Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хромосомные аномалии у детей с недиффиренцированной олигофренией и супружеских пар с отяхощенным акушерским анамнезом по данным молекулярно-цитогенетических исследований

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Хромосомные аномалии у детей с недиффиренцированной олигофренией и супружеских пар с отяхощенным акушерским анамнезом по данным молекулярно-цитогенетических исследований"

госу;.ш;тва22Ш институт усовегшствования врачей

На правах'рукописи

N

ВОРСАЛОВА Светлана Григорьевна

Хромосомны о аномалии у детей с недпЗфэренцированЕоЗ олигофренией и супружеских пар-с отягощенным акусорскнм шгсшззом по даншш молекулярно-цитогенетических

исследований

03.00.15 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в форм научного доклада

Клев - ГЭЭ1 г.

Работа выполнена в Московском Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского института педиатрии и детской хирургии Минздрава РСФСР

Научный консультант акад~У7Ж НЛ1 СССР, доктор медицинских наук, профессор Ю.Е. Еэльтшцев

Официальные оппоненты:

доктор-медицинских наук, профессор Р.Ф.Гарькавцева

доктор медп^шских наук М.А.Пилинская

доктор С7.сл:ппоскЕХ наук И.А.Смирнова

Ведущая организация - Украинский институт усовершенствования врачей

Эадкта состоится ^• на заседании

специажзированного совета Д 074.44.04 Киевского Государственного института усовершенствования врачей в аудитории Я 3 / /з. оо. по адресу: 252112, Киев, ул. Дор^гапщкэя, дом.9 -

¿Г. Р- К

Авторе^рт разослан __

Ученый секрэтарь ■ специализированного совога

кандидат мед.наук Горовенко Н.Г.

■ .лк'/у|hücí ь темы. В большой группе патологических состояний :iidDj:^b$4''llllc'ro и врожденного генеза значительный удельный вес при-вдшг хромосомной пзтолохчш, которая клинически характеризуется недостаточным психомоторным развитием на фоне множественных врожденных плрокоь и/или микрозномашй развития (МВПР и/или MAP) (Schlnsel,1984; ХрсмосекниЯ р'Л'иотр, 1984; Borgaonteir et al., 1991). Следует отметить относительно возрастаклую роль этой патологии как причины детской засюл.-ьа-мости, инвалидизацни и смертности. У детей с недифференцированной умственной недостаточностью с МЫ IP и/или MAP (I группа), а такта и у п>: родителей (2 группа) наряду с хромосомными аномалиями, обнаруживают различные хромосомные варианта (в основном, 1qh+, 9qh+, 1 f.ijhi )/Л.Л.Проко1ьевП"ьелы'овская,1Эаб/. Цитогенотические исследо дованнл показывают, что хромосомные аномалии и варианты достоверно чаще ветречаются у детей с задержкой умственного и физического развитии, Vi'.IiP и/или MAP, а также у их родителей. Так, в первой группе хромосомные аномалии естречаютея в 2,9-16,1% (Kanato S.,1906; English et al., 19:>3), а перечисленные сшив ¡хромосомные варианты в среднем до 11% (Kanato S.,1906); во второй группе сбалансированные хромосомные перестройки - -1,3-9,BS (Keclrla, Plssarskl,1981; Martens et al.,1984; BourrcriilIon et al. ,198')), хромосомные варианты - по разним авторам от 3,5-10,Vi (Nielsen et al.,1974; Retirla,Р1зангак1,1981 ). В общей популяции хромосомные варианты lqh+,9qh+,16qh+ встречаются в 0,051,63 (ü'ffiertcn al. ,1975; Nielsen,Slllesen,1975; Кулешов,Кулиева, 1979; L.lhm et al., 1987).

До недавнего времени для диагностики хромосомна аномалий использовали исключительно традиционные методы патогенетической диагностики, связанные с культивированием клеток, получением хромосомных препаратов и анализа их под микроскопом. Классические методы цитогенетической диагностики позволяют составить представление о кариотше - числе и структуре хромосом человека. Однако, при этом остается нерешешшм ряд проблем, связанных с диагностикой недифференцированных форм хромосомно!^ патологии, таких,как добавочные (дополнительные) или мшшхромосомы, j сложные случаи хромосомного мозаицизма с небольшим процентом аномальны> клеток, участие в хромосомных перестройках более 3-х хромосом с различными точками разрыва. Кроме того, отдельные случаи хромосомных

аномалий требуют уточнения цитогенетического диагноза, например, сбалансированные и несбалансированные транслокации (особенно, семейные случаи) и хромосомные варианты (Vorsanova et al.,1986,1990,1991).

Важно подчеркнуть, что проблема анализа молекулярного состава маркерных (мини-) хромосом, несмотря на несомненную научно-практическую значимость, в настоящее время далека от окончательного решения. Это связано с трудностями в интерпретации их происхождения и генетического состава на основе методов дифференциального окрашивания, а также выяснения их связи с клиническими проявлениями. Маркерные хромосомы встречаются с высокой частотой (1-2 случая на IOOO анализов) при проведении пре- и постнатальной диагностики (Bucktofi et al.,1985; Tozzl et al., 1938; Callen,1990). Они часто сегрегируют в семьях и у отдельных ее членов могут являться причиной умственной отсталости и MBÍIP и/или MAP, в то время как другие, имея дополнительную хромосому, остаются фенотипически нормальными.-Как правило, маркерные хромосомы представляют собой добавочный хромосомный материал в виде акроцентрической или мета-центрической хромосомы и обязательно содержат околоцентрокерный гетерохроматин и центромеру. Традиционными цитогонетическими методами происхождение этих хромосом определить практически невозможна, хотя необходимость этого определения возникает при оценке состояшм больных и .особенно, в процессе генетического консультирования -при прогнозе состояния здоровья будущего потомства.

В последние годы появились принципиально новые подходы к диагностике наследственно обусловленной патологии вообще, и хромосомной патологии,в частности. Это стало возможно на основе разработки технологии получения рекомбинантных молекул ДНК и использования их в виде ДНК проб (или зондов) для диагностики. Идентификация хромосомной патологии базируется на использовании особого типа клонированных фрагментов ДНК человека - хромосомоспецифичных ДНК зондов, которые характерны только для определенных пар хромосом или их участков. Используя ДНК зонды , можно более точно и эффективно определить особенности хромосомного набора с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот In situ. Применяя молекулярно-цитогенети-ческий метод (метод гибридизации нуклеиновых кислот In situ), мож-

з • •

по выявлять и анализировать нормальные (или аномальные) гомологичные хромосомы практически во всех стадиях клотоЧного цикла, в том число и в интерфазе, что вайю в постнаталыюй и, особенно, пренаталь-ной диагностике, когда нужно бистро и точно (ь нативных цитологических препаратах клеток хориона) определить пол плода или онеуплоидию хромосом. Молекулярно-цитогенетическив методы анализа кариотипа человека и, в особенности, получение хромосомостацифичных ДНК-зондов па все хромосомы человека, создали реальные предпосылки для диагностики дополнительных (маркерных) хромосом. Использование ДНК-зондов при проведении гибридизации In situ позволяет установить молекулярный состав добавочных хромосом и, следовательно, их происхождение, а также определить тактику проведения пренатальной диагностики в семьях при повторных случаях. Разработка молекулярно-цитогенетических методов дала реальную возможность для диагностики, тех случаев хромосомной патологии, встречающейся при недифференцированной умственной отсталости, которые трудно идентифицировать традиционным! цитогенетическими методами. Изучение недифференцированных олигофрений и супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом (рождение детей с MBIIP и/или MAP, спонтанные аборты на всех сроках) на молекулярном уровне является принципиально новым направлением в медицинской генетике. Использование хромосомоспвцифичных ДНК-зондов позволит решить ряд теоретических и практических задач в области изучения данной патологии.

Цель исследования. Основная цель исследования - разработка молекулярно-цитогенетических подходов к диагностике хромосомной патологии, связанной с недифференцированными формами умственной отсталости с МВПР и/или MAP, для повышения эффективности диагностики и использования в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики. В этой связи в работе ставились и решались следующие задачи:

1. Установить частоту хромосомных аномалий и вариантов у больных с недифференцированными формами умственной отсталости, МВПР и/или MAP (I группа).

2. Определить частоту хромосомных аномалий и вариантов у супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом (с рождением детой с психомо-

торной задержкой развития и МВПР и/или МЛР, хроглосомной потолопьП, а также со спонтанными абортами на разных сроках беременности) (П группа).

3. Разработать и апробировать'комплекс методов молокулярно-цитогено-тической диагностики хромосомных аномалий, основанной на гибридизации хромосомоспецифичных ДНК-зондов с хромосомной ДНК человека в условиях In SitU.

4. Определить показания к проведе.чию молекулярно-цитогонетической диагностики в 1-ой и 2-ой грушах.

5. Оценить возможности молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных анеуллоидий на интерфззных культивируемых и некультивируемых клетках.

6.' Разработать молекулярно-цитот:енетический метод пренаталыюй диагностики анеуплоидий, используя нативше цитологические препарата клеток ворсин хориона, на'основе применения хромосомоспецифпчных ДНК-зондов.

7. Провести молекулярно-цитогенетическое исследование хромосом у больных с недифференцированными фирмами умственной отсталости и у супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом в случаях: а/ добавочных (маркерных или мини-) хромосом для выяснения их происхождения и определения генетического состава: б/ сложного хромосомного мозаицизма (когда у больного имеется небольшое количество аномальных клеток) для уточнения диагноза; в/ сложных хромосомных нарушений с вовлечением многих хромосом для идентификации хромосом; г/ аномалий хромосом, связанных с разрывом в гетерохроматиновых участках, для уточнения точек разрыва.

8. Оценить возможность применения метода молекулярной гибридизации с использованием клонированных "классических" сателлитных ДНК, . специфичных для гетерохроматиновых районов Iqh+, 9qtn, при анализе происхождения хромосом, определения зиготности близнецов, определения отцовства при проведении генетических исследований. . Научная новизна результатов исследования. До проведения данного исследования в отечественной и зарубежной литературе но было работ, касающихся молёкулярно-цитогенетической диагностики хромосомной патологии.

В д'Ц:!юЛ работа научно рззраоотана и апробирована тактика

проведения модекулярко-цитогенетической диагностики, основанная на иопользсьашш кс'дпдл:са методов для идентификации хромоеомзшх аномалий в про- и постнат&шше период.

Предложена оригинальна]! модификация метода получения цитологических прийраюв для гибридизации иуклеиношх кислот 1л зНи в пренатальной ппагностико. УшПицирован метод проведения гибридизации 1п оНи для препаратов хромосом культивируемых лимфоцитов и фиброфшетов, а т'иако цитологических препаратов клеток ворсин хориона применительно к кляштскэя ш!тогы»тик.;. На основе проведенной работы выявлены показания к молекуг.ярно-'ЦитогенотичэскоП постнатальиой диагностике хромоесляшх оиомчлий и предложи метод количественной оценки гиориди-зикиа нуклеиновых кислот 1п й1Ш для аномал;:!! хромосом с точками разрыва в околицентрсморвом г.П'орохрематине.

Принципиально виши является разработанный подход к «.-'лс-кулярному анализу происхоэдзюм» добавочных маркерных хромосом в карислипе ребенка с задпрккой психомоторного развития и !.«ВПР и/или МАР, а также их !{»--1?отипи'юпп1 нормальных родителей.

Принципиально новым является положение о необходимости проведения молекулярно-цитогенетнчеекой диагностики в случаях: 1/маркер:шх хромосом, С/сложного хромосомного мозаицизма, 3/ участия нескольких (до пяти} хромосом в изменении кариотила, 4/ разрыва в аномальных хромосомах в их гетерохроматиновых околоцентромерных участках (сбалансированные и несСалансировашшо транслокации, делецки).

На примере исследовании нормальных (46.ХХ и 46,ХУ) некультивл-руемых клеток ворсин хориона и культивируемых лимфоцитов получены новые датше, свидетельствующие о возможности диагностики хромосомных апсуплоидий в интер^азных клетках.

Предложена схема мол-зкулярио-иитогонзтичоской про- и пастнатальной диагностики хромосомной патологии (рис.1).

Практическая значимость результатов. Результаты исследования отра-ражаюг развитие нового нштравлония.а именно, молекуллрно-цитогенети-ческсй диагностики хромосомной патологии, в основе которого лежит использование комплекса методов, основанных на использовании хромоео-

моспецифичных ДНК-зондов и гибридизации нуклеиновых кислот In situ.

Новый молекулярный подход к диагностике недифференцированных форм умственной отсталости с МВПР и/или MAP, связанной с ранее недиагности-руемыми нарушениями хромосом, "повышает эффективность профилактических мероприятий и, в первую очередь, эффективность медико-генетического консультирования.

Разработанная схема проведения пре- и постнатальной молекулярно-цитогенетической диагностики хромосомных нарушений у детей с • недифференцированными формами умственной отсталости и МВПР и/или MAP повышает эффективность диагностики хромосомной патологии.

Важное практическое значение имеет разработанный подход к молекулярному анализу происхождения добавочных маркерных хромосом.на основе коллекции хромосомоспецифичных ДНК-зондов на все хромосомы человека. До настоящего времени в мире данный анализ не проводился.

Разработаны дифференцированные показания к проведению молекулярно-цитогенетической диагностики, что повышает эффективность медико-генетического консультирования и определяет правильную тактику проведения пренатальной диагностики.

Большое практическое значение имеет обоснованный подход к диагностике анеуплоидий хромосом в интерфазных клетках, что существенно упрощает анализ и делает его более эффективным.

На основе разработанного подхода к диагностике предложен способ анализа сложных случаев хромосомного мозаицизма с небольшим- числом аномальных клеток, при котором молекулярно-цитогенетические методы помогают адекватно определить наличие аберрантного клона клеток при помощи интерфазного анализа.1

. Результаты нашли отражение в авторских свидетельствах, многочисленных работах в отечественной и зарубежной печати..

Положения, выносимые на'защиту.

В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие. положения:

I. Научно обоснованы показания к проведению молекулярно-цитоге-нетических исследований в отдельных случаях хромосомных аномалий, связанных с недифференцированными формами умственной отсталости с МВПР и/или MAP.

2. Более 20% случаев всей хромосомной патологии требуют проведения молекулярно-цитогенетической диагностики с целью постановки или уточнения диагноза.

3. Разработана схема проведения молекулярно-цитогенэтического анализа в про- и постнатальной диагностике.

4. Проведенные на большом цитологическом материале исследования дают основания считать научно обоснованным и приоритетным в пре- и постнатальной диагностике для молекулярного анализа использовать интерфазные клетки.

■5. Разработана тактика проведения анализа происхождения добавочных (маркерных, мини-) хромосом человека при использовании хромосомоспецифичных ДНК-зондов. По сравнению с классическими цитогеиетическими методами, которыми невозможно классифицировать • маркерные хромосомы, предложенный в работе метод позволяет эффективно определить их генетический состав и происхождение. ,

6. Выявление гиперполиморфизма для гетерохроматиновых районов хромосом с , 9qhf, 164(1+ на осново использования ДНК-зондов, содержащих клонировашше "классические" сателлитные ДНК человека, позволяет проводить определение зиготности близнецов, отцовства в генетичоской практике.

Внедрите в практику.

Результаты исследования апробированы и внедрены на кафедре медицинской генетики ЦОЛИУВ (г.Москва), на кафедра медицинской генетики Государственного Института усовершенствования врачей (г.Киев), на кафедр; биологии и генетики Ташмединститута (г.Ташкент), в лаборатории молекулярной генетики Карлова Университета и в отдела цитогенотики Института развития ребенка (г.Прага, ЧСФР), в отделе медицинской генетики Университета г.Ульма (ФРГ), в институте генетики человека Университета г.Эссена (ФРГ), в межобластном медико-генетическом центре (г.Хмельницкий). Основные положения исследования вошли в отечественные и зарубежные печатные работы, изобретения, которые будут использоваться в научно-исследовательских институтах и медико-генетических центрах страны. . .

Материалы диссертации применяются в учебном процессе на кафедрах

медицинской гонотики Институтов усовершенствования врачей (г.Москва и г.Киев), на кафедре биологии и генетики Ташмединститута (г.Ташкент).

Апробация работы.

Материалы работы доложены на 1-м и 2-м съездах медицинских генетиков (г.Киев,1984г. и г.Алма-Ата,1990г.); 2-м съезде акушеров и гинекологов (г.Душанбе,1905г.); 20-м и 22-м цитогонетическом симпозиуме (г.Брно,1987г. и г.Братислава,1989г., ЧСФР);7-м и 8-м Всесоюзном научно-практическом семинаре "Хромосомныо основы нарушений развития у человека" и "Современные методы цитогенетических исследований" (г.Харьков, 198бг и г.Тбилпси,1938г); 5-м съезде 1ЮП1С (г.Москва,1987г); Международных рабочих совещаниях но картированию генома человека (г.Париж, Франция,1987г. и г.Нью-Хейвен, США,I989г.); 1-м и 2-м Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (¡'.Кембридж и г.Лондон, Великобритания,1989г. и 1991г.); Всесоюзной конкуренции "Хромосомы человека в норме и патологии" (г.Москва,1988г.); пленуме Всесоюзного научного общества медицинских генетиков "Диагностика и профилактика наследственной патологии: теоретические и практические аспекты" (Москва,1939г.); Международном симпозиуме "Трансмиссия хромосом и митоз" (г.Ленинград,1990г.); Всемирном конгрессе по ранней внутриутробной диагностике (г.Прага,ЧСФСР,1990г.); Всесоюзной научно-практической конференции "Пренатальный и неонаталышй скрининг врожденной и наследственной патологии" (г.Харьков,1990г.); Ученом Совете Г.ОШИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РСФСР (г.Москва, 1988г. и 1990г.); 7-м Всесоюзном совещании "Структура и функция хромосом"(г.Пущине, 1991г.), 3-м съезде генетиков человека Германии (г.Ульм.ФРГ, 1991г.); Международном конгрессе-по генетико человека Европейского общества генетиков человека (г.Левен,Бельгия,1991г.); 2-й Всесоюзной научно-практической конференции по цитогенетике человека (г.Москва, 1991г.); 2-й Всесоюзной конференции "Геном человека - 91" (г.Пере-славль -Залесский,1991г.); 8-м Всемирном конгрессе по генетике . человека .(г.Вашингтон,США,1991г.).

Публикации. По томе диссертации опубликовано 73 работ, из них 27 -в зарубежной печати. Материалы исследований дважды представлены на ВДНХ в 1988 и 1989гг. Награждены серебряными медалями. По теме диссертации имеется два авторских свидетельства на изобретения.

Структура работа.. Диссертация излокена в настоящей брошюре в форме научного доклада. Основные результаты получены лично автором. В разработке методов, получении и обсуждении результатов принимали участие: Ю.Е.Вельтищев, Ю.Б.Юров, Е.Пассарге (ФРГ), Л.З.Казанцева, И.А.Демидова, И.А.Александров, А.Шмидт (ФРГ), А.К.Берешева, Н.В.Вехова, Н.Н.Бурова, Г.В.Дерягин, С.П.Миткевич, Т.Э.Зерова. Всем коллегам автор выражает благодарность за помощь в работе.'

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования.

Для решения поставленных задач тактика исследования была построена следующим образом. Кариологически обследовано 1333 ребенка,стрн дающих недифференцированной фермой умственной отсталости, МВПР и/iим MAP (¡группа), а также 251 супружеская пара (502 индивидуума), имеющая отягощенный акушерский анамнез (2группа).Общее число обследованных составляло 1835. Креме того, обследованы индивидуумы контрольной группы, состоящей из 102 здорот детей и 50 (100 индивидуумов) супружеских пар, у которых не было показаний к проведений цитогенетической диагностики или имеющих здоровых детей. Каждому ребенку и взрослому было проведено традиционное цитогенетическое исследование по показаниям, принятым в клинической генетике. При цитогенетическом исследовании применяли методы культивирования лимфоцитов периферической кроЕИ и фибробластов кош, фиксацию клеток на стекле, общепринятые способы дифференциального окрашивания клеток (Q-, G-, С-методы), анализ кэриотипов под микроскопом при увеличении Х1250. Молекулярно-цитогене-тический анализ был проведен в тех случаях, где цитогенетическая диагностика была затруднена. На основе полученных данных разработаны показания к проведению молекулярной диагностики. Среди 1835 (I и 2 груша) цитогенетически обследованных индивидуумов в 211(11,58) случаях обнаружены хромосошше аномалии, а в 64 (28,Эй) проведена молекулярно-цитогенетическая диагностика по показаш!Я.ч. Причем, в I группе среди 181 случая обнаруженной хромосомной аномалии молеку-лнрно-цитогенетичесний м-лод сил положительно применен у 42 (23,2,i) (рис.51, а во 2 rpynw (рас.'i) сриди шявлешшх 30 хромосомных нарушений - у 13 iDWKiWOb (42,3í i (в основном, случаи хрсмсссмиогс моза-

шдазма). Для идентификации хромосом в метафазных или интерфазных клетках, а также для уточнения точек разрыва в аномальных хромосомах использовали коллекцию альфоидных и "классических" сателлитных ДНК, полученную в лаборатории цитогенетики ВЩ психического здоровья АМН СССР (Юров,1987). Коллекция включает хромосомоспецифичные ДНК-зонды практически на все хромосомы человека,в частности, хромосомы 1,3,4,5, 6,7,8,9,10,II,12,13,14,15,16,17,18,19,21,X,У (Александров и др.,1986; Yurov et al.,1989). Альфа-сателлитные последовательности ДНК со спецификой для хромосом 8,12,14,16,22 и У любезно предоставлены американскими коллегами из коллекции АТСС (American Type Cell Collection). ДНК-зонды, содержащие клонирование "классические" последовательности ДНК, специфичные для хромосом 1,9,15,16 и У любезно предоставлены зарубежными коллегами (Cook.Hlndly, 1979; Deininger et'al.,1981; Moyzis et al.,1989). .

.. В работе использовали метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ с некоторыми модификациями (Gall,PardueJ971; Юров,1984) В пренатальной диагаостике использовали цитологические препараты клеток ворсин хориона, фиксированные на стекле /способ отпечатков/ (Ворсанова и др.1987). Нами разработана схема проведения пре- и постнатальной молекулярно-цитогенетической диагностики (рис.1). Для определения числа хромосом в-интерфазной и/или метафазной клетке после проведения гибридизации и радиоавтографии определяли число скопления метки над хромосомой (число кластеров), а для уточнения точек разрыва в околоцентромерных гетерохроматиновых участках аномальных хромосом подсчитывали число зерен серебра в каждом кластере. Результаты анализировали с помощью стандартных статистических методов (Урбах, 1975).

. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСЩЕНИЕ.

Цитогенетические исследования.

При проведении цитогенетического исследования у 1333 детей

Дгруша/ с недифференцированной олигофренией, ШШР и/или MAP у 181 <13,61) били обнаружат громооомные аномалии, среди которых структурно нврупения аутсссм - у 56 (4,2%), численные нарушения аутосом - у 80 (6,ОХ), численные аномалии гоноссм - у 45 (3,4%). Среди 251 супружеской пари (502 индивидуума) с отягощенным акушерским анамнезом /2 груша/ у 17 (3,4$) обнаружены сбалансированные аномалии аутосом и у 13 (2,62) -мозаичные случаи аиоиалиЯ гоносои. Б I п 2 группах показан Taicse удельный вес экстремальных хромосомных вариантов. В I группе ореди 1333 детей у 153 (11,851) обнаружены следующие хромосомные варианты:. Iqh+ у 39 (2,9%);9qh+ у 94 (7,0536); I6qh+ у 25 (1,9«). Во 2 груше обнаружены хромосомные варианты у 67 (13,41): Iqh+ у 21 (4,2%); 9qh+ у 37 (7,4Ж); I6qh+ у 9 (1,8%).В контрольных грушах не обнаружено хромосомных аномалий, а хромосомные варианты встречались в контроле для I группы в 2,95Х (1- lqh+,2- 9qh+) и для 2 группы в 2,0% (2- 9qbt). Сравнивая наши данные с литературным;!,обращает на себя внимание более высокие показатели наличия хромосомных вариантов во 2-й груше. Возможно это связано с более корректны!,! отбором супружеских пар для проведения онтогенетической диагностики. В I и во 2 грушах чаще встречаются хромосомные варианты 9qh+, затем Iqh+ и I6qh+. Данные с анализом всех хромосомных аномалий и наиболее часто наблюдаемых хромосомных вариантов в 1-й и 2-й груше на большом материале в литературе не встречаются.

Среди хромосомных аномалий в 1-й и во 2-й грушах встречались как численные (различные анеуплоидии, в т.ч. добавочные мини-хромосомы), так и структурные (транслокации, делецки, дупликации). Причем, во многих случаях невозможность идентифицировать хромосомные аномалии (маркерные хромосомы, гоносомный мозаицизм с небольшим клоном аномальных клеток, участие в перестройках более двух хромосом) и уточнить точки разрыва в гетерохроматиновых' районах (сбалансированные и несбалансированные перестройки) аномальных хромосом была очевидна. В подобных случаях применялись молекулярно-цитогенетические исследования.

Молекулярко-штогенешескпе исследования.

В 42 случаях (I группа) требовалось применение молекулярно-цитогенетических методов с целью постанови! или уточнения онтогенетического диагноза. Из них:'II случаев с маркерной добавочной хромосомой; II - гоносомного мозаицизма; 6 - различных транслокаций и делеций; 2 - определения хромосом, участвующих в перестройке; 10 - ломкость хромосом 6 и X, 2 - анеуплоидию аутосом (табл.З). В случаях различных транслокаций и делеций использовали ДНК зонда на хромосомы 1,9,15,17,18 и У, которые имели следующие названия в коллекции: альфа-Ш-14, pPD-9, pPD-18, pYAM7-28, pBRHS - 13, pHY 2.1 (соответственно). В случаях гоносомного мозаицизма применяли ДНК-зонда на X и У хромосомы (pYAM 10-40 и pHY 2.1, соответственно). При анализе маркерных хромосом применялись ДНК зонда практически на все хромосомы человека. Использовали из коллекции все ДНК-зонда для определения хромосом, участвующих в перестройке хромосом кариотипа. При ломкой хромосоме X применяли ДНК-зонд pYAÜ - 10-40 (авторское свидетельство 1494724). Обнаружена экспрессивность ломкости хромосомы X от 3 до 12%-(табл.1). Кроме того, в трех случаях обнаружена ломкость хромосомы 6 от 2 до 5Ж. Ломкие хромосомы в кариэтипэ человека принято анализировать с помощью классических методов цитогенатического анализа. Однако трудоемкость данного способа их выявления, связанная с необходимостью применения последовательно рутинной и G-окраскп, приводит к потере метафаз, необходимых для учет экспрессии ломкости хромосом. Применение молекулярных методов диагностики синдромов, связанных с ломкость» хромосом (в частности, хромосом X),'осложняется повышенной частотой рекомбинации ДНК в'этих районах (Bell et al.,1989). Наиболее перспективным является молекулярно-цитогенетический метод, благодаря которому маркируется определенная хромосома в кариотипе с последующим ее цитогенетическим анализом при рутинном окрашивании. В наших случаях при применении

датогенетического метода ломкие хромосомы не выявлялись (шш наблюдались в 2-2% клеток). Тагам образом, молзкулярно-цитогенвтнчэ-:кий метод повышает эффективность выявления ломкости хромосом. Токазанием к проведению этих исследований является отсутствие ломкости (или незнз'штельнэя ее экспрессивность) при типичной клинической <артине после проведения щ1тогенетической диагностики.

Креме того, метод гибридизации нуклеиновых кислот In situ применен тренатально на клетках ворсин хориона (Ворсанова и др.,. 1989), лепользуя ДНК зонд pYAM - 10-40 для определения пола плода о случаях-:цвплешшх с полем болезней. Исследованы клетки 24-х нзтиеных образцов зореин хориона. -Обнаружены 13 плодов венского и II мужского пола. Некоторые образцы исследовали ДНК зондом pHY - 2.1 (хромосома У) для Ее-рпфнкеш-ш полученных данных /8 образцов/. Ошибки в диагностике пола но эбнаружено. Важно подчеркнуть необходимость применения в пренаталыюй диагностике У-специфпеского зонда с целью исключения синдрома Лерешевсксго-Тернерз (моносомии по хромосоме X) при обнаружении в клетках одной хромосомы X. Пренатально анализировали интерфазные клетки Как было отмечено выше, данный молекулярный метод позволяет анализировать и метафазные и штерфазные хромосомы. Это положение с одной стороны важно для пост- и пренатальной диагностики (не требует трудоемкого приготовления препаратов хромосом, ускоряет постановку диагноза), с другой стороны - очень ответственно и требует экспериментальной проверки. С этой целью у четырех индивидуумов и двух плодов на 14806 интерфазных клетках проведен анализ возможности использования их в целях выявления хромосомной патологии (ДНК-зонд pYAM -10-40). В' этой части исследований определяли соотношение частот ядер с различным числом скоплений (кластеров) гранул радиоактивной метки, а в небольших выборках клеток определяли также число гранул серебра в каждом кластере и при помощи окуляр-микрометра измеряли диаметр ядра. В ядрах клеток с кариотипом 46,XX наряду с двумя кластерами, встречались и другие, а при половой кснстг^ции <ш,ХУ обнаружили один (в основном) или два кл&етеря пабл.2). У:::-сиНмса число кластеров, характерное для

тетраплоидных клеток, является следствием полиплоидизации. Диаметр

такого ядра больше диаметра диплоидного болов чем на ЗОЖ. Кроме того,

в ряде случаев имеет место слияние кластеров в пределах ядра, число зерен которых вдвое превышает число гранул в одном кластере и приблизительно равняется сумме гранул (табл.3). Таким образом, показано, что более 951 ядер с одним кластером и более 85Ж ядер с двумя кластерами обнаружены в диплоидных мужских и женских клетках соответственно. Проведенный статистический анэлиз позволяет сделать заключение о наличии в клеточной популяции тетраплоидных ядер при нормальном мужском я женском кариотипе, а также о слиянии отдельных кластеров в части клеток, которое согласуется с ассоциациями и наложениями хромосом в интерфазном ядре (табл.2 и 3). Следовательно, с учетом данных явлений анализ интерфазных ядер позволяет достоверно определять число хромосом X в клетках.

. На основании интерфазного анализа хромосом после гибридизации нуклеиновых кислот In situ были поставлены диагнозы мозаицизма в 24 из 33 случаев "(табл.4). Среди них 16 случаев синдрома Шерешевского-Тернера, 3 - синдрома Клайнфельтера, 3 -трипло-Х, I - дисомии У, I - полисемии X. Аномальный клон присутствовал в клетках от 10 до 20%. Среди хромосомных синдромов, связанных с численными аномалиями хромосом, наиболее часто встречаются гоносомные синдромы. Общая частота их составляет около 4,5 на 1000 новорожденных детей (Harper, 1981). Мозаичные случаи создают трудности при постановке диагноза, потому что аномальная клеточная линия (или аномальный клон) может быть утрачена при однократном (иногда и при повторном) цитогенетическом исследовании. Частота мозаичных форм данных заболеваний по разным авторам противоречива. Например, частота мозаичных форм синдрома Шерешевского-Тернера, достигает 82% (Hassold et al.,1988; Muller et al.,1987), где речь идет о незначительном клоне нормальных клеток. Авторы отмечают, что только молекулярные методы могут установить скрытый мозаицизм у больного. Диагностика синдрома Тернера •при незначительной доле аномального клона (до 15-20$) клеток у боль-

него требует е«е более тщательных исследований для медико-генетического консультирования. Трудности при медико-генетическом консуль-, тировашш обусловлен тем, что такие больные чаще способны воспроизводить потомство, чем больные с полной формой гоносомных синдромов. А мехду тем, женцины с мозаицизмом по полоеым хромосомам илеют высокий риск неблагоприятного исхода беременности (спонтанные аборты,ровдйнпз детей с МЗПР ц/или ПАР) /Бушевская.Выговская 1930/. Кроме того прослеживается наследственная предрасположенность к нерасхожденни половых хромосом (Тзиапз et а1., 1975; Шка ег а1.,1975; Сивгглп- • То1еп(Загю е1 а1., 1976; Шлюп, Ьегоу, 1983; Бужзвская,Выговская,1990), что говорит о необходимости тщательного молекулярно-цитогенетического обследования супружеских пар, дети которых страдают гоносонтш синдромам». Тагам образом, эффективность молекулярной диагностики г.::закчкшс гонэссглшх синдромов очевидна, и получение над дпгаяю хорошо эго иллюстрируют (тзбл.4). Показания;,-.и к проведение ы-.п иеглодепшка у пробанца является наличие клинической карттш , несмотря на отсутствие аномальных клеток при цитогензтическсм ацалаз'.;, и длл супружеских пар - наличка гсноссшсго синдрома у их ребенка.

Следует одажь, что пиритизацию нуклеиновых кислот 1п зИи ??•>•• и-: оценить как качественно: один кластер (скопление метка) - одна хромое-;.!;!, так и количественно, подсчитывая число зерен серебра в еднои кластере (Уогаапоуа сЛ а1.,19йб). Как еидно из таблица 1 во всех случаях сбалансированных и несбалансированных трзнслокацкй бнлп проведены шлекулярно-цитогенотачеекке исследования. Среда них такие как трзасдокацка 1/17, 15/18 (два случая), делещи хромэссш 18р (два случая), игохрскэесш 13 и X. Так в случае патогенетически сбаланскро-ваниеЗ трзнслокшш у 10-летнего мальчика (каризпш 46,ХУД(1 ;17) (Ч12м:?5) пли (^12;:17я25—»Ц1ег) с глзшческсЗ картиной, нагкчш-нате^а Фяктш п}>?ксгсшьну» дедензв Гц, обнаружены тзчте рвзргша в области ьюри игй пер-лихл-и зле л птрг.к?.-] рЗлш х;/ихгта I и г'.К'МойГ] утрата гг.{.гр->>р' гино:г'лоцшла х; .г. ;глч.: I (р'.'.с.Г1 ).

те

При несбалансированной транслокации 15/18 (кариотип 46,ХУД(15;18) ^ег—«еп—»р1ег::р11 — >-сеп—у пробанда после молекулярно-цитогенетического исследования обнаружена утрата не только короткого плеча (как было принято считать после классической онтогенетической диагностики),но и часта околоцентромерного гетерохроматина хромосомы 18 (табл.5 )• Из таблицы видно, что число зерен серебра над нормальной по сравнению с транслоцированной хромосомой 15/18 при использовании ДНК-зонда на хромосому 18 (рВИНБ 13) достоверно меньше (р < 0,001). Следует отметить, что околоцентромерше районы .в транслокациях хрмосом 15 пробанда и 15 и 18 его матери полностью сохранены. Число зерен серебра над нормальным!! 15 (применялся ДНК-зонд рРБ - 18), 18 (рВИНБ 13) и транслоцированной 15/18 хромосомами не отличалось. При количественном анализе чисел зерен серебра над гомологичными хромосомами 18 при делеций короткого плеча этой хромосомы оказалось, что наиболее интенсивно гибридизация проходила в нормальной хромосоме 18 (ДНК-зонд рГВИНБ 13), в то время как аномальная хромосома имела достоверно меньше число зерен серебра (р < 0,001) /табл.6/. При статистической обработке определяли ошибку средней и стандартное отклонение, сравнивая средние значения по ^критерию Стьюдента.

При анализе полученных данных в случае изохромосомы 18Л}/ (кариотип 46,ХХ,118^/) установлено, что изохромосома содержит два не измененных длинных плеча, большую часть околоцентромерного гетерохро-матина обеих хромосом,а полностью утрачены два коротких плеча (табл.?) Обнаружено в 1,5-2,0 раза больше зерен серебра.над изохромосомой 18 (р ■ < 0,001). Аналогичная ситуация наблюдается в .двух случаях образования изохромосомы Х^/. Таким образом, в случаях структурных перестроек с точками разрыва в гетерохроматине околоцентромерных участков хромосом для уточнения диагноза.(точек разрыва на аномальных хромосомах) показано проведение молекулярно-цитогенетической диагностики. Полученные данные следует накапливать и учитывать (особенно случаи сбалансированных перестроек при клинической картине хромосомных

синдромов), т.к. сусестЕует среди ученых мнение о том, что это явление можно объяснить функциональным действием генов в результате произошедшей структурной перестройки, изъявшей ген из обычного окружения в хромосоме и перенесшей его на новое место в другую часть хромосомного набора. Это явление известно из опытов на дрозофиле , как "эффект положения генов" (Прокофьевэ-Бельговская, 1936). Возможно, что хромосомные варианты 1qh+,9qh+,16qh+ в группе детей с недифференцированной умственной отсталостью с (¿ЕПР и/или MAP можно объяснить ,тем же эффектом. Естественно, что для исключения других альтернативных объяснений данных ситуаций необходимо более широкое молекулярное исследование подобных случаев.

Анализ кариотипа и происхождения маркерных хромосом проводили в лимфоцитах периферической крови у II детей и в четырех случаях из mix также в клетках кожи, культивируемых стандартным! методами (Ворсанова, 1976). Вначале идентнфящгровали хромосомы при помощи дифференциального окрашивания (G-, Q-.C-метода).

Во всех исследованных случаях эти методы не позволяли идентифицировать происхождение маркерных хромосом. Для анализа их происхождения с помощью коллекции хрсмосомоспецифичных ДНК-зондов применяли следующую оригинальную тактику: I зтап - предварительная гибридизация In situ с ДШ-зондпми, которые в специфичных условиях эксперимента маркируют строго определенные группы хромосом (гибридизация в смеси 2xSSC, 50i формамид, 37°С): а/ хромосомы 1,3,5,6,7,10,12,16,19 и в меньшей степеш! все акроцентрические хромосомы человека (ДНК-зонд pHS05; Яковлев,1983; Юрсв и др.1990);' б/ хромосомы 2,4,8,9,18,20 (ДНК-зонд pBRHS 13; Александров и-др.,1986; Vorsanova et al.,1986); в/ хромосомы 1,11,17,Х (ДНК-зонд pYAM 10-40; Александров и др.,1986; Юров и др., 1989); г/ хромосомы 1,9,У и все акроцентрические хромосомы человека (ДНК-зонд pPD9) /Delnlnger et al.,1979; Юров и др.,1986/.

Эта серил экспериментов позволяет предварительно определить принадлежность маркерной хромосомы к специфической группе хромосом и цельнаправлошю продолжить идентификацию маркеров с использованием

ТВ

ограниченного числа ДНК-зондов на центромерные районы хромосом человека. Таким образом, наличие сигнала (скопления' метки) но определенных хромосомах (пп "а,б,в,г") говорит о том, что надо использовать этот специфичный зонд в других ("жестких") условиях гибридизации.

2 этап - использование ДНК-зонда в специальных "яестких" условиях проведения гибридизации, когда эти пробы позволяют идентифицировать строго индивидуальные хромосомы этой группы (гибридизация в смеси IxSSC, 50Ж формамида при 42°С).

3 этап -'подсчет зерен серебра и построение гистограмм для анализа происхождения хромосом (рис.. 3).

Как видно на рис.. 3, табл.8 и I маркерные хромосомы были der 7,9,9,13,21,21,21,ХД,У. В одном случае происхождение хромосом установить не удалось.

. Такая тактика диагностики наиболее эффективна при анализе маркерных хромосом, для которых нет предварительной информации об их возможном происхождении. Следовательно, используя данную тактику удается избежать простого поочередного "перебора" всей коллекции ДНК-зондов (на 24 хромосомы) с целью ускорения постановки диагноза и уменьшения числа экспериментов для снижения их стоимости. Полученные данные свидетельствуют о том, что наличие маркерной хромосомы во всех случаях является показанием для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики. Она особенно значима в тех случаях, где маркерная хромосома прослеживается в семье, для определения • тактики проведения пренатальной диагностики.

Комбинируя цитогенетический и молекулярно-цитогенетический метод анализа аномалий хромосом, установлено участие отдельных хромосом в сложных транслокациях (46,XX,t(3,8,10,11,22); 4б,ХУД(13,16,У) /табл.1/). Наличие в кариотипе больного неустановленной цитогенети-чесгащ методами перестройки является показанием к проведению молекулярно-цитогенетической диагностики.

При применении хрзмссомэотецифгшго ДНК-зонда (рБННЗ 13) обнаружено три скопления матки (три кластера) в интерфазах, подтверадащие диагноз синдрома Здвардса (трисс-мия по хромосо ме 18). Причем, в 45% клеток наблюдал! три кластера, а в 552 -два, что соответствует трем и двум хромосомам 13 (мозаищзм).

При использовашш ДНК-зонда, специфичного для хромосомы 9, нами был подтвержден диагноз трисомии 9 у новорожденного ребенка (ДНК-зонд рРВ 9). При учете различных анеушюидий, в том числа хромосом 9 и 18 необходимо считать каждое скопление мотки -кластер.

С целью молекулярного изучения околоцентромерных участков хромосом, которые довольно часто встречаются при недифференцированных Торгах умственной отсталости, применяли ДНК-зснди (рис1.Т7/Н.Соок,Е<11 пьигб,ЦК/; &1рйа Й1-7/Уигоу М а1.,19&9/ и рУД"' 11-39/Александров и др., 1965/; рРО 9/Бе1п1п£С-г е1 а1.,1981/), сно-цифпчннз для хромосомы I и 9. На гистограшэ рис Л на примере 9;])и при анализа распределения зерен серебра по длине хромосомы 9 с увеличенным районом вторичной перетяжки /"а" и "в"/ и нормальной хромосомой 9 /"б" и "г"/ видно, что после гибридизации 1п аНи с. ДНК-50ИД0М рУАМ 11-39 /"а" и "б"/ - альфоидная ДНК и рР1) 9 /"в" и "г"/ -■ "классическая" сателлитная ДНК число зерен серебра различно. Эта вариабельность, вероятно, отражает цитологический полиморфизм С-гетерохромзткна (большее число копий соответствует оолгллн.м по размерам С-сегментам). Причем, при исследовании контрольной группы (20 здоровых детей) гистограммы были аналогичны. Не еле гибридизации с альфоидной ДНИ /зонд рУАй 11-39/ над центромерам рсйоисм хромоссш &qh^ имеется в среднем 57 зерен серебра, п в гомологичной хромосоме над районом qh - 51 зерно /'А'*'-- '.',£3; ц г 2,717; р < 0,01/. После гибридизации с "классической" сз1--ллитн:3 ДНК /згнд рИ» 9/ над районом ¡сдается тги ?:-{.с-:1 гого' рп, а в г т.'ЬГй'Шсй хрпюггй над ряйжи 1-й); - 73 зерна /!/ 33, !:•;. а ^ 5,70; р <<' О.и'ХЛ/. 'Гакгм опргют., гетерм (-{нем г .'гл т; и . ¡: я" 9 ш^ч с дедтгМ с р"'5-

го

i.км увеличением (более чем в 2 раза) числа копий "классической" овт9ллитной ДНК, выявляемой о помощью ДНК-зонда pPD 9. Кроме того, полиморфизм по содержанию "классической" сателлитной ДНК не связан с вариациями альфоидной ДНК - эти два типа повторяющихся последовательностей ДНК варьируют незйвисимо друг от друга.

Для гетерохроматиновых районов хромосом характерно два различных типа полиморфизма на молекулярном уровне -по числу копий повторяющихся последовательностей ДНК и по длине фрагментов рестрикции (ПДРФ) /Сров,1988; Демидова,ВорсаНова,1990/. Поэтому в дальнейшей работе также исследовали рестрикциошшй полиморфизм, выявляемый с помощью ДНК проб рШ.ТТ и pPD 9 (хромосомы I и 9) и рестриктаз Bam Н1, EcoR 1 и Taq 1 (соответственно) /Рогаев,Юров,1990/. В данной части работы с помощью метода гибридизации по Саузерну (Southern,1975) нв'примере хромосомы I проведен поиск рестрикционного полиморфизма клонированного фрагмента "классической" сателлитной ДНК человека (клон pUC1.77). При использовании рестриктаз Bam HI u EcoR 1 обнаружен ранее неизвестный гиперполиморфизм фрагментов рестрикции для данного зонда. На примере пяти семей (19 членов) показано кодоминантное менделевское наследование более чем 25 полиморфных фрагментов рестрикции различного размера (от 0,6 до 5 тыс. пар нуклеотидов ДНК).- В случае хромосомы 9 (зонд - pPD 9, рестриказа Taq 1) также показан гиперполиморфизм фрагментов рестрикции, размер'которых составляет от I до 3 тыс. пар нуклеотидов. Используя явление гиперполиморфизма, в работе проведено подтверждение монозиготности близнецов в случае диагностики у одного из них моногенного синдрома при стертой клинической картине у другого.

Таким образом, для данных двух проб, которые представляют "классическую'* сателлитную ДНК, характерна высокая степень полиморфизма по длине фрагментов рестрикции - гиперполиморфизм. Этот феномен позволяв' проводить выявление "генетического фингерпринта" при проведешп генотипоскопии (определение отцовства, зиготности), а также на основе стратегии сцепления картировать расположенные в этом районе гены и детализировать генетическую карту околоцентромерного района хромосомы I и 9.

2Т

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Хромосомная патология занимает ведущее место среди причин гибели эмбрионов или плодов, в общем числе НВПР и/или MAP у новорожденных. Более 40% спонтанных абортов на разных'сроках обусловлены хромосомным дисбалансом. У 10-ти из 1000 живорожденных детей наблюдают хромосомные изменения. Среди причин МВПР и/или MAP у новорожденных до 4ВД составляют хромосомные аберрации. Роль хромосомной патодогии и перинатальной смертности также велика: примерно I ребенок на 1000 рожденных умирает от хромосомных аномалий. Доля погибших с хромосомными аномалиями в антенатальный, интранатальный и постнатальный периоды достигает более 16%, 4$ и 6% соответственно (ЕорсаноЕа, Юров, 1987). Все это объясняет необходимость эффективной диагностики хромосомной патологии, особенно в антенатальный период. Разработка методов дифференциального окрашивания хромосом по длине (G-.Q-, С- и другие метода) и внедрение их в практику клинической цитогенетшш сделала решающий шаг на пути к точной пре- и постнатальной диагностике большинства хромосомных синдромов. Однако за преде лили точной диагностики оставались отдельные случаи хромосомной патологии такие, как маркерные хромосомы, сложный хромосомный мозаицизм, сбалансированные и несбалансированные структурные перестройки с точками разрыва в околоцентромерном гетерохроматине..Новые, молекулярные и молекулярно-онтогенетические, подходы к изучению хромосомной патологии, связанные с технологией рекомбинантной ДНК весьма перспективны для диагностики всех случаев хромосомных аномалий. Как показано в нашей работе, определение особенностей хромосомного набора без прямого онтогенетического анализа кариотипа стало возможным с использованием хромосомоспецифичных ДНК-зондов, характерных для определенных хромосом или их участков. При помощи таких зондов можно проводить диагностику сложных хромосомных перестроек (транслокаций и делеций), сложных случаев тканеього мозаипизма, опрс-двляя численные изменения гсносем и аутосом, маркерных н дичал хрсмоом. Так, в нздсб рп^оти в 12 случат

недифференцированных форм умственной отсталости с множественными врож-

дашшми пороиоми развития о цэлыо уточнения или поотяновки диагноза

применялись молекулярно-цитогенетические методы. При этом установлено происхождение маркерных хромосом в 10 случаях; утешены точки разрыва при 6-ти различных хромосомных перестройках; в II случаях у детей и в 13 - у взрослых (супружеские пары) обнаружен гоносомный мозаицизм, ранее неустановленный цитогенетическими методами (табл.1 и 4); уточнены хромосомы в двух сложных транслокациях; определена экспрессия ломкости аутосом и плюсом (Гга X и 6) в 10 случаях, а также установлена анеушшдия аутосом 9 и 18 в 2-х случаях (табл.1).Более 20$ случаев всей хромосомной патологии у детей нуждаются в молекуляр-но- цитогенвтпческой диагностике.

Особенно следует отметить проблему происхождения маркерных хромосом для медицинской генетики.Они представляют собой небольшие хромосомы, содержащие центромеру и небольшое количество хромосомного материала, происхождение которого почти невозможно установить с помощью стандартных методов дифференциальной окраски. Использование клонированных последовательностей сателлитной (высокоповторяицейся) ДНК при гибридизации нуклеиновых кислот 1п зШ позволило нам • определить состав околоцентромерных участков и, следовательно, происхождение данной хромосомы.Коллекции клонированных генов могут быть полезными для дальнейшего выяснения генетического состава этих хромосом и установления возможного дисбаланса по определенным генам.

■Важно также отметить, что клонированные фрагменты (ДНК-зонды), используемые в нашей работе, позволяют выявлять нормальные (или аномальные) гомологи хромосом не только в метафазных, но также и в интерфазных ядрах. Эта особенность, несомненно, привлекает внимание исследователей в области пренатальной диагностики, когда нужно максимально эффективно, в нативных цитологических препаратах клеток ворсин хориона установить пол или обнаружить хромосомную анеуплоидию. Высокая разрешенная способность молекулярных и молекулярно-цитогене-тических методов позволила нам разработать и примененить их в практике

гз

клплпчоекий генетики, медико-генетического консультирования и л] с!Л1 ной дитностики для идентификации хромосомной патологии.

В шютолщее время метоцы молекулярной гибридизации (гибридизыл'. И; :;1т и олот-гибридизации) с использованием клонированных Фрагмкн т;>з .ДНК (уи-зоидов) можно применять в случаях: идентификации хр..»лосом, вовлеченных в слсжныа хромосомные перестройки; уточнения ючок рпзриьа аберрштшх хромосом; анализа происхождения до<3авочнм> {^орк^ггшх) хромосом; сложного тканевого мозшщизма; аффективного 1.1!р.-д«Х(;Ш!:1 пола плода в первом триместре беременности на клетках 1<;:-рсил хориона при наследственных болеанях, сцепленных с полон; изучении цитологического и молекулярного полиморфизма готерохрсмя-типовых районов х{)омосс)м и возможной его связи с наследствешюй нтилопкй. Хрокоссмэвпсцифгпшв ДНК-зовди могут с успехом примениться для мышления и характеристики на молекулярном уровне всех хрнц'н\''1лшх ЙЮМШШЛ У ЧСЛ;>150Ка.

ii ы в о л и.

1. Нолшсулярночттогрнотические методы с испоят с-ованиьм xjwoortKiciii • щфгоои ДНК-зондов значительно расширяют юзмэжиостк выявления апо -мадий хромосом и позволяют получить диагностическую информации, недоступную ггри использовании классических цитогенотических методов. Колее 20% случаев аномалий хромосом, выявленных мотодамп классически цитогонетики, нуждаются в молекулярно-цитогенетичоских исследованиях с цель» уточнения или постановки диагноза.

2. Научно обоснованы показания к проведению тюдакуяярио-питогешти-ческой диагностики, которая особенно аффективна в тех случаях, когда методы дифференциального окрашивания не позволяют поставить точный диагноз.

3. Разработаны оригинальные методы молокулярно-цитогинотичеокой диагностики хромосомных аномалий, основанные из использовании гибридизации In cltu и клонированных хромосомоспецифичнпх альфа • ü "1слаосических" сателлитных последовательностей ДНК, которые Позволяют проводить идентификацию практически всех хромосом человека при широком спектре наиболее частых и социально значимых хромосомных нарушений: анеунлоидга, мозаицизме, сбалансированных и несбалансированных транслокациях, ломкости хромосомы X.

•1. Использование оригинального специфичного для хромосомы X ДНК-зонда рУАМ 10-40 (авторское свидетельство N 1494724) позволяет аффективно осуществлять прснатальную диагностику пола плода на нокультивируемых клетках ворсин хориона.

5. Определено происхождение маркерных хромосом в клетках 10-ти индивидуумов. Разработанная оригинальная тактика позволила классифицировать добавочные хромосомы на основе анализа молекулярного состава околоцентромерного гетерохроматика и определить их происхог-денио при недифференцированных фермах умственной отсталости у детей с врожденными пороками развития и микроаномо-лиями (der 7,9,13,15,X И У).

6. Удельный вес различных хромосомных аномалий в группо детой с

ь„ :•.■.;•;« р :!tiu)¡«.i.::H!¡oa c.j:¡;i'o;.pt_-a.i-;-n. шлйлевшм Ермшшшш iK.-j;.r-i.-лн! it или гак^ооношшмии развития составляет 13,ES от всох случыь, !¡.u:j •:!•..,;!. t'i.x un unfí t-iit-пгьское исследование, в том числе аномалий av'.oivM c-4j;y«íTy¡.них - и числишшх - 6,UJ; аномалий голосом -, о ; i.

7. Уд.ь'л ¡.ml ьоо ргкъачних xpt мэсмших аномалий в i'pynne суирухоскьн и:«р с u'i.iiсданшм аку&'р.'кш анамнезам составляет 6,0-б от ьссн. С1:«ч:к.н, и:,upa! ji.ii.-i.'i.jx на иитьгинвтаческов исследование, срчди ни.х г. обнаружены еоалинсирсьпннио аномалии аутооом и в 2,С% -моздичшш случаи аномалий гс носом.

в. Уш-Л! 1ШЙ Вес ОКСЛриП'ШЛШХ XpOMOCCMHi« вариантов, СВЛЗВШШХ С vi-ej.iru iii'j.-M pn.:n--pc¡¡ гегерохремапшоьнх районов Iqh«, 5qh«, löqln ñ ípV'ilie ДО ¡.'i! С i!-JÄlitil0peHiU!p0biiHh0fl олигополией, множественными врожденными iivíjjoKtítJii и/или иикроаномплпями разБашя (I группа) составляет ] 1 ,h;Ví (lqht -- ? ,91; 9<|li+ т 7,05%; 16i.jht -1,9í¡ и супружеских нар с отяг-иишшм акушерским ннямнвзом (2 группа)

- J 3, -Ii (I qhi - Д,\'Л; 9qht - Y,-IX; IGqhf - 1.5'í).

[). Показано, что увеличение Гетерохроматиновых районов хромосом 1,11,1Г. У здо1юшх и у больных индивидуумов (недлКеренцнрхзванныа олшч»1>ришш с множественными врожденными пороками и/или мпкроано-малиями, супружеские пары с отягощенным акушерским анамнезом) связано с повышенным содержанием числа копий "классических" и альфа-сателлнттшх ДШ, причем 5>ти два различных mis ис.ьтсрлшиис-ся ДНК варьируют независимо друг от друга.

1U. Молекулярная гибридизация с использованием в качестве ДЬК-з-.н^ъ

г.лонировашшх "кльесичиеких" сптеллитиих ДНК даат юзмскиосгь оиро-„уд-лшл происхождения хромосом с Iqh», Sqh+, ICqh«, зиготноста блаз-Hvüíti, определения отцовстьа, что имеет оолиис-з значение для iijciе:;ецпл генетических исследований не диЭД«(чниаф^аашшх iJsipM >».v;K'íUi:.tl oicTiuiocíii с множественными врохп-шила! ПьроКа'.'.и и-или t.!ivp-.;::h пе.^ВС.-Н развития.

П. i а. ] а'лпе-л И С/еУН r-í<-l:e.:.4ni!si M:;j.-Ky.irt[ ло-ЦН'К-П ее

й !:.!.ГГН..--:-| .1; i! »p: V!í:íX В ИЧесК- -Л клинике и

• -¿шсо-генэтяческом консультировании, что позволило повысить э№:ктш<-|.. ('ть и точность диагностики хромосомной патологии.

р-лс.1 ■ Схем! пост- и пренатальной молекулярно-цнтсгенетическси- диагностики

Получение ДНК-зондов

Введение изотопной или цеизотспнои метки

Денатурация ДНК-зонда

Взятие клеток пациентов Взятие клеток хориона а 1-ом

триместре беременности

Культивирование клеток крови или кожи

Получение хромосомных препаратов

Получение цитологических препаратов клеток хориона

к-

Гибридизация на препарате хромосомной ДНК с ДНК-зондом (гиеридизаиил т »ии|

Радиоавтография пли иммунологическое выявление результатов гибридизации для нгизотолнои метки

Анализ хромосом (постановка диагноза)

I' j'

* *

íJüií

1,(1) -

..'I.,', 1 I , ;,

. : .i i.

■ i ,. li.'i ••:c.ui .

, : ;/ .■,[.■. t:, ,'.■■;!,.и i ¡i !',

■ ■ ¡ in ".{.ii:¿.r ■ :¡!Uiii líi : i u;

1 л ■

i í!";(.¡!/ii¡!;.;í¡(íij! lu -.b l-í'íiiMiüií.riiiü;.! iiili:

i /.т.

Jim

0,3 -

0,2 ОД

ХИ^Г'яг.спЭ»™гя ^

1

I-T1 . .. *>

21 22 м

ILüu,____Щ

13 15 21 22 nht/

■*Г~1 <—i

I

сШ-

jtl

п_iSJ

13 J4 15

21 22

TUV

9

номера хромоссм

Гис.З (a-r).

и, -з

о,г 0,1

о 0.3

о.

и 0,2

В

Р. 0,1

о

С!

«I

0,3

5 о,а.

с

А К 4) Ь к и о с ь о

0,1

0,3 0,2 0,1

9 13 14 15 покера хромосом

21 22

1 НС-3 .

Идентификация дополнительных маркерных хромосом с цомошьи гибридизации 1п *ии хромосомомоснецнФнчких ДНК-зондов-а/ маркерная хромосомы «1ег(Т| при гибридизации анЫоидного ДНК-зонда

о,в/ маркерные хромосомы <1ег(3) при гибридизации "классически сателлитноП АНК РРВ9;

г/ маркерная хромосома иещз) при гибридизации с ЛНК-зондом а л ь ! а - к 1 о;

а.е/ маркерные хромосомы «1ег<21| при гибридизации в ДШ.-зоидс алыак1б. Происхождение этих маркерных хромосом из хромосомы доказана гибридизацией с уникальным принентромерным ДНК-зонно 1)21313 шиии е1 а1.,19в + , Су 1оуепе».Се11 иеие1.,ЗТ:ь02); »/ маркерная хромосома аецХ) при гибридизации с /Ш£-зондин р 10 -10,

з.' марке имя идиосома <1ег<>'1 пги гибридизации с днс-лонсои

гис.

Ана яиз распределения серен серебра по л "inte хронесош» ■> с увеличенным районом вторичной прр®тя*кг1 /"л" и "г"/ ч нсгчз.и ''"ч хромосечи 9 /"б" и "г"/ после гнбгипизанни ln с

днк-coi'лон pyam /"л" и "с"/ или ррп9 /"в" i! "г"/.

После гибриднзаиии с альФоидной днк /лен:: pyam ii-з?/ та ■ центромернын районом хромосомы 9ih> имеется 5Т зегеч cri-Ti, " в гомологичной хромосоме над районом 9qh - 51 зерно /¿'т.м; 11-2.Т1Т; р<0,01/.

После гибридизации с "классической" алИоидной ЛИК /з-И5 prt>9/ »« .,• рапс-ном эчь+ имеется leo зерен серебра, л в гоно""ГИИ1'чй »rvHcct" над районом 9qh - тз зерна /¿¿32,19; ч:5,70; р<>о,г>ргм/. Таким образом, гетероморфизм гомологов хромосомы 9 ср»зчн в паич ¡ случае с резким увеличением более чем в 2 рзза числа i'-mr-'t "классичрсой" сателлитнои дик. внявляем -й с пемопьп лик-з'-нла PPD9. Кроме того, полиморфизм по солегта.Ч'лг "класп'чесгой" сателлитной ДНК не епчзан с вариациями а.и Фоидноп ЛИ'' - ->ги лга типа повторяюяихся последовательностей ДНК бэгт игугт »ruerno друг от друга.

1-iicy¡¡in; S.ïe-jyjbCbiU nutогииечлл исмой u mauüjuai;ii.—u»itui-c-шличесьйЕ диагностика кедодврвндщдашшп уийвлвииаа о*сгаласте с ьро»двнаыш парокаш иДлп шоигдогши и.-титич.

181 г 13. SC /

IIS?

Цщогеветачвакия диагностика

139

Ii« ¿¿г уд*] ú и- ц. ¡ т о г я п вт w ча саая магносгнжа { ) ~ число ûdasûnaiaifflitï с варшиввш кэдяшвшкш (;•...) •• чадш айсладолзтштг е аьшашцш кариоташои

tK-:.

(йШй ~ чьи» (мЬиюдезшшыт с аиоиадвнии караоашгаи.'иувдакникол ЧаУ в.млгвкуларш-цатих^ншцчвсвсЙ зпашоствке

йгеутг ¿-Рвзуэгетати пптогенсттескоЯ п тодсях.улягяо~иптсг котпчсокор -«япюстпеи у супрувепкпт пап с отягопопчш ат пзрскга анамнезом.

30

б,ох

472 94,

й i таг с irr; тт е ся а л диагностика

1Ълекулягно-ш;тогенетическая диагностика j - чяояо обсяедорапни* индивидуумов с ногитяюти

/

) - та ело обследованных индивидуумов с пно'п-тынг-! rv—rî-ïn?::

- число обслодегаптпс ппг.игидуупов с armün.n''»« г»гп?г!Т'

'J'üO;i.i¡ia 2. (Jooiiiock-iiíu: ча.:у«т ívU-'l» с раэшш числам класмерои.

¡i'»

Кариопы

Число " ' класт^рон

4ti, XX 40.ХХ 46. XX 4t,, XX 46, Xï

46.XÏ

шо Ui.tX)

i.O;, (H.4/»)

u,o {[,,:>%)

hb (t,.(.X) HwO l'U.tii) b (D.7;i)* 1100 (^11.¿i)

11 (0,'U).

1 til Ii (ÜY.UI

64jö (fiii.ùt)

'c 145 (8Я. 1 % )

Y ¿.'il (87.7%)

18 (1 A,fi)

¿'■г (i.9í)

4j (¿.1%)

Я О ■II!

(1 .M) (;\9/a)

46 {'¿.ït'l 64 (О.ЗД 67 (L'.tU)

111 (¿.ti) V.9 (З.Ь%)

4

i - л.цра yi;i'.AH4iiHiiviro днаиитра с идинитш:шши Йолшаи rio раьиеру

киасгирчп. 1-.;«1 и проаНализ.фоьаио ]4ШК>клиток.

Т.'?л;тп 3. Срвллшг зтггая (- •-•пиЯгл грпдтч") л:":»'- п и

ял''р н чном гран/л сребря гпд гг»'»т» 1> от ччс.лл к.п.чс'1'проп.

|Тнд. 1(;'риотнп к^гГУтОрГп..........

По 1 Г 3 1

"Г 45" 'Ш 0\.Г) "Н'.сТ (Г .1]- "13 7( и ¡( м.(')

19 0.9) (1 9) 41 1 5 ! 4«. ( 1 ,'П

с! 46 XX ч 6( 0.3) с 4) 13 3( Г! 3) 1 1 6; 0.1)

35 1 ( 1 .5) зг>.;и 1 7) 4.? <">( 6) у, 7 ( 1 . 1 )

3 ■ 46 XX 6( 0.3) 10.1 ( и *) 0 М 1 1

0( 1 .0) 1 1 ) 55 9 ( 1 7) 6Г> 1 ! \ .-VI

4 46 XX 1 ( 0.3) 10,0( 0 4) 13 0 3) 1Р, 0 ( 0 . !

зз 9( 1 .8) 36.0( 1 0) 4Г< г') 61 6( ч

5 16 ХУ 11 0.5) 1 9.3 ( 0. 5)

13 2( 0.7) Г7.г( 1 1 )

19 0( С.7) *

гз 6( 1 .2)

6 46 п 12 0( 1.0) ГО. 4 ( 1 1 )

16 0( 0.7) гб.1 ( 0. 7)

19 4 ( 0.5)*

Г. 5 6( 0.7)

* - ядра увеличенного диаметра с" единстголшкм Ооямпи по р.!-""р:-кластером.

Верхйее значение - диаметр ядер (с условных едтппих), пнтг число гранул метки.

£|йш;я •!. Результат анздт мозаичных случаев шшиша гоноосм.

ЪЛЛ'О

Спндмл!

í.: 'lu^.iijüií.

tíHúi-ü КлаШ^ольтсра Tpraua X jUicotuut У

Ii

1

Таблица 5. Количественный анализ зерен сребра на хрс-носоке ГО и транслоцированнсй хромосоме 15; 18 после гибрчдгпл ■ пии 1п бИл! иетафчзинх хромосом с ДКК-зовдоч (рВГШЗ 13).

т!исло проанализированных Количество перен серебра над хроисссмой метпфачных клеток __

18/нориялыпя/ 15; /трлнслощгрогшшад/

I 13 5

2 II 6

3 1-1 8

4 . 7 3

5 7 5

6 5 4

7 5 3

8 6 3

9 12 7

10 II 4

II 8 5

12 8 6

13 9 5

14 14 10

15 8 5

16 5 3

17 0 7

18 12 ' 9

19 8 ■1

20 10 8

Всего 181 110

Среднее значение ?,05 5,5

Стандартное отклонение 2,93

Ошибка среднего 0,66 о,а

Примечание. При статистической обработке произведено срапнепте по методу непяраметрич°ского критерия енччоп.

Тьол.б-Колачостьошшя шшл/.з ücf.ou cjfc.lna на

le.и lop- ii юли гиоридизыцщ lu »ltu мотафалш.ч XpuiOCCM с КЛоШрООДШйП 1К»С>.'ДЭ1иГиЛЫЮ!,Т1.Ь jiliRli:; 13

¡1 нроыЬйийр^нПГшЗй КолГнооты^иГГи cvj-.uôfiïï над хрПшзом >а~

Ш'п^чз I3(H'ji::.:aj¡hiiaii) 18р- (абирра.ч'гнап)

1 17 ..... . .¡;|

Û 6

3 H) 10

1 13 9

ь 12 IQ

г, IG 12

7 IG 8

а 10 6

v» lb II

10 IB 10

II 12 ту !

I?. IG 12

13 M 15

1-1 20 Iii

1Ь 12 10

16 9 G

17 M II)

. [в 16 II

19 16 13

23 i a 13

Ï.I 13 9

'V. 17 12

23 M 10

£1 16 И

25 19 Ib

Ь.>;1 С 369 I,G!

'¡:u,iii¡<i6 yria-iotniü 14,76 10,44

¡1 ;ШЛа|Лil'.'ib ОТКЛ¿llüiiílü О »7'> 2,u¡

и.н:'ка ер;aiioio значении ti,'

Таблица 7. Котшчествртшй анализ ~ерсн счреСрз яя хтгаосо»"? I» и ЦЯ/ц/ после гиСридкэйвди 1п в1тч метафа?т?чх хромосом с ДНК-п011д0м (рШК 13).

ЧислсГ "проанализированных Количество ?ерен серебра над »рс«о'г;"г4

метафайл« клеток ___ _т_

Г8 /нормальная/ изо ТП /ц/1""'

1 9 ...... 19

2 8 11

.4 6 10

1 10 16

5 13 20

б 17 20

7 0 11

8 10 15

9 9 10

1(1 10 12

11 5 15

12 9 16

13 8 15

14 8 18

15 14 18

16 9 17

17 18 24

18 12 14

19 8 16

го 4 10

Псе го 195 307

Среднее гчгачетше 9,75 15,35

Стандартное отклонение 3,57 3,88

Списка" среднего 0,00 0,87

Прислан*»?. При статистической обработке проигтелчно срчп»<?1»"<1 пз

кг

'îaoa.e • Результат анализа происхождения доиолжтелыш/. (мьркерных) хромосом.

: Происхождение маркорной Использованные ДйК-зэнда

хромосомы

(в скобках-мзченныэ хромосом )

I. der 7 piiS05 (1,3,5,6,7,10,12,1С,19)

альфаНЫ4 (Y)

der 9 pBRiiS13 (2, -i, У, 9, 18, 20)

pYAM11-39 (4, 9)

pPD9 (9)

;j _ der 9 pPD9 (9)

4. der 13 альфа Rio (13, 21 )

5. der 21 альфа RI6 (13, 21)

Ó.' der 21 il 11

Y. der 21 H H

8. der l pYAH10-4Q (X)

9. der X рШЮ-40 (X)

lü. der Y pY96 (Y)

II.

щкщсхокдьшм установить рШШ-40, i¡Y9¿, альфа FU6, рРЬО, не удалось pllSOS,.pBíiife 13, plKM.YY, píD Ш.

(лтсок роСэт, сч'уЛяиг.овсшшх го тг г,я Л"ССпрта:ич;.

1. С.Г.Ворсановп.

К методике культивирования клеток ашгиотическоЛ жидкости 1979,"Бюлл.экспер.биол.и мед.",6,625-627 (3стр.).

2. М.Ю.Васильев, С.Г.Ворсанова,В.В.Калашников, ¡0. С.Татарииов. Биосинтез эмбрионального преальбумина культивируемыми фибробластами человека.

1900, "Бюлл.экспер.биол.и мед.",2,176-179 (4 стр.).

3. А.Н.Прытков,С.Г.Ворсанова,В.А.Бахарев,Г.Г.Церцвадзе. Медико-генетическое консультирование и пренатальная диапюстика анэнцефалии..

1981,"Акушерство и гинекология",I,26-28 (3 стр.).

4. А.Н.Прытков,С.Г.Ворсанова,Э.Н.Подосинова,Г.Н.Гартман. Добавочная маркерная хромосома у женщин с отягощенным акушерским анамнезом.

1981,"Вопросы охраны материнства и детства",8,48-50 (3 стр.). Г). К).Б.Юров,С.Г.Ворсанова.

Репликация ДИК в культивируемых клетках аышотической жида'.ости

1981,"Бюлл.зкспер.биол.и мед.",9,349-352 (4 стр.).

6. С.Г.Ворсанова,К.А.Бедельбаева,В.А.Никишин,Г.Л.Доронин, И.А.Демидова.

Пренатальная диагностика синдрома Эдвардса: мозаичный случай заболевания

1902,"Вопроси охраны материнства и детства",0,70-71 (3 стр.).

7. С.Г.Еорсансва,И.А.Демидова,Г.Л.Доронин. Пренатальная диагностика наследственных болезней

1982,-Тезисы 4го съезда ВОГИС- .Кишинев,"ШТДОНЦА",4,26-27,(2 стр.)

8. С.Г.Ворсанова.

Ранняя внутриутробная диагностика наследственных болезней при помощи культивирования клеток хориона. 1984."Материалы 1го Всесовзного съезда мед.генетиков', Киев-Москва,72-73 (2стр.). . С.И.Козлова,М.А.Фукс,С.Г.Ворсанова,Г.Л.Доронин, 3. В.Курвинвн. Ультра?вукорче и цитогенетические исследования в пренатальнсй

диагностике наследственных болезней.

1905,"Вопроси охрани материнства и детства",1,61-6-1 (4 стр.). 1 и. С. Г.Корсакова,Ю.С.Юров.

Современные представления о ранней пренатальной диагностике наелкдетвешшх болезней.

190Ь,с(Ук "Врожденные и наследственные заболевания у детей (патогенез,диагностика,терапия) /СССР-ПН!1/" .Москва, 126-13-1 (9 стр.). 11.С.Г.Ворсаноьа.И.А.Деыидова.

Метода онтогенетического анализа,применяемые в педиатрии. 1У85,Тезисы сб-ка "зОлет детской областной б-цы г.Тулы", (I стр.).

IС .Г. Ворсанова, Л. З.Казанцева, И. Л. Демидова, А.В.Шилов.

Цитогенетические исследования в практике медико-генетического консультирования супружеских нар с отягощенный анамнезом. 1586,Тезисы Всесоюзного симпозиума "Актуальные вопросы профилактики наследственных болезней",Вильнюс,20-21,(2 стр.). Буе Папа С.Уогсшюуа.Уи.В.Уигоу, 1.А.Л1ехапс1гоу,5.Р.Ш Ц(е\'1;:Ь, , I. А. Рет1 (1оуа, А. В. ЧЧгскауа.

18р- суп&гогае: ап шшяиа1 оаае ап;1 111а^поя1с Ы1Л пециепсес. 1986, "Ниши Сепеиси",72,185-187 (3 стр.). 1 1.Л.3.Казанцева,С.Г.Ворсанова,И.А.Демидова.

Роль медико-генетического консультирования в профилактике перинатальной патологии.

1986,сб-к "Организация акушерско-1'инс.кологпческой ион-ад» в •Гадосшаютане .Актуальные вопроси акуишрскоЙ и неонатальнсп патологии".Душанбе,303-305 (3 стр.). г,. С. Г. Ворсанона, I). Г,. Кров, И. А. Александров, II. А .Демидова, С.Ц.Мигг.евич.Р. А.Розенфельд.

Пс;о0ич1шП случай синдрома 1йр- : диагностика с исиоцьи клонированного фратента ДНК.

19("11>, "Цитология и 1'епетика", 206, -1,29 [ - ЗУ 1 (5 стр.). 1..М.С.И14нагов^,1и.И.Г.арал1ив,Э.М.ДертйреЫ|,СЛ'.Во{юанаь«. Н.-Фрошггии у детей при хроиосошшх болезнях. 1!>нь, Ч'ву.докллиишо.ч.нелиатрои-нс-фрологой социалистичисшх счр.!

Москва,24. : С. Г. Поре,-»¡юна, Ю.Б.Юрог,.

Гиотехнолоппеские подходи к прснатэлнюЛ диагностике наследственных болезней.

I9EJ6, В сб-ке работ 2го гле:?да акупероп и птнекологоп.Дугаан'е, /бстр./. ¡м.Ю.В.Юроп,С.Г.Корсакова.

Особенности репликации ДНК при длительном культивировании клеток человека п стационарной ij-aw. 1087, "Цитология", XXIX, Т . 1265-1269 (5 стр.). 1 '*.С.Г. Ворсанова, Ю. Б. Юрсв, И. Л. Александров, С. П. Миткевич, И.Л.Демидова.

Молекулярно-цитогенетическая диагностика в практике ктиническ'я ге не тики,weдико-генотичо ского консультирования и пронатальноН диагностики.

1907,сб-к "Педиатрическая наука - практическому ^дряпоохряиспп'-Москва,ВДНХ,9-15 (Остр.). ; г \ С. Г.Ворсанова,Л.3 .Казанцева,И.А.Демидова.

Роль цитогонетическнх исследований при медико-генетическом консультировании в педиатрической практике. 1987,"Вопроси охрани материнства и детства"Л,70-72 (3 стр.). I. Yu.B. Ynrov, I. А. Alexandrov ,S .Г.М1 tkevich ,!> .0. Vorpanova, T.V.Nov1kova,B.1.Chromov.

In sltii hybridization oX human hirJily repetitive DNA to en I nil:; crcmoccmer.: evidence lor chromosome-Rf-cci/1 с amplification "Г "classical" and alpha-satellite DNA sequence» in nnn. 1907, IIGII 9, Гаг Is ,289 (1 стр.). .'.Ю.Е.Beльтшцев,0.Д.Видута,A.A.Ананенко,С.Г.Ворсанова,Ю.D. Грев. Метода генной инженерии в диагностике наследственных бопе^ч"?!. IP87,"Вопросы охрани материнства и детства" ,32,12,41 -40 (Ч стр. ' '.С.I'.ВорсановаД1.Б.Юроз (СССР).

Нолеку.плриэ-цитопзнетичсскпя диагностика хр'-косоиных синдро"оп. 1937,"Использование достгс»<лшй генетики в охране гдеровьт мягер и ребенка (спит стран - членов СЭВ)■.Москва,СЭВ,9П-9? (7 стр.). , ■ .PVeПапа G.Vorsanovn,Yu.B.Yi:rov.

<i6

The using of new molecular and cytogenetic methods in genetic councelling and prenatal diagnosis.

l987,"XXth cytogenetic symposium and annual meeting of the cytogenetic section of the caechoslovak biological society", Prague,26, (1 стр.). : ,t:. С. Г. Ворсанова, И. A. Демидова.

Молекулярная гибридизация в практике клинической цитогенетикн. 1987, Тезисы докладов tiro съезда ВОГИС ,11,25 (1стр.). С.Игнатова,Ю.И.Барашнев,Э.М.Дегтярева,С.Г.Ворсанова (СССР),

0.Павковчекова,В.Клука,В.Тишлер (ЧССР). Нефропатии у детей с хромосомными аберрациями.

1987,"Вопросы охраны материнства и детства",7,41-4-1, (4 стр.). ::V.V.Klulm.O.Pavkovchekova,P.Tyshler (CSSK),

S.G.Vorsanova,Y.l.Barashnev,M.S.Ignatova,E.U.Degtyarova(USSK). Nephropathies in children with chromosomal diseases. 1987, Intern. J.Pediatr.Nephrol. •■ ,0 2,103/1стр./. ::3.Yu.Yurov,I.A.Alexandrov,S.P.Mitkevlch,S.G.Vorcaiiova,

1. V. Novikova, B.I. Chromo v.

. In situ hybridisation оf human higly repetitive UNA to anlnals chromosome-specific amplification of "classical" and alpha-satellite DNA sequences in man.

1987,'Cytogenet.Cell Genet.-,46, (1-4),746 /1стр./. - 29.С.Г.Ворсанова.

Дородовая диагностика наследственных болезней.

1988,"Медицинская сестра",7,22-25 /4стр. ;и).Ю.Б.Юров,И.А.Александров,С.П.Миткевич,Е.И.Рогаев,

Ю.А.Шапиро,С.Г.Ворсанова,А.Г.Яковлев. ' ДНК-диагностика наследственных болезней и генотшшроьаиме (идентификация личности) в криминалистике с помощью технолэпш рекомбинантных молекул ДНК. Коуекция ДНК-зондов для медико-биологических исследований в практической медицине. 1988,Сб-к научных трудов ВДНХ СССР,Москва,1-8 (8стр.). 31 .С.Г.Ворсанова,И.А.Демидова.

Проблемы диспансеризации семей с хромосомными аномалиями. 1988,Сб-к научных трудов "Лечение и диспансеризация детей с

врожденной и наследственной патологией".Москва,32-30 /7стр/. 33.С.Г. Норсановэ, И. Л. Демидова, Э. М. Дегтярева.

Пороки развития мочевой системы и хромосошше аномалии/обзор литературы и перспективы исследований/.

1988,Сб-к "Нефропатии при врожденных и наследственных заболеваниях у детей",35-42 /8стр./. 33. Sve tlana G. Vorsanova.

The indication of DNA probes for chromosomal analysis at prenatal diagnosis.

1988, XXI Cytogenetic symposium , Prague,127 /1стр./. 31.Ю.Б.Юров.И.А.Александров.С.П.Миткевич,С.Г.Ворсанова.

Способ определения количества Х-хромосом человека.

1989,Авторское свидетельство SU 1494724 AI,/12стр./.

. С. Г. Ворсанова, Ю. Б. Юров, И. А. Демидова, И. А. Александров, С. II. Миткевич. Молекулярно-нитогенетическая диагностика хрсиоссшшх нарушений. 1989,"Генетика человека и патология".Материалы 1Й итоговой конференции НИИ медицинской генетики,Из-во Томского Университета, Томск,59-60 /2стр./.

36.Yu.В.Yurov,К.I.Rogaev,I.А.Alexandrov,5.Р.Mitkev1ch,S.G.Vorsanova. Highly polymorphic "classical" satellite DNA probes and their potential for mult Hocus linkage analysis.

1989, 10th HGM,Adstract .New Haven,100-101 /2стр./.

37.Yu.В.Yurov,A.G.Yakovlev,S.G.Vorsanova,E.I.Rogaev.S.Eran,I.Manura. M.E.Vartanian.

Identification and characterization of two distinct polymorphic alpha-satellite DNA sequences from centromeric regions of the; chromosomes 13 and 21.

1989, 10th HGM,Abstract ,New Haven,101-102 /2стр./. 33. Yu.B. Yurov, A.G.Yakovlev, I. A.Alexandrov.S.P.Mltkevich, ЕЛ .Rogaev, S.G.Vorsanova.

Collection of alpha-satellite DNA probes: highly polymorphic markers for centromeric regions of all human chromosomes. 1989, 10th HGM,Abstract ,Hew Haven,101 /1стр./. ; З.С.Г.Ворсанова.Ю.Б.Юров.И.А.Алексанлров,И.А.Де№1ДОва,С.П.Митке1:1г?, Л.Г.Доронин.

к /лекулярно-цитогенетнчеса.ш диагностика наследстииьшх Солеоней, снизаии,: с различный!! анэиалинми хромосом X.

Педиатрия ,1,70-80 /Ьотр./. .$>.И.Ьараинеь,П.В.Новиков,С.Г.Корсакова,И.А.Демидова,М.Б.Курбатов, Л.А.Троицкая.

'1ран;-локацмошшй вариант трлеошш 22 у ребенка с умственной отсталостью.

1989, Вопроси охрани материнства и детства ,2,71-74 /4стр./. . 1".Г.Ворсанова,Л.З.Ла:->анцеьа,И.А.Деи,:доьа,]'.В.Деряпш. Ц:П'огинитичиская диагностика у супружеских пар с отлгсм(ешшм акушерским анамнезом.

1ъв9, Вопроси охрани материнства и детстьа ,34,6,Ь2-Ь6 /?.с?р./. ' Ли.Н. iurov.S.G.Vorsanova, I.A. Alexandre'«',S.F.01 tkevicii. A сиг,pie method Гог identification oi normal and fragile X curomosomes by In situ hybridization with chroinosone X specific alpha -satellite UNA probe.

l(;U9, I fcorld Congress on Psychiatric Gene tics, Carubr Wge ,ЬЛ /icii% ' . i и. Ь.Yurov,A.G.Yako/1ev,S.0.Vorsanova,К.1.Roguev, [.Masura.U.itaw. identification oi two polymorphic alpha-Batelllte DtlA sequences rri.m centromerlc region of the chromosome 21 and theirs putentialr; to study of chi-o.TOuori-.e 21 assotiated neuropsychiatrlc diseases (Dawn's syndrome and Alzheimer's disease).

19U9, X World Congress on 1'sychlatrle Genet Ice,Cambridge /1стр./ !. in. B. Yurov.S.G. Vox'sanova, I. A. Alexari'lrov.S.F .Mi tkevich, 1. A.bcnilduva. id.>leculur-cy togenutic diagnosis of sex chromoconal and autosomal aneuploldes by chromosome-specific repetitive DMA probes. 1969, I World Congress oil Psychiatric Genetics .Cambridge, 10u, /1 с rp./.

. С. Г. Ворсаноьа, Ю. В. К>ров, И. В. Соловьев.

Картирование генои и молекулярная диагностика наследил вешай полезней.

Медицинская х'енетика (экспериментальная информация) ,11, 1 ¡1) /1Ь стр./. • -. с. ('. bopcaiioiij ,11.Б. Юров, И. А .Демидова, И. А .Александров .С.Н.Мш киг»л ч. -к^Л1|рно-цитогенетическйЯ диагностика н педиатрии.

193Э.С0-К "Хромоссмм человека n норме н патологии" Д'осквп, МОИ! "Паука",73-02 /10 стр./. •17.Ю.Б.*"»рг>г!,И.Л.Алрксанлроп,г,.11.»Лп,че!зи,1,Л.Г.Якопл'1т?,Е.И.Гг)гпгп, С.Г.Еореансва.

Молекулярные маркер» для гетерохромэтииоках районов. Н'В9,Сб-К "Хромосомы человека в порке и патологии".Могкпп, М0И11," На у г.а ", 63 -73 /Петр./. 40.Svetlana G.Vornanova.YU.B.Yurov.

Application oi molecular and cytogenetic methods for diagnosis in pediatrics.

1989, XXII Cytogenetic symposium , Bratislava,52 /1стр./. 49.Ю.Е.Вельттцпв,С.Г.Ворспнова,И.А.Деьшдора,Е.Л. Николаева, Г.В.Дерлгин.

Цитогенетическая диагностика недифференцированных форм умственной отсталости у детей с врожденными пороками развития и/или ыикроаномалиями.

1989,"Вопросы охраны материнства и детства",31,II,22-26 /5стр./. r:O.Yu.B.Yurov,E. I.Rogaev, I.A.Alexandrov.S.P.Ml tKevlcli, A.K.Kronnln". S.tt.Vorsanova.

Highly polimorphlc "classical" satellite ША probe? and theirs potential ior multilocus linkage analysis. 1939,"Cytogenetics and Cell Genetics",51,/1-4/,1114 /1 стр./. !.Yu.B.Ynrov,A.G.Yakovlev,I.A.Alexandrov.S.P.Kitkevlcl),EЛ .Rogaey, S.G.Vorr.ariova.

Collection oi L-satelllte DNA probes: highly polymorphic глг1глсп ior centrcmeric regions oi all human chromosomes. 1909,"Cytogenetics and Cell Genetics",51,/1-4/,1114 /1 стр./. ;:2,Yu.B.Yurov,A.G.Yakovlev,S.C.Vcrsanova,E.I.Rogaev,I.Masiira, . R.Sram.W.E.Vartanian.

Identiiication and characterization oi two distinct polymorphic L-catellite DMA sequences from centromerlc regions of the chromosomes 13 and 21.

1989,"Cytogenetic and Cell Genetics",51, /1-4/,1115 /1 стр./. К .С.Г.Корсакова,И.Л.Демидова,М.Г.Гордесва,Ю.Б.Гров. Молекулярно-шттогенетическая диагностика анеуплсидий-

1990,Сб-к тезисов Пго съезда медицинских генетиков,Алма-Ата, /1 стр./.

о t.Svetlana G.Vorsaiiova.Yu.E.Yurov.I.A.Alexandrov.S.P.Uitkevich, I.A.Demldova.

Uolecular-cytogenetic diagnosis of sex chromosomal and autosomal aneuploidles.by in situ hybridization.

1990,"5th International congress on early fetal diagnosis (recent progress and public health implication),Prague,328,/lCTp./.

l^.C.r.HopcaHOiiU /1■..'.'.оc:Ki.a/.

Мсшкулярно-mrrviivHuTH'ivciu'iji диагностике хрммэсомшх аСсрращШ с ном.лцыо хр>'',м..к-оы;к:11-.:ц;!'ГИ'Ш1]Х ДНК-аондон. I'.nO, "Прената.ылшй li неона'пшлшй скрининг ьрожцшшой и нас-лодстшшюа патологии", ыз шл\ мз Усс1\Харькоп, стр. и: /i игр./.

U'..li.n.k)jwn,U.A.Aj»)KCiiiuUiv4i,0.lI.M;nK<ii.i>4,C.r.Hji.Ciui<o.;i /г.Млекни/. Коллекция ДШС-аопдоь для прокат адимП it нистиатзиюй диагаос-'¡'ИКИ хромосомных a-'vppamut.

1 "ll{n)HaTfUMiuil и ноонаталышй окдошшг ьрокдошюй и наследственной патологии",143 CCCi', -МЗ УШ', Харьксш, стр.ао /1 стр./. 1./.И. А.Д»!МИДОГ!а ,0:1'. Ворсшюьм.

Цитологический и мсшжуллрний полншр^иам хромосом чолоьока. .1990, Медицинская геиичшса (эксиеримош-ал! пая ип<|ормнц>м). 12,1-B (9 стр.).

L4.Svetlana G.Vorsanova,Yu.B.Yurov,B.M.Kurbatov,L.Z.Kazantaeva. Translocation t (1 ;1 Y) (q12;q25) with clinical picture of proximal deletion of cliromosome lq:molecular-cytogenetic detection by In Bi-tu hybridization with chi-omoeome 1-speclflc DHA probe. 1990,"Human Genetics",86,173-174 (2 стр.). Oj.Patrlaia Ronchetto,U.Devoto,A.Pulltl,G.Romeo,B.Sokolov,V.N.Kalinin, 'S.G.Vorsanovu.G.Krainia.B.Y.Reznik.

Preliminary results on the frequency of the У508 mutation in cystic fibrosis.patients from USSR. 1990,"Human Genetics",85,2,423-424 (2стр.). C-.).M.bonduelle,W.Lissens, I.Dab et al. (более 100 авторов) в т.ч. Svetlana G.Vorsanova.

Gradient of distribution In Europe oi the major CP mutation and oi its associated haplotype.European Working Group on СГ Geneticd (EfJGCFG).

1990."Human Genetics",05,2,<336—141 /П стр./.

GI . С. Г. Ворсанова ,Л.З. Казанцева, Ю. Б Лг^оп,М.Г.Гордеева,М. P. Kyj^aTon, . И.Л.Демидова.

Использовага'р нслекул.'трио-цитогснетичесиа методов диагностики в генетической клинике.

1991,"Вопроси охрани материнства и детства",[I,71-7П,/6стр./. G2.Sve11ana G.Vorsanova,Yu.В.Yurov,I.A.A1 сxandrov,T.E.Zerova,

1.A.Den idova,A.S chmi d t,E.Fa s sarge.

Chromosome-specific ША probes as molecular markers of target human chromosomes in post- and prenatal diagnosis. 1991,3.Tagung der Gecellcchaft fur Humangenetik.UUl.p. 147 /\ стр. '. Г.,Ч. Yu. В. Yurov, E. H. 5 lnev, I. A. Alexandrov, S. P. Mi tkevich, A. G. Jake? lev, S.G.Vorsanova.

Isolation and characterization oi highly polymorphic and hypervarlable alpha- and "classical" satellite DMA probes for construction of centromeric-bacd linkage map of the human chromosome,

1991,3.Tagung der Gesellechaft fur Humangenetlo,W,4,p.233 /I с ; . . 1.Yu.ri.YiUT>Y,3.(;.7or^,-Hiova,'r.E.Zerova,I.A. Alexandre-»-, A. Scirabli , F.rai-.'irgo.

Kolccuiar-cytop'Tot1 с Identification,or mrRer сЫопгс.т.т'ч: by сЬтотоосчпо-г.рссШс UNA probi-s. 1991 .Annual istetlns Jiuv.fcnn evclety of Human GcnotlT«. J,cuven,IieJg3um.p.67 /1 стр./. (Ъ.S.G.Vorsanova, Yu.В.Yurov.

Application of rhronosomc Х-сресШе nlphold pfJA probo to •ilagnosln of i'ra-X and tsnx chrKnoecwe anruploltiloc. 1991 .Annual mooting European society of llinnan (Sanction, bcuvc-n,Belgium,p.68 /I стр./. С,Уи.В.Yurov,В.К.S'n е v, I. Л. Л1 е 7. an drov.S.G.Vorsanova.

Isolation and characterisation of highly polymorphic aliha-and clarsJcal яа1с1Ше ДОЛ probes.

л.' >1 ,A¡¡:.a'U lúv-rllníj ¿eroj ÜOC U4¿ ct 1ш;:ли Ui-m-tl.w, i <:a\'i ii,tX-1 líí.i,J>..1 43 /2 стр./'. ; . .и.1\Ьорсанова,Ю.К.1иров Д\В.Деряпш,К.В.Соловьеь,Г.А.БцтиУская.

Идентификация хромосом X ь интерфазных ядрах с помощь» гибридизации нуклеиношх кислот in el tu для ышллчпш аноушшадиЯ. ¡м-.11,иь»иш.эксп«р.оиол.мед.", LO, Y.1 YV /к стр./.

• í..'-.i'.l'., .poaii^il.íJ.ÍJ.lj.í'pJji.r.h.Aop.-ll'Hil.JJAM'llJIl ДИнЬЧ,

Г.Л . bu ¡смекая , И.Ь.СОАЭны-и.

ItA.Ül'iK'lilKUÍUUl Х(К,М-'л:иМ i! K№№p)*i;;luU ЯДраХ С ПОМОйД.Ы

гибридизации нуш1оиичЯ.их i.a.x.<r Jn c!lu диапистики /(».«мсошой анеуплоидип.

i9 i¡ .Узбекский биологический ;i;ypaaji,4,ü-lj,/'U:Tp./. C.i. í; .'t¡ t lana G. V'oraauova, Vu.H.Yurov , 1.A.DeüiUlova, I .Л. Ale.uurlrov. Но 1 edilitc-cyU4',etK'tJс hk-íitifloaUon or hiiRiaa climu.w,&.>ü Ьу еЬ romea uine -¡¡pocini.: MÍA probé;,.

J99L, u Ui inU:i4i;illoi::tl O 'Ii;í!4¡üü о Г íiui:.'.m Uvjwtlcs, 30J /I стр./.

ni. Ylt.H.YuroV, .C.

M.jluCüIar-eyl.o^ob.'Uo an;il ¿чз líi cj Г alplia-aatelí 1 le 1n II, e cliroiiioaome;-; of n/ia, or;ií!¿';i!lati and chlm),a>i3e0.

ltfel.U- Iti internat, luir.il Cwí!¡y4::j:¡ of HilMaü Uuíu-tioíí, CjIU, /1 стр./. Vi. C.i'.Üopoahoba, kUlJípoé, T .Э.Г'ёрога, И.Л.ЛЖ-КСандрл., ЛХмпдг, i!. ílaeoapre.

.U'jjifiiyj'aipiio-iuu-Jiuiii.'iiriacKa.-i ндешК'Ь:кащш маркерних хромосом HuJionoKíi с помощью хромосог.юоноцифичннх ДШС-аопдсш. líiyl, Вторая Всесоюзная конференция "Геном человека-91", М., IV;í-1Y4 (2 стр.). V.:. KJ.ü.kipoEi, Е.М.Сииив, Г.И.Деряпш, с.Г.Ворзшюва.

Альфа■■ сатиллитиая ДНК со спецификой для хромосом 13 и

ПИЯЬЛеНИО рОСГрИКЦИОШЮРО ГШШрПОЛНМОрфЛЗМа .

НЫ, Вторая Всесоюзная конференция "Геном человека-01", М. 189-190 (2 стр.). ^•"'•Е'.Юров.С.Г.Ворсацова.А.Г.Яковлив.

1 икомошшнтная плазмида альфа П-1 для маркирования и идеширикгяии 1-й хромосомы человека. Способ получения.

1»91, Авторское свидетельство на изобретение, получена приоритета,! C'-tflCdy vl¿.. ... ' "

о.