Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Частота мейотического нерасхождения хромосом у мужчин с нарушением репродуктивной функции

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Частота мейотического нерасхождения хромосом у мужчин с нарушением репродуктивной функции"

На правах рукописи

Гордеева Евгения Георгиевна

ЧАСТОТА МЕЙОТИЧЕСКОГО НЕРАСХОЖДЕНИЯ ХРОМОСОМ У МУЖЧИН С НАРУШЕНИЕМ РЕПРОДУКИВНОЙ ФУНКЦИИ

03.02.07-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 1 МАР 2013

005050940

Москва-2013

005050940

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Курило Любовь Федоровна

Официальные оппоненты:

Бахарев Владимир Анатольевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный научный сотрудник лаборатории репродуктивной генетики

Ревазова Юлия Анатольевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное учреждение науки «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ведущий научный сотрудник отдела гигиены, токсикологии пестицидов и химической безопасности

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» Российской академии наук

Защита состоится «08» апреля 2013 г. в «11» часов па заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан февраля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор Зипченко Репа Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Хромосомные нарушения являются одной из главных причин аномалий развития эмбриона или плода. Приблизительно 30-50% случаев ранних доимплантациопных потерь, около 30% случаев спонтанных абортов в течение первого триместра беременности и 6% случаев мертворождений или случаев младенческой смертности обусловлены наличием хромосомных аномалий (ХА) в клетках эмбриона/плода (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004; Лебедев И.Н., 2012). Наиболее высокие частоты встречаемости хромосомных заболеваний среди новорожденных характерны для трисомий по хромосомам 13, 18, 21, X и Y. В целом, среди новорожденных частота встречаемости конституциональных ХА составляет приблизительно 0,8-1% (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004).

Этиологическими факторами развития хромосомной патологии у потомства являются геномные и хромосомные мутации, которые приводят к изменению числа или структуры хромосом. Большинство трисомий по хромосомам в регулярной форме имеют гаметическое происхождение (Кулешов Н.П., 1979), поэтому исследование частоты встречаемости мужских и женских гамет с различными вариантами анеуплоидии является актуальной задачей современной биологии и медицины.

В гаметогенезе у человека естественным образом происходит формирование числовых и структурных ХА. К настоящему времени получены свидетельства того, что у здоровых женщин и у здоровых фертильных мужчин могут быть обнаружены гаметы с хромосомным дисбалансом (Guttenbach M. et al., 1997b). Однако вклад материнского и отцовского происхождения различных вариантов ХА в структуру причин ранней эмбриональной смертности и многих синдромальных форм хромосомной патологии у потомства не является одинаковым (Hunt P.A., Hassold T.J., 2002). По данным R.H. Martin частота нерасхождсния хромосом в оогенезе в 1-ом мейозе и во П-ом мейозе составляет приблизительно 20%, тогда как частота мейотического нерасхождешм хромосом в сперматогенезе составляет приблизительно 1-2% (Martin R-H., 2008а).

В течение последних десятилетий в ряде исследовательских работ показано, что частота мейотического нерасхождения хромосом (или хроматид) в гаметогенезе у человека значительно варьирует в зависимости от группы хромосом, особенностей их структуры, и в зависимости от стадии мейоза, в течение которой произошла ошибка сегрегации хромосом (Abruzzo М.А., Hassold T.J., 1995; Hassold T.J., Hunt P.A., 2001; Hassold T.J. et al., 2007). При некоторых формах нарушения сперматогенеза частота мейотического нерасхождения хромосом может превышать референсные значения более чем в 3 раза (Martin R.H., 2007).

Применение методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) помогает решить проблему деторождения в ряде случаев мужского и женского бесплодия. Тем не менее, использование методов ВРТ увеличивает риск передачи генных и хромосомных мутаций, формирующихся de novo в ходе гаметогенеза у одного из родителей. Немаловажным является и то, что использование ВРТ для наступления беременности увеличивает риск по развитию хромосомной патологии эмбриона, которая не приводит к летальному исходу и ее наличие у плода совместимо

с живорождением (Вопс1ие11е М. е1 а1., 2002). Данное обстоятельство указывает на необходимость исследования хромосомного набора зрелых мужских гамет при различных формах патозооспермии, в том числе в случаях наличия числовых и структурных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции.

Цель исследования

Целью настоящей работы являлась оценка частот встречаемости сперматозоидов с различными вариантами анеуплоидии у мужчин с нарушениями репродуктивной функции и патозооспермией, в том числе у мужчин с числовыми и структурными ХА.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди здоровых мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом 46,ХУ.

2. Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди пациентов с различными формами патозооспермии из супружеских пар с бесплодием и/или отягощенным акушерским анамнезом, а также в случаях наличия хромосомной патологии у эмбриона/плода или в случаях рождения ребенка с хромосомной патологией.

3. Оценить частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди мужчин с числовыми и структурными ХА.

4. С помощью П8Н-метода провести анализ мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку или числовое нарушение хромосом, у мужчин со структурными или числовыми ХА в соматических клетках организма.

5. Оценить состояние сперматогенеза у пациентов с различными формами патозооспермии и/или с конституциональными ХА методом количественного кариологического анализа незрелых половых клеток из эякулята.

Научная новизна: для нескольких групп пациентов с нарушением репродуктивной функции неясной этиологии проведена оценка частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У. Всего обследовано 89 мужчин. Проведен РКН-анализ мейотического расхождения хромосом 13 и 14 у б-и носителей Робертсоновской транслокации с1ег(13;14)^10;я10). А также проведен НБН-анализ мейотического расхождения Х- и У-хромосом у мужчин с числовыми аномалиями половых хромосом в регулярной и мозаичной формах и у мужчин со структурными аномалиями половых хромосом. В том числе НБН-анализ мейотического расхождения Х- и У-хромосом проведен у мужчины с У-аутосомной реципрокной транслокацией 1(У;21)(я11.2;я22.3).

В настоящей работе впервые проведен ИКН-анализ мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку, у мужчины с реципрокной транслокацией 1(1 ;11)(ц44^21). Также впервые проведен Р15Н-анализ частоты встречаемости в сперматозоидах рекомбинантных хромосом у мужчины с перицентрической ищерсией хромосомы 18 при кариотипе 46,ХУ,ту(18)(р11.23я21.1).

Настоящее исследование позволило расширить представление о механизмах формирования ХА в гаметогенезе у мужчин и получить представление о мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку, у мужчин с редко встречающимися в общей популяции вариантами числовых и структруных ХА.

Научно-практическая значимость работы: на основании собственных результатов исследования и результатов, представленных в литературных источниках, сформированы клинические группы пациентов, для которых рекомендовано проведение ИЗН-анализа частот встречаемости сперматозоидов с аиеуплоидией. Эти рекомендации и приведенные в настоящей работе оценки риска передачи потомству сверхчисленных хромосом или дополнительного хромосомного материала отцовского происхождения при некоторых вариантах конституциональных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции могут быть использованы в ходе медико-генетического консультирования и при подготовке к проведению процедур ЭКО/ИКСИ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором, с дисомией по хромосомам 13, 18 и 21, частота встречаемости сперматозоидов с XX, ХУ и УУ дисомией среди мужчин с нормальным мужским кариотипом 46,ХУ и нормозооспермией в среднем составляет 0,37%, 0,11%, 0,05%, 0,20%, 0,04%, 0,17% и 0,06%, соответственно.

2. Тяжелые формы нарушения сперматогенеза, умеренная или тяжелая форма олигоастенотератозооспермии у мужчин с нарушением репродуктивной функции, сопровождаются повышенной частотой мейотического нерасхождения хромосом.

3. Хромосомы 21, X и У в большей степени, чем хромосомы 13 и 18, предрасположены к мейотическому нерасхождению в гаметогенезе у мужчин.

4. Р15Н-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией может быть использован как метод определения доли зрелых мужских половых клеток со специфическим хромосомным дисбалансом.

Апробация работы: основные результаты диссертационной работы представлены на международной конференции «Хромосома 2009» в 2009 г. (г. Новосибирск), на VI съезде Российского общества медицинских генетиков в 2010 г. (г. Ростов-на-Дону), па IX научной конференции «Генетика человека и патология: Актуальные проблемы современной цитогенетики» в 2011 г. (г. Томск), на V

Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» в 2012 г. (г. Санкт-Петербург), на первом национальном форуме «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации» в 2012 г. (г. Ростов-на-Дону).

Личный вклад автора в проведении исследования: основная часть исследований выполнена автором лично. Автором сформулированы цель и задачи настоящего исследования, определены критерии отбора пациентов для исследования, сформированы выборки обследуемых пациентов, самостоятельно проведена лабораторная работа с привлечением методов молекулярно-цитогенетического анализа. Автором разработаны модификация метода флуоресцентной гибридизации на препаратах (FISH) сперматозоидов человека и визуальный метод анализа анеуплоидии гамет. Автором лично подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, проведен статистический анализ полученных результатов. Формулировка выводов и написание рукописи настоящей работы выполнены автором самостоятельно.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из них 4 статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОИ РФ.

Структура и объем работы: диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 311 источников, из них 45 отечественных и 266 зарубежных авторов. Работа изложена на 206 листах машинописи. Текст содержит 26 рисунков и 24 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Группы обследуемых пациентов сформированы из мужчин, обратившихся в лабораторию генетики нарушений репродукции ФГБУ «МГНЦ» РАМН по поводу бесплодия в браке, отягощенного акушерского анамнеза у супруги, случаев рождения детей с хромосомной патологией или по поводу клинического обследования с целью планирования деторождения. Препараты ПК 89 мужчин в возрасте от 24-х до 54-х лет (в среднем 35±7 лет) послужили материалом для проведения исследования. Контрольную группу составили 11 мужчин: 10 мужчин в статусе доноров спермы и один мужчина с нормозооспермией, с нормальным мужским кариотипом (46,XY) и подтвержденной фертильностью. Мужчины с олигоастенотератозооспермией (ОАТ) различной тяжести (27 человек) составили 1-го группу. Мужчины с астенотератозооспермией (AT) (28 человек) составили 2-ю группу. Мужчины с конституциональными ХА, числовыми и структурными ХА, (23 человека) и с различными формами патозооспермии составили 3-ю группу. Для проведения ретроспективного анализа частот встречаемости конституциональных ХА у мужчин с нарушением репродуктивной функции использовали архивные данные медицинских карт пациентов.

Анализ кариотипа по лимфоцитам периферической крови проводили по обще-

принятой методике, используя GTG-дифференциалыгое окрашивание (Захаров и др., 1982). Спермиологический анализ (CA) эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1999). Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток (ЮСА НПК) проводили на препаратах ПК из эякулята по методу, предложенному проф. Л.Ф. Курило (Патент на изобретение №2328736, 2007 г.). Молекулярно-цитогенетический анализ мужских ПК проводили по методике, предложенной Martin и соавторами (Martin R.II, et al., 1993). Непосредственно нами оптимизирована методика предобработки сперматозоидов в растворе дитиотреитола для дековденсадии хроматина головок сперматозоидов.

Для каждого пациента проводили молекулярно-цитогенетический анализ ПК по пяти хромосомам с использованием двух- и трехцветной FISH. Для двухцветной FISH использовали смесь локус-специфичных ДНК-зондов на хромосомы 13 и 21: LSI 13, локус гена ретинобластомы RB-1, 13qI4, Spectrum Green, LSI 21, локусы D21S259, D21S341, D21S342, 21q22.13-q22.2, Spectrum Orange. Трехцветную FISH проводили со смесью ДНК-зондов, специфичных к альфа-сателлитным последовательностям центромерного и прицентромерного гетерохроматина хромосом 18, X и Y: СЕР 18, локус D18Z1, 18pll.l-qll.l, Spectrum Aqua, СЕР X, локус DXZ1, Xpll.l-qll.l, Spectrum Green, CEP Y, локус DYZ3, Ypll.l-qll.l, Spectrum Orange (Abbott Molecular Vysis Inc., U.S.A).

Для анализа мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в перестройку, у мужчин с конституциональными ХА проводили индивидуальный подбор ДНК-зондов. Использовали критерии молекулярно-цитогенетического анализа ПК, разработанные Williams и соавторами (Williams et al., 1993). Репрезентативность выборки определена согласно статистическому обоснованию величины выборки при исследовании редких событий, предложенной Плохинским (Биометрические методы, 1975).

Статистический анализ проводили в программе БИОСТАТ (Glantz S.A., 1999). Для проверки гипотезы о связи двух переменных использовали критерий Пирсона. Для анализа сопряженности значений частот сперматозоидов с ХА использовали t-критерий Стьюдента. Для сравнения частот сперматозоидов с ХА использовали критерий Манна-Уитни. Значение р<0,05 выбрано как статистически значимое.

Для выявления корреляции между частотой сперматозоидов с ХА, концентрацией сперматозоидов, долей сперматозоидов с поступательной подвижностью или долей сперматозоидов с нормальной морфологией проводили регрессионный анализ в программе STATISTICA 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектр и частота встречаемости числовых и структурных хромосомных аномалий среди мужчин с нарушением репродуктивной функции

По данным ретроспективного анализа среди мужчин с нарушением репродуктивной функции различной этиологии частота встречаемости конституциональных ХА составила 10% (рис. 1). Всего обследовано 2074 пациента за период с 1989 г. по 2011 г..

1&ло%

■ конституциональные ХА -10%

ш нормальный мужской кариотип, 46,ХУ - 90% Я®

Ирг

Рис 1. Частота встречаемости конституциональных ХА среди мужчин с нарушением репродуктивной функции различной этиологии.

Спектр ХА среди мужчин с бесплодием представлен следующими вариантами ХА:

■ Робертсоновские транслокации 0,85%

Синдром де ля Шапелля при кариотипе 46,XX у лиц мужского пола 1%

■ Синдром Клайнфельтера при кариотипе 47,ХХУ 4,62%

■ Синдром дисомии по У-хромосоме 0,38%

■ Маркерные хромосомы неизвестного происхождения 0,09%

■ Сбалансированные реципрокные транслокации аутосом 0,67%

■ Инверсии аутосом 0,28%

« Мозаичные формы гоносомных аномалий и полисомии по половым 1,25%

хромосомам

■ Х-аутосомные и У-аутосомные транслокации 0,24%

н Инверсии У-хромосомы 0,05%

а Терминальные делеции У-хромосомы 0,24%

Среди мужчин с конституциональными ХА наиболее часто встречающимися хромосомными нарушениями являлись регулярная форма дисомии по Х-хромосоме и мозаичные формы гоносомных аномалий и полисомий по половым хромосомам. Другими часто встречающимися хромосомными нарушениями среди мужчин с бесплодием являлись сбалансированные структурные ХА: Робертсоновские транслокации с вовлечением хромосом 13 и 14, реципрокные транслокации аутосом и инверсии аутосом.

У мужчин со структурными ХА выявлена гетерогенность проявлений нарушения сперматогенеза (Гордеева Е.Г. и др., 2010). Среди мужчин с Робертсоновскими транслокациями (ЛоЬТ) степень нарушения сперматогенеза варьировала от азооспермии и тяжелой формы олигозооспермии до АТ, при этом у одного мужчины (код пациента А8) выявлена нормозооспермия при направительном диагнозе - привычное невыкашивание беременности. Среди мужчин с реципрокными транслокациями аутосом и инверсиями аутосом степень нарушения сперматогенеза варьировала также от азооспермии и тяжелой формы олигозооспермии до АТ и тератозооспермии (Т).

Частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13,18, 21, X, У у мужчин с пормозооспермией и нормальным мужским кариотипом 46,ХУ

В качестве референсных значений частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21,ХиУв настоящей работе приняты значения частот сперматозоидов с анеуплоидией, полученные для 11-и здоровых мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,ХУ). Всего проанализировано 113 340 сперматозоидов. Результаты РІБН-анализа представлены в табл. 1 и 2. Полученный широкий разброс значений (II) частот сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 21, X и У, свидетельствует о наличии межиндивидуальных различий по частоте ошибок мейотического расхождения хромосом. Наиболее высокие значения частот исследованных вариантов ХА в мужских половых клетках при нормозооспермии характерны для гоносомных анеуплоидий — 0,56%, для диплоидного хромосомного набора - 0,37%, и для дисомии по хромосоме 21 - 0,2% (Гордеева Е.Г. и др., 2011).

Оценка состояния сперматогенеза и частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13,18,21, X, У у мужчин с нарушением репродуктивной функции при различных формах патозооспермии

Выбор пациентов для исследования происходил случайным образом, поэтому среди обследуемых мужчин выраженных форм мономорфной тератозооспермии с характерным одним типом морфологических аномалий сперматозоидов ни в одном случае не выявлено. Первую и вторую группу обследуемых составили мужчины с наиболее часто встречающимися сочетанными формами патозооспермии - с АТ и ОАТ различной тяжести, во всех случаях при проведении СА согласно рекомендациям ВОЗ (1999) у пациентов была выявлена полиморфная тератозооспермия в сочетанной форме (WHO, 1999). Среди обследованных у 35-и из 56-и мужчин выявлены признаки частичного блока сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены профазы I мейоза. Ассоциации между наличием признаков частичного блока сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены и пахитены профазы I мейоза, и повышенной частотой встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией у обследованных мужчин мы не выявили.

В ходе работы ИБН-методом проанализировано 270 894 сперматозоида. Средние по группам значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У представлены в табл. 1 и 2. В контрольной группе и во всех группах обследованных пациентов мы наблюдали межхромосомные вариации частот сперматозоидов с анеуплоидией, в среднем значения частот сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21 и с дисомией по половым хромосомам превосходят значения частот сперматозоидов с дисомией по хромосомам 13 и 18, соответственно.

Среди пациентов в 1-й и во 2-й группе, как и в контрольной группе, наблюдался широкий разброс значений (И) частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 21, X и У.

Табл. 1. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13 и 21 (%) у мужчин с нормозооспермией, AT и ОАТ различной тяжести.

Хромосома 13 Хромосома 21 Диплоидные ПК

нуллисомия 1 дисомия нуллисомия | дисомия

Группа контроля: нормозооспермия (11 пациентов)

m±SE 0,13±0,03 0,11±0,04 0,22±0,07 0,20±0,08 0,40±0,18

R 0,09-0,21 0,07-0,21 0,09-0,33 0,1-0,38 0,17-0,72

Группа 1: ОАТ различной тяжести (27 пациентов)

m±SE 0,44±0,37 0,28±0,20* 0,70±0,74 0,59±0,50* 0,79±0,54*

R 0,03-1,78 0-0,77 0,13-4,09 0,07-1,96 0,19-2,03

тяжелая форма ОАТ (5 пациентов)

m±SE 0,89±0,53 0,54±0,21* 1,42±1,53 1,38±0,66* 1,07±0,66*

R 0,41-1,78 0,21-0,77 0,14-4,09 0,38-1,96 0,45-1,94

умеренная форма ОАТ (14 пациентов)

m± SE 0,41±0,24 0,28±0,15* 0,58±0,33 0,48±0,19* 0,80±0,55*

R 0,09-0,87 0,09-0,68 0,13-1,19 0,29-0,83 0,36-2,03

легкая форма ОАТ (8 пациентов)

m ± SE 0,20±0,17 0,11±0,08 0,45±0,18 0,30±0,22 0,39±0,18

R 0,03-0,57 0-0,25 0,23-0,67 0,07-0,77 0,19-0,64

Группа 2: AT (28 пациентов)

m±SE 0Д7±0,18 0,16±0,10 0,37±0,29 0,32±0,25 0,57±0,65

R 0-0,77 0-0,48 0,12-1,59 0-1 0-3,18

* - статистически значимые отличия (р<0,05).

Частоты встречаемости сперматозоидов с гаплоидным хромосомным набором и с ХУ дисомией имели статистически значимые отличия от частот встречаемости сперматозоидов с XX и УУ дисомией также среди всех обследованных пациентов (р<0,05). Частоты встречаемости сперматозоидов с вариантом диплоидного хромосомного набора 46,ХУ не имели статистически значимых отличий от частот встречаемости сперматозоидов с вариантами диплоидного хромосомного набора 46,XX и 46,УУ (р=0,055).

В среднем частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди мужчин с нарушением репродуктивной функции и патозооспермией превосходит частоту встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией среди мужчин с нормозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,ХУ). В зависимости от степени нарушения сперматогенеза и от формы патозооспермии частота встречаемости анеуплоидных гамет может превосходить референсные значения в 1,5-3 раза и более (рис. 2).

При выполнении анализа полученных результатов каждую форму патозооспермии, олигозооспермию, астенозооспермию и тератозооспермию рассматривали как самостоятельную или отдельную качественную или количественную характеристику состояния сперматогенеза у пациентов, изменение

Табл. 2. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 18, X и У (%) у мужчин с нормозооснермией, АТ и ОАТ различной тяжести.

Хромосома 18 Половые хромосомы Х-несу-щие ПК У-несу-щие ПК Диплоидные ПК

нуллисо-мия дисо-мия нуллисо-мия дисомия XX ) ХУ | УУ

Группа контроля: нормозооспермия (11 пациентов)

тіБЕ 0,09 ±0,01 0,05 ±0,02 0,29 ±0,08 0,04 ±0,02 0,17 ±0,11 0,06 ±0,02 50,07 ±0,58 49,17 ±0,50 0,34±0,21

И 0,06-0,11 0,02 -0,09 0,17 -0,45 0 -0,07 0,05 -0,47 0,02 -0,09 49,34 -51,34 48,57 -49,99 0,06-0,76

Группа 1: ОАТ различной тяжести (27 пациентов)

тіБЕ 0,27 ±0,28 0,13 ±0.10* 1,15 ±1,27 0,1 ±0,07* 0,64 ±0,63* 0,16 ±0,14* 48,65 ±4,29 48,29 ±4,95 0,83±0,62*

Я 0,03 -1,33 0,04 -0,41 0,18 -6,96 0 -0,33 0,04 -3,07 0,03 -0,52 42,02 -64,70 35,18 -56,63 0,14 -2,79

тяжелая юрма ОАТ (5 пациентов)

ш±8Е 0,48 ±0,54 0,18 ±0,14* 2,39 ±2,59 0,15 ±0,13* 1,20 ±1,12* 0,29 ±0,15* 50,19 ±8,29 44,10 ±8,12 0,86±0,62*

Я 0,04 -1,33 0,08 -0,41 0,50 -6,96 0 -0,33 0,10 -3,07 0,17 -0,51 45,24 -64,70 35,18 -50,84 0,41-1,94

умеренная форма ОАТ (14 пациентов)

т±БЕ 0,22 ±0,18 0,16 ±0,10* 1,02 ±0,60 0,12 ±0,04* 0,64 ±0,44* 0,14 ±0,09* 49,05 ±2,76 47,84 ±3,06 1,05±0,67*

Я 0,03 -0,75 0,04 -0,42 0,26 -2,54 0,05 -0,19 0,04 -1,74 0 -0,29 43,66 -52,87 40,77 -52,48 0,14-2,75

легкая форма ОАТ (8 пациентов)

т ± БЕ 0,15 ±0,08 0,07 ±0,06 0,60 ±0,28 0,04 ±0,05 0,30 ±0,23 0,11 ±0,17 46,99 ±3,13 51,68 ±3,15 0,42±0ДЗ

Я 0,03 -0,25 0 -0,20 0,18 -0,94 0 -0,16 0,09 -0,85 0 -0,52 42,02 -51,06 46,93 -56,63 0,19-0,80

Группа 2: АТ (29 пациентов)

т± БЕ 0,22 ±0,17 0,11 ±0,09 0,50 ±0,22 0,07 ±0,06 0,31 ±0,25 0,09 ±0,08 48,77 ±2,46 49,55 ±2,52 0,64±0,80

Я 0-0,70 0-0,40 0,21 -1,11 0 -0,21 0,04 -1,05 0 -0,30 43,24 -52,56 46,51 . -55,57 0,09-3,28

* - статистически значимые отличия (р<0,05).

которой может быть связано с изменением уровня анеуплоидий сперматозоидов. Таким образом, мы провели корреляционный анализ между изменением уровня анеуплоидий в зрелых мужских гаметах, диплоидных ПК и между изменениями показателей СА: концентрации сперматозоидов, доли сперматозоидов с поступательной подвижностью и доли морфологически нормальных сперматозоидов.

В среднем высокую частоту встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией мы наблюдали при снижении концентрации сперматозоидов, при олигозооспермии различной тяжести.

Регрессионный анализ показал, что характер изменения частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией при

снижении концентрации сперматозоидов в эякуляте может быть достаточно точно описан гиперболической (или степенной) функцией (г = -0,64, р<0,01), но не линейной (г = -0,36, р<0,01) (рис. 3).

0,9

* - статистически значимые отличия (р<0,05).

Рис. 2. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с дисомией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди мужчин с нормозооспермией (К),

АТ и ОАТ.

У пациентов с тяжелыми формами нарушения сперматогенеза при концентрации сперматозоидов ниже 10 млн/мл (ОАТ 11-111) в среднем частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У выше на один порядок, чем среди здоровых мужчин с нормозооспермией (Гордеева Е.Г. и др., 2013). Наиболее высокие уровни анеуплоидии сперматозоидов характерны для мужчин с тяжелой формой олигозооспермии, при концентрации сперматозоидов ниже 1 млн/мл.

Не выявлено сильной взаимосвязи повышения уровня анеуплоидии сперматозоидов и диплоидных ПК и снижения поступательной подвижности сперматозоидов (г = -0,29, р=0,02). Корреляционная зависимость доли морфологически нормальных сперматозоидов и частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией также достаточно слабая (г = -0,29, р=0,02).

На основании проведенной работы мы полагаем, что высокая частота мейотического нерасхождения хромосом в большей степени сопряжена с изменением такого показателя С А, как концентрация сперматозоидов в эякуляте.

концентрация сперматозоидов в эякуляте млн/мл

Рис. 3. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с

анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди мужчин с нормозооспермией, с различными формами патозооспермии и нормальным мужским кариотипом 46,ХУ. Даны уравнения регрессии и показана обратная зависимость изменения частоты сперматозоидов с анеуплоидией и изменения концентрации сперматозоидов. Коэффициент корреляции Пирсона (линейная функция) г = -0,36, (степенная функция) г = -0,64.

Частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией у мужчин с хромосомной патологией у потомства

Среди мужчин из 2-й группы условно выделена подгруппа пациентов с отягощенным акушерским анамнезом у супруги, со случаями хромосомной патологии у эмбриона/плода или новорожденного. В этой подгруппе у двух мужчин с ХА у потомства обнаружены повышенные частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией. У мужчины (код пациента 63), с отметкой в анамнезе у супруги о беременности плодом с кариотипом 47,+21, частота сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21 составила 0,68%, тогда как частоты сперматозоидов с дисомией по хромосомам 13, 18, X и У не превышали референсных значений. У пациента (код пациента 62), отца ребенка с синдромом Дауна, выявлены повышенные частоты

встречаемости сперматозоидов с дисомией по хромосоме 21, с ХУ дисомией и с диплоидным хромосомным набором, которые составили 0,42%, 0,58%, и 3,19%, соответственно (Гордеева Е.Г. и др., 2013).

Оценка состояния сперматогенеза и частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13,18,21, X, У у мужчин с конституциональными хромосомными аномалиями

Нарушения сперматогенеза, различные формы патозооспермии и признаки частичного блока сперматогенеза на стадии профазы I мейоза выявлены у 84% мужчин с различными вариантами сбалансированных структурных ХА: у мужчин с ЯоЬТ, у мужчин с реципрокными транслокациями и инверсиями хромосом. В сравнении с этими данными, только у 63,3% мужчин с патозооспермией и нормальным мужским кариотипом (46,ХУ) обнаружены признаки частичного блока сперматогенеза.

Р18Н-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У проведен для 20 мужчин с конституциональными ХА из 3-й группы: для 5 мужчин с ЯоЬТ с вовлечением хромосом 13 и 14, для 9 мужчин со сбалансированными реципрокными транслокациями аутосом - 1(1;3)(р21^24), 1(7;13)(р13;Ч14), 1(2;15)(Ч21;Ч22), 1(1;11)(Ч44;Ч21), 1(7;15)(Ч32;Ч24), К2;11)(р22.3;р15.5), 1(1;22)(Ч32;я13), 1(1;4)(р22;Ч35), 1(11;18)(Ч25;Ч21), для 2-х мужчин с инверсиями аутосом - іпу(18)(р11.23;я21.1), іпу(7)^21^32), для носителя хромосомы 13 с делецией неустановленного при цитогенетическом анализе хромосомного района, с1е1(13)(ц?), для носителя У-хромосомы с перицентрической инверсией, 46,ХУ,УчЬ+,іпу(У)(р11.2я11.23), в случае низкоуровневого мозаицизма по гоносомам у пациента с кариотипом тоз47,ХХУ[3]/46,ХУ[97] и в случае регулярной формы дисомии по У-хромосоме. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией среди мужчин со структурными ХА (18 человек) и с различными формами патозооспермии представлены в табл. 3.

Согласно результатам РІБН-анализа, частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с дисомией по хромосомам 21, X и У в подгруппе с ОАТ и ХА не имели статистически значимых отличий от значений в 1 -й группе (р>0,05). Частоты встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с дисомией по хромосомам 21, X и У в подгруппе с АТ, Т и ХА не имели статистически значимых отличий от значений во 2-й группе (р>0,05). Полученные результаты указывают на то, что при наличии хромосомной перестройки в соматических клетках организма частота мейотического нерасхождения хромосом 21, X и У не изменяется и соответствует частоте мейотического нерасхождения этих хромосом у мужчин при патозооспермии и при нормальном мужском кариотипе (46,ХУ).

Табл. 3. Средние значения частот встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди пациентов с различными формами патозооспермии при нормальном кариотипе (46,ХУ) из 1-й и 2-й групп и при структурных ХА из 3-й группы.

Группа пациентов, (количество пациентов в группе) Дисомия, m ± SE, % Диплоидные ПК, m ± SE, %

13 18 21 XX XY YY

Контрольная группа (11 пациентов) 0,11 ±0,04 0,05 ±0,02 0,20 ±0,08 0,04 ±0,02 0,17 ±0,11 0,06 ±0,02 0,37±0,19

Подгруппа с OAT I-III и ХА (8 пациентов) 0,60 ±0,36 0,15 ±0,13 0,54 ±0,29 0,16 ±0,25 0,74±0,58

Группа 1 (27 пациентов) 0,28 ±0,20 0,13 ±0,10 0,59 ±0,50 0,1 ±0,07 0,64 ±0,63 0,16 ±0,14 0,81±0,58

Подгруппа с AT, Т и ХА (10 пациентов) 0,25 ±0,12 0,06 ±0,06 0,30 ±0,17 0,07 ±0,06 0,39±0,35

Группа 2 (28 пациентов) 0,16 ±0,10 0,11 ±0,09 0,32 ±0,25 0,07 ±0,06 0,31 ±0,25 0,09 ±0,08 0,60±0,72

* - для групп пациентов с конституциональными ХА частоты встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 18 не отражены в таблице, поскольку широкий разброс значений частот сперматозоидов с анеуплоидией по данным хромосомам обусловлен тем, что РКН-анализ проведен с использованием ДНК-зондов комплементарных к районам хромосом, которые вовлечены в ХА.

Анализ мейотической сегрегации хромосом у мужчин с конституциональными хромосомными аномалиями

Анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в Робертсоновскую транслокацию der(13;14)(ql0;ql0)

FISH-анализ мейотической сегрегации хромосом 13 и 14 проведен для 6-й мужчин с дериватной хромосомой der(13;14)(ql0;ql0). Результаты исследования представлены в табл. 4. В среднем по группе частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 составила приблизительно 13±6%. Наиболее высокие значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 характерны для мужчин с тяжелой формой О AT (коды пациентов 69, 72, выделены серым в табл. 4). Полученные значения частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 согласуются со значениями других авторов. По данным С. Roux и соавторов (2005) и других исследователей в среднем частота сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 у мужчин с RobT составляет 10-15% (Gardner R.J.M., Sutherland G.R., 2004; Roux С. et al., 2005). Это существенно меньшая доля ПК с хромосомным дисбалансом, чем предполагалось исходя из теоретических оценок частоты ошибок мейотического расхождения хромосом, вовлеченных в RobT.

Табл. 4. Анализ мейотической сегрегации хромосом 13 и 14, вовлеченных в Робертсоновскую транслокацию, для пациентов из 3-й группы. FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 проведен с ДНК-зондами LSI 13, локус гена ретинобластомы RB-1, 13ql4, Spectrum Green, TelVysion 14q, локус D14S1420, tel 14q, Spectrum Orange.

Тип мейотической сегрегации, % сперматозоидов с ХА, (количество ПК)

Количество Альтернативная Совместная сегрегация 3:0

Код пац. проанализи- Нормальный или или

рованных сбалансированный Совместная I Совместная II диплоидный другой

ПК хромосомный набор хромосомный набор гаметы

Хромосо

мный 13я/14ц или 13q/der 14q 14q/der 13q 13q/14q/der

набор аег(13ч;14Ч) (13q;14q) (13q;14q) (13q;14q)

гаметы

сигналы во GGO о GOO G GGOO

67 3 335 90,07 (3 004) 1,49 (50) 1,62 (54) 3,03(101) 2,63 (88) 0,87 (29) 0,26 (9)

68 3 466 90,45 (3 135) 2(71) 2,13(74) 2,42 (84) 1,96 (68) 0,75 (26) 0,23 (8)

69 750 76,53 (574) 5,2 (39) 4,13(31) 6,26 (47) 3,46 (26) 3,06 (23) 1,33(10)

70 3 160 91,64 (2 896) 1,55 (49) 1,36(43) 2,78 (88) 1,55 (49) 0,76 (24) 0,34(11)

71 3 661 88,74 (3 249) 2,56 (94) 2,05 (75) 3,25(119) 2,59 (95) 0,49(18) 0,3(11)

72 890 85,60 (767) 2,34 (21) 1,56(14) 3,79 (34) 3,46 (31) 1,89(17) 0,67 (6)

m ± SE 87,17±5,61 2,52±1,37 2,14±1,01 3,58±1,38 2,6±0,77 1,3±0,98 0,52±0,42

R 76,53-91,64 1,49-5,2 1,36-4,13 2,42-6,26 1,55-3,46 0,49-3,06 0,23-1,33

Столь малая доля зрелых ПК с хромосомным дисбалансом у носителей Робертсоновских транслокаций, которая не совпадает с ожидаемым соотношением 1:1 анеуплоидных гамет и гамет с нормальным хромосомным набором, может быть объяснена только при условии существования в сперматогенезе механизмов естественного отбора, направленного против ПК с хромосомным дисбалансом (Brugnon F. et al., 2010).

Полученные результаты FISH-анализа частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидиеи по хромосомам 13 и 14 у мужчин с RobT свидетельствуют о наличии риска по передаче потомству сверхчисленных хромосом 13 и/или 14, который по нашим оценкам составляет приблизительно 13%.

Анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в транслокацию

Î(l;ll)(q44;q21)

Для мужчины со сбалансированной реципрокной транслокацией с вовлечением хромосом 1 и 11 проведен FISH-анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в хромосомную перестройку.

За консультацией по поводу рождения ребенка с врожденными пороками развития и случая беременности плодом с МВПР обратился мужчина в возрасте 33-х лет. Цитогенетическое исследование хромосом на препаратах из культуры лимфоцитов периферической крови мужчины позволило установить наличие сбалансированной реципрокной транслокации t(l;llXq44;q21). При двухкратном проведении СА с разницей в один год у мужчины установлена AT. При анализе анамнестических данных мужчины в первом случае отмечено рождение недоношенного семимесячного ребенка с задержкой психомоторного развития, у девочки установлен кариотип 46,XX,der(l)t(l;ll)(q44,q21)pat. Ребенок умер в младенчестве. Во втором случае у плода на 24-25-й неделе беременности обнаружены УЗ-маркеры хромосомной патологии плода, при анализе хромосом на препаратах из культуры лимфоцитов пуповинной крови с помощью дифференциального GTG-окрашивания выявлена также несбалансированная транслокация отцовского происхождения, кариотип 46,XY,der(l)t(l;l I)(q44;q21)pat.

Наиболее высокие значения частот встречаемости ПК с сегментной анеуплоидией по хромосомам 1 и 11 соответствовали типу мейотической сегрегации хромосом - совместная I. В среднем частота встречаемости сперматозоидов с хромосомным набором 23,-1 l,+der(l 1) и 23,-l,+der(l) составила 23,4% и 15,3% (табл. 5). Нормальный или сбалансированный хромосомный набор обнаружен в среднем в 53,8% ПК у пациента. Долю сперматозоидов с другим типом мейотической сегрегации хромосом составили 7,5% ПК.

Анализ частоты встречаемости рекомбинантных хромосом в сперматозоидах у пациента с перицентрической инверсией хромосомы 18, inv(18)(pll.23q21.1)

Для пациента с перицентрической инверсией inv(18)(pll.23q21.1) с помощью FISH-метода проведена оценка частоты встречаемости сперматозоидов, несущих рекомбинантиую хромосому 18 (Гордеева Е.Г. и др., 2012).

Табл. 5. Анализ мейотической сегрегации хромосом, вовлеченных в реципрокную транслокацию t(l;l I)(q44;q21) (код пациента 78). FISH-анализ выполнен с использованием ДНК-зондов СЕР 11, локус D11Z1, llpll.ll-qll, Spectrum Aqua, TelVysion llq, локус D11S1037, tel llq, Spectrum Orange, TelVysion lp, локус CEB108/T7, tel lp, Spectrum Green.

Тип мейотической сегрегации хромосом и набор флуоресцентных сигналов Хромосомный набор гаметы Сперматозоиды с XA, % (количество ПК)

Преп. №1 Преп. №2

Сегрегация 2:2

Альтернативная

OAG Нормальный хромосомный набор или сбалансированный 23,-1,-1 l,+der(l),+der(l 1) 52,45 (2 119) 55,17(1 108)

Совместная I

AG 23,-1 l,+der(ll) 22,35 (903) 24,5 (492)

OOAG 23,-l,+der(l) 17,64 (713) 13,09(263)

Совместная II

OGG 23,-1 l,+der(l) 10,34(14) 0,39 (S)

ОАА 23,-l,+der(ll) 10,34(14) 0,29 (6)

Совместная II при единичном кроссовере между сегментами хромосом 1 и 11

ООАА 23,-l,+l1 0,07 (3) 0,04 (1)

АА 23,-1,-1 l,+der(ll),+der(ll) 0,049 (2) 0,14(3)

GG 23,-11,+1 0,12(5) 0

OOGG 23,-1 l,-l,+der(l),+der(l) 0,09 (4) 0,04(1)

Сегрегация 3:1

OA 22,-1 0,62(25) 0,34 (7)

OAGG 24,-11 ,+der( 1 ),+der( 11) 0,49 (20) 0,39 (8)

G 22,-11 0,74 (30) 0,49 (10)

OOAAG 24,-l,+der(l),+der(l 1) 0,27(11) 0,44 (9)

OG 22,-1,-11,der(l) 133(54) 2,04 (41)

OAAG 24,+der(ll) 0,89 (36) 0,59 (12)

А 22,-1,-1 l,+der(ll) 0,49 (20) 0,54(11)

OOAGG 24,+der(l) 0,17(7) 0,24 (5)

Сегрегация 4:0 или диплоидный хромосомный набор

OOAAGG | 46,-1,-11,+der(l),+der(ll) | 0,02(4) |0

Другая

О 0,02 (1) 0,09 (2)

OOG 0,34 (14) 0,34(7)

ООА 0,22 (9) 0,04(1)

AAG 0,07 (3) 0,09 (2)

AGG 0,27(11) 0,14(3)

OOOAG 0,37 (15) 0,24(5)

OOOG 0,02 (1) 0

AAOGG 0,04 (2) 0

ОООAAG 0,02 (1) 0

OOOAGG 0,02 (1) 0,04 (1)

OOOOAAG 0,02 (1) 0

OOOOAGG 0 0,04 (1)

OOOOGG 0 0,04(1)

Количество проанализированных сперматозоидов 4 040 2 008

Проведенный FISH-анализ показал, что частота встречаемости сперматозоидов с сегментной анеуплоидией по хромосоме 18 составляет 3,1% (табл. 6). Мы полагаем, что данное значение является фактическим значением риска формирования при оплодотворении зиготы с рекомбинантной хромосомой 18.

Табл. 6. Частота встречаемости сперматозоидов с рекомбинантной хромосомой 18 в эякуляте у пациента с инверсией inv(18)(pll.23q21.1) (код пациента 75, контрольный препарат № 1). FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с сегментной анеуплоидией по хромосоме 18 выполнен с использованием ДНК-зондов TelVysion 18q, локус VIJyRM2050, tel 18q, Spectrum Orange, СЕР 18, локус D18Z1, 18pll.l-ql 1.1, Spectrum Aqua.

Хромосомный набор гаметы Набор флуоресцентных сигналов inv(18) контроль Р-уровень значимости

частота встречаемости, % (количество ПК)

Гаплоидные клетки, имеющие хромосому с инверсией или нормальную хромосому АО 95,3 (4 890) 99,4 (3 507) -

Гаметы с рекомбинантной хромосомой двух типов 3,1 (162) 0 Р<0,05

Еес(18)с1ир(18р)с1е1(18Ч) А 1,5 (80) 0

]*ес( 18)с1ир( 18я)(1е1( 18р) АОО 1,6 (82) 0

Другой тип сегрегации 0,5 (24) 0,19(7) -

Диплоидные гаметы или гаметы с дисомией по хромосоме 18 ААОО 1,1 (56) 0,39(14) Р<0,05

Количество проанализированных сперматозоидов 5 132 3 528 -

Анализ мейотической сегрегации Х- и У-хромосом у мужчин с числовыми или структурными аномалиями половых хромосом

Для 5-и мужчин (из 3-й группы) со структурными или числовыми аномалиями половых хромосом в соматических клетках организма проведен ИБИ-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 18, X и У. Анализ проведен для пациента с низкоуровневым ХХУ/ХУ мозаицизмом и АТ (код пациента 87), для пациента с азооспермией и синдромом Клайнфельтера при регулярной форме дисомии по Х-хромосоме (код пациента 86), для мужчины с регулярной формой дисомии по У-хромосоме и умеренной формой ОАТ (код пациента 85), для мужчины с перицентрической инверсией ¡пу(У)(р11^ 11.23) и АТ (код пациента 89), для мужчины с реципрокиой транслокацией с вовлечением У-хромосомы и хромосомы 21 при азооспермии (код пациента 88). У всех 5-и пациентов частота встречаемости сперматозоидов с некоторыми вариантами анеуплоидии по X и У-хромосомам превосходила референсные значения, полученные для контрольной группы.

Табл. 7. Частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по X и Y-хромосомам у пациентов из 2-й группы с числовыми и структурными аномалиями половых хромосом и у пациентов с тяжелой формой ОАТ неясной этиологии.

Хромосомный набор ПК Код пац. 87 mos47,XXY [3]/46,XY[97] Код пац. 86 47.XXY Код пац. 85 47.XYY Код пац. 88 46,XY, der(21)t(Y;21) (qll.2;q22.3) Код пац. 89 inv(Y) (pll.2qll.23) Мужчины с нормозооспермией (Пчел.) Мужчины с идиопатической OAT III (5 пац.)

Сперматозоиды с хромосомными аномалиями, % (количество ПК) (in±SE) (m±SE)

23,X 46,67 (1207) 48,00 (1707) 50,08 (2807) 48,11 (1468) 48,92(1597) 50,07±0,58 50,20±7,41

23,Y 51,23 (1325) 46,45 (1652) 48,33 (2709) 47,75 (1457) 50,09 (1635) 49,17±0,50 44,11±7,26

24, XY 0,65 (17) 0,61 (22) 0,19(11) 0,69 (21) 0,18(6) 0,17±0,11 1,20±0,99

24,XX - 0,16(6) 0,32(18) 0,36(11) 0,06 (2) 0,04±0,02 0,15±0,11

24,YY 0,04 (1) 0,22 (8) 0,30 (17) 0,91 (28) 0,18(6) 0,06±0,02 0,29±0,13

22,-X/Y 0,85 (22) 1,21 (43) 0,57 (32) 0,85 (26) 0,39(13) 0,29±0,08 2,39±2,31

25.XYY - 0,08 (3) - - - - 0,009±0,020

25.XXY - - - - - - 0,07±0,11

46,XY 0,27(7) 0,84 (30) 0,03 (2) 0,49 (15) 0,03 (1) 0,20±0,14 0,51±0,48

46,XX 0,11 (3) 0,98 (35) 0,05 (3) 0,13 (4) 0,03 (1) 0,06±0,03 0,14±0,07

46,YY 0,19 (5) 0,89 (32) 0,11(6) 0,29 (9) 0,06 (2) 0,08±0,05 0,16±0,13

47,XXY 0,05 (2) 0,01 (1) - - - 0,024±0,031

47,XYY - 0,02(1) - - 0,03 (1) - 0,0072±0,01

47,YYY - - - 0,03 (1) - - -

48.XXYY - - - 0,03 (1) - - ■ -

92,XXYY - - - 0,06(2) - - -

Частота встречаемости ПК с предположительно нормальным хромосомным набором и формулой кариотипа 23,X или 23,Y значительно превосходила частоты сперматозоидов с анеуплоидией по Х- и/или Y-хромосоме (Гордсева Е.Г. и др., 2012). Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что в ходе сперматогенеза ПК у мужчин с аномалиями половых хромосом в соматических клетках организма, подвергаются действию механизмов селективного отбора, направленного против ПК с хромосомным дисбалансом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С развитием и внедрением в медицинскую практику методов вспомогательных репродуктивных технологий проблема зачатия и рождения здорового ребенка становится решаемой для многих супружеских пар с бесплодием. За последнее десятилетие метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) стали широко применяться в случаях мужского бесплодия. Однако использование спермы при экстракорпоральном оплодотворении, в том числе при оплодотворении in vitro методом ИКСИ, от мужчин с умеренной или тяжелой формами олигозооспермии, а также в случаях некоторых других форм нарушений сперматогенеза, может быть сопряжено с генетическим риском по рождению детей с хромосомной патологией (Martin R.H., 1996; Calogero А.Е. et al., 2001b). Исследования хромосомного набора зрелых мужских половых клеток с применением мультицветовой FISH показали, что у мужчин с тяжелой формой ОАТ частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией может превышать референсные значения в 3 раза и более (Egozcue S. et al., 2000; Ushijima С. et al., 2000; Martin R.H., 2007). При этом согласно результатам, полученными нами, частота встречаемости сперматозоидов с некоторыми вариантами ХА, например с XY дисомией, может достигать значений 3% и более (Гордеева Е.Г. и др., 2013). Согласно данным других исследователей среди мужчин с ОАТ частота встречаемости сперматозоидов с дисомией по аутосомам и гоносомам может достигать 5,4%, а частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором может достигать 9,6% (Pang M.G. et al., 1999).

Предположения о наличии риска передачи потомству ХА при использовании в экстракорпоральном оплодотворении спермы со значительной долей сперматозоидов с хромосомным дисбалансом являются вполне обоснованными, поскольку при проведении процедур ЭКО/ИКСИ сперматозоиды не проходят через естественные селективные барьеры в процессе оплодотворения in vivo (Mortimer D. et al., 1982). Это обстоятельство повышает вероятность участия в оплодотворении in vitro сперматозоида с атипичной морфологией.

Уместно заметить, что даже при условии градиентного разделения сперматозоидов по качеству подвижности на фракции и при отборе морфологически нормальных сперматозоидов в течение процедур ЭКО/ИКСИ риск передачи потомству сверхчисленных хромосом или дополнительного хромосомного материала не может быть полностью исключен. Это не вызывает сомнений ввиду того, что корреляции между долей сперматозоидов с атипичной морфологией, долей сперматозоидов с поступательной подвижностью и долей сперматозоидов, несущих ХА, достаточно слабые, как показано в настоящей работе.

Известно, что эффективность процедур ВРТ в значительной степени зависит от качества мужских и женских половых клеток (Воробьева О.А. и др., 1995). К факторам, влияющим на исход ЭКО/ИКСИ и не относящимся к технической стороне вопроса успешного проведения процедур ВРТ, некоторые специалисты причисляют наличие специфических или тяжелых форм морфологических аномалий сперматозоидов, таких как нарушения в акросоме при выраженной тератозооспермии, и наличие мутаций генов или ХА в сперматозоидах (Venkatararaan G., Craft I., 2002).

По мнению некоторых исследователей не исключено, что высокая частота сперматозоидов с анеуплоидией в эякуляте негативно влияет на способность сперматозоидов к оплодотворению, на вероятность успешной имплантации бластоцисты и вынашивания плода (Rubio С. et al., 2001; Burrello N. et al., 2003; Nicopoullos J.D. et al., 2008).

Анализ данных, представленных в научной литературе, показал, что при концентрации сперматозоидов ниже 20><106/мл использование спермы в качестве донорской в программе ЭКО/ИКСИ приводит к повышению частоты хромосомной патологии эмбрионов (Bonduelle М. et al., 2002). Более того, показано, что частота сперматозоидов с анеуплоидией по половым хромосомам строго соответствует частоте получаемых при оплодотворении in vitro жизнеспособных эмбрионов с трисомией или моносомией по Х- и Y-хромосомам, а частота сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором соответствует частоте получаемых эмбрионов с триплойдным хромосомным набором (Rodrigo L. et al., 2010).

В научной литературе неоднократно появлялись сообщения, свидетельствующие о повышенной частоте встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по половым хромосомам в сперме у мужчин-отцов детей с трисомией или моносомией по половым хромосомам, которые рождены после проведения процедур ЭКО/ИКСИ (Moosani N. et al., 1999, Templado С. et al., 2011). Поэтому, по мнению специалистов, мужчин-кандидатов па проведение оплодотворения in vitro методом ЭКО/ИКСИ с тяжелой формой ОАТ можно считать принадлежащими к группе риска по передаче потомству сверхчисленных хромосом или дополнительного хромосомного материала (Carrell D., 2007). Вместе с тем, следует признать целесообразным включение FISH-анализа частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией в эякуляте в число обязательных предварительных методов генетического обследования для мужчин в программе ЭКО. Фактически с помощью этого метода становится возможной оценка вероятности формирования зиготы со специфическим хромосомным дисбалансом при естественном оплодотворении или при оплодотворении in vitro с помощью методов ЭКО/ИКСИ.

Предоставление информации в ходе медико-генетического консультирования супружеских пар с проблемами деторождения о возможном риске передачи потомству ХА, в особенности о риске по передаче дополнительной Х- и/или Y-хромосомы, является необходимым для планирования деторождения (Venkataraman G., Craft I., 2002).

При конституциональных XA у инфертильных и субфертильных мужчин FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с полной или сегментной анеуплоидией с индивидуальным подбором ДНК-зондов также показал себя как эффективный метод оценки вероятности передачи потомству ХА. В ряду исследований

продемонстрировано, что частота встречаемости сперматозоидов с полной или сегментной апеушгоидией в сперме у мужчин со структурными ХА строго соответствовала частоте бластоцист с хромосомным дисбалансом, которые получены методом ЭКО (Yakut T. et al., 2006; Wiland Е. et al, 2008; Bernicot I. et al., 2010).

Подводя итоги настоящего исследования, можно сказать, что результаты исследований хромосомного набора сперматозоидов у мужчин с различными формами патозооспермии и нарушением репродуктивной функции показывают, что оценка частоты встречаемости сперматозоидов с хромосомным дисбалансом методом FISH может быть использована как высокоинформативный тест. На основании результатов FlSH-анализа частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией можно проводить индивидуальную оценку риска передачи потомству сверхчисленных хромосом или дополнительного хромосомного материала отцовского происхождения.

На основании собственных результатов исследования и предложений по внедрению и использованию FISH-анализа частот встречаемости сперматозоидов с хромосомным дисбалансом разработаны показания, при которых данный тест может быть рекомендован (Martin R.H., 2007; Carrell D., 2008: Sarrate Z. et al., 2010, Гордеева Е.Г. и др., 2013):

1. при регулярной и мозаичной формах дисомии по Х-хромосоме;

2. при Робертсоновских транслокациях;

3. при сбалансированных реципрокных транслокациях;

4. при перицентрических инверсиях хромосом с протяженностью инвертированного сегмента более половины от всей длины хромосомы и составляющих по размеру 100 млн. п.н. и более;

5. при обследовании перед проведением процедур ЭКО/ИКСИ и в случаях повторных неудачных попыток проведения ЭКО/ИКСИ;

6. в случаях рождения ребенка с хромосомной патологией или в случаях выявления хромосомной патологии у плода или эмбриона;

7. при привычном невынашивании беременности;

8. для оценки состояния сперматогенеза и прогноза генетического риска для потомства в случаях пролонгированного мутагенного воздействия ионизирующих излучений или химических агентов.

Также пациенту может быть рекомендован FISH-анализ частот встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией при следующих патологических состояниях:

9. при нарушениях формирования синаптонемного комплекса между гомологичными хромосомами в ПК;

10. при тяжелой форме олигозооспермии или необструктивной азооспермии;

11. при выраженных формах сочетанной или изолированной мономорфной тератозооспермии и бесплодии: при глобулозооспермии; и при тяжелой форме или абсолютной мономорфной тератозооспермии, когда наблюдается преобладание таких специфических патологических форм сперматозоидов в эякуляте, как многожгутиковые сперматозоиды, макроцефаличсские сперматозоиды и сперматозоиды с удлиненными головками, сперматозоиды с удвоенными головками, или сперматозоиды с редуцированными жгутиками.

ВЫВОДЫ

1. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором, с дисомией по хромосомам 13, 18 и 21, частота встречаемости сперматозоидов с XX, ХУ и УУ дисомией среди мужчин с нормальным мужским кариотипом 46,ХУ и нормозооспермией в среднем составляет 0,37%, 0,11%, 0,05%, 0,20%, 0,04%, 0,17% и 0,06%, соответственно.

2. Частота встречаемости сперматозоидов с диплоидным хромосомным набором и с анеуплоидией по хромосомам 13, 18, 21, X и У среди мужчин с нарушением репродуктивной функции и патозооспермией превосходит частоту встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией среди мужчин с нормальным мужским кариотипом (46,ХУ) и нормозооспермией в среднем. В зависимости от формы нарушения сперматогенеза частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией может превосходить референсные значения в 1,5-3 раза или более.

3. Высокая частота мейотического нерасхождения хромосом в большей степени сопряжена с изменением такого показателя спермиологического анализа, как концентрация сперматозоидов в эякуляте, нежели с изменением других показателей: доли сперматозоидов с поступательной подвижностью или доли сперматозоидов с морфологическими аномалиями. Для мужчин с тяжелой формой олишзооспермии при концентрации сперматозоидов менее 1 млн/мл в среднем характерна наиболее высокая частота встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией.

4. Выявлены достоверные различия между частотой встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 21, X и У и частотой встречаемости сперматозоидов с анеуплоидией по хромосомам 13 и 18 среди мужчин с нормозооспермией и патозооспермией, обусловленные наличием предрасположенности к мейотическому нерасхождению хромосом группы О и половых хромосом.

5. Выявлены достоверные различия между частотой встречаемости сперматозоидов с ХУ дисомией и сперматозоидов с XX и УУ дисомией среди мужчин с нормозооспермией и патозооспермией, обусловленные более высокой частотой ошибок мейотического расхождения половых хромосом на стадии анафазы в М1, нежели в МЦ в ходе гаметогенеза у мужчин.

6. У мужчин со структурными ХА с вовлечением аутосом наблюдается гетерогенность фенотипических проявлений нарушения сперматогенеза. В данной клинической группе может быть обнаружена как нормозооспермия, так и различные формы патозооспермии, которые нередко сопровождаются признаками частичного блока сперматогенеза на стадиях прелептотены-зиготены и пахитены профазы I мейоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Курило Л.Ф., Гордеева Е.Г., Кузина Н.Ю., Баркова О.В., Магомедова Х.Д., Гамидов С.И., Типы хромосомных аномалий у пациентов с нарушением формирования и/или функции органов репродуктивной системы // Андрология и генитальная хирургия, 2009, №3, С. 24-28.

2. Гордеева Е.Г., Шилейко Л.В., Панкратова О.С., Курило Л.Ф., Частота анеуплоидий в гаметах у фертильных мужчин // Генетика, 2011, Т. 47 № 5, С. 828-835.

3. Гордеева Е.Г., Сорокина Т.М., Шилейко Л.В., Магомедова Х.Д., Курило Л.Ф., Частота встречаемости гамет с сегментной анеуплоидией у мужчины с бесплодием и перицентрической инверсией inv(18)(pll.23q21.1) И Медицинская генетика, 2012, Т. 11 № 3, С. 41-48.

4. Гордеева Е.Г., Сорокина Т.М., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В., Борзова О.С., Магомедова Х.Д., Кузина Н.Ю., Баркова О.В., Курило Л.Ф., Частота встречаемости гамет с анеуплоидией у мужчин с нарушением репродуктивной функции и патозооспермией // Медицинская генетика, 2013, № 2, С. 15-21.

Публикации в других изданиях:

5. Гордеева Е.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Анализ частот нерасхождения хромосом в половых клетках мужчин носителей сбалансированных реципрокных транслокаций и мужчин с бесплодием // материалы международной конференции «Хромосома 2009» 31/VIII-6/IX, 2009, Новосибирск, С. 126.

6. Гордеева Е.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М., Структурные хромосомные аномалии аутосом у пациентов с нарушением сперматогенеза // материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, 14-18/V, 2010, Ростов-на-Дону, С. 47-48.

7. Савельева А.П., Курило Л.Ф., Гордеева Е.Г., Уровень анеуплоидии по гоносомам в половых клетках у пациентов с синдромом Клайнфельтсра // материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, 14-18/V, 2010, Ростов-на-Дону, С. 156-157.

8. Гордеева Е.Г., Нерасхождение хромосом в мужском гаметогенезе и риск передачи хромосомных аномалий потомству // сборник научных трудов IX научной конференции «Генетика человека и патология: актуальные проблемы современной цитогенетики», выпуск 9, 28-30/ХІ, 2011, Томск, С. 97-98.

9. Гордеева Е.Г., Курило Л.Ф., Магомедова Х.Д., Кузина Н.Ю., Баркова О.В., Частота встречаемости гамет с анеуплоидией по Х- и Y-хромосомам у мужчин с аномалиями половых хромосом // материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт -основа профилактической медицины в век нанотехнологий», 16-18/V, 2012, Санкт-Петербург, С. 32-33.

Ю.Гордеева Е.Г., Результаты цитогенетического обследования и исследования хромосомного набора сперматозоидов у мужчин с нарушением репродуктивной

функции // материалы первого национального форума «Репродуктивное здоровье как фактор демографической стабилизации», 18-19/Х, 2012, Ростов-на-Дону, С. 66-67.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИИ

AT - астенотератозооспермия

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ИКСИ - введение сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ICSI —

Intracytoplasmic Sperm Injection)

KKA - количественный кариологический анализ

MI - первое мейотическое деление половой клетки

МП - второе мейотическое деление половой клетки

МВПР - множественные врожденные пороки развития

НПК - незрелые половые клетки

ОАТ - олигоастенотератозооспермия

OAT І-ІІІ - олигоастенотератозооспермия различной тяжести (легкая, умеренная,

тяжелая формы)

ПК - половые клетки

CA - спермиологический анализ

Т - тератозооспермия

ХА - хромосомные аномалии

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

FISH - флюоресцентная гибридизация на препарате (fluorescence in situ hybridization)

GTG - дифференциальное окрашивание хромосом красителем Гимза с предварительной обработкой трипсином (Giemsa-Trypsin-Giemsa)

m - среднее значение (mean value)

R - разброс значений

RobT - Робертсоновская транслокация

SE - стандартное отклонение (standard error)

Соискатель

Гордеева Е.Г.

Подписано в печать:

18.02.2013

Заказ № 8167 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru