Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль молекулярно-цитогенетических исследований хромосомных аномалий соматических и половых клеток при нарушении репродуктивной системы у пациентов мужского пола

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль молекулярно-цитогенетических исследований хромосомных аномалий соматических и половых клеток при нарушении репродуктивной системы у пациентов мужского пола"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

УДК 576.31232./.38+616-053.2-056.714-076.5

ШАРОНИН ВАСИЛИЙ ОЛЕГОВИЧ

РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ СОМАТИЧЕСКИХ И ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ НАРУШЕНИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ МУЖСКОГО

ПОЛА.

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически наук

Москва 1998 г.

Работа выполнена в Московском ордена трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения Российской Федерации Медико-генетическом научном центре РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор СX ЛЗорсанова доктор биологичесхих наук, профессор Л.Ф.Курило

Официальные оппоиешы: доктор биологических наук, профессор ЮАРевазова кандидат медицински наук Г.Р.Оснпова

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н И. Вавилова РАН

У А Защита состоится .Ь^Лщ^Л... 1998 г.

в ..../../... часов на заседании Диссертационного Совета (Д.001.16.01) Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье

Д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-гснетнческого научного

центра РАМН.

Автореферат разослан ".........."............................1998 г.

Ученый секретарь Днеертационното Совета,

доктор биологических наук Н. А Ляпунов а

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Нарушения развития и функции органов репродуктивной системы у человека занимают третье место среди всех врожденных пороков развития (Курило, 1996; Barakat et al., 1986). В среднем, у 10% пациентов с нарушением репродуктивной системы выявляются аномалии хромосом. Известно, что 70-75% хромосомоиатий, сопровождающихся аномалиями репродуктивной функция, возникают в результате численных или структурных нарушений половых хромосом (Курило, 1996; 1997; 1998; Yoshida et al., 1997). В большинстве случаев эти аномалии связаны с синдромом Клайнфельтера - 6-7% случаев; со структурными перестройками хромосом X н Y или с мозаицизмом по нарушениям гоиосом - 1-3% (Курило, 1996; 1998; van Assche et al., 1996). Цитогенетическне исследования лимфоцитов периферической крови, как правило, позволяют установить характер большинства хромосомных нарушений. Однако, при использовании традиционных цитогенетнческнх методов остается нерешенным ряд проблем, связанных с диагностикой сложных форм хромосомной патологии (Ворсанова, 1991; Соловьев и др., 1995; Vorsanova et al., 1997). Вместе с тем, эффективная и своевременная цнтогенетическая диагностика делает возможным разработать тактику определенной гормональной коррекции здоровья пациентов с нарушением полового развития до наступления пубертатного периода.

В последние годы определены принципиально новые подходы к идентификации аномалий кариотипа на основе гибридизации клонированных последовательностей ДНК человека - хромосомоспецифичных ДНК-зондов в условиях in situ. Так называемый иолекулярно-цитогенетнческий метод или метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ позволяет использовать не только ыетафазные, но и ннтерфазные клетки, что ставит его в ряд наиболее доступных н высокониформатнвных (Ворсанова, 1991; Ворсанова и др., 1989; 1991; 1998; Соловьев и др., 1995; Holmes, Martin, 1993; Martin et al., 1993; Guttenbach et al.. 1994; 1997; Vorsanova et al., 1986; Soloviev et al, 1995; 1997; Yurov et al., 1996). Молекулярно-цитогенетнческне методы могут успешно применяться для диагностики таких хромосомных нарушений, как добавочные (маркерные, минн-) хромосомы, часто являющиеся дериватами половых хромосом; сложные случаи гоносомного мозанцизма; участие в хромосомных перестройках более 3-х хромосом; гнпо- и гипергаплондня в половых клетках (Ворсанова, 1991; Ворсанова и др., 1989; 1998; Соловьев и др., 1995; Курило, 1996; Cremer et al., 1986; Vorsanova et al., 1986; Guttenbach et al., 1994; 1997; Yurov et al., 1996). Эффективная диагностика с помощью молекулярной гибридизации в условиях in situ способствует успешпому, своевременному обнаружению сложных хромосомных нарушений, как в соматических, так и в половых клетках

Гибридизация in situ позволяет выявлять н анализировать нормальные или аномальные хромосомные ДНК-последовательности на всех стадиях клеточного цикла, что делает возможным определение числа хромосом в ядрах сперматозоидов человека со сверхконденснрованной ДНК, а тахже в интерфазных клетках лимфоцитов периферической кровн, значительно ускоряя диагностику и повышая ее эффективность (Ворсанова и др., 1991; Goldman et al., 1993; Miharu et al., 1994; Martin et al., 1995; Rousseaux, Chevret, 1995; Soloviev et al., 1995; Hummelen et al., 1996; Yurov et al., 1996). Применение интерфазной молекулярно-цнтогенетической диагностики обеспечивает возможность выявления и анализа анеуплонднй хромосом в некультивированных клетках, что особенно важно для эффективного определения численных хромосомных аномалий в половых клетках.

Исследования хромосомных аберраций в половых клетках пациентов с нарушением репродуктивной функции с помощью молекулярно-цитогенетических методов до настоящего времени не получили достаточно широкого применения. Не оценена частота хромосомных аномалий в незрелых половых клетках эякулята, ках в норме, так н при нарушении репродуктивной системы. Вместе с тем эффективное определение доли и типов хромосомной патологии на разных стадиях гаметогеиеза, изучение механизмов селекции гамет, выявление причин бесплодия важно для своевременной соответствующей лечебной коррекции пациентов с аномалиями полового развития н нарушениями репродуктивной функции, а также проведения генетического консультирования в семье.

Следует отметить, что мужские половые клетки более доступны для исследования, чем женские. Получение большого числа половых клеток нз эякулята делает возможным проведение экспериментов по гибридизации ш В1Ш, и анализ полученных результатов не является трудоемкой и длительной процедурой, что обеспечивает высокую эффективность диагностики, ее информативность.

Однако, до настоящего времени, не разработаны показания для применения молекулярно-цитогенетических методов в диагностике аномалий полового развития и/или нарушений репродуктивной функции, связанных с хромосомными аберрациями у пациентов мужского пола.

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости изучения аномалий гоносом с различными формами нарушения репродуктивной системы, а также определения показаний к проведению молекулярно-цитогенетических исследований половых и соматических клеток у лиц мужского пола с нарушением репродуктивной функции и/или аномалиями полового развития.

В связи с этим, была поставлена цель и задачи данного исследования.

Цель: На осцове молекулярно-цнтогенетического исследования установить удельный вес н тип аномалий гопосом у взрослых пациентов и у детей мужского пола с различными формами нарушения репродуктивной системы

Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить удельный вес и тип хромосомных аномалий среди детей и взрослых пациентов мужского пола с нарушением репродуктивной системы, используя методы цитогецетнческого аиалщя.

2. llpoBiciii молекулярно - цнгогенстнческне исследования у пациентов с нарушенном репродуктивной системы для выявления сложных случаев гоносомного мозаицизма или псевдомозанцизма при небольшой доле аномального клона, определения происхождения маркерных гоносом, уточнения точек разрыва при структурных хромосомных аберрациях.

3. Оптимизировать условия проведения молекулярно-цитогенетических исследований - изотопной и флюоресцентной гибридизации нуклеиновых кислот in situ (IISH и FISH) для изучения хромосомных аберраций в половых клетках.

4. Определить частоту анеуплонднй гоносом н некоторых аутосом в половых клетках эякулята пациентов с нарушением репродуктивной системы и в норме.

5. Разработать показания к применению молекулярно-цнтогенетнческой диагностики при нарушении репродуктивной системы у индивидуумов мужского пола

Научная новизна. Впервые оценена диагностическая значимость молекулярно-цнтогенетических методов при определении уровня аномалий гоносом в половых и соматических клетках в норме и при патологии репродуктивной системы у индивидуумов мужского пола.

Впервые определен удельный вес и тип анеуплоиднй гоносом, а также некоторых аутосом в незрелых половых клетках эякулята у пациентов с азооспермией или тяжелой формой олигозооспермнн.

Впервые, на основе применения молекулярно-цнтогенетических методов (двухцветовая FISH), разработана схема идентификации маркерных хромосом у детей н взрослых пациентов с аномалиями репродуктивной системы.

Впервые определена корреляция между хромосомными аномалиями в соматических н половых клетках.

Впервые, на основе применения молекулярно-цитогенетнческих методов, определен уровень нерасхождения хромосом в половых клетках у пациентов с синдромом Клайнфельтера.

Научно-практическое значаще работы.

_ Разработаны показания для проведения молекулярно-цитогенетнческой диагностики три нарушении репродуктивной системы у лиц мужского пола (дети и половозрелые 1ацненты). Рекомендована схема определения происхождения маркерных хромосом у тацнентов с нарушением репродуктивной системы. Подтверждена эффективность применения методов интерфазноб молекулярной цитогенетнки для выявления фомосомных янеуплонднй в соматических н половых клетках человека

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Среди пациентов фенотипнческн мужского пола обнаружена частота аномалий сносом: у детей с задержкой полового развития - 14,8%, у мужчин с нарушением ^продуктивной функции- в 13,5% случаев.

2. Показаниями для молекулярно-цитогеиетического исследования при аномалиях юлового развития и нарушении репродуктивной системы являются: наличие в сзрнотипе дополнительной маркерной хромосомы, мозаицнзм с присутствием двух или >олее клеточных линий, терминальные или интерстнциальньш делецни и инверсии, гтергая клиническая картина синдрома (forme fruste), обнаружение нарушений ■аметогенеза (азооспермия, олигозооспермия, тератозооспермия) при анализе клеток якушпа

3. Около 40% случаев аномалий гоносом, выявленных методами классической [итогеиетикн, требуют молекулярно-цнтогенетических исследований с целью уточнения |лн установления диагноза.

4. Молекулярно-цитогенетические исследования эякулята выявляют повышенный дельный вес хромосомных анеуплоиднй (как аутосом, так и гоносом) в половых клетках ациентов с нарушением репродуктивной функции.

Апробация работы. Материалы работы доложены на: 1-й Балканской конференции енетиков человека (Афины, Греция, 1994); Международной конференции "Актуальные роблемы профилактики неинфекционных заболеваний" (г.Москва, Россия, 1995); 1-м оигрессе PECO-EUCROMIC (Прага, Чехия, 1996); конференции Европейского общества

медицинских генетиков (Лондон, Великобритания, 1996); конференциях "Геном человека"-96; -97; -98 (г.Черноголовка Московская обл., Россия); Российской конференции по проблемам меднко-генетнческого консультирования (Москва, Россия, 1997); 2-м конгрессе PECO-EUCROMIC (Будапешт, Венгрия, 1997); дважды на совместном заседании отделов молекулярной цитогенетикн Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, цитогенетикн НЦПЗ РАМН, лаборатории генетики нарушений репродукции МГНЦ РАМН и кафедры генетики Российской медицинской академии последипломного образования (Москва, Россия, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы, из них 12 в отечественной и 21 в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ... страницах машинописного текста и состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материал и методы исследования", 'Тезультаты и обсуждение собственных исследований", "Заключение", "Выводы" н "Список литературы", включающий 49 отечественные работы н 205 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 15 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования в работе являлись 149 мальчиков в возрасте от 1 года до 15 лет (средний возраст 8 лет) с аномалиями полового развития (группа 1) и 141 мужчина (средний возраст 26 лет) с нарушением репродуктивной функции (группа 2), проходившие обследование в отделе врожденных и наследственных заболеваний МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ и з отделе генетики нарушений репродукции Медико-генетического научного центра РАМН. Контрольную группу составили 73 ребенка н 69 взрослых индивидуумов мужского пола, не имеющих аномалий полового развития н нарушений репродуктивной функции.

Цитогенетическая диагностика проводилась на клетках препаратов метафазных хромосом культивированных in vitro. После дифференциального окрашивания по длине G- и С-методамн анализировали не менее 11 метафазных пластинок в каждом случае. Отбор метафазных пластинок н анализ хромосом осуществляли согласно общепринятым приемам (Кулешов, 1991). Мозаицизм оценивали по статистическим критериям (Кулешов, 1991). Спермнологический анализ для большинства пациентов выполняли дважды по методу, рекомендованному ВОЗ (WHO, 1992). По результатам спермиологического анализа пациентов относили к одной из шести групп (WHO, 1992). Суховоздушные препараты половых клеток из эякулята получали общепринятыми методами (Evans et al., 1964; Templado et al., 1986) и окрашивали красителем Гимза дня проведения количественного анализа состава незрелых половых клеток но методу, предложенному Л.Ф.Курнло с соавторами (Курило, 1980; 1985; Курило, Любашевская, 1990). Гибридизацию ДНК на метафазных хромосомах-IISH- проводили по ранее описанному методу (Gall, Pardue, 1971; Chandler, Yunis, 1978) в модификации, предложенной Ю.Б.Юровым (Юров, 1984). Флюоресцентный метод гибридизации in situ (FISH) на метафазных и интерфазных хромосомных препаратах проводили по методу Pinkel et al. (1986), в модификации, принятой в лаборатории цитогенетикн человека НЦ психического здоровья РАМН (Soloviev et al., 1994; Yurov et al., 1996 a; b; 1997). FISH на препаратах половых клеток нз эякулята проводили по методу, предложенному M.Guttenbach et al. (1994), с модификациями, предложенными Ю.Б.Юровым с соавторами

(Уигоу е! а1., 1996 а). Результаты цнтогенетнческого н молекулярно-цитогенетического исследования приведены согласно Международной системе номенклатуры цитогенетнки человека (ГЗС!^, 1995). Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы сравнения стандартных статистик выборок. Определяли среднее и стандартное отклонение групп н число степеней свободы по критериям Фншера и Стьюдента и с использованием «р-преобразовання частот. Результаты считали достоверными, если различие было незначимым (Урбах, 1975).

В работе были использованы ДНК-зонды, любезно предоставленные проф. Ю.Б.Юровым (НЦПЗ РАМН). Часть клеточных препаратов и суспензий любезно предоставлении к.б.н. Л.В.Шилейко н к.б.н. КВ.Мхитаровой (МГНЦ РАМН). Статистическая обработка проведена при содействии д.б.н. В.И.Трубникова (НЦПЗ РАМН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИГСЛЕДОВАШТЙ

Цмюген.мнческое исследование сомшнческнх клеюк у пациентов с нарушением эепродуктивнон системы.

В группе- 1 аномалии хромосом выявлены в 22-х случаях из 149-ти, среди них $стречались только аномалии гоносом (14,8%)(Рис.1), в том числе синдром Югайнфельтера (полная форма) - в 6-ти случаях (4,0%), мозаичные формы в 2-х случаях [1,3%); синдром де ля Шапелля - полная форма (кариотнп 46.ХХ при мужском фенотипе)- 1 случай (0,7%); синдром дисомин У (47,ХУУ)- в 4-х случаях (2,7%), из них 1 мозаичная форма с наличием в кариотнпе 2-х клонов и вариантов гетерохроматнна [0,7%) (Табл.1). В 2-х случаях (1,3%) при клинической картине синдрома Клайнфельтера обнаружены дополнительные маркерные хромосомы, представляющие :обой метацентрические хромосомы, содержащие одну центромеру и имеющие меньшую угину, чем хромосомы группы О. Различные методы дифференциального окрашивания оказывают лишь на наличие в них околоцентромерного гетерохроматнна. Следовательно, (нтогенетнческнми методами было невозможно определить маркерные хромосомы во 1сех случаях. Кроме того, в 3 случаях (2,0%) выявлен кариотнп 46,Х,+таг. Обнаружены два лозанчньм карнотипа: 45,Х/46,Х,+таг (0,7%); 47,ХХУ/46,ХХ (0,7%). Два случая, когда оносомные аномалии были выявлены молекулярно-цнтогенетнческнми методами, усмотрены ниже (Табл.1).

Из общего числа носителей гоносомных аномалий группы 1 (22 ребенка) большую Юлю составляли пациенты с синдромом Клайнфельтера, причем полную форму [аблюдали в 6-ти случаях (27,3%), а мозаицнчную в 2-х (9,1%). Обнаружено пять 1ациентов с маркерными хромосомами (22,7%) и два с гоносомным мозанцнзном 9,1%); с синдромом днеомии У - 4 случая (18,2%), из них с мозаицизмом - 1 (4,5%); нндром де ля Шапелля -1 (4,5%).

рис. 1.

Доля хромосомных аномалий среди 149 мальчиков с нарушениями полового развития. --

14,8%

85Д%

О Нормальный кариотип

! I

I !

□ Аномалии гоносом

рис.2.

Доля хромосомных аномалий среди 141 мужчины с нарушением репродуктивной функции.

13,5%

0,7%

а Нормальный кариотип

□ Аномалии гоносом

I Аномалии аутосом

85,8%

Табл.1 РЕЗУЛЬТАТЫ ЦИТО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛ Я'НО-ЦИТО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ У ДЕТЕЙ С АНОМАЛИЯМИ ПОЛОВОГО РАЗВИТИЯ

N п/п КАРИОТИП ФЕНОТИП, ВОЗРАСТ ЗОНД КАРИОТИП (по реэ-татам IISH/FISH) прим

1-5 47.XXY с-м Клзйнф. 1;1;10;12;13л PY/M1040 47/XY.ishXp11.1-q11.1(pYiûM10-40x2) +

в 47.XXY с-м Клайнф. 13 лет pYAHICUO 47,XXY.IshXp11.1-q11.1(pY/>M1040x 2)[93]/48,XY.ishX p11.1-q11.1(pYM1 1040x1 )[7] 1

7 46,XY с-м Клайнф. 14 лет pYAM1040 47,XXY.IshXp11.1-q11.1(pY<ûM1040x 2)[10J/48,XY.ishX p11.1-q11.1(pYAM 1040x1 )[90] !

S 48.XY с-м Клайнф. 5 лет pYAMl 0-40 47,XXY.ishXp11.1-q11.1(pY-flM10-i0x 2)[8]/48 ,XY .ishX p 11.1 -q11.1(pYAM 10-40x1 >[92] !

9 48.XXXY/ 40/XXXY мужской 1,5 года PYAM10-40 47,XXY.ishXp11.1-q11.1(pY£M1040x2) [3J/48,XXXY.ishXp 11.1-q11.1(pY/>M10-40x3)[8]/49,XXXXY. ishXpll.l-qll.1 (pYAM1040x4)[84]/ 50,XXXXXY.ishXp 11.1-q11.1(pYAM10-40x5)15]

10 47.XXY/48.XY с-м Клайнф. 4 года pYAM10-40 47.XXY.ishXp11.1-q11.1(pY/JM1040x2) !

il; 12 47,XY,+mar с-м Клайнф. 8,12 лет pYAM1040 47,XY,+mar.ish der (Х)(рУЯИ1040+) 4

13 48.XX мужской 4 года Gen-s-Y- alpha; pYAM1040 48.XX.ishXp11.1-q 11.1;Yp11.1-q11.1 (pY/W1040x2;gen-s Y-alpha-) +

14-18 47.XYY мужской 13; 14 лет; 4 года Gen-s-Y-alpha; Y97 47,XYY.ishYp11.1-q11.1(gen-s-Y-alphax2) +

>.лп ; iii.o.T.'rrfeHvif.

,7 -..... ■■ 1 47,XYY,1phqh, 9qh+/46.XY, 1phqh,6qh+ мужской 2 года Gen-s-Y-atpha 47,XYY,1phqh,9qh+. ishYp11.1-q11.1( gen -s-Y-alphax2) [5Sl/4e,XY,1phqh.8 qh+.lshYp11.1-q11. 1(gen-s-Y-alphax1) [42]

18 45.Х/48Л, +mar интерсекс 14 лет Gen-s-Y-alpha, pY/iM10-40 45,X.ishXp11.1-q 11.1;Yp11.1-q11.1 (pYAMI 040x1; gen-s- Y-alpha-) [48]/46Л,+таг. ish der (Y)(pY/>M10-40x1; gen-s-Y-alpha*) (52]

19 47.XXY/46.XX интерсекс 15 пет Gen-s-Y-alpha 47_XXY.ishYq11.1-p 11.1(gen-s-Y-alpha x1)[15]/46,XX.ish Yq11.1-p11.1(gens-Y-alpha-)[S5] •

20-22 40Л+таг мужской 1 год, 5,7 пет Gen-s-Y-Alpha;Y97 46,X,+mar.ish der (Y)(gen-s-Y-afcha+)

ПРИМЕЧАНИЯ:')' цитогенетческий диагноз подтвержден с помощью гибридизации in silu * цитогенетический диагноз уточнен с помощью гибридизации in situ I цитогенетический диагноз изменен с помощью гибридизации in situ.

В группе 2 аномалии хромосом обнаружены в 20-ти случаи из 141-го, среди них гоносомные аномалии - в 19-ти (13,5%), а аутосомные - в 1 (0,7%)(Рнс.2.), при этом синдром Клайнфельтера наблюдали в 9-ти случаях (6,4%), из которых 1 представлен мозаичной формой (0,7%); синдром де ля Шапелля в 6-ти случаях (4,3%), синдром днсомин Y - в 2-х (1,4%); в одном случае обнаружена маркерная хромосома у пациента с ннтерсексуальным фенотипом (0,7%)(Табл.2).

У 1 пациента с азооспермией (0,7%) обнаружена сбалансированная транслокацня хромосом 1 и 13, кариотнп: 46,XY,t(l;13)(q44;ql3).

Среди 19 индивидуумов с аномалиями гоносом по результатам цитогенетнческого исследования большую долю также составили пациенты с синдромом Клайнфельтера - 9 случаев (47,4%), среди них мозаичная форма - 1 (5,3%); затем - с синдромом де ля Шапелля - 6 (31,6%); и синдромом днсомин Y - 2 (10,5%); у одного пациента в кариотипе обнаружена маркерная хромосома (5,3%)(Табя2). Один случай, когда аномалия гоносом была выявлена молекулярно-цитогенетическнми методами, рассмотрен ниже .

Помимо этих двух групп проведен цитогенетический анализ 142 индивидуумов мужского пола (73 детей н 69 взрослых), не имеющих в анамнезе выраженных аномалий полового развития н/нли нарушений репродуктивной функции. При этом у одного ребенка выявлено увеличение гетерохроматинового района хромосомы 9, кариотнп 46,XY,9qh+, а у одного взрослого пациента - экстремальный хромосомный вариант

гетерохроматинового района хромосомы 1, кариотнп 46,ХУ,1с)1гК Такая частота не превышает среднепопуляцнонную (до 1,6%)(Демндова,1992). У 72 детей н 68 половозрелых индивидуумов определен нормальный кариотнп, в котором не отмечалось каких-либо цитогенетнческих особенностей.

Табл.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛ ЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ У ВЗРОСЛЫХ ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ

РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ

N п/п КАРИОТНП ФЕНОТИП ВОЗРАСТ ЗОНД КАРИОТИП (по рез-татам IISH/FISH) прим

1-8 47.XXY с-м Клайнф. 18,22,23,24, 25,25,28,29л. PYAM10-40 47,XXY.ishXp11.1-q11.1(pYAM10-40x2) +

в 47.XXY/48.XY мужской 22 года PYAM10-40 48,XXY+mar.ish Xp11.1-q11.1 der(X)(pYAM10-40 x3)[8]/47,XXY.ishX pll.l-qll.1 (pYAMIO-40x2)190}/ 48.XY.lshXp11.1-q 11.1(pYAM1040x1)[4]

10 48.XY мужской 22 года Gen-s-Y- atpha; pYAM10-40 48JW.ishXp11.1-q 11.1(pYAM10-40x2; gen-s-Y-afcha-) [10J/ 48,XY.IshYp11.H 11.1(pYAM10-40x1; g»n-s-Y-alphax1) [190] 1

11-18 48,ХХ мужской 19,20,21,21, 23,24 года Gen-s-Y-alpha; pYAM10-40 48.XX.lshXp11.1-q 11.1;Yp11.1-q11.1 (pYAM1040x2;gen-s Y-alpha-) +

17; 18 47.XYY мужской 18:21 год Gen-s-Y-alpha 47.XYY.ishYp11.1-q11.1(gen-s-Y-alphax2) +

19 4вД,+таг интерсекс 19 лет Gen-s-Y-alpha; 48.11.0 40,X,del(Y)(p11). ish deKY)(p11.3) (gen-s-Y-alphaxl; РАС 48.11.0-) «

ПРИМЕЧАЛИ Я + цитогенетческий диагноз подтвержден с помощью гибридизации in situ * цитогенетический диагноз уточнен с помощью гибридизации in situ ! цитогенетический диагноз изменен с помощью гибридизации in situ.

Как известно, в общей популяции около 2% мужчин репродуктивного возраста страдают инфертнльностью (Goncalves et al., 1996). У 5-15% мужчин, имеющих нарушение сперматогенеза, обнаруживаются хромосомные нарушения, нз них аномалии гоносои составляют 75%, а аномалии аутосом - 25% ( Курило, 1989; 1998; Barakat et al., 1986; Yoshida et al., 1997). Исследование среди 210 супружеских пар с нарушением репродуктивной функции выявило 10 мужчин с хромосомными аномалиями (4,8%). Из них 6 имели аномалии гоносом и 4 - аномалии аутосом (сбалансированные транслокацин) (Ворсанова и др., 1995; Берешева, 1995). По данным ряда исследователей хромосомные нарушения имеют 15-18% пациентов с азооспермией н 5-8% с олнгозооспермией (Курило, 1998). В первой группе большую часть составляют пациенты с синдромом Клайнфельтера, во второй- носители аутосоыных аномалий: робертсоновские н рецнпрокные транслокацин (Курило и др., 1997; Курило, 1998; van Assche et al., 1996).

Показано, что частота врожденных нарушений полового развития, наблюдающаяся у московских детей при рождения, составляет 1 на 1550 (Селиванова, Тарская, 1995; Тарская, 1996). Одной нз особенностей аномалий гоносом, обуславливающей их клиническую и социальную значимость, является сравнительно легкое течение заболеваний, связанных с аномалиями репродуктивной системы, при отсутствии у больных множественных врожденных пороков развития и выраженной умственной отсталости. Около 1% больных с задержкой умственного развития имеют патологию гоносом (Маринчева, Гаарнлов, 1988). При этом, умственное развитие может быть ниже норны, но выражается не столь отчетливо, как в случаях аномалий аутосом. Многие больные имеют нормальный интеллект при недоразвитии половых органов или репродуктивной дисфункции (Vogel, Motulsky, 1986). Согласно данным современных исследований, многие аномалии половых хромосом остаются невыделенными у индивидуумов мужского пола, так как единственным клиническим проявлением таких нарушений может быть ннфертнльность, которая, зачастую, не является в настоящее время поводом для обращения пациента в генетическую консультацию. Полученные нами результаты, в целом, соогвгкпвукл литературным сведениям.

Среди хромосомных аномалий в группах 1 и 2 встречались как численные (анеуплоидии. в юн числе мозаичные формы и маркерные хромосомы), так и структурные (делецин, транслокацин). Причем, во многих случаях невозможность идентифицировать хромосомные аномалии (маркерные хромосомы, гоносомиый мозанцизм, микроделеции) с помощью традиционных цнтогенетнческих методов бьша очевидна В подобных случаях применялись молекулярно-цнтогенетическне методы.

Молекулярно-цитогенетическое исследование соматических клеток у пациентов с нарушением репродуктивной системы.

Молекулярно-цитогенетическое исследование хромосом в группе 1 проведено в 22 случаях для: 1) уточнения доли аномального или нормального клона (7 случаев - 5%), в том числе при выявлении "скрытого" гоиосомного мозанцнзма (2 случая - 1,3%); 2) обнаружения нормальной клеточной лнннн при полной цнтогенетической форме синдрома, в случае атипичной или стертой клинической картины (forme fruste) - 10 случаев (6,7%); 3) установления происхождения маркерных хромосом (6 случаев - 4%), причем в одном случае наблюдали сочетание мозаичного кариотнпа с маркерной хромосомой (Табл.1).

По данным молекулярно-цитогенетнческой диагностики 2 клеточные линии выявлены в 6-тн случаях, а 4 клона- в одном. У ребенка 1,5 лет с множественными врожденными пороками развития н аномалией половых органов с мозаичным кариотипом 48,XXXY/49,XXXXY (Табл.1, N9). При помощи гибридизации in situ с хромосомо-Х-спецнфичным ДНК зондом pYAM10-40 были выявлены еще две клеточные линии. После молекулярно-цитогенетнческого исследования данного пациента определен следующий кариотнп: 47,XXY.ishXpll.l- qll.l(pYAM10-40x2) [3] /48,XXXY.ishXo 11.1-qll.l(pYAM10- 40хЗ)[8] /49.ХХХХУ. ishXpll.l-qll.l (pYAM10-40x4)[84] /50,XXXXXY.ishXp 11.1 -ql 1. l(pYAM10-40x5)[5],

Во всех мозаичных случаях клеточные линии отличались числом половых хромосом (X или У)(Табл.1, NN 6,7,8,9,17,18,19). В одном случае цитогенетическнй диагноз мозанцизма 47,XXY/46,XY не подтвержден. Определена полная форма синдрома Клайнфельтера, кариотнп: 47.XXY (N10). В 6-ти случаях установлено происхождение маркерных хромосом, дериват хромосомы X - в 2-х случаях, дериват хромосомы Y - в 4-х случаях, при этом в 1-м случае (N18) маркерная хромосома в кариотипе (der Y) сочеталась с клеточной линией 45,X (Табл. 1).

Молекулярно-цитогенетическое исследование в группе 2 проводили в 19 случаях для: 1) определения доли мозанцизма в 1-м случае - (0,7%); 2) установления происхождения и состава маркерной хромосомы в 1-м случае (0,7%); 3) выявления аномального клона у пациента с интерсексуальным фенотипом в 1-м случае (0,7%); 4) выявления скрытого гоносомного мозанцизма при фенотипических особенностях пациентов, характеризующих одну из форм синдромов, связанных с аномалиями гоносом (16 случаев -11,3%).

По данным молекулярно-цитогенетнческой диагностики 2 клеточные линнн выявлены в 1-м случае, 3 клеточные линии также в 1-м случае, причем в последнем (Табл.2, N 9) 3% клеток содержали дополнительную маркерную хромосому, дериват X, в другом случае (Табл.2, N19) происхождение и состав маркерной хромосомы определены как дериват Y.

Молекулярно-цитогенетнческий анализ осуществлен с целью подтверждения или уточнения гипотезы о мозаичном характере некоторых форм гоносомных аномалий у жизнеспособных индивидуумов, что известно, например, для синдрома Шерешевского-Тернера (Бужневская, Выговская, 1990; Hook, Warburton, 1983, Hassold et al., 1988). Несмотря на анализ большого числа клеток в каждом случае (не менее 100) после гибридизации in situ, нами не определены мозаичные формы с нормальным клоном. Исключение составил 1 случай, когда при кариотнпе 47.XXY была выявлена нормальная клеточная линия 46,XY(N 6, Табл.1). В 1 случае, напротив, был исключен мозанцнзм и установлена полная форма синдрома Клайнфельтера (N 10, Табл.1).

Метод ннтерфазного анализа был применен во всех случаях для верификации полученных данных с помощью метода IISH и FJSH-анализа метафазных пластинок. Ранее была показана возможность определения анеуплондий в ннтерфазных клетках при сравнении с метафазными (Ворсаяова и др., 1986; 1991; Юров и др., 1995). В данном исследовании на большой популяции клеток (не менее 100 метафазных и 500 интерфазных клеток в анализе для каждого пациента) проведена оценка возможности диагностики анеуплондий гоносом на ннтерфазных ядрах. Для подтверждения степени достоверности ннтерфазного FISH-анализа использовали препараты больных с различными видами гоносомного мозанцизма (Табл.3). По числу клеток с различным количеством сигналов определяли содержание мозаичного клона, и найденное соотношение сравнивали с аналогичным результатом метафазиого анализа препарата.

Сравнение производили с использованием ^преобразования частот (Урбах, 1975). Из результатов проведенного нами анализа видно, что подсчет интерфазных ядер, печенных in situ (Табл.3), дал возможность достоверно определить соотношение мозаичных линий при сравнении долей клонов, обнаруженных при анализе метафазных и ннтерфазных клеток. Необходимо отметить, что по данным ряда исследователей для достоверного определения числа хромосом X, например, при диагностике пола без учета мозаицнзма, достаточно проанализировать б интерфазных ядер, вероятность ошибки при этом не более 0,01 (Ворсанова и др. 1991; Юров и др., 1995).

Табл.3 Сравнение соотношений клеточных клонов в случаях мозаицнзма, при метафазном __и интерфазном FISH-алализе. _

Число случаев Кариотнп число хромосом X в мет аф азе 1 2 3 4 5 число сигналов в интерфазе 1 2 3 4 5

1. 47,XXY/46,XY 7 93 78 922

2. 47,XXY/46,XY 90 10 886 114

3. 47,XXY/46,XY 92 8 930 70

4. 46,XX/46,XY 190 10 935 65

5. 48,XXY,+der(X)/ 47,XXY/46,XY 4 96 42 889 69

6. 47.XXY/48.XXXY/ 49,XXXXY/ 50,XXXXXY 3 8 84 5 2 8 94 862 34

Полученные данные свидетельствует в пользу объективности и эффективности указанного способа определения аиеуплоиднй. Точность данного метода обеспечивается отсутствием технических погрешностей, возникающих при приготовлении фиксированных препаратов культуры лимфоцитов периферической крови, когда метафазные хромосомы, под воздействием внешних факторов, утрачиваются, образуя неполный карнотип, создавая у исследователя иллюзию мозаицнзма (псевдомозаицизма). Сложности обычно возникают при генетическом консультировании больных с мозаичными формами гоносомных синдромов из-за стертой клинической картины (forme fruste), при которой существует возможность сохранности репродуктивной системы, и вероятность воспроизведения потомства весьма значительна. Молекулярно-интерфазная диагностика синдромов, связанных с аномалиями половых хромосом, является одним из способов решения этой проблемы (Юров и др., 1995)

Оценку ciaincnmecKOil значимости различий проводили с использованием ф-преобразовпння частог (Урбах, 1975). Во всех случаях различия сравниваемых параметров ннтерфазного и метафазного анализа не значимы (Р<0,05).

Таким образом, среди индивидуумов 1-й и 2-й групп, имеющих аномалии кариотипа, с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот в условиях in situ (IISH и FISH) цнтогенетический диагноз был уточнен в 9 (21,9%), изменен в 7 (17,1%) и подтвержден в 25 (61,0%) случаях. Суммарно, необходимость молекулярно-цитогенетической диагностики по нашим данным возникает в 39% случаев после проведения классической цитогенетической диагностики.

В нашем исследовании происхождение маркерных хромосом во всех случаях было гоносомным. При выявлении маркерной хромосомы у пациентов с нарушением репродуктивной системы представляется возможным упростить схему определения их аугосонного и гоносомного происхождения, ранее предложенную в лаборатории молекулярной цитогенетики Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, при помощи двухцветовой флюоресцентной гибридизации in situ в "жестких условиях" с хромосомо-Х и Y-специфичпымн ДНК-зондами, меченными различными флюорофорамн. Предлагаемый метод состоит нз двух этапов:

1) Быстрая, в течение 15-60 минут, гибридизация in situ с гоносомо-спецнфнчнымн ДНК- . зондами, меченными различными флюорофорамн (Soloviev et al., 1994; Yurov et al., 1997);

2) Отмывка препаратов в "жестких" условиях с последующей детекцией и идентификацией сигнала на маркерой хромосоме под микроскопом.

Такой способ определения происхождения маркерных громосом позволил эффективно (в течение одного дня) установить их природу, причем для этой процедуры достаточно одного препарата культивированных лимфоцитов периферической крсви. Подсчет числа сигналов, как в метафазных, так и в ннтерфазных клетках, позволил анализировать большое количество клеток, что обеспечивает высокую точность определения природы маркерных хромосом.

Удельный вес нерасхождения хромосом в мужских половых клетках.

В целях определения анеуплоидии в половых клетках, как показателя нерасхождения хромосом в мейозе, в 27-мн случаях были проведены молекулярно-цитогенетнческне исследования половых клеток эякулята У 24-х из 27-ми обследованных пациентов отмечено нарушение сперматогенеза, представленное азооспермией, олнгозоосперыией, тератозооспермией или сочетанием указанных форм патологии. Флюоресцентную гибридизацию in situ проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для гоносом (X и Y) и аутосом (1,4,10,13+21,18). Аугосомные ДНК-пробы применяли для оценки нерасхождения хромосом в мейозе. Морфометрический анализ диаметров ядер половых клеток из эякулята на цитологических препаратах и после процедуры FISH, выявил возможность идентификации гамет на определенньи стадиях их развития (Табл.4).

Результаты анализа показали, что значимых различий между диаметрами ядер половых клеток на цитологических препаратах и препаратах подвергнутых процедуре гибридизации in situ нет (Т-критерий Стьюдента ST<0,5).

Табл.4. Результаты морфоыетрнческого анализа ядер половых клеток эякулята, проведенного на цитологических препаратах и после процедуры гибридизации in situ

(FISH).

нетод количество клеток (N) среднее значение диаметров (X) мкм стандар-тное отклонение (S) стандарт-пая ошибка (Sx)

сперматозоиды

FISH-аналнз 150 5,95 0,26 0,02

цитологический анализ 223 5,96 0,23 0,02

сперматиды

FlSH-анализ 90 8,35 2,36 0,25

цитологический анализ 90 8,24 2,07 0,22

сперматоциты

FISH-анализ 14 20,9 5,80 1,53

цитологический анализ 51 19,8 6,67 0,93

У 3-х пациентов с нормальным кариотнпом и нормоспермией не выявлено дисомнн хромосом X, Y, 4 по данным молекулярно-цитогеиетнческих исследований гамет (табл.5).

У некоторых из обследованных нами пациентов с нормальным кариотнпом и нарушением сперматогенеза выявлено увеличение числа дисомных гамет (до 60%) по сравнению с частотой днсомии у здоровых мужчин по данным других исследователей (Blanco et al., 1996; Guttenbach et al., 1997). Очевидно, что только небольшая доля половых клеток с анеуплондией может достигать определенной стадии днфференцнровки, формировать сперматозоиды и участвовать в оплодотворении (Табл.6).

У пациента с кариотнпом 46,XY,t(l;13) и азооспермией на суховоздушных препаратах клеток эякулята выявлено лишь 10 сперматозоидов, в 3-х из них определена дисомия хромосомы 1. Из 93-х сперматнд в 22-х также определена дисомия хромосомы 1, в одной сперматнде - трнсомня Примерно в 20% сперматоцнтов наблюдали днсомию по хромосоме 1 (28 из 148 клеток), в одной клетке выявлена трнсомня хромосомы 1. По-видимому, транслокация хромосомы 13 и хромосомы 1 у данного индивидуума, является причиной нарушения расхождения хромосом в делениях созревания. Выявленная нами

Тао л•5

РЕЗУЛЬТАТЫ FISH АНАЛИЗА ПОПОВЫХ КЛЕТОК ПЙЦИЕНТОВ С НОРМАЛЬНЫМ КАРИОТИПОМ И НОРМОСПЕРМИЕЙ

N спермогранма нариотип ДНК-проба распределение сигналов j Hdiipo

к ■во * к- попои*н.* гаплоидные ПК (сп~ зоиды+типы) спернатоци гы j вки профазы I ( %

А >-Ь с d

1 норм ос п е р м и н 46, XV 4 ceri 1 - 500 < 100-Л) j 10«

X ceri 1-502 <50%) I

эо 4M 15 37 V с-Е?П 1--4ЭЗ <49%) 1

2 нориосперния 46, XV X сеп Y ceri 0-50 <48%) 1-55 <52%) 0-42 <48%) 1-46 <52%) " | -

60 51 1 1 за |

нормоспермин 46, X Y X ccn 1-10Й <51%) 1 1 3%

48 32 51 47 —J Y ceri 1 -98 ( 49%) 1 < ,

*а+Ь-- активно подвижные сперматозоиды с - малоподвижные сперматозоиды d~ неподвижные сперматозоиды * »количество указано в миллионах на 1 мл эякулята

Табл.в

РЕЗУЛЬТАТЫ FISH АНАЛИЗА ПОПОВЫХ КЛЕТОК ПЙЦИЕНТОВ С НОРМАЛЬНЫМ КАРИ0ТИП0М И ПАТ0300СПЕРМИЕ1Ч

N спермог рамка карио-r ип ЛНК-npoöa распределение сигналов нан ро голо - DH И %

к ■ подвижн. ► г яплоидные ПК <сп~ зоидьи-тиды) сперматоциты профазы I

b С d

1 астенозоо-спсэрмия 46, XY lO сеп 1-93 <Эв%) 0--2 <2%) 0-1 <0,5%) 1-134 <63%) 2-77 <36%) 3-1 <0,5%) - 5%

1 ceri

1 ceri 0-6 <2%) 1-120 <40%) 2-161 <57%) 3-3 <3%)

27 2 42 56

npoflonweHMe Td6n.6

d 1 ; c\C rCHCiSOO cnefJMHa 65 |¿3 je0 j 57 46, XV Y ce ri 10 ceri 1-125 <50%)| Ci-10 <4%> 1 -.240 <96%) — -

3 e*C fiiHOSC'O-CllOpMMSI go j i j 30 jea 46, XY X cen 13»£1 c-en 1-153 (51%) 0-4; 1-4 £"£0£ (94*) — C, 5%

ac rcyno3co -cncpHKn 46, XY X ceri 18 ce-ri 1 -50 <50«) 0-1 ; £-1 1-90 <98%) — -

35 36 ¿5 39

5 dC rPHO — 3oocnepMMn 46, XY X cen 16 cen 1-136 <50«) 0-4 t - 4 1 -33? i. 98%) — 30%

55 jl9p»3 ¡¿8

6 onMroaOCJC -cnepMMn 46, XV Y cen X cen 1-147 <43%) 1-153 <51%) — -

11 10 29 jei

-T onxroacteiio-soocnepMHn 46, XV 13+21 cen 10 cen 2-945 (95%) 0-¿5; 1-30 1-965 <97%) 0-10; 2-£5 — 2,5

13 ¡30I£5 3

6 OHMrC'SOOC - c.nepHMB 46, XV 1 cen 1B L-eri 1--E4Q <99%) 0-5 1-245 (98%) 0-5 —

6 77 1£ 11

9 otiMroac i eno-BoocnepMMFi 46, XY, lqhph X cen 0-80 (4C>%) 1-96 <48%) ¿-24 <1£%) 8%

11 1C> 36 5£

! 0 orivir oac i eno - 3C'riClti?prtMH 46, XV X cen 18 cen Y con 13+21 cert 1-09 (45%) 1-196 <9S%) 1 -159 (53%) ¿-£94 <98%) -

4 ¡12 ¿1 57 |

11 onur cidt i eue -ooccnepMMH 46, XY X CE?r. 1—£01 <50%) 1 199 (50%) i

1 ¿'8 50 1 |Y ceri

пр<..ччопж1?ние Таьп.6

опт oàc г en' X с. в ri 1 -£56 (SIM

i£ ЗГ'ОСПВрКИП 46, XV -

---------- — 1 31-21

3 Ii¡51 1 I 37 с en £ -465 (ЭЗ/1)

46, XV 13«£1 0-3 о- о

13 йстрнозоо- ceri 1 -3 1- 0

г -£Э4 £- 0 г, s

с периии 3-0 3- 0

> -0 > о

э 30

G, XY X ceri 0 81 0 о

1 4 опи г о .а с т rhô 1-86 1 - 1 £

£-£ £■• 1 о, s

У ^«ОСП€?рМИ91

Y с ií ri 0 - löG 0 1

1 -79 1 -■ 1

£ - ч £•■ Cl

IQ ce ri 0-4 О- 0

1 3££ 1 1£

1

*

i 1 о 33 ев

X ceri 0-30 0 7

опиг о а с г гжо 46, XY 1 -30 1 • Id

г*оосперммя £-1 2- 0 £. 5

Y ceri 0-61 0- 3

i -г 4 1 5

£ 1

¿1 t-13 0-0 0- 0

с en 1 -3 1 - 1

г-io 0

го «

46, XY X cer, 0~£7 о- 1

16 олм г оле rtíHO - i -го 1 - "7

герат ог ) il» О £-14 г- ~7 elf 5

с иирмия 3 -3 з - 7

> а

Y c: c-ri o sa 0-

i -а 1

£ 16 £-.

3 - 3 3

> 3 > - С-

. 1 1° 3, 68

ПрОДОЛЖСЗИИе Табл. 6

17

омигоас гино-г ера(озоо-спсрпип

О,а 16 124(58

46, XV

X сен

V сеп

0 -41

1 -бО £-13 3-0

0-13 1 -С' £-1 3 О

активно подвижные сперматозоиды с- палолопвижние сперматозоиды с1— неподвижные сперматозоиды »»количество умазано б миллионах на 1 ип эянулнта

0 4

0

1 1 1

О

Табл.7

РЕЗУПЬТПТЫ Р15Н 0Н0.ПИ30 ПОПОВЫХ КЛЕТОК ПАЦИЕНТОВ С ИН0М0ЛИЯМИ КйРИОТИПй

N спермограмма кариотил ДНК-п ро 6 а ......... 1 - ......... ...... распределение сигналов мак ро ГОЛ о -ЕЖИ ■А

ЕЮ подвижн.* гаплоидные ПК <сп-зоиды+тиды) сперма гоциты профазы I

а+Ь с с!

1 а?оос: пер ■■ НИИ 46, XV, е (1;13) 1 СЕП 0-е 1-69 £—£5 3-1 > 0 0- 44 1 - 75 а • га 3- 1 > 0 10

>- опмгоаст— енотера -Iояооспермия 47,ХХУС63 /46,ХУ СЭ43 X сег, 0-э 1-63 £-84 3-£2 > £1 0 - 0 1- 0 г- 1 3- 4 > 10 £

0, 9 0 ° 0

3 опигоаст ■ ено тера -гозооспе рмия 47,XXV X сел 0-££ 1-65 £-6 3-1 0- 8 1- 13 Е- 14 3- 1 > г -

продолжение Табл.7

онигоас г

С-ЩОЗООС * Г1£?рМИЯ

ИЛИ азооспермия

47,ХХУ

X свп

О-17

1 -3 Р-Р

а

спермин

X сеп

47, ХХУ

0-ее <43',4)

1-34 <17%> г-ао <405<>

а эооспер мин

47,ХХУ

X сеп

У сеп

0 — 1 9

1-г

з-о

Об

1 -г 2-0 3-0

£1 в

0

1 1 1

■а зооспор-пил

47, ХХУ

У сеп

X сел

0-3

1 -г г-о з-о

0-1 1 -4

г-о

3 -4

1 1 1

О

о

8 Б 11

7 6

4

1

.5"

6

>

„5 "

►аактивно подвижные сперматозоиды с- малоподвижные сперматозоиды с1- неподвижные» сперматозоиды

'«количество умазано в миллионах на 1 нл зямулята

дисомнн хромосом в сперматоцитах профазы I мейоза является, возможно, следствием нарушения конъюгации транслоцнрованной хромосомы (Табл.7).

Нами исследованы половые клетки б-тн пациентов с синдромом Клайнфельтера При анализе частоты нерасхождения хромосомы X в случае мозаицизма 47,XXY/46,XY (1 пациент) дисомня выявлена в 43% сперматозоидоа и сперматид, причем три и более гибридизациоиных сигнала выявлено в 22% этих клеток. У пяти обследованных нами пациентов с карнотипом 47,XXY частота дисомии X в сперматозоидах и сперматидах определенав пределах 6% - 40% (Табл.7).

При молекулярно-цнтогеиетическом анализе сперматоцитов у пациентов с синдромом Клайнфельтера в 20-36% клеток выявлена дисомня хромосомы X. По-видимому, у пациентов с карнотипом 47,XXY сперматогенез нарушается на стадии сперматоцитов I, что подтверждается семиологнческнм исследованием состава незрелых половых клеток эякулята. Такая остановка процесса сперматогенеза приводит к интенсивной гибели половых клеток и может явиться причиной азоо- или олигозооспермнн тяжелой степени. В литературе появляются публикации об уровне хромосомных аномалий в зрелых гаметах (сперматозонды)(ОиПепЬасЬ et al., 1997); данные о частоте дисомни в незрелых половых клетках (сперматоциты и сперматиды) у пациентов с полной формой синдрома Клайнфельтера отсутствуют. Таким образом, с помощью молекулярно-цитогенетических методов установлена зависимость между частотой нерасхождения хромосом в половых клетках, нарушением сперматогенеза и карнотипом соматических клеток.

При использовании гетерологичного оплодотворения ооцитов хомячка сперматозоидами пациента с карнотипом 47,XXY/46,XY показано увеличение частоты гипергаплоидни - 24,XY сперматозоидов (до 0,9%) (Cozzi et al., 1994), опубликованы также данные о наличии 2% сперматозоидов с днсомиен X в эякуляте пациента с таким же мозаичным карнотипом, получеиные с помощью FISH ранге (Chevret et al., 1У96). Полученные результаты подтверждают предположение о том, что у пациентов с карнотипом 47,XXY может, по-видимому, происходить предпочтительная конъюгация юмологичных юносом (в этих случаях XX) н некоторые из таких гамет способны проходить через мейоз, формируя сперматозоиды (Cozzi et al., 1994; Blanco et al., 1996).

Результаты проведенного молекулярио-цнтогенетического анализа половых клеток у пациентов с нарушением сперматогенеза подтверждают возможность выявления в них определенной доли хромосомных анеуплоидий, которые могут явиться причиной нарушения сперматогенеза, и в дальнейшем причиной формирования эмбриона с численным нарушением кариотипа.

Таким образом, установлена доля аномалий гоносом при нарушении репродуктивной системы. Среди мальчиков с задержкой полового развития патология гоносом встречается с частотой 14,8%, среди взрослых пациентов с нарушением репродуктивной функции- в 13,5% случаев. Определены показания для проведения молекулярно-цнтогенетнческой диагностики, которыми являются наличие в кариотипе дополнительной маркерной хромосомы, обнаружение мозаицизма с присутствием двух нлн более клеточных линий, выявление сложных хромосомных аберраций с участием трех и более хромосом, наличие терминальные илн ннтерстнциальных делеций и инверсий, стертая клиническая картина соответствующего синдрома (forme fruste), обнаружение нарушений гаметогенеза (азооспермия, олнгозооспермия, тератозооспермия и т.п.) при анализе клеток эякулята Установлен высокий уровень хромосомной анеуплоидии в половых клетках мужчин с нарушением репродуктивной функции по сравнению с нормой.

Подтверждена возможность применения молекулярно-цитогенетическнх методов Оля выявления аиеуплоидий в интерфазных ядрах соматических и половых клеток. Около 40% случаев аномалий гоносом, выявленных методами классической цитогенетики, требуют молекулярно-цитогенетическнх исследований с целью уточнения или постановки диагноза.

Молекулярно-цитогеиетические методы могут быть успешно использованы для выявления хромосомных аномалий в соматических и половых клетках человека.

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны показания для молекулярно-цнтогенетического исследования при задержке полового развития н нарушении репродуктивной функции: наличие в карпотнпе дополнительной маркерной хромосомы, обнаружение мозаицизма с присутствием двух или более клеточных линий, наличие терминальных или интерстициальных делеций и инверсий, стертая клиническая картина синдрома (forme fruste), обнаружение нарушений гаметогенеза неясной этиологии (азооспермия, олигозооспермия, терагозооспермия, астенозооспермия.) при анализе эякулята.

2. Среди детей с задержкой полового развития патология гоносом встречается с частотой 14,8%, qieflii взрослых пациентов с нарушением репродуктивной функции- в 13,5% случаев.

3. Применение молекулярно-цитогенетическнх методов позволило в 21,9% случаев уточнить и в 17,1% случаев изменить цнтогенетический диагноз.

4. Показана необходимость применения FISH диагностики в 39% случаев нарушения репродуктивной функции, обусловленной хромосомными аномалиями.

5. С помощью молекулярно-цитогенетическнх методов установлена зависимость между кариотнпом пациентов с нарушением репродуктивной системы и частотой хромосомных нарушений в незрелых половых клетках и сперматозоидах.

6. Подтверждена эффективность ннтерфазного FlSH-метода для анализа лимфоцитов периферической крови и половых клеток из эякулята

7. Молекулярно-цитогеиетические исследования позволили выявить повышение частоты днсомнн хромосом (ках аутосом, так и гоносом) в половых клетках эякулята у пациентов с нормальным кариотнпом и аномалиями сперматогенеза, а также у пациентов с аномальным кариотнпом и олигозоо- или азооспермией.

8. Рекомендуется проведение молекулярно-цитогенетической диагностики хромосомных нарушений в гаметах с применением высокоспецифичных ДНК-проб для определения уровня нерасхождения хромосом на различных стадиях сперматогенеза

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.ВорсановаС.Г., Юров Ю.Б., ЗероваТ.Э., ДемидоваИ.А., Шаронин В.О. Молекулярно-цитогенетический анализ маркерных (мини) хромосом генома человека// Сб-к работ "Геном человека-94", Черноголовка, 1994.-17.

2.ВорсаиоваС.Г., ЮровЮ.Б., Мале П., Демидова И.А., Соловьев И.В., Жаффрей Д., Шаронин В.О., Ройзес Ж. Эффективность молекулярно-цитогенетической диагностики в практике клинической генетики.//Генетика, 1994.-30.-27-28.

3.Ворсшюва С.Г., Соловйов И.В., Юров Ю.Б, Демщова ПА., Вехова Н.В., Шарошн В.О., Казанцева Л.З., Гречанша О.Я., Буоюевська T.I., Зерова Т.Е., Мале П., Ройзес Г.

Молекулярно-цитогенетнчна пре- та постнатапьна диагностика хромосомно! патологи.// П ЗЧзд медичних генетнюв Украши, JlbBÎB, 1995.-36-37.

4.Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Соловьев И.В., Жафрей Д., Демидова И.А., Вехова Н.В., Шароннн В.О., Казанцева Л.З., Роизес Ж. Молекулярно-цитогенетическая диагностика в профилактике хромосомных болезней у детей.// Тезисы международ. конф."Акгуальные проблемы профилактики неинфекциониых заболеваний" по линии МЗМПРФ.М., 1995.-35.

5.Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Демидова И.А., Вехова Н.В., Берешева А.К., Шароннн В.О.. Молекулярно-цнтогеиетическая диагностика хромосом- ных аномалий при медико-генетическом консультировании детей с недиффе- ренцированными формами умственной отсталости.// Сб.статей МОНИКИ, "Медико-генет.консультирование и пренат. д-ка", M 1995.-150-161.

6.Соловьев И.В., Ворсанова С.Г., Демидова И. А., Вехова Н.В., Шароннн В.О., Мале П., Казанцева JI.3., Гречаннна Е.Я., Бужневская Т.И., Зерова Т.Э., Ройзес Ж., Юров Ю.Б. Роль молекулярно-цнтогенетической диагностики в пост- н пренатальном выявлении хромосомной патологии.// Ультразвуковая перинат. диагностика, 1995.-6,7.-65-70.

7.Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Соловьев И.В., Гречаннна Е.Я., Бужневская Т.И., Жноллант М., Мале П., Демидова И.А., Зерова Т.Э., Вехова Н.В., Шароннн В.О., Ройзес Ж. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных аномалий у детей с недифференцированными формами умственной отсталости.// Сб. науч. трудов "Актуальные вопросы психиатрии". - Тбилиси,- 1995.- 139-142.

8.Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Соловьев ИВ., Сан ас М.Дж., Шароннн В.О., Курило Л.Ф., Гишауа М.Р., Лучиани ДМ.. Быстрый хромосомный анализ половых клеток с помощью FISH.// Сб-к работ 'Теном человека-96", Черноголовка, 1996.-78.

9.Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б. Соловьев И.В., Демидова И.А., Шаронин В.О., Вехова Н.В., Берешева А.К., Мале П., Жнолант М, Колотий А.Д, Кравец B.C., Казанцева Л.З., Ройзес Ж Современные .достижения молекулярной цитогенетнкн в диагностике хромосомной патологии у детей.// 'Toc. вест, перинат. и педиатрии", 1998.-43.-1.-31-36.

Ю.ВорсаиоваС.Г., Юров Ю.Б., Соловьев И.В., Шаронин В.О., Демидова И. А., Колотий АД, Берешева А.К., Вехова Н.В., Ройзес Ж. Использование многоцветовой флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) в диагностике хромосомных аномалий.// Сб-к работ 'Теном человека-98", г.Черноголовка, 1998.-70.

11.Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Соловьев И.В., ДемидоваИ.А., Шаронин В.О., Мале П., Жиолант М., Вехова Н.В., Берешева А.К., Колотий А.Д., Кравец B.C., Роизес Ж. Современные достижения молекулярной цитогенетики в пренат алыюй н постнатальной диагностике социально значимых форм хромосомной патологии.// Мат-лы VHI съезда педиатров России. Современные проблемы педиатрии, 1998.-204-205.

12. Ворсанова С.Г., Шаронин В.О., Курило Л.Ф. Аномалии половых хромосом при нарушении репродуктивной функции у мужчин.// Проблемы репродукции, 1998.-4.-2.-12-21.

13.Юров Ю.Б., Соловьев И.В., Ворсанова С.Г., Шаронин В.О., Монахов В.В., Георгиу А., Хаджимарку М, Патсалнс Ф., Казаков А.Е., Манандян К.К., Демидова И. А., Роизес Ж., Иоанноу П. Идентификация и цитогенетнческое картирование с помощью FISH наборов космид, PI, РАС н ВАС клонов, специфичных для хромосом 13,18,21,X и Y человека// Сб-к работ "Геном человека-98", г.Черноголовка, 1998.-34.

14. Vorsanova S.G.,Yurov Y.B.^Demidova I.A.,Vechova N.V., Soloviev I.V., Sharonin V.O., Kazantzeva L.Z. Application of in situ hybridization in clinical cytogenetics.// Analytical Cellular Pathology, 1994.-6.-3,- 193.

15.Demidova I.A.. Vorsanova S.G., Soloviev I.V., Sharonin V.O., Yurov V.B. (Cytogenetic investigations m children with mental retardation and congenital malformations: the increase frequency of cliroinosomal variants lqh+,9qli+, 16qlH among 1999 patients.// European J. of Human Genetics, 1996.-4,- 1. - 37.

16.KuriloL.F., MchitarovaE-V., Vorsanova S.G., Sharonin V.O., Soloviev I.V., Yurov Y.B. Chromosomal anomalies in patients with reproductive failures.// European J.of Human Genetics, 1996. -4,- 1. - 140.

17.Soloviev LV., Vorsanova S.G., Sharonin V.O., Monachov V., Yurov Y.B. Collection of DNA probes for FISH analysis of human chromosomes.// 2nd Balkan Meeting on Human Genetics, Turkey, 1996.-4.

18.Vorsanova S.G., Soloviev I.V., Demidova LA, Sharonin V.O., Kazantseva L.Z, P.Ioannou, Yurov Y.B. Clinical applications of uni- and multicolor fluorescence in situ hybridization (FISH) for molecular-cytogenetic diagnosis of chromosomal abnormalities.// AbsLof the 10th Inter. Congress of Histochemistry and Cytochemistry, Japan, 1996.-19.

19.Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Soloviev I.V., Demidova I.A., Malet P., Sharonin V.O., VechovaN.V., Rouzes G. Uni-and multicolor FISH for diagnosis of chromosomal anomalies.// 2nd Balkan Meeting on Human Genetics, Turkey, 1996.-3.

20.Vorsanova S.G., Soloviev I.V., Demidova I.A., .Sharonin V.O., Malet P., Kazantzeva L.Z., Yurov Y.B. Molecular cytogenetic diagnosis of chromosomal abnormalities using uni- and multicolor FISH.// European J.of Human Genetics, 1996.- 4.- 1. - 38.

21.Yurov Y.B., Soloviev LV., Vorsanova S.G., Sharonin V.O., Monachov V. DNA probes for pre- and postnatal diagnosis of chromosomal anomalies: a collection for FISH analysis.// PECO-EUCROMIC Congress, Prague, Czech, 1996.-87.

22.Yurov Y.B., M.J.Saias, Vorsanova S.G., R.Erny, Soloviev I.V., Sharonin V.O., M.R.Guichaoua, J.M.Luciani. Rapid chromosomal analysis of germ-line cells by FISH: an investigation of infertile male with large-headed spermatozoa// Molecular human reproduction, 1996.-2.- 9,- 665-668.

23.Soloviev I.V., Yurov Y.B., I.Ioannou, AGeorghiou, M.Hadjimarcou, P.C.Palsalis, Roizes G., Sharonin V.O., V.S.Kravets; Vorsanova S.G. Identification and molecular-cytogenetic characterization of large subset ofhuman plasmids, cosmids, PAC and YAC clones: the search of DNA probes for pre- and postnatal diagnosis.// Cesko-Slovenska pe- diatrie, 1997.-7.-529-538.

24.Soloviev I.V., Yurov Yu.B., Sharonin V.O., Georghiou A, Hadjimarcou M., Monachov V.V., Kazakov A.E, Patsalis P.C.,. Ioannou I., Roizes G., Vorsanova S.G. Construction and optimization of DNA probes for molecular studies ofhuman chromosome 21 by fluorescence in situ hybridization (FISH).// Abstr.of ATB conference., Milan, 1997.-45.

25.Soloviev I.V., Yurov Yu.B., Sharonin V.O., Ioannou I., Georghiou A., Hadjimarcou M., Patsalis P.C., Tocco T., Monachov V.V., Manadian K.K., Kazakov A.E., Malet P., Roizes G., Vorsanova S.G. Identification and fish mapping of cosmid, BAC, PAC, and YAC clones for molecular studies of centromeric heterochromatin in chromosomes 13, 21 and 22.// Cytogen. Cell genet., 1997.-77.-64.

26.Soloviev I.V., Yurov Yu.B., Sharonin V.O., Georghiou A, Hadjimarcou M., Tocco T., Monachov V.V., Manadian K.K., Kazakov A.E., Patsalis P., Ioannou L, Malet P., Roizes G., Vorsanova S.G. Identification and FISH mapping of cosmid, BAC, PAC and YAC clones for molecular studies of centromeric and telomeric regions inhuman chromosome 21.//Medezinische Genet., 1997.-9.-70.

27. Soloviev LV., Yurov Yu.B., Vorsanova S.Q., Sharonin V.O., Georghiou A., Hadjimarcou M, Tocco T., Monachov V.V.,Manadian K.K,Kazakov A.E., Palsalis P.,Ioannou I.,Malet P. FISH mapping of cosmid, BAC, PAC and YAC clones for molecular studies of centromeric and telomeric regions in human chromosome 21.// Cytogenet. Cell Genet., 1997.-7.-15.

28.Vorsanova S.G., Yurov S.G., Soloviev I.V., Demidova I.A., Sharonin V.O., VechovaN.V., Kravetz V.S., Kazantzeva L.Z, Malet P. Molecular-cytogenetic and clinical approaches in investigation of chromosomal anomalies.//Cytogenet.Cell Genet., 1997.-77.-126.

29.Vorsanova S.G., Yurov S.G., Soloviev IV., Demidova I.A., Sharonin V.O., Malet P. Molecular-cytogenetic studies of chromosomal anomalies in children with nondifferentiated forms of mental retardation.// Psychiatric Genet., 1997.-10.-47.

30. Vorsanova S.G., Yurov YuB., Soloviev I.V., Sharonin V.O., Demidova LA., Beresheva A.K., Kazantzeva L.Z, Malet P., Roizes G. Molecular-cytogenetic studies of chromosomal anomalies at children with mental retardation and couples with failure of reproduction function.// Medezinische Genet, 1997.-9.-79.

31.Yurov Y.B., Soloviev I.V., S.G, Vorsanova, LA.Alexandrov, Sharonin V.O., V.Monachov. DNA probes for pre- and postnatal diagnosis of chromosomal anomalies: a collection for FISH analysis.// Cesko-Slovatska pediatric, 1997.-7.-550-554.

32.Yurov Yu.B., Soloviev I.V., Vorsanova S.G., Alexandrov I.A., Sharonin V.O., Monachov V.V., Roizes G. A set of optimized DNA probes and rapid fish protocols for molecular-cytogenetic analysis of chromosomal anomalies.// Cytogen. Cell Genet., 1997,- 77.-67.

33.Yurov Yu.B., Vorsanova S.G., Sharonin V.O., Soloviev I.V., Monachov V., Manandian K., Kazakov A.E., Ioannou 1, Palsalis P.S., Georghiou A., Hadjimarcou M., Roizes G. A set of centromeric, telomeric and region specific PAC and cosmid clones as DNA probes for molecular-cytogenetics.//Medezinische Genet., 1997.-9.-80.

Типография ордена "Знак Почета" издательства МГУ 119899, Москва, Ленинские горы Заказ К» 120-1 ■ Тираж КМ) экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаронин, Василий Олегович, Москва

Министерство здравоохранения Российской Федерации. Московский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии. Российская Академия медицинских наук. Медико-генетический научный центр.

На правах рукописи

УДК 576.312.32./.38+616-053.2-056.714-076.5

ШАРОНИН ВАСИЛИЙ ОЛЕГОВИЧ

РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ СОМАТИЧЕСКИХ И ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПРИ НАРУШЕНИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ МУЖСКОГО

ПОЛА.

03.00.15 - генетика

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор С.Г.Ворсанова

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

Москва -

1998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................5.

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................6.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................12.

1.1. Аномалии гоносом при нарушении репродуктивной

системы...........................................................................................12.

1.2. Гены, структура и функции хромосомы Y человека......................................14.

1.2.1. Гены короткого плеча хромосомы Y.............................................15.

1.2.2. Гены длинного плеча хромосомы Y..................................................17.

1.2.3. Псевдоаутосомные районы гоносом...................................................18.

1.3. Структурные аномалии хромосомы Y....................................................19.

1.3.1. Нефлюоресцирующая хромосома Y.................................................20.

1.3.2. Делеции хромосомы Y...................................................................21.

1.3.3. Кольцевые хромосомы Y..............................................................22.

1.3.4. Y/гоносомные транслокации..........................................................23.

1.3.5. Y/аутосомные транслокации.............................................................24.

1.4. Анеуплоидии гоносом.........................................................................25.

1.4.1. Синдром Клайнфельтера.................................................................25.

1.4.2. Полисомии гоносом у мужчин...........................................................26.

1.4.3. Мозаичные случаи анеуплоидий гоносом...........................................29.

1.4.4. Маркерные хромосомы....................................................................29.

1.5. Аномалии аутосом при нарушении

репродуктивной системы.....................................................................31.

1.6. Цитогенетический и молекулярно-цитогенетический

анализ хромосомных аберраций............................................................32.

1.6.1. Классическая цитогенетическая диагностика.....................................33.

1.6.2. Молекулярно-цитогенетический анализ

аномалий хромосом.......................................................................35.

1.6.3. Хромосомоспецифичные ДНК-зонды...............................................36.

1.6.4. Радиоизотопная гибридизация нуклеиновых кислот в

условиях in situ: преимущества и недостатки........................................37.

1.6.5. Флюоресцентная гибридизация нуклеиновых кислот в

условиях in situ (FISH)....................................................................39.

1.6.6. Интерфазная молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных аномалий..................................................................41.

1.7. Анеуплоидии хромосом на разных стадиях развития

мужских половых клеток человека.........................................................42.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.........................................................................48.

2.1. Объект исследования..........................................................................48.

2.2. Цитогенетический метод.....................................................................48.

2.2.1. Культивирования лимфоцитов периферической крови, приготовление препаратов метафазных хромосом

и интерфазных клеток................................................................49.

2.2.2. G-окрашивание хромосом.................................................................49.

2.2.3. С-окрашивание хромосом................................................................50.

2.2.4. Принцип анализа хромосомных препаратов..........................................50.

2.3. Анализ половых клеток.........................................................................51.

2.3.1. Спермиологический анализ...............................................................51.

2.3.2. Метод получения препаратов тотальных ядер половых

клеток из эякулята...........................................................................51.

2.3.3. Количественный цитологический анализ состава половых

клеток эякулята..............................................................................52.

2.4. Молекулярно-цитогенетический метод....................................................56.

2.4.1. ДНК-полимеразная реакция замещения (ник-трансляция).....................56.

2.4.2. Радиоизотопная гибридизация ДНК на метафазных

хромосомах в условиях in situ.............................................................56.

2.4.3. Флюоресцентная гибридизация in situ: FISH на препаратах соматических и половых клеток с использованием проб,

меченных различными флюорофорами...............................................58.

2.5. Статистическая обработка полученных результатов...................................62.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

63.

3.1. Цитогенетическое исследование соматических клеток пациентов с нарушением репродуктивной системы.....................................................63.

3.1.1. Цитогенетическое исследование соматических клеток мальчиков с нарушением полового развития.........................................................63.

3.1.2. Цитогенетическое исследование соматических клеток

половозрелых мужчин с нарушением репродуктивной функции................66.

3.2. Молекулярно-цитогенетическое исследование хромосомных

аберраций в соматических клетках........................................................68.

3.3. Определение удельного веса нерасхождения хромосом в мужских

половых клетках...............................................................................77.

3.3.1. Исследование незрелых половых клеток эякулята и сперматозоидов у пациентов с кариотипом 46,ХУ.................................79.

3.3.2. Исследование незрелых половых клеток эякулята и сперматозоидов у пациентов с нарушениями кариотипа..........................85.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................95.

5. ВЫВОДЫ............................................................................................97.

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................98.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Днк- дезоксирибонуклеиновая кислота.

дт- диплотена.

зт- зиготена.

КА- количественный кариологический анализ.

л- литр.

лт- лептотена.

м- моль.

МФ- метафаза мейоза.

мкг- микрограмм.

мкл- микролитр.

млн.- миллион

мм- миллиметр.

мМ- миллимоль.

нг- нанограмм.

н.п.- нуклеотидная пара

НПК- незрелые половые клетки.

НТФ- нуклеозид трифосфат.

ПЛ- прелептотена.

ПТ- пахитена.

сГУТФ- дезоксиуридин 5'-трифосфат.

(ЩТФ- дезоксицитидин 5'-трифосфат.

ФГА- фитогемагглютинин. DABCO-1,4-диазабицикло-[2.2.2]октан.

DAPI- 4,6-диамидино-2-фенилиндол.

FISH- fluorescence in situ hybridization- флюоресцентная гибридизация на препарате.

1С SI- intra-cytoplasmic spermatozoa injection- внутрицитоплазматическая

инъекция сперматозоида. ISH- in situ hybridization- гибридизация на препарате IISH- isotopic in situ hybridization- изотопная гибридизация на препарате.

РАС- phage artificial chromosomes- фаговые искусственные хромосомы.

PBS- phosphate-buffered saline- фосфатный солевой буфер,

rpm- round per minute- обороты в минуту.

SSC- saline-sodium citrate buffer- натрий цитратный солевой буфер.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. Нарушения развития и функции органов репродуктивной системы у человека занимают третье место среди всех врожденных пороков развития в целом (Курило, 1996а,б; Barakat et al., 1986). Причинами нарушений репродуктивной системы могут служить как экзогенные факторы, так и наследственно обусловленная патология, связанная либо с хромосомными аберрациями (как численными, так и структурными), либо с генными мутациями. Изучение характера хромосомных аномалий при нарушении репродуктивной системы приобретает определенное значение ввиду их высокой частоты. В большинстве случаев эти аномалии связаны с половыми хромосомами: больные с синдромом Клайнфельтера составляют 6-7%; со структурными перестройками хромосомы X и Y или с мозаицизмом по нарушениям гоносом - 1-3% (Курило, 19966; 1998; van Assche et al., 1996).

Определение причин нарушения полового развития и репродуктивной функции, связанное с выявлением численных или структурных нарушений гоносом, имеет особое значение в изучении репродуктивной системы и является одной из ведущих проблем медицинской генетики. Изучение корреляции между нарушениями хромосом в соматических и половых клетках расширяют представления о механизмах генетического контроля этого процесса. До настоящего времени не разработана тактика диагностики и лечения больных с нарушением репродуктивной системы, не редки обращения пациентов в детском возрасте до пубертатного периода по вопросам определения пола, задержки или нарушения полового развития.

Выявление дополнительной или недостающей хромосом X и Y по наличию или отсутствию Х- или Y-хроматина в клетках буккального эпителия не отвечает современным требованиям диагностики. Цитогенетические исследования лимфоцитов периферической крови, как правило, позволяют установить характер большинства хромосомных нарушений.

Высокая частота встречаемости синдромов, связанных с аномалиями гоносом в популяции и особенно - среди больных с поражением репродуктивной системы, делает актуальной проблему своевременной цитогенетической диагностики. Известно, что 70-75% хромосомопатий, сопровождающихся аномалиями репродуктивной системы, возникает в результате численных или структурных нарушений половых хромосом (Курило, 1996а,б; 1998; Barakat et al., 1986; Yoshida et al., 1997). Их эффективная

диагностика позволяет выработать своевременную тактику гормональной коррекции пациентов с нарушением полового развития до наступления пубертатного периода. Однако, при использовании традиционных цитогенетических методов остается нерешенным ряд проблем, связанных с диагностикой сложных форм хромосомной патологии.

На современном уровне развития молекулярной и медицинской генетики имеются принципиальные возможности разработать методические подходы для изучения практически любого генетического заболевания, в том числе и хромосомного. Достижения науки в последние годы позволили разработать принципиально новые подходы к определению нарушений в кариотипе на основе использования клонированных последовательностей ДНК человека - хромосомоспецифичных ДНК-зондов. Идентификация хромосомной патологии базируется на применении проб, маркирующих только определенные хромосомы или их участки, что дает возможность выявить особенности хромосомного набора без прямого цитогенетического анализа путем гибридизации нуклеиновых кислот непосредственно на цитологических препаратах соматических и половых клеток. Данный метод позволяет использовать не только метафазные, но и интерфазные клетки, что ставит его в ряд наиболее доступных и высокоинформативных (Юров и др., 1995; Ворсанова и др., 19986; Holmes, Martin, 1993; Martin et al., 1993; Guttenbach et al., 1994; 1997; Soloviev et al, 1995a,b; 1997; Yurov et al., 1996a,b). Молекулярно-цитогенетические методы могут успешно применяться для диагностики таких хромосомных нарушений, как добавочные (маркерные, мини-) хромосомы, часто являющиеся дериватами половых хромосом; сложные случаи гоносомного мозаицизма; участие в хромосомных перестройках более 3-х хромосом; гипо- и гипергаплоидия в зрелых половых клетках (Ворсанова и др., 1998а,б; Vorsanova et al., 1994a,b; Guttenbach et al., 1997).

В последние годы активно разрабатываются и совершенствуются методы изучения хромосомного набора в клетках различных тканей и на всех этапах клеточного цикла, в том числе на различных стадиях гаметогенеза (Ворсанова, 1991; Ворсанова и др., 19896,в; 1998а,б; Соловьев и др., 1995; Курило, 1996а,б; Cremer et al., 1986; Vorsanova et al., 1986; Guttenbach et al., 1994; 1997; Yurov et al., 1996a). Предлагаются эффективные способы приготовления и анализа препаратов половых клеток (Guttenbach et al., 1994). Все более широко развиваются и внедряются в диагностическую практику молекулярные и молекулярно-цитогенетические методы, связанные с технологией

рекомбинантной ДНК. Эффективная диагностика с помощью ISH способствует успешному, своевременному обнаружению сложных хромосомных нарушений, как в соматических, так и в половых клетках.

ISH позволяет выявлять и анализировать нормальные или аномальные хромосомы даже в сверхконденсированных ядрах сперматозоидов человека, а также в интерфазных клетках лимфоцитов периферической крови, значительно ускоряя диагностику и повышая ее эффективность (Ворсанова, 1991; Юров и др., 1995; Goldman et al., 1993; Bischoff et al., 1994; Miharu et al., 1994; Wang et al., 1994; Martin et al., 1995; Rousseaux, Chevret, 1995; Spriggs et al., 1995; Zalensky et al., 1995; Pellestor et al., 1996; van Hummelen et al., 1996; Aviram-Goldring et al., 1997; Vidal, Egozcue, 1997).

Молекулярно-цитогенетический анализ хромосом половых клеток позволяет получить информацию о числе и структуре их аномалий при нарушениях репродуктивной системы человека (Miharu et al., 1994; Yurov et al., 1996а).

Следует отметить, что исследования уровня хромосомных аберраций в половых клетках пациентов с нарушением репродуктивной системы с помощью молекулярно-цитогенетических методов до настоящего времени не получили достаточно широкого применения. Не оценена частота хромосомных нарушений в незрелых половых клетках эякулята, как в норме, так и при патологии репродуктивной системы. Вместе с тем молекулярный подход к такой оценке может быть эффективен для определения уровня и типов хромосомной патологии на разных стадиях гаметогенеза, причин селекции гамет, выявления причин бесплодия, своевременной гормональной коррекции пациентов с аномалиями полового развития и нарушениями репродуктивной системы, а также генетического прогноза.

Молекулярно-цитогенетическая диагностика в течение ряда лет успешно использовалась с целью идентификации хромосомных нарушений при задержке умственного и физического развития, множественных врожденных пороков и/или микроаномалий развития, а также при консультировании супружеских пар с нарушением репродуктивной системы. Задачи в исследовании аномалий половых клеток и их корреляции с соматическими требуют своего решения.

Молекулярно-цитогенетический метод позволяет определить или уточнить аномалии хромосом и, при возможности, связать их с клиническими проявлениями. Представления о характере хромосомных аномалий в мужских половых клетках необходимы для понимания механизмов их происхождения и наследования. Полученные

знания в дальнейшем могут служить основой для разработки методов профилактики хромосомной патологии. Следует отметить, что в виду специфических особенностей гаметогенеза, мужские половые клетки более доступны для исследования, чем женские. Исследование молекулярно-цитогенетическими методами овулирующей яйцеклетки по медицинским показаниям неинформативно и не позволяет составить представление о доле половых клеток с хромосомными аномалиями. Получение большого числа половых клеток из эякулята делает возможным проведение экспериментов по гибридизации in situ, и анализ полученных результатов не является трудоемкой и длительной процедурой, что обеспечивает высокую эффективность диагностики и ее информативность.

Однако, до настоящего времени, не разработаны показания для применения молекулярно-цитогенетических методов в диагностике бесплодия, аномалий полового развития и/или нарушений репродуктивной функции, связанных с хромосомными аберрациями у пациентов мужского пола.

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости определения показаний и подходов к проведению молекулярно-цитогенетических исследований половых и соматических клеток у лиц мужского пола с нарушением репродуктивной системы и/или аномалиями полового развития.

В связи с этим, была поставлена цель и задачи данного исследования.

Цель исследования: На основе молекулярно-цитогенетического исследования установить удельный вес и тип аномалий гоносом у взрослых пациентов и у детей мужского пола с различными формами нарушения репродуктивной системы.

Для осуществления цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Определить удельный вес и тип хромосомных аномалий среди детей и взрослых пациентов мужского пола с нарушением репродуктивной системы, используя методы цитогенетического анализа.

2. Провести молекулярно - цитогенетические исследования у пациентов с нарушением репродуктивной системы для выявления сложных случаев гоносомного мозаицизма или псевдомозаицизма при небольшой доле аномального клона, определения

происхождения маркерных гоносом, уточнения точек разрыва при структурных хромосомных аберрациях.

3. Оптимизировать условия проведения молекулярно-цитогенетических исследований - изотопная и флюоресцентная гибридизация нуклеиновых кислот in situ (IISH и FISH) для изучения хромосомных аберраций в половых клетках.

4. Определить частоту анеуплоидий гоносом и некоторых аутосом в половых клетках эякулята пациентов с нарушением репродуктивной системы и в норме.

5. Разработать показания к применению молекулярно-цитогенетической диагностики при нарушении репродуктивной системы у индивидуумов мужского пола.

Научная новизна.

Впервые оценена диагностическая значимость молекулярно-цитогенетических методов при определении уровня аномалий гоносом в половых и соматических клетках в норме и при патологии репродуктивной системы у индивидуумов мужского пола.

Впервые определен удельный вес и тип анеуплоидий гоносом и некоторых аутосом в незрелых половых клетках