следует также отметить, что межиндивидуальные различия имеются как по общему количеству альфоидной последовательности альфаИ.-6 в целом на геном, так и между гомологичными хромосомами, так назывыаемый гетероморфизм гомологов. Различия между гомологами и 13, и 21 пар хромосом по интенсивности их мечения выявлялись в значительном числе пар и достигали 5-ти и более раз. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, показавших существование полиморфиз- ' ма хромосом по количеству хромосомоспецифичных последовательностей альфа-сателлитной ДНК человека (Юров, 1987; Цветкова и др., 1989; 1990).

В результате проведенного исследования показано, что неоднородность распределения метки по хромосомам в разных клетках каждого индивидуума не может быть объяснена иными причинами, нежели случайные вариации. И, следовательно, изучение полиморфизма хромосом человека при использовании хромосомоспецифичных последовательностей альфоидной ДНК вполне осуществимо с помощью мето-

-28-

да гибридизации на хромосомах in situ.

Впервые предложенный в работе метод сравнения степени мечения гомологичных хромосом позволяет получить дополнительную информацию о происхождении трисомии 21, полученную первоначально на основе анализа цитологических различий гомологов. Используемый в исследовании молекулярно-датогенетический подход позволяет получать информацию о нерасхождении более, чем в 80% случаев, что вполне согласуется с данными других исследователей о необходимости использования для этих целей как цитогенетического, так и молекулярного полиморфизма (анализ ВДРФ) (Stewart et al., -1988; Bricarelli et al. , 1988; Sacchi et al. , 1988). Предложенный метод может быть использован для анализа происхождения хромосом при трисомиях. Гетероморфизм гомологичных хромосом также можно использовать как дополнительный генетический маркер для различения материнского или отцовского происхождения хромосом при проведении анализа сцепления.

В исследовании мы также впервые попытались оценить вклад различных по количеству альфа-сателлитной ДНК человека альфаИ-б вариантов хромосомы 21 в предрасположение к нерасхождению. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что количество аль-фоидной.ДНК альфаИ.-б не оказывает существенного влияния на процесс нерасхождения хромосом в мейозе родителей.

ВЫВОДЫ

1. С помощью метода молекулярной гибридизации ДНК in situ исследована хромосомная локализация клонированной последовательности альфа-сателлитной ДНК человека (ДНК зонд альфаИ-б). Пока-

зано, что альфа-сателлитная ДНК альфаИ-б входит в состав гетерохроматиновых районов двух пар акроцентрических хромосом человека - 13 и 21.

2. Вариабельность рисунка распределения метки между хромосомами разных пар в пределах каждого индивидуума объясняется случайными вариациями. Следовательно, изучение полиморфизма гетерохроматиновых районов акроцентрических хромосом человека при использовании хромоеомоспецифичных последовательностей альфа-са-геллитной ДНК осуществимо с помощью метода гибридизации in situ.

3. Гетерохроматиновые районы хромосом 13 и 21 человека ха- • растеризуются полиморфизмом по количеству альфа-сателлитной ДНК альфаР?1-б. Обнаружено, что каждый индивидуум характеризуется специфичным распределением метки по хромосомам, и это связано с различиями в количестве альфоидной ДНК альфаИ.-6 в акроцентрических хромосомах.

4. Обнаружен выраженный гетероморфизм гомологичных хромосом 13 и 21 пар по количеству альфа-сателлитной ДНК альфаМ.-6.

5. Использованный в работе оригинальный метод сравнения степени мечения гомологичных хромосом 21 пары позволяет значительно дополнить информацию о происхождении лишней хромосомы 21 при синдроме Дауна. Совместное использование морфологических и радиоавтографических критериев позволило получить инфомацию о нерасхождении в 85% случаев. Гетероморфизм гомологичных хромосом также можно использовать для различения материнского или отцовского происхождения хромосом при проведении анализа сцепления.

6. Наличие морфологических различий коротких плеч акроцентрических хромосом не связано явным образом с количеством адь-

фа-сателлитной ДНК человека альфаЯ1-6.

7. Количество альфа- сателлитной ДНК в гомологах 21 пары хромосом не оказывает существенного влияния на процесс нерасхождения . хромосом в мейозе родителей. Следовательно, различные по количеству альфа-сателлитной ДНК альфаИ-б варианты гомологов 21 • пары (как максимальные, так и минимальные) не следует рассматривать как фактор риска в предрасположенности к нерасхождению.

Список опубликованных работ 1. Y. В. Yurov, Н. A. Selivanova, G. V. Deryagin. Use of cloned -alpha-satellite DNA probes for the analysis of polymorphic heterochromatic regions of human acrocentric chromosomes by hybridization in situ technique. - Abstr. Synp. of Cytogenetics and 23rd Annual Meeting, Karlovy Vary, 1990, p. 66.